KR101287602B1 - 신장형 및 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스를 인식하는 항체 및 그의 용도 - Google Patents
신장형 및 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스를 인식하는 항체 및 그의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 신장형 및 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스를 인식하는 항체 및 그를 생산할 수 있는 세포, 상기 항체를 포함하는 조성물 및 키트, 및 상기 항체를 포함하는 분석 장치 및 분석 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 신장형 및 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스를 인식하는 항체 및 그를 생산할 수 있는 세포, 상기 항체를 포함하는 조성물 및 키트, 및 상기 항체를 포함하는 분석 장치 및 분석 방법에 관한 것이다.
전염성 기관지염 (Infectious bronchitis)은 IB 바이러스 (IBV)에 의해서 발생되는 전파력이 매우 빠른 닭의 급성 전염병이다. IB는 감염시 폐사율은 높지 않으나 이환율이 높고 기침, 콧물, 증체율 저하, 외부 및 내부 난질저하를 동반하는 산란율 저하를 유발할 뿐만 아니라 호흡기 후휴증으로 대장균증이 수반되어 만성 폐사가 지속되는 등 매우 다양한 생산성 저하를 유발하여 전세계적으로 양계 산업에 막대한 피해를 입히고 있다. IBV는 RNA 바이러스로서 바이러스 입자를 구성하는 유전자가 인플루엔자 바이러스와 유사하게 쉽게 변이되는 특성이 있다. 따라서 현재 전 세계적으로 매우 다양한 혈청형의 IBV들이 분리 보고되고 있으며, 이들 각 혈청형에서 변이된 변이형 바이러스까지 포함하면 그 종류는 수십 종에 이를 것으로 추정되고 있다. 또한 이들 혈청형들 간에는 상호 교차 반응이나 교차 면역이 잘 되지 않으며, 야외 감염시 나타나는 임상증상들도 고병원성 조류 인플루엔자나 뉴캐슬병과 같이 뚜렷한 질병의 경과를 취하는 것이 아니기 때문에 그만큼 질병의 진단과 예방에 많은 어려움이 수반되고 있다.
국내의 IB 발생은 1986년에 보고된 것이 최초이며, 국내에서 유행하는 IBV 들은 다른 나라에 유행하는 바이러스들과 유전적으로 동떨어져 독립된 특징을 나타내고 있으며 크게 호흡기형의 Korean group I과 Korean group II에 속하는 신장형 IBV를 국내 IBV 유행주의 대표적인 주 유행주로 추정하고 있으며 실험을 통해 1일령 SPF 병아리에 감염시 심한 신장의 요산 침착뿐 아니라 50%의 폐사율을 유발하는 특징을 지니고 있음이 확인된 바 있다.
본 발명의 일 양상은 신장형 및 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스를 인식하는 항체를 제공한다.
본 발명의 다른 양상은 수탁번호 KCLRF-BP-00265인 하이브리도마를 제공한다.
본 발명의 다른 양상은 신장형 및 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스 중 하나 이상을 진단하기 위한 조성물 또는 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 양상은 신장형 및 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스 중 하나 이상을 진단하기 위한 분석 장치를 제공한다.
본 발명의 다른 양상은 시료 중 감염성 기관지염 바이러스의 존재를 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 양상은 신장형 및 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스를 인식하는 항체를 제공한다.
감염성 기관지염 바이러스 (avian infectious bronchitis virus: IBV)는 감염성 기관지염 (IB)을 유발하는 가금 (poultry)을 감염하는 코로나바이러스이다. 감염성 기관지염 바이러스는 닭의 호흡기, 소화관 (gut), 신장 및 생식계에 영향을 미치는 고감염성 조류 병원체이다. 감염성 기관지염 바이러스는 비세그멘트화된, 양성-센스 단일가닥 RNA 게놈을 가진 코로나바이러스이다.
신장형 감염성 기관지염 바이러스는 KM91 주, K91/01 주, K604/97 주 또는 수탁번호 KCTC 10106BP인 것일 수 있다. 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스는 M41 주, RB86, K12/01,B4, EY95, EJ95, K71/01 또는 K620/97일 수 있다.
상기 항체는 뉴클레오캡시드 단백질 TC1, TC2 및 TC3 유래의 항원 중 하나 이상을 포유동물, 예를 들면, 생쥐에 접종하여 면역화하고, 면역된 동물로부터 췌장 세포를 분리하고, 분리된 췌장 세포를 불멸화된 세포, 예를 들면, 골수종 세포와 융합함으로써 얻어진 하이브리도마 세포로부터 생산되는 것일 수 있다. 상기 골수종 세포는 SP2/0-Ag14 (ATCC CRL-1581)일 수 있다. 뉴클레오캡시드 단백질 TC1, TC2 및 TC3 유래의 항원은 예를 들면, 서열번호 1, 2 및 3의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 항체는 수탁번호 KCLRF-BP-00265인 하이브리도마 세포에 의하여 생산되는, 신장형 및 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스를 인식하는 항체일 수 있다.
상기 항체는 단독 또는 다른 물질과 접합된 것일 수 있다. 상기 다른 물질은 검출가능한 신호를 발생하거나 발생시킬 수 있는 것일 수 있다. 상기 다른 물질은, 예를 들면, 형광물질과 같은 발색 물질 또는 효소와 같은 단백질일 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 신장형 및 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스를 인식하는 항체를 생산하는, 수탁번호 KCLRF-BP-00265인 하이브리도마 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 양상은 상기한 바와 같은 항체를 포함하는, 신장형 및 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스 중 하나 이상을 진단하기 위한 조성물을 제공하는 것이다. 상기 조성물은 항체를 액체 중에서 포함하는 액체 조성물일 수 있다. 상기 액체는 상기 항체를 용해시킬 수 있고 유지시킬 수 있는 것일 수 있다. 예를 들면, 물, 또는 PBS와 같은 버퍼 용액일 수 있다. 상기 조성물은 상기 항체를 안정하게 유지하는 물질을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 상기한 바와 같은 항체를 포함하는, 신장형 및 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스 중 하나 이상을 진단하기 위한 키트를 제공한다.
상기 항체는 단독 또는 다른 물질과 접합된 것일 수 있다. 상기 다른 물질은 검출가능한 신호를 발생하거나 발생시킬 수 있는 것일 수 있다. 상기 다른 물질은, 예를 들면, 형광물질과 같은 발색 물질 또는 효소와 같은 단백질일 수 있다.
상기 키트는 항체에 결합하는 제2 항체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 표지되거나 표지되지 않은 항-생쥐 항체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 ELISA 또는 면역형광 분석과 같은 항체를 이용한 분석 반응에 필요한 시약을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은
분석물을 포함하는 액체 시료가 적용되는 부위인 검체패드,
상기 검체패드와 유체 소통가능하게 연결되어 있고 제1항에 따른 항체와 골드 입자의 접합체가 이동가능하게 지지되어 있는 저장 패드,
상기 저장 패드와 유체 소통가능하게 연결되어 있고 모세관 이동에 의하여 상기 액체 시료가 이동하는 크로마토그래피 막 물질로서, 상기 저장 패드의 하류에 상기 제1항에 따른 항체가 비확산적으로 고정화되어 있는 검출 영역을 포함하는 크로마토그래피 막 물질;
상기 크로마토그래피 막 물질과 유체 소통가능하게 연결되어 있는 흡습 패드 및
상기 검체패드, 저장 패드, 크로마토그래피 막 물질 및 흡습 패드를 지지하는 고체 지지체를 포함하는, 신장형 및 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스 중 하나 이상을 진단하기 위한 분석 장치를 제공한다.
본 발명의 분석 장치는 항원 또는 항체와 같은 면역화학 성분의 고상 담체로서 다공성 물질을 이용하는 면역분석 키트에 관한 것이다. 본 발명에서 사용되는 검체패드, 저장 패드, 크로마토그래피 막 물질 및 흡습 패드는 분석되어질 액체 시료를 수용하고 포함하기 충분한 다공성 (porosity)과 부피를 가진 물질로서, 바람직하게는 마이크로다공성 막 물질이다. 상기 마이크로다공성 막 물질의 예에는 나일론, 셀룰로즈 물질, 폴리술폰, 폴리비닐리덴 디플루오라이드, 폴리에스테르 및 유리 섬유가 포함된다. 상기 마이크로다공성 막 물질의 바람직한 예는, 니트로셀룰로스 막이다. 상기 분석 장치는 스트립의 형태를 가질 수 있다.
본 발명에 있어서, "유체 소통가능하게 연결되어 있는 (in flow communication with)"이라는 표현은 하나의 위치 (예, 검체패드)에 액체 시료가 적용되었을 경우 모세관 이동에 의하여 다른 위치 (예, 저장 패드)로 이용가능하게 연결되어 있는 것을 말한다. 또한, 본 발명에 있어서 "이동가능하게 지지되어 있는 (movably supported)"이라는 표현은 액체 시료의 모세관 이동과 함께 상기 제1 단일클론 항체와 골드 입자의 접합체가 이동가능하게 저장 패드에 고정화되어 있는 것을 의미한다. 또한, 본 발명에 있어서 "비확산적으로 고정화되어 있는 (nondiffusively immobilized)"이라는 표현은 제2 단일클론 항체가 상기 검출 영역 내에 상기 액체 시료의 모세관 이동에 의하여 함께 확산되지 않도록 고정화되어 있는 것을 의미한다. 단일 클론항체를 비확산적으로 고정화하는 방법은 상기 크로마토그래피 막 물질과 제2 단일클론 항체를 크로마토그래피 막 물질의 상기 검출 영역에 비확산적으로 고정화할 수 있는 것이면 임의의 방법이 포함될 수 있다. 예를 들면, 공유결합법이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 검출 영역은 임의의 모양, 예를 들면 사각형 및 원형의 형태를 취할 수 있으며 그 면적은 상기 크로마토그래피 막 물질의 면적보다는 작다.
본 발명의 분석 장치에 사용되는 단일클론 항체와 골드 접합체는 당업계에 잘 알려져 있는 방법에 의하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 골드 콜로이드 용액을 만들고, 상기 용액 중의 골드를 단일클론 항체와 공유결합시킴으로써 제조될 수 있다. 단일클론 항체와 골드 접합체는 예를 들면, 참조에 의하여 그 전체로서 본 명세서에 포함되는 미국특허 제5,514,302호 및 제4,313,734호에 개시된 방법에 의하여 제조될 수 있다.
본 발명의 분석 장치에 포함되는 저장 패드에 지지되어 있는 단일클론 항체와 크로마토그래피 막 물질의 검출 영역에 고정화되어 있는 단일클론 항체는 신장형 및 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스에 대하여 특이적인 항체로서, 서로 다른 에피토프에 결합하는 것일 수 있다. 상기 항체는 예를 들면, 수탁번호 KCLRF-BP-00265인 하이브리도마에 의하여 생산되는, 신장형 및 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스를 인식하는 항체일 수 있다.
본 발명의 분석 장치의 저장 패드 및 크로마토그래피 막 물질의 검출 영역에 포함되는 상기 제1 및 제2 단일클론 항체는 동일하거나 다른 신장형 및 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스에 특이적인 단일클론 항체이다. 상기 신장형 및 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스에 특이적인 단일클론 항체는 당업계에 잘 알려져 있는 항체 제조방법에 의하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 정제된 신장형 및 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 생쥐와 같은 동물에 면역접종하고, 신장형 및 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스 뉴클레오캡시드에 특이적인 항체를 생산하는 비장세포를 분리하고 이를 미엘로마 세로와 융합하여 하이브리도마를 제조하여 상기 뉴클레오캡시드에 특이적인 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 선발하고, 이를 배양함으로써 상기 뉴클레오캡시드에 특이적인 항체를 생산할 수 있다.
본 발명자들은 놀랍게도 상기 뉴클레오캡시드에 특이적인 항체가 신장형 및 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스를 인식할 수 있다는 사실뿐만 아니라, 감염성 기관지염 바이러스 이외의 다른 바이러스, 예를 들면, 조류 인플루엔자 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 뉴모 바이러스, 전염성 후두 기관염 바이러스, 감보로 바이러스, 레로 바이러스 및 마렉 바이러스와 상호 교차 반응을 일으키지 않아, 높은 특이성을 가지고 있다는 것을 발견하였다. 종래 감염성 기관지염 바이러스는 변이성이 강하여 동일한 기관지염 바이러스 중의 다른 형태, 예를 들면, 신장형과 호흡기형 기관지염 바이러스를 동시에 인식할 수 있는 항체는 존재하지 않았던 점을 고려하면, 본원 발명의 분석 장치에 사용된 신장형 및 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스에 특이적인 항체는 예측하지 못한 현저한 효과를 갖는 것이다.
본 발명의 분석 장치에 사용되는 고체 지지체는 상기 검체패드, 저장 패드, 크로마토그래피 물질, 및 흡습 패드를 지지할 수 있는 것이면 임의의 재질로 된 것이 사용될 수 있다. 예를 들면, 플라스틱 물질, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 및 폴리스티렌 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 분석 장치의 크로마토그래피 막 물질에는 검출 영역 외에 저장 패드의 제1 단일클론 항체와 골드 접합체에 특이적으로 결합하는 결합제 (예, 산양 항 생쥐 단일클론 항체)가 비확산적으로 고정화되어 있는 대조 영역을 더 포함할 수 있다. 상기 대조 영역은 임의의 모양, 예를 들면 사각형 및 원형의 형태를 취할 수 있으며 그 면적은 상기 크로마토그래피 막 물질의 면적보다는 작을 수 있다. 또한, 상기 대조 영역의 위치는 상기 저장 패드의 하류에 위치하고 상기 검출 영역의 상류 또는 하류에 위치할 수 있다. 본 발명의 분석 장치는 스트립 형태일 수 있다.
본 발명의 분석 장치의 일 예를 도면을 참조하여 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.
도 1은 본 발명에 사용된 분석 장치의 일 예의 구조를 나타내는 측면도이다. 도 1에 나타낸 바와 같이 상기 분적장치는 고체 지지체 (5) 상에 제2 단일클론 항체가 고정화되어 있는 검출 영역 (T)과 대조 영역 (C)이 형성되어 있는 크로마토그래피 물질 막 (3)이 지지되어 있고 여기에 검체패드 (1), 제1 단일클론 항체와 골드 접합체가 지지되어 있는 저장 패드(2) 및 흡습 패드가 중첩되어 연결되어 있다. 스트립에 시료를 검체패드 (1)에 첨가하면, 모세관 현상에 의하여 저장패드 (2)로 이동하여 시료 중의 항원은 저장패드 중의 제1 단일클론 항체와 골드의 접합체와 결합하고 크로마토그래피 물질 막 (3)을 통하여 흡습 패드 (4)의 방향의 하류로 모세관 이동하게 된다. 상기 항원과 상기 접합체의 결합체가 검출 영역 (T)에 도달하게 되면 상기 결합체와 제2 단일클론 항체가 특이적으로 결합하여 발색하게 되고, 상기 결합체가 없는 경우에는 발색을 하지 않게 된다. 또한, 상기 시료와 함께 제1일 단일클론 항체와 금 입자 접합체는 대조 영역 (C)을 통과하는 경우에는 상기 제1 단일클론 항체와 금 입자 접합체는 상기 대조 영역 중의 제1 단일클론 항체와 금 입자 접합체에 특이적인 항체 (산양 항 생쥐 IgG 항체)와 결합하여 발색함으로써, 모세관 이동이 제대로 되었는지를 확인할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은, 상기한 바와 같은 항체를 시료와 접촉시키는 단계;
상기 항체와 감염성 기관지염 바이러스의 복합체를 검출하는 단계; 및
검출결과로부터 시료 중에 감염성 기관지염 바이러스를 결정하는 단계를 포함하는, 시료 중 감염성 기관지염 바이러스의 존재를 확인하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 상기한 바와 같은 항체를 시료와 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 접촉은 액체 매질 중에서 정적 또는 동적으로 이루어질 수 있다. 상기 접촉은 예를 들면, 상기한 바와 같은 본 발명의 분석 장치에 상에 이루어지는 것일 수 있다. 상기 시료는 생물체 또는 그로부터 유래된 물질을 포함하는 생물학적 시료일 수 있다. 예를 들면, 분변, 타액, 혈액, 뇨, 세포 또는 조직일 수 있다.
또한, 상기 방법은 상기 항체와 감염성 기관지염 바이러스의 복합체를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 복합체의 검출은 당업계에 알려진 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 검출가능한 표지가 부착된 상기 항체를 사용하고, 상기 복합체로부터의 상기 검출가능한 표지로부터 나오는 신호를 측정함으로써 상기 복합체를 검출할 수 있다.
또한, 상기 방법은 검출 결과로부터 시료 중에 감염성 기관지염 바이러스를 결정하는 단계를 포함한다. 상기 검출 결과 상기 복합체가 존재하는 경우, 상기 시료 중에서 신장형 및/또는 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스가 존재하는 것으로 결정하고, 상기 검출 결과 상기 복합체가 존재하지 않는 경우, 상기 시료 중에서 신장형 및/또는 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스가 존재하지 않는 것으로 결정할 수 있다.
상기 방법은 상기한 바와 같은 본 발명의 분석 장치를 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 분석 장치를 사용하여 수행되는 방법을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 먼저, 신장형 및/또는 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스가 함유된 검액 (예, 설사 분변을 희석액으로 용해한 것)을 검체패드에 접촉시킨다. 이 경우 검액 중의 각 바이러스 항원은 검체패드 (1)를 이동하면서 큰 입자는 여과되고, 저장 패드 (2)에 고정화되어 있는 금 입자가 부착된 제1 단일클론 항체와 복합체를 형성한다. 이 복합체는 모세관 현상에 의하여 크로마토그래피 물질 막 (3)을 이동하여 검출 영역 (T)에 결합된 제2 단일클론 항체와 반응하여 직접샌드위치 원리에 의하여, 항체-항원-막에 고정화된 항체의 복합체를 형성한다. 이 경우 골드의 색상에 의하여 해당 위치에 보라색 밴드가 형성된다. 검출 영역에서 반응하지 않고 지나친 제1 단일클론 항체-골드 입자는 대조 영역 (C)에 고정화되어 있는 산양 항 생쥐 항체와 반응하여 보라색 밴드를 형성한다. 이와 같은 반응은 통상 5 내지 10 분이 소요될 수 있다.
신장형 및/또는 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스의 존재 여부는 시료를 검체패드에 접촉시킨 후 일정시간, 예를 들면, 5 내지 10 분 후, 검출 영역 (T)과 대조 영역 (C)에 모두 보라색이 발색되면 신장형 및/또는 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스가 존재하는 것으로 판정할 수 있다. 대조 영역 (C)은 스트립이 제대로 작동하는지를 확인하기 위한 것으로 시료를 전개한 결과, 대조 영역 (C)에서 보라색이 발색되지 않는 경우에는, 실험을 무효로 할 수 있다. 반면, 검출 영역 (T)에서는 발색이 되지 않으나, 대조 영역 (C)에서는 발색이 되는 경우에는, 시료 중에 신장형 및/또는 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스가 존재하지 않는 것으로 판정할 수 있다.
본 발명의 신장형 및 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스를 인식하는 항체에 의하면, 신장형 및 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스를 모두 인식할 수 있다.
본 발명의 수탁번호 KCLRF-BP-00265인 하이브리도마에 의하면, 신장형 및 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스를 인식하는 항체를 생산할 수 있다.
본 발명의 신장형 및 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스 중 하나 이상을 진단하기 위한 조성물 또는 키트에 의하면, 신장형 및 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스의 존재를 효율적으로 진단할 수 있다.
본 발명의 신장형 및 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스 중 하나 이상을 진단하기 위한 분석 장치에 의하면, 신장형 및 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스 중 하나 이상을 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 시료 중 감염성 기관지염 바이러스의 존재를 확인하는 방법에 의하면, 시료 중 감염성 기관지염 바이러스의 존재를 효율적으로 확인할 수 있다.
도 1은 본 발명의 신장형 및 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스 중 하나 이상을 진단하기 위한 분석 장치의 일 예를 나타내는 측면도이다.
도 2는 TC1, TC2 및 TC3에 대한 전기영동 결과를 나타낸다.
도 3은 TC1, TC2 및 TC3을 발현하는 세포에 대한 SDS-PAGE과 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다.
도 2는 TC1, TC2 및 TC3에 대한 전기영동 결과를 나타낸다.
도 3은 TC1, TC2 및 TC3을 발현하는 세포에 대한 SDS-PAGE과 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예
1: 신장형 및
호흡기형
감염성 기관지염 바이러스에 공통적인 특이 단일 클론 항체 제조
I. 감염성 기관지염 바이러스 항원 정제
1. 재조합 단백질의 제조
IBV의 핵단백질 (nucleoprotein) 재조합 TC1, TC2, TC3 항원을 사용하였다.제조 과정은 다음과 같이 수행하였다.
(1) 주형
DNA
추출
IBV 바이러스로부터 RNA를 분리하여 주형 RNA를 입수하였다.
(2)
PCR
및 발현벡터 제조
NP TC1,TC2,TC3 항원을 코딩하는 유전자는 IBV RNA을 주형으로 하여 RT- PCR을 수행하여 획득하였다. PCR을 수행하기 위해 다음의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 유전자은행 (Accession No. DQ472166, FJ888351)에서 정보를 얻어 작성하였다 (표 1).
| 프라이머 명칭 | 서열 | 서열번호 |
| IBV N TC1 F | GGA TCC GCA TCT AGT AGA GCA CCA | 1 |
| IBV N TC1 R | GTC GAC TTA CAC TTG ATC AAC CTT ATA | 2 |
| IBV N TC2 F | GGA TCC GAT CCG CAG TTT GAT AAT | 3 |
| IBV N TC2 R | GTC GAC TTA ATC CTG CTT CTT TGG CTT | 4 |
| IBV N TC3 F | GGA TCC CCT AAG AAG GAG AAA | 5 |
| IBV N TC3 R | GTC GAC TCA AAG TTC ATT CTC TCC | 6 |
NP TC1,TC2,TC3 항원 유전자의 증폭을 위한 열순환 (thermocycle) (Mycycler: BioRad 사)은 (42℃ 30분)x1 순환, (94℃, 5분)x1 순환, (94℃, 1분, 45℃, 1분, 72℃, 1분)x28 순환, (94℃, 1분, 60℃, 1분, 72℃, 10분)x1 순환, 4℃, 16시간으로 사용하였다. PCR 반응이 완전히 끝난 후, 1.5%의 아가로즈 겔을 만들어 PCR 산물 1㎕를 전기영동하여 항원의 크기를 확인하고 Gene clean Kit (MP biochemical, #1101-400, France)를 사용하여 증폭된 DNA를 추출하였다 (도 2). 도 2는 TC1, TC2 및 TC3에 대한 전기영동 결과를 나타낸다.
DNA의 확인은 작업의 효율과 정확성을 기하기 위하여 전문업체 (Jenotech, Korea)에 DNA 서열분석을 의뢰하였고, 추출한 DNA가 IBV NP TC1, TC2, TC3 유전자임을 확인하였다 (서열번호 7 내지 12 참조).
IBV NP TC1, TC2, TC3을 위하여 대장균 발현 벡터인 pGS vector (Animal Genetics Inc., Korea)도 프라이머의 링커 부위인 BamH I (NEB, #R0136S, USA), SalI (NEB, #R0138S, USA)으로 절단하고, BamH 아가로즈 겔에 전기영동하여 Gene Clean Kit (MP biochemical, #1101-400, France)를 이용해 추출해 놓았다.
T4 DNA 리가제 (Roche, 10481220001, Germany)를 이용해 증폭해서 추출한 삽입체와 벡터를 16℃ 밤샘 라이게이션시키고 컴페턴트 세포 (Top10F')에 형질전환 시켰다. 형질전환은 열충격 (heat-shock) 법을 이용하였으며, -70℃에 보관된 컴페턴트 세포를 꺼내 얼음 위에서 해동시킨 후 라이게이션 혼합물 5㎕를 넣고 약 3초간 조심스럽게 혼합한 후 얼음에서 30분간 정치시켰다. 반응물이 혼합된 컴페턴트 세포의 튜브를 42℃의 항온 수조에 90초간 정치시킨 후 열 충격을 주고 즉시 얼음에 넣어 주었다. LB 액체 배지를 1 ml 넣어주어 37℃, 1시간 인큐베이션시킨 후 선발마커로 항생제 암피실린이 포함된 LB 아가 플레이트에 100 ㎕의 균액을 도말하고 밤샘, 37℃ 조건으로 배양하였다.
LB 아가 플레이트에 자란 콜로니를 액체 LB 배지에 접종하여 세포가 자랐을 때 Wizard Plus SV Minipreps Kit (Promega, #A1460, USA)를 이용해서 DNA를 추출하고, 추출한 DNA를 BamHI (NEB, #R0136S, USA), SalI (NEB, #R0138S, USA)으로 절단하고 전기영동하여 벡터에 각 항원 삽입체가 라이게이션 되었는지를 확인하였다.
(3)
SDS
-
PAGE
및
웨스턴
블롯
IBV NP TC1, TC2, TC3 유전자가 라이게이션된 세포에서 추출한 DNA를 대장균 발현용 균주인 M15, BL21에 형질 전환시켜서 IBV NP TC1, TC2, TC3 항원을 발현하는 대장균을 얻었다.
유전자 재조합 IBV NP TC1, TC2, TC3 항원을 발현하는 대장균 균주를 삼각 플라스크에 넣어 18시간 이상 진탕 배양하였다. 배양된 균주를 발효기에 접종하여 37℃에서 약 2시간 배양하고 균주가 증식하여 600 nm에서 흡광도 값이 약 1.0 내외가 될 때까지 배양하였다. 균주가 흡광도 1.0 내외로 증식하였을 경우 IPTG를 2.5mM 되도록 첨가하여 추가로 약 5 시간을 배양한 후 배양된 균주액을 회수하여 원심방법으로 균체를 회수하여 SDS-PAGE과 웨스턴 블롯을 수행하여 발현된 유전자재조합 항원 (IBV NP TC1: 22kDa, TC2: 22.5kDa, TC3: 21 kDa)을 확인하였다 (도 3). 도 3은 TC1, TC2 및 TC3을 발현하는 세포에 대한 SDS-PAGE과 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다.
(4) 유전자 재조합 항원의 정제
유전자 재조합 IBV NP TC1, TC2, TC3 항원을 발현하는 대장균 균주를 배양하여 회수한 균체를 초음파 파쇄기 (VCX750: Sonics & materials)로 처리하여 파쇄하고 8,000rpm, 20분, 4℃로 원심분리 (VS24SMTi: vision science)하여 침전을 회수하였다. 항원이 함유된 침전을 6M 구아니딘 용액으로 용해하였다. DEAE-세파로즈 겔을 이용하여 이온교환 크로마토그래피법으로 항원을 정제하였다. 즉, 용해된 봉입체 (inclusion body) 용액을 6M 구아니딘 용액으로 평형화된 겔에 반응시키고 NaCl 구배를 실시하여 각 분획들을 SDS-PAGE 방법으로 분석하여 유전자 재조합 IBV NP TC1, TC2, TC3 항원이 함유된 분획만을 선별하였다. 선별한 항원은 BCA법 (Pierce, USA)으로 정량하여 면역원으로 사용하였다.
2. 바이러스
역가
검정
농축 및 정제된 바이러스의 역가는 실시간 중합효소연쇄반응 (Real-time polymerase chain reaction) 실험을 통해서 확인하였다.
II
. 감염성 기관지염 바이러스 항체 제조
1. 면역원의 제조
상기의 방법으로 정제된 항원을 사용하여 다음과 같이 면역원을 제작하였다. 1차 면역시에 사용하는 면역원은 완전 프로인트 보조제 (Complete Freund's Ajuvant: Sigma 사)를 1:1로 유액화 (emulsion)하여 제조하였고, 2차~4차 면역시에 사용하는 면역원은 불완전 프로인트 보조제 (Incomplete Freund's Ajuvant: Sigma 사)를 1:1로 유액화하여 제조하였다.
2. 면역
상기의 방법으로 제조된 면역원을 BALB/C 마우스, 6주령, 암컷에 다음과 같이 면역하였다. 200 ㎕/마리의 양으로 1주 간격으로 4회 복강 주사하고 일주일 후에 항원을 인산염 완충 용액 (Phosphate buffered saline: PBS)에 20% 농도 (v/v)로 희석하여 1일 간격으로 3회 꼬리 정맥에 50㎕/회 주사하였다. 3차 면역 후에는 꼬리 정맥에서 얻어낸 혈청으로 중간 역가 검사를 실시하였다.
3.
하이브리도마
세포주 제작
면역 후에 마우스의 비장 세포를 떼어내어 45 μm 세포 strainer (BD falcon사)를 통해 걸러내었다. 걸러진 비장세포를 원심분리하여 침전물로 획득하고 적혈구 용해 버퍼 (Red blood cell lysis buffer, Sigma사)를 5ml 섞어준 뒤 4분간 방치하여 적혈구를 제거하였다. 적혈구가 제거된 비장세포는 둘베코이글배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: DMEM, Gibco사)를 넣어 3회 세척하고 세포 카운팅을 실시하였다. 비장세포와 융합시킬 세포는 마우스 유래 골수종 세포인 SP2/0-Ag 14 (ATCC CRL-1581) 세포주이며, 혼합비율은 1:5 (비장세포: SP2/0)가 되게 섞어주었다. 혼합된 세포액은 DMEM으로 2회 세척 후 PEG1500 (Roche사)를 사용하여 융합하였다. 융합은 PEG1500을 1분간 1.7ml 점적하고, 30초간 정치 후 DMEM을 1분간 1ml 점적하고, 30초간 정치 후 DEME을 1분간 2ml 점적하고 30초간 6ml 점적하고, 30초간 정치 후 DMEM을 30초간 10ml 점적하였다. 융합이 완료된 세포액은 원심분리하여 침전물로 획득하고 HAT (PAA사)와 항생제 (Gibco사), 소태아혈청 (Fetal bovine serum, Hyclone 사)이 10% 첨가된 DMEM (이하 - HAT 배지)과 잘 섞어준 뒤 200 ㎕/웰의 용량으로 96 웰 플레이트에 분주한 뒤 3일간 배양기에서 성장시켰다.
4. 세포 배양
융합이 완료된 세포주는 37℃, 5%의 CO2, 가습 조건이 유지되는 세포배양기에서 성장시켰으며, 2일 간격으로 일주일 간 HAT 배지를 교체하였다.
5. 양성 클론 세포주 검색
HAT 배지로 선별이 완료된 세포주는 효소연결면역흡광도분석법 (Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)으로 양성 클론을 검색하였다. 구체적으로, 세포주가 자라고 있는 각각의 배양액을 요막강액 (음성 대조군)과 1:1로 섞어주어 37℃에서 한 시간 동안 반응시켜 비특이적인 항체를 중화시킨 뒤, 96 웰 흡착 플레이트에 (Costar 사) IBV 항원이 1/500 농도로 코팅된 플레이트에 100 ㎕/웰의 용량으로 분주하고 37℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 1 시간 반응 후 5회 세척하고 항 마우스 IgG 항체와 항 마우스 IgM 항체를 100 ㎕/웰의 용량으로 분주하고 37℃에서 30분간 반응시켰다. 30분 반응 후 5회 세척하고 기질액 (TMB-one)을 100 ㎕/웰의 용량으로 분주하여 15분간 발색시켰다. 발색이 완료 후 반응정지액을 100 ㎕/웰의 용량을 분주하고, 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 높은 수치를 나타내는 클론을 선별하였다. 선별된 양성클론은 24-웰 플레이트로 옮긴 뒤 3일간 배양하고 위와 동일한 방법으로 2차 검색하여 최종 양성 클론 후보군을 선별해내었다.
최종 선별된 양성클론은 부다페스트 조약에 따른 국제기탁기관인 한국세포주 연구재단에 수탁번호 KCLRF-BP-00265로 2011년 5월 19일에 기탁되었다.
6. 마우스 복수액 채취
최종 선별된 양성클론은 T75 (NUNC사) 배양 접시로 옮긴 뒤 3일간 배양하여 1x106 cell/ml 세포 밀도로 0.5ml 씩 마우스의 복강에 주사한 뒤, 일주일 뒤 채취하였다.
7. 항체 정제
얻어낸 마우스 복수액은 원심분리 (3000rpm, 10분, 4℃)를 통해 찌꺼기를 제거하고 결합버퍼 (Binding buffer, Thermo scientific 사)와 1:1 비율로 섞어준 뒤 상온에서 1시간 동안 반응하였다. 1시간 후 원심분리 (3000rpm, 10분, 4도)를 통해 찌꺼기를 침전물로 가라앉히고, 1.12μm 구멍크기를 가지는 필터를 사용하여 가라앉지 않은 찌꺼기를 재차 걸러내었다. 찌꺼기가 제거된 복수액은 단백질 G 레진 (Pierce사)이 들어있는 컬럼에 넣어주어, 항체와 단백질 G 간의 결합을 유도하였다. 복수액이 컬럼을 모두 통과한 후 인산염완충용액으로 3회 세척한 뒤 용출버퍼 (elution buffer, Thermo scientific 사)를 사용하여 용출시켰다. 용출된 항체는 다시 PD-10 컬럼 (GE heathcare사)에 적용하고 인산염완충용액으로 용출시켜 최종 정제하였다.
실시예
2: 진단 스트립 및 진단
키트의
제조
1. 멤브레인 코팅 공정
실시예1에 따라 준비되고 정제된 감염성 기관지염 바이러스 항원를 0.75㎍/strip 농도로 PBS로 희석하여 니트로셀룰로즈 멤브레인 검사선 (T)위치에 코팅 용액으로 사용하였다. 그리고 대조선 (C) 위치에는 산양 항 마우스 항체를 0.75 ㎍/strip 농도로 각각 코팅하였다.
2. 금 접합체 제조 공정
실시예1에 따라 준비되고 정제된 감염성 기관지염 바이러스 항원에 대한 항체를 금 콜로이드 (gold colloid)와 결합시켰다. 즉 염화금을 시트르산 나트륨 용액으로 환원시켜 보통 금 (plain gold)을 제조한 후 각각의 항체를 첨가하면서 40nm 크기의 항체가 결합된 골드 입자를 532nm에서 흡광도가 10±1이 되게 제조하였다. 여기에 결합된 항체를 안정화시키기 위하여 PEG 용액으로 처리하였다. 상기의 금입자와 항체가 결합된 각각의 금 접합체를 각각 8.3 ㎕/strip 씩 혼합하고, 폴리에스테르 또는 유리 섬유에 적셔 건조시켜 골드 패드를 제조하였다.
3. 흡습패드 및 검체패드 제조
흡습패드 및 검체패드는 반응용액이 잘 흡수될 수 있도록 건조하여 제조하였다.
4. 디바이스 조립
상기에서 제조된 각각의 멤브레인, 패드들을 오른쪽부터 검체패드, 골드패드, 니트로셀룰로즈 멤브레인, 마지막으로 흡습패드를 각각 중첩되게 결합하고 4.45 mm/스트립 크기로 절단하였다. 이렇게 절단된 스트립을 최종 디바이스의 하판에 넣고 상판을 덮어 진단용 키트를 제조하였다.
5. 제품 구성
상기에서 설명된 디바이스와 검체 채취용 면봉, 희석액을 최종 제품으로 구성되도록 하였다.
실시예
3: 진단 시약의 검사 원리
조류의 분변을 검체 희석액으로 희석하여 검체 적용홀에 적용한다.
이때 검체 중에 감염성 기관지염 바이러스가 일정량 이상 존재하면 금접합체 패드의 금입자에 접합되어 있는 감염성 기관지염 바이러스를 검출할 수 있는 항체와 1차적으로 결합하게 되며, 이후 이 결합체는 면역 크로마토그라피법 원리에 의해 멤브레인을 따라 이동하게 되면서 멤브레인의 특정위치에 있는 감염성 기관지염 바이러스를 검출할 수 있는 항체와 2차적으로 결합하면서 항체-항원-항체 복합체를 형성하면서 대조선 밴드와 함께 2개의 보라색 밴드를 나타낸다.
실시예
4: 본 발명에 따르는 진단 스트립의 진단 효능 시험
1. 검출 한계 시험
본 발명에 따르는 진단 스트립의 측정 범위 및 검출한계를 시험하기 위해 RRT-PCR을 실시하였으며, EKM91 주 (현재 국내에서 가장 많이 분리되는 신장형 바이러스주)에 대한 바이러스 역가는 107 EID50/ml이었다.
난감염 용량 (Egg infectious Dose: EID50 )은 9~11일령의 SPF 부화란에 각 서브타입 바이러스를 10 진 희석하여 장요막강내로 0.1ml 씩 접종한 후 37.6℃에서 3일간 배양하고, 다시 장요막강액을 5% 닭 적혈구 부유액과 혼합하여 평판 혈구 응집반응을 하여 바이러스 감염 여부를 판정하였다. 역가의 계산은 Reed & Munch 법으로 실시하였다.
본 발명에 따르는 진단 스트립의 측정 범위 및 검출한계는 107 EID50/ml 역가를 가진 감염성 기관지염 바이러스를 10진 희석하여 실시하였다. 검사한 결과 검사선의 감염성 기관지염 바이러스에 대한 검출 감도를 조사하였을 때, 105 EID50/ml 까지 검출할 수 있었으며, PCR과 검출 한계 차이는 104 을 보였다.
[KM91주]
| 바이러스 역가 (EID50/ml) | 검출 한계 | |
| 본 발명품 | RRT-PCR | |
| 107 | + | 15.53 (+) |
| 106 | + | 19.63 (+) |
| 105 | + | 22.94 (+) |
| 104 | - | 26.04 (+) |
| 103 | - | 30.06 (+) |
| 102 | - | 33.48 (+) |
| 101 | - | 38.04 (+) |
2. 교차 반응성 시험
본 발명에 따르는 진단 스트립의 교차 반응성을 조사하기 위하여 조류에게 병원성이 있는 여러 종류의 바이러스를 본 발명의 진단 스트립에 적용한 결과, 감염성 기관지염 바이러스만 양성 반응을 보였으며, 그 이외의 바이러스는 모두 음성 반응을 보였다.
| 바이러스 | 결과 |
| 감염성 기관지염 바이러스 (M41 주, 호흡기형) |
양성 |
| 감염성 기관지염 바이러스 (KM 91 주, 신장형) |
양성 |
| 조류 인플루엔자 바이러스 MS 96 (H9N2주) | 음성 |
| 뉴캣슬병 바이러스, 교정원 주 | 음성 |
| 뉴모 바이러스(TRTV 주) | 음성 |
| 전염성 후두 기관염 바이러스, Serva 주 | 음성 |
| 레오 바이러스 IVR-1133주 | 음성 |
| 감보로 바이러스 Winterfield 2510주 | 음성 |
| 마렉 바이러스 CV 1988+HVT 주 | 음성 |
| 레오 바이러스 REV-T 주 | 음성 |
3. 검출시기 및 검출 장기 시료에서의
검출율
비교
감염성 기관지염 바이러스의 호흡기형과 신장형 바이러스 실험적 감염 닭에 대한 본 발명에 따르는 스트립의 분변에서의 검출율을 비교하기 위하여 각 SPF 닭 10수에 KM91 주를 경구 감염시키고, 일별로 총배설강으로부터 바이러스 검출을 위한 분변 시료를 채취하여 검사에 사용하였다.
(KM 91 주)
| 1 DPI | 2 DPI | 3 DPI | DPI 4 | DPI 5 | DPI 7 | DPI 10 | |
| 종란 접종법 | 4/10 (40%) |
5/10 (50%) |
8/10 (80%) |
9/10 (90%) |
10/10 (100%) |
10/10 (100%) |
5/10 (50%) |
| RT-PCR | 2/10 (20%) |
3/10 (30%) |
5/10 (50%) |
9/10 (90%) |
10/10 (100%) |
9/10 (90%) |
4/10 (40%) |
| 본 발명품 | 1/10 (10%) |
3/10 (30%) |
4/10 (40%) |
9/10 (90%) |
10/10 (100%) |
8/10 (80%) |
4/10 (40)% |
또한 전염성 기관지염 감염 닭에 대한 본 발명에 따르는 스트립의 검출율을 비교하기 위하여 마찬가지로 10 마리 SPF 닭에 전염성 기관지 바이러스 (KM 91주) 를 비강 접종한 후 장기를 채취하였다. 양성의 경우 검사선과 대조선에서 선이 관찰 되었다.
장기별 검출율의 차이는 접종한 바이러스의 장기내 분포의 특성 차이에 크게 좌우 된다고 생각된다.
| 검체 | 종란접종법 | RT-PCR | 본 발명품 |
| 분변 | 10/10 (100%) | 10/10 (100%) | 10/10 (100%) |
| 기관 | 10/10 (100%) | 10/10 (100%) | 10/10 (100%) |
| 신장 | 10/10 (100%) | 10/10 (100%) | 10/10 (100%) |
4.
IBV
발생 농장 시료에서의
검출율
비교
본 발명에 따르는 스트립의 자연 감염된 시료에서의 검출율을 확인하기 위하여 IBV로 확진된 20개의 농장으로부터 분변, 장기 등의 시료를 채취하여 개체별, 농장별로 비교하여 보았다. 우선 IBV 발생 닭 농장 (산란계) 분변시료에서의 검출율은 아래와 같다
| 농장 이름 | No. | RT-PCR | 본 발명품 | ||
| 양성 | 음성 | 양성 | 음성 | ||
| Kimpo 1 | 12 | 12 | 0 | 12 | 0 |
| Kompo 2 | 11 | 11 | 0 | 11 | 0 |
| Paju 1 | 8 | 8 | 0 | 7 | 1 |
| Paju 2 | 7 | 7 | 0 | 7 | 0 |
| Paju 3 | 20 | 20 | 0 | 20 | 0 |
| Ilsan 1 | 25 | 25 | 0 | 25 | 0 |
| Ilsan 2 | 24 | 24 | 0 | 24 | 0 |
| Ilsan 3 | 21 | 21 | 0 | 20 | 1 |
| Ilsan 4 | 14 | 14 | 0 | 14 | 0 |
| Ilsan 5 | 11 | 11 | 0 | 11 | 0 |
| Ilsan 6 | 10 | 10 | 0 | 9 | 1 |
| 전체 | 160 | 160 | 0 | 157 | 3 |
| 농장별 | 11 | 11 | 0 | 11 | 0 |
전체 민감도 157/160 98.1%
농장별 민감도 11/11 100%
5. 특이도 시험
본 발명에 따르는 스트립의 감염되지 않은 시료에서의 검출율을 확인하기 위하여 IBV 음성 판정된 산란계 농장에서 수거한 직장 면봉 236 검체에 대하여 본 발명에 따르는 스트립의 특이도 시험을 실시하였다. 본 발명에 따르는 스트립의 특이도를 확인한 결과 RT-PCR 대비 특이도 99.1% 임을 확인할 수 있었다.
| 농장 이름 | No. | RT-PCR | 본 발명품 | ||
| 양성 | 음성 | 양성 | 음성 | ||
| Farm K-1 | 21 | 0 | 21 | 0 | 21 |
| Farm M | 30 | 0 | 30 | 0 | 30 |
| Farm K-2 | 23 | 0 | 23 | 0 | 23 |
| Farm P-1 | 13 | 0 | 13 | 1 | 12 |
| Farm J-1 | 15 | 0 | 15 | 0 | 15 |
| Farm J-2 | 24 | 0 | 24 | 0 | 24 |
| Farm L-1 | 35 | 0 | 35 | 0 | 35 |
| Farm P-2 | 21 | 0 | 21 | 0 | 21 |
| Farm P-3 | 23 | 0 | 23 | 1 | 22 |
| Farm 10 L-2 | 16 | 0 | 16 | 0 | 16 |
| Farm 11 L-3 | 15 | 0 | 15 | 0 | 15 |
| 전체 | 236 | 0 | 236 | 2 | 234 |
서열목록 전자파일 첨부
Claims (6)
- 수탁번호 KCLRF-BP-00265인 하이브리도마에 의하여 생산되는, 신장형 및 호흡기형 가금류 감염성 기관지염 바이러스를 인식하는 항체.
- 신장형 및 호흡기형 가금류 감염성 기관지염 바이러스를 인식하는 항체를 생산하는, 수탁번호 KCLRF-BP-00265인 하이브리도마.
- 제1항에 따른 항체를 포함하는, 신장형 및 호흡기형 가금류 감염성 기관지염 바이러스 중 하나 이상을 진단하기 위한 조성물.
- 제1항에 따른 항체를 포함하는, 신장형 및 호흡기형 가금류 감염성 기관지염 바이러스 중 하나 이상을 진단하기 위한 키트.
- 분석물을 포함하는 액체 시료가 적용되는 부위인 검체패드,
상기 검체패드와 유체 소통가능하게 연결되어 있고 제1항에 따른 항체와 골드 입자의 접합체가 이동가능하게 지지되어 있는 저장 패드,
상기 저장 패드와 유체 소통가능하게 연결되어 있고 모세관 이동에 의하여 상기 액체 시료가 이동하는 크로마토그래피 막 물질로서, 상기 저장 패드의 하류에 상기 제1항에 따른 항체가 비확산적으로 고정화되어 있는 검출 영역을 포함하는 크로마토그래피 막 물질;
상기 크로마토그래피 막 물질과 유체 소통가능하게 연결되어 있는 흡습 패드 및
상기 검체패드, 저장 패드, 크로마토그래피 막 물질 및 흡습 패드를 지지하는 고체 지지체를 포함하는, 신장형 및 호흡기형 가금류 감염성 기관지염 바이러스 중 하나 이상을 진단하기 위한 분석 장치. - 제1항에 따른 항체를 시료와 접촉시키는 단계;
상기 항체와 가금류 감염성 기관지염 바이러스의 복합체를 검출하는 단계; 및
검출결과로부터 시료 중에 가금류 감염성 기관지염 바이러스를 결정하는 단계를 포함하는, 시료 중 가금류 감염성 기관지염 바이러스의 존재를 확인하는 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020110051672A KR101287602B1 (ko) | 2011-05-30 | 2011-05-30 | 신장형 및 호흡기형 감염성 기관지염 바이러스를 인식하는 항체 및 그의 용도 |
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| KR20090096984A (ko) * | 2008-03-10 | 2009-09-15 | 주식회사 코미팜 | 가금류 면역글로불린 지의 에프씨 도메인의 세포 표면발현용 벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포 및상기 숙주세포를 이용한 가금류 질병 관련 바이러스에 대한백신의 제조방법 |
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