KR102393881B1 - 버나바이러스병 감염여부 현장검사용 진단키트 및 진단방법 - Google Patents
버나바이러스병 감염여부 현장검사용 진단키트 및 진단방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102393881B1 KR102393881B1 KR1020200083134A KR20200083134A KR102393881B1 KR 102393881 B1 KR102393881 B1 KR 102393881B1 KR 1020200083134 A KR1020200083134 A KR 1020200083134A KR 20200083134 A KR20200083134 A KR 20200083134A KR 102393881 B1 KR102393881 B1 KR 102393881B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- monoclonal antibody
- antibody
- mabv
- disease
- pad member
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 43
- 241001326160 Marine birnavirus Species 0.000 title description 85
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 8
- 238000012123 point-of-care testing Methods 0.000 title 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims abstract description 50
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 46
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 46
- 241000269980 Pleuronectidae Species 0.000 claims abstract description 35
- 238000007689 inspection Methods 0.000 claims abstract description 30
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 47
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 42
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 40
- 239000010409 thin film Substances 0.000 claims description 37
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims description 31
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 30
- 241000269908 Platichthys flesus Species 0.000 claims description 27
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 26
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 claims description 24
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 22
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 21
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 claims description 19
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 claims description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 19
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 19
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 18
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 17
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 15
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 14
- 101710121537 mRNA (guanine-N(7))-methyltransferase Proteins 0.000 claims description 14
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 13
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 13
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000010408 film Substances 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims description 10
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 8
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 7
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 4
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 claims description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229920005990 polystyrene resin Polymers 0.000 claims description 3
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 claims description 3
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 claims description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 2
- UNEAIINSYNBMRP-QAYSAQNBSA-N (2r,3r)-5-(methylamino)-3-(4-phenylpiperidin-1-yl)-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-2-ol Chemical compound C1CN([C@H]2[C@H](O)CC=3C=CC=C(C=3C2)N[11CH3])CCC1C1=CC=CC=C1 UNEAIINSYNBMRP-QAYSAQNBSA-N 0.000 claims 4
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 abstract description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 33
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 32
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 11
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 9
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 241000148627 Hirame novirhabdovirus Species 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 241000711825 Viral hemorrhagic septicemia virus Species 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 5
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 1,4-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C=C1 AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000711804 Infectious hematopoietic necrosis virus Species 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 4
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 241000710921 Infectious pancreatic necrosis virus Species 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 3
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 3
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 3
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 3
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- -1 β-D-glucosidase Proteins 0.000 description 3
- 241001533425 Aquabirnavirus Species 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N Hydroquinone Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1 QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001600434 Plectroglyphidodon lacrymatus Species 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 241000611868 Yellowtail ascites virus Species 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 2
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 2
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 235000014102 seafood Nutrition 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940005561 1,4-benzoquinone Drugs 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 1
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 1
- 102000012440 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 description 1
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000702628 Birnaviridae Species 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000036569 Carp sprivivirus Species 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013460 Malate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010026217 Malate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 108010053210 Phycocyanin Proteins 0.000 description 1
- 241000269978 Pleuronectiformes Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 239000012327 Ruthenium complex Substances 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241000269796 Seriola quinqueradiata Species 0.000 description 1
- 241001492212 Striped Jack nervous necrosis virus Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 125000004057 biotinyl group Chemical class [H]N1C(=O)N([H])[C@]2([H])[C@@]([H])(SC([H])([H])[C@]12[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229910001417 caesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 229910001613 cyprine Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- RAABOESOVLLHRU-UHFFFAOYSA-N diazene Chemical compound N=N RAABOESOVLLHRU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000071 diazene Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 208000010932 epithelial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N ferrocene Chemical compound [Fe+2].C=1C=C[CH-]C=1.C=1C=C[CH-]C=1 KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 238000010030 laminating Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000001151 other effect Effects 0.000 description 1
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N phenyl 10-methylacridin-10-ium-9-carboxylate Chemical compound C12=CC=CC=C2[N+](C)=C2C=CC=CC2=C1C(=O)OC1=CC=CC=C1 RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 1
- 229920006255 plastic film Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 241001507086 salmonid fish Species 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 235000015170 shellfish Nutrition 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N tetratriacontaethylene glycol monomethyl ether Chemical compound COCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O thiamine pyrophosphate Chemical compound CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- DEIKGXRMQUHZJD-UHFFFAOYSA-N trimethylpyrocatechol Natural products CC1=CC(O)=C(O)C(C)=C1C DEIKGXRMQUHZJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54386—Analytical elements
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/01—DNA viruses
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 넙치 종묘양식장에서 대량폐사를 유발하는 넙치 버나바이러스병 진단기술에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 넙치 버나바이러스병에 특이적인 단일클론 항체를 이용하여 20분 이내에 버나바이러스 감염 여부를 진단할 수 있는 현장검사용 진단 키트 및 진단방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 넙치 종묘양식장에서 대량폐사를 유발하는 넙치버나바이러스병 진단기술에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 넙치버나바이러스병에 특이적인 단일클론 항체를 이용하여 20분 이내에 버나바이러스 감염 여부를 진단할 수 있는 현장검사용 진단 키트 및 진단방법에 관한 것이다.
아쿠아버나바이러스(Aquabirnavirus)는 버나바이러스 과(Birnaviridae), 아쿠아버나바이러스 속(Aquabirnavirus)에 속하며, 담수, 기수 및 해수 환경에 서식하는 다양한 어종으로부터 분리되고 있다. 아쿠아버나바이러스 속에 속하는 대표적인 바이러스 종에는 연어과 어류에서 분리되는 infectious pancreatic necrosis virus (IPNV)와 방어(Seriola quinqueradiata)로부터 분리되는 yellowtail ascites virus (YAV)가 있으며, 미분류된 종(tentative species)으로 해수 환경에 서식하는 어류와 패류에서 분리되는 marine birnavirus (MABV)가 있다.
MABV는 해산 양식어류 중 방어, 넙치, 가자미 등에서 분리되고 있으며, 이 바이러스는 RNA바이러스 중 외막을 가지지 않는 정 20면체의 바이러스로 크기는 50-55nm 이다. 해산어에서 분리된 버나 바이러스는 모양과 혈청학적 특성이 담수어에서 분리된 IPNV와 유사하다고 보고되고 있다. 주요 감염 어종은 해산어류 중 방어, 넙치, 가자미 등이다.
버나바이러스병은 수온 10~30℃ (적온 15~18℃)에서 발병되고 어체중 1~ 2.5 g 전후의 자어에서 많이 관찰되며 복수가 고이고 두부와 등뼈 가까이에 출혈이 나타나는 것이 특징이다. 감염된 병어는 수면에 떠서 유영하기도 하고 저면에 정착하기도 한다. 국내뿐만 아니라 일본, 중국 등 해산어류를 양식하는 국가에서 피해를 주는 바이러스성 질병으로 보고되어 있다. 특히, 넙치의 버나바이러스병은 국내뿐만 아니라 일본, 중국 등 해산어류를 양식하는 국가에서 피해를 주는 바이러스성 질병으로 알려져 있다. 국내 넙치류의 양식 생산량은 2015년 45,759톤(금액: 약 5,000억원)인데, 치어(작은 어류)에서 주로 발생하며, 성어(큰 어류)에 있어서는 세균과 혼합감염되어 대량 폐사를 유발하기 때문이다. 한편, 방어의 경우(일본), 치어에 대량 폐사를 유발한다. 원인병원체인 MABV는 해산어 뿐만 아니라 해산 무척추동물에도 검출되고 있어 넓은 숙주역을 지니고 있다.
버나바이러스병의 원인병원체인 marine birna virus (MABV)는 RNA 바이러스로 segment A (3.1 kb)와 segment B (2.8 kb)가 있고, 형태는 63 nm(diameter) [envelop를 갖지 않는 구형(정이십면체) 바이러스로서 4개의 주요 단백질 (capsid protein: VP2 (50 kDa), VP3 (30 kDa), RNA 중합효소: VP1 (94 kDa), VP5 (17 kDa))로 구성되어 있다.
종래 알려진 MABV를 검사하는 방법으로는 어류주화세포를 이용한 분리배양법, 유전자를 이용한 분자생물학적 방법(reverse transcription- polymerase chain reaction (RT-PCR), real time PCR 등), 항체를 이용한 면역학적인 방법(enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 등), 병리조직학적 방법 등이 사용되고 있다.
이들 검사방법의 장단점을 살펴보면, 먼저, 어류주화세포를 이용한 분리배양 방법: 어류 주화세포 (EPC, CHSE-214, RTG-2)를 사용한 바이러스 분리배양 방법은 전 세계적으로 널리 사용하고 있는 방법이긴 하지만 현장에서 직접 검출하는데 사용이 쉽지 않고, 최소 10일 이상의 시간이 소요되어 검출 시간이 다소 길어 질 수 있는 단점이 있으며, 전문 인력과 시설이 요구되고, 한 번에 다수 샘플 처리가 불가능하고 다수의 샘플 검사 시 많은 비용이 소요된다는 단점이 있다.
분자생물학적 방법의 경우, MABV 게놈을 표적으로 한 PCR 방법은 특이도와 민감도가 우수하여 전 세계적으로 널리 사용하고 있는 방법이긴 하지만 현장에서 직접 검출하는데 사용이 쉽지 않고, 검체 시료의 전처리 등을 위한 시간이 필요함에 따라 최소 1일 이상 소요되어 전체 검출 시간이 다소 길어 질 수 있는 단점이 있으며, 역시 전문 인력과 시설이 요구되고, 한 번에 다수의 샘플 처리가 불가능하며, 다수의 샘플 검사 시 많은 비용이 소요될 뿐만 아니라, PCR 검사를 통해 병원체가 검출되어도 어체 내에서 병원체의 감염상태 파악이 불가능한 문제점이 있다.
면역학적 방법의 경우, MABV에 특이적으로 반응하는 항체를 활용한 면역학적 기법 (ELISA 등)은 특이도와 민감도가 우수하며, 다수의 시료 처리가 가능하다는 장점을 가지고 있으나 현장에서 사용하기 불가능하며, 검체 시료의 전처리 등을 위한 시간이 필요함에 따라 최소 1일 이상이 소요되어 전체 검출 시간이 다소 길어 질 수 있는 단점이 있고, 전문 인력과 시설이 요구되며, 병원체에 대한 항체를 보유하고 있어야만 검사가 가능하다.
따라서, 현장에서의 빠른 대처를 위해 넙치버나바이러스병을 양식 현장에서 신속하게 검출할 수 있는 새로운 진단기술이 요구되고 있는 실정이다.
따라서, 본 발명의 목적은 넙치양식장에서 주로 치어기에 발생하며 대량폐사를 유발하는 버나바이러스병을 일으키는 원인바이러스인 넙치버나바이러스 (marine birna virus, MABV)에 감수성 및 특이성이 있는 단일클론 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 넙치버나바이러스(MABV)에 감수성 및 특이성이 있는 단일클론항체를 생산하는 융합세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 넙치버나바이러스(MABV)에 의해 발병하는 어류의 버나바이러스병의 진단, 치료 및 예방에 용이하게 이용할 수 있는 버나바이러스병 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 넙치버나바이러스(MABV)에 감수성 및 특이성이 있는 단클론 항체를 이용하여 넙치의 버나바이러스병을 20분 이내에 진단할 수 있는 현장 검사용 신속 진단키트 및 현장진단방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상술된 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 넙치버나바이러스(Marine birnavirus, MABV)의 항원단백질 VP3과 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 38B5를 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 단일클론항체 38B5는 수탁번호 KCLRF-BP-00482로 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생산된다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 단일클론항체 38B5는 MABV에 감염된 EPC 세포에서만 나타나는 VP3 유사물질에 특이적으로 결합한다.
또한, 본 발명은 상술된 어느 하나의 단일클론 항체 38B5를 생산하는 수탁번호 KCLRF-BP-00482로 기탁된 하이브리도마 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 넙치버나바이러스(Marine birnavirus, MABV)의 항원단백질 VP3과 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 47E3을 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 단일클론항체 47E3은 수탁번호 KCLRF-BP-00483으로 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생산된다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 단일클론항체 47E3은 MABV에 감염된 EPC 세포에서만 나타나는 VP3 유사물질에 특이적으로 결합한다.
또한, 본 발명은 상술된 어느 하나의 단일클론 항체 47E3을 생산하는 수탁번호 KCLRF-BP-00483으로 기탁된 하이브리도마 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상술된 어느 하나의 단일클론항체 38B5 및 상술된 어느 한 항의 단일클론항체 47E3 중 하나 이상을 포함하고 어류의 버나바이러스병을 진단하는 진단 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상술된 진단 조성물을 포함하는 어류의 버나바이러스병 진단 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 스트립형상의 다공성박막부재; 상기 다공성박막부재의 길이방향 일단부에 형성되는 흡수패드부재; 상기 다공성박막부재의 길이방향 타단부에 적층 형성되고, 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 단일클론항체 38B5가 포함되는 항체접합체패드부재; 상기 항체접합체패드부재의 일부 또는 모든 영역에 적층 형성되는 샘플패드부재; 상기 다공성박막부재의 표면 중 상기 항체접합체패드부재 및 상기 흡수패드부재 사이에 위치된 표면상에 일정폭으로 형성되고, 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 단일클론항체 47E3이 고정되는 검사선부재; 및 상기 다공성박막부재의 표면 중 상기 검사선부재와 상기 흡수패드부재 사이에 위치된 표면상에 일정폭으로 형성되고, 상기 단일클론항체와 결합하는 이차항체가 고정되는 대조선부재;를 포함하는 버나바이러스병 감염여부 현장검사용 진단키트를 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 단일클론항체 38B5는 표지체와 접합되어 형성된 항체-표지체 접합체 형태로 상기 샘플패드부재를 통과한 액상시료의 흐름에 따라 이동가능하게 상기 항체접합체패드부재에 형성된다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 표지체는 HRP(Horseradish peroxidase), 알칼리성 인산분해효소(Alkaline phosphatase), 금나노입자, FITC(Poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(Rhodamine-B-isothiocyanate), Cy3, Cy5, 및 로다민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나이다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 검사선부재의 진단 감도는 105.3 TCID50/100 ㎕이다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 대조선부재에 고정되는 이차항체는 마우스가 아닌 포유동물군에서 유래된 anti-mouse IgG이다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 다공성박막부재는 니트로셀룰로오스막, PVDF막, 폴리비닐수지필름 또는 폴리스티렌수지필름으로 구성된 그룹에서 선택되는 어느 하나로서 5~12㎛의 공극 크기를 갖는다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 다공성박막부재 하부표면에 형성되는 스트립형상의 지지부재를 더 포함한다.
또한, 본 발명은 상술된 어느 하나의 진단키트의 샘플패드부재에 넙치조직 유래 액상시료를 접촉시키는 단계; 및 상기 진단키트의 검사선부재의 양성반응을 탐지하는 단계;를 포함하는 넙치의 버나바이러스병 진단방법을 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 넙치조직은 비장이다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 샘플패드부재에 넙치조직 유래 액상시료를 접촉시킨 후 20분 이내에 버나바이러스병의 양성반응을 탐지하여 버나바이러스병 감염여부를 검출한다.
상술된 본 발명에 의하면 넙치양식장에서 주로 치어기에 발생하며 대량폐사를 유발하는 버나바이러스병을 일으키는 원인바이러스인 넙치버나바이러스 (marine birna virus, MABV)에 감수성 및 특이성이 있는 단일클론 항체 및 이를 생산하는 융합세포주를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 버나바이러스병 진단용 조성물은 넙치버나바이러스(MABV)에 의해 발병하는 어류의 버나바이러스병의 진단, 치료 및 예방에 용이하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명이 현장 검사용 신속 진단키트 및 현장진단방법에 의하면 넙치버나바이러스(MABV)에 감수성 및 특이성이 있는 단클론 항체를 이용하여 넙치의 버나바이러스병을 20분 이내에 진단할 수 있어 현장 적용성이 우수하므로, 신속한 질병진단과 예방 및 대처를 통해 본 질병에 의한 피해를 최소화함으로써 안전한 넙치양식을 수행할 수 있다.
본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 버나바이러스병 감염여부 현장검사용 진단 키트의 사용법을 나타낸 개략도이다.
도 2은 본 발명의 실시예에 따른 넙치버나바이러스병 감염여부 현장검사용 진단 키트의 MABV 배양액에 대한 진단 민감도 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 3는 본 발명의 실시예에 따른 감염여부 현장검사용 진단 키트의 MABV와 어류 바이러스 (VHSV, IHNV, SVCV, HIRRV, NNV)에 대한 특이도 측정 결과이다.
도 2은 본 발명의 실시예에 따른 넙치버나바이러스병 감염여부 현장검사용 진단 키트의 MABV 배양액에 대한 진단 민감도 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 3는 본 발명의 실시예에 따른 감염여부 현장검사용 진단 키트의 MABV와 어류 바이러스 (VHSV, IHNV, SVCV, HIRRV, NNV)에 대한 특이도 측정 결과이다.
본 발명에서 사용되는 용어는 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어를 선택하였으나, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있는데 이 경우에는 단순한 용어의 명칭이 아닌 발명의 상세한 설명 부분에 기재되거나 사용된 의미를 고려하여 그 의미가 파악되어야 할 것이다.
본 발명에서 사용된 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 marine birna virus (MABV)의 감염 여부를 확인하는 것이다.
이하, 첨부한 도면 및 바람직한 실시예들을 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다.
그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐 본 발명을 설명하기 위해 사용되는 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.
본 발명의 기술적 특징은 MABV에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 상기 단일클론항체를 생산하는 융합세포를 개발하고, MABV에 감수성 및 특이성이 있는 단클론항체를 이용하여 제조된 어류 특히 넙치의 버나바이러스병 감염여부를 20분 이내에 진단할 수 있는 현장 검사용 신속 진단키트 및 현장진단방법에 있다.
즉, 종래 공지된 넙치버나바이러스 감염여부 검출방법은 최소 1일 이상의 시간이 소요되며, 전문 인력과 시설이 요구되고, 병원체에 대한 항체를 보유하고 있어야만 검사가 가능하여 현장 적용성이 매우 떨어졌으나, 본 발명은 MABV 구조단백질을 에피토프로 하여 MABV에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 상기 단일클론항체를 생산하는 융합세포를 개발하고, 이를 이용하여 20분 이내에 넙치버나바이러스 감염여부 확인이 가능한 신속진단 키트 및 진단 방법을 개발했기 때문이다.
따라서, 본 발명은 넙치버나바이러스(Marine birnavirus, MABV)의 항원단백질 VP3과 특이적으로 결합할 뿐만 아니라 MABV에 감염된 EPC 세포에서만 나타나는 VP3 유사물질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 38B5 또는 단일클론항체 47E3을 제공한다.
본 발명에서 "38B5 항체"또는 "단일클론항체 38B5"는 수탁번호 KCLRF-BP-00482로 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체를 의미하고, "47E3 항체"또는 "단일클론항체 47E3"은 수탁번호 KCLRF-BP-00483으로 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체를 의미한다.
단일클론항체는 당업자에 알려진 융합에 의한 불멸화된 세포주 생성기술 (Koeher and Milstein, Nature, 256:495 (1975))에 의하여 제조될 수 있다. 그 제조방법을 간단히 설명하면 다음과 같다. 먼저 순수한 단백질을 약 20 ㎍을 얻어서 쥐에 면역화를 시키거나 펩타이드를 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 쥐에 면역화시킨다. 그 후 쥐에서 분리된 항원-생산 B 임파구를 인간 또는 마우스의 골수종세포와 융합하여 불멸화된 하이브리도마를 생성한다. 이어, ELISA (Enzymelinked immunosorbent assay)로 하이브리도마 세포의 단일클론항체의 생성여부를 알아보고 양성 클론을 택하여 배양한 후 항체를 분리 정제하거나 쥐의 복강에 주입한 후 복수를 채취한다.
먼저 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조에 필요한 마우스를 면역화시켰다. 구체적으로는, MABV를 배양하여 농축 및 정제한 후 정제된 바이러스 구조단백질을 인산염 완충액(phosphate buffered saline; PBS)에 희석하고 동일한 부피의 프로인트 완전 아주반트(complete Freund's adjuvant, Sigma)와 혼합하여 에멀젼을 제조한 후, 상기 에멀젼을 마우스의 발바닥에 1차 주사하였다. 1차 면역화 후 2주 후에 마우스로부터 채혈한 후 ELISA를 실시하여 항체가를 측정하였으며, 마우스의 면역성을 높이기 위하여 정제된 바이러스만을 사용하여 2차 면역하였다. 2차 면역화 후 1주 후에 3차 면역화하고, 마지막 면역화한 후 3일 후에 면역화된 마우스로부터 흉선조직을 적출하였다. 적출된 흉선조직과 골수종 세포인 Sp2/0Ag14 세포를 세포수를 기준으로 10:1의 비율로 혼합하고 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 넣어 세포 융합시키고 배양하였다.
상기 융합세포군 중에서 MABV에만 특이적으로 반응하는 융합세포들을 선별하고, 선별된 융합세포가 단일클론이 되도록 제한 희석법(limiting dilution)을 사용하여 융합세포를 희석한 후, 하나의 세포로부터 증식한 융합세포의 흡광도(O.D 값)를 ELISA로 확인하여 흡광도가 가장 우수한 6개의 단일클론을 선별하였다. 선별된 6개의 단일클론을 각각 마우스에 주사하고, 마우스의 혈청으로부터 MABV에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 15E3, 32A6, 35A7, 38B5, 41E1, 47E3을 분리하였다. 그 후 후술하는 실험예와 같이 6개의 단일클론항체에 대해 MABV 신속진단 키트를 위한 pair test를 실시하고 그 결과에 따라 최종적으로 선택한 2개의 단일클론항체를 생산하는 융합세포 즉 하이브리도마 세포를 각각 "MABV 38B5" 및 "MABV 47E3"로 명명하였으며, 한국세포주연구재단에 2020년 5월 19일자로 기탁하여 각각 수탁번호 KCLRF-BP-00482 및 KCLRF-BP-00483을 부여 받았다.
또한, 기탁된 하이브리도마 세포 KCLRF-BP-00482 및 KCLRF-BP-00483 및 이들로부터 각각 생산된 단일클론항체 38B5 및 47E3은 모두 MABV 특히 MABV의 항원단백질 VP3에 대한 결합 특이성이 높았고, 더 나아가 MABV에 감염된 EPC 세포에서만 나타나는 VP3 유사물질에 대한 결합 특이성도 높음을 확인하였다.
다음으로, 본 발명은 단일클론항체 38B5 및 단일클론항체 47E3 중 하나 이상을 포함하는 진단 조성물 및 진단키트를 제공할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 MABV의 감염 여부를 확인하는 것이다.
본 발명의 항체를 이용하여 시료, 예를 들면 어류조직에 포함된 MABV를 분석하는 방법으로는 통상의 항원-항체반응의 분석법을 사용할 수 있다. 예컨대, 면역 검정(측정)법으로는 효소 면역 측정법(ELISA), 형광면역 측정법(FIA), 방사선 면역 측정법(RIA), 발광 면역 측정법, 면역블롯(immunoblot)법, 웨스턴 블롯(western blot)법, 면역 염색법 등이 있다.
본 발명의 진단용 조성물은 단일클론항체 38B5 및/또는 단일클론항체 47E3 이외에 면역학적 분석에 사용되는 당업계에 공지된 시약 등을 추가로 포함할 수 있다.
면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며 비제한적인 예로서, 면역세포화학 및 면역조직화학, 방사선 면역 분석법, ELISA, 면역블롯, 파아르 분석법, 면역침강, 라텍스 응집, 적혈구 응집, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법, 면역크로마토그래피법, 단백질 칩 및 면역형광법 등이 있다.
면역학적 분석에 사용되는 시약으로는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제가 포함되며, 표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.
상기에서 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지는 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하는데, 이의 예로는 효소, 형광물질, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위원소 등이 있다. 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글루코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을 사용할 수 있다. 형광물로는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있다. 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있고 레독스 분자로는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 다이이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있다. 방사성 동위원소로는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있는 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.
본 발명의 진단용 조성물은 진단의 신속도 및 편리성을 높이기 위해, 공지된 다양한 방법을 이용하여 적합한 담체 또는 지지체상에 고정된 상태로 제공될 수 있다. 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs) 등이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.
본 발명의 진단용 조성물은 진단용 키트 또는 마이크로어레이 형태로 제공될 수 있다. 진단용 키트로는 예를 들면, 시료 중의 특정 단백질을 검출하기 위해 면역크로마토그래피법을 기초로 하는 측방 유동 검정 키트(lateral flow assay kit)의 형태로 제공될 수 있다. 측방 유동 검정 키트는 통상 시료가 적용되는 샘플패드(sample pad), 탐지용 항체가 코팅되어 있는 골드패드(gold pad), 시료가 이동하여 분리되고 항원-항체 반응이 일어나는 전개용 막(예를 들어 니트로셀룰로스) 또는 스트립, 그리고 흡수패드(absorption pad)로 이루어진다.
마이크로어레이는 일반적으로 특정 시약으로 처리된 슬라이드글라스 표면 위에 항체를 부착하여 항원-항체 반응에 의해 상기 항체에 특이적으로 부착하는 단백질을 검출할 수 있도록 하는 것이다. 이와 같이 마이크로어레이를 사용하게 되면 MABV에 특이적인 항체인 단일클론항체 38B5 및 단일클론항체 47E3 중 하나 이상을 생물학적 마이크로칩 (Biological microchip) 상에 고정시킨 후 대상어류로부터 분리된 검체 시료와 반응시켜 상기 항체 단백질에 대한 항원을 검출할 수 있는 생물학적 마이크로칩(Biological microchip) 및 자동화된 미세배열 시스템 (Microarray system)을 이용하면, 대량으로 시료를 분석할 수 있다.
본 발명에서 MABV를 인식하는 단일클론항체 38B5 및 단일클론항체 47E3 중 하나 이상을 이용하는 면역 검정의 바람직한 예로서, ELISA 법을 들 수 있다. ELISA 법은 일반적인 경합법, 샌드위치법 등의 수법에 따라 실시할 수 있고, 액상계 또는 고체상태계에서도 실시할 수 있다.
본 발명의 버나바이러스병 진단용 키트(kit)는 본 발명의 단일클론항체 38B5 및 단일클론항체 47E3 중 하나 이상을 포함하는 것으로, 상기 진단용 키트는 필요에 따라 면역 반응을 이용하고, 웰, 염색제, 검출용의 효소 표지 항체, 세척액, 항체 희석액, 검체 희석액, 효소 기질, 효소 기질액 희석액, 그밖의 시약을 포함할 수 있을 것이다.
마지막으로, 본 발명은 현장에서 신속진단이 가능하도록 버나바이러스병 감염여부 현장검사용 진단키트를 제공하는데, 현장검사용 진단키트는 스트립형상의 다공성박막부재; 상기 다공성박막부재의 길이방향 일단부에 형성되는 흡수패드부재; 상기 다공성박막부재의 길이방향 타단부에 적층 형성되고, 단일클론항체 38B5가 포함되는 항체접합체패드부재; 상기 항체접합체패드부재의 일부 또는 모든 영역에 적층 형성되는 샘플패드부재; 상기 다공성박막부재의 표면 중 상기 항체접합체패드부재 및 상기 흡수패드부재 사이에 위치된 표면상에 일정폭으로 형성되고, 단일클론항체 47E3이 고정되는 검사선부재; 및 상기 다공성박막부재의 표면 중 상기 검사선부재와 상기 흡수패드부재 사이에 위치된 표면상에 일정폭으로 형성되고, 상기 단일클론항체와 결합하는 이차항체가 고정되는 대조선부재;를 포함할 수 있다.
여기서, 다공성박막부재는 항원-항체 결합 반응을 위한 고정체로 기능하면서 분석을 위한 액상시료가 모세관현상을 통해 일단부에서 타단부로 이동시킬 수 있도록 하기만 하면 공지된 기술이 모두 적용될 수 있는데 일 구현예로서 니트로셀룰로오스막, PVDF막, 폴리비닐수지필름 또는 폴리스티렌수지필름으로 구성된 그룹에서 선택되는 어느 하나의 소재로 형성된 스트립일 수 있다. 다공성박막부재를 위한 스트립의 크기는 적정량의 분석시료를 이송시키고, 분석 시료 내의 검체와 분석 스트립과의 반응 정도를 관찰할 수 있는 정도의 크기면 되기 때문에 크기에 특별한 제한이 없지만 대략 가로 5mm이하, 세로 100mm 이하의 크기를 가질 수 있다. 또한, 다공성박막부재의 내부에는 5~12㎛의 직경을 가지는 미세 기공이 다수 형성되어 있어 MABV가 포함된 액상시료가 단일클론항체-표지체 접합체와 함께 다공성박막부재로 용이하게 흡수되어 이동될 수 있도록 구성될 수 있다.
항체접합체패드부재는 다공성박막부재의 길이방향 일단부에 적층 형성되는 구성요소로서, 특히 샘플패드부재를 통과한 액상시료가 항체접합체패드부재를 통과할 때 단일클론항체가 표지체와 접합되어 형성된 항체-표지체 접합체가 액상시료에 함유되어 액상시료의 흐름에 따라 이동 가능하도록 포함될 수 있다. 그 결과 다공성박막부재의 일단부에 투입되어 샘플패드부재를 통과한 액상시료는 항체접합체패드부재를 통과하면서 항체접합체패드부재에 포함된 항체-표지체 접합체가 함유된 상태로 다공성박막부재의 타단부에 적층 형성된 흡수패드부재로 이동하게 되는 구성을 갖고 있다. 여기서, 항체-표지체 접합체는 수탁번호 KCLRF-BP-00482로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산되어 MABV의 항원단백질 VP3과 특이적으로 결합하는 단일클론항체 38B5와 HRP(Horseradish peroxidase), 알칼리성 인산분해효소(Alkaline phosphatase), 금나노입자, FITC(Poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(Rhodamine-B- isothiocyanate), Cy3, Cy5, 및 로다민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 표지체가 접합(conjugate)된 것일 수 있다. 따라서, 액상시료에 MABV가 존재하면 항체-표지체 접합체의 단클론항체와 MABV의 항원단백질이 결합된 상태 즉 "MABV의 항원단백질 VP3-항체-표지체 접합체"가 형성되어 액상시료의 흐름을 따라 이동하게 되고, 액상시료에 MABV가 존재하지 않으면 "항체-표지체 접합체"만 이동하게 된다.
흡수패드부재는 다공성박막부재의 길이방향 타단부에 형성되는 구성요소로서, 다공성박막부재를 통한 액상시료의 흐름을 유도할 수 있는 흡수패드를 구성할 있기만 하면 소재 및 구조는 제한되지 않으나, 일 구현예로서 셀룰로오스가 사용될 수 있을 것이다.
샘플패드부재는 항체접합체패드부재의 일부 또는 모든 영역에 적층 형성되어 분석 또는 진단을 위한 검체의 분쇄조직이 포함된 액상시료를 어느 정도 필터링할 수 있기만 하면 공지된 모든 구성이 사용될 수 있는데, 일 구현예로서 유리섬유 재질로 구성될 수 있다.
검사선부재는 다공성박막부재의 양단부에 각각 적층 형성된 항체접합체패드부재 및 흡수패드부재 사이에 위치되어 노출된 다공성박막부재의 표면상에 일정폭으로 형성되고, 수탁번호 KCLRF-BP-00483으로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산되어 MABV의 항원단백질 VP3과 특이적으로 결합하는 단일클론항체 47E3이 고정되어 이루어지는데, 검사선부재 형성시 다공성박막부재의 표면에 단일클론항체가 고정되어 액상시료의 흐름에 따라 이동되지 않기만 하면 공지된 모든 기술이 사용가능하다. 필요한 경우 안정제로 BSA, sucrose 또는 Tween 20등과 같은 비이온성 계면 활성제를 일정량 사용할 수도 있다.
대조선부재는 검사선부재와 흡수패드부재 사이에 위치되어 노출된 다공성박막부재의 표면상에 일정폭으로 형성되고, 단일클론항체와 결합하는 이차항체가 고정되어 이루어지는데, 대조선부재 형성시 다공성박막부재의 표면에 이차항체가 고정되어 액상시료의 흐름에 따라 이동되지 않기만 하면 공지된 모든 기술이 사용가능하다. 필요한 경우 안정제로 BSA, sucrose 또는 Tween 20등과 같은 비이온성 계면 활성제를 일정량 사용할 수도 있다. 또한, 대조선부재에 고정되는 이차항체는 마우스가 아닌 포유동물군(염소, 면양, 토끼 등)에서 유래된 anti-mouse IgG로서 항체-표지체 접합체의 단일클론항체와 결합할 수 있다.
이와 같이 구성된 본 발명의 MABV 감염여부 현장검사용 진단키트는 도 1에 도시된 개략적인 구성 및 사용법이 명시되었고 시제품으로 구현될 수 있으므로 그 사용이 매우 간단하다. 즉, 본 발명의 진단키트의 샘플패드부재로 분석을 위한 액상시료를 투입하면 액상시료에 MABV의 존재 여부에 따라 다음과 같은 원리로 검사선부재와 대조선부재의 발색반응을 통해 분석하고자 하는 액상시료가 MABV 감염여부를 육안으로 확인할 수 있기 때문이다.
구체적으로 살펴보면, 먼저 분석하고자 하는 검체의 조직이 마쇄된 액상시료를 준비한 후 본 발명의 진단키트의 샘플패드부재에 투입시킨다. 샘플패드부재에 투입된 액상시료는 샘플패드부재를 통과하면서 액상시료에 포함된 검체의 마쇄조직이 적절한 크기로만 존재하도록 여과되어 액상시료가 다공성박막부재를 균일하게 통과될 수 있다. 이 때, 액상시료에 MABV가 존재하면 샘플패드부재를 통과한 액상시료가 그 하부에 위치한 항체접합체패드부재를 지나면서 항체접합체패드부재에 존재하는 항체-표지체 접합체와 액상시료에 존재하는 MABV의 항원단백질 VP3이 결합하여 VP3-항체-표지체 접합체가 형성되어 액상시료에 함유되고, 액상시료가 검사선부재를 통과하게 되면 액상시료에 포함된 VP3-항체-표지체 접합체가 검사선부재에 고정된 단일클론항체와 결합되어 반응하면서 발색반응을 하게 되므로 MABV 감염여부를 손쉽게 확인 할 수 있다. 반면, 샘플패드부재로 투입되는 분석을 위한 액상시료에 MABV가 존재하지 않으면 샘플패드부재를 통과한 액상시료에 MABV의 항원단백질 VP3이 존재하지 않으므로 그 하부에 위치한 항체접합체패드부재를 지나면서 항체접합체패드부재에 존재하는 항체-표지체 접합체는 VP3-항체-표지체 접합체를 형성하지 않고 항체-표지체 접합체 상태로 액상시료에 포함되므로 액상시료가 검사선부재를 통과하더라도 액상시료에 포함된 항체-표지체 접합체는 검사선부재에 고정된 단일클론항체와 결합반응이 일어나지 않아 발색반응이 일어나지 않게 된다.
또한, 액상시료에 MABV가 포함되는지 여부와 무관하게 항체접합제패드부재를 지나면서 액상시료에 포함되는 항체-표지체 접합체가 검사선부재를 지나서 대조선부재에 이르게 되면, 대조선부재에 고정된 이차항체와 결합되게 되므로 대조선부재에서는 항상 발색반응이 일어나게 된다. 이러한 대조선부재를 통해 본 발명의 MABV 감염여부 현장검사용 진단키트가 정상적으로 동작하는 것을 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명의 넙치의 버나바이러스병 진단방법은 상술된 구성을 갖는 진단키트의 샘플패드부재에 넙치조직 유래 액상시료를 접촉시키는 단계; 및 상기 진단키트의 검사선부재의 양성반응을 탐지하는 단계;를 포함할 수 있다. 여기서, 넙치 조직은 비장이고, 샘플패드부재에 넙치 조직 유래 액상시료를 접촉시킨 후 20분 이내에 넙치버나바이러스병의 양성반응을 탐지하여 넙치버나바이러스병 감염여부를 검출할 수 있다. 일 구현예로서 도 1에 도시된 바와 같이, 넙치의 비장조직을 적출하여 조직 : buffer 비율이 1:10으로 하여 마쇄한 후 상층액 100 ㎕를 키트에 떨어트린 후 10분 뒤에 결과를 확인하여 검사선에 붉은선이 나타나면 양성, 검사선에 붉은선이 나타나지 않으면 음성으로 판단할 수 있다.
실시예 1
다음과 같은 방법으로 넙치 버나바이러스(marine birna virus, MABV)의 항원단백질 VP3과 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 준비하였다.
1. 바이러스 배양
넙치버나바이러스(MABV)를 대량으로 배양하기 위하여 75㎠ tissue culture flask (Nunc, Denmark)에 epithelioma papilosum cyprine (EPC)를 단층으로 배양한 후 바이러스를 접종하여 15℃에서 10일간 배양하면서 cytopathic effect (CPE)를 관찰하였다. 세포에 바이러스가 감염되어 90% 이상 용해된 세포 배양액을 4℃에서 12,000 rpm으로 30분간 원심 분리하여 세포 잔여물을 제거한 후 상층액을 분리하였다. 분리된 바이러스 상층액은 실험에 사용되기 전까지 ??80℃에서 보관하였다.
2. 바이러스의 농축 및 정제
바이러스 배양액에 polyethlene glycol (PEG)-6000 (sigma, USA)과 NaCl을 각각 7.5% (w/v), 2.3% (w/v)로 첨가한 후 4℃에서 overnight 하였다. PEG가 처리 된 바이러스 배양액을 4℃에서 12,000 rpm으로 30분간 원심 분리 한 후 pellet을 phosphate buffer saline (PBS: 0.13M NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4)완충용액으로 현탁하였다. 현탁액은 30,000 rpm에서 2시간 동안 초원심을 실시한 후 pellet을 PBS로 재부유 시켜 바이러스를 농축하였다. 바이러스를 정제하기 위해, 농축된 바이러스를 step sucrose gradient (10%, 55% sucrose 용액 (w/v)) 위에 넣은 후 21,000 rpm으로 2시간 동안 초원심 분리를 실시하였다. 20%와 35% 경계 지점에 형성된 바이러스로 추정되는 band를 주사기를 이용해 취한 후, PBS로 현탁하여 30,000 rpm으로 2시간 동안 초원심 분리하였다. 원심 분리 후 얻어진 침전물은 PBS 완충용액으로 다시 재현탁하여 실험에 사용되기 전까지 ??80℃에 보존하였다.
3.바이러스 면역 및 hybridoma 제작
면역은 정제 재조합 단백질 (약 100 ㎍)와 complete freunds adjuvant를 1:1 비율로 혼합하여 BALB/c 마우스의 발바닥에 1차 면역하였다. 2주 후 마우스로부터 채혈한 후 ELISA를 실시하여 항체가를 측정하였으며, 재조합 단백질만을 사용하여 2차 면역하였다. 1주후 3차 면역시켰고, 면역 3일 후 마우스의 흉선 조직을 분리한 후 PEG 1500 (Roche, USA)를 이용하여 myeloma cell (Sp2/0Ag14)과 융합시킨 후 hypoxanthine, thymidine (HT) (gibco, USA) 배지를 사용하여 96 well plate (TPP, Switzerland)에 분주하여 CO2배양기에서 37℃로 배양하여 hybridoma를 제작하였다.
4. Hybridoma의 screening
바이러스에 대하여 특이적으로 반응하는 항체를 생산하는 hybridoma를 screening 하기 위하여 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)를 실시하였다. 항원은 정제된 바이러스액을 96 well plate (corning, USA)에 well 당 50 ㎕ (250 ng/well)씩 분주하여 4℃에서 overnight 또는 37℃에서 2시간 coating하였다. 2% skim milk/TBST (Tris-buffered saline-Tween 20) 200 ㎕를 분주하여 blocking한 후, TBST로 1회 세정하고 1차 항체로서 hybridoma 배양 상등액을 well 당 50 ㎕씩 분주하여 37℃에서 2시간 반응하였다. TBST로 3회 세정한 후 2차 항체로는 horseradish peroxidase (HRP)가 표식되어 있는 goat anti-mouse IgG (Pierce, USA)를 2% skim milk/TBST로 5,000배 희석하여 well 당 50 ㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 반응하였다. TBST로 5회 세척한 후 tetramethylbenzidine base (TMB, colorreagents) (surmodics, TMBC)를 well 당 50 ㎕ 분주하여 발색하였다. 각 well에 1N H2SO4를 50 ㎕씩 넣어 발색 반응을 중지시킨 후, microplate photometer (Multiskan, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
상술된 바와 같이 제작된 Hybridoma로부터 생성되는 항체를 ELISA와 western blot으로 스크린 한 결과, 최종적으로 6개의 clone (15E3, 32A6, 35A7, 38B5, 41E1, 47E3)을 선별하였다. 후술하는 바와 같이 6개의 clone을 사용하여 실험예1과 같이 MABV 신속진단 키트의 pair test를 실시하였으며, 최종적으로 선별한 융합세포 즉 하이브리도마 세포를 "MABV 37B5"와 "MABV 47E3"으로 명명하였고, 한국세포주연구재단에 2020년 5월 19일자로 기탁하였으며, 각각 수탁번호 KCLRF-BP-00482 및 수탁번호 KCLRF-BP-00483을 부여받았다.
기탁된 clone으로부터 생산된 항체를 사용하여(항체의 이름 : clone의 이름과 동일하게 사용) 특이성 조사를 실시한 결과 MABV의 항원단백질 VP3과 특이적으로 결합하는 단일클론항체임을 확인하였다. 그 후 기탁된 clone으로부터 생산된 항체를 사용하여 MABV 신속진단 키트를 제작하였다.
실시예 2
플라스틱 지지막부재 위에 다공성박막부재를 적층한 후, 항체접합체부재, 흡수패드부재, 샘플패드부재를 일정 위치에 적층 형성한 후 검사선부재와 대조선부재를 형성하여 다음과 같이 버나바이러스병 감염여부 현장검사용 진단키트를 제조하였다.
1.단일클론항체 준비
실시예1를 통해 MABV의 항원단백질 VP3과 특이적으로 결합하는 단일클론항체 38B5 및 47E3을 pair로 준비하였다.
2. 다공성박막부재, 흡수패드부재 및 지지부재 준비
다공성박막부재는 5~12㎛의 공극 크기를 갖는 가로 및 세로가 각각 약 4mm 및 약 70mm의 크기를 갖는 니트로셀룰로오스막을 준비하였으며, 흡수패드부재는 셀룰로오스(4mmㅧ18mm)를 준비하였다. 지지부재는 상용의 스트립형 플라스틱 지지막을 다공성박막부재와 동일한 크기로 준비하였다.
3. 항체접합체부재 준비
① 항체-표지체 접합체 준비
금 나노입자 (40nm) 용액에 실시예1에서 준비된 단일클론항체 38B5를 첨가하여 결합 유무를 확인하여 다음과 같이 항체-표지체 접합체를 준비하였다. 금 나노입자에 0.2M K2CO3를 첨가하면서 단일클론항체 38B5와의 반응을 촉진시켰다. 단일클론항체 38B5와의 결합이 확인되면 25℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, 10% bovine serum albumin (BSA)을 첨가하여 blocking 시켰다. Washing 버퍼를 이용하여 10,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 수세한 후, 0.45μm 필터로 여과하여 준비된 단일클론항체 38B5-금나노입자 접합체를 실험에 사용하기 전까지 4℃에 보관하였다.
② 항체접합체부재 준비
PE 패드(4mmㅧ6mm)에 준비된 단일클론항체 38B5-금나노입자접합체를 20cm ㅧ 30cm 규격 당 20 ml을 분주한 후 하루 동안 건조시켜 항체접합체부재로 골드패드를 준비하였다.
4. 샘플패드부재 준비
유리 섬유재질(4mmㅧ18mm)에 Tris 버퍼 (0.1 M Tris, pH 8.5)를 20 cm ㅧ 30 cm 규격 당 35 ml 분주 후, buffer가 충분히 흡수되도록 골고루 펴준 뒤, 실온에서 하루 동안 건조 시켜 샘플패드를 준비하였다.
5. 버나바이러스병 감염여부 현장검사용 진단키트 제작
준비된 스트립형 플라스틱 지지막 상에 니트로셀룰로오스막을 플라스틱 지지막에 끼워 넣는 형태로 적층하였다. 니트로셀룰로오스막이 적층된 스트립의 길이방형 일단부에 골드패드를 접착제로 적층하고 타단부에 흡수패드부재를 접착제로 적층하였다. 골드패드를 거의 덮도록 준비된 샘플패드를 접착제로 적층하였다. 그 후 골드패드와 흡수패드가 적층되지 않아 노출된 니트로셀룰로오스막의 표면에 검사선부재와 대조선부재를 각각 형성하였다. 검사선부재는 골드패드로부터 11mm정도 이격된 위치에 단일클론항체 47E3(1mg/ml)를 biodot micro-volume airjet로 분주하여 건조시켜 형성하였고, 대조선부재는 검사선 부재와 흡수패드 사이의 니트로셀룰로오스막 표면에 검사선부재와 5mm간격을 두고 goat anti-mouse IgG (2.5mg/ml)를 biodot micro-volume airjet로 분주하여 건조시켜 형성하는데, 검사선부재 및 대조선부재에 포함된 단클론항체 및 이차항체는 액상시료의 흐름에 따라 이동되지 않도록 니트로셀룰오스막 표면에 고정 형성되었다.
비교예 1 내지 29
진단키트 제조시 하기 표 1과 같은 조합으로 단클론항체 pair를 사용한 것을 제외하면 실시예2와 동일한 방법으로 비교예 진단키트 1 내지 29를 제작하였다.
| 항체접합부재에 포함된 항체 | |||||||
| 15E3 | 32A6 | 35A7 | 38B5 | 41E1 | 47E3 | ||
| 검사선부재에 고정된 항체 | 15E3 | 비교예1 | 비교예2 | 비교예3 | 비교예4 | 비교예5 | 비교예6 |
| 32A6 | 비교예7 | 비교예8 | 비교예9 | 비교예10 | 비교예11 | 비교예12 | |
| 35A7 | 비교예13 | 비교예14 | 비교예15 | 비교예16 | 비교예17 | 비교예18 | |
| 38B5 | 비교예19 | 비교예20 | 비교예21 | 비교예22 | 비교예23 | 비교예24 | |
| 47E3 | 비교예25 | 비교예26 | 비교예27 | 비교예28 | 비교예29 | ||
실험예 1
본 발명의 현장검사용 진단키트에서 항체접합부재 및 검사선부재에 동일한 단일클론항체를 사용하거나 서로 다른 단일클론항체 pair를 사용할 경우 검사 민감도가 어떤 경우 더 우수한지 확인하기 위하여 실시예2에서 제조된 버나바이러스병 감염여부 현장검사용 진단키트 및 비교예1 내지 29에서 제조된 비교예 진단키트 1 내지 29에 MABV (5 x 107.3 TCID50/100 ㎕) 100 ㎕ 씩 떨어트린 후 10분 뒤에 결과를 확인하는 pair test를 실시하고, 그 결과를 표 2에 나타냈다.
표 2에 나타난 바와 같이, pair test 결과 실시예2에서 제조된 버나바이러스병 감염여부 현장검사용 진단키트가 가장 우수한 감도를 나타내는 것을 알 수 있으므로, 단일클론항체 38B5 및 47E3 pair가 가장 우수한 항체 pair임을 확인할 수 있다.
실험예 2
제조된 현장검사용 진단키트의 민감도를 조사하기 위해 MABV 배양액을 희석하여 현장검사용 진단키트의 민감도를 다음과 같이 확인하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
진단키트의 민감도를 조사하기 위해 MABV (108.3 TCID50/100 ㎕) 배양액을 버퍼로 희석한 후 (108.3, 107.3, 106.3, 105.3, 104.3 TCID50/100 ㎕)를 각각 키트에 100 ㎕씩 떨어트린 후 10분 뒤에 결과를 확인하였다.
도 2에 도시된 바와 같이, 105.3 TCID50/100 ㎕ 농도까지 검사선에서 붉은색을 나타남을 따라 신속진단 키트의 진단 감도는 105.3 TCID50/100 ㎕로 결정할 수 있었다.
실험예 3
제조된 현장검사용 진단키트의 특이도를 조사하기 위해 MABV 배양액과 5종의 어류 바이러스 (VHSV, IHNV, SCVC, HIRRV, NNV) 배양액을 사용하여 현장검사용 진단키트의 특이도를 다음과 같이 확인하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
진단키트의 특이도를 조사하기 위해 MABV (108.05 TCID50/100 ㎕)와 [바이러스성출혈성패혈증바이러스(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV : 108.05 TCID50/100 ㎕), 전염성조혈기괴사증바이러스 (infectious hmatopoietic necrosis virus, IHNV: 107.05 TCID50/100 ㎕), 잉어봄바이러스 (spring viraemia of carp virus, SVCV: 106.3 TCID50/100 ㎕), 넙치랩도바이러스 (hirame rhabdovirus, HIRRV : 107.05 TCID50/100 ㎕), 바이러스성신경괴사증바이러스 (nervous necrosis virus, NNV : 107.55 TCID50/100 ㎕)] 배양액을 키트에 100 ㎕씩 떨어트린 후 10분 뒤에 결과를 확인하였다.
도 3에 도시된 바와 같이, MABV 배양액에서는 검사선에 붉은선이 나타남을 확인하였고(양성), 5종의 어류 바이러스 (VHSV, IHNV, SVCV, HIRRV, NNV) 배양액에서는 검사선에 붉은선이 나타나지 않았다(음성). 이 결과로부터 본 발명에서 제조된 버나바이러스병 감영여부 현장검사용 진단키트는 MABV에 특이적인 반응을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 4
실시예2에서 제조된 버나바이러스병 감염여부현장검사용 진단키트에 대한 target 조직을 확인하기 위해, 다음과 같이 감염실험을 실시한 후, 조직을 적출하여 kit test를 실시하고, 그 결과를 표 3에 나타내었다.
현장검사용 진단키트의 target 조직을 확인하기 위해 넙치 치어 (5.9 ㅁ 1 g)를 사용하여 15℃에서 감염 실험을 실시하였다. 30 L 수조에 25마리씩 순치한 후, 넙치에 MABV (5 x 106.3 TCID50/fish)를 복강주사 (Intraperitoneal, IP)로 감염시켰다. 감염 실험 3일째 간, 뇌, 비장, 신장, 심장을 적출하여, 조직을 버퍼 1:10 비율 (0.02 g : 200 ㎕)로 마쇄한 후, 상층액 100 ㎕ 씩 키트에 떨어트린 후 10분 뒤에 결과를 확인하였다.
표 3은 감염 실험 3일째의 넙치 총 10마리의 간, 뇌, 비장, 신장, 심장 조직을 사용하여 MABV 신속진단 키트의 target 조직을 확인한 결과인데, 비장조직에서 100% (10 마리/10 마리) 양성을 보였고, 심장 조직에서 30% (3 마리/10 마리), 신장 조직에서 10% (1 마리/10 마리) 양성을 보였다. 간과 뇌 조직에서는 검출되지 않았다. 따라서, 본 발명의 현장검사용 진단키트의 tarter 조직은 넙치의 비장으로 확인되었다.
실험예 5
실시예2에서 제조된 버나바이러스병 감염여부현장검사용 진단키트(신속진단 키트)의 현장 유효성을 평가하기 위해 MABV 감염 넙치와 정상 넙치를 사용하여 다음과 같이 kit test를 실시하고, 그 결과를 표 4에 나타냈다.
넙치 치어 (5.9 ㅁ 1 g)를 사용하여 30 L 수조에 25마리씩 순치한 후, 넙치에 MABV (5 x 106.3 TCID50/fish)를 복강주사로 감염시켰다. 감염 후 14일 동안 임의적으로 sampling하였다. 감염 넙치와 정상 넙치의 신장을 HBSS로 1:10이 되게 혼합하여 마쇄한 후 6,000 rpm에서 30분간 원심 분리하여 얻어진 상층액을 사용하여 EPC에 접종한 후 CPE를 관찰하였다. CPE 양성을 보이면 RNA분리를 실시한 후 RT-PCR [primer (P1:5'-AGAGATCACTGACTTCACAAGTGA-3'), (P2:5'-TGTGCACCACAGGA AAGATGACTC-3')]을 실시하였다. MABV 감염 넙치 및 정상 넙치의 비장 조직을 버퍼로 1:10 (0.02 g :200 ㎕)이 되게 혼합하여 마쇄한 후, 상층액 100 ㎕를 신속진단 키트에 떨어트린 후 10분 뒤에 결과를 확인하였다.
표 4는 신속진단 키트를 활용하여 MABV 감염 넙치와 정상 넙치에 대한 키트의 특이도를 검사한 결과이다. EPC 세포에서 CPE가 관찰되지 않은 정상넙치 14마리에서는 검사선에 붉은선이 나타나지 않았고 (음성), EPC 세포에서 CPE가 관찰되고 RT-PCR 결과 양성을 보인 감염 넙치 14마리에서는 검사선에 붉은선이 나타남을 확인하였다(양성). 따라서, 본 발명의 실시예2에서 제조된 버나바이러스병 감염여부 현장검사용 진단키트가 감염넙치 모두에 특이적으로 반응하는 것을 확인할 수 있었다.
이상의 실험결과로부터, 본 발명은 넙치버나바이러스(Marine birnavirus, MABV)의 항원단백질 VP3과 특이적으로 결합하는 새로운 단일클론 항체 38B5 및 47E3와 이를 생산하는 하이브리도마 세포를 개발하고, 이들 한 쌍의 단일클론항체를 사용하여 현장에서 신속하게 진단이 가능한 현장검사용 진단키트를 제조함으로써, 넙치 양식 현장에 신속하고 즉각적으로 활용될 수 있으므로 버나바이러스병에 대한 질병진단과 예방 및 대처를 통해 안전한 넙치양식을 수행할 수 있는데 현저하게 기여할 것이다.
본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시 예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시 예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.
Claims (20)
- 수탁번호 KCLRF-BP-00482로 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생산되고, 넙치버나바이러스(Marine birnavirus, MABV)의 항원단백질 VP3과 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 38B5.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 단일클론항체 38B5는 MABV에 감염된 EPC 세포에서만 나타나는 VP3 유사물질에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체 38B5.
- 제 1 항 또는 제 3 항의 단일클론 항체 38B5를 생산하는 수탁번호 KCLRF-BP-00482로 기탁된 하이브리도마 세포.
- 수탁번호 KCLRF-BP-00483으로 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생산되고, 넙치버나바이러스(Marine birnavirus, MABV)의 항원단백질 VP3과 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 47E3.
- 삭제
- 제5항에 있어서,
상기 단일클론항체 47E3은 MABV에 감염된 EPC 세포에서만 나타나는 VP3 유사물질에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체 47E3.
- 제 5 항 또는 제 7 항의 단일클론 항체 47E3을 생산하는 수탁번호 KCLRF-BP-00483으로 기탁된 하이브리도마 세포.
- 제 1 항 또는 제 3 항의 단일클론항체 38B5 및 제 5 항 또는 제 7 항의 단일클론항체 47E3 중 하나 이상을 포함하고 어류의 버나바이러스병을 진단하는 진단 조성물.
- 제 9 항의 진단 조성물을 포함하는 어류의 버나바이러스병 진단 키트.
- 스트립형상의 다공성박막부재;
상기 다공성박막부재의 길이방향 일단부에 형성되는 흡수패드부재;
상기 다공성박막부재의 길이방향 타단부에 적층 형성되고, 제 1 항 또는 제 3 항의 단일클론항체 38B5가 포함되는 항체접합체패드부재;
상기 항체접합체패드부재의 일부 또는 모든 영역에 적층 형성되는 샘플패드부재;
상기 다공성박막부재의 표면 중 상기 항체접합체패드부재 및 상기 흡수패드부재 사이에 위치된 표면상에 일정폭으로 형성되고, 제 5 항 또는 제 7 항의 단일클론항체 47E3이 고정되는 검사선부재; 및
상기 다공성박막부재의 표면 중 상기 검사선부재와 상기 흡수패드부재 사이에 위치된 표면상에 일정폭으로 형성되고, 상기 단일클론항체와 결합하는 이차항체가 고정되는 대조선부재;를 포함하는 버나바이러스병 감염여부 현장검사용 진단키트.
- 제 11 항에 있어서,
상기 단일클론항체 38B5는 표지체와 접합되어 형성된 항체-표지체 접합체 형태로 상기 샘플패드부재를 통과한 액상시료의 흐름에 따라 이동가능하게 상기 항체접합체패드부재에 형성되는 것을 특징으로 하는 버나바이러스병 감염여부 현장검사용 진단키트.
- 제 12 항에 있어서,
상기 표지체는 HRP(Horseradish peroxidase), 알칼리성 인산분해효소(Alkaline phosphatase), 금나노입자, FITC(Poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(Rhodamine-B-isothiocyanate), Cy3, Cy5, 및 로다민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 버나바이러스병 감염여부 현장검사용 진단키트.
- 제 11 항에 있어서,
상기 검사선부재의 진단 감도는 105.3 TCID50/100 ㎕인 것을 특징으로 하는 버나바이러스병 감염여부 현장검사용 진단키트.
- 제 11 항에 있어서,
상기 대조선부재에 고정되는 이차항체는 마우스가 아닌 포유동물군에서 유래된 anti-mouse IgG인 것을 특징으로 하는 버나바이러스병 감염여부 현장검사용 진단키트.
- 제 11 항에 있어서,
상기 다공성박막부재는 니트로셀룰로오스막, PVDF막, 폴리비닐수지필름 또는 폴리스티렌수지필름으로 구성된 그룹에서 선택되는 어느 하나로서 5~12㎛의 공극 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 버나바이러스병 감염여부 현장검사용 진단키트.
- 제 11 항에 있어서,
상기 다공성박막부재 하부표면에 형성되는 스트립형상의 지지부재를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 버나바이러스병 감염여부 현장검사용 진단키트.
- 제 11 항에 따른 진단키트의 샘플패드부재에 넙치조직 유래 액상시료를 접촉시키는 단계; 및
상기 진단키트의 검사선부재의 양성반응을 탐지하는 단계;를 포함하는 넙치의 버나바이러스병 진단방법.
- 제 18 항에 있어서,
상기 넙치조직은 비장인 것을 특징으로 하는 넙치의 버나바이러스병 진단방법.
- 제 18 항에 있어서,
상기 샘플패드부재에 넙치조직 유래 액상시료를 접촉시킨 후 20분 이내에 버나바이러스병의 양성반응을 탐지하여 버나바이러스병 감염여부를 검출하는 것을 특징으로 하는 넙치의 버나바이러스병 진단방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200083134A KR102393881B1 (ko) | 2020-07-06 | 2020-07-06 | 버나바이러스병 감염여부 현장검사용 진단키트 및 진단방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200083134A KR102393881B1 (ko) | 2020-07-06 | 2020-07-06 | 버나바이러스병 감염여부 현장검사용 진단키트 및 진단방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220005363A KR20220005363A (ko) | 2022-01-13 |
| KR102393881B1 true KR102393881B1 (ko) | 2022-05-04 |
Family
ID=79342205
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020200083134A KR102393881B1 (ko) | 2020-07-06 | 2020-07-06 | 버나바이러스병 감염여부 현장검사용 진단키트 및 진단방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102393881B1 (ko) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20080008802A (ko) | 2006-07-21 | 2008-01-24 | 경상대학교산학협력단 | 우럭으로부터 정제된 면역글로불린에 대한 단클론항체 및이의 생성방법 |
| KR102091731B1 (ko) * | 2018-06-07 | 2020-03-20 | 전남대학교산학협력단 | 해양버나바이러스 및 신경괴사증바이러스에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도 |
-
2020
- 2020-07-06 KR KR1020200083134A patent/KR102393881B1/ko active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20220005363A (ko) | 2022-01-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Grauballe et al. | Optimized enzyme‐linked immunosorbent assay for detection of human and bovine rotavirus in stools: Comparison with electron‐microscopy, immunoelectro‐osmophoresis, and fluorescent antibody techniques | |
| KR102227648B1 (ko) | B형 인플루엔자 바이러스의 측정 방법 | |
| JP5575377B2 (ja) | 抗ｒｓウイルスモノクローナル抗体を用いたｒｓウイルス検出用キット及びイムノクロマトグラフィー用試験具、並びに新規な抗ｒｓウイルスモノクローナル抗体 | |
| Lima et al. | Serology applied to plant virology | |
| KR20120010222A (ko) | 고병원성 조류 인플루엔자 ｈ5ｎ1 아형 바이러스의 검출 키트 | |
| JP4554472B2 (ja) | パルボウイルス抗原検出用キット | |
| Abd-Alla et al. | Serum IgM antibody response to the galactose-inhibitable adherence lectin of Entameoba histolytica. | |
| Fenton et al. | Identification of cattle infected with bovine virus diarrhoea virus using a monoclonal antibody capture ELISA | |
| KR102341370B1 (ko) | 넙치랩도바이러스병 감염 여부 현장검사용 진단키트 및 진단방법 | |
| JP4536588B2 (ja) | 成人ｔ細胞白血病の診断器具 | |
| JP5726432B2 (ja) | マイコプラズマ・ニューモニエ抗原測定の検出方法 | |
| KR100877913B1 (ko) | 돼지혈청으로부터 일본뇌염바이러스 항체 검출을 위한면역크로마토그래피 진단 키트 | |
| KR102393881B1 (ko) | 버나바이러스병 감염여부 현장검사용 진단키트 및 진단방법 | |
| KR101990858B1 (ko) | 흰반점 증후군바이러스에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도 | |
| KR102091731B1 (ko) | 해양버나바이러스 및 신경괴사증바이러스에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도 | |
| KR101990850B1 (ko) | 전염성 췌장괴사증 바이러스 및 신경괴사증 바이러스에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도 | |
| KR101032956B1 (ko) | 수청바이러스 유래 뉴클레오캡시드 단백질을 이용하여 신증후출혈열 특이 ＩｇＭ과 ＩｇＧ를 검출하는 신속 진단 키트 | |
| KR102384570B1 (ko) | 넙치랩도바이러스병 감염 여부 현장검사 진단키트용 검체시료조성물 및 상기 조성물을 이용한 넙치랩도바이러스병 현장진단방법 | |
| JP7144039B2 (ja) | 重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キット及び重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出方法 | |
| KR102521239B1 (ko) | 흰반점증후군바이러스 감염여부 현장검사용 lfia기반 신속진단키트에 사용되는 단클론항체 및 이의 용도 | |
| EP0409883B1 (en) | Monoclonal antibody to enteroviruses | |
| CN113999818B (zh) | 一种基于检测循环抗原的诊断包虫病的免疫层析试条 | |
| KR101876535B1 (ko) | 소바이러스성 설사병 바이러스의 탐지용 항체, 이를 이용한 항원 검출 방법, 및 이를 포함하는 탐지키트 | |
| KR102264146B1 (ko) | 락토코커스 가비에에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 포함하는 락토코커스 가비에 검출용 조성물 | |
| KR101287602B1 (ko) | 신장형 및 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스를 인식하는 항체 및 그의 용도 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right |