KR20190138609A - 돌돔의 면역글로불린 m에 특이적인 단클론 항체 및 이의 용도 - Google Patents

돌돔의 면역글로불린 m에 특이적인 단클론 항체 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20190138609A
KR20190138609A KR1020190066869A KR20190066869A KR20190138609A KR 20190138609 A KR20190138609 A KR 20190138609A KR 1020190066869 A KR1020190066869 A KR 1020190066869A KR 20190066869 A KR20190066869 A KR 20190066869A KR 20190138609 A KR20190138609 A KR 20190138609A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
monoclonal antibody
specific
igm
antibody
cell line
Prior art date
Application number
KR1020190066869A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102163241B1 (ko
Inventor
김위식
오명주
Original Assignee
전남대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 전남대학교산학협력단 filed Critical 전남대학교산학협력단
Publication of KR20190138609A publication Critical patent/KR20190138609A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102163241B1 publication Critical patent/KR102163241B1/ko

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12Fused cells, e.g. hybridomas
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854Immunoglobulins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 돌돔 면역글로불린 M에 특이적을 결합하는 단클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포주에 관한 것으로, 본 발명의 단클론항체는 돌돔 면역글로불린 M에 특이적으로 결합하여, 어류 항원에 대한 돌돔의 특이 항체 검출에 바람직하게 활용될 수 있다

Description

돌돔의 면역글로불린 M에 특이적인 단클론 항체 및 이의 용도{MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST IMMUNOGLOBULIN M OF ROCK BREAM AND USE THEREOF}
본 발명은 돌돔(Oplegnathus fasciatus)의 면역글로빈 M(Immunoglobulin M, Ig M)에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 돌돔의 면역글로빈 M에 특이적인 단클론항체를 생산하는 융합세포주와 여기서 생산되는 단클론항체를 이용하여 돌돔 혈청 속에 들어 있는 항체를 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다.
전 세계적으로 어류 증양식 산업의 활성화와 더불어 어병 (魚病)에 의한 피해가 현저하게 증가하여 양식 산업에 주요 문제로 대두되고 있다. 특히 바이러스성 질병으로 인한 폐사율은 어류 생산량의 약 30% 이상을 차지하고 있을 것으로 추정되나 현재까지 효과적인 치료법이 없기 때문에 질병의 신속진단과 예방대책은 주요한 과제로 남아 있다.
우리나라에서는 수산생물전염병을 체계적으로 관리하고 질병에 의한 피해를 최소화하기 위하여, 2008년부터 수산생물질병관리법을 시행하여 21개의 전염병을 대상으로 방역과 검역을 실시하고 있으며, 이들 전염병은 위험도에 따라 중요도 리스트 및 질병 발생 상황별 방역지침을 구분하여 살처분, 격리, 이동제한의 단계적 방역조치를 수행하고 있다.
이들 방역과 검역의 대상이 되는 수산생물질병 중, 바이러스 질병이 67%를 차지하고 있는데, 우리나라에서 검역과 방역에 사용되고 있는 바이러스전염병의 진단법은 주로 바이러스 게놈을 표적으로 한 PCR법을 중심으로 행하여지고 있다. 또한 어류주화세포를 이용한 분리배양법과 병리조직학적 방법을 병행하기도 하는데, 어류의 경우, 주로 PCR법을 사용하며, 패류나 갑각류는 PCR법과 병리조직학적 방법을 병용하고 있다. 그러나 면역학적 방법은 거의 사용하지 않고 있는데, 이는 아직 병원바이러스에 대한 특이항체를 보유하고 있지 않기 때문이다.
PCR에 의한 진단법은 신속진단이 가능하므로 바이러스 검출방법으로 세계적으로 널리 사용되고 있으나, 외국으로부터 유입되는 수산물의 검역, 양식장에서의 역학조사, 병성감정 및 주기적으로 어체내에서 바이러스의 감염상태를 파악하는 등의 방역에서 사용하는데 부적합한 점이 많아 일반적으로 현장에서 적용하기에는 한계가 있다. 즉, PCR법은 병원체를 직접 검출하는 방법이기 때문에 비단잉어와 같이 상품가치가 높은 수산생물일지라도 죽여야만 검사가 가능하다. 또한 한번에 다수의 샘플처리가 어려우며, 다수의 샘플 검사에 많은 비용이 소요되는 단점을 갖고 있다. 또한 PCR 검사는 유전자를 표적으로 하기 때문에 병원체가 불활화 되어도 유전자가 검출되며, 양식어에 2개 이상의 바이러스가 혼합 감염되어 있을 경우, 정확한 진단이 어렵다.
이에 비하여 면역학적 진단법은 항체를 이용하여 병원체 감염을 진단하는 방법이다. 면역학적 진단법에는 병원체의 특이항체를 이용하여 병원체를 직접적으로 검출하는 방법과, 혈중에 존재하는 특이항체를 검출함으로써 병원체 감염을 진단하는 간접적 방법이 있다.
직접법에 의한 면역학적 진단법은 병원체를 직접 검출하는 방법으로, 6시간 이내에 질병 검사가 가능한 신속성을 갖고 있다. 또한 민감도와 특이성이 매우 높으며, 어체 내 병원체 추적이 용이하며, 감염세포 및 감염정도의 확인도 가능하다. 병원체에 대한 특이 항체를 안정적으로 생산이 가능하게 되면, 진단 키트 제작을 통해 양식 현장에서도 간단히 질병을 진단할 수 있다.
간접법에 의한 면역학적 진단법은 혈중에 존재하는 특이 항체를 검출하는 방법으로 저렴한 비용으로 다수의 샘플 처리가 가능하고 검출 감도 및 결과에 대한 신뢰성이 높아 사람이나 가축에서는 병원체의 감염 이력의 파악, 건강상태 모니터링, 백신의 효능 검증 등의 목적으로 널리 사용되고 있다.
간접법에 의한 면역학적 진단법은 검사 대상 생물을 죽일 필요가 없으며, 단지 미량의 혈청채취로 진단이 가능하다. 또한 다수의 시료를 저렴한 비용으로 신속 진단이 가능하여 항체검출 ELISA법을 사용하면 한번에 300개 이상의 시료처리가 가능하고, PCR보다 약 100배 저렴한 비용으로 15배 이상의 시료처리가 가능해지게 된다. 뿐만 아니라, 불현성 감염어 진단 및 바이러스 감염 이력 파악이 가능하며, 백신 효능의 판정 및 방역 실시 후, 효능 판정에 유용하다.
이와 같은 간접법에 의한 면역학적 진단법을 사용하기 위하여는 어류의 IgM에 대한 특이항체가 필요하다. 하지만 어류의 항체는 포유류의 IgG와는 달리 친화력이 낮은 IgM으로 구성되어 있는 것으로 알려져 있으며, 어류를 대상으로 항체검출 ELISA를 적용 시, 어류 IgM과 블로킹제와의 비특이적 흡착에 의해 높은 백그라운드가 유발되는 등 포유류에서 나타나지 않는 문제점들이 보고되고 있다. 이때문에 국제수역사무국 (OIE)에서는 재현성이 낮다는 이유로 항체검출 ELISA를 진단법으로서 받아들이지 않고 있다.
그러나, 최근 연구에서는 어류 IgM과 블로킹제와의 비특이적 흡착을 억제하는 방법이 제기되고 있다. 따라서 ELISA 상에서 블로킹제와의 비특이적 흡착이 낮고 어류 IgM에 대한 특이 항체를 생산, 분리하여 수산생물 병원감염 진단에 사용하는 연구가 시급하다.
KR 10-2018-0023250 A KR 10-2018-0023248 A
본 발명은 돌돔 면역글로불린 M에 특이적으로 결합하여, 어류 항원에 대한 돌돔의 특이 항체 검출에 바람직하게 활용될 수 있는 단클론항체, 상기 단클론항체를 생산하는 융합세포주 및 이를 활용하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 돌돔(Oplegnathus fasciatus)의 면역글로빈 M(Immunoglobulin M, Ig M)에 특이적인 단클론항체를 제공하며, 이를 이용하여 어류 항원에 대한 돌돔의 특이 항체 검출에 활용될 수 있는 진단키트 및 진단키트용 조성물을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 돌돔(Oplegnathus fasciatus)의 면역글로빈 M(Immunoglobulin M, Ig M)에 특이적인 단클론항체를 생산하는 융합세포주에 관한 것이다. 상기 융합세포주는 기탁번호 KCLRF-BP-00437의 융합세포주(RB IgM 20A2)일 수 있다. 이러한 측면에서, 본 발명은 구체적으로 돌돔(Oplegnathus fasciatus)의 면역글로빈 M(Immunoglobulin M, Ig M)에 특이적인 단클론항체를 생산하는 기탁번호 KCLRF-BP-00437의 융합세포주(RB IgM 20A2)일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 돌돔(Oplegnathus fasciatus)의 면역글로빈 M(Immunoglobulin M, Ig M)에 특이적인 단클론항체를 생산하는 기탁번호 KCLRF-BP-00437의 융합세포주(RB IgM 20A2)에서 생산되는 단클론 항체에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 돌돔(Oplegnathus fasciatus)의 면역글로빈 M(Immunoglobulin M, Ig M)에 특이적인 단클론항체를 생산하는 기탁번호 KCLRF-BP-00437의 융합세포주(RB IgM 20A2)에서 생산되는 단클론 항체일 수 있다.
본 발명은 또 다른 측면에서, 돌돔의 면역글로빈 M에 특이적인 단클론항체를 포함하는 돌돔의 감염성 질병의 진단용 키트에 관한 것이다.
상세하게, 상기 돌돔의 감염성 질병의 진단용 키트는 돌돔의 면역글로빈 M에 특이적인 단클론항체를 생산하는 융합세포주에 의해 생산되는 돌돔의 면역글로빈 M에 특이적인 단클론항체를 포함하는 것일 수 있다. 상기 융합세포주는 기탁번호 KCLRF-BP-00437의 융합세포주(RB IgM 20A2)일 수 있다.
이러한 측면에서, 본 발명은 바람직하게는 상기 돌돔의 감염성 질병의 진단용 키트는 돌돔의 면역글로빈 M에 특이적인 단클론항체를 생산하는 기탁번호 KCLRF-BP-00437의 융합세포주(RB IgM 20A2)에 의해 생산되는 돌돔의 면역글로빈 M에 특이적인 단클론항체를 포함하는 돌돔의 감염성 질병의 진단용 키트일 수 있다.
상기 진단키트는 항원-항체 복합체를 색채입자결합법으로 검출하는 것, 바람직하게는 기질과 반응하여 발색하는 표지체와 축합된 항체; 및 발색기질을 포함하며, 상기 표지체는 HRP(Horse-radish peroxidase)이며, 상기 발색기질은 TMB(3,3',5,5'-tetramethyl-benzidine)인 것일 수 있다.
또한, 상기 진단키트는 면역크로마토그래피법을 이용한 스트립 타입인 것일 수 있다.
상기 스트립 타입의 진단용 키트는 돌돔의 면역글로빈 M에 특이적인 단클론항체를 생산하는 기탁번호 KCLRF-BP-00437의 융합세포주(RB IgM 20A2)에 의해 생산되는 돌돔의 면역글로빈 M에 특이적인 단클론항체와 금의 접합체, 마우스 면역글로불린에 대하여 특이적인 항체가 코팅된 멤브레인과 피검체 흡습패드가 부착된 스트립을 포함하는 신속 면역크로마토그래피법에 의한 것일 수 있다.
본 발명은 또 다른 측면에서, 어류 항원에 대한 돌돔의 특이 항체 검출용 조성물에 관한 것일 수 있다.
상게하게는, 상기 어류 항원에 대한 돌돔의 특이 항체 검출용 조성물은 돌돔의 면역글로빈 M에 특이적인 단클론항체를 생산하는 기탁번호 KCLRF-BP-00437의 융합세포주(RB IgM 20A2)에 의해 생산되는 단클론항체를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 단클론 항체는 돌돔 면역글로불린 M에 특이적으로 결합하여, 어류 항원에 대한 돌돔의 특이 항체 검출에 바람직하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 정제된 돌돔 IgM의 SDS-PAGE 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, Protein A affinity column을 사용하여 정제한 돌돔 IgM (PA IgM)에 대한 단클론 항체 (20A2)의 isotyping 결과를 나타낸 표이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, PA IgM에 대한 단클론 항체의 반응을 나타낸 ELISA 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 단클론 항체를 이용한 bovine serum albumin (BSA)에 대한 특이 돌돔 항체 검출 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 돌돔의 면역글로빈 M(Ig M)에 대한 감수성 및 특이성이 우수하여 돌돔의 면역글로빈 M(Ig M)에 특이적이므로, 어류 항원에 대한 돌돔의 특이 항체 검출에 바람직한 돌돔의 면역글로빈 M에 특이적인 단클론항체와 이를 생산하는 융합세포주 및 이의 용도에 관한 것이다. 이하, 본 발명을 구체적인 실시예를 들어 자세히 설명한다.
실시예
<실험 방법>
1. 돌돔의 혈청 분리
실험에 사용한 돌돔 혈청은 여수시에 위치한 수산물 도매상으로 구입한 돌돔 (체중: 300 450 g)의 미부정맥으로부터 채혈한 후, 상온에서 30분 1시간 동안 혈액을 응고시킨 후, 6,000 rpm에서 20분간 원심 분리하여 혈청을 분리하였다. 혈청은 실험에 사용하기 전까지 -80℃에 보관하였다.
2. 돌돔 IgM 정제
Protein A resin (GE Healthcare, UK)를 이용하여 돌돔의 IgM을 정제하였다. Protein A column에 PBS (pH 7.4)를 넣어준 후, 돌돔 혈청을 넣고 binding시킨다. PBS로 수세 후, 0.1M citric acid (pH 2.5 3.0)을 첨가하여 돌돔 IgM을 수집한 후, 1M Tris (pH 9.0)로 중화시켰다. 정제된 돌돔 IgM (PA lgM)은 실험에 사용하기 전까지 -80℃에 보관하였다.
3. 돌돔 IgM의 구조 단백질 분석
정제한 돌돔 IgM의 구조 단백질을 분석하기 위해 SDS-PAGE를 실시하였다. 정제된 돌돔 IgM에 동량의 SDS-sample buffer를 첨가하여 100℃에서 3분간 열처리한 후 SDS-PAGE (12% acrylamide separating gel, 4% acrylamide stacking gel)를 실시하였다. 전기영동 후, 겔은 coomassie brilliant blue로 염색하였다.
4. 돌돔 IgM 면역 및 하이브리도마(Hybridoma) 제작
면역은 정제한 돌돔 IgM (PA IgM, 100 ㎍)과 complete Freund’s adjuvant (Gibco, USA)를 동량으로 섞어 100 uL씩 2마리의 BALB/c 마우스의 복강에 1차 접종하였고, 2주 후에 정제된 돌돔 IgM으로 2차 접종하였다. 다시 1주 후에 정제된 돌돔 IgM으로 3차 접종한 후, 마우스로부터 비장을 분리한 후 polyethylene glycol (Roche, Germany)을 사용하여 SP2/0 myeloma 세포와 융합시킨 후 fetal bovine serum이 10% 첨가된 HAT 배지(0.1 mM hypoxanthine, 4×10-4mMaminoprotein,1.6×10-2mMthymidineinDulbecco’smodifiedeaglemedium)로 suspension 시킨 후 96 well plate에 분주하여 37℃로 설정된 CO2배양기에서 배양하였다.
5. 하이브리도마의 스크리닝
돌돔 IgM에 대하여 특이적으로 반응하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 스크리닝하기 위하여 ELISA를 실시하였다. 항원은 정제된 돌돔 IgM을 96 well plate에 well 당 50 ㎕ (250 ng/well)씩 분주하여 4℃에서 overnight 또는 37℃에서 2시간 코팅하였다. 2% skim milk 200 ㎕를 분주하여 블로킹한 후, TBST로 3회 세정하고 1차 항체로서 hybridoma 배양 상등액을 well 당 50 ㎕씩 분주하여 37℃에서 2시간 반응하였다. TBST로 3회 세정한 후 2차 항체로는 HRP가 표식되어 있는 goat anti-mouse IgG를 2% skim milk로 5,000배 희석하여 well 당 50 ㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 반응하였다. TBST로 5회 세정한 후 발색액 (TMB, color reagents)을 well 당 50 ㎕ 분주하여 발색하였다. 각 well에 1N H2SO4를 50 ㎕씩 넣어 발색 반응을 중지시킨 후, microplate photometer로 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
6. 단클론 항체의 Isotyping
제작된 단클론 항체의 heavy 및 light chain의 subtype을 확인하기 위하여 Rapid ELISA mouse mAb isotyping kit (Pierce, USA)를 사용하여 ELISA를 매뉴얼에 따라 실시하였다.
7. ELISA를 이용한 단클론 항체의 반응 조사
PA IgM에 대한 단클론 항체의 반응을 확인하기 위하여 ELISA를 실시하였다. 약 300 ng의 PA IgM을 96 well ELISA microplates (Greiner-bio-one, Germany)에 각각 50 ㎕씩 분주한 후 37℃에서 overnight하여 항원을 코팅하였다. T-PBS (0.05% Tween-20/PBS (v/v))로 3회 세정하였고 5% skim milk를 380 ㎕씩 분주하여 25℃에서 1시간 동안 blocking하였다. T-PBS로 3회 세정한 후 1차 항체로는 본 연구에서 제작한 단클론 항체를 시료당 2개의 well에 50 ㎕씩 분주하여 25℃에서 1시간 반응하였다. T-PBS로 3회 세정한 후 horseradish peroxidase (HRP)가 표식되어 있는 goat anti-mouse IgG (Youngin, Korea)를 5% skim milk로 1,000배 희석하여 well 당 50 ㎕씩 분주하였으며, 25℃에서 1시간 반응하였다. T-PBS로 5회 세정한 후 ELISA 발색액 (100 mM Na2HPO4,50mMcitricacid,1㎎/㎖ o-phenylen diamine, 0.1% H2O2)을 well 당 50 ㎕ 분주하여 발색하였다. 각 well에 1N H2SO4를 50 ㎕씩 넣어 발색 반응을 중지시킨 후, 490 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
8. Bovine serum albumin (BSA)에 대한 특이 돌돔 항체 검출
여수시에 위치한 수산물 도매상으로 구입한 돌돔 (260 345g)에 BSA를 1 mg/200 ㎕ 씩 복강에 주사한 후, 300 L 수조에 수용하여 (수온: 17-20℃) 22일간 사육하였다. BSA 접종 후, 0, 11, 22일째 돌돔의 미부정맥으로부터 혈액을 약 1 ml씩 채혈한 후, 원심분리 (12,000 rpm, 4℃, 10분)하여 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청은 실험에 사용하기 전까지 20℃에 보관하였다.
BSA에 대한 특이 돌돔 항체를 검출하기 위해, 위에서 얻은 혈청을 사용하여 ELSIA를 실시하였다. ELISA plates에 5 μg BSA/ 50 ㎕를 각 well에 분주한 후, 37℃에서 overnight하여 항원을 코팅하였다. T-PBS (0.05% Tween-20/PBS (v/v))로 3회 세정하였고 5% skim milk를 380 ㎕씩 분주하여 25℃에서 1시간 동안 blocking 하였다. T-PBS로 3회 세정한 후 1차 항체로는 위에서 채혈한 돌돔 혈청을 5% skim milk로 40배 희석하여 1시간 반응시킨 후, 시료당 2개의 well에 50 ㎕씩 분주하였고, 2차 항체로는 본 연구에서 제작한 단클론 항체를 사용하여 50 ㎕씩 분주하였으며, 3차 항체로는 5% skim milk로 1,000배 희석된 horseradish peroxidase (HRP)가 표식되어 있는 goat anti-mouse IgG (Youngin, Korea)를 50 ㎕씩 분주하였다. 각각의 항체 반응은 25℃에서 1시간 동안 반응하였다. T-PBS로 5회 세정한 후 ELISA 발색액 (100 mM Na2HPO4,50mMcitricacid,1㎎/㎖ o-phenylen diamine, 0.1% H2O2)을 well 당 50 ㎕ 분주하여 발색하였다. 각 well에 1N H2SO4를 50 ㎕씩 넣어 발색 반응을 중지시킨 후, 490 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
<실험 결과>
1. 돌돔 IgM 정제
도 1은 정제된 돌돔 IgM의 SDS-PAGE 사진이다. Protein A affinity column을 사용하여 돌돔 IgM을 정제한 후 SDS-PAGE를 실시한 결과, heavy chain (75 kDa)과 light chain (27.2 kDa)이 관찰되었다.
2. Hybridoma 제작 및 단클론 항체의 screening
Protein A affinity column으로 정제한 돌돔 IgM (PA IgM)을 면역시킨 마우스의 비장 조직과 Sp2/0Ag14 myeloma 세포를 PEG로 융합시켜 hybridoma를 제작하였다. Hybridoma로부터 생성되는 항체를 ELISA와 western blot으로 스크린 한 결과, 42개 시료에서 양성 반응을 나타내었다. 42개의 시료를 대상으로 ELISA로 4회 클로닝을 실시한 결과, 최종적으로 1개의 clone (20A2)을 선별할 수 있었다.
상기 클론 22A3(하이브리도마)는 000000자로 한국세포주연구재단에 기탁되어 기탁번호 0000000(융합세포주, 돌돔 IgM 20A2, Rock bream IgM 20A2)를 부여받았다.
이후의 실험에서는 1개의 clone으로부터 생산된 항체를 사용하여 (항체의 이름 : clone의 이름과 동일하게 사용) 특이성 조사를 실시하였다.
3. 단클론 항체의 isotype
도 2는 PA IgM에 대한 단클론 항체 (20A2)의 isotyping 결과를 나타낸 표이다. PA IgM으로 제작된 단클론 항체를 대상으로 rapid ELISA mouse mAb isotyping kit를 사용하여 IgG의 heavy 및 light chain의 subtype을 조사한 결과, H-chain은 IgG1로, L-chain은 κ로 확인되었다.
4. 단클론 항체의 돌돔 IgM 반응
도 3은 PA IgM에 대한 단클론 항체의 반응을 나타낸 ELISA 결과이다. 20A2는 PA IgM에 대해 약 1.4 정도의 OD값을 나타내었다. 대조구 (항원: skim milk)에서는 OD값이 관찰되지 않았다.
5. BSA에 대한 특이 돌돔 항체 검출
도 4는 단클론 항체를 이용한 BSA 에 대한 특이 돌돔 항체 검출 결과를 나타낸 그래프이다. 본 발명에서 제작한 단클론 항체의 특이성을 조사하기 위해, 돌돔에 BSA를 면역시킨 후 0, 11, 22일째 혈청을 분리하여 BSA에 대한 항체가를 측정하였다. BSA 면역된 돌돔 혈청은 시간이 지날수록 항체가가 상승하는 것으로 나타났다. 대조구의 돌돔 (control 1, control 2)에서는 항체가의 상승이 관찰되지 않았다. 즉,BSA를 면역시킨 돌돔 (BSA 1, BSA 2, BSA3)에서는 BSA2를 제외한 BSA 1과 BSA 3에서 11일과 22일째 항체가가 측정되었다.
한국세포주연구재단 KCLRFBP00437P 20180614

Claims (8)

  1. 돌돔(Oplegnathus fasciatus)의 면역글로빈 M(Immunoglobulin M, Ig M)에 특이적인 단클론항체를 생산하는 기탁번호 KCLRF-BP-00437의 융합세포주(RB IgM 20A2)에 의해 생산되는 돌돔의 면역글로빈 M에 특이적인 단클론항체를 포함하는 돌돔의 감염성 질병의 진단용 키트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 진단용 키트는 항원-항체 복합체를 색채입자결합법으로 검출하는 돌돔의 감염성 질병의 진단용 키트.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 진단용 키트는 기질과 반응하여 발색하는 표지체와 축합된 항체; 및 발색기질을 포함하며, 상기 표지체는 HRP(Horse-radish peroxidase)이며, 상기 발색기질은 TMB(3,3',5,5'-tetramethyl-benzidine)인 것을 특징으로 하는 돌돔의 감염성 질병의 진단용 키트.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 진단용 키트는 면역크로마토그래피법을 이용한 스트립 타입인 돌돔의 감염성 질병의 진단용 키트.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 스트립 타입의 진단용 키트는 돌돔의 면역글로빈 M에 특이적인 단클론항체를 생산하는 융합세포주에 의해 생산되는 돌돔의 면역글로빈 M에 특이적인 단클론항체와 금의 접합체, 마우스 면역글로불린에 대하여 특이적인 항체가 코팅된 멤브레인과 피검체 흡습패드가 부착된 스트립을 포함하는 신속 면역크로마토그래피법에 의한 돌돔의 감염성 질병의 진단용 키트.
  6. 돌돔(Oplegnathus fasciatus)의 면역글로빈 M(Immunoglobulin M, Ig M)에 특이적인 단클론항체를 생산하는 기탁번호 KCLRF-BP-00437의 융합세포주(RB IgM 20A2)에 의해 생산되는 단클론항체를 포함하는 어류 항원에 대한 돌돔의 특이 항체 검출용 조성물.
  7. 돌돔(Oplegnathus fasciatus)의 면역글로빈 M(Immunoglobulin M, Ig M)에 특이적인 단클론항체를 생산하는 기탁번호 KCLRF-BP-00437의 융합세포주(RB IgM 20A2)에서 생산되는 단클론항체.
  8. 돌돔(Oplegnathus fasciatus)의 면역글로빈 M(Immunoglobulin M, Ig M)에 특이적인 단클론항체를 생산하는 기탁번호 KCLRF-BP-00437의 융합세포주(RB IgM 20A2).
KR1020190066869A 2018-06-05 2019-06-05 돌돔의 면역글로불린 m에 특이적인 단클론 항체 및 이의 용도 KR102163241B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20180065136 2018-06-05
KR1020180065136 2018-06-05

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190138609A true KR20190138609A (ko) 2019-12-13
KR102163241B1 KR102163241B1 (ko) 2020-10-08

Family

ID=68847455

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190066869A KR102163241B1 (ko) 2018-06-05 2019-06-05 돌돔의 면역글로불린 m에 특이적인 단클론 항체 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102163241B1 (ko)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0959300A (ja) * 1995-08-15 1997-03-04 Norin Suisansyo Suisanchiyou Youshiyoku Kenkyusho 単クローン抗体による海産魚イリドウイルス感染症の迅速診断法
CN103288954A (zh) * 2013-06-04 2013-09-11 大连海洋大学 条石鲷虹彩病毒orf049l重组蛋白的单克隆抗体及其制备方法
KR20140106821A (ko) * 2013-02-27 2014-09-04 경상대학교산학협력단 돌돔 유래의 단백질을 유효성분으로 함유하는 어류용 백신 보조제
KR20180023248A (ko) 2016-08-25 2018-03-07 전남대학교산학협력단 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도
KR20180023246A (ko) * 2016-08-25 2018-03-07 전남대학교산학협력단 어류 신경괴사바이러스에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도
KR20180023250A (ko) 2016-08-25 2018-03-07 전남대학교산학협력단 넙치의 면역글로불린 m에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0959300A (ja) * 1995-08-15 1997-03-04 Norin Suisansyo Suisanchiyou Youshiyoku Kenkyusho 単クローン抗体による海産魚イリドウイルス感染症の迅速診断法
KR20140106821A (ko) * 2013-02-27 2014-09-04 경상대학교산학협력단 돌돔 유래의 단백질을 유효성분으로 함유하는 어류용 백신 보조제
CN103288954A (zh) * 2013-06-04 2013-09-11 大连海洋大学 条石鲷虹彩病毒orf049l重组蛋白的单克隆抗体及其制备方法
KR20180023248A (ko) 2016-08-25 2018-03-07 전남대학교산학협력단 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도
KR20180023246A (ko) * 2016-08-25 2018-03-07 전남대학교산학협력단 어류 신경괴사바이러스에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도
KR20180023250A (ko) 2016-08-25 2018-03-07 전남대학교산학협력단 넙치의 면역글로불린 m에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SANTOS N. M. et al, Fish & Shellfish Immunology 7:pp.175-191 (1997) *

Also Published As

Publication number Publication date
KR102163241B1 (ko) 2020-10-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2016080701A1 (ko) 중동호흡기증후군 코로나바이러스 뉴클레오캡시드를 인식하는 항체 및 그의 용도
KR20180023248A (ko) 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도
CN104928258A (zh) 犬细小病毒杂交瘤细胞、及单克隆抗体和应用
KR20180023250A (ko) 넙치의 면역글로불린 m에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도
KR20160074756A (ko) 공수병 바이러스 p 단백을 표적으로 하는 단클론 항체 또는 항원 검출 및 중화항체가 측정 시험을 위한 용도
KR101865878B1 (ko) 넙치랩도바이러스에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도
KR102163242B1 (ko) 무지개송어의 면역글로불린 m에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도
EP3568698A1 (en) Diagnostic
KR102341370B1 (ko) 넙치랩도바이러스병 감염 여부 현장검사용 진단키트 및 진단방법
KR102450481B1 (ko) 돼지열병 바이러스 특이적인 항체 및 이의 용도
US11307202B1 (en) Antibody binding detection method for detecting MERS-CoV
KR102163241B1 (ko) 돌돔의 면역글로불린 m에 특이적인 단클론 항체 및 이의 용도
KR102091731B1 (ko) 해양버나바이러스 및 신경괴사증바이러스에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도
AU2019355429B2 (en) Methods, devices, kits and compositions for detecting tapeworm
KR101990850B1 (ko) 전염성 췌장괴사증 바이러스 및 신경괴사증 바이러스에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도
Fasihi-Ramandi et al. Production and characterization of monoclonal and polyclonal antibody against recombinant outer membrane protein
KR102264146B1 (ko) 락토코커스 가비에에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 포함하는 락토코커스 가비에 검출용 조성물
KR101937745B1 (ko) 능성어의 면역글로불린 m에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도
WO2009069942A2 (en) The rapid diagnostic kits for the detection of antibodies against paragonimus westermani and monoclonal antibodies for production of paragonimus westermani-specific antigens
KR102384570B1 (ko) 넙치랩도바이러스병 감염 여부 현장검사 진단키트용 검체시료조성물 및 상기 조성물을 이용한 넙치랩도바이러스병 현장진단방법
JP6979200B2 (ja) レプトスピラ症の診断に用いるレプトスピラ抗原検出用抗体
KR20120029137A (ko) 클로스트리디움 퍼프린젠스 장독소 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이를 유효성분으로 포함하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 장독소 검출용 조성물
KR101741206B1 (ko) 유럽형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 특이항체 진단용 래피드 키트
KR102167264B1 (ko) 아데노바이러스 55형에 특이적인 단클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포주
KR101876535B1 (ko) 소바이러스성 설사병 바이러스의 탐지용 항체, 이를 이용한 항원 검출 방법, 및 이를 포함하는 탐지키트

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right