NO871862L - Fremgangsmaate for paavisning av aids-virusinfeksjon. - Google Patents

Description

Sykdommen benevnt som ervervet immunmangelsyndrom

(AIDS) har vært kjent bare i den seneste tid, men har skapt en foruroligende situasjon i mange deler av verden. Antall diagnostiserte tilfeller pr. år har steget raskt med et stort antall dødsfall som resultat. Inntil nylig har sykdommen tydeligvis vært utbredt fortrinnsvis blant homoseksuelle menn med atskillige seksualpartnere, sprøytenarkomane, blødere, blodoverføringsmottakere, og nære heteroseksuelle kontakter til medlemmer av de ovenfor nevnte grupper. Til tross for den stigende bekymring med hensyn til AIDS har opprinnelsen og helbredelsen av sykdommen hentydet til det medisinske og vitenskapelige samfunn, selv om en god del forskning allerede er utført med hensyn til sykdommen.

Et betydelig fremskritt og forståelse av grunnlaget

for AIDS har vært isoleringen av en ny klasse retrovirus fra pasienter som lider av AIDS eller AIDS-beslektet kompleks (ARC). Denne gruppe av vira er avvekslende benevnt lymf-adenopatisk virus (LAV) som henvist til av S. Wain Hobson et al., Cell, 40, 9-17 (1978), humant T-lymfotropisk virus III (HTLV-III) som beskrevet av L. Råtner et al., Nature, 313, 277-84 (1985) og AIDS-tilknyttet retrovirus (ARV) som fremlagt av R. Sanchez Pescador et al., Science, 227, 484-492

(1985). Fra et morfologisk og biologisk standpunkt er denne gruppe vira nærest beslektet med lentivirusfamilien.

De primære mål for hjemsøkelse av AIDS-viruset i menneskekroppen er spesifikke underbestander av T-celler.

Den alvorlige immunmangel hos disse pasienter følger som et resultat av en uvanlig liten andel av T-celler (T4) i deres lymfocyttbestand. Som et resultat er tilgjengeligheten av mange T4-hjelperfunksjoner redusert. En av slike funksjoner er dannelsen av antistoffer ved hjelp av B-cellene.

Den uttalte senkning av cellulær immunitet som opptrer hos pasienter med AIDS, og de kvantitative forandringer i underbestander av deres T-lymfocytter, antyder at T-celler eller en delmengde av T-celler kan være et foretrukket mål for det antatte smittestoff. Alternativt kan disse forandringer være et resultat av påfølgende infeksjoner. Den ned-satte cellulære immunitet kan føre til alvorlige opportunis- tiske infeksjoner hos AIDS-pasienter, av hvilke mange utvikler Kaposi's sarcom. Multiple lymfadenopatier er også beskrevet hos homoseksuelle menn og barn som vil eller ikke vil utvikle AIDS. Lymfadenopatiene kan tilsvare en tidlig eller en mildere form av sykdommen.

Det er for tiden tre betydelige teknikker for påvisning av tilstedeværelsen av serumantistoff spesifikt for HTLV-III-virus. Den mest alminnelig anvendte fremgangsmåte er ELISA-teknikken som benytter enten brønner eller kuler overtrukket med HTLV-III viruslysat. Spesifikt antistoff fra en serumpositiv prøve binder seg til den antigenbelagte overflate, etterfulgt av et enzymbundet, antihumant antistoff og et passende kromogent substrat.

Den andre teknikk for påvisning av antistoff, oftest anvendt som en bekreftende prøve for ELISA-teknikken, er den enzymbundne immunoelektrooverføringsflekk- eller Western flekkteknikk. Et HTLV-III viruslysat blir oppløst ved hjelp av SDS-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) i en serie bånd, hvor hvert bånd angir et spesielt produkt av virus-genomet. De antigene bånd overføres deretter til en nitro-cellulosemembran for anvendelse i en enzymbundet immunosor-bent-prøveteknikk, på samme måte som ELISA-teknikken. Den prinsipielle fordel med Western flekkteknikken er oppløs-ningen av virusantigenene i fine bånd som tilveiebringer meget forbedret spesifisitet. Det er to bånd som tydelig-gjøres av Western flekkteknikken, hvert eller begge av hvilke betraktes som diagnostiske for HTLV-III-spesifikt antistoff, når de påvises ved hjelp av ELISA-andelen av teknikken. Det første bånd er det 24 000 dalton kjerneprotein. Det andre bånd er et 41 000 dalton glykoprotein som utgjør en andel av virushylsteret. Tvetydige resultater i ELISA-teknikken løses ofte ved hjelp av Western flekkteknikken. Positive prøver (spesielt blant individer i lav-risikogrupper) vil i tillegg ofte vise seg å være negative når de revurderes ved hjelp av Western flekkteknikken.

Den tredje antistoffteknikk er en indirekte immuno-fluorescensteknikk som anvender virussmittede lymfoide celler som først reageres med pasientserum og deretter et

fluorkromkonjugert antihumant antistoff.

Fluorescens av de smittede celler utgjør en positiv test. Anvendelsen av uinfiserte lymfoide celler tilveiebringer en negativ kontroll som vil påvise antistoffer spesifikke for cellene og ikke for viruset.

Anvendelsen av ELISA-teknikken og Western flekkteknikken som bekreftende tester for HTLV-III-antistoff, har vært et verdifullt prøveverktøy for eliminering av forurensede blodprodukter fra den nasjonale blodforsyning, så vel som for påvisning av smittsomme organ- og sædgivere. Imidlertid er ikke påvisningen av serumantistoff spesifikt for HTLV-III-virus en diagnose for AIDS. Serumpositivitet beviser ikke at pasienten har blitt utsatt for levende virus, er smittsom, eller har aktivt voksende virus, heller ikke tilveiebringer det noen tegn som angår forløpet av sykdommen. En betydelig prosentdel serumpositive blødere har ikke vist tilstedeværelsen av virus i blodet ved hjelp av de någjel-dende teknikker. Formodentlig har disse individer vært utsatt for inaktivert virus inneholdt i de varmebehandlede faktor VII-preparater. Hos andre serumpositive individer er imidlertid sammenhengen sterk imellom tilstedeværelsen av spesifikt antistoff og muligheten for å oppdyrke HTLV-III-virus.

Behovet for praktiske fremgangsmåter for å påvise tilstedeværelsen av antigener som er tilknyttet HTLV-III virusinfeksjon i humane kroppsvæsker, er vesentlig for en pålite-lig diagnostisk AIDS-test, så vel som for å tilveiebringe midlene for å vurdere virkningen av forskjellige eksperimen-telle medikamenter som nå utprøves med henblikk på deres effektivitet i behandling av AIDS-ofre.

For tiden omfatter den viktigste metode for påvisning av HTLV-III-virus i blod blanding av pasientlymfocytter med fytohemagglutin (PHA)-stimulerte perifere blodlymfocytter (PBL), under tilsetning av frisk PHA-stimulerte PBL hver tredje dag. Supernatantprøver festes deretter hver tredje dag for tilstedeværelsen av reverstranskriptase. Cellene vurderes ved hjelp av elektronmikroskopi med henblikk på tilstedeværelsen av virus. Denne metode er tydeligvis be- grenset til utstyr med et høyt nivå av P3-innhold, så vel som raffinerte vevsdyrknings- og analysemuligheter. Det kan ta flere uker for å erholde resultater, og påliteligheten av å smitte lymfocyttkulturer med virus er tvilsom. Anvendelse av en celleslekt kjent som H9 har vært til noen hjelp, men de fleste av de ovenfor nevnte problemer eksisterer ennå.

Visse diagnostiske teknikker for bestemmelse av tilstedeværelsen av AIDS eller AIDS-antistoffer er kjent. En slik teknikk er en hjelpersuppressor-celleteknikk, utført på T-celler og T-celle-underpopulasjoner. Reverseringen av hjelpersuppressor-forholdet benyttes som et tegn på den mulige tilstedeværelse av AIDS-virus. Denne teknikk har lav spesifisitet og følsomhet. En annen teknikk medfører en bestemmelse av thymosinnivået, økningen av dette nivå er et tegn på tilstedeværelsen av AIDS. Denne teknikk gir posi-

tive resultater bare når sykdommen har nådd et fremskredet stadium. Enn videre er det rapportert at teknikken ikke er i stand til å gi gjennomført positive avlesninger i alle tilfeller når AIDS er kjent å være til stede. Diagnosen av AIDS hos pattedyrmedlemmer, som medfører anvendelse av immunocytoadherent-(rosetthemning)-teknikker er fremlagt i EP patentsøknad nr. 154499. U.S. patentskrift nr. 4 520 113 fremlegger den serologiske påvisning av antistoffer mot HTLV-III i sera fra pasienter med AIDS og pre-AIDS-til-stander. Et nytt differensieringsantigen forbundet med den hjelpertilførende funksjon av humane T-celler er beskrevet i Nature (1985) 318.: 465-467. Diagnosen av AIDS eller lymf-adenopatisk syndrom ved anvendelse av spesifisert T-lymfotropisk retrovirusantigen er diskutert i EP patentsøknad nr. 138667.

Den foreliggende oppfinnelse er rettet mot en fremgangsmåte for å påvise tilstedeværelsen av HTLV-III-smittede celler i et medium slik som en kroppsvæske eller et dyrkningsmedium. Fremgangsmåten omfatter å bringe mediet i kontakt med et monoklonalt antistoff mot et antigen dannet som et resultat av infeksjonen, og å påvise bindingen av antistoffene til antigenet. Antigenet kan være et HTLV-III virusgenprodukt, eller det kan være bundet til et slikt produkt. Alternativt kan antigenet være dannet som et resultat av infeksjonen og funnet på en lymfocytt slik som en T-hjelpercelle.

Oppfinnelsen omfatter videre en immunologisk analysefremgangsmåte for påvisning av en AIDS-virusbeslektet infeksjon i en vert. Fremgangsmåten omfatter blanding av en kroppsvæske fra verten med et monoklonalt antistoff som binder seg til et antigen som er til stede bare når AIDS-virusinfeksjonen er til stede, og en undersøkelse av blandingen for tilstedeværelsen av immunkomplekser bestående av antigenet og det monoklonale antistoff.

Oppfinnelsen omfatter også et antistoff som er i stand til å binde seg til et serumantigen, dannet som et resultat av en human HTLV-III virusinfeksjon. Antigenet kan være på et HTLV-III virusgenprodukt, eller det kan være bundet til et HTLV-III virusgenprodukt. Alternativt kan antigenet være bundet til en lymfocytt som et resultat av en HTLV-III virusinfeksjon. Hybride kontinuerlige cellelinjer, identi-fikasjonskarakterisert ved at de utskiller antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse, er også innbefattet.

Diagnostiske analysesett tilveiebringes også og omfatter, emballert i kombinasjon, et monoklonalt antistoff som er i stand til å binde seg til et antigen dannet som et resultat av en infeksjon av det AIDS-forårsakende virale stoff, eller av et merket derivat av et slikt antistoff.

En annen side av den foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for en tidlig påvisning av HTLV-III virusinfeksjon i cellekulturer. Fremgangsmåten omfatter blanding av celler mistenkt for å være smittet med HTLV-III-virus, med et monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen. Påvisning av en binding imellom antistoffet og antigenet tyder på tilstedeværelsen av HTLV-III virusinfeksjon i cellekulturen.

Oppfinnelsen innbefatter også sammensatte materialer som omfatter et kompleks av et monoklonalt antistoff som binder seg til (a) et HTLV-III-genprodukt eller et derivat derav, og et slikt (b) genprodukt eller derivat. Et annet sammensatt materiale ifølge den foreliggende oppfinnelse omfatter et kompleks av (a) et monoklonalt antistoff som kan binde seg til et annet cellebundet antigen enn et HTLV-III-genprodukt, og som er dannet som et resultat av en HTLV-III-infeksjon, og (b) et slikt antigen.

Før en videre fortsettelse med en beskrivelse av de spesifikke utførelsesformene av den foreliggende oppfinnelse vil et antall uttrykk bli definert.

"AIDS-virus" betyr HTLV-III, ARV, LAV og beslektede vira kjent for å forårsake eller mistenkt for å forårsake AIDS, ARC, LAD og beslektede sykdommer.

"AIDS-beslektede sykdommer" betyr en sykdom som er AIDS, AIDS-beslektet kompleks (ARC), lymfadenopati (LAD), fremskridende utspredt lymfadenopati (PGL), og beslektede sykdommer som er kjent eller mistenkt for å være forårsaket av en AIDS-virusinfeksjon.

"Oppløselig AIDS-antigen" betyr et antigen som er dannet som et resultat av en AIDS-virusinfeksjon som ikke er bundet til en cellemembran, og som karakteristisk er funnet hos mennesker som er smittet av et AIDS-beslektet virus.

"Cellebundet AIDS-antigen" betyr et antigen bundet til en cellemembran og karakteristisk funnet hos mennesker som er smittet av et AIDS-beslektet virus.

"Kroppsvæske" betyr en væske eller et semifast materiale erholdt fra kroppen til et pattedyrindivid. Væskematerialet kan være sterilt eller usterilt og inneholder vanligvis celler. Væskematerialet kan anvendes uten videre behandling, eller det kan behandles for å fjerne celler, debris, o.l. Eksempler på kroppsvæsker er komplett blod, lymfevæske, serum, plasma, spytt, sæd og ryggmargsvæske. Kroppsvæske kan fjernes fra individet ved hjelp av en sprøyte eller nål eller ved naturlig utstøtning.

"Celle" betyr en encellet organisme, slik som en bakterie, og angår også normale og omdannede celler, vanligvis fra pattedyr, erholdt fra en kroppsvæske. Celler kan være smittet eller ikke smittet, eller kan være dyrket eller ikke dyrket.

"Lymfocytt" betyr forskjellige typer hvite blodlegemer eller celler som oppstår i nettvevet hos lymfekjertler og

lymfeknuter. Kjernen er enkel og omgitt av protoplasma som generelt er beskrevet som ikke-kornet. Det finnes små lymfocytter, som er på størrelse med et rødt blodlegeme, og store lymfocytter som antagelig er lymfocytter under utvikling og som er to eller tre ganger større enn de små lymfocytter og som inneholder en større andel protoplasma.

"T-lymfocytt" betyr de lymfocytter som stammer fra thymus. Hovedfunksjonen av T-celler er regulering av immunsvaret fra B-celler via hjelper- og suppressorfunksjoner. T-celler danner ikke alminnelige antistoffer og atskiller

seg således fra antistoffdannende celler som oppstår i ben-margen, og som betegnes som B-lymfocytter.

"T-hjelpercelle" betyr en T-lymfocytt som har en hovedfunksjon i å regulere immunsvaret fra B-celler ved en hjelperegenskap i motsetning til en suppressoregenskap.

"Virusgenprodukt" betyr et produkt så som et antigen erholdt fra det AIDS-tilknyttede virus ved en RNA- eller en DNA-kopiering.

Den foreliggende oppfinnelse er rettet mot en fremgangsmåte for å påvise tilstedeværelsen av celler som er smittet med et AIDS-tilknyttet virus som HTLV-III i et medium. Fremgangsmåten omfatter å bringe mediet i forbindelse med monoklonale antistoffer mot et antigen, dannet som et resultat av infeksjonen, og videre å påvise bindingen av antistoffene til antigenet. Dersom binding imellom anti-

genet og antistoffene inntreffer, tyder dette på tilstedeværelsen av en AIDS-beslektet virusinfeksjon av cellene i mediet. Mediet kan være en kroppsvæske eller et dyrkningsmedium. Antigenet kan være et oppløselig antigen eller et cellebundet antigen. Enn videre kan antigenet være et virusgenprodukt, eller bundet til et virusgenprodukt. Når antigenet ikke er et virusgenprodukt, er det dannet som et resultat av infeksjonen av cellene med det AIDS-beslektede virus. Antigenet kan være bundet til en lymfocytt som en T-hjelpercelle eller til en makrofag. Når antigenet er et virusgenprodukt, medfører vanligvis fremgangsmåten påvisning av bindingen av antistoffer til de smittede celler.

Et antistoff som omfattes av området for den forelig gende oppfinnelse, er i stand til å binde seg til et serumantigen, dannet som et resultat av en HTLV-III virusinfeksjon. Antigenet er et HTLV-III virusgenprodukt, eller det er bundet til et HTLV-III virusgenprodukt. Antigenet kan alternativt være bundet til en lymfocytt og er dannet som et resultat av HTLV-III-infeksjonen. Når antigenet er oppløse-lig, er det vanligvis ikke et virusgenprodukt.

Monoklonale antistoffer som er anvendelige ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan dannes ifølge standard-teknikkene til Kohler og Milstein, Nature, 265:495-497, 1975. I delvis rensede viruslysater erholdt fra dyrkningen av HTLV-III i human lymfe, kan H9-cellelinjen anvendes som immunogenet. Prøver av de HTLV-III-antigene preparater injiseres i en mus og, etter en tilstrekkelig tid, ofres musen og miltceller erholdes. Miltcellekromosomer som koder for basesekvensene i deønskede immunglobuliner bevares for bestandig ved sammensmeltning av miltcellene og myelom-cellelinjer, vanligvis under nærvær av en ikkeionisk deter-gent, f.eks. polyethylenglykol. De resulterende celler, som omfatter de sammensmeltede hybridomer, tillates å vokse i et selektivt medium som HAT-medium, og de overlevende celler dyrkes i et slikt medium under anvendelse av begrensende fortynningsbetingelser. Cellene dyrkes i en passende behol-der, dvs. mikrotiterbrønner, og supernatanten analyseres med henblikk på monoklonale antistoffer med den ønskede spesifisitet.

Forskjellige teknikker for å øke utbyttet av monoklonale antistoffer finnes, slik som injisering av hybridom-cellene i bukhulen til en pattedyrvert som godtar cellene, og innsamling av ascitesvæsken. Når en utilstrekkelig mengde av det monoklonale antistoff samler seg i ascitesvæsken, innsamles antistoffet fra blodet til verten. Forskjellige konvensjonelle metoder for isolering og rensing av de monoklonale antistoffer fra andre proteiner og andre for-urensninger finnes (se Kohler og Milstein, supra).

Ett slikt monoklonalt antistoff som er nyttig ved fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse, er eksemplifisert ved et nytt antistoff som uttrykkes av den hybride kontinuerlige cellelinje med betegnelsen 3D8. Dette monoklonale antistoff binder seg til determinanter på antigener som er HTLV-III genprodukter bundet til en celle. Lysater av AIDS-smittede celler underkastes natriumdodecyl-sulfat-polyacrylamid endimensjonal gelelektroforese (SDS-PAGE). Monoklonalt antistoff bundet til nitrocellulose ble frembrakt ved hjelp av SDS-PAGE-gel ifølge Western flekkteknikker. Det ble fastslått at antistoffet 3D8 binder seg til en reverstranskriptase på 55 kilodalton og 65 kilodalton (p55 og p65), et kjerneprotein på 24 kilodalton (p24), et glykoproteinhylsterantigen på 41 kilodalton (gp41), og et udefinert protein på 39 kilodalton (p39). Antigenene betegnet p55 og p65, kjerneproteinantigenet p24 og glyko-proteinhylsterantigenet gp41 er beskrevet i Science (1986) 2,31-.1289-1291. Udefinerte proteiner p28, p39, p49 og p52 kan være antigener som er bundet til en celle men er ikke HTLV-III genprodukter. Disse antigener kan være dannet som et resultat av en AIDS-virusinfeksjon og identifiserer en celle som smittet. På den annen side kan p28-, p49- og p52-proteinene være virusgenprodukter som ikke er immunogene hos mennesket. P41-, p55-, og p65-antigener synes å være opp-løselige antigener. Bygget på Western flekkobservasjoner, kan 3D8-antistoffet og antistoffene beskrevet herunder gjen-kjenne forskjellige determinanter på de ovenfor beskrevne antigener. 3D8-antistoffet er av IgM-isotypen. 3D8-antistoffet binder seg ikke til normale lymfocytter eller celler fra cellelinjer H9 eller CEM.

Et annet monoklonalt antistoff anvendelig ved fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse illustreres ved et nytt antistoff som uttrykkes av den hybride kontinuerlige cellelinje med betegnelse 3F7. En lignende bestemmelse under anvendelse av SDS-PAGE og Western flekkteknikker viste at antistoff 3F7 binder seg til p24-antigenet, p49-antigenet, p55-antigenet og p65-antigenet. 3F7-antistoffet tilhører IgG 1-isotypen. 3F7-antistoffet binder seg ikke med høy intensitet til normale lymfocytter, H9-celler eller CEM-celler. Ved betegnelsen "høy intensitet" innforstås at topper for fargede celler og ikke-fargede celler i gjennom-

strømningscytometri er atskilt.

Et annet monoklonalt antistoff, anvendelig ved fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse, illustreres ved et nytt antistoff som uttrykkes av den hybride kontinuerlige cellelinje med betegnelse 3G12. Ved en kombinasjon av SDS-PAGE og Western flekkteknikker ble det påvist at antistoff 3G12 binder seg til p24-antigenet og p55-antigenet. 3G12-antistoffet tilhører IgG 1-isotypen. 3G12-antistoffet binder seg ikke med høy intensitet til normale lymfocytter eller CEM-celler.

Et annet monoklonalt antistoff, anvendelig ved fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse, illustreres ved et nytt antistoff som uttrykkes av den hybride kontinuerlige cellelinje med betegnelse 2A11. Antistoff 2A11 binder seg til p24-antigenet, p39-antigenet, og p65-antigenet. 2All-antistoffet er en IgM. 2All-antistoffet binder seg ikke med høy intensitet til normale lymfocytter, H9-eller CEM-celler.

Et annet monoklonalt antistoff, anvendelig ved fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse, illustreres ved et nytt antistoff som uttrykkes av den hybride kontinuerlige cellelinje med betegnelse 4G2. Som påvist ved SDS-PAGE og Western flekkteknikker, binder 4G2-antistoffet seg til p24-antigenet og p55-antigenet. 4G2-antistoffet til-hører IgM-isotypen. 4G2-antistoffet binder seg ikke med høy intensitet til normale lymfocytter, H9-eller CEM-celler.

Et annet monoklonalt antistoff, anvendelig ved fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse, illustreres ved et nytt antistoff som uttrykkes av den hybride kontinuerlige cellelinje med betegnelse 1E2. Dette monoklonale antistoff binder seg til p55-antigenet og p49-antigenet. lE2-antistoffet tilhører IgM-isotypen. lE2-antistoffet binder seg ikke med høy intensitet til normale lymfocytter eller CEM-celler.

Et annet monoklonalt antistoff, anvendelig ved fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse, illustreres ved et nytt antistoff som uttrykkes av den hybride kontinuerlige cellelinje med betegnelse 3G8. Antistoff 3G8 binder seg til p24-antigenet, p39-antigenet og p41-antigenet. 3G8-antistoffet er en IgM-isotype. 3G8-antistoffet binder seg ikke med høy intensitet til normale lymfocytter, H9-celler eller CEM-celler.

Et annet monoklonalt antistoff, anvendelig ved fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse, illustreres ved et nytt antistoff som uttrykkes av den hybride kontinuerlige cellelinje med betegnelse 1C11. Antistoff 1C11 binder seg til p55-antigenet og p65-antigenet. lCll-antistoffet er en IgM. Cellelinjen 1C11 ble erholdt ved re-kloning av cellelinje 3D8. Tydeligvis er cellelinjen 3D8 en blanding av to cellelinjer, nærmere bestemt 3G8 og 1C11. Når "individuelle celler fra 3D8 isoleres og dyrkes, erholdes to cellelinjer, 3G8 og 1C11. De kombinerte Western flekk-mønstre for 3G8 og 1C11 passer, når lagt oppå hverandre, med Western flekkmønsteret for 3D8.

Også innbefattet innenfor området av oppfinnelsen, og innenfor definisjonen av monoklonalt antistoff, er anvendelige bindingsfragmenter av det monoklonale antistoff, som Fab, F(ab')2°9Fv* Antistoffragmentene erholdes ved hjelp av kjent teknikk. Anvendelige bindingsfragmenter kan f.eks. fremstilles ved peptidaseoppløsning av antistoffet ved anvendelse av papain eller pepsin. ;Mens de ovenfor nevnte spesifikke eksempler på de nye antistoffer ifølge den foreliggende oppfinnelse er rettet mot antistoffer tilhørende IgG- og IgM-klassene fra en kilde tilhørende musefamilien, er dette ikke ment å være en begrensning. De ovenfor nevnte antistoffer og de antistoffer som innehar virkemessig ekvivalens med de ovenfor nevnte antistoffer, enten fra en kilde tilhørende musefamilien, en annen pattedyrkilde inkludert menneske, rotte, eller andre kilder, eller kombinasjoner derav, er innbefattet innenfor området av oppfinnelsen. Likeledes er andre klasser som IgA, IgE, o.l., innbefattet isotyper innen slike klasser og også andre isotyper innen IgG- og IgM-klassene. Ved betegnelsen "virkemessig ekvivalens" innforstås at antistoffet er i stand til å binde seg til det ovenfor beskrevne antigen og er i stand til å konkurrere med et antistoff ifølge opp finnelsen for å binde seg til et slikt antigen. Det vil si at et slikt antistoff, når det blandes med en prøve som inneholder et slikt antigen, vil binde seg til et slikt antigen og vil blokkere et antistoff ifølge oppfinnelsen fra å binde seg til et slikt antigen. Pattedyr- (dvs. menneske) monoklonale antistoffer kan fremstilles ved fremgangsmåter beskrevet i Olsson et al., Proe. Nat. Acad. Sei., U.S.A. ;(1980) 77:5429-5431; Engelman et al., "Human Hybridomas and Monoclonal Antibodies", Plenum Press, N.Y., N.Y. (1985). Sammensmeltningsteknikkene er lignende de ovenfor beskrevne med hensyn til fremstillingen av musefamiliehybridomer. De følgende cellelinjer er eksempler på de som kan anvendes til fremstilling av hybride kontinuerlige cellelinjer: NS-1 (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, ATTC), SP-2 (ATTC), HL-1 (Ventrex, Portland, Maine). Ved utførelsen av en fremgangsmåte i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse, innsamles en prøve av en kroppsvæske fra subjektet og prepareres som følger: Ved fremstilling av lymfocytter atskilles mononukleære celler fra resten av blodet. For eksempel antikoaguleres perifert blod med heparin, fortynnes med et like stort volum fosfat-buffer og utsettes for tetthetsgradientsentrifugering, der-ved atskilles de mononukleære celler (hovedsakelig lymfocytter) fra resten av blodet. Cellene vaskes deretter i buffer og suspenderes i buffer med en liten mengde (f.eks. 0,01-1 %, fortrinnsvis 0,1 %) gelatin og en liten mengde (f.eks. 0,01-1 %, fortrinnsvis 0,1 %) natriumazid ved 5 x IO<6>celler pr. ml. Alternativt kan atskillelse av de hvite blodceller oppnås ved hemolyse av komplett blod. Ved fremstilling av serum pipetteres perifert blod over i et vanlig glassrør, blodet tillates å koagulere og sentrifugeres deretter for å atskille serumet fra koagu-latet. Prøvemengden avhenger av beskaffenheten av den spesielle analyseteknikk som anvendes og av den spesielle kropps-væsken som skal analyseres. De følgende prøvemengder nevnes som eksempel og ikke som begrensning; dyktige teknikere vil være i stand til i stor utstrekning å anvende fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse på grunnlag av beskriv-elsen som tilveiebringes heri. For serum- eller plasmaprøver vil prøvemengden være i området fra 0,1 ml til 5,0 ml, fortrinnsvis 1,0 ml til 2,0 ml. For sædprøver vil mengden være 0,05 ml til 1,0 ml, fortrinnsvis 0,1 til 0,5 ml. Prøven bringes deretter i kontakt med en av de ovenfor nevnte antistoffer eller en blanding av disse, under betingelser som gir binding av antistoffet til antigenet i prøven, under dannelse av immun-, dvs. antigen-antistoffkomplekser. Avhengig av fremgangsmåtens beskaffenhet kan antistoffet bindes til et støttestoff, eller det kan foreligge i et vandig medium. Antistoffet og prøven bringes vanligvis i kontakt med hverandre i et vandig, bufret medium. Bufrene som kan anvendes omfatter fosfat, tris og bicarbonat. Den anvendte pH avhenger av beskaffenheten av prøven og antistoffet og befinner seg vanligvis i området fra 5 til 8. Det vandige medium kan i tillegg inneholde organiske polare oppløsningsmidler i en mengde av 0 til 40 %. De organiske polare oppløsningsmidler er vannoppløselige og inneholder generelt fra 1 til 10 carbonatomer og fra 1 til 4 oxygen-atomer. Antistoffkonsentrasjonen avhenger også av fremgangsmåtens beskaffenhet og av prøven som skal analyseres. Antistoffmengden ligger som regel i området 0,5 ug til 2 ug pr. ml. Etter tidsrommet med kontakt mellom prøven og antistoffet,, og avhengig av fremgangsmåtens beskaffenhet, kan blandingen behandles for å fjerne ureagert antistoff. Dette kan oppnås ved vasking med et vandig, vanligvis bufret, medium. I alminnelighet bør mengden av vaskeoppløsning være tilstrekkelig for å fjerne det ureagerte antistoff. Antallet og typen av vasketrinn avhenger av hvorvidt en heterogen eller homogen analysefremgangsmåte anvendes. Deretter påvises tilstedeværelsen av binding av antistoffet til antigenet i prøven. Denne binding er en indika-sjon på tilstedeværelsen av en AIDS-beslektet virusinfeksjon i eksemplaret. Det vil si at antallet av dannede antigen-antistof f ( immun) komplekser bestemmes. For å bestemme tilstedeværelsen av binding, innlemmes midler for å danne et påvisbart signal i forhold til tilstedeværelsen av antigen i prøven, i analyseteknikken. Man kan f.eks. forene antistoffet som er anvendt i den foreliggende teknikk med et merkestoff som er et stoff som er i stand til å danne et påvisbart signal med hensyn til tilstedeværelse eller fravær av en AIDS-beslektet virusinfeksjon. Merkestoffet kan være et enzym, en radioisotop, en partikkel, et støttestoff, et kromogen, et kjemiluminescerende stoff, et fluorescerende stoff, et koenzym, et fritt radikal, eller en bakteriofag. Antallet merkestoffer som anvendes på antistoffet bestemmes vanligvis ved betingelsene for den foreliggende oppfinnelses fremgangsmåte, og ved tilgjengeligheten av seter for til-knytning av merkestoffet til antistoffet. Metoder for til-knytning av merkestoffer til antistoffer er kjent i fremgangsmåten. Se f.eks. U.S. patentskrifter nr. 4 720 450, 4 235 869, 3 935 074 og 3 996 345. Alternativt kan man anvende en merket bindingspartner som er spesifikk for antistoffet. Dette kan være et merket antistoff som er spesifikt for det anvendte antistoff, eller et merket antigen som binder seg til antistoffet. Der hvor det monoklonale antistoff erholdes fra en kilde tilhørende musefamilien, kan et merket antimusimmunglobulin spesifikt for antistoffet som er anvendt i den foreliggende fremgangsmåte, benyttes. Slike immunglobuliner kan dyrkes ifølge standardteknikker ved å injisere en passende vert med det monoklonale antistoff, etter venting i en passende tid innsamles antimusimmunglobulinene fra blodet til den injiserte vert. Fremgangsmåten og antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelse kan tilpasses de fleste analyser som medfører antigen-antistoffreaksjoner. Analysene kan være homogene eller heterogene. I en homogen analysefremgangsmåte kan prøven forbehandles hvis nødvendig for å fjerne uønskede stoffer. Den immunologiske reaksjon omfatter vanligvis det spesifikke antistoff, en merket analytt og den aktuelle prøve. Signalet som oppstår fra det merkede stoff modifi-seres, direkte eller indirekte, ved bindingen av antistoffet til den merkede analytt. Både den immunologiske reaksjon og påvisning av omfanget av denne utføres i en homogen oppløs-ning. Immunkjemiske merker som kan benyttes innbefatter frie radikaler, fluorescerende fargestoffer, enzymer, bakteriofager og koenzymer. Eksempler på homogene analyser er den enzymavpassede immunologiske analyseteknikk (EMIT°) beskrevet i U.S. patentskrift nr. 3 817 837. I en heterogen analysefremgangsmåte er reagensene vanligvis prøven, antistoffet og midler for å danne et påviselig signal. Prøven plasseres vanligvis på et støtte-underlag, som en plate eller et preparatglass, og bringes i kontakt med antistoffet i en vandig fase. Støtteunderlaget atskilles deretter fra den flytende fase, og enten støtte-underlaget eller den flytende fase undersøkes med henblikk på et påviselig signal, under anvendelse av midler for å danne slike signaler. Midler for å danne et påviselig signal i heterogene analyser, omfatter anvendelse av radio-aktive merker, fluorescerende stoffer og enzymer. Eksempler på heterogene immunologiske analyseteknikker er radioimmun-analyseteknikken (RIA), immunofluorescensmetoder, enzymbundne immunanalyseteknikker, slik som den enzymbundne immunosorbentanalyseteknikken (ELISA, se U.S. patentskrifter nr. 3 654 090, 3 839 153, 3 850 752, 4 016 043 og "Reissue" patentskrift nr. 29 169. For en mer detaljert diskusjon av de ovenfor nevnte immunologiske analyseteknikker, se "Enzyme-Immunoassay," av Edward T. Maggio, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1980. Se også U.S. patentskrifter nr. 3 690 834, 3 791 932, 3 817 837, 3 850 578, 3 853 987, 3 867 517, 3 901 654, 3 935 074, 3 984 533, 3 996 345 og 4 098 876. Denne fortegnelsen er ikke tilsiktet å være uttømmende. En bestemt utførelsesform av en analysefremgangsmåte ifølge den foreliggende oppfinnelse, i et illustrerende og ikke begrensende henseende, omfatter anvendelsen av et støtteunderlag som et preparatglass eller en brønn i en petriskål. Fremgangsmåten omfatter festing av analyseprøven til støtteunderlaget ved hjelp av et passende festemateriale som aceton, og inkubasjon av prøven på preparatglasset med et monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen. Etter vasking med en passende buffer, som fosfatbufret salin, bringes støtteunderlaget i kontakt med en merket spesifikk bindingspartner til det monoklonale antistoff. Etter ønsket inkubasjon vaskes preparatglasset to ganger med en vandig buffer, og bestemmelsen med hensyn til binding av det monoklonale antistoff til prøven utføres. Dersom merkingen er fluorescerende, kan preparatglasset dekkes med en fluorescerende antistoffpreparerende væske på et dekkglass og deretter undersøkes med et fluorescensmikroskop for å bestemme omfanget av binding. På den annen side kan merkingen være et enzym som er konjugert med det monoklonale antistoff ifølge oppfinnelsen, og omfanget av binding kan bestemmes ved å undersøke preparatglasset med henblikk på tilstedeværelsen av enzymaktivitet, som kan vises ved dannelse av et bunn-fall, en farge e.l. En annen bestemt utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse omfatter anvendelse av en overflate, til hvilken det monoklonale antistoff ifølge oppfinnelsen festes. Den underliggende struktur av overflaten kan innta forskjellige former, ha forskjellige sammensetninger og være en blanding av bestanddeler eller laminater eller kombinasjoner av disse. Overflaten kan anta mange forskjellige fasonger og former og kan ha forskjellige dimensjoner, avhengig av formen for anvendelse og måling. Illustrerende overflater kan være puter, kuler, skiver, eller strimler som kan være flate, konkave eller konvekse. Tykkelsen er ikke kritisk, vanligvis er den fra 0,1 til 2 mm, og med enhver passende diameter eller andre dimensjoner. Overflaten understøttes karakteristisk av en stav, et rør, et kapillær, en fiber, en strimmel, en skive, en plate eller en kyvett. Overflaten er karakteristisk porøs og flerfunksjonen eller den kan gjøres flerfunksjonen, både for å tillate kovalent binding av det monoklonale antistoff ifølge oppfinnelsen og for å tillate binding av andre forbindelser, som utgjør en del av en metode for dannelse av et påvisbart signal. Et bredt antall forskjellige organiske og uorganiske polymerer, både naturlige og syntetiske og kombinasjoner derav, kan anvendes som materiale for den faste overflate. Illustrerende polymerer omfatter polyethylen, polypropylen, poly(4-methylbuten), polystyren, polymethacrylat, poly-(ethylen-terefthalat), rayon, nylon, poly(vinyl-butyrat), siliconer, polyformaldehyd, cellulose, celluloseacetat, nitrocellulose, latex. Andre materialer som kan anvendes omfatter papir, glass, keramikk, metaller, metalloider, halvledermaterialer, cermitter og silicater. Også omfattet er substrater som danner geler, gelatiner, lipopolysaccha-rider, silicater, agarose og polyacrylamider eller polymerer som danner flere vandige faser som dekstraner, polyalkylen-glykoler (alkylen med 2-3 carbonatomer) eller overflate-aktive stoffer som fosfolipider. Bindingen av det monoklonale antistoff ifølge den foreliggende oppfinnelse til overflaten kan oppnås ved hjelp av velkjente fremgangsmåter, vanlig tilgjengelige i littera-turen. Se f.eks., "Immobilized Enzymes," Ichiro Chibata, Halstad Press, New York (1978) og Cuatrecasas, J. Bio. Chem., 245:3059 (1970) . Ved utførelsen av analysen i samsvar med denne utførelsesform av oppfinnelsen blandes prøven med et vandig medium, og mediet bringes i kontakt med overflaten som inneholder det monoklonale antistoff ifølge oppfinnelsen. Ele-menter av et signaldannende system og alle ønskelige hjelpe-stoffer kan også innbefattes i det vandige medium, enten samtidig eller de tilsettes etter hvert for å tilveiebringe et påviselig signal som er forbundet med overflaten. Midlene for dannelse av det påviselige signal kan medføre en innblanding av en merket analytt i mediet, eller det kan medføre anvendelse av et annet monoklonalt antistoff som har et merkestoff konjugert til seg. Etterfølgende trinn av atskillelse og vask utføres som nødvendig. Det påviste signal settes i sammenheng med tilstedeværelsen av en AIDS-eslektet infeksjon. Det er innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse å innbefatte både en kalibrering og målingen på overflaten av det samme støttemateriale. For en utvidet diskusjon av de forskjellige alminnelige teknikker som er omtalt ovenfor, med hensyn til ut-førelse av en analyse på en overflate, se U.S. patentskrif ter nr. 4 299 916, 4 391 904, 4 533 629 og 4 540 659. Et annet eksempel på en teknikk i overensstemmelse med fremgangsmåten og de nye antistoffer ifølge den foreliggende oppfinnelse er en ikke-gjennomstrømningscytometrisk teknikk. Prøven som skal analyseres og et monoklonalt antistoff ifølge den foreliggende oppfinnelse som er konjugert med et merkestoff, blandes sammen og inkuberes under betingelser som vil medføre agglutinering når et AIDS-beslektet virus-antigen er til stede i prøven. Ønskelige inkuberingstider er 10 til 600 sekunder, fortrinnsvis 10 til 200 sekunder ved moderate temperaturer, vanligvis 10 til 37°C. Etter inku-bering undersøkes mediet for å bestemme enhver forandring i fluorescens som et resultat av agglutinering. Til dette formål kan anvendes en ikke-gjennomstrømningscytometrisk teknikk, i hvilken en lysstråle med liten diameter, dannet ved hjelp av spalter eller fortrinnsvis laser, anvendes for å atskille partikler basert på deres relative størrelse. Denne teknikk anvender fluorescerende pulshøydeanalyse eller sammenheng mellom fluorescenssvingninger: Briggs et al., "Homogeneous Fluorescence Immunoassay," Science, 212:1266-1267 (1981) og Nicoli et al., "Fluorescence Immunoassay Based on Long-time Correlations of Number Fluctuations," Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 7 (8):4904-4908 (1980). En foretrukket teknikk for bestemmelse av en forandring av fluorescensen i en ikke-gjennomstrømningscyto-metrisk teknikk omfatter anvendelse av et fiberoptisk cyto-meter beskrevet i U.S. patentskrift nr. 4 564 598. Det publiseres fremgangsmåte og apparatur for bestemmelse av tilstedeværelse av partikler i en dispersjon, med hensyn til påvisning av tilstedeværelse eller mengde av et materiale av interesse. En optisk fiber anvendes for å definere et rela-tivt lite volum fra hvilket fluorescerende lys kan mottas og telles. Volumet settes i sammenheng med volumet i hvilket det er sannsynlig at det befinner seg bare én enkelt partikkel, eller noen få partikler som fører til en på forhånd bestemt svingning. Ved anvendelse av forskjellige frem-gangsmåteer som tillater forandringer i fluorescenssvingninger i forhold til tilstedeværelsen av en analytt i prøven, kan tilstedeværelse av analytten bestemmes. Svingningene observeres over en tidsperiode på en statisk måte, eller ved prøveuttaking av et stort antall volumer fra prøven. En bestemmelse utføres deretter ved å sammenligne de erholdte resultater med oppløsninger som har en kjent mengde av analytt. En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse omfatter anvendelse av det monoklonale antistoff ifølge oppfinnelsen i en "heleelie-ELISA"-test for påvisning av HTLV-III-manifestering på lymfocytter. I en spektrofotometrisk metode isoleres perifere blodlymfocytter ved tetthetsgradientsentrifugering og suspenderes i et vandig prote-ininneholdende medium (f.eks. et vandig medium som inneholder bovint fosterserum, glutamin, og RPMI/640). En liten prøve, f.eks. 50 y.1 av cellesuspensjonen, kan tilsettes brønner i en 96-brønners mikrotiterplate, og inkuberes i et tidsrom av 1 minutt til 5 timer. Etter vask av de celle-belagte brønner tilsettes en prøve av et antistoff ifølge oppfinnelsen til hver brønn og inkuberes i 1 minutt til 3 timer. Etter vask tilsettes et kromogent substrat som orthofenylendiamin og hydrogenperoxyd til hver brønn og inkuberes i 1 minutt til 1 time. Resultater kan avleses spektrofotometrisk. Ved en mikroskopisk metode inkuberes en suspensjon av bufrede lymfocytter med antistoff i 1 minutt til 3 timer ved en temperatur på 0°C til 37°C. Cellene vaskes og blandes deretter med enzymmerket antistoff mot det ovenfor nevnte antistoff i 1 minutt til 3 timer ved 0°C til 37°C. Etter vask tilsettes enzymsubstrat, og cellene under-søkes for tilstedeværelsen av et signal. En annen utførelsesform ifølge den foreliggende oppfinnelse omfatter anvendelse av en punktflekkteknikk for å påvise tilstedeværelse av et antigen forbundet med en AIDS-beslektet virusinfeksjon. Ved en slik fremgangsmåte plasseres en liten prøve, f .eks. 1 y.1 pasientserum, på en nitro-cellulosestrimmel ved siden av en prøve av normalt serum. Strimmelen bløtes opp i et vandig bufret medium, som fosfatbufret salin med gelatin, inneholdende et monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen, i en periode på 1 til 60 minut ter, etterfulgt av tilsetning av et merket antistoff mot det monoklonale antistoff. I en annen utførelsesform i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse anvendes et gjennomstrømningscyto-metribasert påvisningssystem for HTLV-III-virus på lymfocytter. Gjennomstrømningscytometri betyr analyse ved hjelp av fluorescensaktivert cellesorterer (FACS). Prinsippet for virkemåten av gjennomstrømningscytometri er beskrevet i detalj. Se f.eks. Bonner et al., Rev. scient. Instrum. ;(1972) 43:404-409, Herzenberg et al., Proe. Natn. Acad. Sei., U.S.A. (1979) 76:1453-1455, Miller et al., J. Immunol. Methods (1981) 47:13-24, Loken et al., Ibid (1982) 5_0:R85-R112 og Kruth, Anal. Biochem. (1982) 125:225-242. En suspensjon av enkle celler fra prøven merket med et fluorescerende antistoff sendes i enkel rekke gjennom en smal laserstråle. Den utstrålte fluorescens samles ved hjelp av et optisk system rettvinklet på belysningen. Den utstrålte fluorescens fra hver individuelle celle måles og lagres, og bestemmelse av tilstedeværelse av det aktuelle antigen utføres fra de lagrede data. ;En annen side av den foreliggende oppfinnelse omfatter påvisning av en AIDS-beslektet virusinfeksjon ved hjelp av korttidsvirusdyrkning av kliniske prøver. Prøven dyrkes med H9- eller CEM-celler etterfulgt av påvisning ved benyttelse av prinsippene for gjennomstrømningscytometri, eller prepa-ratglasstester. "H9" betyr en T-cellelymfomcellelinje. "CEM" betyr en T-cellelymfomcellelinje. Med "korttids" menes 2 til 48 timer, fortrinnsvis 10 til 24 timer som en sammenligning med den nåværende fremgangsmåte som krever 20 til 30 dager. ;Det er også innen rammen av den foreliggende oppfinnelse å benytte de nåværende teknikker og nye monoklonale antistoffer i forbindelse med sorteringsanalyse for påvisning av antistoffer mot de AIDS-beslektede antigener i serum. Pasientprøver kan analyseres ved anvendelse av en kjent fremgangsmåte for påvisning av antistoff. Pasienter som er identifisert som positive med hensyn til tilstedeværelse av slike antistoffer, kan identifiseres i overens stemmelse med dette. Prøver tatt fra slike pasienter kan deretter analyseres i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse for å bestemme hvorvidt det er en AIDS-beslektet virusinfeksjon til stede hos slike pasienter. ;Den foreliggende oppfinnelse omfatter også diagnos-;tiske analysesett for å utføre fremgangsmåten beskrevet ovenfor. I analysesettet kan reagensene tilveiebringes emballert i kombinasjon, i de samme eller separate behol- ;dere, slik at forholdet mellom reagenser tilveiebringer en vesentlig optimalisering av et signalsvar på variasjoner i analyttkonsentrasjoner. I en utførelsesform kan det diagnostiske analysesett omfatte (a) et monoklonalt antistoff, ;mer spesifikt definert ovenfor, eller en blanding av slike antistoffer og (b) et konjugat av en spesifikk bindingsdel-taker for det ovenfor nevnte monoklonale antistoff, og et merkestoff som er i stand til å danne et påvisbart signal. Reagensene kan også omfatte hjelpemidler som bufringsmidler ;og proteinstabiliserende midler, dvs. polysaccharider o.l.;Det diagnostiske analysesett kan videre omfatte, når det er nødvendig, andre deltakere i det signaldannende system innen hvilket system merkestoffet er en deltaker, midler for å redusere bakgrunnsforstyrrelse i en test, kontrollreagenser, apparatur for utførelse av en test o.l. ;I en annen utførelsesform kan det diagnostiske analysesett omfatte et konjugat av et monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen og et merkestoff som er i stand til å danne et påvisbart signal. Hjelpemidler som nevnt ovenfor kan også være til stede. ;Eksempler;Oppfinnelsen demonstreres videre ved de følgende illustrerende eksempler. ;Eksempel 1;Dannelse av monoklonale antistoffer mot HTLV- III- antigener;Tre måneder gamle BALB/c- og RBF/DN-hunmus ble immunisert med preparater av HTLV-III-antigen. Det antigene preparat var et delvis renset viruslysat erholdt fra dyrk ning av HTLV-III i den humane lymfom, H9-cellelinje, erholdt fra the National Cancer Institute (NCI). Individuelle mus ble immunisert med 5-20 ug antigen på polystyren latex-partikler, og immuniseringen ble forsterket i ukentlige intervaller med 10 ug oppløselig antigen gitt intravenøst (I.V.) og intraperitonealt (I.P.). Sera ble innsamlet fra musene i ukentlige intervaller og utsatt for Western flekkanalyse for påvisning av antistoff mot HTLV-III virusantigener. Western flekkanalysene viste den økende utvikling av antistoffer mot HTLV-III-antigen i løpet av den 5 uker lange immuniseringsperiode. Mus som viste reaksjon mot HTLV-III virusantigener, ble utvalgt for sammensmeltninger etter 3, 4 og 5 ukers immunisering. Splenocytter ble sammensmeltet med enten SP-2 eller HL-1 myelom-cellelinjer under anvendelse av publiserte fremgangsmåter (for HL-1, Taggart et al., ;Science, (1983) 219:1228; for SP-2, Schulman et al., Nature ;(1978) 276:269). Fremgangsmåter for sorteringsanalyser ble utvalgt for å påvise antistoff i området 1-10 ug/nil. Den innledende sorteringsanalyse var en ELISA-fremgangsmåte for å påvise immunglobulindannelse, etterfulgt av en ELISA sorteringsanalyse med hensyn til HTLV-III-antigener (tabell 1), som illustrerer at de monoklonale antistoffer er spesifikke for HTLV-III-antigenet. Positive brønner ble behand-let mer utførlig og undersøkt ved hjelp av Western flekkanalyser. Positive kulturer fra Western flekkanalysene ble klonet ogkarakterisert. Hybride kontinuerlige cellelinjer 3D8, 3F7, 3G12, 2A11, 4G2, og 1E2 ble dannet på denne måte. ;Flere av de monoklonale antistoffer, uttrykt ved hjelp av de ovenfor nevnte cellelinjer, avslørte mangfoldige bånd. Dette kan angi uttrykk for at forskjellige proteiner deler felles epitoper, påvisning av forløpermolekyler med forskjellige molekylstørrelser, eller påvisning av en felles carbohydratdeterminant på særskilte proteiner. Behandling av Western flekkstrimlene med natriumperiodat forut for reaksjon med de monoklonale antistoffer endret ikke flekk-mønsteret vesentlig. Denne observasjon reduserer sannsyn-ligheten for at carbohydratepitoper avsløres av de monoklonale antistoffer. Ingen av de anti-HTLV-III monoklonale antistoffer reagerer med normale lymfocytter eller mast-lymfocyttcellelinjer. Tre av dem (1E2, 3F7 og 3G12) reagerer imidlertid med H9-celler. Dette antyder at HTLV-III antigenpreparatet inneholdt noen H9-antigener, og monoklonale antistoffer mot H9-proteiner ble dannet. ;Eksempel 2;Påvisning av HTLV- III- antigen ved gjennomstrømningscytometri ;For å evaluere anvendelsen av noen av de monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen til påvisning av HTLV-III-antigentilkjennegivelsen på lymfocytter, ble latexkuler (2,7 y.) overtrukket med HTLV-III antigenlysater og utsatt for gjennomstrømningscytometri for å påvise antigenet. Flere av antistoffene påviste HTLV-III-antigenet som vist ved en forandring i fluorescensintensitet når et geite-anti-mus-Ig-fluorescerende andre antistoffreagens (TAGO, Burling-ame, California), ble benyttet (tabell 2). Disse forsøk viste at ved anvendelse av gjennomstrømningscytometri kunne HTLV-III-antigen påvises på store partikler, under anvendelse av de monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen. ;Eksempel 3;I ytterligere forsøk, ble HTLV-III-antigenet innfanget på latexkuler ved anvendelse av en av de ovenfor nevnte monoklonale antistoffer. Ved denne fremgangsmåte ble 1E2 eller 3D8 adsorbert til latexkulene, og kulene ble vasket. De vaskede kuler ble deretter utsatt for HTLV-III viruslysat, vasket for annen gang og deretter blandet med et påvisningsantistoff. For påvisning ble 3G12 (IgG^-isotype) benyttet. Etter vask ble et fluorescerende geite-antimus-IgG, gammakjedespesifikt, andre antistoff tillatt å reagere, og preparatet ble evaluert ved gjennomstrømningscytometri. Som vises i tabell 3, er dette innfangnings- og påvisningssystem som anvender disse to monoklonale antistoffer, en effektiv metode for å identifisere HTLV-III-antigen. De monoklonale antistoffer ble også anvendt på motsatt måte slik at 3G12 ble anvendt for å innfange antigenet, og 3D8 ble anvendt til å identifisere de innfangede determinanter. ;Eksempel 4;Påvisning av HTLV- III- antigen i blodet til AIDS- pasienter;Den dobbelte antistoffinnfangningsteknikk beskrevet i eksempel 3, ble deretter anvendt for å innfange HTLV-III-antigen fra blodprøver fra pasienter med AIDS og fra kon-trollpasienter. I en sammenlignende undersøkelse med 20 bekreftede HTLV-III-antistoffpositive prøver ble virus påvist i 12 prøver. Prøvene var positive i Western flekkanalyser, men bekreftelse ved direkte virusdyrkning ble ikke utført. ;I ytterligere eksperimenter ble HTLV-III-antigen påvist direkte i kliniske prøver ved påsetning av prøven på nitrocellulose og påvisning av antigenet ved en modifisert ELISA-teknikk. Ved en slik fremgangsmåte plasseres 1 ul av pasientserum på en strimmel av nitrocellulose ved siden av 1 ul normalt serum. Strimmelen bløtes deretter i PBS- ;gelatin i 10 minutter, etterfulgt av alkalisk fosfatasekonjugert geite-antimus-antistoffer i PBS-gelatin i en time ved romtemperatur. Etter tre gangers vask anbringes et substrat bestående av bromklorindolfosfat (BCIP)/nitroblått-tetrazolium (NBT) på strimmelen. Virusantigenpositive serumflekker danner en purpurfarget flekk innen 10 minutter. Normale serumflekker viser ingen fargeutvikling. Dataene i tabell 4 viser resultatene av disse forsøkene. Kloner 3D8 ;og 3G8 påviste HTLV-III-antigen i flertallet av prøvene fra AIDS-pasienter, og AIDS-positive kontrollsera erholdt fra the National Cancer Institute (NCI). Direkte sammenligning med virusdyrkning ble ikke utført. ;Eksempel 5;Påvisning av HTLV- III ved anvendelse av en helcelle- teknikk ;Ved anvendelse av en modifisert helcelle-ELISA-;teknikk ble tilstedeværelsen av HTLV-III-antigen påvist på lymfocytter fra pasienter som var bekreftet positive ved hjelp av Western flekkanalyser. I denne analyse ble cellene påvist mikroskopisk. Påvisning kan også gjøres spektrofotometrisk. I en spektrofotometrisk fremgangsmåte ble perifere blodlymfocytter isolert ved tetthetsgradientsentrifugering ;og suspendert i RPMI 1640 (standard vevsdyrkningsmedium) med 2 mM L-glutamin og 20 % bovint fosterserum ved en konsentra-sjon på 2 x IO<6>celler pr. ml. 50 y.1 av denne cellesuspen-sjon ble overført til en flatbunnet brønn i en 96-brønners mikrotiterplate og inkubert i 3 timer. Etter vask av de celleovertrukne brønner ble anti-HTLV-III monoklonalt antistoff 3D8 overført til brønnen og inkubert i en time. Etter vask ble et citratbufret orthofenylendiamin (OPD)/hydrogen-peroxydsubstrat tilsatt hver brønn og inkubert i 30 minut- ;ter. Positive fargereaksjoner ble avlest med spektrofoto-meter. I den mikroskopiske fremgangsmåte ble lymfocytter suspendert i fosfatbufret salin med 0,1 % gelatin og inkubert med monoklonalt antistoff 3D8 i en time ved 4°C. Cellene ble deretter vasket to ganger og blandet med alkalisk fosfatasekonjugert geite-anti-mus-IgG/IgM i en time ved 4°C. Etter vask ble cellene blandet med substratet BCIP. HTLV-III-positive celler ble farget lys til mørk blå når de ble betraktet mikroskopisk. Resultatene er presentert i tabell 5. ;Eksempel 6;Påvisning av HTLV- III- tilstedeværelse på lymfocytter ved anvendelse av gjennomstrømningscytometri ;HTLV-III angriper T4-lymfocytter og formerer seg i;disse celler. Påvisning av HTLV-III-antigentilstedeværelse på T4-celler ble utført ved hjelp av gjennomstrømningscyto-metri under anvendelse av kloner 3D8 og 3G12. I denne undersøkelse ble prøver tilveiebrakt av the Oregon AIDS Task Force i et tilfeldig utvalg. De utførte evalueringer innbefattet et monoklonalt antistoffutvalg bestående av celle-linjene T^, TH'TS'B°9NK; en Western flekkanalyse; TH/Ts-forhold; og den prosentvise andel positive celler i Tpan- ;og T4~kategoriene, til de ovenfor nevnte tre anti HTLV-III monoklonaler. Pasientgruppene innbefattet åpenbart AIDS-, ARC-, PGL-, og Western flekkpositive men symptomfrie individer. Kontroller bestod av høyrisikogrupper og lavrisiko-kjønns- og alderstilpassede individer. 82 pasienter ble evaluert. Dataene vises i tabell 6. 46 av prøvene kom fra ;pasienter med positive Western flekkanalyser med hensyn til HTLV-III antistoff. ;Monoklonale antistoffer 3D8 og 3G12 påviste tilstedeværelse av HTLV-III-antigen på både Tpan- og T-lymfocytter. Det var en generell sammenheng mellom alvorligheten av sykdommen og antall positive celler. De laveste verdier i pasientgruppene viste individer som ennå var symptomfrie. Området av svar varierte fra 5 % til 55 % positive som en prosentdel av T-cellene med 3D8 eller 3G12. Som sammenligning varierte høyrisikokontrollene mellom 0 og 5 %. Et kontrollindivid viste en verdi på 7,5 %. Interessant nok viste denne pasient et invertert TH/Ts-forhold selv om pasienten ved dette tidspunkt var, ifølge Western flekkanalyser, negativ. 3G12 medførte høyere bakgrunnsnivåer men også høyere prosentdeler av HTLV-III-antigeninneholdende celler (se tabell 6). ;Disse data antyder at HTLV-III-antigentilstedeværelse kan effektivt påvises på T-celler fra Western flekkpositive pasienter, selv i noen tilfeller hvor pasientene ennå er symptomfrie. Dette kan også være en metode for å påvise tilstedeværelse av viruset før antistoffdannelse i høy-risikogrupper. Ytterligere kontrollgrupper i disse under-søkelser omfattet pasienter med herpes 1 og 2, CMV og hepatitt. Pasienter i disse viruskontrollgrupper viste ikke tilstedeværelse av antigener påvist av de ovenfor nevnte monoklonale antistoffer. ;Eksempel 7;Påvisning av HTLV- III- antigentilstedeværelse på H9- celler ved anvendelse av gjennomstrømningscytometri ;H9-cellelinjen er vanlig anvendt for å påvise HTLV-III antigen ved dyrkning og derpå følgende evaluering med henblikk på dannelse av reverstranskriptase i cellene. For å dokumentere at monoklonalene 3D8, 1E2 og 3G12 faktisk påviste HTLV-III-antigen på T-celler fra pasienter, ble det følgende kontrollforsøk, under anvendelse av H9-celler, utført. H9-celler ble dyrket med to virusinneholdende preparater, enten med en cellefri HTLV-III-suspensjon eller med T4lymfocytter-som viste tilstedeværelse av HTLV-III-antigen. Etter dyrkning i 48 timer ble H9-cellene evaluert med monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen og kontroll-antistoffer. Som vises i tabell 7, påviste klonene 3D8, 1E2, og 3G12, HTLV-III-antigentilstedeværelse på H9-celler bare når H9-cellene var blitt infisert. Infeksjon med enten cellefri HTLV-III-virus eller HTLV-III-positive T-celler var like effektive. Det isotype-kontrollmonoklonale antistoff hadde ingen virkning. ; ; a "Mann-Whitney U"-test;b "Fisher's Exact" ;c Asym-symptomfrie pasienter, dvs. de som var serumpositive mhp. AIDS-antistoffer, men som ikke viste noen åpne symptomer som forstørrede lymfekjertler, funnet hos ARC-eller PGL-pasienter, eller smittsomme sykdommer som ;funnet hos AIDS-pasienter.;<*>Antall positive celler påvist ved gjennomstrømningscyto-metri som en prosentdel av 3D8 og 3G12 monoklonale antistoffer på T4-lymfocytter.

Hybride kontinuerlige cellelinjer 1E2, 3D8 og 3G12 ble deponert i American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, under Budapestkonvensjonen 19. mai 1986 og mottok hhv. ATCC tilvekstnumre HB9100, HB9101 og HB9102. Hybride kontinuerlige cellelinjer 3G8 og 1C11 ble deponert i ATCC under Budapestkonvensjonen 28. mai 1986 og mottok hhv. ATCC tilvekstnumre HB9114 og HB9115.

Claims (19)

1. Fremgangsmåte for påvisning av tilstedeværelse av HTLV-III-infiserte celler i et medium, karakterisert ved at nevnte medium bringes i kontakt med monoklonale antistoffer mot et antigen, dannet som et resultat av nevnte infeksjon, og at bindingen av nevnte antistoffer til nevnte antigen påvises, under forutsetning av at, når nevnte antigen er et virusgenprodukt, omfatter nevnte fremgangsmåte påvisning av binding av nevnte antistoffer til nevnte infiserte celler.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte medium er en human kroppsvæske, fortrinnsvis utvalgt fra gruppen bestående av helblod, lymfevæske, serum, plasma, sæd, spytt, og ryggmarksvæske, eller karakterisert ved at nevnte medium er et dyrkningsmedium.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte antigen er et virusgenprodukt eller bundet til et virusgenprodukt.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte antigen er dannet som et resultat av nevnte infeksjon og ikke er et virusgenprodukt.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at nevnte antigen er bundet til en lymfocytt, fortrinnsvis karakterisert ved at nevnte lymfocytt er en T-hjelpercelle, eller til en makrofag.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte antigen er utvalgt fra gruppen antigener karakterisert som molekyler på henholdsvis 24, 28, 39, 41, 55, 65, 49 og 52 kilodalton.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte antistoff er erholdt fra en hybrid kontinuerlig cellelinje utvalgt fra gruppen av hybride kontinuerlige cellelinjer med identi-fiseringskarakteristikaene 3D8, 3F7, 3G12, 2A11, 4G2, 1E2, 3G8 og 1C11.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte antistoff er konjugert til et merkestoff.

9. Immunologisk analysefremgangsmåte for påvisning av en AIDS-virusbeslektet infeksjon i en vert, karakterisert ved at en kroppsvæske fra en vert blandes med et monoklonalt antistoff som binder seg til et antigen som er tilstedeværende bare når nevnte infeksjon er til stede, og undersøkelse av blandingen med hensyn på tilstedeværelse av immunkomplekser som omfatter nevnte antigen og nevnte monoklonale antistoff, under forutsetning av at, når nevnte antigen er et virusgenprodukt, omfatter nevnte immunkompleks nevnte monoklonale antistoffer og nevnte antigen på infiserte celler.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at nevnte monoklonale antistoff binder seg til et oppløselig antigen.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at nevnte AIDS-virus-beslektede infeksjon er utvalgt fra gruppen bestående av AIDS, ARC, PLG og LAD.

12. Antistoff som er i stand til å binde seg til et antigen dannet som et resultat av en human HTLV-III-infeksjon, karakterisert ved at nevnte antigen er et oppløselig serumantigen eller et antigen bundet til en lymfocytt, under forutsetningen av at når nevnte antigen er oppløselig, er nevnte antigen ikke et virusgenprodukt.

13. Antistoff ifølge krav 12, karakterisert ved at det er monoklonalt, fortrinnsvis ved at nevnte monoklonale antistoff er erholdt fra en hybrid kontinuerlig cellelinje med identifiserings-kjennetegnene 3D8, 1E2 eller 3G12.

14. Monoklonalt antistoff ifølge krav 13 konjugert til et merkestoff, karakterisert ved at merkestoffet fortrinnsvis er utvalgt fra gruppen bestående av enzymer, radioisotoper, partikler, støttestoffer, kromogener, kjemiluminescerende stoffer, fluorescerende stoffer, koenzymer, fri radikaler og bakteriofager.

15. Monoklonalt antistoff ifølge krav 13, karakterisert ved at nevnte antigen er, eller er bundet til, et HTLV-III virusgenprodukt.

16. Diagnostisk analysesett, karakterisert ved at det omfatter, emballert i kombinasjon, monoklonalt antistoff som er i stand til å binde seg til et antigen dannet som et resultat av en infeksjon med det virale AIDS-forårsakende stoff eller et merket derivat av nevnte antistoff, idet nevnte antigen er bundet til et virusgenprodukt, eller det er bundet til en lymfocytt som et resultat av nevnte infeksjon.

17. Sammensatt materiale, karakterisert ved at det omfatter et kompleks av (a) monoklonalt antistoff som binder seg til et derivat av et HTLV-III-genprodukt og (b) nevnte genproduktderivat.

18. Sammensatt materiale, karakterisert ved at det omfatter et kompleks av (a) monoklonalt antistoff som er i stand til å binde seg til et annet celle-bundet antigen enn et HTLV-III-genprodukt og dannet som et resultat av en HTLV-III-infeksjon og (b) nevnte antigen.

19. Monoklonalt antistoff, karakterisert ved at det innehar karakter-istikaene til et monoklonalt antistoff som er erholdt fra en hybrid kontinuerlig cellelinje med identifiseringskjenne-tegnene 3D8, 3F7, 3G12, 2A11, 4G2, 1E2, 3G8 eller 1C11.