KR20050031589A - 경부암 관련 ｈｐｖ 감염의 인 비트로 면역염색 검사방법및 이를 위한 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 경부암 관련 HPV (Human papillomavirus) 감염의 인 비트로 면역염색 검사방법 및 경부암 관련 HPV 감염의 인 비트로 면역염색검사용 키트에 관한 것으로서, 본 발명의 방법은 (a) 세포를 포함하는 생시료를 준비하는 단계; (b) 상기 생시료에 H₂O₂를 처리하여 생시료내의 내재적 (endogenous) 퍼옥시다아제를 비활성화 (inactivation)하는 단계; (c) 경부암 관련 HPV로부터 유래된 항원에 대하여 반응성을 나타내는 제 1차 단일클론항체를 상기 생시료에 특이하게 처리하는 단계; (d) 상기 제 1차 항체에 결합능력을 가지며 퍼옥시다아제가 연결된 제 2차 항체를 포함하는 검색 시스템을 상기 생시료에 특이하게 처리하는 단계; (e) 상기 제 2차 항체에 연결된 퍼옥시다아제의 발색기질을 상기 생시료에 처리하여 생시료 내의 세포를 면역염색하는 단계; 및 (f) 상기 생시료 내의 경부암 관련 HPV에 감염된 세포의 면역염색 여부 및 정도를 관찰하는 단계를 포함한다.

Description

경부암 관련 ＨＰＶ 감염의 인 비트로 면역염색 검사방법 및 이를 위한 키트{In Vitro Method and Kit for Detecting Cervical Cancer-associated ＨＰＶ Infection}

본 발명은 경부암 관련 HPV 감염의 인 비트로 면역염색 검사방법 및 경부암 관련 HPV 감염의 인 비트로 면역염색 검사용 키트에 관한 것이다.

HPV (Human papillomavirus) 중에는 발암유전자를 가진 타입의 바이러스가 있어서 경부암을 발생시키는 요소의 하나로 인정된다. 그러므로, 경부암 관련 HPV의 감염 여부의 검사는 혁신적인 경부암 예방 효과를 나타낼 수 있다.

한편, 자궁경부암은 여성에서 발생하는 암중 22.3%로 빈도 1위를 차지하고 있으며, 해마다 약 7,000명의 새로운 환자가 발생하는 암으로 발생율도 대상 여성인구 100,000명당 26.5명으로 한국여성의 가장 중요한 암이다. 자궁경부암의 치료는 수술요법, 항암제치료, 방사선요법이 사용되나 치료의 성패는 암을 발견하는 시기에 크게 좌우된다. 즉, 암세포가 점막상피내에 국한되어 있는 초기 암의 경우는 수술로서 완치가 가능하므로 암의 초기진단이 무엇보다 중요한 암이다.

현재 자궁경부암을 초기에 발견하는데 사용되고 있는 진단법은 자궁경부 세포검사법(Pap smear)으로서 자궁경부에서 채취한 세포를 염색한 후 병리의사 또는 세포학 기술자가 검사하여 암세포를 육안으로 찾아내는 방법이다. 이 방법은 간편하고 경제적이어서 현재 국내에서만 년간 수십만 건의 검사를 행하고 있으며 그 결과로 지난 50여년 동안 자궁경부암에 의한 사망률을 크게 감소시킬 수 있었다. 그러나, 이 방법은 암의 진단이 검사자의의 주관적인 판단에만 의존하므로 검사결과의 정확성이 문제(위음성율이 50-45%) 되고 있으며 특히, 암이 발생하는 초기에 암세포를 발견해야 하므로 높은 민감도가 요구된다.

한편, 현재 가장 활발히 연구가 진행되고 있는 기술로서 DNA 칩을 이용하는 방법이 있다. 이 방법은 HPV에서 서열이 가장 잘 보존된 L1 유전자의 일부를 HPV 타입 별로 합성하여 DNA 칩을 제작하는 것이다. 검사는 자궁경부 조직 또는 세포에서 DNA를 추출하고, L1 유전자를 PCR 증폭한 후 이를 DNA 칩에 혼성화하여 HPV 감염여부와 타입을 결정하는 것이다. 그러나, DNA 칩 방법은 많은 수의 검사를 할 경우 1) DNA 추출과 증폭과정에서 오염이 필연적으로 나타나며, 2) 이에 따라 검사에 많은 시간이 소요됨으로 루틴한 검사로 시행하기 어려우며 3) 이 방법으로는 새로 출현하는 변종을 찾을 수 없고 4) 이 검사를 시행하기 위하여 새로이 PCR 증폭기, 혼성화 챔버, 레이저 검사기 등 고가의 장비를 갖추어야 하며 5) 그러므로 검사비용이 높아 비용-효과 (cost-benefit) 면에서 경제성이 떨어져 자궁암 관련 HPV 검사 방법으로 정착되지 못하고 있다. 뿐만 아니라 향후 검사비용이 낮아 질 경우에도 이 방법이 갖는 고유한 문제는 해결이 곤란할 것으로 생각된다.

따라서, 경부암 관련 HPV의 감염 여부를 검사하는 새로운 기술에 대한 필요성이 당업계에 대두되고 있다.

본 발명자들은 상술한 종래 기술의 문제점을 극복할 수 있는 신규한 HPV의 감염 측정법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 경부암 관련 HPV의 특정 단백질에 대한 단일클론항체를 이용하고, 특정의 조건에 따라 면역염색을 실시하는 경우에는 경부암 관련 HPV의 감염 여부를 간단하면서도 개선된 특이도 및 민감도를 가지고 검사할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 경부암 관련 HPV 감염의 인 비트로 면역염색 검사방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 경부암 관련 HPV 감염의 인 비트로 면역염색 검사용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 세포를 포함하는 생시료를 준비하는 단계; (b) 상기 생시료에 H₂O₂를 처리하여 생시료내의 내재적 (endogenous) 퍼옥시다아제를 비활성화 (inactivation)하는 단계; (c) 경부암 관련 HPV로부터 유래된 항원에 대하여 반응성을 나타내는 제 1 차 단일클론항체를 상기 생시료에 특이하게 처리하는 단계; (d) 상기 제 1 차 항체에 결합능력을 갖으며 퍼옥시다아제가 연결된 제 2 차 항체를 포함하는 검색 시스템을 상기 생시료에 특이하게 처리하는 단계; (e) 상기 제 2 차 항체에 연결된 퍼옥시다아제의 발색기질을 상기 생시료에 처리하여 생시료 내의 세포를 면역염색하는 단계; 및 (f) 상기 생시료 내의 경부암 관련 HPV에 감염된 세포의 면역염색 여부 및 정도를 관찰하는 단계를 포함하는 경부암 관련 HPV (human papilloma virus) 감염의 인 비트로 면역염색 검사방법을 제공한다.

자궁경부의 HPV는 성접촉에 의하여 쉽게 감염된다. 또한 HPV에 감염된 사람 중 일부에서 (0.5%-5%) 자궁경부암이 발생한다. 이 사실은 HPV 타입 중에 경부암 관련 HPV형이 존재하며 세포에 경부암 관련 HPV가 감염된 후 정착되어 바이러스의 발암유전자가 활발히 발현되어야 암이 발명함을 시사한다. 따라서 발현된 발암단백질을 검색하는 것이 보다 확실한 자궁경부암의 초기진단법이라 할 수 있다. 발암과정에서 중요한 HPV 단백질은 E6와 E7이다. E6단백질은 p53과 결합하여 바이러스에 감염된 세포가 아폽토시스되는 것을 막으며, E7단백질은 pRB와 결합하여 pRB-E2F결합체에서 E2F를 분리시켜, 세포분열에 필요한 단백질을 생산하게 한다. 따라서 세포분열에 반드시 필요한 HPV E7 단백질은 발암과정이 진행되는 증거가 될 수 있다고 판단하여, 본 발명에서 타깃으로 이용하였다.

본 발명의 방법은 다양한 생체 시료에 적용될 수 있으며, 바람직하게는 세포 또는 조직 시료를 이용하여 실시된다. 보다 바람직하게는, 생시료는 자궁경부에서 얻은 조직이다. 본 발명의 방법은 자궁경부암의 진단을 위해 이용될 경우, 통상적인 팝 스미어 (pap smear) 과정과 같은 자궁경부 스미어를 이용할 수 있다.

본 발명의 방법에 따르면, 최종적으로 측정되는 시그널은 제 2 차 항체에 연결된 퍼옥시다아제 활성으로부터 유래되는 것이다. 따라서, 최종적인 시그널의 신뢰성을 보다 증가시키기 위해서는 생시료, 특히 자궁경부의 조직에 내재적인 퍼옥시다아제를 비활성화할 필요가 있다. 본 발명에서는 이러한 비활성화에 H₂O₂가 이용되며, 바람직하게는 3.5-10.0% H₂O₂가 이용된다. H₂O₂의 농도가 3.5% 미만인 경우에는 비특정(non-specific) 물질에 의한 염색 때문에 문제점이 있고, 10.0%를 초과하는 경우에는 측정하는 시그널의 강도가 줄어드는 문제점이 있다. 보다 바람직하게는 H₂O₂의 농도는 5.0-8.0%이고, 가장 바람직하게는 약 6.5%이다. H₂ O₂에 의한 비활성화 반응시간은 일반적으로 10분-1시간, 바람직하게는 20분-50분, 가장 바람직하게는 약 30분이다. 비활성화 반응온도는 상온이 가장 적합하다.

본 발명에서 이용되는 제 1 차 단일클론항체는 바람직하게는 (ⅰ) HPV 타입 16의 E7 단백질, (ⅱ) HPV 타입 18의 E7 단백질 또는 HPV 타입 58의 E7 단백질을 항원으로 하는 것이다. 즉, 다양한 HPV 타입 중에서, 자궁경부암을 유발하는 위험성이 큰 경부암 관련 HPV 타입 16 (51%) 또는 HPV 타입 18 (9%)의 E7 단백질에 대한 단일클론항체이다. 한편, E7 단백질의 단편이 항원성을 나타내는 범위에서, 상기 항원으로서의 E7 단백질은 완전한 (intact) 단백질뿐만 아니라, 그의 단편도 포함하는 것으로 해석된다. 바람직하게는, 상기 제 1 차 단일클론항체는 HPV 타입 58의 E7 단백질에 대한 것도 포함한다. 특히, HPV 타입 58은 한국 여성의 자궁경부암에서 높은 비율로 발견된다 (Nam H. Cho, et al., American Journal of Obstetrics and Gynecology, 188(1):56-62 (2003) 및 Hee J. An, et al., Cancer, 1:97(7):1672-80(2003)). 가장 바람직하게는, 제 1 차 단일클론항체는 HPV 타입 16의 E7 단백질에 대한 단일클론항체, HPV 타입 18의 E7 단백질에 대한 단일클론항체 및 HPV 타입 58의 E7 단백질에 대한 단일클론항체의 혼합물이다. 이와 같은 혼합물을 이용하는 경우에는 보다 정확하게, 자궁경부암을 진단할 수 있다. 제 1 차 단일클론항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법에 의해 제조될 수 있으며 (Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1988; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991), 바람직하게는 하기의 실시예에 따라 제조된다. 제 1 차 항체를 이용한 반응, 특히 자궁경부 스미어 시료에 적용되는 경우에는 30분-4시간의 반응시간이 적합하며, 바람직하게는 1시간-3시간, 보다 바람직하게는 1시간 30분-2시간 30분, 가장 바람직하게는 약 2시간이다. 시료가 배양된 세포인 경우에는 약 1시간의 반응시간이 가장 바람직하다. 반응온도는 상온이 가장 적합하다.

상기 단계 (d)의 검색 시스템은 면역분석 방법에 통상적으로 이용되는 제 2 차 항체-효소 컨쥬게이트를 이용할 수 있지만, 바람직하게는 다수의 퍼옥시다아제 및 다수의 Fab 단편이 결합된 중합체가 이용된다. 본 발명에서 이용되는 중합체는 도 6에 도시되어 있다. 도면에서 볼 수 있듯이, 중합체에는 제 1 차 항체에 결합능력을 갖는 다수의 제 2 차 항체와 다수의 퍼옥시다아제가 결합되어 있다. 이와 같은 중합체의 이용에 의해 면역염색을 보다 개선된 민감도 및 특이도로 실시할 수 있다. 상기 중합체는 특별하게 제한되지 않으나, 바람직하게는 아미노산으로 이루어진 중합체이다. 상기 퍼옥시다아제는 바람직하게는, 당업계에서 통상적으로 이용되는 HRP (horse radish peroxidase)이다. 바람직하게는, 상기 중합체는 BSA (bovine serum albumin), 젤라틴, 혈청 (예: 염소 정상 혈청) 및 비이온성 계면활성제의 일종인 폴리소르베이트 계면활성제 (Tween 계열의 계면활성제, 예: Tween 20, 40, 60 및 80)를 포함하는 희석액으로 희석된 것이다. 만일, 다른 희석제로 희석된 경우에는 제 2차 항체가 비특정 물질과 반응하여 비특정 시그널을 나타내는 문제점이 있다. 상기 희석액에 의해 희석 비율은 중합체:희석액 1:20-1:60이 바람직하다. 희석 비율이 1:20 보다 낮은 경우에는 비특정 시그널이 심각하게 나타나는 문제점이 있고, 1:60 보다 높은 경우에는 특정 시그널이 낮아지는 문제점이 있다. 보다 바람직하게는 희석 비율은 1:30-1:50이며, 가장 바람직하게는 약 1:40이다. 제 2 차 항체를 이용한 반응, 특히 자궁경부 스미어 시료에 적용되는 경우에는 20분-3시간의 반응시간이 적합하며, 바람직하게는 30분-2시간, 보다 바람직하게는 50분-1시간 30분, 가장 바람직하게는 약 1시간이다. 반응온도는 상온이 가장 적합하다.

상기 단계 (e)에서 이용되는 발색기질은 퍼옥시다아제의 발색기질로서 통상적으로 이용되는 것, 예컨대, ABTS [[2,2'-azino-bis [3-ethylbenziazoline-6-sulfonic acid]], AEC (aminoethylcarbazole), OPD (o-phenylenediamine), TMB (3,3',5,5'-tetra-methyl benzidine), 디아미노벤지딘, 클로로나프톨 및 구아이아콜 (guaiacol)이 이용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 AEC이다. 발색기질로서, AEC가 가장 적합한 이유는 카운터 세포 염색 (Counter cell staining)이 보라색인데 대조적으로 특정적 염색을 적색으로 나타내기 때문이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (a) 이후에 생시료를 고정화 (fixation)하는 단계 (a)'를 추가적으로 포함한다. 생시료의 고정화에 알코올을 사용하면 표적물질을 변화시켜서 면역반응에 문제가 생긴다. 그러므로 이 발명에 의한 면역염색을 위해서 생시료의 고정화는 4% 포름알데히드 등을 이용하여 실시하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (a) 또는 단계 (a)' 이후에 생시료 내의 세포의 투과도를 증가 (permeabilizaton)시키는 단계 (a)''을 추가적으로 포함한다. 이러한 투과도 증가는 Triton X-100 등을 이용하여 실시할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (c) 이후에 생시료를 포함하는 플레이트에 BSA를 포함하는 블록킹 용액을 처리하는 단계를 추가적으로 포함한다. 이러한 블록킹은 제 1 차 항체의 비특이적 결합을 억제하는 작용을 한다. 보다 바람직하게는, 상기 블록킹 용액은 젤라틴 및 혈청 (예: 염소 정상 혈청)을 추가적으로 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (e) 이후에 헤마토크실린 (hematoxylin)을 처리하여 카운터세포염색을 실시한다.

상기한 과정에 의해 생시료 내의 세포가 면역염색 되며, 세포의 면역염색 여부 및 양상은 광학 현미경으로 용이하게 관찰할 수 있다. 예를 들어, 발색기질로서 AEC가 이용되고, 헤마토크실린으로 카운터염색이 된 경우, 광학 현미경 하에서 세포가 보라색을 보여 주면 음성 결과 (HPV에 감염 안됨)이고, 적색을 보여 주면 양성 결과 (HPV에 감염됨)를 나타내는 것이다.

상술한 각각의 단계를 실시한 다음 1회 이상 세척을 실시하는 것이 일반적이며, PBS (phosphate buffered saline)로 세척하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에 따르면, 경부암 관련 HPV가 감염된 세포를 개선된 민감도 및 특이도로 검사할 수 있으며, 이에 따라 자궁경부암을 진단하는 데 매우 유효하다. 본 발명의 장점은 1) 개선된 특이성 및 민감도, 2) 저비용, 3) 객관적인 결과 도출, 4) 간소화된 방법, 5) 신속한 분석 등이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) BSA를 포함하는 블록킹 용액; (b) HPV 타입 16의 E7 단백질에 대한 제 1 차 단일클론항체, HPV 타입 18의 E7 단백질에 대한 제 1 차 단일클론항체 또는 그의 조합; 및 (c) 상기 제 1 차 항체에 결합능력을 갖으며 다수의 퍼옥시다아제가 연결된 다수의 제 2 차 항체를 포함하는 검색시스템을 포함하는 경부암 관련 HPV (human papillomavirus) 감염의 인 비트로 면역염색 검사용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 상술한 본 발명의 방법을 구현하기 위하여 제작된 것이다. 따라서, 상술한 본 발명의 방법과 본 발명의 키트 사이의 공통적인 사항은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 키트에 포함되는 제 1 차 항체는 HPV 타입 16의 E7 단백질에 대한 항체, HPV 타입 18의 E7 단백질에 대한 항체, HPV 타입 58의 E7 단백질에 대한 항체 또는 그들의 조합이며, 가장 바람직하게는 상기 3종의 항체의 혼합물이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 키트는 퍼옥시다아제의 발색 기질을 추가적으로 포함하며, 가장 바람직하게는 AEC를 추가적으로 포함한다. 상기 블록킹 용액은, 바람직하게는 BSA 이외에, 젤라틴 및 혈청을 추가적으로 포함한다.

본 발명에서 이용되는 제 2 차 항체를 포함하는 검색시스템에서, 바람직하게는 상기 제 2 차 항체는 Fab 단편으로 이루어진 것이다.

상기 제 2 차 항체를 포함하는 중합체는 BSA, 젤라틴, 염소 정상 혈청 및 폴리소르베이트 계면활성제를 포함하는 희석액으로 희석된 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 시료에 내재적인 퍼옥시다아제를 비활성화하기 위한 H₂O₂를 포함하며, H₂O₂의 적합한 농도는 3.5-10.0%, 5.0-8.0%, 가장 바람직하게는 약 6.5%이다.

본 발명의 키트는 세척액, 예컨대, PBS 또는 PBST (phosphate buffered saline-Tween)를 추가적으로 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 재조합 HPV 16 및 18의 E7 단백질 항원의 제조

HPV 타입 16이 감염되어 있는 경부암 Caski 세포주 (American Tissue Culture Collection, ATCC) 및 HPV 타입 18이 감염되어있는 경부암 HeLa 세포주 (ATCC)로부터 지놈 DNA를 분리 (BioCore HPV PCR 키트, BioCore, Korea)한 후, E7에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. HPV 16의 E7 단백질의 유전자 증폭을 위한 전방향 프라이머는 5'-gatgaaatagatggtccagc 이고, 역방향 프라이머는 5'-gctttgtacgcacaaccgaagc 이다. HPV 18의 E7 단백질의 유전자 증폭을 위한 전방향 프라이머는 5'-aagaaaacgatgaaatagatgga 이고, 역방향 프라이머는 5'-ggcttcacacttacaacaca 이다. 한편, PCR 수행을 위해 Thermocycler 기기 (HYBAID)를 사용하였으며 Taq 중합효소 (Roche)를 이용하여 94℃, 60 sec (변성); 55℃, 120 sec (어닐링); 및 68℃, 90 sec (신장 반응)를 거치는 총 40 사이클을 수행하였다.

증폭된 서열은 자동화 DNA 시퀀서 (Applied Biosystem)로 염기서열을 결정하여 올바르게 증폭된 것을 확인하였고, 증폭 산물은 단백질 발현 벡터인 pET-15b (Novagen)에 클로닝하였다. E7 단백질의 발현 및 분리 정제를 위해 상기 재조합 벡터를 단백질 발현용 박테리아 BL21(DE3) (Novagen)에 도입하였다.

이어 형질전환된 BL21(DE3)를 LB 아가 플레이트에 스프레딩하여 콜로니를 형성시켰고, 이를 250 ㎖ 플라스크에서 50 ㎖의 LB배지에 접종하여 37℃, 250 rpm을 유지하며 12시간 동안 진탕 배양하였다. 이를 1000 ㎖ 플라스크에서 250 ㎖의 LB배지에 1%(v/v)로 접종하여 다시 37℃, 250rpm를 유지하며 12시간 동안 진탕배양하였다. 이를 50 ℓ발효기에서 30 ℓ의 LB 배지에 1%(v/v)로 접종하여 OD₆₀₀=0.6이 될 때까지 37℃, 250 rpm을 유지하며 배양한 후 IPTG (1 mM)를 첨가하고, 4시간 동안 단백질 발현을 유도하였다. 그런 다음, 박테리아를 연속원심분리기 (Sorvall)로 원침시켜 -70℃ 냉동고에서 보존하였다.

원침시킨 박테리아를 라이시스 완충액 (20 mM Tris, pH 7.9, 500 mM NaCl, 5 mM 이미다졸) 에 부유시킨 후 음파 파쇄를 실시한 후, 얻어진 분해액을 원심분리와 0.45 ㎛ 필터를 이용하여 데브리스와 파티클을 제거하였다. 이어, 분해액을 니켈-NTA-아가로스 컬럼 (QIAGEN)에 로딩한 다음, 5 mM, 60 mM, 100 mM 및 400 mM 이미다졸 용액 (스텝 농도구배)으로 HPV 타입 16 E7단백질 또는 HPV 타입 16 E7단백질을 용출하였다. 용출된 단백질을 PBS 용액에 투석하였고 이를 농축시킨 후 E7 단백질의 양을 확인하였다. 15% 아크릴아미드 젤 전기영동을 한 후 쿠마시블루 염색을 하여 95% 이상의 순수 정제를 확인하였다 (도 1).

실시예 2: 단일클론 항체의 제조

실시예 2-1: 면역

면역 전에 생후 6-8 주령의 Balb/c 마우스의 피를 안와채혈로 채취하였다. 준비된 HPV 16 또는 18의 E7 단백질 (20㎍)에 동부피의 프로이드 완전 아쥬번트 (Freund's complete adjuvant)에 혼합하여 현탁액을 만든 후, 현탁액 200㎕를 마우스에 복강 투여하여 면역시켰다. 첫 번째 면역한 날부터 14-21일 후 2차 면역하고, 3일 후에 안와채혈하였다.

마우스에서 채혈한 혈청은 아래와 같이 시험하여 항체 타이터를 측정하였다. 96-웰 플레이트를 항원 (1 ㎍/㎖, PBS 또는 0.01 M Tris, pH 8.0)로 30분-1시간 실온에서 코팅하였다. 2차례 PBS로 세척한 다음 200㎕ 1% BSA (PBS 또는 0.01 M Tris, pH 8.0)으로 30분-1시간 오버-코팅하였다. 마우스에서 채혈한 혈청을 시료 희석 완충액 (3% BSA, PBS, 0.1% Tween 20)을 사용하여 1:5와 1:10으로 각각 희석하였다. 희석 된 시료를 100㎕씩 듀플리케이트로 플레이트 웰에 가하고 1시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 플레이트 웰을 3차례 PBS로 세척한 다음, 적절하게 시료 희석 완충액으로 희석된 항-마우스 면역글로불린 항체-HRPO (horse radish peroxidase) (Kirkgard & Perry Laboratories)를 100㎕씩 웰에 첨가하였다. 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후, 3차례 PBS로 세척하고, 기질용액 (orthophenylenediamine, Sigma)을 첨가하고, 10-30분 동안 반응시킨 후 1N H₂SO₄ 용액으로 중단시키고 OD를 490nm에서 측정하였다.

혈청 항체 타이터가 OD₄₉₀ > 1.0에 이를 때까지 면역을 되풀이하였다. OD₄₉₀ 치가 전-면역 혈청 치에 비해서 10배 이상 높아졌을 경우를 (+)로 판정하였다. 마지막 면역한 3일 후 안와채혈하여 항체 타이터 시험한 후 세포융합에 적당한 항체 타이터가 있는지를 결정하였다. 결정이 긍정적 (OD₄₉₀ > 1.0) 이면 비장을 적출하여 세포융합 절차를 시작하였다.

실시예 2-2: 세포융합

가. 마우스 비장 세포 준비

최종 주사 3일 후에 마우스를 질식사를 시키고 복부를 절개 및 박리를 하여 비장을 포셉으로 적출하여 가위로 주변에 붙은 지질을 제거하였다. 비장을 집어서 DMEM으로 세척한 후 60 메쉬 스크린 위에 놓았다. DMEM을 2-3 방울 비장 위에 떨어뜨린 후, 포셉으로 비장을 누르면서 그 위에 DMEM을 한 방울씩, 총 10㎖를 적하하면서 비장 세포를 추출 하였다. 튜브를 흔들어 세포를 세척액에 현탁시킨 후, 우태아혈청-튜브 내의 혈청 위에 천천히 얹었고, 이 상태로 10분 동안 실온에 놓아두면 불순물이 튜브 밑에 침전되었다. 불순물이 침전된 후, 불순물만 제외한 모든 용액을 새로운 우태아혈청-튜브에 옮긴 다음, 원심분리기에 넣고 10분간, 1200rpm 속도로 원심분리 하였다.

튜브를 꺼내어 밑에 가라앉은 펠릿만 남기고 상층액을 조심스럽게 제거한 다음, 튜브 내에 남은 펠릿에 3-5㎖ 0.83% NH₄Cl을 가하였다. 펠릿을 NH₄Cl에 현탁시킨 후 3분간 실온에 놓아두고, 위에서 현탁된 세포를 전부 새로운 우태아혈청-튜브에 옮기고 1200rpm 속도로 10분간 원심분리하였다. 이어, 펠릿만 남기고 상층액을 제거한 후, DMEM을 14㎖ 가하여 세포를 현탁시키고 위와 같은 조건으로 원심분리 하였다. 위와 같은 조건으로 DMEM을 사용하여 2회 더 세척하였다. 마지막으로, 100㎕ 세포 현탁액에 5㎖ DMEM을 가하여 희석 (약 50배)한 다음 세포수를 측정하였다.

나. Sp2/0 AG-14 세포 준비

RPMI HT 배지 (Jeil Biotech services)에 부유된 Sp2/0 AG-14 세포 (ATCC)를 1200rpm에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리한 상층액은 다른 튜브에 모아서 나중에 배지로 제한 희석 및 클로닝에 사용하고, Sp2/0 AG-14 세포를 10 ㎖ DMEM-Hepes (Jeil Biotech services) 배지에 부유시켰다. Sp2/0 AG-14 세포 부유액을 10배 희석시키고 세포수를 측정하였다.

다. 비장 세포와 Sp2/0 AG-14 세포의 융합

배지에 부유된 Sp2/0과 비장 세포를 다음과 같이 혼합하였다. 세포수 측정을 기준으로, Sp2/0과 비장 세포가 1:7의 비율이 되도록 튜브에 넣고 튜브를 가볍게 돌리며 혼합하였다. 세포 혼합액를 원심분리하여 상층액을 제거하고 DMEM을 가하여 부유시킨 다음 원심분리하고, 이와 같은 조건으로 DMEM을 사용하여 2회 더 세척하였다. 동시에, PEG (polyethylene glycol)를 30분 동안 수욕에 넣어 미리 37℃로 승온시켰다.

PEG 용액을 1 x 10⁸ 비장 세포 당 1㎖로 계산하여 상기 혼합세포에 가하고, 천천히 튜브를 돌리며 혼합한 후, DMEM 1㎖을 한 방울씩 1분에 걸쳐 가해주고 계속해서 30초 동안 튜브를 천천히 돌리며 혼합하였다. 그런 다음, DMEM 2㎖을 튜브를 천천히 돌리면서 1분에 걸쳐 가하고 8㎖을 30초에 걸쳐 같은 동작으로 가하고 10㎖ 더 30초에 걸쳐 같은 동작으로 가한 다음 원심분리하였다. 그 동안, HAT 배지 (200 μM 하이포크산틴, 800nM 아미노프테린, 32 μM 티미딘, 10% 우태아혈청, DMEM)를 10분 동안 수욕에 미리 넣어 37℃로 승온시켰다. 상기 원심분리한 튜브에서 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 40㎖ HAT 배지에 부유시킨 후 96-웰 플레이트의 각 웰 당 200㎕씩 분주하고, 2주 동안 37℃에서 배양하였다.

실시예 2-3: 융합세포 검색, 제한희석 및 클로닝

융합을 시작한 다음날 각 웰에 200㎕ HAT 배지를 가하고, 다음날 새로운 배지로 교환하였다. 다음날부터, 격일에 위와 같은 방법으로 4차례 더 배지를 교환하였다. 융합 후 11일 째, 배지를 HAT에서 HT (200 μM 하이포크산틴, 32 μM 티미딘, 10% 우태아혈청, DMEM)로 교환하는 데, 이 과정에서 교환되는 배지 양을 100 ㎕에서 200㎕로 증가시켰다. 계속해서 융합 후 13일, 15일에 위와 같이 HT 배지로 교환하였다.

17일 째, 각 웰의 배지를 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent assay)로 테스트하였다. HPV 16 또는 18의 E7 단백질을 TBS (Tris-buffered saline)에 1 ㎍/㎖이 되도록 희석한 후, 96-웰 EIA (Nunc)에 1시간 동안 상온에서 코팅을 하였다. 5% BSA를 PBST (Phosphate-buffered saline에 0.1% Tween 20포함)에 녹인 후 각 웰을 1시간 동안 상온에서 블록킹하였다. 융합세포가 성장하고 있는 웰로부터 배양 상층액을 50㎕씩 취하여 면역플레이트에 가하고 1시간 동안 항온처리한 후, HRPO-접합 2차 항체 (Pierce)와 발색 기질인 OPD (ortho-phenylenediamine)를 이용하여 발색반응을 유도하였다. 490nm에서 흡광도를 측정하여 가장 높은 결과가 나오는 웰을 선택하였다.

이를 통해 일차적으로 우수한 양성 융합세포군을 선별하였고, 양성 세포군을 웰 당 1개의 세포가 들어가도록 제한희석 (limiting dilution)을 하였다. 양성 융합 세포군은 HT 배지로 바꾸어 배양한 후 웰 당 0.5 개의 세포가 들어가게끔 세포를 센 다음 96-웰 플레이트에 분주하였다. 2주간 배양한 후 다시 융합세포 검색과 동일한 방법으로 검색을 하였고, 여기서 가장 좋은 결과가 나오는 웰을 선택하여 동일한 방법으로 한번 더 클로닝을 하였다.

마지막 세포 클로닝을 한 다음, ELISA를 통해 우수한 융합세포들을 선택하였고, 이들을 연속희석에 따른 반응 분석으로 민감성이 높은 항체를 생산하는 융합세포들을 선별하였다 (도 2a 및 2b). 도 2b는 정제된 항-HPV 16 E7 항체 및 항-HPV 18 E7 항체를 희석하여 반응을 분석한 결과를 나타냈다.

실시예 2-4: 단일클론 항체의 대량 생산 및 분리정제

선별된 항체를 생산하는 융합세포를 750㎖ 플라스크 내의 DMEM-HT 배지에서 배양한 후 10 주령 이상의 Balb/c 마우스 복강에 주입하였다. 이에 앞서 대량의 복수액을 확보하기 위해서 융합세포 주입 4일전에 불완전 프로이드 아쥬번트를 미리 주입하였다. 10-14일이 경과된 후 쥐의 복강으로부터 복수를 채취하고 원심분리를 통해 세포 조각, 적혈구 및 지질을 제거하였다. 분리정제는 친화성 크로마토그래피와 염 침전/음이온 교환 크로마트그래피법을 이용하였다. 친화성 크로마토그래피를 위해서 단백질 G-아가로스 컬럼 (Pierce)을 사용하였고, pH 용출 및 중성화를 통해 항체를 분리정제 하였다. 또한, 50% 암모늄 설페이트 용액으로 항체를 침전시킨 후 투석을 통해 염을 제거하였고, 이어 DEAE-셀룰로오스 컬럼 (Whatman)을 이용하여 항체를 분리정제 하였다. 항체의 분리정제는 ELISA, 단백질 정량법, SDS-PAGE 등을 이용하여 확인하였다.

실시예 3: 단일클론 항체의 특성 조사

실시예 3-1: 웨스턴 블롯팅

HPV 16이 감염된 암세포주인 SiHa (ATCC), Caski (ATCC), SNU 17 (Korean Cell Line Bank), SNU 703 (Korean Cell Line Bank)과 HPV18이 감염된 세포주인 HeLa 세포 (ATCC)를 양성군으로 사용하고 PC3M (prostate cancer cell, ATCC), MCF3 (breast cancer cell, ATCC), NIH3T3(ATCC), C33A (cervical cancer cell, ATCC) 및 A549 (lung cancer cell, Korean Cell Line Bank) 등의 암세포주를 음성 대조군으로 사용하였다. 이들 세포에서 단백질을 추출한 후, 웨스턴 블롯팅을 통해 특이성을 파악하였다. 세포주들에서 단백질 추출물을 마련하고, 이들을 15% 폴리아크릴아미드 젤 전기용동으로 분리시킨 후, 니트로셀룰로오스 막 (Amersham Pharmacia Biotech)에 전이시켰다. 전이한 후, 니트로셀룰로오스 막을 5% 탈지분유와 0.05% Tween 20이 포함된 TBS 용액 내에서 1시간 블록킹한 다음, TBS-0.05% Tween 20으로 세 번 세척하였다. 이어, 상기 타이트레이션 시험 및 세포 ELISA를 통해 선별된 항-HPV 16 또는 18 E7 항체를 가하여 실온에서 1시간 반응시킨 후, 10분씩 3번 TBS-0.05% Tween 20으로 세 번 세척하였다. 그런 다음, HRP가 결합된 염소 항-마우스 immunoglobulin (Pierce)을 가하고 실온에서 1시간동안 반응시킨 후, 각 5분씩 5번 세척하였다. 여기에 ECL-검사 시약 (Amersham Pharmacia Biotech) 를 가하고 1분간 반응시킨 후, 암실에서 필름에 1-20분간 감광시켜 현상하였다.

도 3에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 항-HPV 16 E7 단일클론항체는 HPV 16이 감염된 세포주인 SiHa, Caski, SNU 17 및 SNU 703으로부터 유래된 항원에 대하여 특이적으로 반응을 하고, 본 발명의 항-HPV 18 E7 단일클론항체는 HPV 18이 감염된 세포주인 HeLa 세포로부터 유래된 항원에 대하여 특이적으로 반응하는 것을 알 수 있다.

실시예 3-2: 면역세포화학 분석 (immunocytochemical assay)

면역세포화학염색법을 통해 항체의 특이성을 파악하였다. 웨스턴 블롯팅 분석에 사용한 것과 동일하게 HPV 16이 감염된 암세포주인 SiHa, Caski, SNU 17, SNU 703과 HPV18이 감염된 세포주인 HeLa 세포를 양성군으로 사용하였다. 또한 PC3M, MCF3, NIH3T3, C33A, A549 등의 암세포주를 음성 대조군으로 사용하여 면역염색법을 시행하였다. 실험하기 전에 24 웰에 알코올 램프로 미리 소독한 커버 유리를 올려놓았다. 여기에 트립신-EDTA 처리하여 세포를 플레이팅하고 37℃, CO₂ 항온기에서 18-24시간동안 RPMI 배지에서 세포가 부착되도록 성장시켰다. 배지를 흡입하고 4% 포름알데히드-PBS로 상온에서 세포를 15분간 고정하였다. 0.1% Triton X-100-PBS를 사용해 세포를 8분간 투과화하고, 3% BSA-PBS로 상온에서 30분간 블록킹을 하였다. 그리고 1차 항체인 HPV 16 E7, 또는 18 E7 항체를 3% BSA-PBS (0.1% Tween 20)에 희석하여 상온에서 1시간 동안 항온에서 처리 하였다. 세포와 2차 검색 항체인 HRP-접합 항-마우스 Immunoglobulin 항체 (Zymed) 또는 FITC-접합 염소 항-마우스 Immunoglobulin 항체 (Zymed)를 상온에서 30분 동안 반응시키고, 기질인 AEC (3-amino-9-ethyl-carbazole)를 이용하여 발색 침전을 유도하였다. 발색침전 반응 후 현미경 슬라이드에 마운팅하여 광 콘트라스트 현미경으로 염색패턴을 확인하였다. 실험 결과, 상기 웨스턴 블롯팅 분석결과와 동일하게, 본 발명의 항-HPV 16 E7 단일클론항체는 HPV 16이 감염된 세포주인 SiHa, Caski, SNU 17, SNU 703 및 SNU 1299를 특이적으로 염색하였고, 본 발명의 항-HPV 18 E7 단일클론항체는 HPV 18이 감염된 세포주인 HeLa 세포를 특이적으로 염색하였다 (참조: 도 4 및 도 5).

실시예 3-3: 면역염색법의 2차항체 검색 시스템

일반적으로 면역염색법에 많이 사용하는 바이오틴-아비딘 증폭 시스템은 내재적인 바이오틴-함유 단백질에 비특이적으로 반응을 하여, 오류-양성 결과를 가져오기 쉽다. 그러므로 민감도를 높이면서 특이적으로 염색할 수 있는 면역염색법을 개발하였다. 여러 가지 면역염색 방법 중 민감도가 가장 좋은 것을 선택하기 위해서 폴리머 증폭 시스템 (PicTure-Plus kit, Zymed, 참조: 도 6), 바이오틴-아비딘 증폭 시스템, 그리고 2차 검색 항체를 간접적으로 사용하는 시스템을 가지고 면역염색을 수행하였다. 먼저 항원을 코팅하고 선별된 1차 검색 항체를 첨가하여 반응시키고 위의 3가지 시스템을 2차 검색 항체로 사용해 ELISA를 하였다 (도 7). 이 중 폴리머에 2차 검색 항체와 HRP 효소가 다량으로 부착된 증폭방식 (폴리머 증폭 (PicTure-Plus) 시스템)이 가장 특이적이며 동시에 높은 민감성을 가져 이를 면역염색법을 사용하여 조건을 최적화하였다.

실시예 3-4: 단일클론 항체의 아형결정

96-웰 플레이트에 염소 항-마우스 immunoglobulin (Sigma)을 웰 당 50㎕씩 가하고 4℃에서 12시간 놓아둔 후, 용액을 제거하고, 3% BSA를 웰 당 150㎕ 씩 가하여 37℃에서 1시간 놓아두었다. PBS-0.05% Tween 20으로 세 번 세척한 후, 본 발명의 단일클론 항체를 50㎕ 씩 가하고 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 다시 PBS-0.05% Tween 20으로 세 번 세척한 후, 마우스 아형에 특이한 HRP-접합 염소 항-마우스 Immunoglobulin 항체 (Sigma)를 각 웰 당 50㎕씩 가하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. OPD 용액으로 발색을 유도하고 1N HCl용액을 첨가하여 반응을 멈춘 후, 492nm에서 흡광도를 측정하였다. 또 다른 방법은 스트립 형태의 고속 검사 키트 (Serotech)를 사용하여 항체의 아형을 결정하였다.

실험 결과, 본 발명에 사용한 항-HPV 16 E7 단일클론항체는 IgG2a 아형이고, 항-HPV 18 E7 단일클론항체는 IgG1 아형으로 판명되었다.

실시예 3-5: 교차반응 분석

HPV 타입 16 E7 단백질과 HPV 타입 18 E7 단백질에 대한 각각의 항체가 다른 항원과 반응하는 교차-반응성을 검사하였다. 먼저, 재조합 HPV 16 E7 과 HPV 18 E7 단백질을 ELISA 플레이트에 각각 코팅하였다. 3% BSA-PBS 용액으로 블롯킹을 하고 재조합 HPV 16 E7 단백질 또는 HPV 18 E7 단백질이 코팅된 웰에 HPV 16 E7 항체와 HPV 18 E7 에 대한 항체를 각각 첨가하여 반응시켰다. 웰을 세척한 다음 HRP-접합 염소 항-마우스 Immunoglobulin 항체를 첨가하여 반응시켰다. OPD 용액으로 발색을 유도하고 그 위에 1N HCl 용액을 첨가하여 반응을 멈춘 후, 492nm에서 흡광도를 측정하였다. 위와 같은 ELISA 시험으로, HPV 16 E7에 대한 항체는 HPV 16 E7 항원과 반응하며 HPV 18 E7 항원과는 반응하지 않음을 알 수 있었으며, 역으로의 실험결과도 상호 교차-반응성이 관찰되지 않았다 (도 8).

실시예 4: 단일클론 항체에 의한 자궁경부암 조직 면역 염색

환자의 자궁암 조직을 파라핀 블록으로 만들고, 조직의 적정량을 잘라내어 유리 슬라이드에 붙였다. 0.05M PBS 용액으로 10분간 세척한 후에 세포 내에 존재하는 내재성 퍼옥시다아제를 제거하기 위해 3% H₂O₂ 용액에 30분간 처리하였다. 이후 PBS로 다시 10분간 3회를 세척한 후에, 비특이적 반응을 방지하기 위해 3% BSA로 30분간 상온에서 블록킹하였다. 다음, 조직에 본 발명의 항-HPV E7 항체를 가한 후, 상온에서 1시간 반응시키고 PBS로 3회 세척한 후, 다시 2차 검색항체인 폴리머 증폭 시스템 (Picture-Plus, Zymed)을 첨가하여 반응시켰다. 마지막으로 AEC 발색시약을 첨가하여 발색을 유도하고 현미경슬라이드에 마운팅하였다. 염색결과는 광 콘트라스트 현미경으로 염색패턴을 검사하였다. 실험 결과, 본 발명에 포함된 항체를 이용한 면역염색법은 경부암 관련 HPV가 감염된 세포주뿐만 아니라 실제 경부암 환자의 조직에도 특이하게 면역염색할 수 있음을 확인하였다.

실시예 5: 자궁경부 스미어 (smear) 시료 면역염색방법의 최적화

실시예 5-1: 내재적 퍼옥시다아제 비활성화

최종적인 시그널의 특이성을 높이려면 스미어에 포함된 퍼옥시다아제와 다른 단백질에 의한 반응을 비활성화 해야 한다. 이 실험에서 사용하는 경부 스미어 시료는 H₂O₂ 농도를 5% 이상으로 하여 20분 이상 처리해야만 비특정 시그널을 제거 할 수 있는 것을 알아냈다. 그러나 H₂O₂ 농도가 8% 이상이면 특정 시그널이 동시에 약해지므로, 가장 바람직한 조건은 H₂O₂ 농도가 5.0-8.0% 이고 처리시간이 20-30분인 경우이다.

실시예 5-2: 제 1 차 항체 반응 조건

경부스미어 시료를 제1차 항체에 반응시키려면 배양 세포를 면역 염색할 때보다 높은 농도를 사용해야 특정 시그널이 나타난다. 그 이유는 특정 항원인 단백질이 H₂O₂ 용액 처리 (실시예 5-1)와 다른 비특정 요소 때문에 제1차 항체와의 반응효과가 감소하기 때문이다. 따라서 이 발명에 최적 반응 조건을 결정하기 위해서 항체의 농도와 반응 시간을 최적화시겼다. 면역 염색 결과에 의하면 경부스미어 시료와 제1차 항체 반응은 항체의 농도가 배양세포를 염색하는 경우 보다 약 10배 높아야하며 반응 시간은 약 2시간이 적합한 것을 알아냈다. 항체의 농도가 10배 이하이거나 처리시간이 1시간 반 이내인 경우는 특정 시그널이 약하게 나타나는 것을 볼 수 있다.

실시예 5-3: 제 2 차 항체 반응 조건

본 실험에서 사용한 제2차 항체는 다수의 퍼옥시다아제(HRP)가 중합된 폴리머(polymer)가 결합된 항 마우스 항체(Picture-Plus, Zymed)이다. 이 항체를 원액으로 경부스미어 시료에 반응시키면 비특정 물질과 반응하여 심각한 비특정 시그널을 나타낸다. 그러므로 이 항체 시약을 적당한 희석액으로 희석하므로서 비특정 반응을 제거해야 한다. 희석액에는 BSA, 젤라틴, 염소정상 혈청 및 비이온성 계면 활성제 (Tween 20)을 포함하는 것이 가장 효과적인 것을 알아냈다. 최적 희석 비율은 1:40 이며, 희석 비율이 1:20 이하이면 비특정 시그널이 나타나고 1:60 이상이면 특정 시그널이 현저하게 감소되는 것으로 나타났다. 항체와 스미어시료에 함유된 항원과의 반응시간은 1-2시간이 적합하고 약 1시간이 가장 바람직하다.

실시예 5-4: 발색 반응 조건

퍼오시다아제의 발색기로 여러 가지 물질이 있으나 그 중 AEC (aminoethylcarbazole)는 양성(positive) 세포를 적색으로 염색하므로 보라색으로 카운터 염색된 음성(negative) 비특정 세포와 구별이 가장 용이한 것을 알아냈다. 발색 반응 시간은 5분이 적당한 것으로 판단됐다.

실시예 6: 배양 세포의 면역염색의 최적화 프로토콜(protocol)

상술한 실험 결과를 기초로 하여, 배양 세포를 면역염색하는 데 있어서 최적화된 프로토콜을 만들었다.

a. 씨딩(seeding):

- 샘플 수대로 커버 유리를 알코올 램프로 열 처리한다.

- 검사를 시작하기 최소한 18시간 전 (보통 20-22 시간)에 24-웰 플레이트의 각 웰에 하나씩 커버 유리를 넣는다.

- 배양한 세포를 1.0 x 10⁶씩 각 웰에 넣어서 씨딩한다 (80% 컨플루언트하게 씨딩)

- 배지를 흡입으로 제거하고, PBS로 2회 세척한다.

b. 고정화(Fixation):

시약: 포름알데히드 (Sigma)

- 4% 포름알데히드 (PBS 용액) 0.5㎖을 각 웰에 가하고 실온에서 15분간 반응시킨다.

- PBS로 세포를 3회 세척한다.

c. 투과도 증가 (Permeabilization):

시약: Triton X-100 (Sigma)

- 0.1% Triton X-100 (in PBS) 용액 0.5㎖을 각 웰에 가하고 실온에서 8분간 처리한다.

- PBS로 세포를 3회 세척한다.

d. 비특이적 결합의 블록킹(Blocking non-specific reaction):

시약: BSA(Sigma)

CWFS 젤라틴(Sigma)

염소 정상 혈청(Sigma)

블록킹 용액 100㎖ 만들기:

5g BSA (Sigma)

2㎖, 5% CWFS 젤라틴 (100% 젤라틴을 d.d.H₂O로 희석하여 4℃에 보관)

5㎖ 정상 염소 혈청

PBS로 최종 부피를 100 ㎖로 만든다.

분획하여 -20℃에 보관.

- 블록킹 용액 0.5㎖씩을 각 웰에 가하고 상온에서 30 분간 처리한다.

- PBST (0.1% Tween 20)로 세포를 1회 세척한다.

e. 제 1 차 항체 반응:

시약: 정제된 본 발명의 단일클론 항체 (Monoclonal antibody, MAb)

반 정제된(partially purified) (암모늄 설페리트 침전) 단일클론 항 체

본 발명의 단일클론 항체를 포함하는 복수(Ascites fluid)

희석 완충액은 10% BSA-PBST 용액을 최종 3% BSA-PBST가 되도록 희석하여 사용한다.

- 정제한 MAb 농도가 5㎍/㎖ 되도록 3% BSA-PBST를 사용해서 희석한다.

- 희석된 MAb 0.5㎖를 각 웰에 가하고 상온에서 1시간동안 반응시킨다.

- 복수를 사용할 경우, 희석 시험으로 적당한 희석 비율을 결정하여 위의 희석 완충액으로 희석하여 최종 3% BSA-PBST가 되도록 하여 반응에 사용한다.

- PBST (0.1% Tween 20)로 세포를 각 2분씩 5회 세척한다.

f. 제 2 차 항체 반응:

시약: 2차 항체-Picture-Plus (HPR/Fab 폴리머 컨쥬게이트, Zymed)

'희석용액'은 (d)의 블록킹 용액에 Tween 20를 가해서 0.1% Tween 20로 만든다.

2차 항체 용액은 PicTure-Plus 용액을 '희석용액'으로 1/40 비율로 희석하여 사용한다.

- 각 세포시료에 2차 항체 용액을 0.5㎖씩 가한다.

- 상온에서 1시간 동안 반응시킨다.

- PBST (0.1% Tween 20)로 세포를 각 2분씩 5회 세척한다.

g. 발색:

시약: 기질용액 (AEC 용액, Zymed)

- 각 세포시료에 AEC 용액을 0.5㎖씩 가하고 블록킹면서 5분간 반응시킨다.

- d.d. H₂O로 세포시료를 5회 세척한다.

h. 카운터염색:

시약: 헤마토크실린 카운터염색 시약 (Zymed)

수용성 마운팅 용액 (Dako)

- 세포에 헤마토크실린을 0.5㎖씩 가하고 실온에서 3분간 반응시킨다.

- d.d. H₂O로 세포시료를 5회 세척한다.

- 수용성 마운팅 용액으로 세포를 마운팅한 후, 커버-유리를 덮는다.

i. 염색된 세포의 가시화/사진화:

- 세포를 현미경으로 관찰하여 양성/음성을 결정한다.

- 세포가 보라색을 나타내면 음성이고, 붉은 색을 나타내면 양성으로 판단된 다.

상기한 프로토콜에 따라 실시된 면역 염색의 결과는 도 9에 나타나 있다. 염색결과, HPV 16에 감염된 Caski 세포가 적색으로 염색된 것을 볼 수있다.

실시예 7: 자궁경부 스미어 (smear) 시료의 면역염색의 최적화 프로토콜

상술한 실험 결과를 기초로 하여, 실제 임상에 적용할 수 있는 자궁경부 스미어 시료를 면역염색하는 데 있어서 최적화된 프로토콜을 다음과 같이 만들었다.

a. 시료 준비:(Sampling Preparation)

시약: 포름알데히드(Sigma)를 PBS로 희석하여 4% 용액을 만든다.

- 유리 슬라이드 위에 채취한 자궁경부 스미어를 4% 포름알데히드 용액으로 고정하여 같은 용액에 담궈서 운반한다.

- 유리 슬라이드에 고정된 스미어를 PBS로 2회 세척하고 다시 PBS 용액에 담궈서 보관한다.

- 검사하기 전에 시료를 PBS로 1회 세척한다.

b. 투과도 증가 (Permeabilization):

시약: Triton X-100 (Sigma)

- 시료에 0.1% Triton X-100 (in PBS) 용액을 가하고 실온에서 30분간 처리한다.

- PBS로 시료를 3회 세척한다.

c. 내재적 퍼옥시다아제의 비활성화:

시약: H₂O₂ (30% 스톡 용액, Merck)

H₂O₂ 스톡 용액을 d.d. H₂O로 희석하여 6.5%를 만든다.

- 시료에 희석된 6.5% H₂O₂를 가하고 상온에서 30분간 반응시킨다.

- PBS로 샘플을 3회 세척한다.

d. 비특이적 결합의 블록킹:

시약: BSA(Sigma)

CWFS 젤라틴(Sigma)

염소 정상 혈청(Sigma)

블록킹 용액 100 ㎖ 만들기:

5g BSA (Sigma)

2㎖, 5% CWFS 젤라틴 (100% 젤라틴을 d.d.H₂O로 희석하여 4℃에 보관)

5㎖ 정상 염소 혈청

PBS로 최종 부피를 100 ㎖로 만든다.

분획하여 -20℃에 보관.

- 시료에 블록킹 용액 1 ㎖을 각 슬라이드에 가하고 파라필름으로 시료를 덮는다.

- PBST (0.1% Tween 20)로 시료를 1회 세척한다.

e. 제 1 차 항체 반응:

시약: 정제된 본 발명의 단일클론 항체 (MAb)

MAb 용액 - MAb 스톡용액을 3% BSA-PBST 용액로 농도가 50㎍/㎖가 되도록 희석한다.

- 희석된 MAb 1 ㎖를 각 시료에 가하고 실링필림( Sealing film, Whatman)으 로 덮는다.

- 상온에서 2시간 동안 반응시킨다.

- PBST (0.1% Tween 20)로 시료를 각 2분씩 5회 세척한다.

f. 제 2 차 항체 반응:

시약: 2차 항체-PicTure -Plus (HPR/Fab 폴리머 컨쥬게이트, Zymed)

"희석용액"은 블록킹 용액에 Tween 20를 가해서 0.1% Tween 20로 만든다.

2차 항체 용액은 (PicTure -Plus 용액을) "희석용액"으로 사용하여 1/40 비율로 희석한다.

- 각 시료에 2차 항체 용액을 1㎖씩 가하고 실링필림으로 덮는다.

- 상온에서 1시간 동안 반응시킨다.

- PBST (0.1% Tween 20)로 세포를 2분씩 5회 세척한다.

g. 발색:

시약: 기질용액 (AEC 용액, Zymed)

- 시료에 AEC 용액을 1㎖씩 가하고 록킹하면서 5분간 반응시킨다.

- d.d. H₂O로 세포를 5회 세척한다.

h. 카운터염색:

시약: 헤마토크실린 카운터염색 시약 (Zymed)

수용성 마운팅 용액 (Dako)

- 시료에 헤마토크실린을 1 ㎖씩 가하고 실온에서 3분간 반응시킨다.

- d.d. H₂O로 세포를 5회 세척한다.

- 수용성 마운팅 용액으로 시료를 현미경 슬라이드에 마운팅한 후, 커버-유 리를 덮는다.

i. 염색된 세포의 가시화/사진화:

- 세포를 현미경으로 관찰하여 양성/음성을 결정한다.

- 세포가 보라색을 나타내면 음성이고, 붉은색을 나타내면 양성으로 판단된 다.

상기한 프로토콜에 따라 실시된 면역 염색의 결과는 도 10에 나타나 있다. 염색 결과, 정상 세포들은 염색되지 않았고(보라색), 특이적으로 HPV 16에 감염된 세포만이 적색으로 염색되었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 경부암 관련 HPV 감염의 인 비트로 면역염색 검사방법 및 경부암 관련 HPV 감염의 인 비트로 면역염색검사용 키트를 제공한다. 본 발명의 방법은 HPV가 감염된 세포를 개선된 민감도 및 특이도로 검사할 수 있으며, 이에 따라 경부암 관련 HPV의 유무를 판단해주어서 환자의자궁경부암을 진단하는 데 매우 유효하다.

도 1은 정제된 HPV (Human papillomavirus) 타입 16의 E7 단백질과 HPV 타입 18의 E7 단백질을 보여주는 전기영동 결과 사진.

도 2a는 HPV 16 타입 E7 단백질에 대한 12개 단일클론항체 배양액을 연속 희석해서 반응을 분석한 결과를 보여주는 그래프.

도 2b는 HPV 16 E7 단백질 또는 HPV 18 E7 단백질에 대한 단일클론항체를 정제하여 연속희석에 따른 반응을 분석한 결과를 보여주는 그래프.

도 3는 웨스턴 블롯팅으로 HPV 16 E7 또는 HPV 18 E7 단백질에 대한 단일클론항체를 여러 종류의 암세포주 추출물로 특이성을 검사한 결과를 보여주는 사진.

도 4는 HPV 16 E7에 대한 단일클론항체를 HPV 16 양성세포주와 HPV 16 음성세포주를 배양하여 면역염색한 결과를 나타내는 사진.

도 5는 HPV 18 E7에 대한 단일클론항체를 HPV 18 양성세포주와 HPV 18 음성세포주를 배양하여 면역염색한 결과를 나타내는 사진.

도 6은 면역염색방법에서 채택한 폴리머 증폭 시스템 (제 1 차 항체에 결합능력을 갖으며 퍼옥시다아제가 연결된 제 2 차 항체를 포함하는 검색 시스템)의 구조를 나타낸 그림. Enz: HRP 효소

도 7은 제 2 차 항체 검색 시스템의 평가를 위한 민감성 분석 결과를 보여주는 그래프.

도 8은 HPV 16 E7 에 대한 단일클론항체의 교차 반응성을 보여주는 그래프. HPV 16 E7 단백질 또는 HPV 18 E7 단백질을 웰에 코팅하고 단일클론항체를 첨가하여 반응시켰다. HRP-접합 항-마우스 immunoglobulin 항체와 OPD로 발색시킨 결과 HPV 16 E7에 대한 단일클론항체는 HPV 18 E7 단백질과 교차 반응을 하지 않음을 보여준다.

도 9는 본 발명의 방법에 따라 면역 염색된 경부암 세포주 Caski의 대표적인 양성 염색 패턴을 보여주는 사진.

도 10은 본 발명의 방법에 따라 면역 염색된 자궁 경부암 환자의 스미어 시료의 염색 패턴중 양성반응이나 음성반응을 보여주는 대표적인 사진.

Claims (20)

1. 다음의 단계를 포함하는 경부암 관련 HPV (human papilloma virus) 감염의 인 비트로 면역염색검사 방법:

   (a) 세포를 포함하는 생시료를 준비하는 단계;

   (b) 상기 생시료에 H₂O₂를 처리하여 생시료내의 내재적 (endogenous) 퍼옥시다아제를 비활성화 (inactivation)하는 단계;

   (c) HPV로부터 유래된 항원에 대하여 반응성을 나타내는 제 1 차 단일클론항체를 상기 생시료에 처리하는 단계;

   (d) 상기 제 1 차 항체에 결합능력을 갖으며 퍼옥시다아제가 연결된 제 2 차 항체를 포함하는 검색 시스템을 상기 생시료에 처리하는 단계;

   (e) 상기 제 2 차 항체에 연결된 퍼옥시다아제의 발색기질을 상기 생시료에 처리하여 생시료 내의 세포를 면역염색하는 단계; 및

   (f) 상기 생시료 내의 세포의 면역염색 여부 및 정도를 관찰하는 단계.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 생시료는 세포 또는 조직인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 생시료는 자궁경부에서 얻은 스미어 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 H₂O₂ 농도는 3.5-10.0%인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 제 1 차 단일클론항체는 (ⅰ) HPV 타입 16의 E7 단백질 또는 (ⅱ) HPV 타입 18의 E7 단백질 또는 (iii) HPV 타입 58의 E7 단백질을 항원으로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (d)의 검색 시스템은 다수의 퍼옥시다아제 및 다수의 Fab 단편이 결합된 중합체인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 퍼옥시다아제는 HRP (horse radish peroxidase)인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 6 항에 있어서, 상기 중합체는 BSA (bovine serum albumin), 젤라틴, 혈청 및 폴리소르베이트 계면활성제를 포함하는 희석액으로 희석된 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 8 항에 있어서, 상기 희석액에 의한 희석 비율은 중합체:희석액 1:20-1:60인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 1 항에 있어서, 상기 발색기질은 AEC (aminoethylcarbazole)인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (a) 이후에 생시료를 고정화하는 단계 (a)'를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 11 항에 있어서, 상기 고정화 단계 (a)'은 생시료에 포름알데히드를 처리하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 1 항 또는 제 11 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (a) 또는 단계 (a)' 이후에 생시료 내의 세포의 투과도를 증가 (permeabilizaton)시키는 단계 (a)''을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (c) 이후에 생시료를 포함하는 플레이트에 BSA를 포함하는 블록킹 용액을 처리하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (e) 이후에 헤마토크실린 (hematoxylin)을 처리하여 카운터염색을 실시하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 다음을 포함하는 경부암 관련 HPV (human papilloma virus) 감염의 인 비트로 면역염색검사용 키트:

    (a) BSA를 포함하는 블록킹 용액;

    (b) HPV 타입 16의 E7 단백질에 대한 제 1 차 단일클론항체, HPV 타입 18의 E7 단백질에 대한 제 1 차 단일클론항체 또는 그의 조합; 및

    (c) 상기 제 1 차 항체에 결합능력을 갖으며 다수의 퍼옥시다아제가 연결된 연결된 다수의 제 2 차 항체를 포함하는 검색시스템.
17. 제 16 항에 있어서, 상기 키트는 상기 퍼옥시다아제의 발색 기질을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
18. 제 17 항에 있어서, 상기 발색 기질은 AEC (aminoethylcarbazole)인 것을 특징으로 하는 키트.
19. 제 16 항에 있어서, 상기 블록킹 용액은 BSA 이외에, 젤라틴 및 혈청을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
20. 제 16 항에 있어서, 상기 제 2 차 항체를 포함하는 검색 시스템은 BSA, 젤라틴, 혈청 및 폴리소르베이트 계면활성제를 포함하는 희석액으로 희석된 것을 특징으로 하는 키트.