CN112458061B - 一种抗hpv e6的单克隆抗体及其细胞株和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗HPV E6的单克隆抗体及其细胞株和应用，涉及生物检测技术领域。所述抗HPV E6的单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C2020149或CCTCC NO:C2020153的杂交瘤细胞株分泌得到，本发明还提供所述单克隆抗体在制备HPV E6蛋白检测试剂盒中的应用。本发明提供的单克隆抗体能够与多种HPV类型的E6蛋白结合，特异度强，可用于人HPV E6蛋白检测，提高宫颈癌筛查的特异度，减少漏诊，避免过度诊疗。

Description

一种抗HPV E6的单克隆抗体及其细胞株和应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体为一种抗HPV E6的单克隆抗体及其细胞株和应用。

背景技术

宫颈癌是所有癌症中目前唯一明确病因的癌症，其主要原因为高危型HPV的持续感染。据报道，女性罹患宫颈癌呈逐年上升趋势，宫颈癌已经成为威胁女性健康的重要疾患，由此造成的生活质量的降低以及死亡已经引起世界卫生组织的关注。因此，宫颈癌的早期诊断以及预防显得越来越重要。在一些发达国家，宫颈癌的早期筛查已经普及。其原因归功于巴氏涂片的广泛应用，从而极大地推动了宫颈癌筛查项目的进展，然而该项技术本身存在局限性，影响了临床诊断效果，如所取的细胞量不稳定，诊断结果受取材的影响而不能重复等。近年来随着液基细胞学的临床应用使细胞量不足的问题得到了改善，然而其与巴氏涂片一样要依赖细胞病理学医生的主观判断，而细胞病理学医生的诊断水准不尽一致，从而降低了细胞学诊断的敏感性。并且，由于细胞学形态异常改变发生比较晚，不能早期预示病变情况，制约了其早期诊断意义。基于以上种种因素，HPV的检测就成为了宫颈癌早期筛查的切入点，这也被国内外同行所认可。

随着HPV HC2方法的普及，其高的检测敏感性以及检测的稳定性使之成为美国FDA认证的检测的金标准，其对宫颈癌的筛查起到了不可替代的作用。然而，由于HPV存在的普遍性和的终生累计感染风险已经达到了80%， 使得该方法对宫颈病变诊断的特异性降低。有很多报道显示，其检测的特异性较低，容易引起假阳性，其结果往往会给临床医生进一步治疗带来困惑，相当一部分医师会采取过度的治疗方式，这样会给病人的身体和心理带来许多的伤害。特异性不高的根本原因在于感染普遍性，以及感染后有一过性消除的特点，检测阳性结果只能证明曾经有过的感染，目前体内是否已经清除病毒，是否持续感染，这些并不能得到证实。即使病毒依然存在于体内，其是否整合入宿主基因中，是否会导致上皮内病变，是否有活性的复制与转录，都无法从的实验结果中判读出来，因而方法也存在局限性。在这样的前提下，检测是否能够成为一个新的生物标记，其所检测的是否可以反映当前体内病毒的活性情况，从而对临床起到更大指导意义成为一个值得探讨的问题。

环状HPV基因组包括七个早期区和两个晚期区，其中，由E6、E7基因编码的致癌蛋白是导致宫颈上皮癌变的重要因子。在HPV感染的最初阶段，HPV病毒会随着细胞凋亡而被清除，但若HPV病毒持续感染，可能会导致病毒随机将E6E7基因整合入宿主细胞中，进而引起E6/E7癌蛋白的过度表达。

E6癌蛋白通过E6AP复合物与细胞凋亡因子p53结合，使p53降解，导致细胞凋亡程序失控，因此， E6癌蛋白是宫颈上皮癌变的最重要的生物标志物，与晚期肿瘤有密切关系。

2015年CFDA批准的Aptima HPV E6 mRNA检测是E6作为宫颈癌筛查特异性生物标志物应用的重要里程碑。然而，mRNA体内易于降解，其检测需要昂贵的仪器、严格的实验室环境及繁琐的程序，因此基于E6 mRNA检测的测试可能在常规妇科实践中具有有限的临床应用。 而基于E6或E6蛋白检测的试剂将比检测HPV DNA或HPV E6 mRNA具有优势，而目前市面上仅有针对HPV 16，18等几种HPV类型的E6蛋白检测试剂，并不能满足宫颈癌筛查的需求。

因此，有必要研究一种新的HPV E6蛋白检测试剂盒，满足多种HPV类型同时检测的同时，提高宫颈癌筛查的特异度，减少漏诊，避免过度诊疗。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种HPV E6蛋白检测试剂盒，能够同时检测多种HPV类型的E6蛋白检测试剂盒，提高宫颈癌筛查的特异度，减少漏诊，避免过度诊疗。

为实现上述目的，本发明提供了一种可分泌抗HPV E6单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为CCTCC NO:C2020149或CCTCC NO:C2020153。

本发明还有一个目的在于，提供了一种抗HPV E6单克隆抗体，由如上所述的杂交瘤细胞株产生。

本发明还有一个目的在于，提供了所述单克隆抗体在制备HPV E6蛋白检测试剂盒中的应用。

本发明还有一个目的在于，提供一种HPV E6蛋白检测试剂盒，其特征在于，包括抗HPV E6单克隆抗体，质控片、样本稀释液；所述单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C2020149或保藏号为CCTCC NO:C2020153的杂交瘤细胞株产生。

进一步地，所述抗HPV E6单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C2020153的杂交瘤细胞株产生。

进一步地，所述样本稀释液包括三(2-羧乙基)膦盐酸盐和Tris缓冲液。

进一步地，所述二抗检测系统为SP法检测系统，采用生物素标记羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG，优选羊抗鼠IgG。

进一步地，所述质控片包括阳性质控片和阴性质控片，所述阳性质控片通过细胞保护液将阴性细胞和阳性细胞固定在载玻片，装入玻片盒中真空封装；质控片使用的阳性细胞为HPV感染的宫颈癌细胞系CaSki，SiHa，HeLa,MS751中的一种，优选为CaSki，阴性质控片为HPV阴性的宫颈癌细胞系C-33A。

本发明另外还提供了所述HPV E6蛋白检测试剂盒在检测HPV类型E6蛋白中的应用。

其中，所述HPV类型包括高危型及低危型；所述高危型包括HPV-16，HPV-18，HPV-31，HPV-33，HPV-35 ，HPV-39，HPV-45，HPV-51，HPV-52，HPV-56，HPV-58，HPV-59和HPV-68；所述低危型包括HPV-6，HPV-11，HPV-42，HPV- HPV-44，HPV-53，HPV-54，HPV-55和HPV-56。

与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：

1. 本发明提供抗HPV E6单克隆抗体用于试剂盒检测宫颈上皮内瘤变（CIN2及以上）灵敏度高，特异性强，稳定性好，与现有市场上采用单个亚型的HPV E6蛋白检测试剂相比有很大的优势，可大大提高试剂盒的灵敏度；

2. 本发明提供的试剂盒首次在试剂盒中加入样本处理液，克服样本中大部分含有组织粘液等物质的干扰，使样本检测前能够分散，减少非特异性染色，更有利于后续的样本结果判断；

3. 本发明提供的试剂盒二抗系统采用的物素标记羊抗鼠IgG仅识别小鼠IgG的Fc段，并与人IgG，牛IgG，马IgG无交叉反应，更有利于减少样本的非特异性染色；

4. 试剂盒中加入细胞质控片，保证每批次检测可控。

附图说明

图1为本发明提供的试剂盒质控片检测显色示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的检测原理：利用免疫学抗原抗体分子由于结构的互补和彼此亲和性所发生特异性结合原理，并通过氧化还原化学反应使标记抗体的酶显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性。首先是联结鼠抗人HPV E6单克隆抗体和细胞上的 HPV E6 抗原； 第二，生物素标记羊抗小鼠 IgG 识别已经连接上的 HPV E6抗体； 第三，加入过氧化物酶标记的链霉亲和素，识别生物素；第四，加入底物，聚合物上的辣根过氧化物酶部分可以催化 DAB 显色液中的 H₂O₂ 分解，使联苯胺氧化变成联苯亚胺，使细胞沉降片中抗原位点上出现黄色或棕黄色着色；最后对样本进行复染和封片。通过显微镜观测显色情况，推断细胞沉降片上 HPV E6 蛋白的存在位点和情况。

基于以上原理，我们首先筛选出特异性的抗人HPV E6单克隆抗体，然后使用免疫细胞化学的方法检测宫颈脱落细胞样本，本发明所涉及的HPV感染宫颈脱落细胞样本为志愿者病例。

以下结合实施例对本发明作进一步说明，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。下列实施例中未特别说明的具体条件的实验方法是按常规实验方法。

实施例1 抗人HPV E6单克隆抗体筛选

使用HPV16 E6或HPV18 E6按照正常的免疫程序免疫BALB/C小鼠后（本公司专利US8865162），检测小鼠血清效价，当血清效价达到最佳状态时，按照标准的杂交瘤细胞融合程序生产筛选单克隆杂交瘤细胞，将筛选出的单克隆细胞株同时使用HPV16 E6和HPV18 E6筛选细胞上清，选择双项阳性的单克隆细胞株进行扩培，选择抗体效价高，细胞状态好的4株单克隆细胞株（根据筛选先后顺序分别命名为Mab1，Mab2，Mab13，Mab14）按照标准的单克隆细胞株生产腹水，收集的腹水按照标准的抗体纯化程序使用ProteinG纯化。

将上述所述分泌得到的抗体使用抗体稀释液（10mM PBS，4% BSA，0.05%吐温-20）稀释至4μg/ml，分别检测Caski，C-33A，及10例样本。检测结果如表1所示。

表1：

根据以上结果发现，Mab14所得抗体检测有非特异性显色，Mab13所得特异性显色较弱， Mab1和Mab2显色基本一致，但Mab1所得抗体会引起某些样本白细胞显色，但不影响最终结果的判断，因此这两个细胞株分泌得到的抗体择其一可作为本发明试剂盒的一抗试剂；因Mab1所得抗体会引起某些样本白细胞显色，故优选Mab2所得抗体作为本发明试剂盒的一抗试剂。两株细胞株于2020年08月24日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏。Mab1提交保藏信息为，培养物名称（分类命名）：杂交瘤细胞株P2B2-1-D4-1G4，保藏编号：CCTCC NO:C2020149。Mab2提交保藏信息为，培养物名称（分类命名）：杂交瘤细胞株P1B7-2-D8-1F10，保藏编号为：CCTCC NO:C2020153。

实施例2 阳性质控片和阴性质控片制作

1）细胞复苏与传代：将CaSki，HeLa（也可以选择SiHa和MS751制作阳性质控片）与C-33A复苏后传代，待细胞达到所需要的细胞量后，胰蛋白酶消化后离心；

2）细胞固定：将上述细胞沉淀加入细胞保存液（HEER，I型）中混匀，2~8度固定2小时以上；

3）沉降：取适量上述固定后的细胞离心，加入缓冲液（Tris，pH8.0）混匀，在10mm套管中沉降15分钟；

4）细胞固定保护：将上述沉降后的玻片在细胞保护液（1%PEG，50%乙醇）中固定30分钟；

5）干燥：将上述固定后玻片放入干燥箱中干燥过夜，之后放入玻片盒中真空包装。

按照上述方法制作的质控片按照试剂盒检测流程检测与新鲜细胞显色一致，如图1所示（图1A为CaSki，20×，图1B为C-33A，20×），该质控片2~8℃可保存6个月，完全可以满足临床质控需求。

实施例3 Mab2检测试剂盒的制备

用于检测HPV E6蛋白的试剂盒，包括如上实施例1中所述的抗HPV E6单克隆抗体，实施例2中的阴阳质控片，以及样本稀释液和二抗检测系统。

样本稀释液为20mM Tris缓冲液，质量浓度3%的 TCEP·4HCl。

一抗试剂为Mab2抗体按照1:200稀释，稀释液为4%牛血清白蛋白，10mM PBS缓冲液。

二抗检测系统包括封闭液（1%山羊血清，5%牛血清白蛋白，10mM PBS），生物素标记羊抗鼠IgG试剂（1:1000稀释，稀释液为1%山羊血清，5%牛血清白蛋白，10 mM PBS），过氧化物酶标记链霉亲和素试剂（1:500稀释，稀释液同封闭液），DAB显色剂A液（0.1%吐温20，0.05%过氧化脲，20mM咪唑），DAB显色剂B液（1% DAB，10mM PBS）。

实施例4 Mab1检测试剂盒的制备

用于检测HPV E6蛋白的试剂盒，包括如上实施例1中所述的抗HPV E6单克隆抗体，实施例2中的阴阳质控片，以及样本稀释液和二抗检测系统。

样本稀释液为20mM Tris缓冲液，质量浓度1%的TCEP·4HCl。

一抗试剂为Mab1抗体按照1:100稀释，稀释液为4%牛血清白蛋白，10mM PBS缓冲液。

二抗检测系统包括封闭液（1%山羊血清，5%牛血清白蛋白，10mM PBS），生物素标记羊抗鼠IgG试剂（1:1000稀释，稀释液为1%山羊血清，5%牛血清白蛋白，10 mM PBS），过氧化物酶标记链霉亲和素试剂（1:500稀释，稀释液同封闭液），DAB显色剂A液（0.1%吐温20，0.05%过氧化脲，20mM咪唑），DAB显色剂B液（1% DAB，10mM PBS）。

实验例1.用本发明试剂盒检测宫颈脱落细胞

使用实施例3、4中制备的试剂盒进行检测，具体如下：

1. 检测所需仪器、设备：

卧式染缸、移液器、免疫组化油笔、计时器、孵育盒、染色架、盖玻片、光学显微镜（10×~40×）、制片板、洗瓶、载玻片、10mm套管、离心机、恒温水浴培养箱、冰箱。

2. 溶液配制：

PBS溶液、PBST溶液参见各产品说明书；DAB显色液的配制： DAB显色液需要在使用前30分钟内配制。配制方法：在配备的小试管中依次加入DAB显色剂A液1mL、 DAB显色剂B液40μL；配置好的DAB显色液混匀后避光存放，30分钟内有效。

3. 实验室温度条件： 22℃~28℃。

4. 试验步骤：

1）取适量细胞离心去上清，加次缓500μL重悬（对于粘液类标本可用样本稀释液Ⅲ型处理后再进行沉降）。

2）于10mm卡好套管中沉降15分钟。

3）沉降结束后用50%乙醇清洗两遍，取下套管（实验各步骤避免玻片细胞干燥）。

4）将沉降好的细胞玻片放入卧式染缸中，用PBS溶液清洗5分钟×2次。

5）弃去PBS溶液，95%酒精固定10分钟。

6）阻断内源性过氧化物酶：弃去PBS溶液，加入内源性过氧化物酶阻断剂，室温下阻断10分钟。PBS溶液清洗5分钟×3次。

7）加入封闭液：弃去PBS溶液，在油笔圈定的待测细胞区域内加150μl封闭液，37℃恒温箱温育1小时。

8）加入一抗试剂：弃去封闭液，加入150μL一抗试剂后4℃冰箱放置过夜（12-16小时）。

9）弃去抗体液体，PBST溶液清洗5分钟×3次。

10）加入生物素标记物：弃去清洗液，加入150μL生物素标记羊抗鼠IgG，室温或25℃恒温箱温育15分钟，PBST溶液清洗5分钟×3次。

11）加入酶标记链霉亲和素：弃去清洗液，加入150μLHRP酶标记链霉亲和素，室温或25℃恒温箱温育15分钟，PBST溶液清洗5分钟×3次。

12）显色：除去清洗液，加150μL新鲜配制的DAB显色液，孵育5-10分钟，光镜观察染色结果一般不超过10分钟。（低温影响显色，可将孵育湿盒提前预热）。

13）复染：将细胞片放入染色架，自来水冲洗4分钟后，浸入苏木素染色液中3分钟，自来水冲洗3分钟，然后浸入盐酸酒精溶液5-15秒后取出，次缓冲液浸泡1分钟，自来水冲洗3-4分钟。

14）脱水、透明、封片。

5. 结果判断：

该染色液会在相应的抗原存在区域沉淀，出现棕黄色物质。染色结果要由有资质的病理医生在生物显微镜下对染色后切片进行观察并进行判断。

实验例2.试剂盒灵敏度和特异度测定

使用实施例3，4中的试剂盒，按照实验例1的检测方法检测300例宫颈脱落细胞样本，其中有109例样本追踪到活检结果，以活检结果为金标准，这些样本同时使用市售HPVDNA检测试剂检测HPV DNA，计算本发明试剂盒灵敏度和特异度。

检测结果如表2-4所示。

表2：Mab2抗体试剂盒灵敏度和特异度

	E6+	E6-	灵敏度	特异度
					CIN2+	32	3	91%
CIN2-	20	54		73%

表3：Mab1抗体试剂盒灵敏度和特异度

	E6+	E6-	灵敏度	特异度
					CIN2+	33	2	94%
CIN2-	22	52		70%

表4：市售HPV DNA试剂盒灵敏度和特异度

	HPV DNA +	HPV DNA-	灵敏度	特异度
					CIN2+	34	1	97%
CIN2-	52	22		30%

由以上数据可得，本发明实施例3试剂盒灵敏度和特异度分别为91%和73%（表2），实施例4试剂盒的灵敏度和特异度分别为94%和70%（表3）。相比于现有宫颈癌筛查试剂HPVDNA检测（表4），灵敏度略低，特异度提高近1.5倍，在临床应用上大幅度减少了过度诊疗。

本发明并不仅仅限于说明书和实施方式中所描述，因此对于熟悉领域的人员而言可容易地实现另外的优点和改进，故在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念的精神和范围的情况下，本发明并不限于特定的细节、代表性的方案和这里示出与描述的图示示例。

Claims (9)

1.一种可分泌抗HPV E6单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C2020149或CCTCC NO:C2020153。

2.一种抗HPV E6单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的杂交瘤细胞株产生。

3.权利要求2所述单克隆抗体在制备HPV E6蛋白检测试剂盒中的应用。

4.一种HPV E6蛋白检测试剂盒，其特征在于，包括质控片、样本稀释液和二抗检测系统，以及抗HPV E6单克隆抗体；所述单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C2020149或CCTCCNO:C2020153的杂交瘤细胞株产生。

5.根据权利要求4所述的HPV E6蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述二抗检测系统为SP法检测系统，采用生物素标记羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG。

6.根据权利要求4所述的HPV E6蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述二抗检测系统采用生物素标记羊抗鼠IgG。

7.根据权利要求4所述的HPV E6蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液包括三(2-羧乙基)膦盐酸盐和Tris缓冲液。

8.根据权利要求4所述的HPV E6蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述质控片包括阳性质控片和阴性质控片；所述阳性质控片使用细胞为CaSki、SiHa、HeLa或MS751中的一种，阴性质控片为HPV阴性的宫颈癌细胞系C-33A。

9.根据权利要求8所述的HPV E6蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述阳性质控片使用的细胞为CaSki。

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