CN110187108A - 一种用于早期食管癌筛查的自身抗体联合检测elisa试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于肿瘤医学技术领域，具体公开了一种用于早期食管癌筛查的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，该试剂盒包括固相载体和包被于固相载体上的肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关抗原为EYA4、ABL1、ATF2、CD38、NOTCH1、ZBTB20、BCL2L1和P53。进一步地，所述试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、阳性对照血清、阴性对照血清、显色液、终止液和洗涤液。本发明的ELISA试剂盒可以有效检测食管癌，尤其是早期食管癌，其检测灵敏度高达94%，特异性达到了79%，可用于食管癌高发区无症状人群的大规模筛查，有利于无症状高危人群筛查和早期发现。

Description

一种用于早期食管癌筛查的自身抗体联合检测ELISA试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学和肿瘤学领域，具体涉及一种用于早期食管癌筛查的自身抗体联合检测ELISA试剂盒。

背景技术

食管癌(本专利所示的食管癌为食管鳞癌)是全球六大恶性肿瘤之一，全球每年新增约50万例食管癌患者，其中一半以上发生在中国，比西方国家发病率高100倍。国家癌症中心2018年全国最新癌症报告显示，2014年我国食管癌新发病例为18.85/10万，在恶性肿瘤中排第六位，而食管癌死亡病例为14.11/10万，在恶性肿瘤中排第四位。在我国河南、河北和山西三省交界的太行山地区是世界上食管癌发病率和死亡率最高的地区。《2017年河南省肿瘤登记年报》显示：我省发病率和死亡率最高的十大恶性肿瘤中食管癌均排第三位。食管癌是极具中国人特色的疾病，在流行特征、组织学发生和发病危险因素等方面与西方国家人群存在巨大差异，导致中西方学者关注的科学问题明显不同，中西方食管癌研究成果共享困难。

中晚期食管癌患者5年生存率仅10％左右，而早期食管癌则可达90％以上。由于食管癌患者在早期阶段缺乏明显的特异症状，并且缺乏适宜大范围高危人群筛查的经济、高效和敏感的生物标志物，这些原因导致目前临床上就诊的食管癌患者在确诊时多已为中晚期，也是导致食管癌患者死亡率无明显改善的主要原因之一。传统上，“高发区、40岁以上、男性、吸烟、饮酒、家族史阳性的无症状人群”被笼统界定为“食管癌高危或高风险人群”，也是食管癌早期筛查主要对象。目前，色素内镜和粘膜活检病理检查是食管癌早期发现的重要筛查方法。但是，因内镜筛查有创伤、高成本和低效率(例如，常规高发区内镜筛查如上“高危人群”，早期癌的发现率仅2％左右，约90％以上的无症状“高危人群”均为“陪伴检查”)，限制了内镜筛查在无症状高危人群食管癌早期发现中的推广应用。因此，筛选高效、特异的食管癌分子标志物对于食管癌患者的早期发现、早期筛查尤为重要。

近年的研究发现了一系列恶性肿瘤的相关抗原，其中一些已经应用于临床辅助诊断，比如当甲胎蛋白已作为肝癌诊断的一项生物学指标、CA125已应用于卵巢癌的普查和筛选，癌胚抗原(CEA)已作为早期诊断肠道腺癌特异性标志物。然而尚无食管癌特异相关抗原试剂盒应用于临床诊断。

食管癌是由多种基因编码的蛋白参与的复杂的多阶段演进过程，是环境和遗传互作的结果，人体受到各种物理或生化因素刺激，如亚硝胺导致DNA烷基化损伤，微量元素缺乏等，均可导致食管鳞状上皮基底细胞过度增生，进一步成为不典型增生，最终发展为早期浸润癌。王立东教授领衔的食管癌研究团队历经24年建立了5.4万例食管癌高发区无症状人群33年随访(1985-2018)研究队列和50万例食管癌患者临床诊疗、病理和45年随访信息(1973-2018)大数据库及生物样本库，在随访过程中发现，经内镜活检确定为食管癌前病变的患者除发展为浸润癌之外，有一部分癌前病变的人群并未发展为食管癌，有的甚至转为正常，这一现象提示食管癌前病变具有双向发展的特性。本研究团队在前期利用全基因组关联分析、全基因组测序和全基因组外显子测序等技术建立的基因组学数据库的基础上，应用自身抗体芯片技术筛选出8种肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen,TAA)，这8种TAA分别为EYA4、ABL1、ATF2、CD38、NOTCH1、ZBTB20、BCL2L1和P53，并且发现在食管粘膜鳞状上皮发生癌变之前就能够检测到上述8种TAA的自身抗体存在，这些自身抗体对于食管癌和癌前病变患者具有较高的特异敏感性，因此，用这8种TAA制成的试剂盒能够应用于高发区无症状人群早期食管癌筛查并预测其转归。EYA4是一种非巯基蛋白酪氨酸磷酸酶，在细胞凋亡调控、DNA损伤修复、血管生成等过程中都起重要作用。ABL1是一种原癌基因，受氧化应激和DNA损伤激活，其活性对于糖酵解和氧化应激相关的肿瘤发展有重要作用。ATF2属碱性亮氨酸拉链转录因子家族成员，其既有癌基因的特性，也具有肿瘤抑制因子的特性，参与细胞生长、发育、细胞应激和DNA损伤反应及细胞死亡调节等过程。CD38是定位于膜上的糖蛋白，具有酶活性，催化生成烟酰胺、烟酸腺嘌呤二核苷酸、二磷酸腺苷核糖和二磷酸腺苷核糖环化酶，后三者调节细胞内钙离子的释放。NOTCH1是一种高度保守的细胞表面受体，其信号紊乱不仅可以直接而且可以间接通过其它多条信号传导通路诱导肿瘤发生。ZBTB20是调节巨噬细胞免疫应答的重要分子，通过抑制IkBa基因转录，调节NF-kB信号通路的活化，从而增加巨噬细胞的免疫应答。BCL2L1是Bcl-2家族的成员，参与细胞凋亡和肿瘤发生过程。P53是细胞生长周期中的负调节因子，参与细胞周期调控、DNA损伤修复以及细胞凋亡等，目前许多研究表明P53与参与人类肿瘤发生发展密切相关。因此，本研究联合筛选的八种TAA自身抗体，开发一种具有高灵敏度高和高特异性的用于早期食管癌筛查的ELISA试剂盒。

发明内容

针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的是提供一种用于早期食管癌筛查的自身抗体联合检测ELISA试剂盒。

为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供了一种肿瘤相关抗原EYA4、ABL1、ATF2、CD38、NOTCH1、ZBTB20、BCL2L1和P53的组合在制备用于食管癌筛查的试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种用于早期食管癌筛查的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，所述试剂盒包括固相载体和包被于固相载体上的肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关抗原为EYA4、ABL1、ATF2、CD38、NOTCH1、ZBTB20、BCL2L1和P53。

根据上述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，优选地，所述试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、阳性对照血清、阴性对照血清、显色液、终止液和洗涤液。更加优选地，所述样品稀释液为含有1％(W/V)BSA的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液；所述第二抗体稀释液为含有1％(W/V)BSA的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液；所述显色液由显色液A和显色液B组成，所述显色液A为0.02％(W/V)TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)，所述显色液B为0.006％(W/V)过氧化脲素；所述终止液为10％的硫酸；所述洗涤液为含0.05％吐温-20的0.01M的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液(pH7.4)。

根据上述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，优选地，所述第二抗体带有可检测的标记物。

根据上述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，优选地，所述标记物为辣根过氧化物酶。

根据上述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，优选地，所述第二抗体为RecA蛋白。

根据上述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，优选地，所述阳性对照血清为P53阳性对照血清，所述阴性对照血清为P53阴性对照血清。更加优选地，所述P53阳性对照血清是使用间接ELISA和Western blot方法检测P53抗体均为阳性的食管癌患者血清，所述P53阴性对照血清是使用间接ELISA和Western blot方法检测P53抗体表达水平为正常人群血清抗体平均含量的正常人的血清。大量研究已明确表明P53抗原在食管癌的发生发展过程中起十分重要的调节作用，并且抗P53抗体在食管癌患者血清中具有较高的阳性率。本发明选择P53抗体阳性血清作为阳性对照，同一ELISA试剂盒的其他抗原抗体反应的强弱可以据此作为参照，达到质控的目的。

根据上述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，优选地，所述固相载体为酶标板。更加优选地，所述固相载体优选为96孔酶标板(共8行12列)；所述96孔酶标板按照精心设计的布局图(参见图1)包被EYA4、ABL1、ATF2、CD38、NOTCH1、ZBTB20、BCL2L1和P53这8种肿瘤相关抗原，其中每行包被有一种抗原，每种抗原包被于11个点样孔中。同一检测对象的血清样品经过稀释后加入本发明ELISA试剂盒的96孔酶标板的一列，可达到同时检测出该血清样品中8种抗TAA抗体表达水平的目的。所述96孔酶标板上设有空白对照孔、阳性对照孔和阴性对照孔，所述空白对照孔中包被不含抗原的包被液，所述阳性对照孔和阴性对照孔中均包被P53抗原。

根据上述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，所述自身抗体联合检测ELISA试剂盒的检测对象为人类血清。同一血清样本经过稀释后加入96孔酶标板的一列，可以达到同时检测出该血清样品中8种TAA的抗体的表达水平。

与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果为：

(1)本发明首次将EYA4、ABL1、ATF2、CD38、NOTCH1、ZBTB20、BCL2L1和P53这8种肿瘤相关抗原作为一个组合，联合检测人血清中上述8种TAA的抗体表达水平，可以有效检测食管癌，尤其是早期食管癌，其检测灵敏度高达94％(即早期食管癌患者中应用这8个肿瘤相关抗原进行诊断时被正确的诊断为早期食管癌的比率为94％)，特异性达到了79％(即非食管癌患者用8种肿瘤相关抗原联合检测时，被确定为未患食管癌者的比率为79％)，远高于现有临床内镜筛查食管癌的检出率(2％-3％)，因此，本发明的ELISA试剂盒具有较高的灵敏度和特异度，可用于食管癌高发区无症状人群的大规模筛查，能够大大提高早期食管癌的检出率，有利于无症状高危人群筛查和早期发现，从而大大降低了食管癌患者的死亡率，为贲门癌患者和家庭带来极大的福祉。

(2)本发明制备的ELISA试剂盒检出成功率高，技术重现性好，性价比高，使用方便，操作步骤简单、快捷，极大地提高了临床食管癌的检测效率；而且检测成本低，能够在普通实验室推广使用。

(3)本发明的ELISA试剂盒，可以实现同时检测11个待测血清样品中8种TAA抗体的表达水平，因此，可用于大规模的样本检测，极大地提高了检测和诊断效率。

附图说明

图1为本发明自身抗体联合检测ELISA试剂盒中96孔酶标板的抗原包被分布图(其中，抗原名称代表了该孔包被了此抗原，加入的是待测血清，用来检测待测血清中相应抗体的表达水平；“+”代表阳性对照孔，加入的是阳性对照血清；“-”代表阴性对照孔，加入的是阴性对照血清；“空白”代表空白对照孔，该孔不加入含血清的样本稀释液，其它操作均相同，该空白对照用于反应实验过程中的背景值)；

图2为8种肿瘤相关抗原的自身抗体在食管癌组血清中的分布图；

图3为8种肿瘤相关抗原的自身抗体在对照组血清中的分布图；

图4为8种肿瘤相关抗原的自身抗体在食管癌组和对照组中阳性率结果图；

图5为8种肿瘤相关抗原的自身抗体检测食管癌的ROC曲线。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明作进一步详细说明，但并不限制本发明的范围。

下列实施例所述的实验方法，如无特殊说明，均为本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂、材料和仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：8种肿瘤相关抗原的制备

通过使用原核表达系统，原核表达和纯化8种肿瘤相关抗原(EYA4、ABL1、ATF2、CD38、NOTCH1、ZBTB20、BCL2L1和P53)，以便为下步实验做准备。具体抗原制备过程如下：

(1)使用基因克隆技术构建8种肿瘤相关抗原蛋白(EYA4、ABL1、ATF2、CD38、NOTCH1、ZBTB20、BCL2L1和P53)的重组原核表达质粒；

(2)表达目的蛋白：将构建的重组原核表达质粒分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，使用IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导目的蛋白表达；

(3)纯化目的蛋白：根据目的蛋白所携带的标签，采用传统的相应的纯化方案对目的蛋白进行纯化；

(4)使用Bradford法测定蛋白浓度，使用Western Blot的方法对纯化蛋白的免疫学活性进行鉴定。

鉴于原核系统表达纯化重组蛋白技术已比较成熟，具体过程不再详述，通过以上制备步骤，成功获取8种有活性的目的蛋白，即肿瘤相关抗原，为后续实验做准备。

实施例2：试剂盒的制备

本发明根据间接酶联免疫法的原理制备了一种用于早期食管癌筛查的自身抗体联合检测ELISA试剂盒。间接酶联免疫法的原理是将抗原链接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物，再用酶标二抗与固相抗原-受检抗体复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，然后测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。

1.试剂和材料：

(1)8种肿瘤相关抗原蛋白(EYA4、ABL1、ATF2、CD38、NOTCH1、ZBTB20、BCL2L1和P53)；

(2)96孔酶标板：购自Corning公司；

(3)包被液：碳酸盐缓冲液，pH＝9.6；

(4)封闭液：含2％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(5)样品稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(6)第二抗体稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(7)酶标第二抗体：辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白；

(8)洗涤液：pH7.4的0.01M的PBST(磷酸盐)缓冲液；

(9)阳性对照血清：P53阳性对照血清，即使用间接ELISA和Western blot方法检测P53抗体均为阳性的食管癌患者血清；

(10)阴性对照血清：P53阴性对照血清，即使用间接ELISA和Western blot方法检测P53抗体表达水平为正常人群血清抗体平均含量的正常人的血清；

(11)显色液A：0.02％(W/V)TMB，配制：取甲基联苯胺(TMB)0.005g，溶解于25ml去离子水中；

(12)显色液B：0.006％(W/V)过氧化脲，配制：取柠檬酸4.665g、Na₂HPO₄18.40g，充分溶解于400ml去离子水中，加0.75％过氧化氢脲素3.2ml，调整pH值至5.0-5.5，加去离子水定容至终体积500ml，混匀4℃保存；

(13)终止液：10％的硫酸。

2.制备抗原包被的酶标板：

(1)制备8种肿瘤相关抗原溶液：

将8种肿瘤相关抗原蛋白分别溶解于包被液中，充分混匀，配制成8种抗原溶液，其中EYA4溶液的浓度为0.125μg/ml，ABL1溶液的浓度为0.25μg/ml，ATF2溶液的浓度为0.5μg/ml，CD38溶液的浓度为1.0μg/ml，NOTCH1溶液的浓度为1.0μg/ml，ZBTB20溶液的浓度为0.75μg/ml，BCL2L1溶液的浓度为0.175μg/ml，P53溶液的浓度为0.35μg/ml。

(2)包被酶标板：

将制备好的八种肿瘤相关抗原溶液按照图1所示的布局分别加入到96孔酶标板的点样孔中，加样量为100μl/孔；阳性对照孔和阴性对照孔中加入p53抗原溶液，空白对照孔加入包被液，37℃恒温培养箱孵育1h，4℃过夜后去除包被液，然后用洗涤液洗涤3次，每次洗涤3min。

(3)封闭：

向包被后的96孔酶标板的点样孔中加入封闭液，加样量为300μl/孔，室温孵育2小时，然后除去封闭液。

(4)干燥和包装：

将封闭处理后的96孔酶标板放置37℃烘干箱烘干后，包装，得到抗原包被的96孔酶标板，4℃保存备用。

3.本发明试剂盒的组成如下：

(1)抗原包被的96孔酶标板；

(2)样品稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(3)第二抗体稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(4)酶标第二抗体：辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白，购自Invitrogen公司；

(5)显色液：显色液由显色液A和显色液B组成，其中，显色液A为0.02％(W/V)TMB，显色液B为0.006％(W/V)过氧化脲；使用时，显色液A和显色液B按照1:1等体积混合均匀；

(6)终止液：10％的硫酸；

(7)洗涤液：pH7.4的0.01M的PBST(磷酸盐)缓冲液。

(8)阳性对照血清：P53阳性对照血清；

(9)阴性对照血清：P53阴性对照血清。

试剂(2)-(9)分别包装后与抗原包被的96孔酶标板构成试剂盒。

实施例3：本发明试剂盒的检测方法

1.血清样本孵育：

将待检测的血清样本用样品稀释液按1：100的比例进行稀释，然后将稀释后的血清样本加入已包被抗原的96孔酶标板的点样孔中，加样量为100μl/孔，置于37℃恒温培养箱孵育1h，然后弃去点样孔中液体，用洗涤液洗涤5次。

2.酶标二抗孵育：

将辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白用第二抗体稀释液按1：8000的比例进行稀释，然后将稀释后的辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白加入96孔酶标板的点样孔中，加样量为100μl/孔，置于37℃恒温培养箱孵育1h，然后弃去点样孔中液体，用洗涤液洗涤5次。

3.显色及终止反应：

将显色液A和显色液B按照1:1等体积混合均匀，然后将混合后的显色液迅速加入96孔酶标板的点样孔中，加样量为100μl/孔，置于37℃水浴避光显色15min，然后向每个点样孔中再加入50μl终止液，终止显色反应，用自动酶标仪在450nm(检测波长)和595nm(参比波长)处读取OD值，并用空白对照孔调零。

4.结果判定：

以阴性对照孔所测OD值得平均数加两个标准差(Mean+2SD)为截断值(cut-off值)，反应孔中OD值读数大于等于截断值的判断为阳性，反应孔中OD值读数小于截断值的判断为阴性。

实施例4：本发明试剂盒的诊断价值分析

用本发明实施例2所述的试剂盒的检测食管癌患者和正常人的血清样本，以评估和分析本发明试剂盒用于早期食管癌筛查的价值。

样本准备：根据流行病学分析，本研究收集了200例原发性早期食管癌患者的血清(食管癌组)，以及200例正常人的血清(对照组)。200例早期食管癌患者中，男性100例，女性100例，平均年龄为60.3±8.4岁，年龄范围为38-82岁；200例正常人中，男性100例，女性100例，平均年龄为58.7±9.2岁，年龄范围为35-80岁。所有食管癌患者血清都是在患者最初诊断为早期食管癌并尚未受任何放化疗时收集的，被诊断的时间为2010年1月至2015年12月。正常人血清来自门诊胃镜并经活检病理确诊为非癌或非癌前病变的健康人群。

采用本发明实施例2所述的试剂盒和实施例3所述的检测方法分别对200例早期食管癌患者血清(食管癌组)和200例正常人血清(对照组)中8种肿瘤相关抗原自身抗体的含量进行检测。应用MedCalc软件绘制8种肿瘤相关抗原自身抗体在食管癌组和对照组中的平均表达水平分布图(结果见图2和图3)；以实施例3步骤4中的结果判定标准为标准，分别计算食管癌组和对照组中8种肿瘤相关抗原自身抗体的阳性率(每组中检测出的阳性对象例数除以该组被检测对象总例数即为阳性率)，应用Excel软件绘制8种肿瘤相关抗原的自身抗体在食管癌组和对照组中阳性率的柱形图(结果见图4)。本研究还应用SPSS21.0软件对食管癌组和对照组抗体阳性率进行独立样本卡方检验，检验水准α取0.05，当P＜0.05时，结果具有统计学意义，然后采用筛检试验的评价方法评价自身抗体检测食管癌的诊断价值(结果见表1和图5)。

表1不同肿瘤相关抗原自身抗体组合联合检测结果

图2为8种肿瘤相关抗原自身抗体在食管癌组血清中的分布图，从该图中可以看出，这8种肿瘤相关抗原自身抗体在早期食管鳞癌组中平均表达水平比较高，平均OD值在0.75附近浮动，并且OD值大于2.5的血清也比较多，部分血清的OD值甚至超过了5.0。图3为8种肿瘤相关抗原自身抗体在对照组血清中的分布图，从该图中可以看出，这8种肿瘤相关抗原自身抗体在对照组中平均表达水平比较低，平均OD值为0.15，而且OD值大于0.75的血清非常少。由图2和图3可知，早期食管癌组患者血清中8种TAAs平均水平均明显高于对照组，提示着8种TAAs自身抗体可以用于早期食管癌的筛查。

图4为8种肿瘤相关抗原自身抗体在食管癌组和对照组中的阳性率结果，由图4可知，早期食管癌组患者血清中这8种TAA自身抗体阳性率在25％至48％范围内，而在对照组中的阳性率仅为3％-10％。经统计学检验，这8种肿瘤相关抗原自身抗体在食管癌组中的阳性率均高于对照组。由此证明这8种肿瘤相关抗原自身抗体可以作为早期食管癌诊断检测指标，用于早期食管癌的诊断。

由表1可知，随着抗原组合数目的增加，早期食管癌诊断的灵敏度也随之增加；当8种肿瘤相关抗原组合时，灵敏度高达94％，也就是说早期食管癌患者中应用这8个肿瘤相关抗原进行诊断时被正确的诊断为早期食管癌的比率为94％；随着抗原组合数目的增加，特异度虽有所降低，但8个肿瘤相关抗原进行诊断时特异度仍能达到79％，这一结果表明非食管癌患者用8种肿瘤相关抗原联合检测时，被确定为未患食管癌者的比率为79％。使用这8种肿瘤相关抗原组合对食管癌进行诊断时，其灵敏度为用单一指标P53进行检测的2.35倍，而特异度仅降低了0.105。因此，使用EYA4、ABL1、ATF2、CD38、NOTCH1、ZBTB20、BCL2L1和P53这8种肿瘤相关抗原组合进行早期食管癌诊断，可以在保证诊断特异度的前提下大幅度的提高诊断的灵敏度。此外，约登指数在统计学中是指敏感度和特异度之和减去1，其数值范围是0-1，约登指数越接近于1，其诊断价值越大，表明该方法的应用价值越高。随着抗原数目的增加，约登指数在不断增大且逐渐趋向于1，表明8种肿瘤相关抗原组合用于诊断和筛查早期食管癌的方法具有较好的诊断价值。所以，采用EYA4、ABL1、ATF2、CD38、NOTCH1、ZBTB20、BCL2L1和P53这8种肿瘤相关抗原的自身抗原联合检测待测血清中相应自身抗体表达水平的方法，既能保持较高的特异度又能提高诊断的敏感度，对评估待测对象患食管癌的风险具有很好的诊断和应用价值，是较为理想的早期食管癌的筛查方法和手段。

由图5可知，随着抗原组合数目的增加，ROC曲线下面积由0.648升至0.865，说明使用这8种肿瘤相关抗原自身抗体联合检测ELISA试剂盒对于早期食管癌具有较高的判定正确性和诊断价值，进一步证实了该试剂盒可以作为较理想的早期食管癌的筛查方法和手段。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，但不仅限于上述实例，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.肿瘤相关抗原EYA4、ABL1、ATF2、CD38、NOTCH1、ZBTB20、BCL2L1和P53的组合在制备用于食管癌筛查的试剂盒中的应用。

2.一种用于早期食管癌筛查的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括固相载体和包被于固相载体上的肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关抗原为EYA4、ABL1、ATF2、CD38、NOTCH1、ZBTB20、BCL2L1和P53。

3.根据权利要求2所述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、阳性对照血清、阴性对照血清、显色液、终止液和洗涤液。

4.根据权利要求3所述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述第二抗体带有可检测的标记物。

5.根据权利要求4所述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述标记物为辣根过氧化物酶。

6.根据权利要求3～5任一所述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述第二抗体为RecA蛋白。

7.根据权利要求6所述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述阳性对照血清为P53阳性对照血清，所述阴性对照血清为P53阴性对照血清。

8. 根据权利要求7所述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述P53阳性对照血清是使用间接ELISA和Western blot方法检测P53抗体均为阳性的食管癌患者血清，所述P53阴性对照血清是使用间接ELISA和Western blot方法检测P53抗体表达水平为正常人群血清抗体平均含量的正常人的血清。

9.根据权利要求8所述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述固相载体为酶标板。

10.根据权利要求9所述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，所述自身抗体联合检测ELISA试剂盒的检测对象为人类血清。