KR20160074756A - 공수병 바이러스 p 단백을 표적으로 하는 단클론 항체 또는 항원 검출 및 중화항체가 측정 시험을 위한 용도 - Google Patents
공수병 바이러스 p 단백을 표적으로 하는 단클론 항체 또는 항원 검출 및 중화항체가 측정 시험을 위한 용도Info
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Abstract
본 발명은 공수병 바이러스 인체 분리주인 KGH 주 유래의 인단백질(phosphoprotein; P)을 에피토프(epitope)로 인식하는 공수병 바이러스 P 단백 표적 단클론 항체에 관한 것으로, 상기 단클론 항체는 공수병 바이러스가 감염된 다양한 세포 및 다양한 공수병 바이러스에 대한 항원 검출이 가능하였으며, 상용화 되고 있는 항체에 비해 높은 희석비까지 항원 검출이 가능함을 확인함으로써, 공수병 바이러스 항원 검출 및 공수병 중화항체가를 측정하는 신속형광응집억제시험법에 유용하게 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 공수병 바이러스(rabies virus)의 인단백질(phosphoprotein; P)을 에피토프(epitope)로 인식하는 공수병 바이러스 P 단백 표적 단클론 항체(monoclonal antibody; mAb) 및 이를 이용한 공수병 바이러스 검출 방법에 관한 것이다.
공수병은 공수병 바이러스에 의한 질병으로 문헌상 기록으로 볼 때 가장 오래된 인수공통감염병의 하나이며 중추신경계에 치명적인 손상을 야기한다. 그 어원은 기원전 3000년 전 '광폭한 행동'을 의미하는 'rabhas'라는 단어로부터 시작되어, 한 번 발병하면 거의 사망에 이르는 치명적인 질병으로 주목받았으며, 폭력적인 성향 때문에 널리 알려져 왔다.
우리나라에서는 공수병 바이러스에 의한 질병이 동물에서 발생한 경우 광견병(狂犬病)이라 부르고, 사람에서 발생한 경우에는 물을 두려워하는 임상증상을 고려하여 공수병(恐水病)이라 명명하였다. 공수병은 전 세계적으로 매년 55,000~70,000명의 사망자가 발생하는 질병으로, 대부분 아프리카와 아시아 지역에서 발생하며, 발병 시 사망률은 100%에 이른다. 공수병은 대부분 광견병에 걸린 동물에 물린 상처를 통해 전파되는 바이러스성 질병으로, 미국 질병통제예방센터(Centers for Disease Control and prevention; CDC)에 보고된 광견병은 너구리, 스컹크, 박쥐, 여우와 같은 야생 동물에서 대부분 발생한다. 이론적으로 모든 온혈동물이 감염될 수 있고, 주로 감염동물에게 물린 후 상처부위의 신경 말단이나 신경섬유에 침입한 바이러스가 뇌로 이동하면서 발병하는데, 잠복기는 물린 부위와 상처의 경중에 따라 15일에서 1년 이상으로 다양하다. 우리나라에서 공수병은 보건 분야에서는 제 3군 법정감염병으로, 수의분야에서는 제 2종 가축전염병으로 지정되어 관리되고 있다.
공수병 발병 초기에는 감기와 같은 발열, 두통, 구토, 마른기침 등의 증상을 나타내며, 물린 부위에 가려움증이나 열을 느낀다. 병이 진행되면 약 80%의 환자에서 뇌염이나 광폭한 성향 및 공수증(근육 특히 목 근육이 민감하게 반응하여 물과 같은 액체를 삼키게 되면 경련과 심한 통증이 야기되어 물을 두려워하는 증상)이 나타나며, 감각기관이 과민하게 반응하여 신경이나 근육에 마비를 일으키고 혼수상태에 빠지거나 호흡곤란을 일으켜 사망에 이른다. 약 20%의 환자는 뇌염이나 공수증 없이 마비, 근력약화 등의 증상이 나타나는데, 이 경우 다른 신경 질환과의 구별이 어려워 진단에 어려움이 있으며, 그 동안 환자가 사망에 이를 수도 있다. 공수병은 일단 발병하면 대부분 사망에 이르는 치명적인 질병이지만, 세계보건기구(World Health Organization; WHO)에서 권고하는 교상 후 노출 정도에 따른 인면역글로불린(Rabies immuno-globulin, RIG)과 백신 접종을 통한 교상 후 치료로 발병을 막을 수 있다.
동물에 물린 직후 광견병 바이러스에 감염되었는지를 확인할 수 있는 진단법은 없다. 특징적인 임상 증상이 나타나면 감염을 의심할 수 있으며, 환자가 사망한 경우 사망 후 조직의 면역형광염색이나 조직검사를 통해 바이러스를 검출하여 확진한다. 공수병 진단에는 역전사중합효소연쇄반응(Reverse Transcription Polymerase chain reaction; RT-PCR)등과 같은 분자생물학적 방법, 간접적으로 항체를 측정하는 혈청학적 방법, 원인 바이러스를 세포에 배양하는 바이러스학적 방법, 그리고 병소를 직접 관찰하는 병리조직학적 방법 등이 이용되고 있으며, 그 중 항원검출을 위한 형광 항체 시험법(Fluorescent Antibody Test; FAT)이 표준 시험법으로 권고되고 있다. FAT는 조직검체에 공수병 바이러스 특이항체를 결합시키고 형광염색으로 이를 가시화하여 항원을 검출하는 방법으로, 공수병 진단에 가장 널리 사용되는 방법이다. 그러나 검체의 상태가 결과에 큰 영향을 미치며, 사망 후 조직에 대하여는 민감도와 특이도가 높으나, 사망 전 검사로 활용할 경우 민감도가 떨어지는 문제점이 있다.
혈청학적으로 바이러스 중화항체를 측정하는 시험법 중 신속형광응집억제시험법(A Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test; RFFIT)은 공수병에 노출되거나 백신 접종을 통하여 획득된 면역반응에 의해 생성된 환자의 혈청 내 중화항체를 검출하는 방법으로 1973년 Smith 등에 의해 개발되었다. 세포배양이 가능하도록 제작된 chamber 슬라이드에 공수병 바이러스와 환자 혈청을 중화반응 시켜주면, 혈청 내 존재하는 특이적인 항체가 바이러스와 결합하여 중화반응을 형성한다. 여기에 Neuro-2a(N2a; Mouse neuroblastoma cell) 세포 또는 BHK-21(baby hamster kidney cell) 세포를 첨가하여 공수병 바이러스가 감염되도록 반응시켜준다. 만약 중화항체가를 보유하고 있으면 바이러스가 세포에 감염되는 것을 차단한다. 바이러스에 감염된 세포의 확인은 공수병 바이러스 특이 항체 표식자로 항원-항체 복합체에 형광색소가 결합된 항체를 처리하여 형광현미경 하에서 반응결과를 눈으로 관찰한다. 국제수역사무국(Office International des Epizooties; OIE)과 WHO에서는 공수병 바이러스 중화항체가를 측정하는 방법으로 신속형광응집억제시험법을 표준시험법(gold standard method)으로 권고하고 있다.
국내에서 공수병 중화항체가를 측정하는 실험실 진단법으로 신속형광응집억제시험법을 사용하고 있다. WHO에서는 공수병 진단을 위한 표준항체로 항 공수병 바이러스 단클론 항체(monoclonal antibody; mAb)의 사용을 권고하고 있는데, Fujibio Diagnostics Inc. 또는 Millipore 등 국외업체에서 판매하고 있다. 2012년 국내에서는 의료기기법 시행규칙에 대한 법령개정 시행으로, '체외진단분석기용 시약'의 질병 진단을 목적으로 하는 시약의 경우 잠재적 위해성이 높은 4등급으로 분류되어 제조(수입) 허가증이 요구되었으며, 현재 공수병 바이러스 항체가 이에 해당하여 수입이 중단되었다.
공수병 바이러스는 단일 가닥의 RNA로 이루어진 바이러스로, 핵단백질(nucleoprotein; N), 인단백질(phosphoprotein; P), 기질 단백질(matrix protein; M), 당단백질(glycoprotein; G) 그리고 중합효소(polymerase; L) 5개의 단백질로 암호화되어있다. 바이러스를 구성하는 각 단백질의 분자량은 연구 결과마다 다소 차이는 있지만, 가장 많은 양을 차지하는 단백질은 N 단백(1325 또는 1800 copies)이며 그 뒤를 잇는 것은 P 단백(691 또는 950 copies)으로 보고되고 있다.
공수병 바이러스(rabies virus) 전체를 항원으로 사용하여 항체를 제작하는 경우, 항원은 다수의 에피토프(epitopes)를 제공하며, 따라서 하나의 에피토프에 특이적인 개개의 항체의 혼합물이 제작된다. 그러나 연구 및 진단의 목적으로 생체 밖(in vitro)에서 사용할 경우 항혈청의 효능은 감소 될 수 있다. 따라서 이 중 P 단백에 대한 에피토프에만 특이적으로 반응하는 단클론 항체를 제작하고자 하였다.
이에, 본 발명자들은 공수병 바이러스 항원 검출 및 중화항체가 측정에 응용 가능한 공수병 바이러스 인체 분리주인 KGH 주 유래의 P 단백을 표적으로 하는 단클론 항체(KGH P protein specific mAb)를 개발하였고, 이는 다양한 세포에서 다양한 공수병 바이러스 주에 대한 항원 검출이 가능하였으며, 상용화되고 있는 항체에 비해 높은 희석비까지 항원 검출이 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 공수병 바이러스(rabies virus)의 인단백질(phosphoprotein; P)을 에피토프(epitope)로 인식하는 공수병 바이러스 P 단백 표적 단클론 항체(monoclonal antibody; mAb) 및, 이를 이용한 공수병 바이러스 진단 키트 및 검출 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 공수병 바이러스(rabies virus)의 인단백질(phosphoprotein; P)을 에피토프(epitope)로 인식하는 공수병 바이러스 P 단백 표적 단클론 항체(monoclonal antibody; mAb)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론 항체를 포함하는 공수병 바이러스 진단용 키트를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 항체를 검체 시료에 접촉시켜 항원-항체 복합체 존재 여부를 확인하는 단계를 포함하는 공수병 바이러스 검출 방법을 제공한다.
본 발명은 공수병 바이러스(rabies virus) 인체 분리주인 KGH 주 유래의 인단백질(phosphoprotein; P)을 에피토프(epitope)로 인식하는 공수병 바이러스 P 단백 표적 단클론 항체에 관한 것으로, 상기 단클론 항체는 공수병 바이러스가 감염된 다양한 세포 및 다양한 공수병 바이러스에 대한 항원 검출이 가능하였으며, 상용화 되고 있는 항체에 비해 높은 희석비까지 항원 검출이 가능함을 확인함으로써, 공수병 바이러스 항원 검출 및 공수병 중화항체가를 측정하는 신속형광응집억제시험법에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은, SDS-PAGE를 이용하여 공수병바이러스 국내분리주인 KGH 주의 다량의 순도 높은 P 단백 항원을 확인한 도이다:
M : 프로테인 사이즈 마커;
1 : 세포 상등액(cell lysate sup; 10 ㎕/1 ml);
2 : 통과액(flowthrough; 10 ㎕/1 ml);
3-4 : 세척(wash; 10 ㎕/500 ㎕); 및
5-7 : 용리(elution; 10 ㎕/50 ㎕.
도 2a는, 공수병 바이러스(rabies virus)가 감염된 다양한 세포주에서 KGH P 단백 표적 단클론 항체(monoclonal antibody; mAb)의 공수병 바이러스 항원 검출을 간접면역형광항체법(Indirect immunofluorescence assay; IFA)을 통해 확인한 도이다:
ERA infected BHK-21 cell : 표준 공수병 바이러스주(ERA)에 감염된 BHK-21(baby hamster kidney cell) 세포;
ERA infected BHKT7-9 cell : 표준 공수병 바이러스주(ERA)에 감염된 BHKT7-9 세포;
ERA infected N2a cell : 표준 공수병 바이러스주(ERA)에 감염된 Neuro-2a(N2a; Mouse neuroblastoma cell) 세포;
DFA reagent(PC) : Rabies DFA reagent(양성대조군);
KGH P protein specific mAb : KGH P 단백 표적 단클론 항체; 및
Negative : 음성대조군.
도 2b는, 다양한 공수병 바이러스 주에 대하여 KGH P 단백 표적 단클론 항체의 공수병 바이러스 항원 검출을 간접형광항체시험법을 통해 확인한 도이다:
KGH infected N2a cell : 국내 인체 분리주인 KGH 주에 감염된 N2a 세포;
CVS infected N2a cell : 표준 공수병 바이러스주(CVS)에 감염된 N2a 세포;
ERA infected N2a cell : 표준 공수병 바이러스주(ERA)에 감염된 N2a 세포;
DFA reagent(PC) : Rabies DFA reagent(양성대조군);
KGH P protein specific mAb : KGH P 단백 표적 단클론 항체; 및
Negative : 음성대조군.
도 3a는, 간접형광항체시험법을 이용한 KGH P 단백 표적 단클론 항체의 공수병 바이러스 항원 검출 한계 검증 결과를 나타낸 도이다.
도 3b는, 직접형광항체시험법(Direct immunofluorescence assay; DFA)을 이용한 Alexa-conjugated KGH P 단백 표적 단클론 항체의 공수병 바이러스 항원 검출 한계 검증 결과를 나타낸 도이다.
도 4는, Alexa-conjugated KGH P 단백 표적 단클론 항체 및 DFA reagent의 신속형광응집억제시험범(Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test, RFFIT) 결과를 비교한 도이다.
M : 프로테인 사이즈 마커;
1 : 세포 상등액(cell lysate sup; 10 ㎕/1 ml);
2 : 통과액(flowthrough; 10 ㎕/1 ml);
3-4 : 세척(wash; 10 ㎕/500 ㎕); 및
5-7 : 용리(elution; 10 ㎕/50 ㎕.
도 2a는, 공수병 바이러스(rabies virus)가 감염된 다양한 세포주에서 KGH P 단백 표적 단클론 항체(monoclonal antibody; mAb)의 공수병 바이러스 항원 검출을 간접면역형광항체법(Indirect immunofluorescence assay; IFA)을 통해 확인한 도이다:
ERA infected BHK-21 cell : 표준 공수병 바이러스주(ERA)에 감염된 BHK-21(baby hamster kidney cell) 세포;
ERA infected BHKT7-9 cell : 표준 공수병 바이러스주(ERA)에 감염된 BHKT7-9 세포;
ERA infected N2a cell : 표준 공수병 바이러스주(ERA)에 감염된 Neuro-2a(N2a; Mouse neuroblastoma cell) 세포;
DFA reagent(PC) : Rabies DFA reagent(양성대조군);
KGH P protein specific mAb : KGH P 단백 표적 단클론 항체; 및
Negative : 음성대조군.
도 2b는, 다양한 공수병 바이러스 주에 대하여 KGH P 단백 표적 단클론 항체의 공수병 바이러스 항원 검출을 간접형광항체시험법을 통해 확인한 도이다:
KGH infected N2a cell : 국내 인체 분리주인 KGH 주에 감염된 N2a 세포;
CVS infected N2a cell : 표준 공수병 바이러스주(CVS)에 감염된 N2a 세포;
ERA infected N2a cell : 표준 공수병 바이러스주(ERA)에 감염된 N2a 세포;
DFA reagent(PC) : Rabies DFA reagent(양성대조군);
KGH P protein specific mAb : KGH P 단백 표적 단클론 항체; 및
Negative : 음성대조군.
도 3a는, 간접형광항체시험법을 이용한 KGH P 단백 표적 단클론 항체의 공수병 바이러스 항원 검출 한계 검증 결과를 나타낸 도이다.
도 3b는, 직접형광항체시험법(Direct immunofluorescence assay; DFA)을 이용한 Alexa-conjugated KGH P 단백 표적 단클론 항체의 공수병 바이러스 항원 검출 한계 검증 결과를 나타낸 도이다.
도 4는, Alexa-conjugated KGH P 단백 표적 단클론 항체 및 DFA reagent의 신속형광응집억제시험범(Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test, RFFIT) 결과를 비교한 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 공수병 바이러스(rabies virus)의 인단백질(phosphoprotein; P)을 에피토프(epitope)로 인식하는 공수병 바이러스 P 단백 표적 단클론 항체(monoclonal antibody; mAb)를 제공한다.
상기 공수병 바이러스는 국내 분리주인 KGH 주인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 상기 공수병 바이러스 P 단백은 서열번호 1로 기재되는 뉴클레오티드(nucleotide) 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 "단클론 항체" 는 당해 분야에 공지된 용어이며, 단일 항원성 부위에 대해서 지시되는 고도로 특이적인 항체이다. 전형적으로 상이한 에피토프에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론 항체와는 다르게, 단클론 항체는 항원 상의 단일 에피토프에 대해서 지시된다. 본 발명의 단클론 항체는 통상적인 클로닝 및 세포 융합 기술들을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 관심 대상의 면역원(항원)을 야생형이나 육종된 마우스(예를 들면, BALB/c)에 투여하여 천연 또는 사람 단클론 항체를 생산할 수 있다. 이러한 항원은 단독으로 투여되거나, 애주번트와 혼합하여 투여되거나, 벡터로부터 발현될 수 있으며 DNA 또는 융합 단백질로서 면역 반응을 유도할 수 있다. 융합 단백질은 면역 반응에 의도된 펩타이드와 커플링된 담체 단백질, 예를 들면, β-갈락토시다제, 글루타티온 S-트랜스퍼라제, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 및 소 혈청 알부민을 포함하며, 담체 단백질은 이에 제한되지는 않는다. 상기의 경우에 펩타이드는 담체 단백질에 대해서 합텐(hapten)으로 작용한다. 단클론 항체 제조 방법을 간략히 설명하면 다음과 같다. 동물을 부스팅시킨 후, 비장을 제거하고 비장 세포를 추출하여 당해 분야에 공지된 방법[Kohler and Milstein, Nature 256: 495-497 (1975); and Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)]]으로 골수종 세포와 융합시킨다. 수득되는 하이브리드 세포를 통상적인 방법, 예를 들면, 제한 희석으로 클로닝하고, 목적하는 단클론 항체를 생산하는 수득된 클론을 배양하는 것이다. 단클론 항체는 항원-항체 결합을 사용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한, 하이브리도마(hybridoma) 배양에 의해 합성되기 때문에, 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 또 다른 장점을 갖는다.
본 발명에서 "하이브리도마" 는 당해 분야에 공지되어 있으며, 항체 생산 세포와 불멸 세포, 예를 들면 골수종 세포와의 융합에 의해서 형성된 세포를 의미한다. 상기 하이브리드 세포는 항체를 지속적으로 공급할 수 있다. 상기의 하이브리도마 세포가 생산하는 단클론 항체는 정제하지 않은 상태로 사용될 수 있으며, 또한 다양한 통상의 방법, 예를 들면 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등을 이용하여 고-순도로 정제하여 사용될 수 있다.
단클론 항체를 대량생산하기 위한 방법의 일례로서, 선별된 하이브리도마를 생쥐의 복강에 주사하여 복수액(ascites fluid)에서 배양한 후, 이에 제한되는 것은 아니나 단백질 G-세파로스(sepharose) 컬럼 크로마토그래피 등으로 분리하는 것을 포함한다. 또한, 원하는 하이브리도마 클론이 분리되면, 이 클론을 배양하여 배양액에 존재하는 단클론 항체를 분리하여 사용할 수도 있으며, 생쥐의 복강에 하이브리도마 클론을 주사하여 얻은 복수액으로부터 단클론 항체를 얻을 수도 있다. 상기와 같이 제조된 단클론 항체는 면역진단, 면역치료, 그리고 항원 및 항체의 분자세포생물학적인 연구, 더 나아가 촉매항체와 같은 유용한 항체를 얻는 데에도 널리 이용된다.
바람직하게 본 발명의 대량생산방법은 추가적으로 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법을 사용하여 고-순도(예컨대 95% 이상)로 정제하는 과정을 포함할 수 있다. 예를 들어 겔 전기영동, 투석, 염 침전 또는 크로마토그래피 등의 정제방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액으로부터 상기 단클론 항체를 분리할 수 있다.
본 발명에 따른 공수병 바이러스 표적 항원 단백질을 선택적, 특이적으로 인식하는 단클론을 선별하기 위하여 통상 사용되는 다양한 방법, 예를 들면, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(enzyme immunoassay, EIA)라고도 알려져 있는 효소면역흡착법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 면역형광법(Immunofluorescence assay, IFA), 웨스턴 블롯팅(Western blotting) 및 유세포 분석법 등을 사용할 수 있는데 꼭 이들로만 국한되는 것은 아니다. 본 발명의 예시된 방법은 웨스턴 블롯팅 또는 면역흡광법이다.
본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명자들은 공수병 바이러스 국내 인체 분리주인 KGH 주(질병관리본부)로부터 P 단백 유전자를 분리하기 위해 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 통해 RNA에서 cDNA를 합성하고, 합성된 cDNA를 이용하여 KGH P 단백 전체 유전자(서열번호 1)를 추출하였다. 상기 P 단백 유전자 cDNA를 프라이머(서열번호 3, 서열번호 4)를 이용하여 PCR로 증폭시켰으며, 상기 증폭시킨 유전자를 E. coli에 발현시키기 위해 vector(pBAD202 vector, Invitrogen, USA)를 이용하여 클로닝 하였다. 상기 P 단백 유전자가 클로닝된 벡터를 E. coli에 도입하여 KGH P 단백을 발현시켰으며 히스티딘(histidine)이 표식된 상기 단백질을 니켈 이온 컬럼을 이용하여 정제하여 순도 높은 다량의 항원으로 만들었다. 이를 도데실 황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE)을 통해 확인하였으며, 53 kDa의 크기에서 순도 높은 항원을 확인하였다(도 1 참조).
또한, 본 발명자들은 KGH P 단백 표적 단클론 항체를 제조하기 위해, 정상적인 항체를 생산하는 활성화 된 B세포를 골수종세포(종양성 형질세포)와 융합시킴으로써 얻은 하이브리도마를 이용한 방법으로 실시하였으며 구체적으로, 상기 제조한 KGH P 단백으로 면역반응시킨 마우스의 비장세포를 분리한 후, 이것과 마우스의 골수종세포를 융합하여 배양하였다. 이중 가장 적합한 항체를 생산하는 클론을 선택하여 배양한 후 배양 세포를 마우스 복강에 주입하고, 10일 후에 마우스에서 복수를 채취하였다.
본 발명의 공수병 바이러스(rabies virus) 인체 분리주인 KGH 주 유래의 인단백질(phosphoprotein; P)을 에피토프(epitope)로 인식하는 공수병 바이러스 P 단백 표적 단클론 항체는 공수병 바이러스가 감염된 다양한 세포 및 다양한 공수병 바이러스에 대한 항원 검출이 가능하였으며, 상용화되고 있는 항체에 비해 높은 희석비까지 항원 검출이 가능함을 확인함으로써, 공수병 바이러스 항원 검출 및 공수병 중화항체가를 측정하는 신속형광응집억제시험법에 유용하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 단클론 항체를 포함하는 공수병 바이러스 진단용 키트를 제공한다.
상기 항체는 형광물질이 접합된 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 형광물질은 면역 분석에 사용되는 모든 형광물질일 수 있으며, 예컨대, 쿠마린(coumarin) 계열 형광물질(예컨대, 7-hydroxycoumarin, 4-methyl-7-hydroxycoumarin등); 잔텐(xanthene) 계열 형광물질(예컨대, ROX, TET, Texas Red, 플루오레세인(fluorescein), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine) 등); 시아닌(cyanine) 계열 형광물질 (예컨대, Cy3, Cy5 등); 보디피(Bodipy) 계열 형광물질(예컨대 Bodipy FL, Bodipy 530, Bodipy R6G, Bodipy TMR 등); 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 계열 형광물질(예컨대, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 532등); 다이라이트 플루오르(DyLight Fluor) 계열 형광 물질(예컨대, DyLight 405, DyLight 488, DyLight 549, DyLight 594, DyLight 633, DyLight 649, DyLight 680, DyLight 750, DyLight 800등), 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 사용하기 위한 키트 시스템은 이에 한정되는 것은 아니나, ELISA 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피법 및 방사 분할 면역검정 디바이스, 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등을 포함한다. 바람직하게는, 면역크로마토그래피법을 이용한 스트립 형태 또는 디바이스 형태의 진단 키트를 이용할 수 있다. 면역크로마토그래피법을 이용한 진단은, 검체의 혈청 중에 들어 있는 항원이 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)에 결합된 표식자 항체(tracer antibody)와 반응한 다음, 모세관 현상에 의해 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 멤브레인의 미세구멍(micropore)을 통하여 이동하는 도중에 미세구멍의 내부 표면에 고정되어 있는 포획 항체(capture antibody)와 결합하여 발색띠를 형성함으로써, 양성 및 음성을 육안으로 판별 가능하도록 할 수 있다.
상기 키트는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 효소연관 면역분석법(ELISA) 또는 측방 유동 면역 크로마토그래피 분석법(lateral flow immunographic assay)을 이용할 수 있다. 앞서 기술한 바와 같이 샌드위치 면역분석법 및 측방 유동 면역 크로마토그래피 분석법(lateral flow immunographic assay)을 사용하는 경우 본 발명의 단클론 항체를 이용하여 항체 쌍을 제조하고 이를 이용하여 병원체를 탐지할 수 있다.
상기 본 발명의 키트에는 통상적으로 키트에 사용되는 것이라면 이에 한정되지 않지만, 예를 들어 ELSIA를 이용한 것이라면 고체상 지지체; 본 발명의 단클론 항체 및 단백질 A에 특이적인 항체; 및 항원과의 반응을 위한 효소표지항체액 및 효소반응을 나타내는 발색액을 함유하는 효소-연관 면역분석용(ELSIA) 반응액을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로 효소표지항체액은 goat anti-mouse Ig-HRP로 적정농도에서 플레이트 웰당 50 내지 150㎕가 포함될 수 있으며, 발색액은 테트라 메틸벤지딘(Tetramethylbenzidine, TMB)로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으며, 반응차단용액은 1N HCl 또는 1N H2SO4으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명자들은 KGH P 단백 표적 단클론 항체가 공수병 바이러스를 검출할 수 있는지를 확인하기 위하여, 표준 공수병 바이러스주(ERA strain)에 감염된 BHK-21 cell, BHK T7-9 cell 및 N2a cell을 이용하여 공수병 바이러스 항원슬라이드를 제작하고, 이 슬라이드를 이용하여 간접면역형광항체법(Indirect immunofluorescence assay; IFA)으로 공수병 바이러스의 검출가능성을 평가하였다. 기존에 공수병 바이러스 항원 검출용으로 상용화되고 있는 진단용 항체 Rabies DFA reagent(Millipore, USA, 이하 DFA reagent)를 Evans blue에 1:80으로 희석하여 양성대조군으로 사용하였다. 또한 다양한 공수병 바이러스 주에서 항원 검출이 가능한지를 확인하기 위하여 표준 공수병 바이러스주인 CVS와 ERA, 국내분리주인 KGH에 감염된 N2a cell을 이용하여 공수병 바이러스 항원슬라이드를 제작하고, 이 슬라이드를 이용하여 간접면역형광항체법으로 확인하였다. 그 결과, 공수병 바이러스가 감염된 다양한 세포주에서 공수병 바이러스 항원을 검출할 수 있음을 확인하였고(도 2a 참조), 또한, 다양한 공수병 바이러스 주에 대하여 항원검출이 가능함을 확인하였다(도 2b 참조).
또한, 본 발명자들은 상기 제작한 KGH P 단백 표적 단클론 항체의 공수병 바이러스 검출능력을 확인하기 위하여 상기 에서 제작한 공수병 바이러스 항원슬라이드를 이용하여 간접면역형광항체법으로 검출한계를 측정하였다. 그 결과, KGH P 단백 표적 단클론 항체의 경우 희석비 1:100,000까지 공수병 바이러스 항원이 검출되었으며, 상용화되고 있는 진단용 항체보다 더 높은 희석비까지 검출한계를 나타냄을 확인하였다(도 3a 참조).
또한, 본 발명자들은 KGH P 단백 표적 단클론 항체에 형광입자를 결합시켜 직접면역형광항체법(Direct immunofluorescence assay; DFA) 사용 가능한 Alexa-conjugated KGH P 단백 표적 단클론 항체를 제작하였으며, 상기 제작한 Alexa-conjugated KGH P 단백 표적 단클론 항체의 공수병 바이러스 검출능력을 확인하기 위하여 공수병 바이러스 항원슬라이드를 이용하여 직접면역형광항체법으로 검출한계를 측정하였다. 그 결과, Alexa-conjugated KGH P 단백 표적 단클론 항체의 경우, 1:2,500 희석비까지 검출되어 상용화되고 있는 진단용 항체보다 높은 희석비까지 검출한계를 나타냄을 확인하였다(도 3b 참조).
또한, 본 발명자들은 Alexa-conjugated KGH P 단백 표적 단클론 항체의 공수병 바이러스 중화항체가 측정을 위한 신속형광응집억제시험법에 활용가능성을 확인하기 위하여, 2007년 공수병 중화항체가 측정시험 진단을 의뢰한 검체 25건을 이용하여 비교 검증하였다. 기존에 공수병 바이러스 항원 검출용으로 상용화되고 있는 DFA reagent를 이용하여 실험한 신속형광응집억제시험법(Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test, RFFIT) 결과와 Alexa-conjugated KGH P 단백 표적 단클론 항체를 이용하여 실험한 RFFIT 결과에 큰 차이가 없음을 상관 비교 분석하였다. 표준 공수병 바이러스로 CVS 주를 이용하였으며, 공수병 바이러스가 감염되도록 하는 세포로 N2a 세포를 사용하였다. 그 결과, 상관계수 r=0.988(p<0.0001)으로 나타나, 통계적으로 유의한 양의 상관성을 보여 결과에 차이가 없음을 확인하였다(도 4 참조).
따라서, 본 발명의 공수병 바이러스(rabies virus) 인체 분리주인 KGH 주 유래의 인단백질(phosphoprotein; P)을 에피토프(epitope)로 인식하는 공수병 바이러스 P 단백 표적 단클론 항체는 공수병 바이러스가 감염된 다양한 세포 및 다양한 공수병 바이러스에 대한 항원 검출이 가능하였으며, 상용화되고 있는 항체에 비해 높은 희석비까지 항원 검출이 가능함을 확인함으로써, 공수병 바이러스 항원 검출 및 공수병 중화항체가를 측정하는 신속형광응집억제시험법에 유용하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 단클론 항체를 검체 시료에 접촉시켜 항원-항체 복합체 존재 여부를 확인하는 단계를 포함하는 공수병 바이러스 검출 방법을 제공한다.
상기 항체는 형광물질이 접합된 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 형광물질은 면역 분석에 사용되는 모든 형광물질일 수 있으며, 예컨대, 쿠마린(coumarin) 계열 형광물질(예컨대, 7-hydroxycoumarin, 4-methyl-7-hydroxycoumarin등); 잔텐(xanthene) 계열 형광물질(예컨대, ROX, TET, Texas Red, 플루오레세인(fluorescein), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine) 등); 시아닌(cyanine) 계열 형광물질 (예컨대, Cy3, Cy5 등); 보디피(Bodipy) 계열 형광물질(예컨대 Bodipy FL, Bodipy 530, Bodipy R6G, Bodipy TMR 등); 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 계열 형광물질(예컨대, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 532등); 다이라이트 플루오르(DyLight Fluor) 계열 형광 물질(예컨대, DyLight 405, DyLight 488, DyLight 549, DyLight 594, DyLight 633, DyLight 649, DyLight 680, DyLight 750, DyLight 800등), 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 시료는 세포, 조직, 전혈, 혈정, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨 중에서 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 단클론 항체를 사용하여 생물학적 시료와 반응시켜 공수병 바이러스 항원 또는 이들 항원을 함유한 백신에서의 항원의 발현 정도를 측정할 수 있다. 이러한 의미에서 본 명세서에 사용되는 용어 "생물학적 시료"란 인간을 포함한 동물, 예를 들어 포유동물의 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 요(尿)는 물론이고 공수병 바이러스의 특정 항원을 함유하는 백신 등을 포함한다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명에 따른 단클론 항체와 반응시켜 공수병 바이러스의 표적 단백질인 인단백질(phosphoprotein; P)의 발현 정도를 측정할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항원-항체 복합체"란, 생물학적 시료 중의 공수병 바이러스의 표적 단백질인 인단백질의 발현 여부를 확인하기 위하여 반응시킨 공수병 바이러스 인단백질과 본 발명에 따른 단클론 항체 또는 이와 동일한 에피토프를 인식하는 단클론 항체의 결합물을 의미한다. 이러한 항원-항체 복합체의 형성은 예를 들어, 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method) 등의 방법을 통해 검출할 수 있지만, 본 발명이 이러한 방법으로만 한정되는 것은 아니고 다양한 응용이 가능하다.
이때, "검출"이란, 항원-항체 복합체를 탐지하기 위한 것으로 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소 등의 표지를 사용할 수 있지만, 다른 표지 역시 사용될 수 있다. 구체적으로, 검출 표지로 사용가능한 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-락타마제 등을 포함하며, 형광물로는 플루오레세인, Eu3 +, Eu3 + 킬레이트 또는 크립테이트(cyptate) 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는 57Co, 3H, 125I, 125I-볼튼(Bolton) 헌터(Hunter) 시약 등을 포함한다.
상기 항원-항체 복합체 존재 여부를 확인하는 방법은 면역분석법, 효소연관 면역분석법(ELISA), 샌드위치 면역분석법 및 측방 유동 면역 크로마토그래피 분석법(lateral flow immunographic assay)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
바람직하게는, 항원-항체 복합체를 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 검출할 수 있다. 효소면역흡착법(ELISA)에는 ⅰ) 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적(direct) ELISA, ⅱ) 고체 지지체에 부착된 항원과 이 항원을 인지하는 1차 항체가 결합된 항원-1차 항체의 복합체에서 이 1차 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적(indirect) ELISA, ⅲ) 고체 지지체에 부착된 항체(즉, 포획 항체(capture antibody)와 이 항체가 인지하는 특정 영역을 가지는 항원이 결합한 항원-항체 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체(즉, 검출 항체(detection antibody)를 이용하는 직접적 샌드위치(sandwich)ELISA, ⅳ) 고체 지지체에 부착된 포획 항체와 이 항체가 인지하는 특정 영역을 가지는 항원이 결합된 포획항체-항원의 복합체에 이 항원의 다른 부위를 인지하는 또 다른 항체(1차 검출 항체)와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체(2차 검출 항체)를 이용하는 간접적 또는 중첩적(double) 샌드위치 ELISA, 또는 ⅴ) 항원을 포함하는 샘플과 항체를 인큐베이션 한 뒤, 이 항원으로 코팅된 well로 항원-항체 복합체를 첨가하고 well의 항원과 결합되지 않은 항체를 제거한 뒤에, 이 항체 또는 항원에 특이적인 2차 항체로서 효소와 conjugate된 2차 항체(또는 항체 특이적인 항원으로서 효소 등에 의해 표지된 항원)를 반응시키는 경쟁적 ELISA(competitive ELISA, 이 경우에는 샘플 내에 항원이 많을수록 well에 코팅된 항원과 결합하는 1차 항체의 수가 감소하게 된다) 등을 적용해 볼 수 있다.
일례로, 본 발명에 따른 단클론 항체는 검출 표지를 가질 수 있으며, 검출표지를 가지지 않을 경우는 이들 단클론 항체를 포획할 수 있고 검출 표지를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다. 특히 바람직하게는, 항원-항체 복합체를 샌드위치 ELISA를 이용하여 검출할 수 있다. 직접적 또는 중첩적 샌드위치 ELISA를 사용하는 경우에 포획항체와 검출항체는 항원의 다른 부분을 에피토프로 인식하는 것이 바람직하다.
ELISA 검출 방법에 따라, 생물학적 시료는 고체 지지체, 예를 들어 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트, 멤브레인, 테스트 스트립 등에 코팅된 본 발명의 단클론 항체(포획항체)와 접촉된다. 구체적 일례로서, 마이크로타이터 플레이트의 웰을 본 발명의 단클론 항체(포획항체)로 코팅하고, 단클론 항체에 의해 코팅되지 않은 결합 부위를 차단하기 위해서 비-반응성 단백질인 BSA(bovine serum albumin) 또는 casein과 같은 단백질을 첨가한 후, 코팅된 플레이트의 웰(well)을 시료 샘플과 인큐베이션하고, 이어서 항원-항체 복합체의 존재를 결정할 수 있다. 항원-항체 복합체의 존재는 항원-항체 복합체의 항원에 대해 특이적인 항체(검출항체), 예를 들어 공수병 바이러스의 인단백질에 특이적으로 결합하는 검출 항체 또는 임의의 다클론 항체를 사용하여 확인할 수 있다. 상기 단클론항체 또는 다클론 항체는 검출표지를 가질 수 있으며, 검출 표지를 갖지 않는 경우 이들 단클론 항체 또는 다클론 항체를 검출할 수 있는 또 다른 항체로 처리하여 확인할 수 있다.
바람직하게는 항원 또는 백신의 특이성을 고려해 볼 때, 본 발명에 따른 단클론 항체 중 선택되는 어느 하나의 항체를 포획항체로 사용하여 웰의 플레이트에 먼저 부착한 뒤에 표적 항원을 포함하는 생물학적 시료, 예를 들어 공수병 바이러스 백신을 여기에 첨가한 뒤, 본 발명에 따른 단클론 항체 중 선택되는 다른 항체를 1차 검출 항체로 사용하고 이 검출 항체를 인식하는 표지된 2차 검출 항체를 사용하는 중첩적 샌드위치(double sandwich) ELISA이다.
이에, 본 발명의 공수병 바이러스(rabies virus) 인체 분리주인 KGH 주 유래의 인단백질(phosphoprotein; P)을 에피토프(epitope)로 인식하는 공수병 바이러스 P 단백 표적 단클론 항체는 공수병 바이러스가 감염된 다양한 세포 및 다양한 공수병 바이러스에 대한 항원 검출이 가능하였으며, 상용화되고 있는 항체에 비해 높은 희석비까지 항원 검출이 가능함을 확인함으로써, 공수병 바이러스 항원 검출 및 공수병 중화항체가를 측정하는 신속형광응집억제시험법에 유용하게 이용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
단클론
항체 제작을 위한 표적 항원의 제조
본 발명자들은 공수병 바이러스 국내 인체 분리주인 KGH 주(질병관리본부)로부터 P 단백 유전자를 분리하기 위해 하기와 같은 실험을 실시하였다.
구체적으로, KGH 주로부터 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 통해 RNA에서 프라이머(서열번호 2)를 사용하여 cDNA를 합성하고, 합성된 cDNA를 이용하여 KGH P 단백 전체 유전자(서열번호 1)를 추출하였다. 상기 P 단백 유전자 cDNA를 프라이머(서열번호 3, 서열번호 4)를 이용하여 PCR로 증폭시켰으며, 상기 증폭시킨 유전자를 E. coli에 발현시키기 위해 vector(pBAD202 vector, Invitrogen, USA)를 이용하여 클로닝 하였다. 상기 P 단백 유전자가 클로닝된 벡터를 E. coli에 도입하여 KGH P 단백을 발현시켰으며 히스티딘(histidine)이 표식된 상기 단백질을 니켈 이온 컬럼을 이용하여 정제하여 순도 높은 다량의 항원으로 만들었다. 이를 도데실 황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE)을 통해 확인하였다. SDS-PAGE를 이용하여 단백질의 전하량에 관계없이 단백질 분자량에 비례하여 분리되었으며 분리된 단백질은 coomassie brilliant blue로 염색하여 확인하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 53 kDa의 크기에서 순도 높은 항원을 확인하였다.
<
실시예
2>
KGH
P 단백 표적
단클론
항체(
KGH
P
protein
specific
mAb
)의 제작
단클론 항체를 제조하는 방법은 1975년 Georges Khler와 Cesar Milstein에 의해 고안된 방법으로, 정상적인 항체를 생산하는 활성화 된 B세포를 골수종세포(종양성 형질세포)와 융합시킴으로써 얻은 하이브리도마(hybridoma)를 이용한 방법으로 실시하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 상기 <실시예 1>에서 제조한 KGH P 단백으로 면역반응시킨 마우스의 비장세포를 분리한 후, 이것과 마우스의 골수종세포를 융합하여 배양하였다. 이중 가장 적합한 항체를 생산하는 클론을 선택하여 배양한 후 배양 세포를 마우스 복강에 주입하고, 10일 후에 마우스에서 복수를 채취하였다.
그 결과, 상기에서 얻은 복수액에 다량의 단클론 항체가 포함되어 있는 것을 확인하였으며 제작한 KGH P 단백 표적 단클론 항체는 사용 시까지 -20℃에서 보관하였다.
<
실시예
3>
KGH
P 단백 표적
단클론
항체를 이용한 공수병 바이러스 검출 확인
본 발명자들은 KGH P 단백 표적 단클론 항체가 공수병 바이러스를 검출할 수 있는지를 확인하기 위하여, 표준 공수병 바이러스주(ERA strain)에 감염된 BHK-21 cell, BHK T7-9 cell 및 N2a cell을 이용하여 공수병 바이러스 항원슬라이드를 제작하고, 이 슬라이드를 이용하여 간접면역형광항체법(Indirect immunofluorescence assay; IFA)으로 공수병 바이러스의 검출가능성을 평가하였다. 기존에 공수병 바이러스 항원 검출용으로 상용화되고 있는 진단용 항체 Rabies DFA reagent(Millipore, USA, 이하 DFA reagent)를 Evans blue에 1:80으로 희석하여 양성대조군으로 사용하였다. 또한 다양한 공수병 바이러스 주에서 항원 검출이 가능한지를 확인하기 위하여 표준 공수병 바이러스주인 CVS와 ERA, 국내분리주인 KGH에 감염된 N2a cell을 이용하여 공수병 바이러스 항원슬라이드를 제작하고, 이 슬라이드를 이용하여 간접면역형광항체법으로 확인하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 2>에서 제작한 KGH P 단백 표적 단클론 항체를 1% bovine serum albumin(BSA) 이 포함된 PBS에 1:100으로 희석한 후 상기 공수병 바이러스 항원슬라이드의 각 well에 분주하여 습윤상자에 넣고 37℃ 배양기에서 30분간 반응시켰다. PBS를 이용하여 10분간 슬라이드를 세척한 후 잘 말리고, 2차 항체로써 항 마우스 면역글로불린 G(anti-mouse IgG Fluorescein isothiocyanate(FITC))를 0.00025% Evans blue가 포함된 PBS에 1:300으로 희석하여 슬라이드의 각 well에 분주하였다. 습윤상자에 넣고 37℃ 배양기에서 30분간 반응시킨 후 PBS를 이용하여 10분간 슬라이드를 세척하였다. 글리세롤이 포함된 수용성 봉입제를 첨가 후 커버글라스를 올려 형광현미경 하에서 400 배율로 2시간 이내에 두 명의 실험자가 각 2회씩 판독하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 공수병 바이러스가 감염된 다양한 세포주에서 공수병 바이러스 항원을 검출할 수 있음을 확인하였다(도 2a). 또한, 다양한 공수병 바이러스 주에 대하여 항원검출이 가능함을 확인하였다(도 2b).
<
실시예
4>
Alexa
-
conjugated
KGH
P 단백 표적
단클론
항체의 제작 및 항원 검출 한계의 확인
<4-1>
KGH
P 단백 표적
단클론
항체의 항원 검출 한계 확인
상기 <실시예 2>에서 제작한 KGH P 단백 표적 단클론 항체의 공수병 바이러스 검출능력을 확인하기 위하여 상기 <실시예 3>에서 제작한 공수병 바이러스 항원슬라이드를 이용하여 간접면역형광항체법으로 검출한계를 측정하였다.
구체적으로, 상용화되고 있는 N 단클론 항체(Median 사)를 비교 대조군으로 사용하였으며, KGH P 단백 표적 단클론 항체를 1% BSA(bovine serum albumin)이 포함된 PBS에 1:100부터 1:1,000,000까지 10 배씩 단계적으로 희석하였고, 간접면역형광항체법은 상기 <실시예 3>과 같이 실시하였다.
그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이 KGH P 단백 표적 단클론 항체의 경우 희석비 1:100,000까지 공수병 바이러스 항원이 검출되었으며, 상용화되고 있는 진단용 항체보다 더 높은 희석비까지 검출한계를 나타냄을 확인하였다(도 3a).
<4-2>
Alexa
-
conjugated
KGH
P 단백 표적
단클론
항체의 제작
실험의 편의성을 위하여 KGH P 단백 표적 단클론 항체에 형광입자를 결합시켜 직접면역형광항체법(Direct immunofluorescence assay; DFA) 사용 가능한 Alexa-conjugated KGH P 단백 표적 단클론 항체를 제작하였다.
구체적으로, KGH P 단백 표적 단클론 항체에 결합하는 형광입자로는 Alexa fluor를 이용하였으며, 이는 Alexa fluor protein labeling kit(Molecular probes Inc., USA)을 사용하였다. Alexa fluor는 보통 형광입자로 널리 사용되는 FITC 보다 높은 형광강도를 나타내며, 안정성이 입증된 형광입자이다. Alexa fluor labeling 실험은 제조사에서 제시하는 방법에 따라 수행하였다.
<4-3>
KGH
P 단백 표적
단클론
항체 및
Alexa
-
conjugated
KGH
P 단백 표적
단클론
항체의 항원 검출 한계 확인
상기 실시예 <4-2>에서 제작한 Alexa-conjugated KGH P 단백 표적 단클론 항체의 공수병 바이러스 검출능력을 확인하기 위하여 상기 <실시예 3>에서 제작한 공수병 바이러스 항원슬라이드를 이용하여 직접면역형광항체법으로 검출한계를 측정하였다.
구체적으로, 상용화되고 있는 N 단클론 항체(Millipore 사 DFA reagent)를 비교 대조군으로 사용하였으며, Alexa-conjugated KGH P 단백 표적 단클론 항체를 0.00025% Evans blue가 포함된 PBS에 1:100부터 1:12,500까지 5 배씩 단계 희석한 후 슬라이드의 각 well에 분주하였다. 습윤상자에 넣고 37℃ 배양기에서 30분간 반응시킨 후 PBS를 이용하여 10분간 슬라이드를 세척하였다. 글리세롤이 포함된 수용성 봉입제를 첨가 후 커버글라스를 올려 형광현미경 하에서 400 배율로 2시간 이내에 두 명의 실험자가 각 2회씩 판독하였다.
그 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이 Alexa-conjugated KGH P 단백 표적 단클론 항체의 경우, 1:2,500 희석비까지 검출되어 상용화되고 있는 진단용 항체보다 높은 희석비까지 검출한계를 나타냄을 확인하였다(도 3b).
<
실시예
5> 공수병 바이러스 중화 항체가 측정을 위한 신속형광응집억제시험법에 활용가능성 확인
Alexa-conjugated KGH P 단백 표적 단클론 항체의 공수병 바이러스 중화항체가 측정을 위한 신속형광응집억제시험법에 활용가능성을 확인하기 위하여, 2007년 공수병 중화항체가 측정시험 진단을 의뢰한 검체 25건을 이용하여 비교 검증하였다. 기존에 공수병 바이러스 항원 검출용으로 상용화되고 있는 DFA reagent를 이용하여 실험한 신속형광응집억제시험법(Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test, RFFIT) 결과와 Alexa-conjugated KGH P 단백 표적 단클론 항체를 이용하여 실험한 RFFIT 결과에 큰 차이가 없음을 상관 비교 분석하였다. 표준 공수병 바이러스로 CVS 주를 이용하였으며, 공수병 바이러스가 감염되도록 하는 세포로 N2a 세포를 사용하였다.
구체적으로, 검체를 56℃에서 30분간 방치시켜 보체를 비활성화시킨 후, advanced DMEM배지를 이용하여 1:2.5에서 1: 312.5까지 5배씩 단계 희석하고, 세포배양이 가능하도록 제작된 chamber 슬라이드에 100 ㎕씩 첨가하였다. 여기에 공수병 바이러스가 FFD50=35-100개가 되도록 희석하여 100 ㎕씩 첨가한 후 CO2 5%, 37℃ 배양기에서 90분간 중화반응시켰다. N2a 세포를 1X105/well이 되도록 중화반응시킨 well에 첨가하여 CO2 5%, 37℃ 배양기에서 20시간 동안 세포에 공수병 바이러스가 감염되도록 반응시켰다. 반응이 끝난 슬라이드는 80% Acetone을 이용하여 고정시키고, 자연 건조시켰다. 완성된 슬라이드에 Alexa-conjugated KGH P 단백 표적 단클론 항체를 0.00025% Evans blue가 포함된 PBS에 1:100으로 희석하여 슬라이드의 각 well에 분주하였다. 습윤상자에 넣고 37℃ 배양기에서 30분간 반응시킨 후 PBS를 이용하여 10분간 슬라이드를 세척하였다. 글리세롤이 포함된 수용성 봉입제를 첨가 후 커버글라스를 올려 형광현미경 하에서 200 배율로 2시간 이내에 두 명의 실험자가 각 2회씩 판독하였다.
결과 판독은 형광현미경 하에서 각 well을 20개의 구역으로 나누어 관찰하여 이루어지며, 각 well 당 특이 형광이 관찰된 구역 수를 기록하였다. 50% 이상의 구역에서 감염된 세포가 1개 이상이 관찰된, 양성을 보인 well의 혈청 희석비를 최종 역가로 판정한다. 결과 판정은 Reed & muench 방법에 따라 Internatianl Unit(IU)으로 결정한다. WHO에서는 최소 항체 양전율이 0.5 IU/ml 이상이면 적정 항체가로 판정하는 것을 권고한다. 0.5 IU/ml은 최소 바이러스 방어 중화항체가이다. 두 시험 간 실험결과를 Pearson's correlation analysis에 따라 상관성 분석을 시행하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 상관계수 r=0.988(p<0.0001)으로 나타나, 통계적으로 유의한 양의 상관성을 보여 결과에 차이가 없음을 확인하였다(도 4).
<110> Korea centers for disease control and prevention
<120> Monoclonal antibody targeting rabies virus P protein and uses
therof
<130> 2014P-10-032
<160> 4
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 894
<212> DNA
<213> Rauvolfia mannii
<400> 1
atgagcaaaa tctttgtcaa tccgagcgca atccgagccg gtctagctga cctcgagatg 60
gctgaagaga ctgttgatct gatcaataaa aacatagaag ataatcaggc tcatctccag 120
ggagaaccca tagaggtgga caatctccct gaggacatga ggcggctcca gctggacgat 180
aaagaacctt ctaaccttgg cggggtgacc acagcggggg aaggcaagta tcgggaagac 240
tttcagatgg atgaagggga ggaccctaac gtcctcttcc agtcatacct ggacaatgtt 300
ggagtccaga tagtcagaca aatgagatca ggggaaagat ttcttaagat atggtcacaa 360
accgtggagg aaatcatatc ttatgttgcg gtcaactttc ctaaccctcc agggaggtct 420
tcggaggaca aatcaaccca gactactggc cgagaactca agaaggagac tacatccatt 480
tcttcccaga gagacagcca atcttcgaaa gccaggatgg cggctcaagc tgcctccggt 540
cctccagctc tcgaatggtc tgccaccaac gaggaggatg atctatcagt ggaagctgag 600
attgctcacc aaattgcgga aagcttttcc aagaaataca agtttccctc tcgatcatca 660
gggatattct tgtataactt tgagcagtta aaaatgaacc tcgatgacat agttaaagag 720
gcaaaaaatg tgccaggtgt tgcccgtcta gcccatgatg gatctaaact ccctctaaga 780
tgtgtactgg ggtgggttgg tctggccaat tccaaaaaat tccagttgtt agtcgagcct 840
gacaagttaa ataaaattat gcaagacgat ctgaatcgct atgtatccag ctaa 894
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RV_cDNA
<400> 2
acgcttaaca acaaaatcag aaaa 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KGH PF
<400> 3
caccatgagc aaaatctttg tcaa 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KGH PR
<400> 4
gctggataca tagcgattca gatc 24
Claims (11)
- 공수병 바이러스(rabies virus)의 인단백질(phosphoprotein; P)을 에피토프(epitope)로 인식하는 공수병 바이러스 P 단백 표적 단클론 항체(monoclonal antibody; mAb).
- 제 1항에 있어서, 상기 공수병 바이러스는 KGH 주인 것을 특징으로 하는 공수병 바이러스 P 단백 표적 단클론 항체.
- 제 1항에 있어서, 상기 공수병 바이러스 P 단백은 서열번호 1로 기재되는 뉴클레오티드(nucleotide) 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 공수병 바이러스 P 단백 표적 단클론 항체.
- 제 1항의 단클론 항체를 포함하는 공수병 바이러스 진단용 키트.
- 제 5항에 있어서, 상기 항체는 형광물질이 접합된 것을 특징으로 하는 공수병 바이러스 진단용 키트.
- 제 5항에 있어서, 상기 형광물질은 쿠마린(coumarin) 계열 형광물질, 잔텐(xanthene)계열 형광물질, 시아닌(cyanine)계열 형광물질, 보디피(Bodipy) 계열 형광물질, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 계열 형광물질, 및 다이라이트 플루오르(DyLight Fluor) 계열 형광물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 공수병 바이러스 진단용 키트.
- 제 1항의 단클론 항체를 검체 시료에 접촉시켜 항원-항체 복합체 존재 여부를 확인하는 단계를 포함하는 공수병 바이러스 검출 방법.
- 제 8항에 있어서, 상기 항체는 형광물질이 접합된 것을 특징으로 하는 공수병 바이러스 검출 방법.
- 제 8항에 있어서, 상기 형광물질은 쿠마린(coumarin) 계열 형광물질, 잔텐(xanthene)계열 형광물질, 시아닌(cyanine)계열 형광물질, 보디피(Bodipy) 계열 형광물질, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 계열 형광물질, 및 다이라이트 플루오르(DyLight Fluor) 계열 형광물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 공수병 바이러스 검출 방법.
- 제 8항에 있어서, 상기 시료는 세포, 조직, 전혈, 혈정, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 공수병 바이러스 검출 방법.
- 제 8항에 있어서, 상기 항원-항체 복합체 존재 여부를 확인하는 방법은 면역분석법, 효소연관 면역분석법(ELISA), 샌드위치 면역분석법 및 측방 유동 면역 크로마토그래피 분석법(lateral flow immunographic assay)으로 이루어진 군에서 선택된 것을 이용하는 것을 특징으로 하는 공수병 바이러스 검출 방법.
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-
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| A201 | Request for examination | ||
| E601 | Decision to refuse application |