TWI497075B - 早期及晚期人類乳突病毒感染之偵測 - Google Patents

Description

早期及晚期人類乳突病毒感染之偵測 本項發明應用相關參照

此專利應用範圍受利於美國臨時專利申請序號61/131,991，2008年6月13號提交，和美國臨時專利申請序號61/192,912，2008年9月22日提交。每一上述相關之專利申請，在此以提及方式納入。

本案係關於人類乳突瘤病毒早期及晚期感染之免疫分析試驗。

先前技術中似仍存有缺失。

本項發明主體提供各式免疫試驗原位偵測HPV蛋白，利用各式單株抗體抗HPV重組蛋白，感染高風險或低風險HPV病毒型，可被單一特異性單株抗體或一般泛抗體偵測到。在一實施案例中，一方法用來偵測人體HPV感染，利用一種或多種能與HPV早期蛋白產生鍵結之單株抗體，進行臨床人類檢體之免疫試驗和人體細胞核染色。在另一實施案例中，一方法用來偵測人體HPV感染，利用一種或多種抗體，產生多種純化後HPV重組蛋白，對臨床檢體之人體細胞進行免疫組織化學試驗，並比較細胞核與細胞質之染色。另一偵測人體HPV感染方法，利用多種抗體與篩選自E6,E7,L1及其結合蛋白之HPV病毒蛋白產生鍵結，進行臨床 人類檢體之免疫試驗，並以兩種以上抗體比較人體細胞染色情形，若至少一種以上抗體試驗呈陽性染色結果，則表示人體受HPV病毒感染。

在一面項中，本發明提供一抗-HPV單株抗體，能應用於一免疫試驗中，對HPV晚期感染之人類細胞進行細胞質染色。在另一面項中，本發明提供一抗-HPV E7單株抗體和抗--HPV E6單株抗體，能應用於一免疫試驗中，對人類細胞進行細胞核染色，以表示在疾病階段中之HPV感染。HPV感染之人體細胞的細胞核染色，指出HPV之早期感染，而細胞質之染色，則指出病變增生成為晚期疾病階段。使用於免疫試驗之抗-HPV單株抗體包括，抗-HPV E7、抗-HPV E6和抗-HPV L1單株抗體，以及其結合。在另一面項中，本發明提供一抗-HPV E7單株抗體和HPV E7蛋白，作為生物標記，用以偵測子宮頸癌之增生。

此外，本發明提供多種免疫試驗之實施方法，包括免疫組織化學和免疫細胞學試驗分析。單株抗體對HPV病毒蛋白具有高度專一性，亦可作為HPV偵測之免疫試驗。在一實施案例中，以抗-HPV單株抗體對上皮組織樣本的細胞核染色，可顯示一般HPV之感染。在另一實施案例中，以抗-HPV單株抗體對上皮組織樣本之細胞質染色，可顯示HPV感染之病變增生。

在另一面項中，提供臨床檢體免疫試驗之試劑，包含抗-HPV單株抗體能對HPV感染之人類細胞之細胞核進行染色，顯示HPV之感染；對HPV感染之人類細胞之細胞質進行染色，則顯示HPV晚期疾病階段之感染。在一面項中，人體HPV感染之偵測試劑，包含一抗-HPV單株抗體，用於人類臨床檢體中進行免疫試驗，能 對來自臨床之人體細胞進行細胞核染色，並與人體細胞之細胞質染色做比較。

本發明提供各式免疫試驗，用以原位偵測HPV蛋白，利用各種單株抗體，對抗HPV重組蛋白，感染高風險或低風險HPV病毒型，可被單一特異性單株抗體或一般泛抗體偵測到。本發明亦提供HPV免疫細胞化學(ICC)試驗、HPV流氏細胞試驗和HPV免疫組織化學試驗(IHC)，偵測子宮頸細胞或組織中HPV蛋白之存在。此外，單株抗體對HPV病毒蛋白具有高度專一性，可用於HPV ICC或HPV流氏細胞試驗。

在一實施案例中，一免疫細胞學試驗方法用來偵測人體HPV感染，原位偵測試片上含有人類細胞薄層之生物檢體中，來自多種HPV病毒型之HPV蛋白，利用多種抗體對人類細胞薄層進行染色。方法包含提供來自人體之臨床檢體，將檢體製作成型態不正常和正常之人類細胞混合物，將混合物於試片上製成細胞薄層，以一種或多種抗體，產生抗多種純化後HPV重組蛋白，進行免疫細胞化學試驗，試片上臨床檢體中的不正常和正常形態細胞混合物中，來自多種HPV病毒型之多種HPV蛋白可原位被染色。

在另一實施案例中，提供偵測人體HPV感染之方法，包括提供人類臨床檢體，並標記上多種抗體作為試劑，將檢體製成含有型態不正常和正常人類細胞混合物之溶液。利用多種抗體產生抗多種純化後HPV重組蛋白，對型態不正常和正常人類細胞混合物進行染色。該方法進一部包含進行多樣流氏細胞試驗，由型態不正常和正常人類細胞混合物中分離每一細胞以進行偵測，偵測液態臨床檢體型態不正常和正常人類細胞混合物中，多種HPV病毒型之HPV蛋白之存在。

在一實施案例中，產生一或多種抗體，抗多種純化後HPV重組蛋白，至少一種抗體可辨識HPV早期蛋白。在另一實施案例中，多種抗體以試劑進行標記，將人體生物樣本中之多種人類細胞製備成溶液，各式抗體與來自各種HPV病毒型之HPV蛋白產生鍵結，與被標記的抗體反應，藉由試劑的表現被偵測到。在另一實施案例中，試劑包括比色試劑、螢光染色試劑和其他試劑，作為流氏細胞試驗中人類細胞分離和定性之試劑。

此外，提供一進行免疫試驗之試劑。該試劑包含前-抗體終止溶液、後-抗體終止溶液、抗-HPV抗體作為一級抗體、抗-老鼠或抗-兔子免疫球蛋白接枝HRP或生物素、或其他作為二級抗體之試劑，含有適當試劑之溶液作為二級抗體之基質被偵測。

在另一實施案例中，提供試劑偵測人體HPV感染，包含抗-HPV單株抗體，能與HPV早期蛋白產生鍵結，進行臨床檢體之免疫細胞化學試驗，將檢體製成含有型態不正常和正常人類細胞之混合溶液，並於試片上製成薄層細胞，用以原位染色其中多種來自HPV各式病毒型之HPV蛋白。

本發明提供多種固態表面免疫試驗，用以偵測HPV蛋白，利用各式抗-HPV抗體，抗HPV重組蛋白，高風險或低風險型HPV可藉由單一具專一性之單株抗體或一般泛抗體被偵測。本發明亦提供HPV膜點墨試驗、蛋白質晶片微陣列試驗、HPV微粒試驗、HPV測流快速試驗、HPV垂直通透快速試驗、HPV微流體快速試驗、直接酵素免疫試驗(EIA)和酵素連結免疫吸附試驗(ELISA)，偵測生物檢體如子宮頸細胞或組織中HPV蛋白之存在。此外，亦提供進行這些試驗的試劑和設備。

在一實施案例中，提供一方法偵測多種HPV蛋白，提供一抗-HPV抗體，能與臨床檢體中來自各種HPV病毒型之多種HPV蛋白產生鍵結，提供一固體表面，披覆抗-HPV抗體或表現於細胞裂解物溶液中的病毒蛋白；將臨床檢體製程細胞裂解溶液，其中含有多種HPV蛋白。方法進一步包含抗-HPV抗體與細胞裂解物溶液進行反應，形成一含有多種HPV蛋白與抗-HPV抗體複合物之固態試片，偵測試片上的複合物，確認臨床檢體中HPV蛋白之表現。

在另一實施案例中，提供一方法偵測生物樣本中，來自不同HPV病毒型的多種HPV蛋白之存在，並提供生物樣本製成細胞裂解溶液，提供抗-HPV一級抗體固定於固態表面，與細胞裂解溶液中的抗-HPV二級抗體進行反應。兩者抗體能與來自多種HPV病毒型之HPV蛋白產生鍵結。方法進一步包括在固態表面形成多種HPV蛋白與抗-HPV一級、二級抗體之複合物，藉偵測固態表面上複合物的形成，可偵測生物樣本中多種HPV蛋白之表現。

此外，依據本發明一實施案例，提供一側流系統，可偵測生物樣本中來自不同HPV病毒型之多種HPV蛋白。側流系統包含固定有抗-HPV一級抗體之固態一級表面，和另一端含有抗-HPV二級抗體之固態二級表面，與生物樣本製成的細胞裂解溶液進行反應，以側流經過固態表面，與抗-HPV一級抗體形成複合物。在另一實施案例中，提供一垂直快速測試系統，可偵測生物樣本中來自不同HPV病毒型之多種HPV蛋白。垂直快速測試系統包含一固定有抗-HPV一級抗體之固態膜表面，與生物樣本製成的細胞裂解溶液進行反應，以及加入抗-HPV二級抗體垂直流經固態表面，在膜表面上與抗-HPV一級抗體形成複合物。

在一面項中，產生抗-HPV一級抗體，抗多種帶有各式HPV病毒基因之重組蛋白，該抗-HPV一級抗體可捕捉固態表面上，細胞裂解溶液中的多種HPV蛋白。在另一面項中，產生抗-HPV二級抗體，抗帶有相同HPV病毒基因之相同第一重組蛋白，該抗-HPV二級抗體能與固態表面上，細胞裂解溶液中的多種HPV蛋白產生鍵結並進行偵測。

1.表現、純化並製備HPV重組蛋白，作為免疫原，產生抗血清及抗-HPV抗體，以融合瘤細胞株進行篩選形成單株抗體。

HPV重組蛋白可為任何HPV蛋白及早期或晚期基因之HPV蛋白，包括但不僅限於E2,E6,E7,L1及L2，且可形成多種HPV病毒型。E6,E7及L1之全段多肽序列，不僅難以被獲得，且蛋白純化時產生非預期之聚集現象，造成蛋白質不穩定和低度表現，且純化後之蛋白免疫原表現量低。例如，許多早期E6原致癌蛋白包含許多半胱氨酸，因而正確的E6原致癌蛋白拓墣圖需要許多適切的雙硫鍵之形成。此外，某些免疫學試驗使用早期E6和E7蛋白之小分子胜肽，其偵測特異性和敏感度極低，且不適合作為臨床活體診斷之工具。因此，本專利發明提供之重組蛋白，重組HPV原致癌蛋白之部分序列或全段續列，形成重組雜交蛋白。

1).各式帶有HPV16 E6和HPV18 E6基因的重組蛋白之選殖和產生。一來自HPV範例病毒型HPV-16之E6早期原致癌範例基因被選殖，此選殖基因具有474個鹼基對(b.p.)之DNA片段，包含全部HPV-16 E6基因之157種胺基酸編碼區，經聚合酶鏈鎖反應(PCR)獲得並加以擴增。分離出的DNA片段之DNA序列 經由與基因銀行資料庫的比對進行確認。重組蛋白HPV-18 E6亦可被獲得。所有選殖步驟依據”分子選殖”，實驗室手冊，Sambrook,Fritsch and Maniatis,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989.一書所描述之方法。此外，HPV18 E6基因亦被選殖及確認DNA序列。

2).各式帶有HPV16 E7和HPV18 E7基因的重組蛋白之選殖和產生。一來自HPV範例病毒型HPV-16之早期原致癌範例基因E7被選殖，此選殖基因具有294個鹼基對(b.p.)之DNA片段，包含全部HPV-16 E7基因之99種胺基酸編碼區，經聚合酶鏈鎖反應(PCR)獲得並加以擴增。分離出的DNA片段之DNA序列經由與基因銀行資料庫的比對進行確認。HPV-18 E7重組蛋白亦被獲得。此外，來自不同HPV病毒型的E7 DNA片段，可由不同臨床檢體或來源被選殖。

3).帶有HPV16 L1和HPV18 L1基因的重組蛋白之選殖和產生。一來自HPV範例病毒型HPV-16之早期範例基因被選殖，1596個鹼基對(b.p.)之DNA片段，包含全部HPV-16 L1基因之531種胺基酸編碼區，經聚合酶鏈鎖反應(PCR)獲得並加以擴增。分離出的DNA片段之DNA序列經由與基因銀行資料庫的比對進行確認。此外，來自不同HPV病毒型的L1DNA片段，可由不同臨床檢體或來源被選殖。

由His-標記表現系統獲得HPV16 L1蛋白之N端重組片段。HPV-16 L1 N端重組蛋白之分子量約為34 KD。L1 C端片段亦可被獲得。HPV-18 L1重組蛋白也能被獲得，做為免疫原產生抗血清、多株抗體和單株抗體。

此專利描述之多種重組蛋白可表現於各種合適之系統中，諸如細菌、病毒、酵母菌和哺乳類表現系統，如大腸桿菌、酵母菌、桿狀病毒和哺乳類之細胞培養等。雖多胜肽可由其他方式獲得，專利提供之實施案例中，多種重組蛋白大部分(或幾乎)為其原始型式，此構型在免疫分析試驗中，更有可能與來自HPV感染人體組織之抗體產生鍵結。例如，GST,MBP或His標誌-HPV16-E6,HPV18 E6,HPV16 E7,HPV18 E7,HPV16 L1，和HPV18 L1重組蛋白，利用IPTG驅動誘導，在E.coli BL21(DE3)中被表現。誘導蛋白質表現後，標誌-HPV重組蛋白經由培養細胞裂解後溶解部分被獲得，並純化至濃度約為0.1到1mg/ml或更高。HPV重組蛋白之純度，經PAGE分析，預估大於90%。HPV重組蛋白可用以偵測臨床檢體中HPV抗體之存在與否，也可做為免疫原製造多株抗血清和單株抗體。

此專利描述之各式表現載體的細胞培養包含多種HPV重組蛋白，放大至1L,10L或100L甚至更高，以獲得大量可溶的重組蛋白進行純化。細胞裂解後可溶解部分，通過各式層析管柱，在適當的表現系統中與HPV重組蛋白之標記位置鍵結；標誌-HPV重組蛋白在由管柱中被沖提出來，濃縮至100ml,10ml或1ml。純化後的水溶性HPV重組蛋白進一步以中性pH值緩衝液或PBS緩衝液濃縮和透析，作為免疫原產生抗HPV蛋白之抗血清。由溶解部份純化出的水溶性HPV重組蛋白，摺疊方式與其在活體狀態下原始摺疊方式相似。

生產各種不同型式之單株抗體，獲得高品質的純化後HPV重組蛋白是很重要的，抗體能辨識一般或特殊的抗原決定位，用以偵測HPV感染。純化後HPV重組蛋白，經由測試確認與來自臨床HPV感染檢體之HPV抗體的鍵結能力。該純化後之HPV重組 蛋白可作為免疫原產生抗血清和抗體，在活體中辨識HPV自然病毒蛋白。

2.生產抗HPV多株抗體：

純化E coli中表現之HPV E6,E7或L1重組蛋白，以PBS濃縮透析後作為免疫原。免疫反應按照標準程序進行，以ELISA分析每一獲得之血清，接著程序性增加及出血。收集滴定度最佳之血液，產生之血清經由蛋白質A管柱或親合性管柱進行免疫球蛋白(Ig)之純化；純化後之IgG作為HPV免疫針測分析之抗HPV抗體。

此專利發明描述的單株抗體、多株抗體和血清之獲得、純化和試驗，無論致病原因、細胞病灶、發炎反應或癌症之發展情況，可用以偵測HPV感染。其他研究者嘗試發展抗HPV單株抗體卻未得成果，因未能得到足夠之HPV蛋白來產生單株抗體；無法產生高度專一性之單株抗體，因免疫原不具免疫抗原性；或產生之抗體無法辨識臨床檢體早期HPV感染之HPV原始病毒型式。一些抗體產生抗突變之胜肽，僅能辨識晚期子宮頸癌，但不確定其抗體辨識HPV野型之自然蛋白或任何早期HPV感染。此外，晚期HPV之偵測對疾病介入和治療已太遲。

此專利發明所描述之臨床抗體應用，可藉適當之臨床檢體經HPV免疫偵測分析被證實，如ELISA試驗、免疫細胞化學試驗、免疫組織化學試驗。本發明之新型單株抗體和抗血清獲得方法，可與具有早期細胞病灶，如子宮頸上皮內贅瘤(CIN)和晚期HPV相關之子宮頸癌，之臨床檢體的HPV病毒蛋白反應並產生鍵結。此單株抗體和抗血清，為HPV相關致病原和早期晚期子宮頸癌發 展之偵測和篩選，提供了強而有利的偵測工具，因此提供疾病發展之介入和早期治療之管道。

3.發展抗HPV單株抗體：

純化在E coli表現之HPV E6,E7或L1重組蛋白，以PBS濃縮和透析後作為免疫原。小鼠之免疫反應測試按照標準程序進行，以ELISA分析滴定每一獲得之血清，接著程序性增加及出血。當小鼠之血清達最佳化時，以標準步驟融合小鼠之脾細胞和腫瘤細胞。選殖融合細胞，如融合瘤細胞，並進一步進行培養。

1).融合瘤細胞篩選：為獲得本專利所描述對各種HPV蛋白具有專一性鍵結能力之HPV抗體產生性融合瘤細胞，藉由篩選各種原始免疫原和其他HPV蛋白作為正向篩選，非相關性的蛋白則作為負向篩選，以進行融合瘤細胞選殖。例如，兩種以上純化後HPV重組蛋白被篩選出，用以抗每一融合瘤細胞之選殖，並用以測試和了解所獲得的每一抗體產生性融合瘤細胞株之專一性。

2).融合瘤細胞株庫：以免疫分析方法(如ELISA,EIA和其他試驗)選殖所希望之陽性反應及陰性反應之融合瘤細胞，並選殖至單一細胞。每一單一細胞經細胞培養而生長，當細胞數達每毫升含一百萬個細胞時，將細胞冷凍保純在-80℃或液態氮中，作為細胞庫之儲存。

3).腹水之產生：每一融合瘤細胞株在組織培養中生長，並注射至小鼠體中以產生腹水。產生並收集之腹水做為以G蛋白管柱純化之免疫球蛋白，每一融合瘤細胞株純化出之免疫球蛋白是同型的，可應用於HPV免疫分析。

4.HPV免疫組織化學(IHC)試驗：

1).HPV IHC試劑和試驗：

在一實施案例中，提供進行HPV IHC試驗的試劑。試劑包括抗原擷取試劑、前-抗體終止溶液、後-抗體終止溶液、抗-HPV一級抗體、抗-老鼠或抗-兔子免疫球蛋白接枝上辣根過氧化酵素(HRP)或生物素以及其他試劑，作為二級抗體，溶液中含有適當之試劑作為二級抗體被偵測之基質。

抗原擷取試劑包含低pH值、中性pH值或高pH值之緩衝溶液。前-抗體終止溶液包含一些蛋白質、牛血清蛋白(BSA)、血清或其他試劑，用以終止抗體非特異性鍵結之細胞。後-抗體終止溶液與前-抗體終止溶液相似，含有少量蛋白質或血清，與一級抗體進行培養。含有HPV抗體之溶液可以為濃縮形式，或被稀釋作為試劑之使用。抗-HPV抗體亦直接標記有HRP、生物素或其它試劑，可被做為基質之適當試劑偵測。含有二級抗體之溶液可以為濃縮形式，或被稀釋作為試劑之使用。溶液中含有適當之試劑作為基質，包括DAB(3.3’-diaminobenzidine)作為一組成成分或兩種成分，或AEC(3-Amino-9-Ethylcarbazole)基質作為一組成成分或兩種成分，或其他基質。

一旦子宮頸組織被製成和固定後，便進行免疫組織化學(IHC)試驗，以抗原擷取試劑將試片上的組織加熱沸騰一段時間，然後將試片冷卻至室溫，以前-抗體終止溶液進行終止一段時間後，與HPV抗體進行培養。以PBS、水或其他緩衝液清洗試片，除去任何未鍵結之HPV抗體；將試片與二級抗體進行培養，如抗-老鼠IgG HRP，以適當之基質進行偵測。試舉一例，當過氧化物酶和過氧化氫存在時，DAB被氧化產生棕色沉澱，和酵素活性部位上之酒精不溶性沉澱；沉澱顏色依酵素含量呈淡金棕色至深金棕色， 顯微鏡下金棕色沉澱，表示HPV抗體與試片上組織細胞中表現的HPV蛋白產生專一性鍵結。此試驗可在室溫或高溫下加速鍵結反應進行，該HPV IHC試驗可徒手操作或以IHC自動儀進行，提供了HPV感染和HPV原致癌蛋白原位偵測之有力工具。因此，HPV IHC染色試驗是非常有用的確認檢查，對於結構不良細胞之確認，HPV IHC染色提供HPV感染或H)V原致癌蛋白表現情形之進一步資訊。此外，不同階段之子宮頸細胞結構不良，HPV E6和E7原致癌蛋白之過度表現，可能表示CIN之增生或子宮頸癌之發展。

2).樣本選擇與製備：為了分析本發明所提供之抗-HPV抗體是否能原位偵測不同CIN病程或癌症之HPV蛋白，以IHC試驗分析子宮頸組織，包括含有CIN2(子宮頸上皮內贅瘤2期伴隨中度病灶表現)之高度鱗狀表皮病變(HSIL)、CIN3(子宮頸上皮內贅瘤3期伴隨重度病灶表現)、含有鱗狀上皮癌(SCC，子宮頸癌最常見之癌症)之侵襲性癌症和腺癌(ADC，腺型腫瘤)。將蠟質組織塊切割成4μm，至於試片上培養在60℃隔夜；去蠟質/脫水部分則不遮蔽，進行標準IHC染色程序。將純化後的抗HPV蛋白單株抗體稀釋作為一級抗體，染色步驟依序為二級抗體溶液、清洗和適當之基質試劑。當片段形成時，立即以去離子水將試片懸浮，以四溴螢光素進行復染，脫水後蓋上蓋玻片。

3).組織微陣列：為了在一次均質試驗反應中同時分析多個樣本，以組織微陣列將許多樣本同時點在試片上。將來自CIN2,CIN3或非侵襲性癌症共84組樣本製備成三個組織微陣列：一陣列包含30個CIN2個體以及其周圍正常表皮細胞；另一陣列包含30個CIN3個體以及其周圍正常表皮細胞；最後一陣列包含12%子宮頸鱗狀上皮細胞癌以及其周圍正常表皮細胞，12個腺癌樣本及其正常表皮相關細胞，距離腫瘤邊緣至少15m的陰道或子宮頸黏膜。 在每一CIN病例中，選擇一腫瘤形成之代表性組織陣列點，和另一代表其正常相關組織之微陣列點；在非侵襲性癌症病例中，選擇兩個組織為陣列點，和一個正常相關組織微陣列點。取得HPV DNA比對之組織試片後，回收來自相關蠟嵌入組織塊之2mm圓形組織陣列點。

4).HPV DNA測試：每一病例之HPV DNA比對，使用EasyChip® HPV點墨法或HR-HPV晶片，藉由修飾有MY11/GP6+PCR-基準之反-點墨試驗進行確認，其在尼龍濾膜上含有13種特異性之寡核苷酸，以全部細胞DNA作為核苷酸的來源，放大後藉雜交進行偵測。

5).IHC程度和數據分析：組織微陣列上每一陣列點之染色結果，由專業之解剖病理學家以顯微鏡進行分析，腫瘤細胞或結構不良性細胞之面積，經細胞染色後計算其百分比，染色深淺分為0-3個等級。正常鄰近上皮細胞，或與其相關之結構不良細胞和腫瘤相距15mm的正常組織皆納入等級分類；所有數據結果皆由專業病理學家進行分級，將10%的染色部分切下以進行陽性或陰性試驗，所有數據在表1-17中顯示。

為證明能夠偵測非侵襲性子宮頸癌之HPV蛋白，鱗狀上皮細胞癌(SCC)是最常見的子宮頸癌，將SCC癌組織進行HPV IHC試驗。圖1A-1D說明以老鼠HPV E7單株抗體進行鱗狀上皮細胞癌組織IHC染色之結果。圖1A說明以抗-HPV E7老鼠單株抗體，對組織微陣列中的SCC組織進行IHC染色之代表性影像圖。圖1B說明圖1A中，SCC個案之正常上皮細胞(與腫瘤組織相距15mm)代表性影像圖。圖1C說明使用相同抗-HPV E7老鼠單株抗體，對組織微陣列另一SCC樣本進行IHC染色之代表性影像圖。圖1D 說明圖1C中腫瘤細胞細胞質以相同抗-HPV E7抗體染色後之放大影像圖。研究結果顯示，E7原致蛋白癌的表現可在SCC組織中的腫瘤細胞被偵測到，黑色實心箭頭標示出腫瘤細胞中E7蛋白之特異性染色，而空心箭頭則標示出未被染色的正常細胞。這些結果顯示，SCC子宮頸組織中的HPV E7蛋白，可藉由抗-HPV E7抗體進行IHC試驗被原位偵測。

在另一類型非侵襲性子宮頸癌的HPV蛋白偵測中，圖2A-2C說明以相同老鼠HPV E7單株抗體，對子宮頸腺癌進行IHC染色。結果顯示，腺癌組織中的腫瘤細胞，可偵測到E7原致癌蛋白的表現，黑色實心箭頭標示出腫瘤細胞中E7蛋白之專一性染色，而空心箭頭則標示出未被染色之正常細胞。圖2A說明以圖1中相同之抗-HPV E7抗體，對腺癌(ADC)樣本之腫瘤細胞進行IHC染色的代表性影像圖。圖2B圖2A中，ADC樣本之相關性正常上皮細胞(與腫瘤組織相距15mm)代表性影像圖。圖2C說明圖2A中腺癌腫瘤細胞的細胞質染色放大影像圖，由放大的影像圖可標示出在腫瘤細胞細胞質中E7蛋白表現的位置。這些結果顯示，以E7單株抗體進行IHC染色，可偵測腺癌的腫瘤細胞，且與SCC染色型態相似。

分析每一侵襲性癌症之HPV IHC結果，表1說明24個IHC侵襲性癌症樣本細胞質(C)、細胞核(N)染色之結果，在圖1A-1D和圖2A-2C中，以C或N表示抗-HPV E7抗體染色之百分比。附加的抗-HPV抗體包含其他抗-E7抗體、抗-HPV E6抗體，如MAb1和MAb 7，以及抗-HPV L1抗體，皆以相同的組織微陣列進行測試。為了進行各種抗-HPV抗體之IHC染色，使用另一抗-HPV抗體對腫瘤細胞的細胞質染色，IHC分級結果說明於表1，HPV DNA比對之結果亦說明於表中，作為相關性樣本。

表1結果說明，以抗-E7抗體對SCC和ADE的腫瘤細胞進行染色，可發現細胞核和細胞質皆被染色；然而，與腫瘤細胞的細胞核染色做比較，細胞質的染色程度較大。在其鄰近正常上皮細胞中，僅在細胞核偵測到HPV E7蛋白的表現，而未在細胞質中測得HPV E7蛋白表現，與正常鄰近細胞做比較，腫瘤細胞的細胞質明顯的被染色。這些結果說明，SCC和ADE組織中的腫瘤細胞，在其細胞質和細胞核中可偵測到HPV E7蛋白的表現。E7蛋白的表現位置在腫瘤細胞的細胞質中，而非正常上皮細胞或基質細胞，顯示出其對腫瘤存在特異性。藉由抗-E7抗體，偵測表現在正常鄰近上皮細胞和腫瘤細胞的HPV E7蛋白，可顯示原致癌蛋白表現的HPV感染。使用其他抗-HPV抗體的類似染色型態說明於表1，結果顯示此處所描述之HPV IHC試驗，可偵測到表現於子宮頸組織腫瘤細胞中的HPV早期基因，如E6和E7，以及晚期基因L1蛋白。

比較HPV IHC及HPV DNA比對之結果，抗-E7抗體對所有測試樣本中的HPV病毒型呈陽性反應。此處所描述之抗-E7單株抗體可偵測單一HPV病毒型感染，諸如HPV-16,HPV-18,HPV-33和HPV-45這些與癌症相關之HPV病毒型(高風險HPV病毒型)。單一抗-E7單株抗體也可偵測多種病毒型感染的HPV，如HPV 11,HPV-16,HPV-18,HPV-52,HPV-58,HPV-51和HPV-59這些病毒型之結合，包含高風險、低風險和非原致癌基因α-HPV；然而，多重HPV病毒型之感染，其中至少含有一種高風險型HPV。這些結果顯示，本發明中描述之抗-E7抗體是非專一性的，因此可作為有利之工具，偵測子宮頸癌常見之一般高風險病毒型的HPV E7蛋白。

偵測非侵襲性嚴重結構性不良子宮頸組織(HSIL；高度鱗狀表皮病變，第3期)的HPV蛋白，圖3說明以相同老鼠HPV E7單株抗體，對CIN3組織進行IHC染色之結果，結果顯示在CIN3組織中，可偵測到E7原致癌蛋白的表現；黑色實心箭頭指出在結構不良性細胞中對E7蛋白的專一性染色，空白箭頭則表示未被染色的正常細胞。圖3A說明以圖1和圖2偵測侵襲性癌組織的相同抗-HPV E7抗體，結構不良性細胞的CIN3組織進行IHC染色之代表 性影像圖。圖3B說明圖3A中CIN3組織的鄰近正常上皮細胞代表性影像圖。這些結果顯示，藉由老鼠抗-HPV E7抗體，進行此處所描述之IHC試驗，可原位偵測CIN3子宮頸組織的HPV E7蛋白表現。

分析每一CIN3個案的HPV IHC結果，表2說明30個CIN 3樣本之IHC等級，進行細胞膜(M)、細胞質(C)和細胞核(N)染色，以M,C或N表示抗-E7抗體之染色程度(%)。附加的抗-HPV抗體包括抗-HPV E6抗體，如MAb1和MAb7，以及抗-HPV L1抗體，皆在相同組織微陣列中被測試。不同抗-HPV抗體之IHC染色結果，以另一抗-HPV抗體對腫瘤細胞的細胞質進行染色，IHC等級如表1所示。HPV DNA比對結果亦說明於表中，作為相關性樣本。

如表2所示，利用抗-E7抗體進行試驗，在所有CIN3樣本中，發現結構不良性細胞的細胞核被染色，僅部分樣本發現細胞質被染色。結果顯示結構性不良細胞的細胞質被染色部分較細胞核多，亦如前述之侵襲性癌組織中，鄰近正常上皮細胞中的HPV E7蛋白僅在細胞核中被發現，而非在細胞質中被發現；與結構不良性鄰近的正常細胞做比較，細胞質的染色在結構不良性細胞中最為清楚。E7蛋白的表現位置在結構不良性細胞的細胞質，而非正常的表皮細胞或基質細胞，顯示其對HSIL的專一性。這些結果顯示，在CIN3組織中的細胞質和結構不良性細胞的細胞核中，可偵測到HPV E7蛋白的表現；以抗-HPV E7抗體可偵測HPV E7蛋白在正常鄰近表皮細胞的細胞核和結構良性細胞中表現，顯示受HPV感染且伴隨原致癌蛋白表現。蛋白高度表現的案例中，偵測其結構不良性細胞之細胞質，可專一性指出結構不良性細胞的增生。表2說明使用另一抗-HPV抗體，可得到相似的染色型態，結 果顯示此處所描述之HPV IHC試驗，可偵測HPV早期基因如E6和E7，以及晚期基因L1蛋白，在CIN3結構不良性細胞中的表現。

比較HPV IHC和DNA比對之結果，抗-E7抗體對測試樣本中所有表現的HPV病毒型呈陽性反應。例如，此處所描述之抗-HPV E7單株抗體可偵測單一HPV感染，至少為HPV-16,HPV-18,HPV-31,HPV-33,HPV-39和HPV-58與癌症相關(高風險HPV病毒型)之其中一種病毒型。單一抗-HPV E7單株抗體亦可偵測兩種以上HPV病毒型的感染，例如常見之高風險HPV病毒型HPV-16,HPV-18,HPV-33,HPV-39,HPV-52和HPV-58。這些結果顯示，本專利發明所描述之抗-HPV E7抗體是非專一性的，可做為偵測CI3組織中，常見高風險HPV病毒型的HPV E7蛋白之有利偵測工具。

偵測HSIL伴隨中度不典型增生(CIN2)中的HPV蛋白，圖4說明以老鼠抗-HPV E6單株抗體對CIN2組織進行IHC染色之結果，結果顯示可偵測CIN2早期E6原致癌蛋白之表現。圖4A說明CIN2組織以抗-HPV E6單株抗體進行免疫組織學染色(IHC)之代表性影像圖。圖4B說明圖4A中CIN2樣本結構不良性組織的鄰近正常上皮細胞之代表性影像圖。圖4C說明以相同抗-HPV E6單株抗體，對另一CIN2樣本結構不良性組織上皮細胞進行IHC染色之代表性影像圖。圖4D為圖4C之放大代表性影像圖，黑色實心箭頭指出結構不良性細胞中E6蛋白的專一性染色，空心箭頭 則指出未被染色之正常細胞。在CIN3中可發現與CIN2相似的染色型態，顯示出E6蛋白的表現位置是在結構不良性細胞之細胞質中，而非其他細胞和基質細胞。這些結果顯示，CIN2子宮頸組織的HPV E6蛋白之原位表現，可藉由老鼠抗-HPV E6單株抗體進行IHC染色而被偵測到。

分析每一CIN2個案的HPV IHC結果，表3說明30個CIN 2樣本之IHC等級，進行細胞膜(M)、細胞質(C)和細胞核(N)染色，以M,C或N表示抗-E7抗體之染色程度(%)。附加的抗-HPV抗體包括抗-HPV E6抗體，如MAb1和MAb7，以及抗-HPV L1抗體，皆在相同組織微陣列中被測試。不同抗-HPV抗體之IHC染色結果，以另一抗-HPV抗體對腫瘤細胞的細胞質進行染色，IHC等級如表3所示。HPV DNA比對結果亦說明於表中，作為相關性樣本。

如表3所示，利用抗-E6或抗-E7抗體進行試驗，在所有CIN2樣本中，發現結構不良性細胞的細胞核被染色，僅部分樣本發現細胞質被染色。結果顯示，在CIN2樣本中，結構性不良細胞的細胞核被染色部分較細胞質多，亦如前述之SCC,ADC和CIN3樣本中，鄰近正常上皮細胞的HPV E7蛋白僅在細胞核中被發現，而非在細胞質中被發現；與鄰近的正常細胞做比較，以抗-E6抗體對CIN2細胞質的染色，在結構不良性細胞中最為清楚。E6蛋白的表現位置在結構不良性細胞的細胞質，而非正常的表皮細胞或基質細胞，顯示其對HSIL的專一性。這些結果顯示，在CIN2組織中的細胞質和結構不良性細胞的細胞核中，可偵測到HPV E6蛋白的表現；在結構不良性細胞之細胞質中偵測到HPV E6蛋白高度表現的案例，可說明結構不良性細胞的增生。表3說明使用另一抗-HPV抗體，可得到相似的染色型態，結果顯示此處所描述之HPV IHC 試驗，可偵測HPV早期基因如E6和E7，以及晚期基因L1蛋白，在CIN2結構不良性細胞中的表現。

比較HPV IHC和DNA比對之結果，抗-E7抗體對測試樣本中所有表現的HPV病毒型呈陽性反應。例如，此處所描述之抗-E7單株抗體可偵測單一HPV感染，至少為HPV-16,HPV-18,HPV-31,HPV-52和HPV-58與癌症相關(高風險HPV病毒型)之其中一種病毒型，以及HPV6和HPV 53非高風險之HPV病毒型。單一抗-HPV E7單株抗體亦可偵測兩種以上HPV病毒型的感染，例如常見之高風險或低風險HPV病毒型HPV6,HPV-16,HPV-18,HPV-31,HPV-39,HPV-44,HPV-52,HPV-58,HPV-66,HPV-68，以及其結合型。這些結果顯示，本專利發明所描述之抗-HPV E7抗體是非病毒型專一性的，可偵測CI N2組織中，來自常見高風險和低風險HPV病毒型的HPV E7蛋白。結構不良性細胞的形成原因，可能來自原致癌蛋白的表現，而非HPV病毒型的基因型；這解釋了感染高風險HPV病毒型，且未在細胞質中偵測到原致癌蛋白時，可能產生復原。因此，本專利描述之HPV IHC試驗，不僅提供臨床偵測HPV感染之額外資訊，亦可偵測結構不良性細胞增生的跡象。

與正常細胞相較，細胞質染色僅在結構不良性細胞中被發現且明顯可辨，因此可作為結構不良性細胞增生之試驗依據。為了進一步比較不同CIN程度或癌組織結構不良性細胞的專一性細胞質染色，分析表1-3中之數據以獲得試驗結果。每一案例中，染 色程度大於10%即判定為陽性，小於10%者則為陰性。如表4數據所示，試驗的陽性比率隨CIN嚴重程度增加，從38%,52%至100%，在CIN2,CIN3,SCC或ADE病例中亦如此。陽性預測值(PPV)和陰性預測值(NPV)亦表示於表中，顯示以細胞質染色百分比作為試驗之專一性。

HPV E7原致癌蛋白之表現可藉由另一抗-E7單株抗體被偵測到，以相同組織微陣列進行測試，結果呈現於表5，說明以另一E7抗體進行之試驗分析，對CIN2,CIN3,SCC和腺癌之偵測，分別具有72%,48%,67%,83%之陽性比率。陽性預測值(PPV)和陰性預測值(NPV)亦表示於表中，顯示以該抗體進行試驗之專一性不佳。

為了證實HPV E6蛋白可利用抗-E6單株抗體進行偵測，以相同組織微陣列進行測試，結果呈現於表6-7，說明以另一兩種抗-E6抗體進行之試驗分析。如數據所示，來自CIN2,CIN3和非侵襲性癌症之腫瘤細胞的結構不良性細胞，其細胞質中E6蛋白之表現，可被本專利描述之抗-E6抗體偵測到。在抗-E7抗體IHC試驗中，隨CIN嚴重程度而增加的陽性比率，在抗-E6抗體試驗中呈相同增加趨勢。兩種抗-E6抗體在試驗中，隨CIN嚴重程度呈現相同的陽性比率增加趨勢，而其中一抗-E6抗體在試驗中的表現優於另一抗-E6抗體；MAb1可能辨識與MAb7不同之抗原決定位，因此造成不同的試驗結果。然而，如表中所示，這兩種單株抗體皆具有高度之陽性預測值(PPV)和陰性預測值(NPV)。以抗-E7抗體進行的所有IHC試驗，其陽性比率高於使用抗-E6抗體之試驗，可能是因H7蛋白比E6蛋白的表現時間較早，因此可作為子宮頸癌之早期偵測的生物標記。

以相同組織微陣列，利用抗-L1抗體進行IHC試驗，偵測不同CIN階段，L1病毒蛋白之表現。由L1抗體對細胞質進行染色，獲得不同IHC等級結果，分析所有樣本之陽性比率。研究不同CIN階段之HPV早期和晚期蛋白原位表現間之相關性，表8說明IHC試驗，CIN2,CIN3和侵襲性癌症的細胞質中，E7和L1蛋白表現 之陽性比率。以本發明所述之HPV IHC試驗，比較不同CIN階段和非侵襲性癌症組織中E7和L1表現之相關性，結果顯示E7似乎是子宮頸癌早期偵測之良好生物標記。表8說明CIN樣本經IHC試驗呈L1陽性結果者，其中CIN2約有60%(15個樣本中有9個)，CIN3約有58%(19個樣本中有11個)在E7 IHC試驗中呈陽性。非侵襲性癌症樣本呈L1細胞質陽性之比率，SCC(11個樣本中有11個)和腺癌(10個樣本中有10個)皆為100%，呈E7細胞質陽性，顯示癌症的發展與E7的表現具有100%相關性。研究結果顯示，CIN2/3樣本L1和E7細胞質皆呈陽性反應者，與L1陽性但E7陰性者相較下，具有較高的結構不良性細胞發展之風險。

表8同時說明樣本細胞質中E7和E6陽性表現之關連性，如數據所示，E7細胞質呈陽性表現之樣本，其對E6細胞質表現之陽性比率，CIN2約為45%(11個樣本中有5個)，CIN3為57%(14個樣本中有8個)，SCC為100%(11個樣本中有11個)，ADE則為90%(10個樣本中有9個)。這些結果顯示，在結構不良性細胞早期發展中，E6在E7之後才表現，但在子宮頸癌晚期則共同表現。

為了在單一反應中，使各種不同疾病程度之樣本，能在均質條件下進行試驗，利用組織微陣列將CIN2,CIN3和非侵襲性癌症之各式樣本收集於同一試片上。製備兩組組織微陣列：一陣列為各包含10組樣本之CIN2,CIN3,SCC以及其鄰近正常上皮細胞；另一陣列為CIN2,CIN3,ADE以及其鄰近正常上皮細胞各10組樣本。為了進一步確認HPV IHC試驗對HPV相關之結構不良性細胞或子宮頸癌具有專一性，另外製備一組織微陣列，含有來自各式正常人類組織的90種以上樣本，在HPV IHC試驗中作為負控制組。以抗-E6和抗-E7抗體進行相同的HPV IHC試驗，可應用於這些組織微陣列中，以獲得前述之IHC染色百分比；細胞核或細胞質染色率達10%以上者即歸類為陽性反應。

所有組織微陣列試驗之IHC數據，呈現於表9-14。表9說明各式子宮頸癌發展中及組織病灶切片檢體樣本，以老鼠抗-HPV E7抗體進行IHC染色之結果。研究數據顯示，不同病程階段之子宮 頸組織，由CIN2,CIN3和侵襲性癌組織如鱗狀上皮細胞癌(SCC)或腺癌(AD)樣本中，可藉增加的陽性比率鎮測HPV E7蛋白的原位表現。樣本中CIN2和CIN3的陽性比率分別為72%和90%。在癌組織中(鱗狀上皮細胞癌和腺癌)，以抗-HPV E7抗體進行IHC染色，100%的樣本呈陽性結果，表示100%的癌症皆表現HPV原致癌基因蛋白。這些結果顯示，本專利發明描述之HPV E7抗體進行IHC試驗，可作為由不同病程之組織中診斷出子宮頸癌之有利工具。

將表9的數據進一步分析，以獲得試驗之結果。表10說明表9中IHC染色之結果，以正常人類組織作為CIN2陰性反應之樣本。實驗數據顯示，以抗-HPV E7抗體進行IHC染色，對CIN2+之敏感度達87%，專一性達92%。這些結果顯示，該試驗可有效應用於偵測HPV蛋白，以進行子宮頸病灶CIN2之確認。

為了進一步分析數據，表11說明表9和表10中IHC染色之結果，顯示以本發明描述之抗-HPV E7抗體，對CIN3+(包括CIN3和侵襲性癌症)進行HIC試驗，敏感度達95%，專一性達92%，陽性預測值達93%，陰性預測值為95%。這些結果顯示，該試驗可於臨床應用中偵測HPV蛋白，以進行子宮頸病灶不同病程之確認。

為了確認利用本發明所描述之抗-E6抗體進行IHC試驗，是否可偵測E6蛋白之表現，使用相同的組織微陣列，以抗-E6抗體進行IHC試驗。表12-14說明以抗-HPV E6抗體進行另一HPV IHC試驗之結果，如數據所示，比較抗-E6和抗-E7抗體之IHC結果。

表12說明各種不同發展中子宮頸癌及組織病灶之組織切片樣本，以抗-HPV E6抗體進行IHC染色之結果。研究數據顯示，以本發明描述之老鼠抗-HPV E6單株抗體進行IHC試驗，可偵測HPV E6蛋白。來自不同病程階段之子宮頸組織的HPV E6蛋白，可原位偵測其表現。如數據所示，由CIN2,CIN3和侵襲性癌組織如鱗狀上皮細胞癌(SCC)或腺癌(AD)樣本中，可藉增加的陽性比率偵測 HPV E6蛋白的原位表現。如數據所示，在CIN2,CIN3和癌組織鱗狀上皮細胞癌樣本中，HPV E6蛋白的表現呈陽性且隨比例增加；樣本中CIN2和CIN3的陽性比率分別為65%和70%。在癌組織中，96%的SCC樣本以抗-HPV E6抗體進行IHC染色呈陽性，而AD樣本僅71%呈陽性，表示HPV E6原致癌基因在SCC的表現高於AD。這些結果顯示，以本發明所描述之HPV E6抗體進行IHC試驗，提供作為確認不同病程子宮頸癌組織之診斷工具。

為了進一步分析數據，表13說明表11和表12中IHC染色之結果，顯示以本發明描述之抗-HPV E6抗體，對CIN2+進行HIC試驗，敏感度達73%，專一性達87%。這些結果顯示，該試驗可於臨床應用中偵測HPV蛋白，以進行子宮頸病灶不同病程之確認。

為了進一步分析數據，表14說明表13中IHC染色之結果，顯示以本發明描述之抗-HPV E6抗體，對CIN3進行HIC試驗，敏感度達77%，專一性達92%，陽性預測值為91%，陰性預測值為79%。這些結果顯示，該試驗可於臨床應用中偵測HPV蛋白，以進行子宮頸病灶不同病程之確認。

5.HPV ICC試驗

樣本製備：傳統子宮頸抹片樣本和液態細胞學樣本，這兩種形式之樣本可應用於ICC試驗。子宮頸細胞直接由試片上之抹片或液體溶液中分為兩部分，一作為細胞學抹片染色，另一部份以本發明描述之HPV抗體進行IHC染色。依據抹片染色之結果，將樣本分為0-17個等級，等級1-3為正常，等級4以上則屬於不正常。不正常細胞包括不同病程階段之鱗狀上皮細胞，可能發展成就不良性細胞或病灶；例如，LSIL：低度鱗狀表皮病變、HSIL：高度鱗狀表皮病變、CIN1：子宮頸上皮內贅瘤，輕度細胞變異、CIN2：子宮頸上皮內贅瘤伴隨增生性病灶、CIN3：子宮頸上皮內贅瘤伴隨結構不良性增生，侵襲性癌症則包括鱗狀上皮癌(SCC)、腺癌(AD)以及其他。未被定義之變異性細胞，如ASCUS：重要性不明之非典型鱗狀細胞(ASCUS)和抹片中不正常或非典型細胞，仍無清楚之結論，其差異性亦未被確定。已被定義之變異性細胞，HPV ICC染色可提供HPV感染或原致癌蛋白表現之附加訊息，因此，與子宮頸抹片染色相較，HPV ICC染色可更有效應用於偵測LSIL或HSIL非正常細胞，或偵測其他未被定義之不正常細胞，如ASCUS或AGUS。

以ICC方法作為一免疫試驗範例，將子宮頸抹片之細胞直接塗抹在試片上，或收集於液體溶液中，經離心和純化及免疫染色 後，進行ICC步驟。收集於液體溶液中的子宮頸抹片依操作程序，將子宮頸細胞進行細胞離心或薄層技術製成單層細胞，將試片上的薄層細胞固定，以抗-HPV抗體染色，進行HPV ICC步驟，被染色的細胞以顯微鏡進行觀察。

在一實施案例中，提供進行ICC試驗之試劑。該試劑包含前-抗體終止溶液、後-抗體終止溶液、抗-HPV抗體作為一級抗體、抗-老鼠或抗-兔子免疫球蛋白接枝HRP或生物素、或其他作為二級抗體之試劑，含有適當試劑之溶液作為二級抗體之基質被偵測。

抗-HPV抗體可直接標記上HRP、生物素或其他試劑，以利下一步適當試劑作為基質時被偵測。前-抗體終止溶液則包含部分蛋白質、BSA、血清或其他試劑，用以終止細胞對抗體之非特異性鍵結。後-抗體終止溶液與前-抗體終止溶液成分相似，含有少量蛋白質或血清，與一級抗體進行培養。含有HPV抗體之溶液可以為濃縮形式，或被稀釋作為試劑之使用。抗-HPV抗體亦直接標記有HRP、生物素或其它試劑，可被做為基質之適當試劑偵測。含有二級抗體之溶液可以為濃縮形式，或被稀釋作為試劑之使用。溶液中含有適當之試劑作為基質，包括DAB(3.3’-diaminobenzidine)作為一組成成分或兩種成分，或AEC(3-Amino-9-Ethylcarbazo1e)基質作為一組成成分或兩種成分，或其他基質。

當分離出子宮頸抹片中的人類細胞，並在試片上固定成薄層或薄片後，終止溶液先與HPV抗體共同培養，以前-抗體終止溶液終止試片一段時間，進行ICC試驗。之後將試片以PBS、H2O或其他溶液清洗3到5次，移除未鍵結的HPV抗體；將試片與二級抗體如抗-老鼠IgG HRP進行培養，以適當之基質進行偵測。試舉一例，當過氧化物酶和過氧化氫存在時，DAB被氧化產生棕色沉 澱，和酵素活性部位上之酒精不溶性沉澱；沉澱顏色依酵素含量呈淡金棕色至深金棕色，顯微鏡下金棕色沉澱，表示HPV抗體與試片上組織細胞中表現的HPV蛋白產生專一性鍵結。此試驗可在室溫或高溫下加速鍵結反應進行，該HPV ICC試驗可徒手操作或以ICC自動儀進行，提供了子宮頸抹片表皮細胞中HPV感染和HPV原致癌蛋白原位偵測之有力工具。

為進一步證實HPV ICC試驗可應用於不同階段之結構不良性細胞，測試不同早期、中期或晚期階段之病灶。測試樣本包括但不僅限於早期病灶LSIL,CIN1或ASCUS，中期病灶CIN2,CIN3或HSIL，以及晚期病灶SCC和ADE。使用不同溶態溶液製備不同病程階段的樣本，進行本專利所述之ICC試驗，以證實該試驗可應用於各式不同來源、不同病程階段和不同液態溶液之樣本。

HPV ICC試驗可用於確認標準細胞學抹片染色所無法確認之不正常細胞，例如ASCUS(非典型鱗狀細胞，在抹片中之不正常或不典型細胞，無定論且不確定其差異性)，或AGUS(不確定性非典型腺體)，HPV ICC試驗即用於測試ASCUS樣本。如圖5A所示，ICC試驗結果說明，某些經抹片染色被診斷為ASCUS之子宮頸抹片細胞，以抗-E6單株抗體進行ICC染色呈陽性反應。圖5B顯示與圖5A相同樣本之ICC試驗結果，說明某些子宮頸抹片細胞(經抹片染色被診斷為ASCUS)，以抗-E7單株抗體進行ICC染色呈陽性反應。如圖5A和5B所示，高N/C(細胞核/細胞質)值的不正常細胞(以黑色箭頭標示)呈陽性染色，正常細胞(大且型態不規則，細胞核小)染色則呈陰性，以白色箭頭標示。圖5A和5B皆說明子宮頸抹片ASCUS樣本，可偵測其不正常細胞中的HPV E6和HPV E7蛋白，此結果顯示ASCUS樣本中含有 受HPV感染之細胞，且伴隨E6和E7原致癌蛋白之表現，因此可以老鼠抗-HPV E6及抗-HPV E7單株抗體進行ICC試驗原位偵測。

HPV ICC試驗可偵測HSIL細胞，圖6A說明以抹片染色診斷為CIN2之子宮頸細胞，以另一液態溶液進行製備，利用抗-E7單株抗體進行ICC試驗呈陽性染色。如圖6A所示，CIN2,HSIL不正常細胞具有高N/C(細胞核/細胞質)值(以黑色箭頭表示)，其細胞核和細胞質染色呈陽性。這些結果顯示，以老鼠-HPV E7對不同來源的液態溶液進行ICC試驗，可偵測到在不同階段腫瘤的不正常細胞中原位表現的HPV E7蛋白。

另一範例中，圖6B說明另一子宮頸細胞之CIN2樣本，以另一液態溶液進行製備後，經抗-E6單株抗體進行ICC染色試驗呈陽性反應。如果圖6B所示，CIN2,HSIL不正常細胞具有高N/C(細胞核/細胞質)值(以黑色箭頭表示)，其細胞核和細胞質染色呈陽性。這些結果顯示，以老鼠-HPV E6對不同來源的液態溶液進行ICC試驗，可偵測到在不同階段腫瘤的不正常細胞中原位表現的HPV E6蛋白。

本發明描述之ICC試驗，可確認中期到晚期CIN細胞，以不同溶液配製的CIN3子宮頸抹片樣本，亦能進行該ICC試驗。圖7A說明子宮頸抹片細胞(抹片染色診斷為CIN3)，以抗-E6單株抗體進行ICC染色呈陽性反應。圖7B-7D說明以相同抗-E6老鼠單株抗體，分析另一CIN3樣本；如圖所示，HSIL不正常細胞N/C(細胞核/細胞質)值高(以黑色箭頭表示)，故與其他細胞連結在一起，染色結果呈陽性反應。這些結果顯示，中期/晚期腫瘤不正常細胞中，HPV E6蛋白的原位表現，在不同來源的液態溶液中，可利用老鼠抗-HPV單株抗體經ICC試驗進行偵測；來自 CIN3液態溶液中的不正常細胞之HPV E6蛋白的原位表現，可藉老鼠抗-HPV單株抗體經ICC試驗進行偵測。

圖7E說明與圖7B相同之CIN3樣本，以抗-HPV E7老鼠單株抗體進行ICC染色之結果。圖7F說明另一ICC染色結果，與圖7E使用相同抗-HPV E7老鼠單株抗體；如圖所示，CIN3中HSIL不正常細胞N/C(細胞核/細胞質)值高(以黑色箭頭表示)，故與其他細胞連結在一起，染色結果呈陽性反應。這些結果顯示，中期腫瘤不正常細胞中，HPV E7蛋白的原位表現，在不同來源的液態溶液中，可利用老鼠抗-HPV單株抗體經ICC試驗進行偵測；來自CIN3液態溶液中的不正常細胞之HPV E7蛋白的原位表現，可藉老鼠抗-HPV單株抗體經ICC試驗進行偵測。

為了確認晚期腫瘤中p16也成過渡表現狀態，以抗-p16老鼠單株抗體對相同的CIN3樣本進行ICC染色。圖7G說明與圖7B-7F相同之CIN3樣本，以抗-p16老鼠單株抗體進行ICC染色之結果，如圖所示，CIN3中HSIL不正常細胞N/C(細胞核/細胞質)值高(以黑色箭頭表示)，故與其他細胞連結在一起，染色結果呈陽性反應。這些結果顯示，中期到晚期腫瘤不正常細胞中，p16蛋白的原位表現，在不同來源的液態溶液中，可利用老鼠抗-HPV單株抗體經ICC試驗進行偵測；來自CIN3液態溶液中的不正常細胞之HPV E6,HPV E7和p16的原位表現，可藉老鼠單株抗體經ICC試驗進行偵測。

本處所描述之ICC試驗可作為另一範例，應用於偵測液態容液中之子宮頸癌細胞，子宮頸抹片樣本中不同的癌腫瘤以不同溶液進行製備，進行ICC試驗分析。圖8說明子宮頸癌細胞(經抹片染色診斷為腺癌以抗)-E6單株抗體進行ICC染色呈陽性反應； 其中，具有高N/C(細胞核/細胞質)值(以黑色箭頭表示)的不正常細胞，染色呈陽性，與其他細胞連結之HSIL不正常細胞亦呈陽性染色反應。這些結果顯示，溶態溶液中的腺癌子宮頸細胞，其HPV E6蛋白之表現，可藉抗-HPV E6老鼠單株抗體進行ICC試驗加以偵測。

本處所描述之ICC試驗也可應用於偵測另一液態溶液中的子宮頸癌另一種病毒型，圖9A說明另一型子宮頸癌細胞SCC(經抹片染色診斷為鱗狀細胞癌)，以抗-E6單株抗體進行ICC染色呈陽性反應。圖9B說明相同SCC樣本以抗-HPV E7老鼠單株抗體進行ICC染色之結果。圖9C說明同SCC樣本以抗-p16老鼠單株抗體進行ICC染色之結果。如圖所示，HSIL SCC細胞之細胞核和細胞質染色呈陽性反應，表示不同病毒型子宮頸癌細胞於液態溶液中，其HPV E6和HPV E7蛋白之原位表現，可利用抗-HPV E6或E7老鼠單株抗體，進行ICC試驗加以偵測。為了確認晚期腫瘤中p16也成過渡表現狀態，以抗-p16老鼠單株抗體對相同的SCC樣本進行ICC染色。圖9C說明與圖9A-9B相同SCC樣本，以抗-p16老鼠單株抗體進行ICC染色之結果，顯示晚期腫瘤中的p16蛋白表現可被偵測到；說明來自不同病毒型子宮頸癌液態溶液中的不正常細胞，其HPV E6,HPV E7和p16蛋白的原位表現，可藉老鼠單株抗體經ICC試驗進行偵測。

為了確認本處所描述之ICC染色結果，說明子宮頸抹片細胞中原位表現的HPV蛋白與HPV抗體為專一性鍵結，亦將液態溶液中所獲得正常的子宮頸細胞進行ICC試驗分析。圖10A說明以液態溶液製備的子宮頸抹片細胞(抹片染色診斷為正常者)，以抗-E6單株抗體進行ICC試驗呈陰性染色反應；相同的樣本以抗-E7單株抗體進行ICC試驗結果說明於圖10B。研究結果顯示， 正常細胞中所表現的HPV E6或E7蛋白，以抗-HPV E6或E7單株抗體進行ICC試驗，皆呈陰性染色結果；表示本發明所描述之ICC試驗，是一專一性染色方法，以HPV特異性抗體偵測HPV蛋白。

細胞層級中之ICC染色結果，圖11A說明以抗-HPV E6老鼠單株抗體，對液態溶液製備的子宮頸抹片細胞之細胞質進行染色。圖11B說明與圖11A相同樣本，以抗-HPV E7老鼠單株抗體進行細胞核染色之結果。圖11C說明以抗-HPV E7老鼠單株抗體，對另一樣本進行細胞質染色之代表性影像圖。如圖所示，不正常細胞具有高N/C(細胞核/細胞質)值(以黑色箭頭表示)，染色結果呈陽性；而正常細胞(大，細胞型態不規則，且細胞核小)染色結果則呈陰性反應，以白色箭頭表示。這些結果說明，本發明描述之抗HPV E6和E7老鼠單株抗體，可偵測細胞或細胞核中HPV E6和E7蛋白之表現。

HPV E6和E7原致癌蛋白可在某些LSIL(低度鱗狀上皮內病灶)或CIN1(子宮頸上皮內贅瘤中度細胞病變)中表現，圖12A-12C說明以抗-HPV E6老鼠單株抗體，對臨床診斷為CIN1樣本之液態溶液，進行ICC染色之結果。圖12B-12C說明使用與圖12A相同抗-HPV E6老鼠單株抗體，進行ICC染色之結果。圖12D說明與圖12A相同之CIN1樣本，以抗-HPV E7老鼠單株抗體進行ICC染色之結果。圖12E使用與圖12D相同抗-HPV E7老鼠單株抗體，進行ICC染色之結果。如圖所示，不正常的LSIL和CIN1細胞彼此間相互連結，或具有高的N/C(細胞核/細胞質)值(以黑色箭頭表示)，其細胞核和細胞質染色結果呈陽性反應。這些結果說明，利用抗-HPV E6或E7抗體進行ICC試驗，HPV E6和E7蛋白的原位表現，可在液態溶液製備的早期腫瘤樣本中被偵測 到。為了確認早期腫瘤中p16蛋白是否表現，以抗-p16老鼠單株抗體對CIN1樣本進行ICC染色。圖12F說明與圖12A-12E相同之CIN1樣本，以抗-p16老鼠單株抗體進行ICC試驗之結果，顯示該樣本早期腫瘤中無法偵測到p16蛋白。所有結果說明，HPV E6和HPV E7蛋白之原位表現，可利本發明描述之用抗-HPV E6或E7老鼠單株抗體，對早期腫瘤之不正常細胞進行偵測，而抗-p16老鼠單株抗體進行ICC試驗，則無法偵測到p16蛋白之表現。

ICC試驗不僅可偵測HPV感染，亦能原位偵測HPV原致癌蛋白。因此，相對於標準HPV DNA試驗或抹片試驗，單獨的ICC試驗，或與其他各式專一性或一般抗-HPV抗體結合後，可成為原位偵測HPV之有利工具。

液樣本進行ICC試驗之結果

表15說明以抗-HPVE6老鼠單株抗體對各式子宮頸抹片液態溶液樣本進行ICC試驗之結果。結果說明，使用抗-HPVE6老鼠單株抗體，對固定於試片上之單一細胞進行ICC試驗，可原位偵測HPV E6蛋白之表現，且樣本可為各種病程階段之子宮頸抹片液態溶液樣本。將相同的樣本進行抹片染色與ICC染色結果作比較，圖表15所示，HPV E6蛋白的表現，隨子宮頸抹片正常，ASCUS,ASC-H,CIN1和CIN2/3樣本，呈正向增加之趨勢。

經抹片診斷為CIN2/3之樣本，100%呈陽性反應，而被診斷為正常染色之樣本，以相同之抗-HPV E6抗體進行ICC染色試驗，有14%呈陽性反應。ASCUS或ASC-H樣本中，使用與表15中CIN1和CIN2/3樣本相同之抗-HPV E6抗體，約有33%至50%呈陽性染色結果，表示這些ASCUS或ASC-H樣本中原致癌蛋白的表現，將更進一步形成癌症的增生。抹片染色診斷為ASCUS但ICC染色(抗-HPV E6抗體)呈陰性的樣本，發展成增生病灶的風險可能較低。

表16說明來自表15之ICC染色結果。如數據所示，以本發明所描述之抗-HPV E6抗體進行ICC染色試驗，對CIN2+敏感度達95%，專一性達83%。研究結果顯示，該試驗有利於偵測HPV蛋白，可對一般大眾例行性之抹片染色進行子宮頸癌篩選。

另一ICC試驗偵測HPV之範例，表17和表18說明以抗-HPV E7抗體進行ICC染色之結果。如數據所示，抗-HPV E7抗體ICC試驗結果與抗-HPV E6之結果不同，表17說明HPV E7蛋白的表現，隨子宮頸抹片正常，ASCUS,ASC-H,CIN1和CIN2/3樣本，呈正向增加之趨勢。診斷為抹片CIN2/3之樣本94%呈陽性反應，僅11%抹片正常之樣本，以相同抗-HPVE7抗體進行ICC試驗呈陽性反應。ASCUS或ASC-H樣本中，以與表17的CIN1,CIN2/3樣本使用相同之抗-HPVE7抗體，40%呈陽性染色反應，表示這些樣本的原致癌基因蛋白之表現，可能造成進一步癌症增生；抹片診斷為ASCUS且ICC染色(抗-HPVE7抗體)呈陰性之樣本，發展成病灶增生之風險則較低。

表18說明來自表17之ICC染色結果。如數據所示，以本發明所描述之抗-HPV E7抗體進行ICC染色試驗，對CIN2+敏感度達91%，專一性達89%。研究結果顯示，該試驗有利於偵測HPV蛋白，可對一般大眾例行性之抹片染色進行子宮頸癌篩選。

為了測試本發明描述之HPV ICC試驗是否能作為子宮頸癌早期篩選之工具，將抹片正常樣本進行HPV ICC試驗與HPV DNA測試之比較。如表19數據所示，以抗-HPV抗體進行試驗，所有抹片正常樣本呈陰性反應(32個樣本中有32個)，32個樣本中，16個樣本以抗-HPV E7抗體進行染色，4個樣本以抗--HPV L1抗體進行染色。結果顯示，本發明描述之ICC染色試驗具有很好之專一性，與HPV DNA測試作比較，僅19%(32個樣本中有6個)的抹片正常樣本在HPV DNA測試中呈陽性反應。本實驗中，以唯一FDA許可之hc2進行HPV DNA測試。HPV DNA呈陽性反應，抹片染色卻正常，且HPV ICC試驗呈陰性之樣本，可能是偽陰性，或並未表現HPV原致癌基因蛋白。實驗結果顯示，HPV ICC試驗與HPV DNA試驗相較下，提供較高之陽性預測值，因此，對於臨床篩選子宮頸癌，ICC提供了較好之依據。

6.HPV流式細胞試驗

另一HPV蛋白免疫學試驗偵測範例，為HPV流式細胞試驗。將子宮頸抹片細胞收集至液態溶液中，依標準程序進行離心與純化，接著進行與ICC染色相似步驟之免疫染色。將細胞保持在溶液中而不固定於試片上，以利流式細胞儀進行分析，以抗-HPV抗體對溶液中的細胞進行固定、終止和培養，接著以適當之二級抗體和基質試劑進行流式細胞儀偵測。HPV流式細胞儀試驗之優點 為，一次可測試高度流率之樣本數，而不需要專業的細胞學家對試片進行分析。

在一實施案例中，提供ICC流式細胞儀試驗之試劑。該試劑可包含前-抗體終止溶液、後-抗體終止溶液、抗-HPV抗體作為一級抗體、抗-老鼠或抗-兔子免疫球蛋白接枝螢光物或生物素、或其他作為二級抗體之試劑，含有適當試劑之溶液作為二級抗體之基質，以利流式細胞儀進行偵測。

非直接標定需要兩階段之培養步驟，先使用一級抗體，接著使用相容之二級抗體，二級抗體可帶有螢光染劑(FITC,PE,Cy5等)。抗-HPV抗體亦可直接標記上螢光物質、生物素或其他試劑，以適當之試劑作為基質進行偵測。前-抗體終止溶液則包含某些蛋白質、BSA、血清或其他試劑，用以終止與抗體非特異性鍵結之細胞。後-抗體終止溶液與前-抗體終止溶液相似，含有少量蛋白質或血清，與一級抗體進行培養。含有HPV抗體之溶液可以為濃縮形式，或被稀釋作為試劑之使用。含有二級抗體之溶液可以為濃縮形式，或被稀釋作為試劑之使用。

HPV E6,E7或L1蛋白可以專一性抗體和標記有螢光染劑(接枝上FITC,PE,Cy5等)之二級抗體進行偵測。以流式細胞儀分析細胞，可依其大小或其他參數將細胞進行分類，且可進行染色或不需染色。將較小細胞之細胞群的染色程度與較大細之細胞群做比較，並作為試驗中正常細胞的控制組。該試驗提供每一細胞專一性染色，使否被染色的細胞數可經由計算而得知，且染色程度可藉由分析而量化。此試驗可大量分析、不需顯微鏡的使用，亦不需要細胞學家進行染色結果的程度分級。流式細胞儀之電腦軟體可準確無誤地對資料進行分析，且不需進行細胞學之專人訓 練，故可有效應用於臨床，作為偵測HPV相關蛋白之篩選或輔助工具。

在另一範例中，細胞被染色後，懸浮保存在4℃黑暗環境下，且盡快以細胞儀進行分析，若等待分析時間超過一個小時，則需將細胞進行固定，可使細胞保存數天，可穩定光散色且將多數生物危害因子去活化，不同試驗則需要不同的試劑加以固定並找出最佳化之參數。格式1.0.01%至1%三聚甲醛10-15分鐘，每樣本為100μl，格式2.丙酮或甲醇：每一樣本中加入1ml冰丙酮，混和均勻後，於-20℃靜置5-10分鐘，離心後以PBS 1% BSA清洗兩次。

將細胞先進行固定，以確認短半衰期抗原或抗體之穩定性，進行細胞內染色，可維持標記蛋白在原始細胞中的位置。偵測細胞內抗原，在進行染色前需進行細胞通透步驟，將抗體在通透緩衝液中進行製備，以確保細胞能維持通透，當細胞群開始通透時，流式細胞儀上的細胞光散色數據在通透後產生改變。細胞質胞器和顆粒中的抗原，依抗原種類不同而有不同的固定和通透方法，以維持抗原決定為之可用性。

細胞固定對是影響染色試驗之結果品質之重要因素，固定的方法如下：(1)使用甲醛及界面活性劑：在0.01%甲醛中進行固定10-15分鐘(穩定蛋白質)，以界面活性劑打破細胞膜。界面活性劑：Triton或NP-40(0.1-1%溶於PBS中)，可部分溶解細胞核膜，且適合用於細胞核抗原染色。值得注意的是，細胞膜和細胞質的損失可導致光散色減少，亦減低非特異性之螢光值。Tween 20,Saponin,Digitonin和Leucoperm是溫和的細胞膜溶解劑，以PBC配置成0.5%，提供夠大的孔徑使抗體能夠穿透，而不須溶解細胞 質膜，適合於細胞質或細胞表面之抗原，也可用於溶解性細胞核抗原。(2)使用甲醛(0.01%)及甲醇，和界面活性劑：在每一樣本中加入1m冰甲醇，混和均勻後，於-20℃靜置5-10分鐘，離心後以PBS 1% BSA清洗兩次。以丙酮進行固定和通透：在每一樣本中加入1m冰丙酮，混和均勻後，於-20℃靜置5-10分鐘，離心後以PBS 1% BSA清洗兩次。

7.以一抗-HPV抗體偵測固態表面之HPV蛋白

1).直接EIA試驗：將多種HPV蛋白披覆於微孔盤上，以多種抗-HPV抗體進行偵測

臨床之子宮頸抹片樣本以直接EIA試驗偵測HPV E6,E7或L1蛋白。不同樣本之子宮頸細胞，可來自液態細胞溶液中、運送液中(進行HPV DNA測試)或細胞裂解液中。為進行EIA試驗，樣品進行製備、離心、純化和裂解，產生細胞裂解物作為分析。定量分析細胞裂解物中的蛋白質，並等量將其披覆在微孔盤每一微孔中，以HPV單株抗體鍵結微孔盤中的蛋白質並進行偵測，接著以接枝有HRP之二級抗體(以老鼠或兔子抗-IgG為例)進行鍵結，加入TMB基質做為終止溶液，以ELISA酵素免疫儀偵測OD 450吸收值。

將來自不同腫瘤病程階段之子宮頸細胞收集在液態溶液中，獲得其細胞裂解物，用以偵測HPV DNA和蛋白質。HPV DNA偵測中，採遞減式PCR步驟；以直接EIA試驗，進行HPV蛋白質的偵測，將細胞裂解物直接披覆在微孔盤上進行鍵結，接著以接枝上HRP之特異性二級抗體進行反應。以微孔分析儀讀取加入或未加入一級HPV抗體之OD450吸收值。微孔盤上披覆有細胞裂解物中各式不同的蛋白質，沒有添加一級HPV抗體之樣本所測得的 OD值，表示細胞裂解物和二級抗體為非專一性鍵結。HPV蛋白與抗-HPV抗體產生專一性鍵結之OD值，將每一樣本OD值與二級抗體非專一性鍵結之OD值相減，得到淨OD值，即為HPV蛋白與一級抗-HPV抗體專一性鍵結之OD值。PCR呈陰性反應之樣本，自偵測其淨OD值，以其平均值作為試驗的基準。EIA試驗中，樣本之淨OD值為PCR陰性樣本平均OD值兩倍以上時，表示為陽性，反之則為陰性。

臨床樣本以組織學或抹片染色診斷為正常細胞，ASCUS,CIN1,CIN2,CIN3,SCC或腺癌者，進行細胞裂解後，直接披覆於微孔盤 上。比較臨床診斷或抹片結果，以PCR偵測HPV DNA，以EIA偵測HPV蛋白，結果顯示於表20。數據顯示，以抗-E7多株抗體偵測HPV DNA與HPV蛋白之一致性為79%(24個樣本中有19個)，兩者結果不符合率達21%(24個樣本中有5個)，其中3個樣本為PCR陽性，EIA陰性(樣本No.9/CIN1,No.12/CIN2和No.13/CIN2)，表示受HPV感染但，無E7原致癌蛋白之表現，或未偵測到其表現。PCR呈陽性，EIA呈陰性之樣本中，樣本No.4(ASCUS)和No.10(CIN1/ASCUS)可能為PCR偽陰性，或E7原致癌蛋白表現伴隨HPV DNA之缺失。

PCR呈陽性，EIA卻呈陰性之樣本，可能是HPV DNA試驗的偽陽性，或確實為陽性，但HPV原致癌基因蛋白沒有表現，這些結果顯示，HPV EIA試驗可作為臨床篩選子宮頸癌之另一項依據。偵測HPV原致癌蛋白對追蹤結構不良性HSIL是否發生是很重要的，HPV原致癌蛋白可作為早期偵測或篩選子宮頸癌及其他HPV相關癌症之良好生物標記。PCR和EIA試驗皆呈陰性，但卻被診斷為ASCUS或CIN的病例，HPV DNA和原致癌蛋白的無法偵測，可能與病患子宮頸抹片樣本之製備有關，或其抹片染色結果呈偽陽性，儘管如此，仍有許多樣本需進行測試。

2).點墨試驗：將細胞裂解物轉漬在膜上，以一種或多種抗-HPV抗體，偵測生物性樣本中之HPV蛋白

發展一快速且不需儀器判讀結果之試驗，點墨法是一可行的方式，以比色劑提供一可視之結果，偵測膜上細胞裂解物中的HPV蛋白。將來自不同腫瘤病程階段子宮頸細胞收集至液態溶液中，製備成細胞裂解物並轉漬在膜上，先將膜風乾以終止溶液終止轉漬點，加入抗-HPV抗體與轉漬點進行反應，接著加入能與抗-HPV 抗體產生鍵結之二級抗體。每一步驟間清洗轉漬點，以避免非特異性鍵結之抗體附著於膜上，最後加入TMB呈色試劑，細胞裂解物與抗-HPV抗體產生鍵結者，在試驗中即呈藍色陽性反應。HPV重組蛋白亦轉漬在膜上，作為正控制組或負控制組。

圖13A說明以抗-HPV L1老鼠單株抗體，進行點墨法偵測HPV L1蛋白之結果。第一行為不同SCC子宮頸抹片之液態細胞裂解物，第二行為HPV16 L1重組蛋白，由左至右濃度分別為20,2,0.2和0ug/ml，以A,B,C,D做標示。由第二行點墨的結果顯示，0.2ug/mH濃度以上之HPV16 L1重組蛋白，或純化後之低濃度重組蛋白，以圖13A使用之抗-HPV L1老鼠單株抗體反應呈高度陽性。實驗數據顯示，使用與圖13A相同之抗-HPV L1老鼠單株抗體進行點墨試驗，可偵測來自HPV 16 L1重組蛋白和細胞裂解物中的HPV L1蛋白。

圖13B說明使用與圖13A相同之抗-HPV L1老鼠單株抗體進行另一點墨試驗之結果。第一行和第二行之轉漬點為來自不同SCC子宮頸抹片之液態細胞裂解物，第三行轉漬點則為HPV16 E6,HPV18 E6,HPV16 E7,HPV18 E7,HPV16 L1重組蛋白，由左至右標記為A,B,C,D,E。如結果所示，HPV重組蛋白點3E，以抗-HPV L1抗體進行試驗呈陽性反應，與第三行HPV16 E7和HPV16 E6無反應進行的轉漬點，或HPV18 E7和HPV18 E6反應性弱的轉漬點進行比較。以反應性弱的轉漬點或非特異性鍵結者作為背景值，臨床樣本2C和2E與HPV16 L1重組蛋白具有很強的反應性，結果說明，使用與圖13A相同之抗-HPV L1老鼠單株抗體進行點墨試驗，可偵測來自HPV 16 L1重組蛋白和細胞裂解物中的HPV L1蛋白。

以點墨法偵測HPV E6蛋白，圖14A說明以抗-HPV E6抗體進行點墨分析之結果。如圖所示，第一行為來自不同SCC子宮頸抹片之細胞裂解物溶液(與圖1的第一行相同)，第二行為HPV16 E6重組蛋白，由左至右濃度分別為20,2,0.2和0ug/ml，以A,B,C,D做標示。第二行轉漬點結果顯示，以圖3所使用之抗-HPV E6老鼠單株抗體進行點墨試驗，濃度為20和2ug/ml之HPV E6重組蛋白呈陽性反應，0.2ug/ml和純化後之重組蛋白反應性弱。顯示使用與圖14A相同之抗-HPV E6老鼠單株抗體進行點墨試驗，可偵測來自HPV 16 E6重組蛋白和細胞裂解物中的HPV E6蛋白。

圖13B相同的點墨法亦應用於HPV E6蛋白之偵測。圖14B說明以圖14A相同抗-HPV E6抗體進行點墨試驗偵測HPV E6之結果。如結果所示，第三行HPV16 E6重組蛋白點3A，以抗-HPV 16 E6抗體進行試驗呈陽性反應，與圖13B第三行HPV18 E6反應性弱的轉漬點，或其他無反應進行的轉漬點進行比較。結果說明，抗-HPV16 E6老鼠單株抗體與HPV E6為專一性反應，而不與HPV L1或HPV E7蛋白產生反應。以反應性弱的轉漬點作為背景值或試驗中HPV18 E6之交叉性鍵結，相對於其他反應性適中的轉漬點，樣本2C和2E為反應性很強之轉漬點，樣本2D則無偵測到轉漬點。這些實驗數據顯示，70%(10樣本中有7個樣本)的臨床樣本含有HPV E6蛋白，可利用抗-HPV16 E6老鼠單株抗體進行點墨法試驗加以偵測。

為說明以點墨法偵測HPV E7蛋白，將圖13B和圖14B中相同的轉漬點，以抗-HPV E7老鼠單株抗體偵測HPV E7蛋白，如圖15所示。結果顯示，圖15第三行轉漬點中，HPV18 E7重組蛋白轉漬點3D與抗-HPV E7老鼠單株抗體呈陽性反應，其他HPV重 組蛋白則未偵測到轉漬點，或與HPV16 L1有反應性極弱的轉漬點3E，如圖15第三行所示。這些結果說明，抗-HPV E7老鼠單株抗體與HPV E7為專一性反應，而不與HPV L1或HPV E7蛋白產生交叉反應。以反應性弱的轉漬點作為背景值或試驗中HPV 18 E7之交叉性鍵結，相對於其他無反應性的轉漬點，樣本2C和2E為反應性很強之轉漬點。這些實驗數據顯示，樣本2C和2E含有HPV18 E7蛋白，可利用抗-HPV18 E7老鼠單株抗體進行點墨法試驗加以偵測。

3).抗體微陣列：將抗體轉漬在蛋白質晶片上，以偵測生物性檢體標記的細胞裂解物中之HPV蛋白和細胞內生性蛋白

試舉一例，在蛋白質晶片中，作為蛋白質披覆/鍵結的表面，可為經表面化學處理後之玻璃或膜，可與捕捉試劑或蛋白，產生共價性或非共價性鍵結。轉漬機器上適當的針孔中嵌有捕捉試劑，如重組蛋白、抗原、抗體或其他蛋白質，將其置於適當之緩衝液中，以便於與表面披覆之蛋白或抗體產生鍵結。亦如微孔盤的表面所述，捕捉蛋白或抗體與蛋白質晶片表面化學處理後之表面產生很強的鍵結，保留此表面使捕捉蛋白能與標的蛋白、抗體或抗原產生作用且專一性鍵結，經過多次清洗除去非特異性之鍵結，以接枝上Cy3或Cy5之偵測系統進行偵測。以微陣列掃描器量測轉漬點影像之螢光強度，判定是否產生專一性反應。

在一範例中，抗體微陣列可以蛋白質晶片試驗形式，用來偵測HPV蛋白或其他細胞性蛋白。將欲進行測試的細胞、樣本或培養細胞，收集、離心、清洗後，加以裂解產生細胞裂解物作為分析物。定量細胞裂解物中的蛋白質含量，並標定上生物素、Cy3、Cy-5或其他呈色示劑，以利偵測轉漬點上抗體表面所標記到的蛋 白質之鍵結。蛋白質晶片的表面，依不同的分析和定量技術，可為膜或玻璃表面。

表21說明蛋白質晶片試驗偵測不同HPV蛋白和宿主細胞蛋白表現之結果。抗體微陣列先轉漬上抗體，其可抗HPV和各種細胞蛋白，用來偵測臨床子宮頸抹片樣本中，HPV蛋白和宿主細胞蛋白之表現。10組子宮頸抹片樣本(在表2標記為S1-S10)被診斷為角蛋白鱗狀上皮細胞癌(等級2或3)，保存在液態溶液中被裂解產生蛋白質裂解物，並標記上適當之標記物(如生物素)以利偵測之進行(如卵白素-Cy3)。螢光強度表示樣本中的蛋白質與抗體產生鍵結，抗體包括但不僅限於HPV-16 E7,HPV-16 L1,p63,p53,p21WAF1,p16INK4a，磷酸化Rb和未磷酸化Rb，如表21所示。螢光強度表示特異之蛋白與微陣列上抗體產生專一性鍵結，顯示不同程度之HPV感染，比較並分析於圖6-12。

抗體產生專一性鍵結

比較10組受測之SCC樣本蛋白質之表現，測量樣本特異性之蛋白質螢光強度平均值及標準差，可顯示其蛋白質表現量，如圖16所示。結果顯示，10組子宮頸抹片樣本之細胞裂解物中，各種 HPV蛋白和細胞內生性蛋白可藉抗體微陣列試驗進行偵測，如圖16所示，HPV 16和HPV16 E7這兩種蛋白，與其他細胞性蛋白相較呈過度表現狀態。

比較不同樣本中HPV16的不同，圖17說明來自圖16中子宮頸抹片樣本細胞裂解物，偵測HPV L1蛋白之螢光強度值。結果說明，HPV 16抗體(抗-HPV L1抗體)與HPV蛋白產生鍵結，特別是抗體微陣列上來自子宮頸癌病患之細胞裂解物中所表現的L1病毒蛋白。HPV16 L1蛋白主要表現在樣本S1,S3,S6和S10中，中度表現在樣本S4,S5和S9，在樣本S2,S7和S8中則表現力較差，該樣本可能為另一HPHV病毒型感染，在此試驗中無法被HPV16抗體辨識。

HPV E6和E7蛋白在子宮頸癌HPV原致癌基因中扮演重要角色，為研究HPV E6 E7原致癌蛋白和細胞性蛋白間的交互作用，抗體微陣列試驗可做為一工具，同時偵測HPV蛋白和細胞性蛋白如p53或Rb，該蛋白與受HPV感染影響之HPV原致癌蛋白或細胞性蛋白p16,p21等產生交互作用。P16INK4a常被用來偵測子宮頸癌，為偵測HPV病毒蛋白，如E6或E7原致癌蛋白可做為較好的生物標記，抗體微陣列(蛋白質晶片試驗)分析可同時偵測多種HPV蛋白和細胞性蛋白。圖18說明10組SCC樣本中，HPV E7和p16蛋白表現之偵測和比較，每一樣本之螢光強度值(由1到10)表示抗體微陣列上子宮頸癌患者細胞裂解物中所表現之蛋白，與HPV16 E7和p16INK4a抗體產生專一性鍵結。每一組樣本對HPV E7抗體之螢光強度皆高於p16抗體，顯示HPV E7蛋白表現量較p16蛋白多，結果說明HPV E7是較好的偵測子宮頸癌之標記物。

子宮頸癌HPV影響p53，圖19說明HPV16和p53抗體之螢光強度，顯示HPV感染之臨床樣本中，HPV16的過度表現會抑制p53。比較HPV16和p53的表現，結果顯示，在多數樣本中(S7和S8樣本除外)，p53表現量遠低於HPV16的高度表現，S7和S8可能為其他HPV16以外之病毒型感染。臨床樣本中p53的低度表現顯示，多數的p53蛋白在子宮頸癌發展中被HPV E6原致癌蛋白降解。

說明子宮頸癌HPV影響之E7、視網膜母細胞腫瘤(Rb)蛋白和磷酸化Rb，圖20說明HPV16 E7和pRb抗體之螢光強度，以抗-Rb-磷酸特異性抗體將Rb去活化時，HPV16 E7即過度表現。比較HPV16 E7和Rb-磷酸化之表現，樣本S2中明顯可見HPV16 E7之過度表現抑制磷酸化Rb，結果說明以E7將Rb去活化(與抗-Rb-磷酸抗體反應性降低)，將導致發展中子宮頸癌之腫瘤惡性轉變。

子宮頸癌之蛋白質晶片試驗表現分析，圖21說明樣本S2中被選擇的HPV蛋白和細胞性蛋白之表現分析。研究結果顯示，當其他細胞性蛋白受抑制時，HPV E7和p16皆過度表現，由圖8、圖20和圖21所有結果指出，樣本2中HPV E7蛋白的過度表現，會使Rb去活化並誘導p16INK4a表現，導致腫瘤惡性轉變且使子宮頸癌發展。樣本S1中HPV E7的高度表現可能與Rb無關，因此p16INK4a亦不高度表現。

子宮頸癌中另一細胞蛋白p21 WAF1之表現與p53有關，圖12說明子宮頸抹片細胞之細胞裂解物，偵測其細胞性p21 WAF1及p53蛋白表現之螢光強度值。如圖22所示，10個樣本中有9個樣本(樣本S1除外)的p21WAF1與p53之表現有顯著相關， 研究結果顯示，經由HPV E6路徑抑制p21WAF1，可使腫瘤壓制基因p53被降解，因而導致腫瘤惡性轉變成子宮頸癌之發展。

蛋白質晶片試驗可作為偵測HPV蛋白之工具，亦可偵測惡性癌症發展中受HPV感染所誘導或抑制之細胞性蛋白。本發明所使用之蛋白質晶片試驗研究結果說明，本研究中之子宮頸癌病患其患病路徑不同，因此癌症發展狀況亦不同。本技術應用於其他HPV相關性癌症，用以預測惡性腫瘤之發展路徑，亦可發展相關之數據分析，在癌症發展路徑過程中辨識各個相關性之蛋白，因此，可發展出針對個人用藥之特異性治療。

8.將抗-HP一級抗體捕捉於一表面，經抗-HPV二次抗體進行辨識，偵測生物檢體中之HPV蛋白

抗原三明治試驗法是以蛋白質晶片、一層膜或微孔盤為底，在其表面披覆一層一級抗體，如捕捉抗體或點樣抗體，該抗體對感興趣之抗原具有親和力，並能產生鍵結。感興趣之抗原可能為HPV蛋白、原致癌蛋白、外鞘蛋白，其帶有HPV病毒基因，如早期基因或晚期基因。阻斷晶片表面未鍵結部分後，受分析的臨床樣本可與捕捉抗體產生鍵結形成一免疫複合體，經二級抗體或偵測性抗體鍵結至感興趣之抗原加以偵測。因此，一級抗體、二級抗體、捕捉抗體對和偵測性抗體與感興趣之抗原交互作用，狀似三明治，故有三明治試驗法之稱。捕捉性抗體或點樣抗體可以是相同的或不同的抗體，其與偵測性抗體可對感興趣之抗原如HPV病毒蛋白、HPV原致癌蛋白和外鞘蛋白等產生專一性鍵結。

其次，三明治鍵結之抗原-抗體複合體可以二級抗體進行偵測，該抗體對偵測抗體具有親和力，且可以標準免疫複合體偵測系統簡單被測量，如比色劑、化學冷光、螢光和其他不同種類之 基質。最後的數據讀取和呈現，藉由儀器設定進行適當之吸收光讀取，或直接以目視與控制組進行比較。陽性反應結果表示臨床樣本中所表現的感興趣之抗原，與一級抗體、捕捉抗體和偵測性抗體產生鍵結；反之，陰性反應則表示一級抗體未與感興趣之抗原產生鍵結，代表臨床樣本中不存在感興趣之抗原。

1).酵素結合免疫吸附試驗：上微孔盤上披覆抗-HPV一級抗體，藉由抗-HPV二級抗體偵測HPV蛋白

說明三明治在微孔盤上進行酵素結合免疫吸附試驗，將診斷出含有SCC、HPV PCR陽性或HPV PCR陰性之血清加以稀釋，製備成細胞裂解物，以進行HPV E6,E7或L1蛋白之存在。試驗步驟為，披覆一層兔子抗-E6,E7或L1之單株抗體作為一級抗體，加上細胞裂解物(血清)，以及其相關之抗-HPV二級抗體，再以另一接枝有HRP之抗體進行偵測，與基質和終止試劑培養後，以微孔盤分析儀測量OD 450吸收值。如圖8所示，實驗結果說明ELISA試驗以兔子抗-HPV多株抗體，可偵測被診斷為SCC、HPV陽性或HPV陰性之人類血清樣本中，HPV E6,E7和L1蛋白之表現。

圖23說明從被診斷為SCC、HPV陽性之病患血清中，以HPV陰性作為控制組，可偵測E6,E7原致癌蛋白和L1病毒蛋白。實驗數據顯示，相較於E6和L1蛋白，E7蛋白是血清中的主要蛋白；相對於HPV陰性樣本，E6及E7蛋白是SCC和HPV陽性樣本中的主要蛋白，而HPV陽性樣本並無L1病毒蛋白之表現，在其他案例中，L1蛋白的表現皆不及E6和E7蛋白。這些結果說明，依病毒感染的程度或週期不同，血清中的L1蛋白可能表現或不表現；而SCC和HPV陽性樣本皆在血清偵測到E6或E7原致癌蛋 白，標示E6或E7是HPV血清偵測較好的生物標記。此為從血清中偵測到E6,E7原致癌蛋白的第一份報告，需要更多的血清樣本進行分析。

2).流式磁珠試驗：在一磁珠上披覆抗-HPV一級抗體，藉由抗-HPV二級抗體偵測HPV蛋白

將抗-HPV一級抗體披覆在磁珠表面，與生物性檢體細胞裂解物中之HPV蛋白進行反應，在磁珠表面形成一複合體，以捕捉抗-HPV二級抗體。當抗-HPV二級抗體事先被標記時，該複合體可直接被偵測到，或加入能與二級抗體產生鍵結之預標記抗體，即可偵測到該複合體。預標記抗體可用偵測性抗原加以標記，包含但不僅限於辣根過氧化酶、生物素、奈米金粒子、螢光染劑或其加以結合。試舉一例，在磁珠固態表面上之複合體，利用抗-老鼠或兔子PE作為二級抗體，便可由FACS(螢光活化細胞分類計)進行偵測。當多種HPV蛋白被捕捉至磁珠表面時，標記有不同螢光染劑之多種抗-HPV二級抗體，可同時被FACS偵測。因此以FACS進行磁珠試驗是一有利的多重試驗工具，用來偵測生物性檢體中一種或多種以上之HPV蛋白。

T型磁珠試驗可應用於偵測各式HPV蛋白，利用各式抗-HPV E6,HPV E7或HPV L1抗體作為披覆和偵測性抗體，偵測HPV E6,HPV E7和HPV L1蛋白。圖24-27說明以FACS進行磁珠試驗，偵測HPV 16 L1,HPV 16E6,HPV 18 E6和HPV 16E7蛋白之結果。圖24說明以FACS進行三明治磁珠試驗，以兔子抗-HPV16 L1多株抗體作為披覆抗體，以及老鼠抗-HPV16 L1單株抗體作為偵測性抗體，再以接枝上PE試劑之老鼠抗體作為二級抗體，偵測HPV16L1重組蛋白。如數據所示，含有純化後HPV16 L1重組蛋 白之樣本被捕捉在磁珠表面，以FACS進行偵測，可顯示出不連續的波峰，表示有很強的螢光PE(波峰位於圖24右邊)來自含有樣本之緩衝溶液，作為試驗的負控制組(波峰位於圖24左邊)。實驗結果顯示，未偵測到蛋白質表現之控制組樣本(平均值約為12)和含有特異性偵測蛋白之樣本(平均值約為2958)螢光強度差異達250倍，表示該磁珠試驗分析方法，可動態分析不同程度臨床樣本中HPV L1蛋白之表現。

在另一範例中，圖25說明以兔子抗-HPV16 E6多株抗體作為披覆抗體，以及老鼠抗-HPV16 E6單株抗體作為偵測性抗體，再以接枝上PE試劑之老鼠抗體作為二級抗體，以FACS進行三明治磁珠試驗，偵測HPV16 E6重組蛋白。如數據所示，含有純化後HPV16 E6重組蛋白之樣本被捕捉在磁珠表面，以FACS進行偵測，可顯示出不連續的波峰，表示有很強的螢光PE(波峰位於圖25右邊)來自含有樣本之緩衝溶液，作為試驗的負控制組(波峰位於圖25左邊)。實驗結果顯示，未偵測到蛋白質表現之控制組樣本(平均值約為17)和含有特異性偵測蛋白之樣本(平均值約為114)螢光強度差異達7倍，表示該磁珠試驗分析方法，可動態分析不同程度臨床樣本中HPV E6L1蛋白之表現。

圖26說明以兔子抗-HPV18 E6多株抗體作為披覆抗體，以及老鼠抗-HPV18 E6單株抗體作為偵測性抗體，再以接枝上PE試劑之老鼠抗體作為二級抗體，以FACS進行三明治磁珠試驗，偵測HPV16 E6重組蛋白。如數據所示，含有純化後HPV18 E6重組蛋白之樣本被捕捉在磁珠表面，以FACS進行偵測，可顯示出不連續的波峰，表示有很強的螢光PE(波峰位於圖26右邊)來自含有樣本之緩衝溶液，作為試驗的負控制組(波峰位於圖26左邊)。實驗結果顯示，未偵測到蛋白質表現之控制組樣本(平均值約為 148)和含有特異性偵測蛋白之樣本(平均值約為2294)螢光強度差異達15倍，表示該磁珠試驗分析方法，可動態分析不同程度臨床樣本中HPV 18E6蛋白之表現。

圖27說明以兔子抗-HPV16 E7多株抗體作為披覆抗體，以及老鼠抗-HPV16 E7單株抗體作為偵測性抗體，再以接枝上PE試劑之老鼠抗體作為二級抗體，以FACS進行三明治磁珠試驗，偵測HPV16 E7重組蛋白。如數據所示，含有純化後HPV16 E7重組蛋白之樣本被捕捉在磁珠表面，以FACS進行偵測，可顯示出不連續的波峰，表示有很強的螢光PE(波峰位於圖27右邊)來自含有樣本之緩衝溶液，作為試驗的負控制組(波峰位於圖27左邊)。實驗結果顯示，未偵測到蛋白質表現之控制組樣本(平均值約為5.5)和含有特異性偵測蛋白之樣本(平均值約為673)螢光強度差異達122倍，表示該磁珠試驗分析方法，可動態分析不同程度臨床樣本中HPV 16 E7蛋白之表現。

磁珠試驗之表現方式隨披覆抗體的改變而異，圖28-29說明不同的試驗方法偵測HPV 16 E6和HPV 18 E6，並與圖25和圖26做比較。圖28說明以兔子抗-HPV16 E6多株抗體作為披覆抗體，以及老鼠抗-HPV16 L1單株抗體作為偵測性抗體，再以接枝上PE試劑之老鼠抗體作為二級抗體，以FACS進行三明治磁珠試驗，偵測HPV16 E6重組蛋白。如數據所示，含有純化後HPV16 E6重組蛋白之樣本被捕捉在磁珠表面，以FACS進行偵測，可顯示出不連續的波峰，表示有很強的螢光PE(波峰位於圖28右邊)來自含有樣本之緩衝溶液，作為試驗的負控制組(波峰位於圖28左邊)。實驗結果顯示，未偵測到蛋白質表現之控制組樣本(平均值約為1223)和含有特異性偵測蛋白之樣本(平均值約為2755)螢光強度差異達2倍；比較圖28和圖25磁珠試驗偵測HPV 16 E6 蛋白之結果，顯示圖25提供較大之動態偵測範圍，可偵測臨床樣本中各種不同含量之HPV E6蛋白表現。

在另一範例中，圖29說明以兔子抗-HPV18 E6多株抗體作為披覆抗體，以及老鼠抗-HPV18 E6單株抗體作為偵測性抗體，再以接枝上PE試劑之老鼠抗體作為二級抗體，以FACS進行三明治磁珠試驗，偵測HPV18 E6重組蛋白。如數據所示，含有純化後HPV18 E6重組蛋白之樣本被捕捉在磁珠表面，以FACS進行偵測，可顯示出不連續的波峰，表示有很強的螢光PE(波峰位於圖29右邊)來自含有樣本之緩衝溶液，作為試驗的負控制組(波峰位於圖29左邊)。實驗結果顯示，未偵測到蛋白質表現之控制組樣本(平均值約為787)和含有特異性偵測蛋白之樣本(平均值約為3803)螢光強度差異達5倍。比較圖29和圖26磁珠試驗偵測HPV18 E6蛋白之結果，顯示圖26提供較大之動態偵測範圍，可偵測臨床樣本中各種不同含量之HPV E6蛋白表現。

3).快速流體試驗偵測HPV感染：快速免疫學試驗可在膜上垂直進行或在試片上平行進行。測流或擴散單步驟快速免疫試驗亦可指免疫層析試驗，簡易之始用方式花費約5-15分鐘便可得到結果，且不需經過訓練或儀器分析。該試驗基本原理為固態硝化纖維或含有捕捉試劑之試片，與抹片樣本進行反應，若病患樣本含有標的試劑，硝化纖維上的捕捉試劑便與其產生反應形成複合體，並藉由擴散或毛細反應轉移到硝化纖維上。

試膜或試棒亦可用於樣本收集或與棉質紗布共同或單獨使用，以便所設計的免疫反應開始進行，能即時獲得測試之結果，亦如在人體中插入探視鏡後，便可立即觀測內子宮頸。因此，單步驟快速免疫試驗可作為一級初步篩選方法，使用於HPV確認試 驗，如抹片細胞學測試、免疫學試驗和核酸雜交試驗或其組合試驗之前。

重直快速免疫試驗，在一有膜作為捕捉/鍵結表面，用以披覆或轉漬捕捉試劑的設備中進行；。該設備在膜下方含有一襯墊，以利樣本和試驗試劑流過試膜。樣本中所包含的任何標的蛋白、抗體或抗原，可以捕捉試劑產生特異性反應並鍵結，因此不過流過試膜，即使經過多次清洗步驟除去非特異性之鍵結，被捕捉到的樣本仍可維持在膜表面上。接枝有HRP或其他物質的二級抗體可應用於膜表面，偵測維持在膜上的任何蛋白-抗體複合物，且可藉由呈色試劑達可視之觀察。

本發明所提供之單步驟快速免疫試驗，是一種非侵入式且簡單進行的試驗方法，如同一般臨櫃購得之懷孕檢測方法，不需任何特殊之儀器。單步驟快速免疫試驗可作為活體之免疫層析試驗，可直接定性分析一般HPV抗原、高風險HPV病毒型之特殊抗原或HPV相關之抗體。單步驟快速免疫試驗可作為護理站診斷、小診所或實驗室中抹片檢查之輔助。單步驟快速免疫試驗適於在室溫下，簡單加入不需經過稀釋的樣本，稍待一段反應時間後，便可產生可視之結果。

測流快速免疫試驗是一單步驟試驗方法，預先將捕捉蛋白或抗體披覆在膜試片表面，帶有標的蛋白或抗體之樣本接枝上偵測性抗體，並與奈米金粒子結合，直接將結合物應用於膜試片，使樣本測向流過膜試片，直至到達試片表面所設計之位置。捕捉-標的-偵測性蛋白-免疫複合體，在所設計的位置捕捉蛋白或抗體披覆處成形且維持在膜表面，在設計位置處不需經過清洗或分離，即 可視陽性反應之結果，因此稱為單步驟反應。整個試驗步驟僅耗時低於15分鐘，因此稱為單步驟快速測試。

單步驟快速免疫層析試驗是一個簡單、快速且操作簡易之試驗方法，可方便使用於照護站。本發明提供受試之樣本與偵測抗體之混合物，該混合物可貼附或先固定於膜表面或玻璃上，在適當之培養溫度下(如室溫)反應數分鐘。反應時間可依試驗之反應條件和偵測抗體之品質而縮短，因此快速免疫試驗之等待時間短，試驗不需經由儀器偵測便可得可視之結果。

A.)單步驟HPV測流試驗：將抗-HPV一級抗體固定於試膜上，以接枝有奈米金粒子之抗-HPV二級抗體進行偵測

單步驟快速免疫試驗可以是膜或固定有捕捉試劑之測試棒，捕捉試劑如純化後之HPV抗體、重組蛋白或HPV相關之抗體和蛋白質等，其所捕捉之標的試劑，如臨床樣本中之HPV相關之抗體和蛋白等，接著以免疫試驗系統進行偵測。

圖30A-30G說明以本發明描述之抗體，進行單步驟測流試驗，偵測HPV蛋白。圖30A說明以兔子抗-L1多株抗體固定於膜上，並接枝奈米金粒子，進行單步驟測流試驗偵測HPV L1重組蛋白。試驗控制組(TC)顯示於第一條線上，第二條線(箭號)為陽性反應，右邊箭號無可見之帶紋者為陰性反應。L1重組蛋白濃度由左至右為6,3,1.5,0.75,0.375,0ug/ml。實驗數據顯示，單步驟HPV測流試驗可偵測濃度低於375ng/ml之HPV L1重組蛋白。

快速測流試驗可偵測臨床樣本中之HPV L1蛋白，圖30B說明以圖30A相同兔子抗-L1多株抗體固定於膜上，偵測血清樣本中HPV L1蛋白之結果。試驗控制組(TC)顯示於第一條線上， 第二條線(箭號)為陽性反應說明SCC病患之血清樣本中偵測到L1蛋白(左邊)，經PCR因為HPV陰性之血清無可見之帶紋，作為試驗中之陰性控制組(右邊)。實驗數據顯示，單步驟HPV測流試驗可經由比較HPV陰性血清，偵測SCC血清樣本中之HPV L1蛋白。

快速測流試驗可偵測HPV E6蛋白，圖30C說明以老鼠抗-HPV E6單株抗體固定於膜上，並接枝奈米金粒子，進行單步驟測流試驗偵測HPV E6蛋白。試驗控制組(TC)顯示於第一條線上，第二條線(箭號)為陽性反應，右邊箭號無可見之帶紋者為陰性反應。E6重組蛋白濃度由左至右為10,2,0ug/ml。實驗數據顯示，單步驟HPV測流試驗可偵測濃度低於2ug/ml之HPV E6重組蛋白。

測流試驗系統可進一步用來偵測臨床樣本中之HPV E6蛋白圖30D說明以圖30C相同老鼠抗-E6單株抗體固定於膜上，偵測血清樣本中HPV E6蛋白之結果。試驗控制組(TC)顯示於第一條線上，第二條線(箭號)為陽性反應說明SCC血清樣本(由左邊開始第一及第二)中E6蛋白呈偵測陽性，經PCR反應為HPV陰性之血清無可見之帶紋，作為試驗中之陰性控制組(右邊)。實驗數據顯示，單步驟HPV測流試驗可經由比較HPV陰性血清，偵測SCC血清樣本中之HPV E6蛋白。

圖30E說明以另一老鼠抗-E6單株抗體固定於膜上，並接枝奈米金粒子，進行單步驟測流試驗偵測HPV E6重組蛋白。試驗控制組(TC)顯示於第一條線上，第二條線(箭號)為陽性反應，右邊箭號無可見之帶紋者為陰性反應。E6重組蛋白濃度由左至右為 875,438,0ug/ml。實驗數據顯示，單步驟HPV測流試驗可偵測濃度低於435ng/ml之HPV E6重組蛋白。

快速測流試驗可偵測HPV E7蛋白，圖30F說明以老鼠抗-HPV E7單株抗體固定於膜上，並接枝奈米金粒子，進行單步驟測流試驗偵測HPV E7蛋白。試驗控制組(TC)顯示於第一條線上，第二條線(箭號)為陽性反應，右邊箭號無可見之帶紋者為陰性反應。E7重組蛋白濃度由左至右為0,660,66,6.6,0.66ug/ml。實驗數據顯示，單步驟HPV測流試驗可偵測濃度低於660ug/ml之HPV E7重組蛋白。

測流試驗系統可進一步用來偵測臨床樣本中之HPV E7蛋白，圖30G說明以圖30F相同老鼠抗-HPV E7單株抗體固定於膜上，偵測血清樣本中HPV E7蛋白之結果。試驗控制組(TC)顯示於第一條線上，說明PCR反應呈HPV陽性(左邊)之血清樣本E7蛋白呈陽性偵測，經PCR反應為HPV陰性之血清無可見之帶紋，作為試驗中之陰性控制組(右邊)。實驗數據顯示，單步驟HPV測流試驗可經由比較HPV陰性血清，偵測已知HPV陽性血清樣本中之HPV E7蛋白。

一種或多種以上之免疫學試驗，使用抗體和由早期或晚期基因所純化後之重組蛋白，針對HPV感染發生時，做為可信之指標物質。此外，HPV相關惡性腫瘤或腫瘤前之細胞轉換皆可以試驗分析，其中本發明最有用之面項為診斷子宮頸癌、鱗狀上皮細胞和腺癌等，任何與HPV感染原致癌基因相關之不正常表皮細胞，如細胞空洞、過度角質化，癌前病灶包括上皮細胞變性或內皮細胞病灶、高度結構不良增生，以及非侵襲性或惡性癌症。

HPV感染之早期診斷在成功預防和治療子宮頸癌中扮演重要角色。子宮頸癌之預防階段，需要促進普遍人口之大範圍的HPV試驗/篩選方式，並對過去和現在有HPV感染病史和癌前病灶之病患進行追蹤。最重要的是，12-15歲的女性感染HPV將可能導致非侵襲型性癌症的發展，因此本發明所述女性早期篩選HPV感染之生物標記試驗便相當重要，該試驗可早期治療HPV感染病預防子宮頸癌的發展，而不需依賴化學治療或放射性治療癌症惡性腫瘤。

圖1A說明以抗-E7單株抗體經免疫組織化學(IHC)微陣列染色，鱗狀上皮癌(SCC)組織的代表性圖。

圖1B說明圖1A之SCC個案正常上皮細胞(與腫瘤組織相距15mm)代表性圖。

圖1C說明以相同抗-E7單株抗體，經免疫組織化學(IHC)微陣列染色SCC樣本的代表性圖。

圖1D說明圖1C腫瘤細胞之細胞質染色放大代表性圖。

圖2A說明以抗-E7單株抗體，經IHC染色腺癌(ADC)腫瘤細胞樣本之代表性圖。

圖2B說明圖2A腺癌樣本之相關正常上皮細胞(與腫瘤組織相距15mm)代表性圖。

圖2C說明圖2A腺癌細胞之細胞質染色放大代表性圖。

圖3A說明CIN3結構不良細胞代表性染色圖，依據另一發明實施案例，以老鼠單株抗-HPV E7抗體進行IHC試驗。

圖3B說明圖2A結構不良上皮細胞之放大表表性圖，指出CIN3結構不良之細胞核染色。

圖4A說明CIN2結構不良細胞代表性染色圖，依據一發明實施案例，以老鼠抗-HPV E6單株抗體進行IHC試驗。

圖4B說明圖1A之CIN2樣本結構不良組織鄰近之正常上皮細胞代表性染色圖，以相同老鼠抗-HPV E6單株抗體進行IHC試驗。

圖4C說明CIN3組織之結構不良性上皮細胞染色結果，依據另一發明實施案例，以與圖1A相同之老鼠抗-HPV E6單株抗體進行IHC試驗。

圖4D說明另一CIN3組織之結構不良性上皮細胞染色結果，依據另一發明實施案例，以與圖1C相同之老鼠抗-HPV E6單株抗體進行IHC試驗。

圖5A說明臨床檢體診斷為非典型鱗狀細胞(ASCUS)之染色結果，依據一發明實施案例，在溶液中以老鼠抗-HPV E6單株抗體進行ICC試驗。

圖5B說明與圖5A相同之臨床檢體染色結果，依據一發明實施案例，以老鼠抗-HPV E7單株抗體進行ICC試驗。

圖6A說明臨床檢體診斷為CIN2之染色結果，依據一發明實施案例，在溶液中以老鼠抗-HPV E7單株抗體進行ICC試驗。

圖6B說明另一診斷為CIN2臨床檢體之染色結果，依據另一發明實施案例，在溶液中以老鼠抗-HPV E6單株抗體進行ICC試驗。

圖7A說明臨床檢體診斷為CIN3之染色結果，依據另一發明實施案例，在溶液中以老鼠抗-HPV E6單株抗體進行ICC試驗。

圖7B說明另一也診斷為CIN3臨床檢體之染色結果，以圖7A相同之老鼠抗-HPV E6單株抗體進行染色。

圖7C說明與圖7B相同之臨床檢體的另一ICC染色圖，以相同老鼠抗-HPV E6單株抗體進行染色。

圖7D說明與圖7B相同之臨床檢體的另一ICC染色圖，以相同老鼠抗-HPV E6單株抗體進行染色。

圖7E說明與圖7B相同之CIN3樣本的另一ICC染色圖，但依據另一發明實施案例，以老鼠抗-HPV E7單株抗體進行染色。

圖7F說明與圖7E相同之CIN3樣本的另一ICC染色圖，以相同之老鼠抗-HPV E7單株抗體進行染色。

圖7G說明與圖7B相同之CIN3樣本染色結果，但以老鼠抗-p16單株抗體進行ICC試驗。

圖8說明臨床診斷為腺癌之染色結果，依據另一發明實施案例，以老鼠抗-HPV E6單株抗體進行ICC試驗。

圖9A說明臨床診斷為鱗狀上皮癌(SCC)之染色結果，依據另一發明實施案例，以老鼠抗-HPV E6單株抗體進行ICC試驗。

圖9B說明與圖9A相同之SCC樣本染色結果，依據另一發明實施案例，以老鼠抗-HPV E7單株抗體進行ICC試驗。

圖9C說明與圖9A相同之SCC樣本染色結果，依據另一發明實施案例，以老鼠抗-p16單株抗體進行ICC試驗。

圖10A說明臨床診斷為正常樣本之染色結果，依據另一發明實施案例，以老鼠抗-HPV E6單株抗體進行ICC試驗。

圖10B說明與圖6A相同之臨床樣本染色結果，依據另一發明實施案例，以老鼠抗-HPV E7單株抗體進行ICC試驗。

圖11A說明另一子宮頸抹片樣本之細胞質染色結果，依據另一發明實施案例，以老鼠抗-HPV E6單株抗體進行ICC試驗。

圖11B說明與圖11A相同樣本之細胞核染色結果，以老鼠抗-HPV E7單株抗體進行試驗。

圖11C說明另一子宮頸抹片樣本之細胞質染色結果，以老鼠抗-HPV E6單株抗體進行試驗。

圖12A說明臨床診斷為CIN1樣本之染色結果，依據另一發明實施案例，以老鼠抗-HPV E6單株抗體進行ICC試驗。

圖12B說明與圖12A相同CIN1樣本之另一ICC染色結果，以相同老鼠抗-HPV E6單株抗體進行試驗。

圖12C說明與圖12A相同CIN1樣本之另一ICC染色結果，以相同老鼠抗-HPV E6單株抗體進行試驗。

圖12D說明與圖12A相同CIN1樣本之另一ICC染色結果，但依據另一發明實施案例，以老鼠抗-HPV E7單株抗體進行ICC試驗。

圖12E說明與圖12D相同CIN1樣本之另一ICC染色結果，以相同老鼠抗-HPV E7單株抗體進行試驗。

圖12F說明與圖12A相同CIN1樣本之染色結果，依據另一發明實施案例，以老鼠抗-p16單株抗體進行ICC試驗。

圖13A說明偵測HPV L1蛋白之墨點法結果，依據一發明實施案例，以老鼠抗-HPV L1單株抗體進行試驗。

圖13B說明另一偵測HPV L1蛋白之墨點法結果，以與圖1相同之老鼠抗-HPV L1抗體進行試驗。

圖14A說明與圖13A相同偵測HPV E6蛋白墨點法之結果，依據另一發明實施案例，以老鼠抗-HPV E6單株抗體進行試驗。

圖14B說明與圖13B相同偵測HPV E6蛋白墨點法之結果，依據另一發明實施案例，使用與圖14A相同之老鼠抗-HPV E6單株抗體進行試驗。

圖15說明與圖13A及圖14A相同墨點法之結果，依據另一發明實施案例，以老鼠抗-HPV E7單株抗體偵測HPV E7蛋白。

圖16說明由10組子宮頸抹片樣本之細胞裂解物，抗體微陣列試驗分析之平均螢光強度結果，依據另一發明實施案例，偵測各式HPV蛋白和細胞內生性蛋白質。

圖17為圖16中10組細胞裂解物每一樣本之螢光強度結果，依據發明另一實施案例，偵測HPV L1蛋白。

圖18為圖16中10組細胞裂解物每一樣本之抗體微陣列分析螢光強度結果，依據發明另一實施案例，偵測HPV E7蛋白以及細胞p16 INK4a蛋白。

圖19為圖16中10組細胞裂解物每一樣本之抗體微陣列分析螢光強度結果，依據發明另一實施案例，偵測HPV L1蛋白以及細胞p53蛋白。

圖20為圖16中10組細胞裂解物每一樣本之抗體微陣列分析螢光強度結果，依據發明另一實施案例，偵測HPV E7蛋白以及來自Rb蛋白之細胞磷酸鹽。

圖21為另一圖片說明樣本S2之抗體微陣列分析螢光強度結果。

圖22圖16中10組細胞裂解物每一樣本之抗體微陣列分析螢光強度結果，依據發明另一實施案例，偵測細胞p21 WAF1以及p53蛋白。

圖23說明ELISA試驗結果，針對臨床診斷為鱗狀上皮癌(SCC)，或與HPV陰性血清樣本比對後為HPV陽性(經PCR測試)之人體血清樣本，偵測其HPV E6,E7和L1蛋白，依據發明另一實施案例，以兔子抗-HPV多株抗體作為披覆及偵測。

圖24說明以螢光活化細胞分類計(FACS)進行三明治型免疫分析法偵測HPV16 L1重組蛋白之結果，以老鼠抗-HPV16 L1 單株抗體作為披覆抗體，以兔子抗-HPV16 L1多株抗體作為偵測抗體。

圖25說明以螢光活化細胞分類計(FACS)進行三明治型免疫分析法偵測HPV16 E6重組蛋白之結果，以老鼠抗-HPV16 E6單株抗體作為披覆抗體，以兔子抗-HPV16 E6多株抗體作為偵測抗體。

圖26說明以螢光活化細胞分類計(FACS)進行三明治型免疫分析法偵測HPV18 E6重組蛋白之結果，以老鼠抗-HPV18 E6單株抗體作為披覆抗體，以兔子抗-HPV18 E6多株抗體作為偵測抗體。

圖27說明以螢光活化細胞分類計(FACS)進行三明治型免疫分析法偵測HPV16 E7重組蛋白之結果，以老鼠抗-HPV16 E7單株抗體作為披覆抗體，以兔子抗-HPV16 E7多株抗體作為偵測抗體。

圖28說明以螢光活化細胞分類計(FACS)進行三明治型免疫分析法偵測HPV16 E6重組蛋白之結果，以老鼠抗-HPV16 E6單株抗體作為披覆抗體，以兔子抗-HPV16 E6多株抗體作為偵測抗體。

圖29說明以螢光活化細胞分類計(FACS)進行三明治型免疫分析法偵測HPV18 E6重組蛋白之結果，以老鼠抗-HPV18 E6單株抗體作為披覆抗體，以兔子抗-HPV18 E6多株抗體作為偵測抗體。

圖30A說明單步驟測流試驗偵測HPV L1重組蛋白(由左至右：875,435,0ug/ml)之結果，將兔子抗-HPV L1多株抗體由膜上除去，並與金粒子接枝(作為偵測試劑)。

圖30B說明單步驟測流試驗偵測鱗狀上皮癌(SCC)病患血清樣本(左)HPV L1重組蛋白之結果，與正常血清(HPV陰性)做比較，使用與圖30B相同之方法。

圖30C說明單步驟測流試驗偵測HPV E6重組蛋白(由左至右：10,2,0ug/ml)之結果，將老鼠抗-HPV E6單株抗體由膜上除去，並與金粒子接枝做偵測。

圖30D說明單步驟測流試驗偵測鱗狀上皮癌(SCC)病患血清樣本(由左至右為第一及第二)HPV L1蛋白之結果，與正常血清(HPV陰性)做比較，使用與圖30C相同之方法。

圖30E說明單步驟測流試驗偵測HPV E6重組蛋白(由左至右：875,435,0ug/ml)之結果，將另一老鼠抗-HPV E6單株抗體由膜上除去，並與金粒子接枝做偵測。

圖30F說明單步驟測流試驗偵測HPV E7重組蛋白(由左至右：0,660,66,6.6,0.66ug/ml)之結果，將老鼠抗-HPV E7單株抗體由膜上除去，並與金粒子接枝做偵測。

圖30G說明單步驟測流試驗偵測HPV陽性患血清樣本(左)HPV E7蛋白之結果，與HPV陰性血清(右)做比較，使用與圖30F相同之方法。

Claims (35)

1. 一種偵測及分期人類乳突狀病毒感染的方法，包括：提供一人類樣本進行一免疫學試驗；以該人類樣本進行一免疫學試驗，其中該免疫學試驗包含以至少一單株抗體或一多株抗體對該人類樣本之細胞進行染色，該單株抗體或該多株抗體會與至少一人類乳突狀病毒蛋白原位結合，以得到一細胞染色位置，其中該人類乳突狀病毒蛋白為HPV E6蛋白、HPV E7蛋白或HPV L1蛋白；以及以該細胞染色位置，判斷該人類樣本感染乳突狀病毒的疾病分期，其中當細胞核染色呈陽性反應時，判斷疾病發展階段係為早期，當細胞質及細胞核染色呈陽性反應時，判斷疾病發展階段係為晚期。
2. 根據申請專利範圍第1項之方法，處於早期發展階段之疾病為低度鱗狀上皮細胞病變(LSIL)、高度鱗狀上皮細胞病變(HSIL)、子宮頸上皮內贅瘤伴隨輕度細胞變異(CIN1)或子宮頸上皮內贅瘤伴隨增生性病兆(CIN2)。
3. 根據申請專利範圍第1項之方法，處於晚期發展階段之疾病為高度鱗狀上皮細胞病變(HSIL)、子宮頸上皮內贅瘤伴隨增生性病兆(CIN2)、子宮頸上皮內贅瘤伴隨結構不良性增生(CIN3)、侵襲性子宮頸癌、鱗狀上皮細胞癌(SCC)或腺癌。
4. 根據申請專利範圍第1項之方法，處於晚期發展階段之疾病為高度鱗狀上皮細胞病變(HSIL)、子宮頸上皮內贅瘤伴隨結構不良 性增生(CIN3)、侵襲性子宮頸癌、鱗狀上皮細胞癌(SCC)或腺癌。
5. 根據申請專利範圍第1項之方法，該單株抗體為抗-HPV E6單株抗體、抗-HPV E7單株抗體、抗-HPV L1單株抗體或其組合。
6. 根據申請專利範圍第5項之方法，其中該人類乳突狀病毒蛋白之人類乳突狀病毒型為HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV39、HPV44、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV58、HPV59、HPV66或HPV68。
7. 根據申請專利範圍第6項之方法，該人類乳突狀病毒蛋白之人類乳突狀病毒型為HPV16、HPV18或其組合。
8. 根據申請專利範圍第1項之方法，該免疫學試驗為免疫組織化學染色法(Immunohistochemistry,IHC)、免疫細胞化學染色法(Immunocytochemistry,ICC)或流式細胞儀試驗(Fluorescence-activated cell sorter,FACS)。
9. 一種偵測及分期人類乳突狀病毒感染之方法，包含：將一來自人類的細胞樣本製備成一細胞裂解物溶液；將該細胞裂解物溶液披覆於一部分之固態表面；提供一抗-HPV的單株抗體與該細胞裂解物溶液反應，其中該單株抗體與一特定人類乳突病毒蛋白原位結合以形成一複合體於該部分之固態表面的上方，其中該人類乳突病毒蛋白為天然HPV E6蛋白、天然HPV E7蛋白或天然HPV L1蛋白；偵測該部分之固態表面上方的該複合體，其中該複合體的 表現係用來指示人類乳突蛋白是否表現於該細胞樣本；以及以複合體的表現量判斷該細胞樣本之感染人類乳突病毒的疾病分期，其中該複合體的表現越多，判斷疾病發展階段係越為晚期。
10. 根據申請專利範圍第9項之方法，其中該人類乳突狀病毒蛋白之人類乳突狀病毒型為HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV39、HPV44、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV58、HPV59、HPV66或HPV68。
11. 根據申請專利範圍第9項之方法，其中該固態表面為磁珠表面、試紙表面、快速試驗試紙表面、膜表面、重直流系統膜表面、微流系統表面、轉漬膜表面、蛋白質晶片表面、玻璃表面或微孔盤底部表面。
12. 根據申請專利範圍第11項之方法，以螢光活化細胞分類計(FACS)偵測各式磁珠固態表面之複合體。
13. 根據申請專利範圍第11項之方法，以抗-HPV一級抗體固著於試紙一端，於試紙另一端加入抗-HPV二級抗體和細胞裂解物溶液，在溶液測向流經試紙表面前，便與抗-HPV一級抗體形成一複合體而可被加以偵測。
14. 根據申請專利範圍第11項之方法，以抗-HPV一級抗體固著於重直流系統之膜表面，並依序加入抗-HPV二級抗體和細胞裂解物溶液，當溶液流經重直流快速測試系統時，與抗-HPV一級抗體形 成一複合體而可被加以偵測。
15. 根據申請專利範圍第11項之方法，複合體流經微流體系統，可在其表面被偵測到。
16. 根據申請專利範圍第9項之方法，細胞裂解物溶液中之各該人類乳突病毒蛋白，與抗-HPV抗體進行反應前，被披覆於固態表面。
17. 根據申請專利範圍第16項之方法，細胞裂解物溶液中之各該人類乳突病毒蛋白，被披覆於轉漬膜之固態表面。
18. 根據申請專利範圍第16項之方法，細胞裂解物溶液中之各該人類乳突病毒蛋白，被披覆於微孔盤之固態表面，抗-HPV抗體則預先標記上篩選出的偵測試劑，該試劑包括酵素接枝之生物素和奈米金粒子，以及由上述所組成的構成群組；偵測試劑的表現說明固態表面上，形成由各該人類乳突病毒蛋白和抗-HPV抗體所組成的複合體，表示樣本中含有之各該人類乳突病毒蛋白之表現。
19. 根據申請專利範圍第9項之方法，抗-HPV抗體在與含有之各該人類乳突病毒蛋白之細胞裂解物溶液進行反應前，先披覆於固態表面，以偵測樣本中HPV之感染。
20. 根據申請專利範圍第19項之方法，抗-HPV抗體在與細胞裂解物溶液進行反應前，被披覆在蛋白質晶片之固態表面上。
21. 根據申請專利範圍第19項之方法，抗-HPV抗體在與細胞裂解 物溶液進行反應前，被披覆在微流體系統之固態表面上。
22. 根據申請專利範圍第9項或第10項之方法，偵測固態表面上之複合體，可進一步偵測含有抗-HPV抗體之標記蛋白偵測試劑之表現、細胞裂解物溶液中各該人類乳突病毒蛋白之表現、二級抗體與抗-HPV抗體產生鍵結，以及由上述組成的構成群組，其中二級抗體之種類依抗-HPV抗體而異，抗-HPV抗體亦可與臨床檢體中，來自各該人類乳突狀病毒型的各該人類乳突病毒蛋白產生鍵結。
23. 根據申請專利範圍第22項之方法，由篩選出之試驗方法，分析偵測試劑是否表現，包括以試劑之顏色改變作為直接定性分析、以ELISA分析儀、微陣列掃描器、和FACS等讀取數據，以及由上述組成的構成群組。
24. 根據申請專利範圍第9項之方法，其中該方法可用以偵測各種病程階段之HPV感染，篩選出之病程階段包括早期HPV感染、晚期HPV感染、早期子宮頸細胞病灶、晚期子宮頸細胞病灶、低度鱗狀上皮細胞病變(LSIL)、高度鱗狀上皮細胞病變(HSIL)、非典型鱗狀細胞(ASCUS)、子宮頸上皮內贅瘤(CIN1,CIN2,CIN3)、發展中子宮頸癌、腺癌(ADC)、鱗狀上皮細胞癌(SCC)，以及由上述組成的構成群組。
25. 根據申請專利範圍第9項之方法，進一步包括：在該固態表面上披覆一抗體，以偵測一細胞性蛋白；以及比較臨床樣本中，細胞性蛋白和多種HPV蛋白之表現量，其中該細胞性蛋白為p16INK4a,E2F,Ki-67(MIB-1)、MYC蛋 白、CDK4、週期素-A、週期素-B、週期素-E、端粒酶-TERC、MCM2蛋白、TOP2A蛋白、熱休克蛋白40(HSP40)、熱休克蛋白60(HSP60)、熱休克蛋白70(HSP70)、CA9/MN蛋白、層粘連蛋白5、層粘連蛋、brn-3a、CDK N2蛋白、拓樸異構酶2A、微粒體維持蛋白-2、微粒體維持蛋白-4、微粒體維持蛋白-5、生長素蛋白、VEGF蛋白、p53、RB、p27(kip1)、和p21(waf)或由上述組成之群組。
26. 一種偵測人類乳突狀病毒蛋白之方法，其係藉由一測流系統偵測已製備成細胞裂解物溶液的樣本，其中該方法包括：在一第一試片之一端固態表面披覆上一抗-HPV一級抗體，該抗-HPV一級抗體與樣本中之一HPV病毒型之一HPV蛋白產生鍵結，因此能將細胞裂解物溶液中的HPV蛋白捕捉至固態表面；在第二試片之另一端披覆上抗-HPV二級抗體，流經第一試片之細胞裂解物溶液測流進入後，與抗-HPV二級抗體反應形成複合體，該抗-HPV二級抗體能與該HPV蛋白產生鍵結，因此能偵測樣本中HPV蛋白之表現；以及以HPV蛋白之表現量判斷該細胞樣本之感染人類乳突病毒的疾病分期，其中HPV蛋白的表現量越多，判斷疾病發展階段係越為晚期。
27. 一種偵測人體中各種HPV病毒蛋白之方法，包含：提供一來自人類的樣本，其中該樣本包含一群可被一人類乳突病毒感染的細胞；將該樣本置於一試片上； 提供一染劑與該樣本反應，當該樣本呈現陽性反應，表示該樣本有表現人類乳突病毒蛋白，代表該樣本受到人類乳突病毒的感染，其中該染劑包含一抗-HPV的單株抗體係用以對抗一純的人類乳突病毒蛋白，且該抗-HPV的單株抗體特定與一天然HPV E6蛋白或一天然HPV E7蛋白原位結合；分析該細胞群中至少一細胞中之細胞核與細胞質之體積比值大小，並利用該比值及其染色是否呈陽性反應，決定出一數值，用以判斷該樣本之癌症病變的風險。
28. 根據申請專利範圍第27項之方法，其中該一或多種純化的重組人類乳突病毒蛋白為來自HPV 16的重組E6蛋白、來自HPV 18的重組E6蛋白、來自HPV 16的重組E7蛋白、來自HPV 18的重組E7蛋白、來自HPV 16的重組L1蛋白或來自HPV 18的重組L1蛋白。
29. 根據申請專利範圍第27項之方法，其中該天然的HPV E6蛋白係來自HPV 16或HPV 18。
30. 根據申請專利範圍第27項之方法，其中該天然的HPV E7蛋白係來自HPV 16或HPV 18。
31. 根據申請專利範圍第27項之方法，其中該人類乳突病毒蛋白為人類乳突病毒E6蛋白、人類乳突病毒E7蛋白或人類乳突病毒L1蛋白。
32. 根據申請專利範圍第27項之方法，其中該人類乳突病毒蛋白具 有乳突病毒型為高風險性HPV、低風險性HPV、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV39、HPV44、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV58、HPV59、HPV66或HPV68
33. 一種用於檢測HPV感染之試驗套組，包含：至少一抗-HPV單株抗體，其中該抗-HPV單株抗體為抗-HPV E7單株抗體、抗-HPV E6單株抗體、抗-HPV L1抗體或其組合。
34. 據申請專利範圍第33項之試驗套組，其中該試驗套組更包含一固相支持物、一訊號複合物、一呈色物質、一操作手冊或其任意組合。
35. 根據申請專利範圍第33項之試驗套組，其中該試驗套組用以偵測各種病程階段之HPV感染，篩選出之病程階段包括早期HPV感染、晚期HPV感染、早期子宮頸細胞病灶、晚期子宮頸細胞病灶、低度鱗狀上皮細胞病變(LSIL)、高度鱗狀上皮細胞病變(HSIL)、非典型鱗狀細胞(ASCUS)、子宮頸上皮內贅瘤(CIN1,CIN2,CIN3)、發展中子宮頸癌、腺癌(ADC)、鱗狀上皮細胞癌(SCC)，以及由上述組成的構成群組。