KR102264146B1 - 락토코커스 가비에에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 포함하는 락토코커스 가비에 검출용 조성물 - Google Patents

락토코커스 가비에에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 포함하는 락토코커스 가비에 검출용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 락토코커스 가비에(Lactococcus garvieae)에 대하여 특이적인 면역반응성을 나타내는 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주, 상기 하이브리도마 세포주를 배양하는 단계를 포함하는 락토코커스 가비에 특이적 단클론 항체의 제조방법, 상기 하이브리도마 세포주가 생산하는 락토코커스 가비에에 특이적으로 결합하는 단클론 항체, 상기 단클론 항체를 포함하는 락토코커스 가비에 검출용 조성물 및 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항체를 이용하면, 많은 개체의 감염이 발생하기 전 신속하고 정확하게 락토코커스 가비에 감염을 검출할 수 있어, 양식어민의 피해를 최소화하고, 방역기관의 초기대응을 신속하게 진행할 수 있다.

Description

락토코커스 가비에에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 포함하는 락토코커스 가비에 검출용 조성물{Comosition for Detecting Lactococcus garvieae Comprising Monoclonal Antibody Specific for Lactococcus garvieae}
본 발명은 락토코커스 가비에(Lactococcus garvieae)에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 포함하는 락토코커스 가비에 검출용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 락토코커스 가비에에 대하여 특이적인 면역반응성을 나타내는 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주, 상기 하이브리도마 세포주를 배양하는 단계를 포함하는 락토코커스 가비에 특이적 단클론 항체의 제조방법, 상기 하이브리도마 세포주가 생산하는 락토코커스 가비에에 특이적으로 결합하는 단클론 항체, 상기 단클론 항체를 포함하는 락토코커스 가비에 검출용 조성물 및 키트에 관한 것이다.
양식장의 밀집, 노후화 및 연안 오염으로 증가되고 있는 수산자원생물의 질병 문제는 우리나라 수산업이 직면한 주요 현안문제 중 하나이다. 질병은 양식생물의 누적 폐사로 인한 직접적인 경제적 피해와 더불어, 수산용 약제의 사용 증가와 관리 인력 비용 증가 등 제반 생산비용을 증가시켜 수산생물 생산성을 저하시킴으로써 심각한 경제적 피해를 유발하고 있다. 국내 양식 어류에 매년 질병이 발생하여 어류 폐사, 생산성 저하 등 경제적 손실이 커 현장에서 신속한 질병 진단에 의한 조기 대책 마련이 필요하다.
양식 현장에서 사용되고 있는 세균성 질병의 검출은 많은 시간을 필요로 하는 세균 배양법에 의존하고 있으며, 이러한 세균 배양법은 객관성이 떨어져 검출 오류의 가능성이 있고, 선택배지를 사용한 세균 배양법은 단일 세균에 대한 검사만 가능하며, 세부적인 분류가 불가능한 단점을 가지고 있다. 검출의 정확도를 높이기 위하여 생화학 분석(API test)이 사용되고 있으나, 절차가 복잡하고 반응시간이 길어 신속한 검출이 불가능하며, 특히 수산 질병관련 세균의 경우, 데이터베이스가 많지 않아 정확도가 낮으므로 실제 수산 현장에 사용되지 않고 있다. 이러한 문제점을 극복하고 수 시간 내 정확한 검출이 가능한 분자검출 제품의 개발로 질병의 피해를 조기에 막을 수 있다.
어류 연쇄구균병과 에드와드병 원인세균인 에드와드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda), 스트렙토코카스 이니애(Streptococcus iniae), 스트렙토코카스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) 및 락토코커스 가비에(Lactococcus garvieae)는 세계적으로 많이 양식되는 틸라피아, 방어, 무지개송어, 넙치에 감염되어 높은 폐사를 일으키고 있다. 이 중 락토코커스 가비에(Lactococcus garvieae)는 그람양성 구균으로 1950년대 일본의 무지개송어에서 처음 발견되었다. 방어, 숭어, 넙치, 조피볼락, 돌돔 등의 어류에 질병을 일으키는 병원체로 알려져 있으며, 일본, 이탈리아, 스페인, 미국, 우리나라 등에서 분리가 되었다. 조피볼락과 돔류의 락토코커스 가비에(Lactococcus garvieae)에 의한 연쇄구균병은 법정전염병으로 지정되어 있지는 않으나, 매년 고수온기에 발생하여 대량폐사를 유발하고 있다.
연쇄구균병의 신속 진단은 질병의 확산을 막을 수 있으며, 연쇄구균병의 경우 항생제 투여로 피해를 최소화시킬 수 있다. 그러나, 기존에 보고된 검사법, 예를 들면, 중합효소연쇄반응법(RT-PCR), Nested-PCR을 포함하는 분자생물학적 방법과 효소면역측정법(ELISA), 형광항체법(IFAT)을 포함하는 면역학적 방법은 검사 및 진단에 많은 시간이 소요되며(1일 이상), 질병 원인 판정에 한계가 있고, 전문 인력 및 장비가 요구되는 등의 단점이 존재한다.
양식 현장에서 20분 이내에 질병을 진단할 수 있는 방법으로서 면역크로마토그래피법으로 제작한 신속진단 키트가 있는데, 신속진단 키트는 검사소요 시간이 약 20분으로 매우 짧고, 특별히 고가의 검사장비를 필요로 하지 않다는 장점을 가지고 있다. 신속진단 키트는 1 step으로 모든 실험이 완결된다. 검체를 진단 키트의 검체 주입구에 소량 투여하면 전처리 여과용 필터를 통과한 후, 양성일 경우에는 검체 중에 있는 병원체가 1차적으로 특이 항체(타겟 병원체에 대한 단클론 항체)가 접합된 gold-conjugate와 반응하여 항원-항체 결합체를 형성한다. 이후 이 항원-항체 결합체는 연속적으로 진단시약 내부에 있는 여러 패드를 통과해서 nitrocellulose membrane까지 수평적으로 흘러가게 되면서 nitrocellulose membrane에 코팅되어 있는 항체(타겟 병원체에 대한 단클론 항체)와 반응하여 색상을 발현하므로, 타겟 병원체의 존재여부를 육안으로 확인할 수 있다.
이러한 신속진단 키트를 개발하기 위해서는 타겟 병원체를 특이적으로 인식하는 항체가 반드시 필요하다. 이에 본 발명자들은, 조피볼락과 돔류의 락토코커스 가비에에 의한 연쇄구균병에 대한 신속진단 키트 개발을 위한 단클론 항체를 제작하여, 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 락토코커스 가비에(Lactococcus garvieae) 검출용 조성물 및 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 락토코커스 가비에(Lactococcus garvieae)에 대하여 특이적인 면역반응성을 나타내는 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 락토코커스 가비에(Lactococcus garvieae) 특이적 단클론 항체의 제조방법 및 락토코커스 가비에(Lactococcus garvieae)에 대하여 특이적인 면역반응성을 나타내는 단클론 항체를 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 락토코커스 가비에(Lactococcus garvieae) 항원 포획을 위한 1차 항체, 검출표지, 상기 검출표지와 결합하는 2차 항체 및 상기 검출표지의 활성 측정용 시약을 함유하는 락토코커스 가비에(Lactococcus garvieae) 검출용 조성물에 있어서, 상기 1차 항체 및 2차 항체는 기탁번호 KCTC14089BP로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해서 생산되는 단클론 항체인 것을 특징으로 하는, 락토코커스 가비에(Lactococcus garvieae) 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 락토코커스 가비에(Lactococcus garvieae) 검출용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 락토코커스 가비에(Lactococcus garvieae)에 대하여 특이적인 면역반응성을 나타내는 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주(KCTC14089BP)를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 하이브리도마 세포주(KCTC14089BP)를 배양하여 생산된 항체를 수득하는 단계를 포함하는 락토코커스 가비에(Lactococcus garvieae) 특이적 단클론 항체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 하이브리도마 세포주(KCTC14089BP)에 의해 생산되고, 락토코커스 가비에(Lactococcus garvieae)에 대하여 특이적인 면역반응성을 나타내는 단클론 항체를 제공한다.
본 발명에 따른 락토코커스 가비에(Lactococcus garvieae) 항체를 이용하면, 많은 개체의 감염이 발생하기 전 신속하고 정확하게 락토코커스 가비에 감염을 검출할 수 있어, 양식어민의 피해를 최소화하고, 방역기관의 초기대응을 신속하게 진행할 수 있다.
도 1은 L. garvieae로부터 추출한 whole cell lysates(W), soluble(S) 및 insoluble proteins(I)의 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 2는 L. garvieae 면역 후 마우스로부터 채혈한 혈청을 사용한 ELISA 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 Hybridoma 세포의 사진이다.
도 4는 L. garvieae로부터 추출한 whole cell 및 insoluble fraction에 대해, MAb 1-8의 반응을 나타낸 그래프이다(MAb-1: 50H3, MAb-2: 1H4, MAb-3: 74C10, MAb-4: 19C4, MAb-5: 54F9, MAb-6: 20A11, MAb-7: 95H11, MAb-8: 63G11).
도 5는 L. garvieae에 대한 MAb의 Western blotting에 의한 항원 인식 부위 확인 결과이다(W: whole cell lysates, S: soluble proein, I: insoluble protein, MAb: 좌측부터 50H3, 1H4, 74C10, 19C4, 54F9, 20A11, 95H11, 63G11).
도 6은 L. garviae의 insoluble protein으로 제작한 8개 MAb의 민감도를 나타낸 그래프이다(분석방법: ELISA; MAb-1: 50H3, MAb-2: 1H4, MAb-3: 74C10, MAb-4: 19C4, MAb-5: 54F9, MAb-6: 20A11, MAb-7: 95H11, MAb-8: 63G11).
도 7은 L. garviae의 insoluble protein으로 제작한 8개 MAb의 특이도를 나타낸 그래프이다(분석방법: ELISA; MAb-1: 50H3, MAb-2: 1H4, MAb-3: 74C10, MAb-4: 19C4, MAb-5: 54F9, MAb-6: 20A11, MAb-7: 95H11, MAb-8: 63G11).
도 8은 L. garvieae에 대한 단클론성 항체의 특이성을 조사한 ELISA 결과 그래프이다.
도 9는 54F9 hybridoma cell 접종 후, 마우스 복수로부터 정제된 항체의 SDS-PAGE 분석 결과이다(M: Protein Size Marker, Lane 1: Ascites 1(0.2μL Loading), Lane 2: Ascites 2(0.2μL Loading), Lane 3: Wash(1.0μL Loading), Lane 4: Elution 1(4.0μL Loading), Lane 5: Elution 2(4.0μL Loading), Lane 6: Elution 3(4.0μL Loading), Lane 7: Elution 4(4.0μL Loading), Lane 8: Elution 5(4.0μL Loading)).
도 10은 정제 및 농축된 54F9 항체의 SDS-PAGE 및 Image J 분석을 통한 항체 분획 및 순도 분석 결과이다.
도 11은 74C10 hybridoma cell 접종 후, 마우스 복수로부터 정제된 항체의 SDS-PAGE 분석 결과이다(M: Protein Size Marker, Lane 1: Ascites 1(0.2μL Loading), Lane 2: Ascites 2(0.2μL Loading), Lane 3: Wash(1.0μL Loading), Lane 4: Elution 1(4.0μL Loading), Lane 5: Elution 2(4.0μL Loading), Lane 6: Elution 3(4.0μL Loading), Lane 7: Elution 4(4.0μL Loading), Lane 8: Elution 5(4.0μL Loading)).
도 12는 정제 및 농축된 74C10 항체의 SDS-PAGE 및 Image J 분석을 통한 항체 분획 및 순도 분석 결과이다.
도 13은 11H4 hybridoma cell 접종 후, 마우스 복수로부터 정제된 항체의 SDS-PAGE 분석 결과이다(M: Protein Size Marker, Lane 1: Ascites 1(0.2μL Loading), Lane 2: Ascites 2(0.2μL Loading), Lane 3: Wash(1.0μL Loading), Lane 4: Elution 1(12.0μL Loading), Lane 5: Elution 2(12.0μL Loading), Lane 6: Elution 3(12.0μL Loading), Lane 7: Elution 4(12.0μL Loading), Lane 8: Elution 5(12.0μL Loading)).
도 14는 정제 및 농축된 11H4 항체의 SDS-PAGE 및 Image J 분석을 통한 항체 분획 및 순도 분석 결과이다.
도 15는 정제된 IgG의 L. garvieae에 대한 반응성을 나타낸 그래프이다.
도 16은 Immunoblotting assay에 의해 L. garvieae의 항체들의 항원 인식 및 특이도를 확인한 결과이다.
도 17은 부유액의 10배 다단계 희석 후, 각 희석배수 별 DNA 추출에 의한 PCR 민감성 조사 결과이다.
도 18은 106 CFU 부유액으로부터 DNA를 추출하여 10배 다단계 희석 후, PCR 민감성 조사한 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는, 어류의 락토코커스 가비에(Lactococcus garvieae) 감염을 효과적으로 진단할 수 있는 키트를 제작하기 위하여, L. garvieae 항원으로 면역화시킨 마우스의 비장 조직을 얻어 골수종(myeloma) 세포와 융합시켜, 항-L. garvieae 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma) 세포를 제작하고, 상기 하이브리도마 세포를 마우스에 주사하여 항-L. garvieae 단클론 항체를 제작하였다. 상기 제작된 단클론 항체를 이용하여 제작한 진단 키트는 L. garvieae 감염 진단에 대해 민감도, 재현성이 우수한 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 락토코커스 가비에(Lactococcus garvieae) 항원 포획을 위한 1차 항체, 검출표지, 상기 검출표지와 결합하는 2차 항체 및 상기 검출표지의 활성 측정용 시약을 함유하는 락토코커스 가비에(Lactococcus garvieae) 검출용 조성물에 있어서, 상기 1차 항체 및 2차 항체는 기탁번호 KCTC14089BP로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해서 생산되는 단클론 항체인 것을 특징으로 하는, 락토코커스 가비에(Lactococcus garvieae) 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 검출표지는 비오틴(biotin), HRP(horseradish peroxidase), 염기성탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(colloid gold), FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocya nate) 및 RITC(rhodamine-B-isothiocyanate)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 검출표지와 상기 검출표지의 활성 측정용 시약은 반응에 의해 발색, 형광, 발광 특성 중 어느 하나를 나타내어 이를 측정하기 위함으로 일반적인 면역측정법에 사용되는 각종 검출표지와 각 검출표지에 따른 활성 측정용 시약을 사용할 수 있다.
본 발명의 L. garvieae 검출용 조성물(또는 진단 시약)은 상기 진단 대상인 항원, 상기 항원 포획을 위한 단클론 항체, 검출표지, 상기 검출표지와 결합하는 단클론 항체 및 상기 검출표지의 활성 측정용 시약 외에 일반적인 면역측정법에 사용되는 시약이 추가로 포함될 수 있다. 보다 구체적으로는, 항체 고정용액, 항원 고정용액, 블로킹 용액, 가검시료 희석제, 혈청 반응 및 항체의 비특이 반응을 제거하기 위한 세척액, 테스트의 유효성을 검증하기 위한 양성 및 음성 대조시약, 상기 검출표지의 활성 측정을 위한 반응을 정지시키기 위한 정지액 등이 포함될 수 있다. 또한, 일반적인 면역측정법에 사용되는 각종 고체상 지지체, 즉, 플레이트, 마이크로플레이트 웰, 플라스틱 시험관, 유리 비드, 플라스틱 비드 등도 포함될 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 락토코커스 가비에(Lactococcus garvieae)에 대하여 특이적인 면역반응성을 나타내는 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주(KCTC14089BP)에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 하이브리도마 세포주(KCTC14089BP)를 배양하여 생산된 항체를 수득하는 단계를 포함하는 락토코커스 가비에(Lactococcus garvieae) 특이적 단클론 항체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 하이브리도마 세포주(KCTC14089BP)에 의해 생산되고, 락토코커스 가비에(Lactococcus garvieae)에 대하여 특이적인 면역반응성을 나타내는 단클론 항체에 관한 것이다.
본 발명의 용어 "하이브리도마 세포주"란, 2개의 다른 종류의 세포를 인공적으로 융합시켜 만든 세포로, 폴리에틸렌글리콜 등 세포융합을 일으키게 하는 물질이나 어떤 종의 바이러스를 사용하여 둘 이상의 동종 세포나 이종 세포가 융합되어, 각기 다른 세포가 갖는 다른 기능을 하나의 세포 속에 통합시킨 세포 또는 세포주를 의미한다. 특히, 골수종 세포(myeloma cell)와 비장이나 림프절에 들어 있는 림프구 가운데 항체 생성세포의 선 구세포인 B세포를 융합시킨 잡종세포는 단클론 항체를 만들어내므로 연구와 임상에 널리 응용된다. 그 밖에 림포카인(생리활성물질)을 만들어내는 T세포와 그 종양세포인 하이브리도마 등도 실용화되고 있다.
본 발명에 따른 하이브리도마는 L. garvieae 항원을 접종하여 면역시킨 BALB/c 마우스 유래 비장 세포와 골수종 세포를 융합시켜 제조되고, 하이브리도마 세포는 당업계에 통상적인 방법, 예를 들어, HAT(hypoxanthine-aminopterin-thymidine) 선택법 등을 이용하여 제조될 수 있다.
상기 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주는 2019년12월20일자로 한국생명공학연구원에 기탁번호 KCTC14089BP로 기탁하였다.
본 발명에서, 용어 "특이적인 면역반응성을 나타내는"이란, 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항체가 특정 항원에 대하여만 결합하고 다른 항원에 대하여는 결합하지 않으며, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 항-L. garvieae 단클론 항체를 사용하여 경합적 ELISA를 실시하였을 때, L. garvieae 감염 동물 유래 조직 및 혈중 L. garvieae 항원을 효과적으로 검출하였다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 검출용 조성물을 포함하는 락토코커스 가비에(Lactococcus garvieae) 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 L. garvieae 검출용 키트(또는 진단용 키트)는 상기 L. garvieae 검출용 조성물(또는 진단 시약)을 포함하여 이루어지는 키트인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 L. garvieae 진단 또는 검출은 면역학적 방법, 바람직하게는 효소면역측정법(ELISA)을 이용하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 L. garvieae 검출용 단클론 항체, 진단용 항원 포획용 단클론 항체와 진단용 L. garvieae 항원의 복합체 및 피검체로부터 채취한 가검시료를 반응시켜 항원-항체 반응을 검출할 수 있는 방법이라면 어느 방법도 사용 가능하다.
상기 가검시료는 피검체로부터 채취한 생물학적인 시료를 의미한다. 세포간 체액이나 혈청을 사용하는 것이 바람직하고, L. garvieae의 항원 또는 상기 L. garvieae에 대한 자가 항체가 정제되도록 처리한 시료를 채취하여 사용할 수 있다.
보다 구체적인 본 발명의 L. garvieae 진단 방법은, 고체상 지지체에 항원 포획을 위한 단클론 항체를 고정하는 단계; 상기 고체상 지지체에 부착되지 않은 항체들을 세척하여 제거하는 단계; 상기 고체상 지지체에 L. garvieae 진단용 항원을 반응시키는 단계; 상기 고체상 지지체에 부착되지 않은 항원들을 세척하여 제거하는 단계; 및 검출표지가 결합된 단클론 항체를 고체상 지지체에 고정된 상기 L. garvieae 진단용 항원과 반응시키는 단계를 포함하고, 상기 진단용 항원 포획을 위한 단클론 항체는 하이브리도마 세포주 KCTC14089BP에 의해 생산되고, L. garvieae에 면역반응성을 나타내는 단클론 항체를 사용한다.
L. garvieae 신속진단 키트의 장점은 기존의 높은 비용과 고가의 장비를 활용한 real-time PCR기법보다 저렴한 비용과 5~10분내의 짧은 결과 판독시간이 소요되며, 비숙련자가 실험하여도 숙련자가 실험한 기법과 동일한 검사결과를 활용할 수 있어 현장적용에 있어 여러 면에서 장점을 갖는다.
본 발명의 진단 키트는 현장 사용의 편의성을 위하여 키트 패키지 타입으로 구성될 수 있으며, 구성 물품으로는 L. garvieae 신속진단 키트, 완충용액, 간이 분쇄기, 간이 스포이트를 포함할 수 있다.
본 발명은 수산생물질병의 상시 예찰 및 법정전염병 모니터링을 위한 진단시스템 개발을 통하여 수산양식 산업의 피해를 최소화하고 바이오 신소재를 활용한 대응체계 마련에 방향을 제시하는 등 효과적인 수산방역체계 강화에 기여할 것으로 기대된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
1. 재료 및 방법
실시예 1: Lactococcus garvieae 에 대한 단클론 항체( MAb ) 제작
실시예 1-1: 세균 배양
실험에 사용한 균주는 Lactococcus garvieae FP6019이다. Tryptic soy broth(TSB)에 접종 후 27℃에서 배양하고, cryobead(PULSE scientific Inc.)를 이용하여 -70℃에서 보관하였다. 단클론성 항체 생산 및 생산된 항체의 스크리닝을 위해 보관된 균주들을 tryptic soy agar(TSA)에 접종하여 27℃에서 배양하면서 실험에 사용하였다.
실시예 1-2: 막 단백질(membrane protein)의 추출
면역 항원과 hybridoma를 스크리닝하기 위한 목적으로 L. garvieae로부터 막단백질을 추출하였다. Tris buffer에서 막단백질의 소수성 및 세포질단백질의 특성에 따른 용해도의 차이에 의한 추출 방법을 이용하였다(Zuobi-Hasona et al., Electrophoresis. 2005 Mar;26(6):1200-5). TSB에서 배양된 세균을 phosphate buffer saline(PBS; 0.13M NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4) 완충용액으로 3회 세척하고, protease inhibitor cocktail이 포함된 40mM Tris buffer(pH 7.5)에 부유한 후, bead beating에 의해 whole cell lysates를 추출하였다. 추출된 lysates은 4℃ 원심분리기에서 13,000rpm으로 30분간 원심분리하여 unbroken cell과 cell debris를 제거한 후, 상층액(whole cell lysates)은 다시 45,100rpm에서 2시간 원심분리하였다. Soluble fraction(대부분은 cytosolic proteins)이 포함된 상층액은 1.5㎖ tube에 옮겨졌으며, 주로 막단백질로 구성된 pellet은 40mM Tris로 부유하지 않은 상태로 세 번 세척한 후, 동일 완충액으로 부유(insoluble fraction)하였다.
실시예 1-3: 막 단백질의 분석
추출된 whole cell lysate, soluble 및 insoluble fraction에 동량의 SDS-sample buffer를 첨가하여 100℃에서 5분간 열처리한 후, SDS-PAGE(12％ acrylamide separating gel, 4％ acrylamide stacking gel, 30mA, 2 hours)를 실시하였다. 전기영동 후, 겔은 0.2％ coomassie brilliant blue R-250로 염색하여 결과를 확인하였다.
실시예 1-4: 마우스의 면역
면역은 L. garvieae의 insoluble fraction(주로 막단백질, 100㎍)과 Fruend's complete adjuvant(Sigma, USA)를 1:1 비율로 혼합하여 BALB/c 마우스의 복강에 1차 면역하였다. 3주 후 동일 항원을 Fruend's incomplete adjuvant(Sigma, USA)와 혼합하여 2차 면역하였다. 3주 후 정제 바이러스를 사용하여 3차 면역하였고, 세포 fusion 4일 전에 마우스의 혈청을 취해 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)를 실시하였다.
실시예 1-5: Hybridoma 제작
면역된 마우스로부터 비장을 분리한 후 PEG 1500(Roche, USA)을 이용하여 myeloma cell(Sp2/0Ag14)과 융합시킨 후, hypoxanthine-aminopterin-thymidine(HAT, 0.1mM hypoxanthine, 4×10- 4mM aminoprotein, 1.6×10- 2mM thymidine in Dulbecco’s modified eagle medium) 배지를 사용하여 96 well plate(TPP, Switzerland)에 분주하고, CO2 배양기에서 37℃로 배양하였다.
실시예 1-6: Hybridoma 스크리닝 및 클로닝
연쇄구균에 특이적으로 반응하는 항체를 생산하는 hybridoma를 screening하기 위해 ELISA를 실시하였다. 포르말린 killed cell(OD 값: 1, 108 colony-forming unit(CFU)/㎖)과 insoluble protein(250ng/㎖)을 ELISA plate에 각각 50㎕ 분주하여 4℃에서 overnight하여 coating하였다. 2% skim milk/TBST 200㎕를 분주하여 blocking한 후, TBST로 1회 세정하고, 1차 항체로서 hybridoma 배양 상등액을 well 당 50㎕씩 분주하여 37℃에서 2시간 반응하였다. TBST로 3회 세정한 후, 2차 항체로는 HRP가 표식되어 있는 goat anti-mouse IgG serum을 2% skim milk/TBST로 5,000배 희석하여 well 당 50㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 반응하였다. TBST로 5회 세정한 후 TMB를 well 당 50㎕ 분주하여 발색하였다. 각 well에 1N H2SO4를 50㎕씩 넣어 발색 반응을 중지시킨 후, microplate photometer로 480㎚에서 흡광도를 측정하였다. 양성 hybrioma는 ELISA로 선별하였고, 제한 희석법으로 3회 클로닝 하였다.
실시예 1-7: MAb의 항원 인식 부위 분석
세균에 대해 생산된 MAb들이 인식하는 항원들을 규명하기 위하여 Western blot을 실시하였다. SDS-PAGE는 실시예 1-3과 동일한 방법으로 실시하였다. 정제된 바이러스를 사용하여 전기영동 한 후, gel에 있는 단백질을 transblot 장치를 이용하여 144㎃에서 1시간 동안 nitrocellurose membrane에 blotting하였다. Blotting 후 2% skim milk로 blocking하여 1시간 반응시킨 후, buffer 1(0.1M maleic acid, 0.15M NaCl, pH 7.5)로 15분간 세정하였다. 1차 항체로는 본 발명에서 제작한 hybridoma 배양 상등액을 1시간 반응시킨 후, 실시예 1-6과 동일한 방법으로 세정하였다. 2차 항체로는 AP가 표식되어 있는 goat anti-mouse IgG serum을 2% skim milk로 5,000배 희석하여 1시간 반응시킨 후, 5회 세정하고 발색제로 발색하여 육안으로 확인하였다. 발색이 완료된 후 발색 정지액을 첨가하였다.
실시예 1-8: MAb의 민감도 분석
제작된 MAb의 민감도를 분석하기 위해, L. garvieae를 TSB에서 배양하였다. 원심분리 후, 세균 pellet은 OD 값이 1이 되도록 멸균 PBS로 부유하였고, 집락수를 계산하기 위하여 TSA에 접종하였다. PBS에 부유된 세균은 동일 buffer에 10배 다단계 희석하여 ELISA plate에 각각의 희석액을 50㎕(250ng/well) 씩 2개의 well에 분주하여 민감도를 조사하였다. ELISA 방법은 실시예 1-6과 동일하게 실시하였다.
실시예 1-9: MAb의 특이도 분석
제작된 MAb의 특이도를 분석하기 위해, 3종의 연쇄구균(S. iniae(1.2×106 CFU/㎖), S. parauberis(1.8×106 CFU/㎖) 및 L. garvieae(2.0×106 CFU/㎖))과 Edwardsiella tarda(1.4×106 CFU/㎖)의 whole cell을 사용하여 ELISA를 실시하였다. ELISA 방법은 실시예 1-6과 동일하게 실시하였다.
실시예 2: 마우스 항체 대량 생산 및 정제
실시예 2-1: Anti- L. garvieae antibody( Ab )를 생산하는 hybridoma cell의 선별
L. garvieae POCT 키트 제작을 위한 마우스로부터 항체의 대량 생산 전에, 선별된 단클론성 항체의 특이성을 재조사함으로서 hybridoma cell을 선별하였다. 선별된 hybridoma cell로부터 생산되는 anti-L. garvieae MAbs의 특성을 하기 표 1에 나타내었다.
Anti-L. garvieae MAbs의 선별
Target Antigen( kDa ) Clone No. H-chain L-chain
L. garvieae 15~20 74C10 IgG2a κ
20~25 1H4 IgA κ
15~20 54F9 IgG2a κ
74C10 및 54F9는 15~20kDa의 하나의 insoluble antigen을 인식하며 1H4는 20~25kDa의 하나의 insoluble antigen을 인식한다. 선별된 MAbs를 생산하는 hybridoma cell들은 배양 후 상층액으로, ELISA와 immunoblot assay를 통해 특이성을 재조사하였다.
실시예 2-2: Hybridoma cell의 배양
액체질소에 보관된 hybridoma cell들은 37℃에서 해동 후, hypoxanthine-aminopterin-thymidine(HAT, 0.1mM hypoxanthine, 4×10- 4mM aminoprotein, 1.6×10-2mM thymidine in Dulbecco’s modified eagle medium) 배지를 사용하여 96 well plate(TPP, Switzerland)에 분주하여 CO2 배양기에서 37℃로 배양하였다(Liddell and Cryer, A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, 1991). 세포의 모양과 수를 확인한 후, 상층액 및 hybridoma cell들은 원심 후 각각 분리하였다. 상층액은 생산된 MAbs의 특이성을 재조사하기 위하여 ELISA와 immunoblot assay를 수행하였으며, 준비된 hybridoma cell들은 마우스 접종을 위해 준비하였다.
실시예 2-3: 마우스 복수로부터 항체의 정제
배양된 hybridoma cell로 마우스에서 항체의 대량 생산 및 정제를 위해, 마우스 준비, 접종, 복수의 생산 및 채취, 그리고 affinity column으로 정제의 단계들을 수행하였다.
선별된 단클론성 항체를 생산하는 hybridoma cell은 대략 1×106cell/ml로 준비하여 10주령의 Balb/c(마우스)의 복강에 접종하여 복수를 생산하였다. Hybridoma cell 접종 전 마우스는 1주일 간의 실험실에서 안정화를 거친 후, 0.5ml의 pristane(Sigma)을 접종하였다.
접종 10일 후 각 hybridoma cell은 5마리의 마우스 복강에 접종하여 1~2주일 동안 복수 생성 유무를 확인하였다. 복수가 충분히 생성된 마우스로부터 복수를 채취 후 3,000rpm에서 15분 동안 원심분리하였고, 상층액은 정제를 위해 냉장 또는 냉동 보관하였다.
생산된 마우스 복수액은 protein A resin(GenScript)을 사용한 affinity column으로 정제하였다. 우선, 그 resin을 column에 넣고 멸균된 PBS(0.1M sodium phosphate buffer, pH 7.0)로 3번 수세한 후, 마우스의 복수액을 column에 주입하여 실온에서 1시간 동안 반응 후 PBS로 3회 세척하였다.
Protein A resin에 결합된 IgG는 0.1M glycine buffer(pH 3.0) 사용에 의해 추출한 후, Tris buffer(pH 8.8)로 중화시켰다. 정제된 IgG는 sodium dodecyl sulfate poly acrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)에 의해 확인한 후, 사용하기 전까지 -80℃에 보관하였다.
실시예 2-4: 항원의 준비
단클론성 항체의 제작 및 생산된 항체의 스크리닝을 위해 사용된 균주는 Lactococcus garvieae 6019로, 국립수산과학원으로부터 분양 받았다. 균주는 tryptic soy broth(TSB)에 접종 후 27℃에서 배양하여 cryobead(PULSE scientific Inc.)를 이용하여 -70℃에서 보관하였다.
세균의 세포벽 항원을 추출하기 위하여, TSB에서 배양된 세균은 PBS로 세 번 세척 후 protease inhibitor cocktail이 포함된 40mM Tris buffer(pH 7.5)에 부유한 후, bead beating에 의해 whole cell lysates를 추출하였다. 추출된 lysates은 4℃ 원심분리기에서 13,000rpm으로 30분간 원심분리하여 unbroken cell 및 cell debris를 제거한 후 상층액은 다시 45,100rpm(100,000g)에서 2시간 원심분리하였다.
Soluble protein(대부분은 cytosolic proteins)이 포함된 상층액은 1.5ml tube에 옮겨졌으며. pellet은 40mM Tris로 부유하지 않은 상태로 세 번 세척한 후 동일 완충액으로 부유하였다. 추출된 whole cell lysate, soluble 및 insoluble protein들은 SDS-PAGE로 분석하였다.
실시예 2-5: SDS-PAGE 및 immunoblot assay
마우스 복수로부터 정제된 항체의 항원에 대한 반응을 조사하기 위해, SDS-PAGE와 ELISA를 김위식 등(2017, 한국수산과학회지, 50(2), 169-174)과 정하나 등(2017, 한국어병학회지, 30(2), 149-154)의 방법에 준해 실시하였다.
항원에 동량의 SDS-sample buffer(1.59％ SDS, 0.5M Tris-HCl(pH 6.8), 14% glycerol(w/v), 0.01% bromophenol blue(w/v), 4% 2-mecaptoethanol(v/v))를 첨가하여 100℃에서 3분간 열처리한 후, SDS-PAGE(12％ acrylamide separating gel, 4％ acrylamide stacking gel, 30mA, 2 hours)를 실시하였다. 전기영동 후, 겔은 0.2％ coomassie brilliant blue R-250(Wako)로 염색하여 결과를 확인하였다.
항원에 대한 항체의 인식 능력을 확인하기 위하여, immunoblotting assay을 실시하였다. SDS-PAGE는 위와 동일한 방법으로 실시 후, gel에 있는 단백질을 transblot 장치(ATTO, Japan)를 이용하여 144㎃에서 1시간 동안 nitrocellurose membrane(advantec, Japan)에 blotting하였다.
Blotting 후 2% skim milk로 blocking하여 1시간 반응시킨 후, buffer 1(0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, pH 7.5)로 15분간 세정하였다. 1차 항체로는 본 발명에서 제작한 hybridoma 배양 상등액을 1시간 반응시킨 후, 위와 동일한 방법으로 세정하였다. 2차 항체로는 alkaline phosphatase(AP)가 표식되어 있는 goat polyclonal anti-mouse IgG antibody(novus, USA)를 2% skim milk로 5,000배 희석하여 1시간 반응시킨 후 5회 세정하고 발색제(100mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 50mM MgCl2용액(pH 9.5) 20㎖, NBT(75㎎/㎖ 4-nitrotetrazolium blue chloride) 90㎕, BCIP(50㎎/㎖ 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate p-toluidine salt/dimethyl -formamide) 70㎕)로 발색하여 육안으로 확인하였다. 발색이 완료된 후 발색 정지액(1mM EDTA, 10mM Tris-HCl)을 첨가하였다.
실시예 2-6: ELISA
ELISA를 위해 연쇄구균의 항원은 107CFU/ml를 준비하였다. 연쇄구균은 96 well ELISA microplates(Greiner-bio-one, Germany)에 각각 50㎕씩 분주한 후 37℃에서 overnight하여 항원을 코팅하였다.
T-PBS(0.05% Tween-20/PBS(v/v))로 3회 세정하였고 5% skim milk를 380㎕씩 분주하여 25℃에서 1시간 동안 blocking하였다. T-PBS로 3회 세정한 후 1차 항체로는 본 발명에서 제작한 단클론 항체를 시료 당 2개의 well에 50㎕씩 분주하여 25℃에서 1시간 반응하였다. T-PBS로 3회 세정한 후 horseradish peroxidase(HRP)가 표식되어 있는 goat anti-mouse IgG(Youngin, Korea)를 5% skim milk로 1,000배 희석하여 well 당 50㎕씩 분주하였으며, 25℃에서 1시간 반응하였다.
T-PBS로 5회 세정한 후 ELISA 발색액(100mM Na2HPO4, 50mM citric acid, 1㎎/㎖ o-phenylen diamine, 0.1% H2O2)을 well 당 50㎕ 분주하여 발색하였다. 각 well에 1N H2SO4를 50㎕씩 넣어 발색 반응을 중지시킨 후, 490㎚에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 3: POCT (Point of Care Testing; 현장현시검사 ) 진단 키트의 제작
실시예 3-1: 키트의 구성
POCT 키트는 플라스틱 지지막(cassette), 샘플패드, 골드패드, 니트로셀룰로오스 막, 흡수패드로 구성되어 있다. 키트는 면역크로마토그래피법을 이용한 항원-항체반응으로 검사소요 시간이 약 20분 이내로 매우 신속한 진단 방법이며, 또한, 특별한 고가의 검사 장비를 필요로 하지 않아 진단 비용이 저렴하다는 장점을 가지고 있다. 신속진단 키트는 1 step으로 모든 실험이 완결된다.
검체를 진단 키트의 검체 주입구에 소량 투여하면(예를 들면, 참돔의 내부 장기 마쇄액 사용) 전처리 여과용 필터를 통과한 후, 양성인 경우 검체 중에 있는 병원체가 1차적으로 특이 항체(병원체에 대한 단클론 항체)가 접합된 gold-conjugate와 반응하여 항원-항체 결합체를 형성한다. 이후 이 항원-항체 결합체는 연속적으로 진단시약 내부에 있는 여러 패드를 통과해서 nitrocellulose membrane까지 수평적으로 흘러가게 되면서 nitrocellulose membrane에 코팅되어 있는 항체(병원체에 대한 단클론 항체)와 반응하여 색상을 발현함으로써, 병원체의 존재여부를 육안으로 진단할 수 있도록 한다.
실시예 3-2: 금 나노입자( collopidal gold)의 제작
금 나노입자(콜로이드 골드(colloid gold))는 Frens, Nature Physical Science, volume 241, pages 20-22(1973)의 방법에 따라 제작하였다. 3차 증류수 2L를 삼각플라스크에 넣고 교반하면서 100℃가 될 때까지 끓인 후, tetrachloro auric (III) acid hydrate를 첨가하여 교반하면서 끓인다. Sodium citrate tribasic dihydrate를 첨가하고 믹서기를 이용하여 교반한다. 무색에서 보라색으로 색 변화를 관찰 후 추가로 5분간 끓이고, 실온에서 식힌 후에 사용한다. 530nm와 600nm에서 흡광도를 측정 후, 530/600nm 비율이 2.9-3.5 값에 들어올 경우 사용하였다.
실시예 3-3: 금 나노입자와 항체 축합 (conjugation)
금 나노입자 용액에 항체를 각각 첨가하여 결합 유무를 확인하였다. 금 나노입자가 항체와 정상적으로 결합하면 혼합용액이 붉은색을 유지하고, 비정상적인 결합의 경우에는 진보라색이나 검은색으로 변한다. 반응이 잘 이루어지지 않을 경우, 금 나노입자에 0.4M K2CO3를 첨가하면서 항체와의 반응을 촉진시켰다. 항체와의 결합이 확인되면 25~30℃에서 2시간 30분 동안 반응시킨 후, 10% bovine serum albumin BSA)을 첨가하여 blocking 시켰다.
Washing 버퍼를 이용하여 10,000rpm에서 20분간 원심분리하여 수세한 후, 0.45μm 필터로 실험에 사용하기 전까지 4℃에 보관하였다. 본 발명에서는, 40nm, 100nm 또는 200nm의 금 나노입자를 실험에 사용하였다.
실시예 3-4: POCT 키트 제작을 위한 최적의 항체 선별
마우스 복수로부터 정제된 항체들은 pairing test에 의해 선별되었다. 정제된 항체들의 각각은 골드입자와 축합하여 골드패드에 부착하였고, 비축합형 항체는 검사선에 분주 후 POCT 키트를 제작하였으며, 매칭 테스트를 실시하여 검사선용 항체와 금-접합체용 항체 조합 중에서 각 항원에 가장 반응이 우수한 조합을 선별하였다.
다양한 항체 조합으로 제작된 키트에 항원을 각각 100μl씩 주입 후 15분 뒤에 결과를 확인하였으며, 결과의 판정은 밴드가 2개가 나오면 양성, 1개가 나오면 음성으로 하였다.
실시예 3-5: 골드(결합) 패드 제작
PE 패드(Boredabiotech)에 금 나노입자와 항체가 축합된 믹스처를 20cm × 30cm 규격 당 20ml을 분주한 후 하루 동안 건조하였다.
실시예 3-6: 샘플 패드 제작
유리 섬유재질(Boredabiotech)에 Tris 버퍼(0.1M Tris, pH 8.5)를 20cm × 30cm 규격 당 35ml 분주 후, buffer가 충분히 흡수되도록 골고루 펴 준 뒤, 실온에서 하루 동안 건조시킨다.
실시예 3-7: 검사선(capture line)과 대조선(control line) 제작
니트로셀룰로오스 막(10μm, Nupore Filtration Systems PvT) 위에 SVCV 항체(1~2mg/ml, 검사선에 사용)와 goat anti-mouse IgG(2.5mg/ml, 대조선에 사용)를 biodot micro-volume airjet(Arista Biologicals)로 각각 5mm 간격으로 분주 후 건조시켰다.
실시예 3-8: 진단 키트의 카세트 조립
제작된 구성품들을 플라스틱 지지막 위에 샘플패드, 골드패드, 니트로셀룰로오스 막, 흡수패드를 붙여서 제작하였다. 각각의 패드는 시료 용액이 끊기지 않고 흐를 수 있도록 각각의 끝부분이 서로 2mm씩 겹치도록 제작하였다. 제작된 키트는 폭 4mm 간격으로 절단하여 플라스틱 카세트에 조립 후 사용 전까지 제습함에 넣어 보관하였다.
실시예 3-9: 진단 키트의 특이도 조사
연쇄구균 POCT 키트의 특이성은 건강한 우럭 그리고 참돔의 간, 비장, 신장 그리고 혈액을 채취하여 각 조직을 마쇄 후 마쇄액들을 샘플패드에 적용에 의해 평가하였다.
한편, 채취된 조직들은 TSA 또는 TCBS agar를 사용하여 세균도말하고 DNA를 추출하여 연쇄구균들의 특이 primer sets을 사용한 PCR에 의해 어류 병원체에 대한 감염여부를 조사하였다.
조직 마쇄액의 세균도말에서 세균 검출을 할 수 없을 경우 105CFU/ml을 준비하여 100μl 연쇄구균 부유액에 조직 마쇄액 100μl, Buffer 10 800μl를 혼합하여, 제작된 POCT 키트의 샘플패드에 혼합물 200μl 적용하여 특이성을 조사하였다. POCT 키트에서 특이성 판정은 조직 마쇄액 주입 후 15분 뒤에 결과를 확인하였으며, 밴드가 2개가 나오면 양성, 1개가 나오면 음성으로 하였다.
한편, 연쇄구균 POCT 키트의 특이성은 전북대학교에 어류 질병 진단을 위해 의뢰된 어류 샘플들에서 수행하였다. 의뢰된 개체들은 넙치, 참돔 및 숭어이며, 각 어종들의 내부 장기로부터 세균 분리 및 세균 동정은 PCR 및 16s rRNA sequencing에 의해 수행되었다. 의뢰된 개체들의 조직 마쇄물은 POCT 키트에 적용하였으며, 본 발명에 따른 POCT 키트의 특이성은 PCR 및 세균 배양 후 동정 결과의 비교에 의해 수행되었다.
실시예 3-10: 진단 키트의 민감도 조사
연쇄구균 POCT 키트의 민감도 평가는 S. iniae 및 L. garvieae를 TSB에 배양 후 수행하였다. 배양된 각 세균들은 PBS에 3회 세척 후 PBS 1ml에 부유하였다. 그 후 OD를 측정하였으며, 측정된 부유액은 10배 다단계희석하여 각 희석배수별로 준비하여 제작된 POCT 키트의 샘플패드에 적용하였다.
키트의 민감성 비교를 위해 세균 배양에 의한 CFU를 측정하여, POCT 키트의 검출한계를 조사하였다. 한편, POCT 키트의 민감성 비교는 PCR에 의해 수행되었다. L. garvieae를 위한 PCR은 하기 표 2에 정리하였다.
L. garviae의 검출을 위한 primer 및 PCR 조건
Pathogen Primer PCR conditions Reference
Name sequence(5'-3')
L. garvieae pLG-1 CATAACAATGAGAATCGC
(서열번호 1)		 94℃ for 2 min; 92℃ for 1 min, 55℃ for 1 min, 72℃ for 90 s for 30 cycles Mata et al., Vet Microbiol. 2004 Jun 21;101(2):109-16
pLG-2 GCACCCTCGCGGGTTG
(서열번호 2)
실시예 3-11: 교차반응성 및 재현성 조사
연쇄구균 POCT 키트의 교차반응성 및 재현성은 하기 표 3에 목록화된 어류 주요 병원체들에 대해 조사하였다.
연쇄구균 POCT 키트의 교차반응성 조사를 위한 세균 목록
Bacteria Host
L. garvieae 6019 Mullet
L. garvieae MK2 Mullet
L. garvieae R3 Rock fish
L. garvieae F12 Flounder
L. garvieae MD5 Mullet
L. garvieae R5 Rock fish
S. iniae 4433 Rock fish
S. parauberis jm150 Flounder
V. harveyi 139k Flounder
V. harveyi 138s Flounder
V. parahaemolyticus p1 Shrimp
Enterococcus sp . W12 Chicken
V. anguillarum k189 Flounder
E. tarda Y011 Flounder
A. salmonicida R41 Rock fish
각 세균들은 TSB에 배양 후 OD 1.0으로 적정한 후, POCT 키트의 샘플패드에 주입하였다. POCT 키트에서 특이성 판정은 각 세균 부유액 100μl 주입 후 15분 뒤에 결과를 확인하였으며, 밴드가 2개가 나오면 양성, 1개가 나오면 음성으로 하였다.
키트의 재현성을 조사하기 위해, 3주 간격으로 3개의 다른 lot(lot 1의 제작 시기: 10월 초, lot 2: 10월 말, lot 3: 11월 중순)의 키트를 제작하였다. 다양한 어류 병원체를 배양하여 PBS에 부유 후, Buffer 10과 혼합하여 키트에 각각 100μl씩 떨어트린 후, 15분 뒤에 결과를 확인하였다.
실시예 4: 면역진단법의 현장 적용
실시예 4-1: 연쇄구균 인위감염 후 POCT를 사용한 검사
L. garvieae를 배양한 후 조피볼락의 복강에 인위감염 시킨 후, 폐사하거나 일정 시간이 경과한 후에 미생물 배양으로 신장의 세균 수를 분석하고, PCR법과 POCT 검사법을 비교하였다.
실시예 4-2: 연쇄구균병 면역진단법의 현장 적용
5월에 전남 여수 가두리 양식장 4개소에서 조피볼락, 참돔, 숭어 등 28마리를 대상으로 기존 세균 배양법과 면역진단법을 비교하였다. 7월에 경남 남해·하동 가두리 5개소 양식장에서 조피볼락, 숭어 등 25마리를 대상으로 기존 검사법(세균 배양법, PCR법)과 개발 면역진단법을 비교하였다.
2. 결과
실시예 5: L. garvieae 의 MAb 제작
실시예 5-1: Insoluble protein의 분리
L. garvieae를 bead beating하여 whole cell lysates를 추출한 후, 원심분리하여 unbroken cell과 cell debris를 제거하고, 상층액은 다시 초고속 원심분리하여 상층액(soluble proteins)과 침전물(insoluble protein)로 구분하였다. L. garvieae의 whole cell lysate, soluble protein 및 insoluble protein을 사용하여 SDS-PAGE를 실시한 결과, whole cell lysate와 soluble protein은 SDS-PAGE에서 유사한 형태를 보였으나, insoluble protein과는 약간의 차이를 보였다(도 1). Insoluble protein에서는 두 세균 모두 분자량 약 41kDa과 50kDa에서 진한 밴드들이 관찰되었다.
실시예 5-2: L. garvieae 면역
L. garvieae로부터 추출한 insoluble proteins을 마우스에 면역시킨 후, 혈청을 취하여 동일한 항원에 대한 항체가를 ELISA로 측정하였다. 그 결과, L. garvieae의 항원에 대해 혈청 1:1,000 희석배수에서도 OD 값이 1 이상을 보여, 단클론성 항체를 생산하기 위한 fusion 단계를 수행하였다(도 2).
실시예 5-3: Hybridoma 제작, 스크리닝 및 클로닝
L. garvieae(insoluble proteins)를 면역시킨 마우스의 비장 조직을 얻어 골수종(myeloma) 세포와 PEG(polyethylene glycol)로 융합시켜 hybridoma를 제작하였다(도 3).
Hybridoma로부터 생성되는 항체를 ELISA로 스크리닝한 결과, L. garvieae에 대해서는 20개에서 양성반응을 보였다. 제작된 hybridoma를 ELISA로 3회 클로닝한 결과, L. garviae를 위한 8개의 clone을 선별할 수 있었다. 이후의 실험은 상기 8개의 clone으로부터 얻은 항체를 사용하여 진행하였다(L. garviae에 대한 항체 1-8(MAb 1 내지 MAb 8로 약칭)).
L. garvieae에 대한 MAb 1-8은 L. garvieae의 insoluble protein과 whole cell lysates 모두에 반응하였고(OD 값: 1.0-1.6), insoluble protein 보다는 whole cell lysate에서 더 높은 OD 값을 보였다(도 4).
실시예 5-4: MAb의 항원 인식 부위 분석
8개 MAb(L. garviae의 insoluble protein으로 제작한 항체)의 L. garviae 인식 부위를 조사하기 위해, L. garviae의 whole cell lysate, soluble protein 및 insoluble protein을 사용하여 Western blot을 실시하였다. 8개의 MAb는 18-35kDa의 분자량을 강하게 인식하였다(도 5).
실시예 5-5: MAb의 민감도 분석
8개 MAb(L. garviae의 insoluble protein으로 제작한 항체)의 민감도를 조사하기 위해, L. garviae의 희석액을 제작한 후 ELISA를 실시하였다. 8개의 MAb는 107 CFU/㎖에서 1 이상의 OD 값을 보였고, 105 CFU/㎖에서 약 0.2의 OD 값을 보였다. 104 CFU/㎖ 이하의 세균 농도에서는 0.1 이하의 OD 값이 관찰되었다(도 6).
실시예 5-6: MAb의 특이도 분석
8개 MAb(L. garviae의 insoluble protein으로 제작한 항체)의 특이도를 조사하기 위해, L. gavieae , S. iniae , S. parauberis 및 E. tarda의 whole cell을 항원으로 한 ELISA를 실시하였다. 8개의 MAb는 L. gavieae의 whole cell과 강하게 반응하였으나(OD 값: 1.1 이상), S. iniae , S. parauberis 및 E. tarda와는 반응하지 않았다(OD 값: 0.1 이하) (도 7).
실시예 6: 연쇄구균 항체 생산을 위한 hybridoma cell의 선별
선별된 hybridoma cell들로부터 생산되는 배양액을 이용하여, ELISA 및 Immunoblot assay에 의해 MAbs의 특이성 및 재현성을 재규명하였다.
실시예 6-1: Anti- L. garvieae MAbs을 생산하는 hybridoma cell의 선별
2종의 hybridoma cell(54F9, 74C10)로부터 생산되는 두 Anti-L. garvieae MAbs는 동종의 insoluble antigen 중 15~20kDa의 하나의 항원을 인식하는 항체인 반면, 1H4는 20~25kDa의 하나의 insoluble antigen을 인식하는 항체이다. 마우스 접종 전 hybridoma cell들의 배양 후 배양액을 수집하여, ELISA와 immunoblot assay를 통해 동일 항원 인식 및 항원과의 반응성을 재 평가하였다.
실시예 6-2: ELISA
3종의 hybridoma cell(74C10, 1H4, 54F9)로부터 생산된 MAb를 이용하여 다양한 어류 유래 세균들과 동종의 whole cell lysates, insoluble proitein 및 soluble protein들과 함께 ELISA를 수행하였다. 세 MAbs는 L. garviaea의 whole cell lysates 및 insoluble protein의 항원과 높은 반응성을 보인 반면, 동종의 soluble protein 및 이종성 세균들과는 낮은 반응성을 보였다(도 8).
실시예 6-3: Immunoblot assay
3종의 hybridoma cell(74C10, 1H4, 54F9)로부터 생산된 MAb를, 어류 질병 유래 세균(V. harveyi, V. parahaemolyticus, E. tarda, S. parauberis, S. iniae) 및 L. garvieae로 SDS-PAGE 후, immunoblot assay를 수행하였다. 세 MAbs는 전과 동일한 분자량을 가진 L. garvieae antigen들을 인식하였으나, 다른 어류 세균들에 대해서는 전혀 반응하지 않았다. 따라서, 세 hybridoma cell들을 재배양 후, 그로부터 생산된 항체는 동일한 특이성 및 재현성을 보임을 확인하였으며, 마우스 접종을 위해 준비되었다.
실시예 7: 연쇄구균 POCT 키트의 개발
실시예 7-1: 마우스로부터 Anti- L. garvieae Abs의 정제
(1) 54F9 clone으로부터 항체의 생산 및 정제
54F9 hybridoma cell을 마우스 복강에 접종하고 복수를 채취 후, protein G column으로 정제하여 elution 1~5의 fraction들을 수집할 수 있었다. 각 fraction들은 PBS로 투석 및 농축하였으며, SDS-PAGE를 수행하였다. SDS-PAGE 분석 결과, 대략 53kDa 및 25kDa의 밴드들 확인할 수 있었고, 이 밴드는 각각 Ig의 heavy chain과 light chain인 것으로 고려된다(도 9).
Elution 1~3의 fraction들에서 다량의 정제된 항체들이 SDS-PAGE 수행 결과에서 확인되어, 3개의 fraction들을 pooling하여 SDS-PAGE로 항체를 확인하고, Image J 분석으로 정제된 항체의 purity를 확인하였다. 정제된 항체의 순도는 대략 96%였으며, 정제된 단백질의 양은 14ml(2.80mg/ml)였다(도 10).
(2) 74C10 clone으로부터 항체의 생산 및 정제
74C10 hybridoma cell을 마우스 복강에 접종하고 복수를 채취하여, 항체 정제를 시도하였다. Protein G column을 사용하여 정제한 결과, elution 2에서 다량의 항체를 정제할 수 있었다(도 11). 정제된 항체는 PBS로 투석 및 농축을 하였고, SDS-PAGE로 항체를 확인하고, Image J 분석으로 정제된 항체의 purity를 확인하였다. 그 결과, SDS-PAGE 분석에서 대략 53kDa 및 25kDa의 밴드들 확인할 수 있었고, 이 밴드는 각각 Ig의 heavy chain 그리고 light chain인 것으로 고려된다. 정제된 항체의 순도는 대략 99%인 것을 Image J 분석을 통해 알 수 있었다(도 12).
(3) 11H4 clone으로부터 항체의 생산 및 정제
11H4 hybridoma cell을 마우스 복강에 접종하고 복수를 채취하여 항체 정제를 시도하였다. Protein G column을 사용하여 정제한 결과, elution 4, 5, 6 fraction들에서 항체를 정제할 수 있었으나(도 13), 정제된 항체의 SDS-PAGE 결과, 항체의 heavy chain 및 light chain의 밴드의 intensity는 매우 낮았다. PBS로 투석 및 농축 후 SDS-PAGE로 항체를 확인하고, Image J 분석으로 purity를 확인하였다. Purity는 98.5%였으며, SDS-PAGE 결과는 정제 후 그것과 유사한 두 밴드의 intensity를 보였다(도 14).
낮은 11H4 hybridoma cell로부터의 항체 정제율은 클론으로부터 생산되는 항체의 isotype가 IgA로서, protein A 및 portein G affinity column에 대한 낮은 친화력 때문인 것으로 사료된다.
실시예 7-2: 정제된 anti- L. garvieae Abs의 ELISA에 의한 반응성 조사
L. garvieae의 세 항체에 대한 반응성을 조사하였다. 74C10은 50,000배 희석, 54F9는 10,000배 희석 배율에서 1.0 이상의 흡광도를 보였다. 그러나, 1H4의 경우 100배 희석 배율에서 0.5 정도의 흡광도를 보여 L. garvieae의 항원에 대해 두 항체에 비해 낮은 반응성을 보이는 것을 확인하였다(도 15).
실시예 7-3: 정제된 anti- L. garvieae Abs의 immunoblot assay에 의한 반응성 조사
L. garvieae의 세 항체들은 동종의 항원에 대한 특이성을 보였고, 74C10의 경우 대략 25kDa, 1H4는 20~25kDa의 하나의 항원, 54F9는 15~20kDa의 항원을 인식하여 단클론성 항체의 스크리닝시 인식된 항원과 동일한 양상을 보였다(도 16).
실시예 7-4: L. garvieae POCT 키트 제작을 위한 항체 선별
3종의 L. garvieae 항체(74C10, 54F9, 1H4)를 이용하여 골드입자 축합 항체 및 비축합 항체와의 pairing test를 수행한 결과, 74C10-74C10 항체 조합에서 강한 양성반응을 보였지만. 나머지 항체 조합 모두에서는 음성반응을 보였다(표 4).
3종의 항체의 L. garvieae 검출을 위한 pairing test
Conjugation
Capture antibody Antibody No.(1mg/ml)
74C10 54F9 1H4
Antibody No.
(1mg/ml)		 74C10 ++ - -
54F9 - - -
1H4 - - -
따라서, POCT 진단 키트의 특이도 및 민감도 시험은 74C10-74C10 항체 조합으로 제작한 키트로 수행하였다.
상기 74C10 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma) 세포주를 KCTC에 2019.12.20자로 기탁하였다(기탁번호 KCTC14089BP).
실시예 7-5: L. garvieae POCT 키트의 민감도
제작된 POCT 키트의 민감도를 조사는 L. garvieae를 TSA에 배양하여 PBS에 세척 후, OD 0.92 및 OD 0.76의 두 부유액으로 수행하였다. 두 부유액의 colony count를 수행한 결과, OD 0.92는 4.5×107 CFU/ml, OD 0.76 부유액은 1.3×107 CFU/ml이었다. 각 부유액은 10배 다단계 희석하였고, 각 희석배수 별 100μl를 채취하여 POCT 키트의 샘플패드에 적용하였다.
한편, 본 발명에 따른 L. garvieae POCT 진단 키트와의 민감성 비교를 위해, Mata et al., Vet Microbiol. 2004 Jun 21;101(2):109-16에 의해 고안된 L. garvieae의 특이 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 수행을 위해 DNA는 두 가지 방법에 의해 준비하였다. 한 방법은 4.5×107 CFU/ml의 PBS로 부유한 원액으로부터 DNA를 추출 후 10배 다단계희석을 하였고, 다른 한 방법은 4.5×107 CFU/ml(OD 0.92) 및 1.3×107 CFU/ml(OD 0.76)의 L. garvieae를 PBS로 부유한 후 10배 단계희석하여 각 희석단계별로 DNA를 추출하였다.
세균 희석액으로부터 DNA를 추출 후 PCR의 민감성을 조사한 결과, OD 0.92 부유액에서는 104 CFU/100μl에서 강한 증폭산물을 확인할 수 있었으나, 103 CFU/100μl에서는 미약한 밴드를 확인할 수 있었다. 그리고, OD 0.76의 부유액은 105 CFU/100μl까지 강한 양성반응을 나타냈으나, 104 CFU/100μl에서는 미약한 양성반응이 관찰되었다(도 17). 따라서, 세균 희석액으로부터 PCR 민감성은 103 ~104 CFU/100μl임을 알 수 있었다. 4.5×107 CFU/ml의 PBS 부유액으로부터 DNA를 추출 후 10배 다단계희석한 DNA로부터 PCR을 수행한 결과, 10-4 희석배수까지 양성반응을 보여, CFU로 환산 시 102 CFU/100μl의 검출 한계를 보였다(도 18).
제작된 POCT 키트의 민감성을 확인하기 위해, 1.3×107 CFU/ml(OD 0.76)의 PBS 부유액을 10배 다단계 희석하여 샘플패드에 적용한 결과, 104 CFU/100μl에서 양성반응을 보였다. 그러나, 반응의 강도는 세균의 농도에 의존한다. 예를 들어 105 CFU/100μl 이상의 세균 농도에서는 5분 이내에 강한 양성반응을 보였다. 그러나, 104 CFU/100μl를 주입했을 경우 10분 후에 양성반응을 보였으며, 105 CFU/100μl에 낮은 양성 밴드를 보였다.
L. garvieae-free PBS를 주입했을 경우 음성반응을 보여 어떠한 위양성반응을 관찰할 수 없었다. 제작된 POCT 키트의 민감성을 확인하기 위해, 4.5×107 CFU/ml(OD 0.92)의 PBS 부유액을 10배 다단계 희석하여 샘플패드에 적용한 결과, 104 CFU/100ul에서 양성반응을 보였다. 103 CFU 이하 및 L. garvieae-free PBS를 적용 시 20분 동안의 반응에서도 음성반응을 보였다.
본 발명에 따른 POCT 진단 키트 및 PCR의 민감도 비교에서, L. garvieae POCT 키트는 PCR에 비해 10배 정도의 낮은 민감성을 보였다.
한편, 106 CFU로부터 DNA를 추출(DNA Con., 4ng/μl) 후, 10배 다단계 희석하여 PCR을 수행하였을 경우, 103 CFU에 해당하는 4pg/μl까지 강한 양성반응을 보이지만, 102 CFU에 해당하는 0.4pg/μl에서는 약한 양성반응을 보였고, 그 이하의 희석배수에서는 음성반응을 보였다(표 5).
L. garvieae POCT 키트와 PCR의 민감성 비교
CFU/100μl POCT kit PCR by dilution
DNA Bacterium
106 + + +
105 + + +
104 + + +
103 - + +
102 - + -
101 - - -
두 유전자 추출 방법에 따른 민감성의 차이는 유전자 추출 과정에서의 DNA 소실에 의한 것으로 추측된다. 본 발명에 따른 POCT 키트의 민감성은 PCR에 비해 10~100배 정도의 민감성 차이를 보인다. PCR 진단법은 실험실 내 신속한 진단 및 치료에 어려움이 있고, 고가의 장비가 필요하다는 등의 단점이 있으므로, 현장 적용이 가능한 POCT 키트의 분명한 장점이 대두된다.
실시예 7-6: 연쇄구균 POCT 키트의 교차반응성
9종의 15개 균주를 활용하여 제작된 L. garvieae 진단 키트에서 특이도를 조사하였다. 모든 균주들은 TSB에서 105 CFU/ml로 배양하여 PBS로 부유하여 시험에 사용하였다.
그 결과, 제작된 진단 키트는 L. garvieae의 6개 균주에서만 양성반응을 보였다. 목적 세균의 반응은 2분 이내에 진단 키트에서 양성반응을 보였다. 그러나, L . garvieae를 제외한 이종성 세균 9종의 균주에서는 20분 반응시간에도 음성반응을 보였다(표 6). 또한, 숭어, 우럭, 넙치 등의 숙주와 상관없이 모두 양성반응을 보였다.
L. garvieae POCT 키트의 특이성
Bacteria Host POCT kit for L. garvieae
L. garvieae 6019 Mullet +
L. garvieae MK2 Mullet +
L. garvieae R3 Rock fish +
L. garvieae F12 Flounder +
L. garvieae MD5 Mullet +
L. garvieae R5 Rock fish +
S. iniae 4433 Rock Fish -
S. parauberis jm150 Flounder -
V. harveyi 139k Flounder -
V. harveyi 138s Flounder -
V. parahaemolyticus p1 Shrimp -
Enterococcus sp . W12 Chicken -
V. anguillarum k189 Flounder -
E. tarda Y011 Flounder -
A. salmonicida R41 Rock fish -
결과적으로, 본 발명에서 제작된 L. garvieae POCT 키트는 숙주 기원과 무관하게 5분 이내에서 L. garvieae의 strains에 대해 양성반응을 보인 반면, 다른 균종에 대해서는 음성반응을 보여, 특이도 및 신속성이 증명되었다.
실시예 7-7: L. garvieae POCT 키트의 재현성
제조 일자가 다른 3개의 lot의 키트를 준비하였다. L. garvieae(104~102 CFU/100μl), S. iniae 및 S. parauberis의 whole cell로부터 제작된 진단 키트의 특이성을 평가하였다. 그 결과, POCT 키트는 L. garvieae 항원에 대해 특이적인 양성반응을 보였으며, 검출 한계는 103 CFU/100μl로 동일한 결과를 보였다.
한편, 어류 연쇄구균병의 주요 원인체인 S. iniae 및 S. parauberis의 whole cell을 샘플패드에 적용 시, 모두 음성반응을 보였다. 따라서, 제작된 키트의 특이성이 인정되므로 반복적 생산에 의한 재현성이 입증되었다.
실시예 7-8: L. garvieae POCT 키트의 특이도
L. garvieae POCT 키트의 특이도를 조사하기 위하여 건강한 참돔 및 우럭의 간, 신장, 비장, 혈액을 준비하여 Buffer 10에 마쇄 또는 부유하여 POCT 키트에 적용하였다. 일부 조직들은 마쇄하여 TSA배지에 도말하여 세균 감염 유무를 확인하였다.
그 결과, TSA 배지에서는 어떠한 세균도 배양되지 않았으며, POCT 키트 사용 시 모든 조직에서 음성반응을 보였다. 우럭 및 참돔 조직에서 L. garvieae 감염을 확인할 수 없어 104 CFU/ml의 L. garvieae 부유액에 조직(100g)을 첨가하여 Buffer 10과 함께 마쇄하여 마쇄액 200μl를 샘플 패드에 주입하였다. 그 결과, L. garvieae 부유액이 첨가하였을 경우 POCT 키트로 양성반응을 관찰할 수 있었다.
한편, 연쇄구균병이 의심되는 어류의 감염 조직을 수집하고, 수집된 조직으로 본 발명에 따른 POCT 키트의 특이성을 조사하였다. 대조실험으로는 PCR 및 세균배양법을 실시하였다(표 7).
L. garvieae 진단을 위한 POCT 키트, PCR 및 세균배양 결과의 비교
Fish Tissue Identification
after culture1 		Diagnosis from fish organs
PCR Culture POCT
Mullet Kidney L. garvieae + + +
Sea bream Kidney - - - +
Flounder Liver L. garvieae + + +
Flounder Liver L. garvieae - + +
Flounder Liver L. garvieae - + +
Flounder Liver L. garvieae + + +
Flounder Liver - - - +
Flounder Liver - - - +
Flounder Liver S. iniae - - -
Flounder Liver S. parauberis - - -
Flounder Liver - - - -
Flounder Liver - - - -
Flounder Liver S. parauberis - - -
Flounder Spleen - - - -
Flounder Spleen L. garvieae - + -
Flounder Spleen L. garvieae - + -
Positivity (%) 23.5 43.8 50.0
1 세균 배양 후 dominant colony들에 대한 다양한 어류 병원체들의 특이 primer를 활용하여 PCR에 의한 세균 동정
POCT 키트로 병어의 조직(넙치 14 샘플, 숭어 1 샘플, 참돔 1 샘플)에 대한 L. garvieae 감염 여부를 확인한 결과, 8개 샘플에서 양성반응을 보였으며 반응시간은 10분 이내였다. 양성샘플은 숭어 및 참돔 각 1 샘플이었으며, 넙치의 경우 6 샘플이였다. 따라서, 본 발명에 따른 POCT 키트의 양성율은 52.9%였다.
PCR을 이용하여 조직으로부터 L. garvieae의 감염 여부를 진단한 결과, 23.5% 양성율을 보였으며, POCT 진단 결과와 비교하였을 때, 5개(불일치율 29.4%)의 조직 샘플에서 상이한 결과를 확인할 수 있었다.
조직으로부터 세균배양을 확인한 결과, L. garvieae는 7 샘플(양성율 43.8%)에서 배양할 수 있었다. 세균배양 결과와 PCR 및 POCT 결과들을 비교한 결과, 불일치율은 각각 23.5%(불일치 샘플 3개), 29.4%(불일치 샘플 5개)였다.
상기의 결과들에 의해, 본 발명에서 개발된 L. garvieae POCT 진단 키트는 세균배양과 유사한 검출율을 보임을 확인하였다. 5개의 조직 샘플에서 두 진단법의 불일치는 조직 샘플의 우발적 오염 또는 L. garvieae colony의 잘못된 선별에 기인된 것으로 추측된다. 또한, POCT 키트는 PCR에 비해 더 높은 양성율을 보였으며, 두 진단법 사이에서 불일치가 5개의 샘플에서 관찰되었으나, 이는 핵산 추출과정에서 DNA의 소실에 기인된 것으로 판단된다.
실시예 7-9: 연쇄구균 인위감염 후 POCT를 사용한 검사
L. garvieae를 조피볼락에 인위감염 시킨 후, 미생물 배양으로 세균 수를 분석하고, PCR법과 POCT 검사법을 비교하였다. L. garvieae에 감염된 조피볼락은 복수, 안구소실, 간충혈 등의 증상을 나타내었고, 신장에서 7.5×106 내지 1.1×1010 CFU/g의 세균이 분리되었다. PCR 및 POCT 키트 모두에서 양성을 나타내어 일치된 결과를 나타내었다. 폐사한 시험어는 신장에서 1.4×108 내지 3.3×109 CFU/g의 세균이 분리되었고, PCR 및 POCT 키트 모두에서 양성을 나타내었다. 시간이 경과하여도 증상이 나타나지 않는 시험어는 인위감염 6일 이후에 검사하였으며, 세균이 분리되지 않았고, PCR에서 음성, POCT 키트에서 음성 결과를 나타내었다(표 8).
인위감염 rock fish(L. garvieae 및 S. iniae)에 대한 세균배양법, 면역진단 키트, 분자진단 키트를 이용한 L. garvieae 감염 검사 결과 비교
cultivation method PCR immunodiagnostic kit
Positive negative Positive negative Positive negative
L. garvieae 22 0 22 0 22 0
실시예 7-10: 연쇄구균병 면역진단법의 현장 적용
5월 전남 여수 가두리 양식장 4개소에서 조피볼락, 참돔, 숭어 등 28마리를 대상으로 세균배양법과 면역진단법을 비교하였다. 연쇄구균은 분리되지 않았으며, Vibrio spp.와 Photobacterium spp. 등이 분리되었고, POCT 키트에서 음성이었다.
7월 경남 남해·하동 가두리 5개소 양식장에서 조피볼락, 숭어 등 25마리를 대상으로 세균배양법, PCR법과 개발된 면역진단법을 비교하였다. 숭어 13마리에서 L. garvieae가 분리되었고, PCR에서 양성, POCT 키트에서 양성으로 검사법이 일치하였으며, 조피볼락에서 L. garvieae가 분리되지 않았고, PCR에서 음성, POCT 키트에서 음성으로 검사법이 일치하였다(표 9).
세균배양법, PCR 및 POCT 진단 키트에 의한 넙치의 연쇄구균병 진단 결과
No. fish species (No.) Major symptom cultivation method PCR method POCT method
L. garvieae L. garvieae
YS 1 sea bream(n=6) Abdominal hyperemia Vibrio spp.
Photobacterium spp.		 - -
2 mullet(n=8) - Vibrio spp. - -
3 sea bream(n=9) Hyperemia Vibrio spp.
Photobacterium spp . 		- -
4 rockfish(n=5) Snout Vibrio spp. - -
HD 1 mullet(n=6) Abdominal·Eye congestion, hepatorrhagia L. garvieae , Vibrio spp. + +
2 mullet(n=6) green liver L. garvieae , Vibrio spp. + +
3 mullet(n=1) - L. garvieae , Vibrio spp. + +
NH 1 rockfish(n=6) - Vibrio spp. - -
2 rockfish(n=6) - Vibrio spp. - -
결과적으로, 본 발명에서 제작된 키트는 연쇄구균병에 대한 현장 검사용 신속진단 키트로서 사용될 수 있으며, 키트의 성능을 정리하면 하기 표 10과 같다.
본 발명에 따른 POCT 키트의 성능
성능 L. garvieae
검사 시간 15분
민감도 103 CFU/100μl 이상
특이도 L. garvieae에만 반응
(다른 어류 병원체: 음성, 어류 조직: 음성)
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC14089BP 20191220
<110> Republic of Korea (National Fisheries Research and Development Institute) <120> Comosition for Detecting Lactococcus garvieae Comprising Monoclonal Antibody Specific for Lactococcus garvieae <130> P20-B284 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cataacaatg agaatcgc 18 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gcaccctcgc gggttg 16

Claims (6)

  1. 락토코커스 가비에(Lactococcus garvieae) 항원 포획을 위한 1차 항체, 검출표지, 상기 검출표지와 결합하는 2차 항체 및 상기 검출표지의 활성 측정용 시약을 함유하는 락토코커스 가비에(Lactococcus garvieae) 검출용 조성물에 있어서,
    상기 1차 항체 및 2차 항체는 기탁번호 KCTC14089BP로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해서 생산되는 단클론 항체 74C10인 것을 특징으로 하는, 락토코커스 가비에(Lactococcus garvieae) 검출용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 검출표지는 비오틴(biotin), HRP(horseradish peroxidase), 염기성탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(colloid gold), FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocya nate) 및 RITC(rhodamine-B-isothiocyanate)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항의 조성물을 포함하는 락토코커스 가비에(Lactococcus garvieae) 검출용 키트.
  4. 락토코커스 가비에(Lactococcus garvieae)에 대하여 특이적인 면역반응성을 나타내는 단클론 항체 74C10을 생산하는 하이브리도마 세포주(KCTC14089BP).
  5. 제4항의 하이브리도마 세포주(KCTC14089BP)를 배양하여 생산된 항체를 수득하는 단계를 포함하는 락토코커스 가비에(Lactococcus garvieae) 특이적 단클론 항체 74C10의 제조방법.
  6. 제4항의 하이브리도마 세포주(KCTC14089BP)에 의해 생산되고, 락토코커스 가비에(Lactococcus garvieae)에 대하여 특이적인 면역반응성을 나타내는 단클론 항체 74C10.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Sung-hyun Kang et al, Fish & Shellfish Immunology (2006), vol 20, pp 295-304. *
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