KR20080008802A

KR20080008802A - 우럭으로부터 정제된 면역글로불린에 대한 단클론항체 및이의 생성방법

Info

Publication number: KR20080008802A
Application number: KR1020060068539A
Authority: KR
Inventors: 정태성; 김영림; 신기욱
Original assignee: 경상대학교산학협력단
Priority date: 2006-07-21
Filing date: 2006-07-21
Publication date: 2008-01-24

Abstract

본 발명은 우럭 (Sebastes schlegeli)으로부터 분리/정제된 면역글로불린 (Ig) 및 이의 생성방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 우럭 (Sebastes schlegeli)으로부터 분리/정제된 면역글로불린에 대한 단클론항체 및 이의 생성방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 우럭으로부터 정제된 면역글로불린에 대한 단클론항체의 감별키트를 제공하며, 백신 개발에 필요한 유용한 정보를 제공한다.

우럭, 면역글로불린, 단클론항체, 감별키트

Description

우럭으로부터 정제된 면역글로불린에 대한 단클론항체 및 이의 생성방법 {Monoclonal antibody against immunoglobulins purified from serum of black rockfish and the preparation method thereof}

도 1은 단백질 A, 만난 결합 단백질 (MBP) 및 염소 IgG 친화 컬럼을 사용하여 분리/정제된 우럭 Igs에 대한 음이온 교환 컬럼(HQ)의 크로마토그램을 나타낸 것이다.

도 2는 단백질 A, 만난 결합 단백질 (MBP) 및 염소 IgG 친화 컬럼을 사용하여 분리/정제된 우럭의 SDS-PAGE 분석을 나타낸 사진으로 Lane 1은 우럭의 전체 혈청, Lane 2는 MBP-양성 Ig, Lane 3은 단백질 A-양성 Ig, Lane 4는 염소(goat) IgG로 면역화된 혈청으로부터의 염소(goat) IgG-양성 Ig를 나타낸 것이다.

도 3은 단백질 A-양성 Ig에 대한 특이적 단클론 항체를 사용한 면역블랏 분석을 나타낸 것으로, Lane 1은 Ig 중쇄에 대한 특정 MAb의 대표(representive) 클론 (R7B4-8), Lane 2는 Ig 경쇄에 대한 특정 MAb의 대표(representive) 클론 (R11H4-1)을 나타낸 것이다.

도 4는 MAb의 R7B4-8(panel A) 및 R7B4-9(panel B)의 세 개의 다른 친화 컬럼으로부터 분리/정제된 Igs에 대한 교차반응(cross-reaction)을 나타낸 것으로 Lane 1 및 Lane 5는 MBP 컬럼으로 정제된 Igs, Lane 2 및 Lane 6은 단백질 A 컬럼으로 정제된 Igs, Lane 3 및 Lane 4는 IgG 컬럼으로 정제된 Igs를 나타낸 것이다.

도 5는 특정 MAb(R7B4-9)를 사용한 2-DE 면역블랏 프로파일에서 Ig 중쇄의 동정을 나타낸 도로써, (A)는 CBG로 염색된 하나의 겔을 나타내며, (B)는 면역블랏 분석에 사용된 또 다른 겔을 나타낸 것이다.

본 발명은 우럭 (Sebastes schegeli)으로부터 분리/정제된 면역글로불린 (Ig) 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 면역글로불린에 대한 단클론 항체 및 이의 생산방법에 관한 것이다.

즉, 본 발명의 발명자들은 단백질 A (Protein A), 만난 결합 단백질 (MBP)및 면역친화 컬럼를 이용하여 우럭 (black rockfish) 혈청으로부터 면역글로불린을 정제하는데 성공하고 본 발명에 이르게 되었다.

우럭 (Sebastes schegeli) 은 양볼락과(Scorpaenidae)에 속하고, 한국, 중국 및 일본에서 중요한 양식 물고기 종이다. 2002년 한국의 우럭 생산량은 16,548 매트릭톤에 이르렀다. 하지만, 이 종의 집약적인 양식으로 인해 심각한 경제적 손실을 가져오는 다양한 기생충, 박테리아 및 바이러스성 질병의 갑작스런 발명을 가져 오게 하고 있다. 다양한 질병에 대한 물고기의 방어 기전을 좀 더 철저히 이해하는 것이 적절한 질병 관리 전략 및 지속 가능한 양어 생산을 발달시키는 데 더 없이 필요할 것이다.

척추동물의 방어 기전은 일반적으로 선천적인 면역반응 및 후천적인 면역반응으로 나누어진다. 후천적 면역반응은 항원의 자극에 의해 숙주가 특이적인 면역글로불린 (Igs)을 생산하는 것을 포함한다. 생산된 면역글로불린은 병원체를 제거하거나 혈액 또는 기관으로 병원성 인자가 유입되는 것을 막는다. 포유류는 IgM, IgG, IgA, IgE 및 IgD의 5 클래스로 나누어진다 (Tizard, 1996). 한편, 어류는 게노믹 연구로부터 Ig 중쇄 (heavy chain)의 4 종류의 이소타입을 가지는 것으로 보고되고 있다. 즉, IgM (Lee et al., 2001; Hordvik et al., 2002), IgD (Hordvik et al., 1999; Hirono et al., 2003; Srisapoome et al., 2004], IgZ (Savan et al., 2005) 및 IgT (Hansen et al., 2005).

이들 면역글로불린들 (Igs) 중 단지 IgM 만이 어류의 체액성 면역반응에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있다 (Iwama and Nakanishi, 1996; Tizard, 1996). 어류 및 포유류 IgM이 구조적 유사성을 일부 가지고 있음에도 불구하고, 경골어류(teleost)의 IgM는 주요 중합 형태가 테트라머인 (~800 kDa) 특성을 가지는 것으로 특징지어 진다.(George I, Teruyki N. ; 1996)

한편, 어류의 혈청으로부터 면역글로불린을 정제하기 위해, 포화 황산암모늄 에서의 침전, 겔 거르기, 이온 교환 크로마토그래피 및 친화 크로마토그래피를 포함하는 다양한 방법들이 사용되고 있다. 단백질 A, 만난 결합 단백질 (MBP) 및 특정 단백질과 같은 특정 리간드와 결합된 친화 컬럼은 방법상의 간편함과 IgM에 대한 특이성으로 인해 어류 혈청으로부터 IgM을 정제하는데 널리 사용되고 있다 (Suzuki et al., 1990; Al-Harbi et al., 2000; Watts et al., 2001; Crosbie and Nowak, 2002; Bromage et al., 2004). Staphylococcus aureus의 세포 벽 성분인 단백질 A는 IgG의 중쇄 내 그리고 포유류 IgM의 Fab 영역의 VH III 구조 내의 CH2-CH3 도메인에 결합한다. 포유류 혈청에 존재하는 렉틴 (lectin)인 MBP는 만노즈 및 N-acetylglucosamine에 특이적이며, 면역글로불린 (Ig) 상의 특이적인 탄수화물 성분에 결합할 수 있다 (Koppel et al., 1994). 다른 한편으로, 특이적 단백질은 이에 대한 면역글로불린을 정제하는 항원으로 사용된다 (Grove et al., 2006; Palenzuela et al., 1996; Watts et al., 2001). 하지만, 지금까지 단백질 A (Protein A), MBP (Mannan Binding Protein) 및 염소 IgG를 이용하여 정제된 우럭(black rockfish) 면역글로불린 및 이의 특성에 대하여 보고 된 바 없다.

본 발명의 발명자들은 우럭의 면역성에 대한 이해를 향상시키기 위해 단백질 A, 만난 결합 단백질 (MBP) 및 염소 (goat) IgG와 같은 3개의 다른 친화 컬럼으로 우럭 혈청으로부터 Igs를 정제하는 능력에 대하여 측정하였으며, 분리된 면역글로불린들의 특성을 검증하였으며, 단일형태의 면역글로불린에 대한 단클론항체 (MAbs)를 생산하였고, 2-DE 프로화일 및 면역블랏 프로화일로 이를 확인하면서 본 발명에 이르렀다.

이에 본 발명은 우럭 (Sebastes schegeli)의 혈청으로부터 분리/정제된 면역글로불린 (Ig)에 대한 단클론항체 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 우럭으로부터 정제된 면역글로불린에 대한 단클론항체를 포함하는 검출키트를 제공함으로써 병원체에 대한 우럭의 체액성 면역 반응의 연구, 진단 마커 및 백신 개발에 필요한 유용한 정보를 제공하고자 한다.

본 발명은 우럭 (Sebastes schegeli)의 혈청으로부터 분리/정제된 면역글로불린 (Ig)에 대한 단클론항체 및 이의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 우럭 (Sebastes schegeli)을 동물의 면역글로불린으로 면역한 후 우럭의 혈청을 분리하는 제 1단계; 단백질A, 만난 결합 단백질 (Mannan Binding Protein; MBP) 또는 면역친화 컬럼을 사용하여 면역글로불린 (Igs)을 정제하는 제 2단계; 면역된 마우스로부터 비장을 수집하여 골수종세포(myeloma cell)와 융합하고 배양하여 우럭 면역글로불린에 대한 단클론항체를 제조하는 제 3단계를 포함하는 우럭 면역글로불린에 대한 단클론항체 제조방법을 제공한다.

상기 정제된 면역글로불린은 70 kDa의 분자량의 중쇄 및 25 kDa의 경쇄로 구성됨을 특징으로 하며, 상기 동물이 염소 (goat)인 것을 특징으로 한다.

상기 제 1단계의 동물이 염소 (goat)인 것을 특징으로 한다.

상기 제 2단계 이후에 면역글로불린 (Igs)을 마우스에 주사하여 면역증강 (booster) 시키는 단계를 더 포함함을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기의 제조방법에 의해 제조된 단클론항체를 제공한다.

또한, 본 발명은 i) 우럭의 면역글로불린에 대한 단클론항체가 공유 결합 또는 물리적 흡착에 의해 고정화되어 있는 고체 지지체, ii) 감지 가능한 발색 시약을 포함하는 하나 이상의 용액 및 iii) 완충된 세척 용액 및 품질 관리에 요구되는 시료를 포함하는 우럭의 면역글로불린 검출키트를 제공한다.

상기 키트에 사용된 단클론항체는 상기의 제조방법에 의해 제조된 단클론항체임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기의 제조방법에 의해 제조된 검출키트를 사용하여 병원체에 대한 우럭의 체액성 면역을 진단하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 우럭의 면역글로불린 (Igs)에 대한 단클론항체를 수득하는 방법을 상세히 설명한다.

제 1단계: 우럭의 혈청 분리

우럭에 FCA (Freund's Complete Adjuvant)와 염소 IgG을 적정한 비율로 혼합하여 복강 내 주사하여 면역화 한 후, 일정한 간격으로 동일한 양의 부스터 (booster)를 투여한 다음, 미정맥 (caudal vein)으로부터 방혈하여 혈청을 수집하 고 70℃에서 보관한다.

제 2단계: 면역글로불린 ( Igs )의 정제

여러가지 컬럼, 바람직하게는 단백질 A, 만난 결합 단백질 및 면역친화 컬럼을 사용하여 1.2±0.08 mg/ml, 0.9±0.1 mg/ml 및 0.7±0.1 mg/ml 농도의 Ig-유사 단백질을 각각 정제할 수 있다.

제 3단계: 우럭 면역글로불린에 대한 단클론항체 제조

면역혈청으로부터 단백질 A, MBP 및 면역친화 컬럼으로 정제된 Ig으로 마우스를 면역하고, 면역증강 (booster)한 후, 면역된 마우스로부터 비장을 수집하여 골수종 세포 (myeloma cells)와 융합시키고, 융합세포를 마우스 혈액 세포로 된 배양층 위에서 배양하고 ELISA 및 면역블랏팅 분석을 통해 단클론항체를 수득할 수 있다.

본 발명에서, 2-차원 겔 전기영동 (2-DE), 면역블롯팅 및 MALDI-TOF MS를 사용하는 펩타이드 질량 핑거프린팅 (PMF)과 같은 면역반응을 연구하기 위한 단백체학 도구들이 단백질/항원의 분리 및 이들을 세포, 조직, 체액 또는 조직 융해체로부터 확인하는데 사용될 수 있다. 2-DE는 어류 면역학에서 다양한 방법들에 의해 정제된 Igs의 특성을 분석하기 위해 널리 사용되고 있다 (Shin et al., 19962006). 다른 한편으로, 병원체의 2-DE 면역블랏 분석법은 S. pyogenes (Lei et al., 2000), Staphylococcus aureus (Vytvytska et al., 2002), Aeromonas hydrophila (Chen et al., 2004), Edwardsiella ictaruli (Moore et al., 2002), E. tarda (Kawai et al., 2004) 및 Lactococcus garvieae (Kang et al., 2006). 다양한 방법에서, 프로테오믹 도구들은 병인론을 연구하고, 진단을 위한 마커를 발굴하고 백신을 개발하는데 아주 유용한 것으로 확인되고 있다.

또한, 본 발명의 어류의 혈청으로부터 면역글로불린을 정제하기 위해, 포화 황산암모늄에서의 침전, 겔 거르기, 이온 교환 크로마토그래피 및 친화 크로마토그래피를 포함하는 다양한 방법들이 사용될 수 있다. 또한, 단백질 A, 만난 결합 단백질 (MBP) 및 특정 단백질과 같은 특정 리간드와 결합된 친화 컬럼은 방법상의 간편함과 IgM에 대한 특이성으로 인해 어류 혈청으로부터 IgM을 정제하는데 사용될 수 있다 (Suzuki et al., 1990; Al-Harbi et al., 2000; Watts et al., 2001; Crosbie and Nowak, 2002; Bromage et al., 2004).

Staphylococcus aureus의 세포 벽 성분인 단백질 A는 IgG의 중쇄 내 그리고 포유류 IgM의 Fab 영역의 VH III 구조 내의 CH2-CH3 도메인에 결합한다. 포유류 혈청에 존재하는 렉틴 (lectin)인 만난 결합 단백질 (MBP)은 만노즈 및 N-acetylglucosamine에 특이적이며, 면역글로불린 (Ig)상의 특이적인 탄수화물 성분에 결합할 수 있다 (Koppel et al., 1994). 또한, 특이 단백질이 본 발명의 면역글로불린을 정제하는 항원으로 사용될 수 있다 (Grove et al., 2006; Palenzuela et al., 1996; Watts et al., 2001).

본 발명의 발명자들은 단백질 A (Protein A), 만난 결합 단백질(MBP) 및 면역친화 컬럼을 이용하여 우럭 (black rockfish) 혈청으로부터 Ig-유사 단백질을 정제하는데 성공하였다. 단백질 A는 면역글로불린 (Ig)의 Fc 영역의 도메인에 결합하는 Staphylococcus aureus의 세포벽 성분이다 (Sasso et al., 1991; Harada et al., 1994). 한편, 만난 결합 단백질 (MBP)은 병원체 청소 작용을 하며 IgM의 만노즈 영역에 대한 높은 특이성을 가진 동물 렉틴 (lectin)이다 (Koppel et al., 1994). 이들 2 분자들은 염소 IgG와 같이 (Palenzuela et al., 1996; Watts et al., 2001), 어류 혈청으로부터 친화 컬럼을 이용한 IgM 정제에 사용되어 오고 있다 (Suzuki et al., 1990; Al-Harbi et al., 2000; Watts et al., 2001; Crosbie and Nowak, 2002; Bromage et al., 2004).

한편, SDS-PAGE 분석을 통해 이전에 이미 경골어류의 IgM이 70-81 kDa의 중쇄 및 22-32 kDa의 경쇄로 구성되어 있음이 밝혀져 있다. 다른 한편으로, 이전의 2-DE 실험들은 사람 IgM의 중쇄에 해당하는 스팟이 5.6 ~ 6.4 범위의 pI, 80-82 kDa의 분자량 범위에서 발견되었음을 보여주었다 (Al-Harbi et al., 2000; Watts et al., 2001; Crosbie and Nowak, 2002; Bromage et al., 2004; Kang et al., 2006; Palenzuela et al., 1996; Iwama and Nakanishi, 1996). 또한, IgM의 중쇄의 pI 범위 및 분자량은 emerald rockcod (Ttrematomus bernacchii pI range 4.0- 6.0, MW 78 kDa) (Pucci et al., 2003), rainbow trout (pI 4.8-6.0, MW 76 kDa) 및 Arctic char (Salvelinus alpinus pI 5.0-6.5, MW 76 kDa) (Hordvik et al., 2002)에서 약간씩 달랐으며, 반면에 상기 3종들은 4~7의 pI 범위에 널리 분포하였다 (Hordvik et al., 2002; Pucci et al., 2003).

상기 내용과 유사하게, 본 발명의 우럭으로부터 정제된 면역글로불린 (Igs)들은 SDS-PAGE에서 70 kDa 및 25 kDa의 밴드를 나타내었으며, 주요 스팟 그룹은 정제된 Ig의 2-DE 프로화일 상에 pI 4.8-5.6 및 MW 70 kDa, MW 25 kDa의 범위로 나타났다. 특히, SDS-PAGE 및 2-DE의 결과에 기초하여, 70 kDa의 밴드 및 25 kDa의 스팟이 중쇄 및 경쇄를 각각 나타내는 것으로 여겨진다. 또한 PMF, NCBI 데이터베이스 검색결과 면역글로불린 단백질의 중쇄는 IgM 또는 IgM 전구체로 확인되었다. 즉, 본 발명에서 정제한 면역글로불린 단백질은 SDS-PAGE 2-DE 및 PMF 분석으로 우럭의 IgM인 것으로 확인된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 어류 및 면역 혈청의 준비

우럭 (체중 300~400g)을 수산시장에서 구입하여 18 ~ 20℃로 유지된 재순환 바닷물이 채워진 섬유강화 플라스틱 (FRP) 탱크에서 유지하였다. 15 마리의 물고 기에 Freund's Complete Adjuvant (FCA)와 1:1 (v/v)로 혼합한 염소 IgG (250 ug/100g 체중)를 복강 내 주사하여 면역화하였다. 2주 간격으로 동일한 양의 2번째 및 3번째 부스터 (booster)를 투여하였다. 3번째 주사 후 일주일에 미정맥 (caudal vein)으로부터 방혈하여 혈청을 수집하고, 사용 때까지 70℃에서 유지하였다.

< 실시예 2> 물고기 항체의 정제

면역된 혈청으로부터 면역글로불린 (Ig)을 정제하기 위해 단백질 A, 만난-결합 단백질 (MBP) 및 면역친화 컬럼을 사용하였다.

A. 단백질 A 친화 컬럼

면역된 우럭으로부터 면역글로불린 (Igs)을 정제하기 위해 조금 변형된 Bollage et al. (1996) 방법에 따라 단백질 A (Protein A) 비드 (beads) (Sigma, USA)를 사용하였다. 간략히, 단백질 A 비드를 일회용의 폴리스틸렌 컬럼 (Bio-Rad, USA)으로 팩킹하고 결합완충액 (10 mM Tris, 1.25 M NaCl, 20 mM CaCl₂, 0.02% NaN₃, pH 7.4)으로 세척하였다. 혈청 샘플들을 결합완충액과 혼합하여 (1:1) 컬럼에 적용하였다. 결합되지 아니한 물질들을 150 ㎖의 결합 완충액으로 제거하고, 0.1 ㎖의 0.1 M Tris buffer (pH 7.4)를 포함하는 마이크로튜브 내에 수집된 1 ㎖의 프랙션으로 용리완충액 (10 mM Tris, 1.25 M NaCl, 0.02% NaN₃, pH 7.4)을 사용 하여 면역글로불린 (Igs)을 용리하였다.

단백질 A 컬럼은 우럭의 혈청으로부터 Ig-유사 단백질을 성공적으로 정제할 수 있었다. 단백질 A 컬럼을 사용하여 정제된 Ig-유사 단백의 농도는 1.2± 0.08 mg/ml 이었다.

B. 만난 결합 단백질 ( MBP ) 친화 컬럼

ImmunoPure IgM Purification Kit (Pierce, USA)를 사용하여 면역된 우럭 (black rockfish)로부터 면역글로불린 (Igs)을 정제하였다. 간략히, 컬럼을 5 ㎖의 사용전 버퍼(preparation buffer)로 전-세척하고, 20 ㎖의 결합 완충액으로 평형화시켰다. 혈청 샘플들을 결합 완충액과 혼합 (1:1)하고, 컬럼에 적용한 후 4℃에서 30분간 배양하였다. 결합하지 않은 물질을 42 ㎖의 결합 완충액으로 제거하고 컬럼을 3 ㎖의 용리 완충액으로 로딩한 후 상온에서 1시간 동안 배양하고 용출액을 상기와 같이 분획화 하였다.

만난 결합 단백질 (MBP) 컬럼은 우럭의 혈청으로부터 Ig-유사 단백질을 성공적으로 정제할 수 있었다. 만난 결합 단백질 (MBP) 컬럼을 사용하여 정제된 Ig-유사 단백의 농도는 0.9±0.1 mg/ml 이었다.

C. 면역친화 컬럼

면역글로불린 (Igs)을 Smith's method (1992)에 따라 면역된 우럭 혈청으로부터 면역친화 정제하였다. 간략히, 염소 IgG 아가로즈 비드 (Sigma, USA)를 포함 하는 컬럼을 150㎖의 PBS (0.02M phosphate, 0.15 M NaCl)로 세척하고 PSB와 1:1로 혼합된 혈청 샘플들로 로딩 (loading)하였다. 컬럼을 150㎖의 PBS로 세척하고, 면역글로불린을 용리완충액 (0.1 M glycine-NaOH, pH 11)으로 용리하고, 1㎖의 프랙션 (fractions)을 0.1㎖의 0.1 M 트리스 버퍼 (Tris buffer) (pH 7.4)를 포함하는 마이크로튜브 내에 수집하였다.

면역친화 컬럼은 우럭의 혈청으로부터 Ig-유사 단백질을 성공적으로 정제할 수 있었다. 면역친화 컬럼을 사용하여 정제된 Ig-유사 단백질의 농도는 0.7±0.1 mg/ml 이었다.

D. 음이온 교환 컬럼 분석

상기에서 정제된 우럭의 Ig를 음이온 교환 컬럼을 사용하여 분석하였다.

정제된 Igs은 음이온 교환 컬럼에서 0.46M의 NaCl 농도에서 단일 피크 (single peak)를 나타내었다.(도 1)

< 실시예 3> 친화컬럼을 사용한 정제된 단백질의 탈염

탈염을 위해, 정제된 면역글로불린 (Igs)을 PBS에서 3회 세척하고 1,600 × g (Centricon, Falcon, USA)에서 원심 분리하였다. 정제된 단백질의 농도는 595 nm에서 분광광도계로 브라드포드 시약 (Bradford reagent)(Bio-Rad, USA)를 사용하여 측정하였다.

A. 정제된 면역글로불린의 SDS - PAGE 및 2-차원 겔 전기영동 (2- DE )

정제된 면역글로불린 (Igs)의 분자량을 확인하기 위해 환원 조건 하에서 SDS-PAGE를 수행하였다. 환원성 분위기를 위해, 정제된 면역글로불린 (0.3 ㎍)를 SDS-PAGE 샘플완충액 (60 mM Tris-HCl, 25% glycerol, 2% SDS, 14.4 mM 2-멀캅토에탄올 (mercaptoethanol), 0.1% 브로모페놀 블루 (bromophenol blue))과 혼합하고 100℃에서 10분간 끓였다.

변성된 단백질들을 15분간 50V로, 그 이후 염색약이 겔이 바닥에 이르게 될 때까지 100V로 12.5% 겔 상에서 분석하였다. 2-DE는 Get al. (2000)에 의해 설명된 방법을 약간 변형하여 수행하였다. 친화 컬럼으로 정제된 면역글로불린들을 재수화 완충액 (9 M urea, 4% CHAPS, 20 mM DTT, 0.5% IPG buffer, pH 4-7 및 미량의 브로모페놀 블루 (bromophenol blue)로 1 ㎎/㎖까지 희석한 후, 상온에서 16,000 × g로 10분간 마이크로원심 분리하였다. 상층액을 IPGphor system (Amersham)을 사용하는 고정된 pH 경사 (IPG) 스트립 (strips)으로 등전-집속을 수행하였다. 자동화된 실행은 전체 56kVhr이 되도록 30V에서 6시간, 60V 에서 6 시간 및 4,500V 까지 점차적으로 전압의 상승으로 구성하였다. 집중된 IPG 스트립을 0.5% (w/v) 아가로즈로 봉인된 12.5% SDS-PAGE 겔 상에 놓고 염색액이 겔의 바닥에 닿을 때까지 전기영동 하였다. SDS-PAGE 상의 밴드 및 2-DE 겔 상의 점들은 CBB G-250으로 시각화되었고, Agfa Arcus 1200™ 이미지 스캐너 (Agfa-Gevaert, Mortsel, Belgium)로 디지털화하고, Phoretix™ 2D software (Ver. 5.01, NonLinear Dynamics Ltd., UK)를 사용하여 분석하였다.

B. SDS - PAGE 및 2- DE 결과

3개의 다른 컬럼을 사용하여 정제한 Ig-유사 단백질을 SDS-PAGE 및 2-DE 분석을 수행하였다.

환원 조건 하에서 SDS-PAGE 분석은 경골어류의 IgM은 70-81 kDA의 중쇄와 22-32 kDa의 경쇄로 구성되어있음이 이미 밝혀져 있다. 이와 일치하는 결과로서 본 실험에서 정제된 Ig-유사 단백질 모두는 70 및 25 kDa의 밴드로 구성되어 있었고, 따라서 70 kDa의 밴드는 중쇄로, 25 kDa의 밴드는 경쇄임을 확인하였다.(도 2)

< 실시예 4> 단클론항체의 제조

A. 단클론항체의 제조

면역혈청으로부터 단백질 A, MBP 및 면역친화 컬럼으로 정제된 Ig으로 BALB/C 마우스 (Hyochang Science Inc., Korea)를 Al-Harbi et al. (2000)에 기술된 방법에 따라 면역하였다. 간략히, Freund's 완전 (제1) 또는 불완전 (제2 및 제3) 어쥬반트와 1:1로 혼합된, 50㎍의 우럭 면역글로불린 (Igs)을 6주에 걸쳐 매 2주 마다 복강 내 (IP) 주사하였다.

세 번째 주사 1주일 후, 어쥬반트 없이 50 ㎍의 면역글로불린을 미정맥 주사를 통하여 면역증강 (booster)하였다. 어쥬반트-없이 면역증강 한 3일 후, 면역된 마우스로부터 비장을 수집하여 폴리에틸렌글리콜을 사용하여 Sp2/o 골수종 세포 (myeloma cells) (CRL 1581; ATCC, USA)과 융합시켰다. 융합 세포를 96-웰 플레이 트에서 마우스 혈액 세포로 된 배양층 위에서 배양하였다. ELISA 및 면역블랏팅 분석으로 단클론항체를 스크리닝하였다.

B. 면역블랏 분석

ELISA 스크리닝 후 SDS-PAGE 면역블랏 분석으로 Ig에 대한 21 개의 단클론항체 클론을 선택하였다. SDS-PAGE 는 10% 아크릴아미드 겔에서 수행되었고, 분리된 단백질들을 니트로셀룰로오스 막으로 이동시키고 21 MAb 클론과 반응시켰다.

Ig에 대한 단클론항체 중 R7B4-8 및 R7B4-9를 포함하는 19개의 클론들은 Ig의 중쇄 (heavy chain)에 특이적이었으며, 두개의 클론 (R11H4-1, R9C7-6)은 Ig의 경쇄 (light chain)에 특이적이었다.(도 3).

생성된 모든 MAbs는 이소타입(isotype) 클래스에 대한 분석에서 IgG2, IgG1 또는 IgM에 속하였다. 단백질 A 컬럼을 사용한 Ig 정제에서 오염물질 또는 불특정 단백질에 대한 보고가 있으나 본 실험에서의 면역블랏 프로파일에서는 어떠한 오염물질 또는 불특정 단백질이 관찰되지 않았다.

단백질 A-양성 Ig에 대한 MAbs 는 세 개의 친화 컬럼으로부터 분리된 모든 Ig와 비슷한 반응을 갖음을 확인할 수 있었다.(도 4)

C. 2- DE 면역블랏 분석

우럭의 전체 혈청으로부터의 Ig의 중쇄를 동정하기 위하여 2-DE(two dimensional gel electrophoresis) 면역블랏 분석을 수행하였다. 2-DE는 IPG 건조 스트립(strip)(pH 4-7, 7cm)을 사용한 IEF (isoelectric focusing)에 의해 수행된 후 12.5% SDS-PAGE를 실시하였다. 2-DE 면역블랏 프로파일은 Ig 중쇄에 대한 MAb 분자량 70kDa 및 등전점 4.8-5.6의 범위에서 분리된 스팟들과 반응함을 확인할 수 있었다.(도 5)

본 발명은 우럭 혈청으로부터 분리 및 정제한 면역글로불린 및 이의 제조방법, 더 나아가 상기 면역글로불린에 대한 단클론항체 및 이의 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 우럭 면역글로불린에 대한 단클론항체를 포함하는 키트를 제공함으로써 면역글로불린의 검출을 용이하게 하여 병원체에 대한 우럭의 체액성 면역반응에 대한 연구, 진단 마커 및 백신 개발에 유용한 정보를 제공할 수 있다.

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Claims

우럭 (Sebastes schegeli)을 동물의 면역글로불린으로 면역한 후 우럭의 혈청을 분리하는 제 1단계; 단백질A, 만난 결합 단백질 (Mannan Binding Protein; MBP) 또는 면역친화 컬럼을 사용하여 면역글로불린 (Igs)을 정제하는 제 2단계; 면역된 마우스로부터 비장을 수집하여 골수종세포(myeloma cell)와 융합하고 배양하여 우럭 면역글로불린에 대한 단클론항체를 제조하는 제 3단계;를 포함하는 우럭 면역글로불린에 대한 단클론항체 제조방법
제 1항에 있어서, 상기 정제된 면역글로불린은 70 kDa의 분자량의 중쇄 및 25 kDa의 경쇄로 구성됨을 특징으로 하는 단클론항체 제조방법
제 1항에 있어서, 상기 제 1단계의 동물이 염소 (goat)인 것을 특징으로 하는 단클론항체 제조방법
제 1항에 있어서, 상기 제 2단계 이후에 면역글로불린 (Igs)을 마우스에 주사하여 면역증강 (booster) 시키는 단계를 더 포함함을 특징으로 하는 단클론항체. 제조방법
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 의 제조방법에 의해 제조된 단클론항체
i) 우럭의 면역글로불린에 대한 단클론항체가 공유 결합 또는 물리적 흡착에 의해 고정화되어 있는 고체 지지체, ii) 감지 가능한 발색 시약을 포함하는 하나 이상의 용액 및 iii) 완충된 세척 용액 및 품질 관리에 요구되는 시료를 포함하는 우럭의 면역글로불린 검출키트
제 6항에 있어서, 상기 단클론항체는 제 5항의 단클론항체임을 특징으로 하는 검출키트
제 6항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 검출키트를 사용함을 특징으로 하는 병원체에 대한 우럭의 체액성 면역 진단 방법