KR102341370B1 - 넙치랩도바이러스병 감염 여부 현장검사용 진단키트 및 진단방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 넙치 양식장에서 폐사를 유발하는 넙치랩도바이러스병 진단기술에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 넙치랩도바이러스병에 특이적인 단일클론항체를 이용하여 20분 이내에 넙치랩도바이러스 감염 여부를 진단할 수 있는 현장검사용 진단키트 및 진단방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 넙치의 폐사를 유발하는 넙치랩도바이러스병 진단기술에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 넙치랩도바이러스병에 특이적인 단일클론항체를 이용하여 20분 이내에 넙치랩도바이러스 감염 여부를 진단할 수 있는 현장검사용 진단키트 및 진단방법에 관한 것이다.
넙치랩도바이러스병(Hirame rhabdoviral disease)은 1984년대 초 일본에서 양식장인 넙치(Paralichthys olivaceus)가 대량으로 폐사하면서 원인 바이러스가 처음으로 분리되었다. 국내의 경우 1998년도에 넙치로부터 바이러스가 분리되었으며, 2013년 이후에는 감성돔(Acanthopagrus schlegeli)과 점농어(Lateolabrax mac ulatus)에서도 바이러스가 분리되었다.
넙치랩도바이러스병은 수온 2~18℃에서 발병되고 어체중 100~700 g 전후의 넙치에서 주로 발생하며 체표나 지느러미의 출혈, 복부팽만, 생식선의 울혈, 근육내출혈이 나타나는 것이 특징이다. 저수온기 (5~10℃) 넙치양식장에서 폐사를 일으키며, 수온이 낮을수록 높은 폐사율을 보인다. 넙치랩도바이러스병은 국내뿐만 아니라 일본에서도 피해를 주는 바이러스성 질병으로 알려져 있다.
넙치랩도바이러스병의 원인병원체인 넙치랩도바이러스(Hirame rhabdovirus, HIRRV)는 단일가닥의 RNA 바이러스이며 랩도비리대(Rhabdoviridae) 과, 노비랩도바이러스(Novirhabdovirus) 속에 속하는 바이러스이다.
HIRRV는 약 11,000 bp의 negative-strand RNA virus로 6개의 유전자들 nucleocapsid (N), phosphoprotein (P), matrix protein (M), glycoprotein (G), non-virion protein (NV)와 polymerase (L) 유전자들이 3'-N-P-M-G-NV-L-5'의 순으로 구성되어 있다.
종래 알려진 HIRRV를 검사하는 방법으로는 어류주화세포를 이용한 분리배양법, 유전자를 이용한 분자생물학적 방법[reverse transcription- polymerase chain reaction (RT-PCR), real time PCR 등], 항체를 이용한 면역학적인 방법[enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), fluorescent antibody techniques (IFAT) 등] 등이 사용되고 있다.
이들 검사방법의 장단점을 살펴보면, 먼저, 어류주화세포를 이용한 분리배양 방법: 어류 주화세포 (CHSE-214, EPC, FHM)를 사용한 바이러스 분리배양 방법은 전 세계적으로 널리 사용하고 있는 방법이긴 하지만 현장에서 직접 검출하는데 사용이 쉽지 않고, 최소 10일 이상의 시간이 소요되어 검출 시간이 다소 길어 질 수 있는 단점이 있으며, 전문 인력과 시설이 요구되고, 한 번에 다수 샘플 처리가 불가능하고 다수의 샘플 검사 시 많은 비용이 소요된다는 단점이 있다.
분자생물학적 방법의 경우, HIRRV 게놈을 표적으로 한 PCR 방법은 특이도와 민감도가 우수하여 전 세계적으로 널리 사용하고 있는 방법이긴 하지만 현장에서 직접 검출하는데 사용이 쉽지 않고, 검체 시료의 전처리 등을 위한 시간이 필요함에 따라 최소 1일 이상 소요되어 전체 검출 시간이 다소 길어 질 수 있는 단점이 있으며, 역시 전문 인력과 시설이 요구되고, 한 번에 다수의 샘플 처리가 불가능하며, 다수의 샘플 검사 시 많은 비용이 소요될 뿐만 아니라, PCR 검사를 통해 병원체가 검출되어도 어체 내에서 병원체의 감염상태 파악이 불가능한 문제점이 있다.
면역학적 방법의 경우, HIRRV에 특이적으로 반응하는 항체를 활용한 면역학적 기법 (ELISA, IFAT 등)은 특이도와 민감도가 우수하며, 다수의 시료 처리가 가능하다는 장점을 가지고 있으나 현장에서 사용하기 불가능하며, 검체 시료의 전처리 등을 위한 시간이 필요함에 따라 최소 1일 이상이 소요되어 전체 검출 시간이 다소 길어 질 수 있는 단점이 있고, 전문 인력과 시설이 요구되며, 병원체에 대한 항체를 보유하고 있어야 만 검사가 가능하다.
따라서, 현장에서의 빠른 대처를 위해 넙치랩도바이러스병을 양식 현장에서 신속하게 검출할 수 있는 새로운 진단기술이 요구되고 있는 실정이다.
따라서, 본 발명의 목적은 넙치양식장에서 주로 성어기에 발생하며 폐사를 유발하는 넙치랩도바이러스병을 일으키는 원인바이러스인 넙치랩도바이러스(Hirame rhabdovirus, HIRRV)에 감수성 및 특이성이 있는 단일클론항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 넙치랩도바이러스(HIRRV)에 감수성 및 특이성이 있는 단일클론항체를 생산하는 융합세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 넙치랩도바이러스(HIRRV)에 의해 발병하는 넙치랩도바이러스병의 진단, 치료 및 예방에 용이하게 이용할 수 있는 넙치랩도바이러스병 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 넙치랩도바이러스(HIRRV)에 감수성 및 특이성이 있는 단일클론 항체를 이용하여 넙치랩도바이러스병을 20분 이내에 진단할 수 있는 현장검사용 신속 진단키트 및 현장진단방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상술된 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 먼저 본 발명은 넙치랩도바이러스(hirame rhabdovirus, HIRRV)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 11-2D9를 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 단일클론항체 11-2D9는 수탁번호 KCLRF-BP-00513으로 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 것이다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 단일클론항체 11-2D9는 HIRRV에 감염된 EPC 세포에만 특이적으로 결합한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 HIRRV에 감염된 EPC 세포는 HIRRV의 항원단백질 M을 포함한다.
또한, 본 발명은 상술된 어느 하나의 단일클론항체 11-2D9를 생산하는 수탁번호 KCLRF-BP-00513으로 기탁된 하이브리도마 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 넙치랩도바이러스(hirame rhabdovirus, HIRRV)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 15E10을 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 단일클론항체 15E10은 수탁번호 KCLRF-BP-00514로 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 것이다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 단일클론항체 15E10은 HIRRV에 감염된 EPC 세포에만 특이적으로 결합한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 HIRRV에 감염된 EPC 세포는 HIRRV의 항원단백질 N을 포함한다.
또한, 본 발명은 상술된 어느 하나의 단일클론항체 15E10을 생산하는 수탁번호 KCLRF-BP-00514로 기탁된 하이브리도마 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상술된 어느 하나의 단일클론항체 11-2D9 및 상술된 어느 하나의 단일클론항체 15E10 중 하나 이상을 포함하고 넙치랩도바이러스병을 진단하는 진단 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상술된 진단 조성물을 포함하는 넙치랩도바이러스병 진단키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 스트립형상의 다공성박막부재; 상기 다공성박막부재의 길이방향 일단부에 형성되는 흡수패드부재; 상기 다공성박막부재의 길이방향 타단부에 적층 형성되고, 상술된 어느 하나의 단일클론항체 11-2D9가 포함되는 항체접합체패드부재; 상기 항체접합체패드부재의 일부 또는 모든 영역에 적층 형성되는 샘플패드부재; 상기 다공성박막부재의 표면 중 상기 항체접합체패드부재 및 상기 흡수패드부재 사이에 위치된 표면상에 일정폭으로 형성되고, 상술된 어느 하나의 단일클론항체 15E10이 고정되는 검사선부재; 및 상기 다공성박막부재의 표면 중 상기 검사선부재와 상기 흡수패드부재 사이에 위치된 표면상에 일정폭으로 형성되고, 상기 단일클론항체와 결합하는 이차항체가 고정되는 대조선부재;를 포함하는 넙치랩도바이러스병 감염 여부 현장검사용 진단키트를 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 단일클론항체 11-2D9는 표지체와 접합되어 형성된 항체-표지체 접합체 형태로 상기 샘플패드부재를 통과한 액상시료의 흐름에 따라 이동가능하게 상기 항체접합체패드부재에 형성되는 것이다. 을
바람직한 실시예에 있어서, 상기 표지체는 HRP(Horseradish peroxidase), 알칼리성 인산분해효소(Alkaline phosphatase), 금나노입자, FITC(Poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(Rhodamine-B-isothiocyanate), Cy3, Cy5, 및 로다민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나이다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 검사선부재의 진단 감도는 105.2 TCID50/100 ㎕이다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 대조선부재에 고정되는 이차항체는 마우스가 아닌 포유동물군에서 유래된 anti-mouse IgG이다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 다공성박막부재는 니트로셀룰로오스막, PVDF막, 폴리비닐수지필름 또는 폴리스티렌수지필름으로 구성된 그룹에서 선택되는 어느 하나로서 5~12 ㎛의 공극 크기를 갖는다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 다공성박막부재 하부표면에 형성되는 스트립형상의 지지부재를 더 포함한다.
또한, 본 발명은 상술된 어느 한 항의 진단키트의 샘플패드부재에 넙치조직 유래 액상시료를 접촉시키는 단계; 및 상기 진단키트의 검사선부재의 양성반응을 탐지하는 단계;를 포함하는 넙치랩도바이러스병 진단방법을 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 샘플패드부재에 넙치조직 유래 액상시료를 접촉시킨 후 20분 이내에 넙치랩도바이러스병의 양성반응을 탐지하여 넙치랩도바이러스병 감염 여부를 검출하는 것이다.
상술된 본 발명에 의하면 넙치양식장에서 주로 성어기에 발생하며 폐사를 유발하는 넙치랩도바이러스병을 일으키는 원인바이러스인 넙치랩도바이러스(Hirame rhabdovirus, HIRRV)에 감수성 및 특이성이 있는 단일클론항체 및 이를 생산하는 융합세포주를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 넙치랩도바이러스병 진단용 조성물은 넙치랩도바이러스(HIRRV)에 의해 발병하는 넙치랩도바이러스병의 진단, 치료 및 예방에 용이하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명이 현장검사용 신속 진단키트 및 현장진단방법에 의하면 넙치랩도바이러스(HIRRV)에 감수성 및 특이성이 있는 단일클론 항체를 이용하여 넙치랩도바이러스병을 20분 이내에 진단할 수 있어 현장 적용성이 우수하므로, 신속한 질병진단과 예방 및 대처를 통해 본 질병에 의한 피해를 최소화함으로써 안전한 넙치양식을 수행할 수 있다.
본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 넙치랩도바이러스병 감염 여부 현장검사용 진단키트의 사용법을 나타낸 개략도이다.
도 2는 넙치랩도바이러스병 감염 여부 현장검사용 진단키트의 사용된 단일클론항체의 HIRRV 인식부위 확인을 나타낸 웨스턴 블로팅 결과를 나타낸 것이다[M: marker (kDa), 1: 단일클론항체 11-2D9, 2: 단일클론항체 15E10].
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 넙치랩도바이러스병 감염 여부 현장검사용 진단키트의 HIRRV 배양액에 대한 진단 민감도 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 감염여부 현장검사용 진단키트의 HIRRV와 다른 종류의 어류 바이러스들 (VHSV, IHNV, IPNV, MABV, NNV)에 대한 특이도 측정 결과이다.
도 2는 넙치랩도바이러스병 감염 여부 현장검사용 진단키트의 사용된 단일클론항체의 HIRRV 인식부위 확인을 나타낸 웨스턴 블로팅 결과를 나타낸 것이다[M: marker (kDa), 1: 단일클론항체 11-2D9, 2: 단일클론항체 15E10].
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 넙치랩도바이러스병 감염 여부 현장검사용 진단키트의 HIRRV 배양액에 대한 진단 민감도 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 감염여부 현장검사용 진단키트의 HIRRV와 다른 종류의 어류 바이러스들 (VHSV, IHNV, IPNV, MABV, NNV)에 대한 특이도 측정 결과이다.
본 발명에서 사용되는 용어는 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어를 선택하였으나, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있는데 이 경우에는 단순한 용어의 명칭이 아닌 발명의 상세한 설명 부분에 기재되거나 사용된 의미를 고려하여 그 의미가 파악되어야 할 것이다.
본 발명에서 사용된 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 hirame rhabdovirus (HIRRV)의 감염 여부를 확인하는 것이다.
이하, 첨부한 도면 및 바람직한 실시예들을 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다.
그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐 본 발명을 설명하기 위해 사용되는 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.
본 발명의 기술적 특징은 HIRRV에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 상기 단일클론항체를 생산하는 융합세포를 개발하고, HIRRV에 감수성 및 특이성이 있는 단일클론항체를 이용하여 넙치랩도바이러스병 감염 여부를 20분 이내에 진단할 수 있는 현장검사용 신속 진단키트 및 진단키트의 사용법에 있다.
즉, 종래 공지된 넙치랩도바이러스 감염 여부 검출방법은 최소 1일 이상의 시간이 소요되며, 전문 인력과 시설이 요구되어 현장 적용성이 매우 떨어졌으나, 본 발명은 HIRRV에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 상기 단일클론항체를 생산하는 융합세포를 개발하고, 이를 이용하여 20분 이내에 넙치랩도바이러스 감염 여부 확인이 가능한 신속 진단키트 및 진단방법을 개발했기 때문이다.
따라서, 본 발명은 넙치랩도바이러스(hirame rhabdovirus, HIRRV)에 감염된 EPC 세포에만 특이적으로 결합하는 단일클론항체 11-2D9 및/또는 단일클론항체 15E10을 제공한다.
본 발명에서 "11-2D9 항체"또는 "단일클론항체 11-2D9"는 수탁번호 KCLRF-BP-00513으로 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체를 의미하고, "15E10 항체"또는 "단일클론항체 15E10"은 수탁번호 KCLRF-BP-00514로 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체를 의미한다.
단일클론항체는 당업자에 알려진 융합에 의한 불멸화된 세포주 생성기술 [Koeher and Milstein, Nature, 256:495 (1975)]에 의하여 제조될 수 있다. 그 제조방법을 간단히 설명하면 다음과 같다. 먼저 순수한 단백질을 약 20 ㎍을 얻어서 쥐에 면역화를 시키거나 펩타이드를 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 쥐에 면역화시킨다. 그 후 쥐에서 분리된 항원-생산 B 임파구를 인간 또는 마우스의 골수종세포와 융합하여 불멸화된 하이브리도마를 생성한다. 이어, ELISA (Enzymelinked immunosorbent assay)로 하이브리도마 세포의 단일클론항체의 생성여부를 알아보고 양성 클론을 택하여 배양한 후 항체를 분리 정제하거나 쥐의 복강에 주입한 후 복수를 채취한다.
먼저 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조에 필요한 마우스를 면역화시켰다. 구체적으로는, HIRRV를 배양하여 농축 및 정제한 후 정제된 바이러스 구조단백질을 인산염 완충액(phosphate buffered saline; PBS)에 희석하고 동일한 부피의 프로인트 완전 아주반트(complete Freund's adjuvant, Sigma)와 혼합하여 에멀젼을 제조한 후, 상기 에멀젼을 마우스의 복강에 1차 주사하였다. 1차 면역화 후 2주 후에 마우스로부터 채혈한 후 ELISA를 실시하여 항체가를 측정하였으며, 마우스의 면역성을 높이기 위하여 정제된 바이러스만을 사용하여 2차 면역하였다. 2차 면역화 3일 후에 면역화된 마우스로부터 비장조직을 적출하였다. 적출된 비장조직과 골수종 세포인 Sp2/0Ag14 세포를 세포수를 기준으로 10:1의 비율로 혼합하고 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 넣어 세포 융합시키고 배양하였다.
상기 융합세포군 중에서 HIRRV에만 특이적으로 반응하는 융합세포들을 선별하고, 선별된 융합세포가 단일클론이 되도록 제한 희석법(limiting dilution)을 사용하여 융합세포를 희석한 후, 하나의 세포로부터 증식한 융합세포의 흡광도(O.D 값)를 ELISA로 확인하여 흡광도가 가장 우수한 8개의 단일클론을 선별하였다. 선별된 8개의 단일클론을 각각 마우스에 주사하고, 마우스의 혈청으로부터 HIRRV에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 1B3, 5G6, 11-2D9, 15E10, 15-1G9, 17F11, 24-1C6, 36D3을 분리하였다. 그 후 후술하는 실험예와 같이 8개의 단일클론항체에 대해 HIRRV 신속 진단키트를 위한 pair test를 실시하고 그 결과에 따라 최종적으로 선택한 2개의 단일클론항체를 생산하는 융합세포 즉 하이브리도마 세포를 각각 "HIRRV 11-2D9" 및 "HIRRV 15E10"로 명명하였으며, 한국세포주연구재단에 2021년 5월 4일자로 기탁하여 각각 수탁번호 KCLRF-BP-00513 및 KCLRF-BP-00514를 부여 받았다.
다음으로, 본 발명은 단일클론항체 11-2D9 및 단일클론항체 15E10 중 하나 이상을 포함하는 진단 조성물 및 진단키트를 제공할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 HIRRV의 감염 여부를 확인하는 것이다.
본 발명의 항체를 이용하여 시료, 예를 들면 어류조직에 포함된 HIRRV를 분석하는 방법으로는 통상의 항원-항체반응의 분석법을 사용할 수 있다. 예컨대, 면역 검정(측정)법으로는 효소 면역 측정법(ELISA), 형광면역 측정법(FIA), 웨스턴 블롯(western blot)법 등이 있다.
본 발명의 진단용 조성물은 진단용 키트 또는 마이크로어레이 형태로 제공될 수 있다. 진단용 키트로는 예를 들면, 시료 중의 특정 단백질을 검출하기 위해 면역크로마토그래피법을 기초로 하는 측방 유동 검정 키트(lateral flow assay kit)의 형태로 제공될 수 있다. 측방 유동 검정 키트는 통상 시료가 적용되는 샘플패드(sample pad), 탐지용 항체가 코팅되어 있는 골드패드(gold pad), 시료가 이동하여 분리되고 항원-항체 반응이 일어나는 전개용 막(예를 들어 니트로셀룰로스) 또는 스트립, 그리고 흡수패드(absorption pad)로 이루어진다.
마이크로어레이는 일반적으로 특정 시약으로 처리된 슬라이드글라스 표면 위에 항체를 부착하여 항원-항체 반응에 의해 상기 항체에 특이적으로 부착하는 단백질을 검출할 수 있도록 하는 것이다. 이와 같이 마이크로어레이를 사용하게 되면 HIRRV에 특이적인 항체인 단일클론항체 11-2D9 및 단일클론항체 15E10 중 하나 이상을 생물학적 마이크로칩 (Biological microchip) 상에 고정시킨 후 대상어류로부터 분리된 검체 시료와 반응시켜 상기 항체 단백질에 대한 항원을 검출할 수 있는 생물학적 마이크로칩(Biological microchip) 및 자동화된 미세배열 시스템 (Microarray system)을 이용하면, 대량으로 시료를 분석할 수 있다.
본 발명에서 HIRRV를 인식하는 단일클론항체 11-2D9 및 단일클론항체 15E10 중 하나 이상을 이용하는 면역 검정의 바람직한 예로서, ELISA 법을 들 수 있다. ELISA 법은 일반적인 경합법, 샌드위치법 등의 수법에 따라 실시할 수 있고, 액상계 또는 고체상태계에서도 실시할 수 있다.
본 발명의 넙치랩도바이러스병 진단용 키트(kit)는 본 발명의 단일클론항체 11-2D9 및 단일클론항체 15E10 중 하나 이상을 포함하는 것으로, 상기 진단용 키트는 필요에 따라 면역 반응을 이용하고, 웰, 염색제, 검출용의 효소 표지 항체, 세척액, 항체 희석액, 검체 희석액, 효소 기질, 효소 기질액 희석액, 그밖의 시약을 포함할 수 있을 것이다.
마지막으로, 본 발명은 현장에서 신속진단이 가능하도록 넙치랩도바이러스병 감염 여부 현장검사용 진단키트를 제공하는데, 현장검사용 진단키트는 스트립형상의 다공성박막부재; 상기 다공성박막부재의 길이방향 일단부에 형성되는 흡수패드부재; 상기 다공성박막부재의 길이방향 타단부에 적층 형성되고, 단일클론항체 11-2D9가 포함되는 항체접합체패드부재; 상기 항체접합체패드부재의 일부 또는 모든 영역에 적층 형성되는 샘플패드부재; 상기 다공성박막부재의 표면 중 상기 항체접합체패드부재 및 상기 흡수패드부재 사이에 위치된 표면상에 일정폭으로 형성되고, 단일클론항체 15E10이 고정되는 검사선부재; 및 상기 다공성박막부재의 표면 중 상기 검사선부재와 상기 흡수패드부재 사이에 위치된 표면상에 일정폭으로 형성되고, 상기 단일클론항체와 결합하는 이차항체가 고정되는 대조선부재;를 포함할 수 있다.
여기서, 다공성박막부재는 항원-항체 결합 반응을 위한 고정체로 기능하면서 분석을 위한 액상시료가 모세관현상을 통해 일단부에서 타단부로 이동시킬 수 있도록 하기만 하면 공지된 기술이 모두 적용될 수 있는데 일 구현예로서 니트로셀룰로오스막, PVDF막, 폴리비닐수지필름 또는 폴리스티렌수지필름으로 구성된 그룹에서 선택되는 어느 하나의 소재로 형성된 스트립일 수 있다. 다공성박막부재를 위한 스트립의 크기는 적정량의 분석 시료를 이송시키고, 분석 시료 내의 검체와 분석 스트립과의 반응 정도를 관찰할 수 있는 정도의 크기면 되기 때문에 크기에 특별한 제한이 없지만 대략 가로 5 mm이하, 세로 100 mm 이하의 크기를 가질 수 있다. 또한, 다공성박막부재의 내부에는 5~12 ㎛의 직경을 가지는 미세 기공이 다수 형성되어 있어 HIRRV가 포함된 액상시료가 단일클론항체-표지체 접합체와 함께 다공성박막부재로 용이하게 흡수되어 이동될 수 있도록 구성될 수 있다.
항체접합체패드부재는 다공성박막부재의 길이방향 일단부에 적층 형성되는 구성요소로서, 특히 샘플패드부재를 통과한 액상시료가 항체접합체패드부재를 통과할 때 단일클론항체가 표지체와 접합되어 형성된 항체-표지체 접합체가 액상시료에 함유되어 액상시료의 흐름에 따라 이동 가능하도록 포함될 수 있다. 그 결과 다공성박막부재의 일단부에 투입되어 샘플패드부재를 통과한 액상시료는 항체접합체패드부재를 통과하면서 항체접합체패드부재에 포함된 항체-표지체 접합체가 함유된 상태로 다공성박막부재의 타단부에 적층 형성된 흡수패드부재로 이동하게 되는 구성을 갖고 있다. 여기서, 항체-표지체 접합체는 수탁번호 KCLRF-BP-00513로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산되어 HIRRV에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 11-2D9과 HRP(Horseradish peroxidase), 알칼리성 인산분해효소(Alkaline phosphatase), 금나노입자, FITC(Poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(Rhodamine-B- isothiocyanate), Cy3, Cy5, 및 로다민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 표지체가 접합(conjugate)된 것일 수 있다. 따라서, 액상시료에 HIRRV가 존재하면 항체-표지체 접합체의 단일클론항체와 HIRRV의 항원단백질이 결합된 상태 즉 "HIRRV-항체-표지체 접합체"특히 "HIRRV의 항원단백질 M-항체-표지체 접합체"가 형성되어 액상시료의 흐름을 따라 이동하게 되고, 액상시료에 HIRRV가 존재하지 않으면 "항체-표지체 접합체"만 이동하게 된다.
흡수패드부재는 다공성박막부재의 길이방향 타단부에 형성되는 구성요소로서, 다공성박막부재를 통한 액상시료의 흐름을 유도할 수 있는 흡수패드를 구성할 있기만 하면 소재 및 구조는 제한되지 않으나, 일 구현예로서 셀룰로오스가 사용될 수 있을 것이다.
샘플패드부재는 항체접합체패드부재의 일부 또는 모든 영역에 적층 형성되어 분석 또는 진단을 위한 검체의 분쇄조직이 포함된 액상시료를 어느 정도 필터링할 수 있기만 하면 공지된 모든 구성이 사용될 수 있는데, 일 구현예로서 유리섬유 재질로 구성될 수 있다.
검사선부재는 다공성박막부재의 양단부에 각각 적층 형성된 항체접합체패드부재 및 흡수패드부재 사이에 위치되어 노출된 다공성박막부재의 표면상에 일정폭으로 형성되고, 수탁번호 KCLRF-BP-00514로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산되어 HIRRV, 특히 HIRRV의 항원단백질 N과 특이적으로 결합하는 단일클론항체 15E10이 고정되어 이루어지는데, 검사선부재 형성시 다공성박막부재의 표면에 단일클론항체가 고정되어 액상시료의 흐름에 따라 이동되지 않기만 하면 공지된 모든 기술이 사용가능하다. 필요한 경우 안정제로 BSA, sucrose 또는 Tween 20등과 같은 비이온성 계면 활성제를 일정량 사용할 수도 있다.
대조선부재는 검사선부재와 흡수패드부재 사이에 위치되어 노출된 다공성박막부재의 표면상에 일정폭으로 형성되고, 단일클론항체와 결합하는 이차항체가 고정되어 이루어지는데, 대조선부재 형성시 다공성박막부재의 표면에 이차항체가 고정되어 액상시료의 흐름에 따라 이동되지 않기만 하면 공지된 모든 기술이 사용가능하다. 필요한 경우 안정제로 BSA, sucrose 또는 Tween 20등과 같은 비이온성 계면 활성제를 일정량 사용할 수도 있다. 또한, 대조선부재에 고정되는 이차항체는 마우스가 아닌 포유동물군(염소, 면양, 토끼 등)에서 유래된 anti-mouse IgG로서 항체-표지체 접합체의 단일클론항체와 결합할 수 있다.
이와 같이 구성된 본 발명의 HIRRV 감염 여부 현장검사용 진단키트는 그 사용이 매우 간단하다. 즉, 본 발명의 진단키트의 샘플패드부재로 분석을 위한 액상시료를 투입하면 액상시료에 HIRRV의 존재 여부에 따라 다음과 같은 원리로 검사선부재와 대조선부재의 발색반응을 통해 분석하고자 하는 액상시료가 HIRRV 감염 여부를 육안으로 확인할 수 있기 때문이다.
구체적으로 살펴보면, 먼저 분석하고자 하는 검체의 조직이 마쇄된 액상시료를 준비한 후 본 발명의 진단키트의 샘플패드부재에 투입시킨다. 샘플패드부재에 투입된 액상시료는 샘플패드부재를 통과하면서 액상시료에 포함된 검체의 마쇄조직이 적절한 크기로만 존재하도록 여과되어 액상시료가 다공성박막부재를 균일하게 통과될 수 있다. 이 때, 액상시료에 HIRRV가 존재하면 샘플패드부재를 통과한 액상시료가 그 하부에 위치한 항체접합체패드부재를 지나면서 항체접합체패드부재에 존재하는 항체-표지체 접합체와 액상시료에 존재하는 HIRRV와 결합하여 HIRRV-항체-표지체 접합체 특히 HIRRV 항원단백질 M-항체-표지체 접합체가 형성되어 액상시료에 함유되고, 액상시료가 검사선부재를 통과하게 되면 액상시료에 포함된 HIRRV의 항원단백질 M-항체-표지체 접합체가 검사선부재에 고정된 단일클론항체(HIRRV의 항원단백질 N 인식)와 결합되어 반응하면서 발색반응을 하게 되므로 HIRRV 감염 여부를 손쉽게 확인 할 수 있다. 반면, 샘플패드부재로 투입되는 분석을 위한 액상시료에 HIRRV가 존재하지 않으면 샘플패드부재를 통과한 액상시료에 HIRRV가 존재하지 않으므로 그 하부에 위치한 항체접합체패드부재를 지나면서 항체접합체패드부재에 존재하는 항체-표지체 접합체는 HIRRV의 항원단백질 M-항체-표지체 접합체를 형성하지 않고 항체-표지체 접합체 상태로 액상시료에 포함되므로 액상시료가 검사선부재를 통과하더라도 액상시료에 포함된 항체-표지체 접합체는 검사선부재에 고정된 단일클론항체와 결합반응이 일어나지 않아 발색반응이 일어나지 않게 된다.
또한, 액상시료에 HIRRV가 포함되는지 여부와 무관하게 항체접합제패드부재를 지나면서 액상시료에 포함되는 항체-표지체 접합체가 검사선부재를 지나서 대조선부재에 이르게 되면, 대조선부재에 고정된 이차항체와 결합되게 되므로 대조선부재에서는 항상 발색반응이 일어나게 된다. 이러한 대조선부재를 통해 본 발명의 HIRRV 감염 여부 현장검사용 진단키트가 정상적으로 동작하는 것을 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명의 넙치랩도바이러스병 진단방법은 상술된 구성을 갖는 진단키트의 샘플패드부재에 넙치조직 유래 액상시료를 접촉시키는 단계; 및 상기 진단키트의 검사선부재의 양성반응을 탐지하는 단계;를 포함할 수 있다. 여기서, 넙치 조직은 비장이고, 샘플패드부재에 넙치 조직 유래 액상시료를 접촉시킨 후 20분 이내에 넙치랩도바이러스병의 양성반응을 탐지하여 넙치랩도바이러스병 감염 여부를 검출할 수 있다. 일 구현예로서 도 1에 도시된 바와 같이, 넙치의 비장조직을 적출하여 조직 : buffer 비율이 1:10으로 하여 마쇄한 후 상층액 100 ㎕를 키트에 떨어트린 후 10분 뒤에 결과를 확인하여 검사선에 붉은선이 나타나면 양성, 검사선에 붉은선이 나타나지 않으면 음성으로 판단할 수 있다.
실시예 1
다음과 같은 방법으로 넙치랩도바이러스(hirame rhabdovirus, HIRRV)에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 준비하였다.
1. 바이러스 배양
넙치랩도바이러스(HIRRV)를 대량으로 배양하기 위하여 75㎠ tissue culture flask (Nunc, Denmark)에 epithelioma papilosum cyprine (EPC)를 단층으로 배양한 후 바이러스를 접종하여 15℃에서 10일간 배양하면서 cytopathic effect (CPE)를 관찰하였다. 세포에 바이러스가 감염되어 90% 이상 용해된 세포 배양액을 4℃에서 12,000 rpm으로 30분간 원심 분리하여 세포 잔여물을 제거한 후 상층액을 분리하였다. 분리된 바이러스 상층액은 실험에 사용되기 전까지 ??80℃에서 보관하였다.
2. 바이러스의 농축 및 정제
바이러스 배양액에 polyethlene glycol (PEG)-6000 (sigma, USA)과 NaCl을 각각 7.5% (w/v), 2.3% (w/v)로 첨가한 후 4℃에서 overnight 하였다. PEG가 처리 된 바이러스 배양액을 4℃에서 12,000 rpm으로 30분간 원심 분리 한 후 pellet을 phosphate buffer saline (PBS: 0.13M NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4)완충용액으로 현탁하였다. 현탁액은 30,000 rpm에서 2시간 동안 초원심을 실시한 후 pellet을 PBS로 재부유 시켜 바이러스를 농축하였다. 바이러스를 정제하기 위해, 농축된 바이러스를 step sucrose gradient [20%, 35%, 50% sucrose 용액 (w/v)] 위에 넣은 후 30,000 rpm으로 2시간 동안 초원심 분리를 실시하였다. 20%와 35% 경계 지점에 형성된 바이러스로 추정되는 band를 주사기를 이용해 취한 후, PBS로 현탁하여 30,000 rpm으로 2시간 동안 초원심 분리하였다. 원심 분리 후 얻어진 침전물은 PBS 완충용액으로 다시 재현탁하여 실험에 사용되기 전까지 ??80℃에 보존하였다.
3.바이러스 면역 및 hybridoma 제작
면역은 정제 바이러스 (약 100 ㎍)와 complete freunds adjuvant를 1:1 비율로 혼합하여 BALB/c 마우스의 복강에 1차 면역하였다. 2주 후 마우스로부터 채혈한 후 ELISA를 실시하여 항체가를 측정하였으며, 정제 바이러스만을을 사용하여 2차 면역하였다. 2차 면역 3일 후 마우스의 비장 조직을 분리한 후 PEG 1500 (Roche, USA)를 이용하여 myeloma cell (Sp2/0Ag14)과 융합시킨 후 hypoxanthine, thymidine (HT) (gibco, USA) 배지를 사용하여 96 well plate (TPP, Switzerland)에 분주하여 CO2배양기에서 37℃로 배양하여 hybridoma를 제작하였다.
4. Hybridoma의 screening
바이러스에 대하여 특이적으로 반응하는 항체를 생산하는 hybridoma를 screening 하기 위하여 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)를 실시하였다. 항원은 정제된 바이러스액을 96 well plate (corning, USA)에 well 당 50 ㎕ (250 ng/well)씩 분주하여 4℃에서 overnight 또는 37℃에서 2시간 coating하였다. 2% skim milk/TBST (Tris-buffered saline-Tween 20) 200 ㎕를 분주하여 blocking한 후, TBST로 1회 세정하고 1차 항체로서 hybridoma 배양 상등액을 well 당 50 ㎕씩 분주하여 37℃에서 2시간 반응하였다. TBST로 3회 세정한 후 2차 항체로는 horseradish peroxidase (HRP)가 표식되어 있는 goat anti-mouse IgG (Pierce, USA)를 2% skim milk/TBST로 5,000배 희석하여 well 당 50 ㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 반응하였다. TBST로 5회 세척한 후 tetramethylbenzidine base (TMB, colorreagents) (surmodics, TMBC)를 well 당 50 ㎕ 분주하여 발색하였다. 각 well에 1N H2SO4를 50 ㎕씩 넣어 발색 반응을 중지시킨 후, microplate photometer (Multiskan, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
상술된 바와 같이 제작된 Hybridoma로부터 생성되는 항체를 ELISA로 스크린 한 결과, 최종적으로 8개의 clone (1B3, 5G6, 11-2D9, 15E10, 15-1G9, 17F11, 24-1C6, 36D3)을 선별하였다. 후술하는 바와 같이 8개의 clone을 사용하여 실험예1과 같이 HIRRV 신속 진단키트의 pair test를 실시하였으며, 최종적으로 선별한 융합세포 즉 하이브리도마 세포를 "HIRRV 11-2D9"와 "HIRRV 15E10"으로 명명하였고, 한국세포주연구재단에 2021년 5월 4일자로 기탁하였으며, 각각 수탁번호 KCLRF-BP-00513 및 수탁번호 KCLRF-BP-00514를 부여받았다.
기탁된 clone으로부터 생산된 항체를 사용하여(항체의 이름 : clone의 이름과 동일하게 사용) 특이성 조사를 실시한 결과 HIRRV에 특이적으로 결합하는 단일클론항체임을 확인하였다. 그 후 기탁된 clone으로부터 생산된 항체를 사용하여 HIRRV 신속 진단키트를 제작하였다.
실시예 2
다음과 같은 방법으로 HIRRV에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 11-2D9 및 15E10 pair의 항원 인식부위를 조사하였다.
1. SDS-PAGE
정제된 바이러스의 구조단백질을 분석하기 위해 sodium dodecyle sulfate poly acrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)를 실시하였다. 정제된 바이러스에 동량의 SDS-sample buffer [1.59% SDS, 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8), 14% glycerol (w/v), 0.01% bromophenol blue (w/v), 4% 2-mecaptoethanol (v/v)]를 첨가하여 100℃에서 3분간 열처리한 후 SDS-PAGE (12% acrylamide separating gel, 4% acrylamide stacking gel, 30 mA, 2 hours)를 실시하였다. 전기영동 후, gel은 0.2% coomassie brilliant blue R-250로 염색하여 결과를 확인하였다.
2. Westen blot
HIRRV에 대한 항체의 인식 능력을 확인하기 위하여 western blot 분석을 실시하였다. SDS-PAGE는 위와 동일한 방법으로 실시하였다. 정제된 HIRRV를 사용하여 전기영동 한 후, gel에 있는 단백질을 transblot 장치를 이용하여 144 mA에서 1시간 동안 nitrocellurose membrane에 blotting하였다. Blotting 후 2% skim milk로 blocking하여 1시간 반응시킨 후, 1시간 반응시킨 후, buffer 1 (0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, pH 7.5)으로 15분간 세정하였다. 1차 항체로는 본 연구에서 사용한 단일클론항체의 하이브리도마 세포의 배양 상등액을 2% skim milk로 2배 희석하여 1시간 반응시킨 후 위와 동일한 방법으로 세정하였다. 2차 항체로는 alkaline phosphatase (AP)가 표식되어 있는 goat anti-mouse IgG antibody를 2% skim milk로 1,000배 희석하여 1시간 반응시킨 후 5회 세정하고 발색제 [100 mM Tris-HClm 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2용액 (pH 9.5) 20 ml, NBT (75 mg/ml 4-nitrotetrazolium blure chloride) 90 ㎕, BCIP (50 mg/ml 5-Bromo-4-choloro-3-indolyl phosphate p-toluidine salt/dimethyl-formamide) 7 ㎕]로 발색하여 육안으로 확인하였다. 발색이 완료된 후 발색 정지액 (1 mM DETA, 10 mM Tris-HCl)을 첨가하였다.
기탁된 하이브리도마 세포 KCLRF-BP-00513 및 KCLRF-BP-00514 및 이들로부터 각각 생산된 단일클론항체 11-2D9 및 15E10은 각각 HIRRV의 항원단백질 M과 N에 대한 결합 특이성이 높았다.
실시예 3
플라스틱 지지막부재 위에 다공성박막부재를 적층한 후, 항체접합체부재, 흡수패드부재, 샘플패드부재를 일정 위치에 적층 형성한 후 검사선부재와 대조선부재를 형성하여 다음과 같이 넙치랩도바이러스병 감염 여부 현장검사용 진단키트를 제조하였다.
1.단일클론항체 준비
실시예1을 통해 HIRRV에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 11-2D9 및 15E10을 pair로 준비하였다.
2. 다공성박막부재, 흡수패드부재 및 지지부재 준비
다공성박막부재는 5~12 ㎛의 공극 크기를 갖는 가로 및 세로가 각각 약 4 mm 및 약 70 mm의 크기를 갖는 니트로셀룰로오스막을 준비하였으며, 흡수패드부재는 셀룰로오스(4 mmㅧ18 mm)를 준비하였다. 지지부재는 상용의 스트립형 플라스틱 지지막을 다공성박막부재와 동일한 크기로 준비하였다.
3. 항체접합체부재 준비
① 항체-표지체 접합체 준비
금 나노입자 (40 nm) 용액에 실시예1에서 준비된 단일클론항체 11-2D9를 첨가하여 결합 유무를 확인하여 다음과 같이 항체-표지체 접합체를 준비하였다. 금 나노입자에 0.2M K2CO3를 첨가하면서 단일클론항체 11-2D9와의 반응을 촉진시켰다. 단일클론항체 11-2D9와의 결합이 확인되면 25℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, 10% bovine serum albumin (BSA)을 첨가하여 blocking 시켰다. Washing 버퍼를 이용하여 10,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 수세한 후, 0.45μm 필터로 여과하여 준비된 단일클론항체 11-2D9-금나노입자 접합체를 실험에 사용하기 전까지 4℃에 보관하였다.
② 항체접합체부재 준비
PE 패드(4 mmㅧ6 mm)에 준비된 단일클론항체 11-2D9-금나노입자접합체를 20 cm ㅧ 30 cm 규격 당 20 ml을 분주한 후 하루 동안 건조시켜 항체접합체부재로 골드패드를 준비하였다.
4. 샘플패드부재 준비
유리 섬유재질(4 mmㅧ18 mm)에 Tris 버퍼 (0.1 M Tris, pH 8.5)를 20 cm ㅧ 30 cm 규격 당 35 ml 분주 후, buffer가 충분히 흡수되도록 골고루 펴준 뒤, 실온에서 하루 동안 건조 시켜 샘플패드를 준비하였다.
5. 넙치랩도바이러스병 감염 여부 현장검사용 진단키트 제작
준비된 스트립형 플라스틱 지지막 상에 니트로셀룰로오스막을 플라스틱 지지막에 끼워 넣는 형태로 적층하였다. 니트로셀룰로오스막이 적층된 스트립의 길이방형 일단부에 골드패드를 접착제로 적층하고 타단부에 흡수패드부재를 접착제로 적층하였다. 골드패드를 거의 덮도록 준비된 샘플패드를 접착제로 적층하였다. 그 후 골드패드와 흡수패드가 적층되지 않아 노출된 니트로셀룰로오스막의 표면에 검사선부재와 대조선부재를 각각 형성하였다. 검사선부재는 골드패드로부터 11 mm정도 이격된 위치에 단일클론항체 15E10(1 mg/ml)를 biodot micro-volume airjet로 분주하여 건조시켜 형성하였고, 대조선부재는 검사선 부재와 흡수패드 사이의 니트로셀룰로오스막 표면에 검사선부재와 5 mm간격을 두고 goat anti-mouse IgG (2.5 mg/ml)를 biodot micro-volume airjet로 분주하여 건조시켜 형성하는데, 검사선부재 및 대조선부재에 포함된 단일클론항체 및 이차항체는 액상시료의 흐름에 따라 이동되지 않도록 니트로셀룰오스막 표면에 고정 형성되었다.
비교예 1 내지 55
진단키트 제조시 하기 표 1과 같은 조합으로 단일클론항체 pair를 사용한 것을 제외하면 실시예2와 동일한 방법으로 비교예 진단키트 1 내지 55를 제작하였다.
| 항체접합부재에포함된 항체 | ||||||||
| 1B3 | 5G6 | 11-2D9 | 15-1G9 | 17F11 | 24-1C6 | 36D3 | ||
| 검사선부재에 고정된 항체 | 1B3 | 비교예1 | 비교예2 | 비교예3 | 비교예4 | 비교예5 | 비교예6 | 비교예7 |
| 5G6 | 비교예8 | 비교예9 | 비교예10 | 비교예11 | 비교예12 | 비교예13 | 비교예14 | |
| 11-2D9 | 비교예15 | 비교예16 | 비교예17 | 비교예18 | 비교예19 | 비교예20 | 비교예21 | |
| 15E10 | 비교예22 | 비교예23 | 비교예24 | 비교예25 | 비교예26 | 비교예27 | ||
| 15-1G9 | 비교예28 | 비교예29 | 비교예30 | 비교예31 | 비교예32 | 비교예33 | 비교예34 | |
| 17F11 | 비교예35 | 비교예36 | 비교예37 | 비교예38 | 비교예39 | 비교예40 | 비교예41 | |
| 24-1C6 | 비교예42 | 비교예43 | 비교예44 | 비교예45 | 비교예46 | 비교예47 | 비교예48 | |
| 36D3 | 비교예49 | 비교예50 | 비교예51 | 비교예52 | 비교예53 | 비교예54 | 비교예55 | |
실험예 1
본 발명의 현장검사용 진단키트에서 항체접합부재 및 검사선부재에 동일한 단일클론항체를 사용하거나 서로 다른 단일클론항체 pair를 사용할 경우 검사 민감도가 어떤 경우 더 우수한지 확인하기 위하여 실시예2에서 제조된 넙치랩도바이러스병 감염 여부 현장검사용 진단키트 및 비교예1 내지 55에서 제조된 비교예 진단키트 1 내지 55에 HIRRV (108.5 TCID50/100 ㎕) 100 ㎕ 씩 떨어트린 후 10분 뒤에 결과를 확인하는 pair test를 실시하고, 그 결과를 표 2에 나타냈다.
표 2에 나타난 바와 같이, pair test 결과 실시예2에서 제조된 넙치랩도바이러스병 감염 여부 현장검사용 진단키트가 가장 우수한 감도를 나타내는 것을 알 수 있으므로, 단일클론항체 11-2D9 및 15E10 pair가 가장 우수한 항체 pair임을 확인할 수 있다.
실험예 2
HIRRV에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 11-2D9 및 15E10 pair의 항원 인식부위를 조사하고 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2는 단일클론항체의 HIRRV 인식 분위를 나타낸 웨스턴 블로팅 결과이다 [M: marker (kDa), 1: 11-2D9, 2: 15E10]
도 2로부터 알 수 있듯이 단일클론항체 11-2D9 및 15E10은 각각 HIRRV의 항원단백질 M과 N에 대한 결합 특이성이 높았다.
실험예 3
제조된 현장검사용 진단키트의 민감도를 조사하기 위해 HIRRV 배양액을 희석하여 현장검사용 진단키트의 민감도를 다음과 같이 확인하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
진단키트의 민감도를 조사하기 위해 HIRRV (107.5 TCID50/100 ㎕) 배양액을 버퍼로 희석한 후 (107.5, 106.5, 105.5, 105.2, 104.5 TCID50/100 ㎕)를 각각 키트에 100 ㎕씩 떨어트린 후 10분 뒤에 결과를 확인하였다.
도 3에 도시된 바와 같이, 105.2 TCID50/100 ㎕ 농도까지 검사선에서 붉은색을 나타남을 따라 신속 진단키트의 진단 감도는 105.2 TCID50/100 ㎕로 결정할 수 있었다.
실험예 4
제조된 현장검사용 진단키트의 특이도를 조사하기 위해 HIRRV 배양액과 5종의 어류 바이러스 (VHSV, IHNV, IPNV, MABV, NNV) 배양액을 사용하여 현장검사용 진단키트의 특이도를 다음과 같이 확인하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
진단키트의 특이도를 조사하기 위해 HIRRV (107.5 TCID50/100 ㎕)와 [바이러스성출혈성패혈증바이러스(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV : 107.05 TCID50/100 ㎕), 전염성조혈기괴사증바이러스(infectious hmatopoietic necrosis virus, IHNV: 107.8 TCID50/100 ㎕), 전염성췌장괴사증바이러스(infectious pancrearic necrosis, IPNV: 107.3 TCID50/100 ㎕), 버나바이러스(marine birnavirus, MABV: 107.3 TCID50/100 ㎕), 바이러스성신경괴사증바이러스(nervous necrosis virus, NNV : 107.55 TCID50/100 ㎕)] 배양액을 키트에 100 ㎕씩 떨어트린 후 10분 뒤에 결과를 확인하였다.
도 4에 도시된 바와 같이, HIRRV 배양액에서는 검사선에 붉은선이 나타남을 확인하였고(양성), 5종의 어류 바이러스 (VHSV, IHNV, IPNV, MABV, NNV) 배양액에서는 검사선에 붉은선이 나타나지 않았다(음성). 이 결과로부터 본 발명에서 제조된 넙치랩도바이러스병 감염 여부 현장검사용 진단키트는 HIRRV에 특이적인 반응을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 5
실시예3에서 제조된 넙치랩도바이러스병 감염 여부 현장검사용 진단키트(신속 진단키트)의 현장 유효성을 평가하기 위해 HIRRV 감염 넙치와 정상 넙치를 사용하여 다음과 같이 kit test를 실시하였다.
넙치 치어 (6.98 g)를 사용하여 6℃에서 감염 실험을 실시하였다. 20 L 수조에 20 마리씩 순치한 후, 넙치에 HIRRV (106.5 TCID50/fish)를 복강으로 감염시켰다. 감염 후 20일 동안 폐사를 관찰하였으며, 임의적으로 sampling하였다. 감염 넙치와 정상 넙치의 비장을 HBSS로 1:10이 되게 혼합하여 마쇄한 후 6,000 rpm에서 30분간 원심 분리하여 얻어진 상층액을 사용하여 EPC에 접종한 후 CPE를 관찰하였다. CPE 양성을 보이면 RNA분리를 실시한 후 RT-PCR [primer (oPVP278:5′-ACTACAATCAACAAATCGCA-3′), (oPVP279:5′-GTTGGCGAGTGGGATGTTG??3′)]을 실시하였다. HIRRV 감염 넙치 및 정상 넙치의 비장 조직을 버퍼로 1:10 (0.02 g: 200 ㎕)이 되게 혼합하여 마쇄한 후, 상층액 100 ㎕를 진단키트에 떨어트린 후 10분 뒤에 결과를 확인하였다.
| NO. | HIRRV 감염 넙치 | 정상 넙치 | ||
| 분리배양법 + RT-PCR | 진단키트 | 분리배양법 + RT-PCR | 진단키트 | |
| 1 | + | + | - | - |
| 2 | + | + | - | - |
| 3 | + | + | - | - |
| 4 | + | + | - | - |
| 5 | + | + | - | - |
| 6 | + | + | - | - |
| 7 | + | + | - | - |
| 8 | + | + | - | - |
| 9 | + | + | - | - |
| 10 | + | + | - | - |
| 10/10 | 10/10 | 0/10 | 0/10 | |
표 3은 진단키트를 활용하여 HIRRV 감염 넙치와 정상 넙치에 대한 진단키트의 특이도를 검사하였다. EPC 세포에서 CPE가 관찰되지 않은 정상 넙치 10 마리에서는 검사선에 붉은선이 나타나지 않았고 (음성), EPC 세포에서 CPE가 관찰되고 RT-PCR 결과 양성을 보인 감염 넙치 10 마리에서는 검사선에 붉은선이 나타남을 확인하였다 (양성). 따라서, 본 발명의 실시예3에서 제조된 넙치랩도바이러스병 감염 여부 현장검사용 진단키트가 감염 넙치 모두에 특이적으로 반응하는 것을 확인할 수 있었다.
이상의 실험결과로부터, 본 발명은 넙치랩도바이러스(hirame rhabdovirus, HIRRV)의 항원단백질 M과 N을 특이적으로 결합하는 새로운 단일클론항체 11-2D9 및 15E10와 이를 생산하는 하이브리도마 세포를 개발하고, 이들 한 쌍의 단일클론항체를 사용하여 현장에서 신속하게 진단이 가능한 현장검사용 진단키트를 제조함으로써, 넙치 양식 현장에 신속하고 즉각적으로 활용될 수 있으므로 넙치랩도바이러스병에 대한 질병진단과 예방 및 대처를 통해 안전한 넙치양식을 수행할 수 있는데 현저하게 기여할 것이다.
본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시 예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시 예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.
Claims (21)
- 수탁번호 KCLRF-BP-00513으로 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생산되어 넙치랩도바이러스(hirame rhabdovirus, HIRRV)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 11-2D9.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 단일클론항체 11-2D9는 HIRRV에 감염된 EPC 세포에만 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 11-2D9.
- 제 3 항에 있어서,
상기 HIRRV에 감염된 EPC 세포는 HIRRV의 항원단백질 M을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 11-2D9.
- 제 1 항, 제 3 항, 제 4 항 중 어느 한 항의 단일클론항체 11-2D9를 생산하는 수탁번호 KCLRF-BP-00513으로 기탁된 하이브리도마 세포.
- 수탁번호 KCLRF-BP-00514로 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생산되어 넙치랩도바이러스(hirame rhabdovirus, HIRRV)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 15E10.
- 삭제
- 제 6 항에 있어서,
상기 단일클론항체 15E10은 HIRRV에 감염된 EPC 세포에만 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 15E10.
- 제 8 항에 있어서,
상기 HIRRV에 감염된 EPC 세포는 HIRRV의 항원단백질 N을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 15E10.
- 제 6 항, 제 8 항, 제 9 항 중 어느 한 항의 단일클론항체 15E10을 생산하는 수탁번호 KCLRF-BP-00514로 기탁된 하이브리도마 세포.
- 제 1 항, 제 3 항, 제 4 항 중 어느 한 항의 단일클론항체 11-2D9 및 제 6 항, 제 8 항, 제 9 항 중 어느 한 항의 단일클론항체 15E10 중 하나 이상을 포함하고 넙치랩도바이러스병을 진단하는 진단 조성물.
- 제 11 항의 진단 조성물을 포함하는 넙치랩도바이러스병 진단키트.
- 스트립형상의 다공성박막부재;
상기 다공성박막부재의 길이방향 일단부에 형성되는 흡수패드부재;
상기 다공성박막부재의 길이방향 타단부에 적층 형성되고, 수탁번호 KCLRF-BP-00513으로 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생산되어 넙치랩도바이러스(hirame rhabdovirus, HIRRV)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 11-2D9가 포함되는 항체접합체패드부재;
상기 항체접합체패드부재의 일부 또는 모든 영역에 적층 형성되는 샘플패드부재;
상기 다공성박막부재의 표면 중 상기 항체접합체패드부재 및 상기 흡수패드부재 사이에 위치된 표면상에 일정폭으로 형성되고, 수탁번호 KCLRF-BP-00514로 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생산되어 넙치랩도바이러스(hirame rhabdovirus, HIRRV)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 15E10이 고정되어 포함된 검사선부재; 및
상기 다공성박막부재의 표면 중 상기 검사선부재와 상기 흡수패드부재 사이에 위치된 표면상에 일정폭으로 형성되고, 상기 단일클론항체와 결합하는 이차항체가 고정되는 대조선부재;를 포함하는 넙치랩도바이러스병 감염 여부 현장검사용 진단키트.
- 제 13 항에 있어서,
상기 단일클론항체 11-2D9는 표지체와 접합되어 형성된 항체-표지체 접합체 형태로 상기 샘플패드부재를 통과한 액상시료의 흐름에 따라 이동가능하게 상기 항체접합체패드부재에 형성되는 것을 특징으로 하는 넙치랩도바이러스병 감염 여부 현장검사용 진단키트.
- 제 14 항에 있어서,
상기 표지체는 HRP(Horseradish peroxidase), 알칼리성 인산분해효소(Alkaline phosphatase), 금나노입자, FITC(Poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(Rhodamine-B-isothiocyanate), Cy3, Cy5, 및 로다민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 넙치랩도바이러스병 감염 여부 현장검사용 진단키트.
- 제 13 항에 있어서,
상기 검사선부재의 진단 감도는 105.2 TCID50/100 ㎕인 것을 특징으로 하는 넙치랩도바이러스병 감염 여부 현장검사용 진단키트.
- 제 13 항에 있어서,
상기 대조선부재에 고정되는 이차항체는 마우스가 아닌 포유동물군에서 유래된 anti-mouse IgG인 것을 특징으로 하는 넙치랩도바이러스병 감염 여부 현장검사용 진단키트.
- 제 13 항에 있어서,
상기 다공성박막부재는 니트로셀룰로오스막, PVDF막, 폴리비닐수지필름 또는 폴리스티렌수지필름으로 구성된 그룹에서 선택되는 어느 하나로서 5~12 ㎛의 공극 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 넙치랩도바이러스병 감염 여부 현장검사용 진단키트.
- 제 13 항에 있어서,
상기 다공성박막부재 하부표면에 형성되는 스트립형상의 지지부재를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 넙치랩도바이러스병 감염 여부 현장검사용 진단키트.
- 제 13 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항의 진단키트의 샘플패드부재에 넙치조직 유래 액상시료를 접촉시키는 단계; 및
상기 진단키트의 검사선부재의 양성반응을 탐지하는 단계;를 포함하는 넙치랩도바이러스병 진단방법.
- 제 20 항에 있어서,
상기 샘플패드부재에 넙치조직 유래 액상시료를 접촉시킨 후 20분 이내에 넙치랩도바이러스병의 양성반응을 탐지하여 넙치랩도바이러스병 감염 여부를 검출하는 것을 특징으로 하는 넙치랩도바이러스병 진단방법.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210075407A KR102341370B1 (ko) | 2021-06-10 | 2021-06-10 | 넙치랩도바이러스병 감염 여부 현장검사용 진단키트 및 진단방법 |
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| KR102341370B1 true KR102341370B1 (ko) | 2021-12-21 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102521239B1 (ko) * | 2022-11-09 | 2023-04-12 | 전남대학교산학협력단 | 흰반점증후군바이러스 감염여부 현장검사용 lfia기반 신속진단키트에 사용되는 단클론항체 및 이의 용도 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101865878B1 (ko) | 2017-05-16 | 2018-07-04 | 전남대학교산학협력단 | 넙치랩도바이러스에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도 |
| KR20190138443A (ko) * | 2018-06-05 | 2019-12-13 | 주식회사 바이오노트 | 랍도비리대 과 바이러스 검출용 항체 및 그의 용도 |
-
2021
- 2021-06-10 KR KR1020210075407A patent/KR102341370B1/ko active IP Right Grant
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| KR101865878B1 (ko) | 2017-05-16 | 2018-07-04 | 전남대학교산학협력단 | 넙치랩도바이러스에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도 |
| KR20190138443A (ko) * | 2018-06-05 | 2019-12-13 | 주식회사 바이오노트 | 랍도비리대 과 바이러스 검출용 항체 및 그의 용도 |
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| Date | Code | Title | Description |
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