CN111308090A - 一种食管癌多联快速检测elisa试剂盒 - Google Patents

一种食管癌多联快速检测elisa试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药生物技术领域，具体公开了一种食管癌多联快速检测ELISA试剂盒，该试剂盒包括固相载体和包被于固相载体上的肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关抗原由MTA2、ATF2、PAR‑2、COX‑2和PCNA组成。进一步地，所述试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、阳性对照血清、阴性对照血清、显色液、终止液和洗涤液。本发明的ELISA试剂盒可以有效检测食管癌，尤其是早期食管癌，其检测灵敏度高达93.3%，特异性达到了82.5%，可用于食管癌高发区无症状人群的大规模筛查，有利于无症状高危人群筛查和早期发现。

Description

一种食管癌多联快速检测ELISA试剂盒
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种食管癌多联快速检测ELISA试剂盒。
背景技术
我国是全球食管癌发病率最高的国家。河南是中国食管癌高发省份，食管癌高发区(发病率＞60/10万)人口超过4371万，占全省人口的41％，分布在11个市，9万多平方公里的区域，占全省面积的55％。河南、河北和山西三省交界的太行山地区，特别是河南的林县、安阳、辉县等地是中国，也是世界上食管癌发病率和死亡率最高的地区。以河南林县地区为中心，随着半径逐渐增大，食管癌的发病率呈明显降低的趋势，例如，与林县相距仅200公里的河南范县，食管癌发病率已由林县地区的160/10万人下降到25/10万人左右。
早期发现是降低食管癌发病率和死亡率的关键；早期发现指的是无症状重度癌前病变患者和早期癌患者。目前，临床上90％的食管癌患者就诊时已属中晚期，导致此结局的主要原因是患者早期无特异症状，缺乏无症状高危人群预警筛查的分子靶标。传统上，“高发区、40岁以上、男性、吸烟、饮酒、家族史阳性的无症状人群”被笼统界定为“食管癌高危或高风险人群”，也是食管癌早期筛查的主要对象。目前，色素内镜和黏膜活检是食管癌早期发现的重要筛查方法。但是，内镜筛查有创伤、成本高且效率低(例如，常规高发区内镜筛查高危人群，早期癌的发现率仅2％左右，约90％以上的无症状高危人群均为“陪伴检查”)，这些限制了内镜筛查在无症状人群中的推广应用。
肿瘤相关抗原(Tumor-associated Antigen，TAA)是与病理生理过程相关的可测量的变化。本研究团队在前期利用全基因组关联分析、全基因组测序和全基因组外显子测序等技术建立的基因组学数据库的基础上，应用自身抗体芯片技术筛选出5种TAA，分别为MTA2、ATF2、PAR-2、COX-2和PCNA，并且发现在食管粘膜鳞状上皮发生癌变之前就能够检测到上述5种TAA的自身抗体存在，这些自身抗体对于食管癌和癌前病变患者具有较高的特异性和敏感性。然而，应用MTA2、ATF2、PAR-2、COX-2和PCNA这5种TAA来检测食管癌患者血清中相应自身抗体的表达并未见报道。因此，本研究提出一种可用于管癌检测的ELISA试剂盒，这将会推动我国食管癌的诊治水平，也为将来对食管癌的进一步研究提供思路。
发明内容
针对现有技术中存在的问题和不足，本发明旨在提供一种食管癌多联快速检测ELISA试剂盒。
为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：
肿瘤相关抗原MTA2、ATF2、PAR-2、COX-2和PCNA的组合在制备用于筛查早期食管癌的自身抗体联合检测ELISA试剂盒中的应用。
一种食管癌多联快速检测ELISA试剂盒，所述试剂盒包括固相载体和包被在固相载体上的肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关抗原由MTA2、ATF2、PAR-2、COX-2和PCNA组成。
根据上述的食管癌多联快速检测ELISA试剂盒，优选地，所述试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、洗涤液、显色液和终止液。更加优选地，所述样品稀释液为含有1％(W/V)BSA的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液；所述第二抗体稀释液为含有1％(W/V)BSA的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液；所述显色液由显色液A和显色液B组成，所述显色液A为0.02％(W/V)TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)，所述显色液B为0.006％(W/V)过氧化脲素；所述终止液为10％的硫酸；洗涤液为含0.05％吐温20的pH7.4的0.01M的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液。
根据上述的食管癌多联快速检测ELISA试剂盒，优选地，所述第二抗体带有可检测的标记物。
根据上述的食管癌多联快速检测ELISA试剂盒，优选地，所述标记物为辣根过氧化物酶。
根据上述的食管癌多联快速检测ELISA试剂盒，优选地，所述第二抗体为RecA蛋白。
根据上述的食管癌多联快速检测ELISA试剂盒，优选地，所述阳性对照血清为PCNA阳性对照血清，所述阴性对照血清为PCNA阴性对照血清。
根据上述的食管癌多联快速检测ELISA试剂盒，优选地，所述PCNA阳性对照血清是使用间接ELISA和Western blot方法检测PCNA抗体均为阳性的食管癌患者血清，所述PCNA阴性对照血清是使用间接ELISA和Western blot方法检测PCNA抗体表达水平为正常人群血清抗体平均含量的正常人的血清。因研究已明确表明PCNA抗原参于食管癌的发生发展，当前大量文献也报道了抗PCNA抗体在食管癌患者血清中具有较高的阳性率。因此为了提高工作效率，本发明选择PCNA抗体阳性血清作为阳性对照。因为阳性对照血清和阴性对照血清是经过精心筛选出来的血清，因此，同一ELISA试剂盒的其他抗原抗体反应的强弱可以据此作为参照，达到质控的目的。
根据上述的食管癌多联快速检测ELISA试剂盒，优选地，所述固相载体为酶标板。更加优选地，所述酶标板为48孔酶标板(共6行8列)，所述48孔酶标板按照精心设计的布局图(参见图1)包被MTA2、ATF2、PAR-2、COX-2和PCNA这5种肿瘤相关抗原，其中每行包被有一种抗原，每种抗原包被于7个点样孔中。同一检测对象的血清样品经过稀释后加入该48孔酶标板的一列，可同时检测出该血清样品中5种抗TAA抗体表达水平，可进行大规模的样品检测。所述48孔酶标板第8列中设有空白对照孔、阳性对照孔和阴性对照孔，所述空白对照孔中包被不含抗原的包被液，所述阳性对照孔和阴性对照孔中均包被PCNA抗原。
根据上述的食管癌多联快速检测ELISA试剂盒，优选地，所述试剂盒的检测对象为人类血清。
与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果为：
(1)本发明首次将MTA2、ATF2、PAR-2、COX-2和PCNA这5种TAA作为一个组合，联合检测人血清中上述5种TAA的抗体表达水平，可以有效检测食管癌，尤其是早期食管癌，其检测灵敏度高达93.3％(即早期食管癌者中应用这5个肿瘤相关抗原进行诊断时被正确的诊断为早期食管癌的比率为93.3％)，特异性(特异度又称真阴性率，即实际无病按该诊断标准被正确的判为无病的百分比，较高的特异性意味着较低的误诊率)达到了82.5％(即非食管癌患者用这5种肿瘤相关抗原联合检测时，被确定为未患食管癌者的比率为82.5％)；因此，本发明试剂盒在将灵敏度提高到93.3％的同时，能够将特异度保持在82.5％，很大程度上提高了早期食管癌的检出率以及正确率，同时也大大降低了早期食管癌的误诊率，极大地提高了早期食管癌诊断的准确度。
(2)本发明试剂盒的检测灵敏度和特异度远高于现有临床内镜筛查食管癌的检出率，可用于食管癌高发区无症状人群的大规模筛查，能够大大提高早期食管癌的检出率，有利于无症状高危人群筛查和早期发现，从而大大降低了食管癌患者的死亡率，为食管癌患者和家庭带来极大的福祉。
(3)本发明制备的ELISA试剂盒可同时检测血清样品中5种TAA抗体的表达水平，与5种TAA抗体的单独检测相比，5种TAA抗体联合检测，检出成功率高，技术重现性好，耗材少，成本低，操作简单，使用方便、快捷，极大地提高了临床食管癌的检测效率和诊断效率，能够在普通实验室推广使用，有很好的应用前景。
(4)本发明的多种自身抗体联合检测ELISA试剂盒使用RecA蛋白做为第二抗体，其可以与抗体结构中的Fc段特异结合，相对于传统的辣根过氧化物酶标记的IgG，以RecA蛋白做为第二抗体具有特异性强、背景值低的特点，能够提高抗体检测的准确率，降低假阳性率。
附图说明
图1为本发明ELISA试剂盒中48孔酶标板的抗原包被布局图(其中，抗原名称代表了该孔包被了此抗原，加入的是待测血清，用来检测待测血清中相应抗体的表达水平；“+”代表阳性对照孔，加入的是阳性对照血清；“-”代表阴性对照孔，加入的是阴性对照血清；“空白”代表空白对照孔，该孔加入不含血清的样本稀释液，其它操作均相同，该空白对照用于反应实验过程中的背景值)。
图2为间接酶联免疫吸附实验原理图。
图3为5种TAA自身抗体在食管癌血清中的分布图。
图4为5种TAA自身抗体在对照组血清中的分布图。
图5为5种TAA自身抗体在食管癌组和对照组中的阳性率结果图。
图6为5种TAA自身抗体检测食管癌的ROC曲线图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明作进一步详细说明，但并不限制本发明的范围。
下列实施例所述的实验方法，如无特殊说明，均为本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂、材料和仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：试剂盒的制备
本发明根据间接酶联免疫法的原理制备了一种用于食管癌多联快速检测ELISA试剂盒。间接酶联免疫法的原理是将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物，再用酶标二抗与固相抗原-受检抗体复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，然后测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量(参见图2)。
1.实验材料及试剂：
(1)5种肿瘤相关抗原蛋白(MTA2、ATF2、PAR-2、COX-2和PCNA)，购买于武汉艾美捷科技有限公司；
(2)48孔酶标板：3590(costar.美国)；
(3)包被液：50mM碳酸盐缓冲液，pH＝9.6；
(4)封闭液：含2％(W/V)BSA的PBST缓冲液；
(5)样品稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；
(6)第二抗体稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；
(7)酶标第二抗体：辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白(Invitrogen公司)；
(8)洗涤液：含0.05％吐温20的PH7.4的0.01M的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液；
(9)阳性对照血清：PCNA阳性对照血清，即使用间接ELISA和Western blot方法检测PCNA抗体均为阳性的食管癌患者血清；
(10)阴性对照血清：PCNA阴性对照血清，即使用间接ELISA和Western blot方法检测PCNA抗体表达水平为正常人群血清抗体平均含量的正常人的血清；
(11)显色液A：0.02％(W/V)TMB，配制：取甲基联苯胺(TMB)0.005g，溶解于25ml去离子水中；
(12)显色液B：0.006％(W/V)过氧化脲素，配制：取柠檬酸4.665g、Na2HPO4 18.40g，充分溶解于400ml去离子水中，加0.75％过氧化氢脲素3.2ml，调整pH值至5.0-5.5，加去离子水定容至终体积500ml，混匀4℃保存；
(13)终止液：10％的硫酸；
(14)酶标仪：Star Fax 2100(Awareness.美国)。
2.制备抗原包被的酶标板：
(1)制备5种肿瘤相关抗原溶液：
将5种肿瘤相关抗原蛋白分别溶解于包被液中，充分混匀，配制成5种不同浓度的抗原溶液。其中，MTA2溶液的浓度为0.125μg/ml，PCNA溶液的浓度为0.25μg/ml，ATF2溶液的浓度为0.5μg/ml，PAR-2溶液的浓度为0.5μg/ml，COX-2溶液的浓度为1.0μg/ml。
(2)包被酶标板：
将制备好的5种肿瘤相关抗原溶液按照图1所示的布局分别加入到48孔酶标板的点样孔中，加样量为100μl/孔；阳性对照孔和阴性对照孔中加入PCNA抗原溶液，空白对照孔加入包被液，37℃恒温培养箱孵育1h，4℃过夜后去除包被液，然后用洗涤液洗涤3次，每次洗涤3min。
(3)封闭：
向包被后的48孔酶标板的点样孔中加入封闭液(加样量为300μl/孔)，室温孵育2小时，然后除去封闭液。
(4)干燥、包装：
将封闭处理后的48孔酶标板放置37℃烘干箱烘干后，包装，得到抗原包被的48孔酶标板，4℃保存备用。
3.本发明试剂盒的组成如下：
(1)步骤2制备的抗原包被的48孔酶标板；
(2)样品稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；
(3)第二抗体稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；
(4)酶标第二抗体：辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白(Invitrogen公司)；
(5)显色液：显色液由显色液A和显色液B组成，其中，显色液A为0.02％(W/V)TMB，显色液B为0.006％(W/V)过氧化脲素；使用时将显色液A和显色液B按照1:1等体积混合均匀；
(6)终止液：10％的硫酸；
(7)洗涤液：含0.05％吐温20的PH7.4的0.01M的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液；
(8)阳性对照血清：PCNA阳性对照血清；
(9)阴性对照血清：PCNA阴性对照血清。
试剂(2)-(9)分别包装后与抗原包被的48孔酶标板构成试剂盒。
实施例2：试剂盒的使用方法
1.血清样本孵育：
将待检测的血清样本用样品稀释液按1:500的比例进行稀释，然后将稀释后的血清样本加入已包被抗原的48孔酶标板的反应孔中，加样量为100μl/孔，置于37℃恒温培养箱孵育1h，然后弃去反应孔中液体，用洗涤液洗涤3次，每次洗涤3min。
2.酶标二抗孵育：
将辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白用第二抗体稀释液按1:40000的比例进行稀释，然后将稀释后的辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白加入48孔酶标板的反应孔中，加样量为100μl/孔，置于37℃恒温培养箱孵育1h，然后弃去点样孔中液体，用洗涤液洗涤3次，每次洗涤3min。
3.显色及终止反应：
将显色液A和显色液B按照1:1等体积混合均匀，然后将混合后的显色液迅速加入48孔酶标板的反应孔中，加样量为100μl/孔，置于37℃避光反应15min，然后向每个反应孔中再加入50μl终止液，终止显色反应，于20分钟内用酶标仪器读取OD450光密度值，并用空白对照孔调零。
4.结果判定：
以阴性对照孔所测OD值的平均数加两个标准差(Mean+2SD)为截断值(cut-off值)，反应孔中OD值读数大于等于截断值的判断为阳性，反应孔中OD值读数小于截断值的判断为阴性。
实施例3：本发明试剂盒的诊断价值分析
用本发明实施例1所述的试剂盒的检测早期食管癌患者和正常人的血清样本，以评估和分析本发明试剂盒用于早期食管癌筛查和诊断的价值。
1.样本来源
收集来自省部共建食管癌防治国家重点实验室240份血清样本，其中正常人血清120份(对照组)，早期食管癌患者血清120份(食管癌组)。120例正常人血清来自该实验室合作医院体检中心的健康体检人群，无任何肿瘤相关的证据。120例正常人中，男性63例，女性57例，平均年龄53.4岁，年龄范围41-72岁。120份早期食管癌患者血清来源于经组织病理学证实的早期(0期+I期)食管癌患者，均未接受放疗或化疗治疗120例食管癌患者中，男性78例，女性42例，平均年龄59.7岁，年龄范围46-83岁。
2.血清制备
抽取空腹静脉血5ml至离心管中，室温中静置30分钟，离心(2000转/min)，吸取上层血清分装，每管100μl，-80℃冰箱储存。
3.实验方法
采用本发明的实施例1制备的试剂盒和实施例2所述的试剂盒的使用方法对120例食管癌患者血清(食管癌组)和120例正常人血清(对照组)中5种肿瘤相关抗原自身抗体的含量进行检测。应用MedCalc软件绘制5种肿瘤相关抗原自身抗体在食管癌组和对照组中的平均表达水平分布图(结果见图3和图4)；以实施例3步骤4中的结果判断标准为标准，分别计算食管癌组和对照组中5种肿瘤相关抗原自身抗体的阳性率(每组中检测出的阳性对象例数除以该组被检测对象总例数即为阳性率)，并应用Excel软件绘制5种肿瘤相关抗原自身抗体在早期食管癌组和对照组中阳性率的柱形图(结果见图5)；应用SPSS22.0软件进行统计学检验，采用两独立样本卡方检验方法比较食管癌组和对照组抗体阳性率，检验水准α＝0.05，当P＜0.05时，结果具有统计学意义，然后采用筛检试验的评价方法评价自身抗体检测食管癌的诊断价值(结果参见表1和图6)。
表1不同肿瘤相关抗原自身抗体组合联合检测结果
Figure BDA0002393639100000081
4.结果分析
图3为5种肿瘤相关抗原自身抗体在食管癌组血清中的分布图，从该图中可以看出，5种肿瘤相关抗原自身抗体在食管癌组中平均表达水平较高，平均OD值在0.3附近浮动，并且OD值大于0.5的血清较多。图4为5种肿瘤相关抗原自身抗体在对照组血清中的分布图，从该图中可以看出，5种肿瘤相关抗原自身抗体在对照组中平均表达水平较低，平均OD值均小于0.25。由图3和图4可知，食管癌组患者血清中5种TAA自身抗体的平均水平均明显高于对照组，说明5种TAA自身抗体可以用于食管癌的诊断。
图5为5种肿瘤相关抗原自身抗体在食管癌组和对照组中的阳性率结果图，由该图可知，早期食管癌组患者血清中这5种TAA自身抗体阳性率在27％～38％范围内，而在对照组中的阳性率均不超过7％。而且，经统计学检验，这5种TAA自身抗体在食管癌组中的阳性率均高于对照组。由此证明，这5种TAA自身抗体可以作为食管癌早期诊断的检测指标，用于食管癌的早期诊断。
由表1可知，随着抗原组合数目的增加，早期食管癌诊断的灵敏度也随之增加；当5种肿瘤相关抗原组合时，灵敏度高达93.3％，也就是说食管癌患者中应用该方法能够正确的诊断为食管癌的比率为93.3％；虽然随着抗原数目的增加，检测特异度逐渐降低，但当5种肿瘤相关抗原组合时，其特异度仍然能够达到82.5％，这一结果表明非食管癌患者采用5种肿瘤相关抗原联合检测时，被正确的诊断为未患食管癌的百分比为82.5％；因此，使用MTA2、ATF2、PAR-2、COX-2和PCNA这5种肿瘤相关抗原组合进行早期食管癌诊断，可以在保证诊断特异度的前提下大幅度的提高诊断的灵敏度。此外，约登指数在统计学中是指敏感度和特异度之和减去1，其数值范围是0～1，约登指数越接近于1，其诊断价值越大，表明该方法的应用价值越高。随着抗原数目的增加，约登指数在不断增大且逐渐趋向于1，表明5种肿瘤相关抗原组合用于诊断和筛查早期食管癌的方法具有较好的诊断价值。因此，采用MTA2、ATF2、PAR-2、COX-2和PCNA这5种肿瘤相关抗原的自身抗原联合检测待测血清中相应自身抗体表达水平的方法，既能保持较高的特异度又能提高诊断的敏感度，对评估待测对象患食管癌的风险具有很好的诊断和应用价值，是较为理想的早期食管癌的筛查方法和手段。
图6为5种肿瘤相关抗原自身抗体检测食管癌的ROC曲线图，由该图可知，采用单一TAA检测时，ROC曲线下面积均较低，最高仅有0.7244(PCNA)；2种肿瘤相关抗原联合检测的ROC曲线下面积为0.8090，3种肿瘤相关抗原联合检测的ROC曲线下面积为0.8360，4种肿瘤相关抗原联合检测的ROC曲线下面积为0.8741，5种肿瘤相关抗原联合检测的ROC曲线下面积达到了最大，为0.9283。由此说明，使用本发明ELISA试剂盒对于食管癌具有较高的判定正确性和较高的诊断价值，进一步证实了本发明ELISA试剂盒是较为理想的食管癌早期诊断和筛查方法和手段。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，但不仅限于上述实例，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.肿瘤相关抗原MTA2、ATF2、PAR-2、COX-2和PCNA的组合在制备用于食管癌检测的试剂盒中的应用。
2.一种食管癌多联快速检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括固相载体和包被在固相载体上的肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关抗原由MTA2、ATF2、PAR-2、COX-2和PCNA组成。
3.根据权利要求2所述的食管癌多联快速检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、洗涤液、显色液和终止液。
4.根据权利要求3所述的食管癌多联快速检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述第二抗体带有可检测的标记物。
5.根据权利要求4所述的食管癌多联快速检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述标记物为辣根过氧化物酶。
6.根据权利要求3～5任一所述的食管癌多联快速检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述第二抗体为RecA蛋白。
7.根据权利要求6所述的食管癌多联快速检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述阳性对照血清为PCNA阳性对照血清，所述阴性对照血清为PCNA阴性对照血清。
8. 根据权利要求7所述的食管癌多联快速检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述PCNA阳性对照血清是使用间接ELISA和Western blot方法检测PCNA抗体均为阳性的食管癌患者血清，所述PCNA阴性对照血清是使用间接ELISA和Western blot方法检测PCNA抗体表达水平为正常人群血清抗体平均含量的正常人的血清。
9.根据权利要求8所述的食管癌多联快速检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述固相载体为酶标板。
10.根据权利要求9所述的食管癌多联快速检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测对象为人类血清。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113030457A (zh) * 2021-02-25 2021-06-25 北京蛋白质组研究中心 Pcna自身抗体在癌症预测、诊断和预后评估中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1955737A (zh) * 2005-10-28 2007-05-02 中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所 用于筛查食管癌癌前病变的蛋白质芯片
CN106053812A (zh) * 2016-06-29 2016-10-26 厦门生迪生物技术有限公司 一种用于肝癌早期筛查和诊断的多种自身抗体联合检测elisa试剂盒
CN110187108A (zh) * 2019-05-31 2019-08-30 郑州大学第一附属医院 一种用于早期食管癌筛查的自身抗体联合检测elisa试剂盒
CN110196329A (zh) * 2019-05-31 2019-09-03 郑州大学第一附属医院 一种食管癌早期联合检测试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1955737A (zh) * 2005-10-28 2007-05-02 中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所 用于筛查食管癌癌前病变的蛋白质芯片
CN106053812A (zh) * 2016-06-29 2016-10-26 厦门生迪生物技术有限公司 一种用于肝癌早期筛查和诊断的多种自身抗体联合检测elisa试剂盒
CN110187108A (zh) * 2019-05-31 2019-08-30 郑州大学第一附属医院 一种用于早期食管癌筛查的自身抗体联合检测elisa试剂盒
CN110196329A (zh) * 2019-05-31 2019-09-03 郑州大学第一附属医院 一种食管癌早期联合检测试剂盒

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YI-WEI XU ,ET AL: "Autoantibodies: Potential clinical applications in early detection of esophageal squamous cell carcinoma and esophagogastric junction adenocarcinoma", 《WORLD J GASTROENTEROL》 *
吕洋和刘博: "食管鳞癌组织MTA2表达与淋巴结转移相关性的探讨", 《中华肿瘤防治杂志》 *
费素娟 等: "食管癌组织中COX-2、p53和PCNA的表达及意义", 《中国癌症杂志》 *
邵颖: "PAR2在食管癌中的表达及胰蛋白酶对EC109细胞增殖移动的影响", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *
高闯: "ATF2在食管癌中的表达和分子机制的初步探索", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113030457A (zh) * 2021-02-25 2021-06-25 北京蛋白质组研究中心 Pcna自身抗体在癌症预测、诊断和预后评估中的应用

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