CN103713127A - 一种人类嗜t细胞病毒酶联检测试剂盒 - Google Patents

一种人类嗜t细胞病毒酶联检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人类嗜T细胞病毒酶联检测试剂盒，包括盒体，盒体内置7个下凹瓶位，7瓶设有密封盖试剂瓶、一块人类嗜T细胞包被酶标反应板及两张封板膜，其中所述的7个下凹瓶位内分别相应放置酶标记物、浓缩洗涤液、底物液A、底物液B、阳性对照、阴性对照和终止液各一瓶，所述的多孔酶联板包括数个底面封闭且顶面敞口的微孔反应孔的内壁包被有P24、P19、P15、gp21、gp46、gp68、pr53抗原。本发明提供的人类嗜T细胞病毒酶联检测试剂盒具有较好的特异性，尤其是对于P24、P19、P15、gp21、gp46、gp68、pr53的快速测定，解决传统方法存在非特异性反应的问题，且重复性良好。

Description

一种人类嗜T细胞病毒酶联检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种酶联检测试剂盒及其用途，具体说，是设计一种人类嗜T细胞病毒酶联检测试剂盒，属生物技术领域。
背景技术
人类嗜T细胞病毒(HTLV)，是20世纪70年代后期发现的第一个人类逆转录病毒，有Ⅰ型(HTLV-Ⅰ)和Ⅱ型(HTLV-Ⅱ)之分，分别是引起T细胞白血病和毛细胞白血病的病原体。属逆转录病毒科的RNA肿瘤病毒亚科。HTLV-Ⅰ可通过输血、注射或性接触等途径传播，也可经胎盘、产道或哺乳等垂直传播。HTLV流行地区和非流行地区的人群感染率不同在流行地区，无症状的病毒携带者抗体阳性率明显高于非流行地区，如日本北部Hokkaido非流行地区的抗体阳性率为0%，而西南部Nagasaki和 Kagoshima流行地区人群抗体阳性率分别为16% 和15%，并有明显的聚集发病趋势。加勒比海盆地是HTLV的另一个流行地区，牙买加的非何杰金恶性淋巴瘤患者约70% HTLV-Ⅰ抗体阳性。牙买加健康人群抗体阳性率约2%～10%，海地的健康人群抗体阳性率估计还要高些。英国加勒比海盆地移民中，患ATL的黑色人种近乎100% HTLV-Ⅰ抗体阳性。非洲南部和北部也是HTLV感染的高发区。南非、尼日利亚、埃及、北非和加纳等国中，正常人群HTLV-Ⅰ的抗体水平为2%～10%。另外在美国和以色列也存在小范围流行。我国福建省也有HTLV-Ⅰ小流行的报道。
在非流行国家，健康者HTLV-Ⅰ或(和)Ⅱ携带率不高，一般低于2%。资料表明病毒可通过供血者传播，有多次输血史的人群HTLV-Ⅰ、Ⅱ的受染率分别为10.2% 、0.8%。有学者认为，非T细胞白血病或淋巴瘤患者，或是儿童白血病HTLV-Ⅰ的感染可能是由于输入污染有HTLV-Ⅰ的血制品造成。虽然输有HTLV血液的受血者可能不发病，但作为携带个体，可能通过分娩、哺乳、性接触等途径，成为病毒传播的重要传染源。
目前已从许多T淋巴细胞的恶性疾病中分离到HTLV，如成人T细胞白血病（ATL）、T细胞淋巴瘤（TCL）、皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）、T细胞性毛细胞白血病（THCL）、播散性混合性淋巴瘤（DML）等。此外，从艾滋病、某些慢性神经系统的退行性病变的组织及健康人中也分离到HTLV，研究显示，HTLV-Ⅰ是T淋巴细胞白血病或淋巴瘤的病原因子，血液或组织中的肿瘤细胞以CD+ 4、CD- 8为主。另外在感染HTLV-Ⅰ后，可出现HTLV-Ⅰ相关的脊髓病或热带痉挛性下肢轻瘫（HAM/TSP）HAM/TSP是一种慢性、进行性神经性疾病，表现为脊髓退行性病变，并在外周血和脑脊髓液中出现CD+ 8细胞毒T淋巴细胞的浸润。虽然多次从T细胞性毛细胞白血病患者中分离到HTLV-Ⅱ，HTLV-Ⅱ也能在体外转化人的正常T细胞，但病毒在体内致病机理尚不明了，故目前仍不能十分确定HTLV-Ⅱ作为致病因子可造成淋巴细胞增殖性疾病。在美国，1988年起已开始对血库的血源作HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ的测定。
通常HTLV-I／Ⅱ抗体的初筛试验，采用培养人T细胞系中的病毒裂解物作为抗原，现采用最多的抗原是gp46、p2le、p24和p40tax，该类试验敏感性很高，但特异性较低，适用于大规模的初筛，而Western blot，PCR技术这些方法费时，费力，并且需要昂贵的设备仪器，无法满足同时大量处理标本的需求。同时，鉴于HTLV-I／Ⅱ病毒的危害性，有必要开发一种简单快速的检验HTLV-I／Ⅱ的病毒抗体的检测试剂盒。
HTLV为单股RNA病毒，具有外膜。根据基因组及血清学反应可分为I型(HILV—I)和Ⅱ型(HTLV一Ⅱ)，HTLV—I基因组全长9．03kb，5 端的开放阅读框架编码核心蛋白(gag)，蛋白酶(pro1)，逆转录酶(po1)，外膜蛋白(env)，3 端ORF编码Tax和Rex，另外还编码两种功能尚不清楚的小蛋白Tof和Kof。Gag由24kDa(P24)，19kDa(P19)和15kDa(P15)分子群组成，Env是一种糖蛋白，由21kDa的跨膜糖蛋白gp21e和46kDa的外膜蛋白gp46组成，HTLV-Ⅱ与HTLV-I有60％的基因序列同源。根据WHO规定的WB阳性判定标准是p24、p19、pr53中的一条带或几条带和gp21、gp46、gp68中的一条带或几条带。由于传统的WB同样使用的是与ELISA相同的病毒裂解物作为抗原，因而也存在非特异性反应的问题，因此本试剂盒需要包被HTLV病毒全部序列从而解决特异性反应的问题，同时该方法也为人类嗜T细胞病毒(HTLV)的防治、早期筛查、检测工作提供了准确、简便、有效的监测手段，具有广泛的应用范围和社会需求。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种人类嗜T细胞病毒酶联检测试剂盒。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种人类嗜T细胞病毒酶联检测试剂盒，包括盒体，盒体内置有7个下凹瓶位，7瓶试剂瓶、一酶标反应板2片封膜构成，所述试剂瓶内的试剂分别为：酶标记物、浓缩洗涤液、底物液A、底物液B、终止液、阴性对照和阳性对照各一瓶，所述的多孔酶联反应板包括数个底面封闭且顶面敞口的微孔反应孔的内壁包被有P24、P19、P15、gp21、gp46、gp68、pr53抗原。
作为一种优选方案，所述的人类嗜T细胞病毒抗体检测盒包被全部序列特异性抗原即P24，P19，P15，gp21,gp46,gp68,pr53。
所述酶标反应板由稀释度为1:1000-1:1100的人类嗜T细胞病毒抗原包被；包被全部序列特异性抗原即P24、P19、P15、gp21、gp46、gp68、pr53；
所述浓缩洗涤液为含有15%氯化钠的磷酸盐缓冲液；
所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的酶标P24、P19、P15、gp21、gp46、gp68、pr53抗原，稀释度1:1200-1:1500；
所述底物液A为0.04%过氧化脲乙酸缓冲液；
所述底物液B为0.04%TMB的柠檬酸缓冲液；
所述终止液为1mol/L硫酸溶液；
所述阴性对照为阴性血清；
所述阳性对照为P24、P19、P15、gp21、gp46、gp68、pr53抗体阳性血清。
作为进一步优先方案，所述下凹瓶位可由塑料或纸板制成。
作为进一步优选方案，所述酶标反应板位于所述试剂瓶之前，所述封板膜与所述酶标板相邻；且所述酶标反应板的大小一致。
作为进一步优选方案，所述酶标反应板包括支撑架，及放置在支撑架之上的数条可拆卸的微孔反应板条，每条微孔反应条上设有数个可拆卸的微反应孔。
作为进一步优选方案，所述酶标反应板上共设有96个微反应孔，且所述酶标反应板外设有封套。
附图说明
图1为本发明提供的人类嗜T细胞病毒酶联检测试剂盒的结构示意图。
图2为本发明提供的人类嗜T细胞病毒酶联检测试剂盒中的96孔酶标板的结构示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解，下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商建议的条件。比例和百分比基于重量，除非特别说明。
下面结合附图其实施例对本发明进一步详细说明。
 
实施例
如图1和图2所示，本发明提供的一种人类嗜T细胞病毒酶联检测试剂盒，包括盒体（8）、盒体内置有7个下凹瓶位（4）、7瓶试剂瓶组、一块酶标反应板（1）两张封板膜（3）其中所述的7个下凹瓶位内分别相应放置装有酶标记物（11）、浓缩洗涤液（12）底物液A（9）底物液B（7）、终止液（5）、阴性对照（6）、阳性对照（10）各一瓶，所述酶标反应板位于所述试剂瓶之后，所述封板膜与所述酶标反应板相邻；且所述封板膜与所述酶标反应板的大小一致；所述酶标反应板包括支撑架（13），及放置在支撑架之上的数条可拆卸的微孔反应板条（15）；所述酶标反应板上共设有96个微反应孔（14），且所述酶标反应板外设有封套（2）。
试剂盒的制备：
（1）试剂
包被液（0.05mol/L，pH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液）：Na2CO3 1.5g、NaHCO3 2.9g、加双蒸水至1000ml，调至pH9.6；
封闭液：（10%小牛血清PBS溶液）小牛血清100ml×PBS（pH7.4）900ml；
浓缩洗涤液（PBST,pH7.4）：由NaCl 8.0g、KH2PO4 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、KCl 0.2g、Tween200 5ml加双蒸水至1000ml，调至pH7.4；
酶标记物（HRP*HTLV-Ⅰ和 HTLV-Ⅱ抗原）：辣根过氧化物酶标记的P24、P19、P15、gp21、gp46、gp68、pr53抗原，稀释度1:1200-1：1500；
底物液A：由过氧化脲 0.4g、柠檬酸 2.1g、无水乙酸钠 7.38g、丙三醇 50ml 加纯化水定溶至1000ml即得（pH4.2）；
底物液B：由3,3,5,5-四甲基联苯胺 0.4g、二甲基亚砜 20ml、柠檬酸 2.1g、丙三醇 50ml加纯化水定溶至1000ml即得（pH2.7）； 
终止液：由硫酸 27ml加纯化水定溶至1000ml即得（硫酸缓慢滴加并缓慢搅拌）；
所述阴性对照为阴性血清；
所述阳性对照为P24、P19、P15、gp21、gp46、gp68、pr53抗体阳性血清。
（2）主要仪器
酶标仪：热电MK3，水浴锅，洗板机 移液器       ELISA反应板：厦门云鹏。
（3）方法
酶标记物最适滴度的选择：
   取96孔酶标板一块，用100ng/ml P24、P19、P15、gp21、gp46、gp68、pr53抗体100ul/孔2-8℃孵育18-22小时，洗涤液洗板2次，350ul/孔，甩干；将酶标P24、P19、P15、gp21、gp46、gp68、pr53抗原用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中，100ul/孔，37℃孵育60min，后用洗板5次，350ul/孔，甩干；加底物显色，每孔加入底物A及底物B液体各50ul，37℃避光显色15分钟；后加入终止液50ul终止反应，在酶标仪上读取450nm波长处 吸光度，即A值，取A值在1.0时的酶标抗体稀释度，作为酶标记物的最适滴度为1：1200-1：1500。
 
选择包被抗原最适滴度：
取96孔酶标板一块，用包被液将抗原作一系列稀释后进行包被，每孔100ul；2-8℃孵育18-22小时；弃去孔中包被液，洗涤液洗板2次，350ul/孔，拍干，将抗原包被板加150ulPBS稀释的10%小牛血清封闭液，22-8℃孵育18-22小时。弃去封闭液，拍干，将已包被完成的抗原包被板置于干燥间干燥，干燥时间不得低于16小时，温度≤35℃，湿度≤30%，最后封袋备用。
加按最适滴度稀释的酶标记，保温，洗涤。
加底物显色，加终止液终止反应后再酶标仪上读取450nm波长处吸光度，即A值；
选择强阳性参考血清的A值为0.8-1.0间 、阴性参考品血清的A值小于0.2的包被抗原的稀释度作为最适滴度，本试剂盒最适包被人类嗜T细胞病毒的稀释度为1:1000-1:1100。
 
人类嗜T细胞病毒包被反应板的制备方法：
取96孔聚苯乙烯酶标板一块；包被，将抗原稀释到包被液中以1:1000-1:1100稀释包被，每孔加入100ul抗原包被液于酶标板孔中，置于2-8℃冰箱18-22小时；弃去孔中抗原包被液洗板2次拍干；洗板，用0.01mol/L的PBST洗涤液洗板2次拍干；封闭，每孔加入150ul含10%小牛血清封闭液置于2-8℃冰箱18-22小时；弃去孔中封闭液，拍干；干燥，将已包被完成的抗原包被板置于干燥间干燥，干燥时间不得低于16小时，温度≤35℃，湿度≤30%，得到抗原包被反应板。
 
人类嗜T细胞病毒IgG检测试剂盒，由上述人类嗜T细胞病毒包被反应板、浓缩洗涤液、酶标记物、底物液A、底物液B、终止液、阴性对照、阳性对照构成。
具体分为：
所述酶标反应板由稀释度为1:1000-1:1100人类嗜T细胞病毒抗原包被；
浓缩洗涤液为含有15%氯化钠的磷酸盐缓冲液；
酶标记物为辣根过氧化物酶标记的P24、P19、P15、gp21、gp46、gp68、pr53抗原，稀释度1:1200-1:1500；
底物液A为0.04%过氧化脲乙酸缓冲液；
底物液B为0.04%TMB的柠檬酸缓冲液；
终止液为1mol/L硫酸溶液；
所述阴性对照为阴性血清；
所述阳性对照为P24、P19、P15、gp21、gp46、gp68、pr53抗体阳性血清。
 
实施例2利用上述试剂盒采用ELISA法检测血清中P24、P19、P15、gp21、gp46、gp68、pr53抗体：
1. 实验前，将试剂盒从冰箱取出，室温放置30分钟后使用。
2. 将浓缩洗涤液用蒸馏水稀释20倍后使用。
3. 每次试验设阳性对照、阴性对照各1孔，每孔加对照液100ul；空白1孔；其余为样品孔，每孔加样品50ul和酶标记物50ul。贴上封口膜置37℃温育60分钟。
4. 弃去孔中液体，拍干，每孔加洗涤液350ul，静置5～10秒钟后弃去，拍干，重复洗涤5次，拍干。
5. 每孔滴加底物A、底物B各50ul，37℃避光显色15分钟；
6. 加底物显色15分钟后，每孔立即加入终止液50ul，轻轻震荡混匀。设定酶标仪波长450nm或双波长450nm/630nm。当使用单波长时，以空白孔调零，用酶标仪读取450nm处的A值；当使用双波长时，可以不设空白孔，用酶标仪直接读取450nm/630nm处的A值。注意：在终止反应15分钟内读数。
7. 实验结果判定：
每个试验结果独立使用，通过（Cut off）值判定结果.
计算临界值：Cut off（C.O）=2.1*阴性对照（NC）A值（当阴性对照A值小于0.05时按0.05计算；大于0.05时按实际值计算）
结果判定：标本A值<临界值，则判为阴性。标本A值≥临界值，则判为阳性。
组装所得的人类嗜T细胞病毒酶联检测试剂盒的特异性及重复性检测采用现有技术的常规方法，具体如下：
特异性试验：
分别筛选HBsAg、HCVAb，HIV1+2Ab，TPAb的阳性血清以及含EDTA，柠檬酸钠抗凝剂，RF的血清各20份，采用人类嗜T细胞病毒酶联检测试剂盒进行试验，均在临界值以下对试剂盒试验结果均无影响，说明该试剂盒特异性良好。
重复性试验：
以同一批试剂盒测定参考品10次进行重复检测，进行变异系数测算（标准差/平均值*100%），得批内CV≤10%，以不同批次试剂盒测定参考品10次进行重复检测，进行变异系数测算（标准差/平均值*100%），得批间CV≤15%，证明该试剂盒具有良好的重复性。
本发明是提供一种人类嗜T细胞病毒酶联检测试剂盒具有良好的特异性，尤其是对于P24、P19、P15、gp21、gp46、gp68、pr53的快速测定，解决传统方法存在非特异性反应的问题，且重复性良好。
最后需要说明的是：以上实施例子只用于针对本发明技术方案作进一步详细地说明，不能理解是本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据 本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种人类嗜T细胞病毒酶联检测试剂盒，其特征在于，包括盒体，盒体内置有7个下凹瓶位，7瓶设有密封盖的试剂瓶、一酶标反应板和两张封板膜构成，所述试剂瓶内的试剂分别为：酶标记物、洗涤液、底物液A、底物液B、阴性对照、阳性对照和终止液，所述的多孔酶联反应板包括数个底面封闭且顶面敞口的微孔反应孔的内壁包被有P24、P19、P15、gp21、gp46、gp68、pr53抗原，其中：
所述酶标反应板由稀释度为1:1000-1:1100的人类嗜T细胞病毒抗原包被；包被全部序列特异性抗原即P24、P19、P15、gp21、gp46、gp68、pr53；
所述浓缩洗涤液为含有15%氯化钠的磷酸盐缓冲液；
所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的酶标P24、P19、P15、gp21、gp46、gp68、pr53抗原，稀释度1:1200-1:1500；
所述底物液A为0.04%过氧化脲乙酸缓冲液；
所述底物液B为0.04%TMB的柠檬酸缓冲液；
所述终止液为1mol/L硫酸溶液；
所述阴性对照为阴性血清；
所述阳性对照为P24、P19、P15、gp21、gp46、gp68、pr53抗体阳性血清。
2.根据权利要求1所述的人类嗜T细胞病毒酶联检测试剂盒，其特征在于；所述下凹瓶位可由塑料或纸板制成。
3.根据权利要求1所述的人类嗜T细胞病毒酶联检测试剂盒，其特征在于：所述酶标反应板位于所述试剂瓶之后，所述封板膜与所述酶标反应板相邻；且所述封板膜与所述酶标反应板的大小一致。
4.根据权利要求1所述的人类嗜T细胞病毒酶联检测试剂盒，其特征在于：所述酶标反应板包括支撑架，及放置在支撑架之上的数条可拆卸的微孔反应板条，每条微孔反应条上设有数个可拆卸的微反应孔。
5.根据权利要求1所述的人类嗜T细胞病毒酶联检测试剂盒，其特征在于：所述酶标反应板上共设有96微孔反应孔，且所述酶标反应板外设有封套。
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