CN117683123A - 抗狂犬病毒人源化抗体和抗体组合及其用途 - Google Patents

抗狂犬病毒人源化抗体和抗体组合及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN117683123A
CN117683123A CN202311194093.1A CN202311194093A CN117683123A CN 117683123 A CN117683123 A CN 117683123A CN 202311194093 A CN202311194093 A CN 202311194093A CN 117683123 A CN117683123 A CN 117683123A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino acid
antibody
acid sequence
seq
sequence shown
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN202311194093.1A
Other languages
English (en)
Inventor
杨鹏云
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Sibirui Biotechnology Co ltd
Dongpu Anfeng Beijing Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Beijing Sibirui Biotechnology Co ltd
Dongpu Anfeng Beijing Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Sibirui Biotechnology Co ltd, Dongpu Anfeng Beijing Biotechnology Co ltd filed Critical Beijing Sibirui Biotechnology Co ltd
Priority to CN202311194093.1A priority Critical patent/CN117683123A/zh
Publication of CN117683123A publication Critical patent/CN117683123A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/145—Rhabdoviridae, e.g. rabies virus, Duvenhage virus, Mokola virus or vesicular stomatitis virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明属于本发明涉及单克隆抗体和/或工程化抗体领域，公开了一种抗狂犬病毒人源化抗体和抗体组合及其用途，结合狂犬病毒的抗体或其抗原结合片段。本发明还提供了对于全球狂犬病毒流行株具有最大中和能力的抗体和抗体组合。

Description

抗狂犬病毒人源化抗体和抗体组合及其用途
技术领域
本发明涉及单克隆抗体和/或工程化抗体领域，具体地，本发明提供了与狂犬病毒特异性结合的抗体或其抗原结合片段和包含其的组合物，以及抗体的组合。还提供了编码本发明抗体或其抗原结合片段的核酸分子，用于表达本发明抗体或其抗原结合片段的载体和宿主细胞，以及本发明抗体或其抗原结合片段的治疗和预防用途。
背景技术
本发明对于背景技术的描述属于与本发明相关的相关技术，仅仅是用于说明和便于理解本发明的发明内容，不应理解为申请人明确认为或推定申请人认为是本发明在首次提出申请的申请日的现有技术。
狂犬病(Rabies)是由狂犬病毒属病毒(Lyssavirus)(绝大多数情况下为狂犬病毒，少数情况为其他狂犬病毒属病毒)感染引起的急性传染病，在感染者出现临床症状后，死亡率可达100％。虽然在极少数国家当中，狂犬病或犬狂犬病得到了消除，但是全球每年仍然有约5-6万人死于狂犬病，其中大约一半发生在亚洲。综合来看，狂犬病仍然是给人类带来极大负担的传染病。
暴露后及时正确地进行暴露后预防措施(post exposure prophylaxis，PEP)，能有效的预防狂犬病的发生，因此对于这种极高死亡率的疾病暴露者而言至关重要。由于疫苗接种虽然有效但需要一定的时间才能在体内产生足够的中和抗体，因而接受免疫球蛋白被动免疫是PEP的重要组成部分。由于人狂犬免疫球蛋白全球供应短缺且价格相对较高，而马来源的免疫球蛋白还具有一定的免疫原性在人体内会引起副反应，WHO建议使用单抗制品来替代目前的免疫球蛋白，并建议至少使用两种以上的单抗来组成“组合制剂”，从而可以最大程度的对各种狂犬病病毒(RABV)进行中和。
狂犬病毒(Rabies Virus,RABV)是具有较高突变率的RNA病毒，自然突变引起的序列多样性会影响狂犬病毒单抗的有效性，但目前对于狂犬病毒单抗的缺乏有效的评价手段，基于ELISA、狂犬活病毒等开展的表位或广谱性研究具有其局限性只能提供粗略而有限的信息，无法完整地表征单抗的中和表位，包括中和表位序列和定位、表位中关键的结合位点、中和逃逸位点和逃逸的氨基酸种类及其自然流行情况等信息，同时在活病毒上开展的中和广谱性评价也缺乏病毒流行的代表性，这些关键信息对于狂犬病毒单抗的筛选、药学研究和临床使用都是至关重要的。
本领域仍然需要经过充分、深入评估的狂犬病毒单抗或单抗组合，从而在最大程度上中和可能的狂犬病毒，将暴露者的发病风险降至最低。
发明内容
本发明提供了一种抗狂犬病毒人源化抗体和抗体组合及其用途，利用狂犬假病毒系统对抗体的中和能力进行了验证评估。该系统包括大量的狂犬病毒G蛋白定点突变，并包装各种自然流行病毒株，其全面性超过任何已有平台，同时与活病毒中和试验具有良好的一致性，因此在狂犬病毒单抗表位和中和广谱性研究中具有显著的优势。因此，本发明提供了对于全球(尤其是中国境内)狂犬病毒流行株具有最大中和能力的抗体和抗体组合。
在一个方面，本发明提供了一种抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段，其中所述抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:20-24中任一项所示的重链可变区的3个互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，和/或如SEQ ID NO:25-28中任一项所示的轻链可变区的3个互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，本发明提供了结合狂犬病毒的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和/或轻链可变区，其中
所述重链可变区包含：
(1)包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的HCDR1，包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的HCDR2，和包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的HCDR3；
(2)包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的HCDR1，包含如SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列的HCDR2，和包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的HCDR3；或
(3)包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的HCDR1，包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的HCDR2，和包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的HCDR3；
和/或
所述轻链可变区包含：
(1)包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的LCDR1，包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的LCDR2，和包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的LCDR3；
(2)包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的LCDR1，包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的LCDR2，和包含如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的LCDR3；或
(3)包含如SEQ ID NO:16或19所示的氨基酸序列的LCDR1，包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的LCDR2，和包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，本发明提供了结合狂犬病毒的抗体或其抗原结合片段，其包含如下表1中任一组合所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3:
表1
在一些实施方案中，本发明提供了结合狂犬病毒的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区VH和/或轻链可变区VL，其中，
(a)重链可变区VH
(i)包含与选自SEQ ID NO:20-24中任一项所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；或者
(ii)包含选自SEQ ID NO:20-24中任一项所示的氨基酸序列或由其组成；或者
(iii)包含与选自SEQ ID NO:20-24中任一项所示的氨基酸序列相比具有1-15氨基酸的添加，取代或缺失或其任意组合(例如1个，2个或3个的氨基酸的添加，取代或缺失或其任意组合)的氨基酸序列；
和/或
(b)轻链可变区VL
(i)包含与选自SEQ ID NO:25-28中任一项所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(ii)包含选自SEQ ID NO:25-28中任一项所示的氨基酸序列或由其组成；或者
(iii)包含与选自SEQ ID NO:25-28中任一项所示的氨基酸序列相比具有1-15氨基酸的添加，取代或缺失或其任意组合(例如1个，2个或3个的氨基酸的添加，取代或缺失或其任意组合)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了结合狂犬病毒的抗体或其抗原结合片段，其包含如下表2中任一组合所示的重链可变区VH和轻链可变区VL:
表2
在一些实施方案中，本发明提供了抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段，其包含重链和/或轻链，其中
(a)重链
(i)包含与选自SEQ ID NO:29-33中任一项的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(ii)包含选自SEQ ID NO:29-33中任一项的的氨基酸序列或由其组成；或者
(iii)包含与选自SEQ ID NO:29-33中任一项的的氨基酸序列相比具有1-20个氨基酸的添加，取代或缺失或其任意组合(例如1个，2个或3个的氨基酸的添加，取代或缺失或其任意组合)的氨基酸序列；
和/或
(b)轻链
(i)包含与选自SEQ ID NO:34-37中任一项的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(ii)包含选自SEQ ID NO:34-37中任一项的氨基酸序列或由其组成；或者
(iii)包含与选自SEQ ID NO:34-37中任一项的氨基酸序列相比具有1-20个氨基酸的添加，取代或缺失或其任意组合(例如1个，2个或3个的氨基酸的添加，取代或缺失或其任意组合)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的结合狂犬病毒的抗体或其抗原结合片段，其包含如下表3中任一组合所示的重链(HC)和轻链(LC):
表3
在一些实施方案中，本发明的抗体是单克隆抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗体是鼠源抗体、嵌合抗体、或人源化抗体或全人抗体。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体是全人抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗原结合片段包括以下的抗体片段：Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、Fd、单链抗体(例如scFv)或(Fab’)2、单结构域抗体、双体抗体diabody(dAb)或线性抗体。
在一些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段是IgG亚型，其中所述IgG亚型可以是任何IgG亚型，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，优选为IgG1亚型。
第二方面，本发明提供了一种分离的抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段，其具有以下特性中的一种或多种：
(1)与本发明的任何一种抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段结合相同或者完全或部分重叠的人狂犬病毒G蛋白的表位；
(2)与本发明的任何一种抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段竞争结合人狂犬病毒G蛋白的表位；
(3)显示与本发明抗体对狂犬病毒相同或相似的结合亲和力和/或特异性；
(4)具有本发明抗体的一个或多个生物学特性。
在一些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段，其具有以下特性中的一种或多种：
(1)与狂犬病毒的已知表位结合，例如，I表位，II表位，III表位，IV表位，G5表位，和/或minorA表位，并且所结合表位具有不低于60％的表位保守率、不低于65％的表位保守率、不低于70％的表位保守率、不低于75％的表位保守率、不低于80％的表位保守率、不低于82％的表位保守率、不低于85％的表位保守率、不低于88％的表位保守率、不低于90％的表位保守率、不低于91％的表位保守率、不低于92％的表位保守率、不低于93％的表位保守率、不低于94％的表位保守率、不低于95％的表位保守率、不低于96％的表位保守率、不低于97％的表位保守率、不低于98％的表位保守率、不低于99％的表位保守率，如通过充分的中和广谱性评估所测定的。
(2)与狂犬病毒的未知表位结合，并且所结合表位具有不低于60％的表位保守率、不低于65％的表位保守率、不低于70％的表位保守率、不低于75％的表位保守率、不低于80％的表位保守率、不低于82％的表位保守率、不低于85％的表位保守率、不低于88％的表位保守率、不低于90％的表位保守率、不低于91％的表位保守率、不低于92％的表位保守率、不低于93％的表位保守率、不低于94％的表位保守率、不低于95％的表位保守率、不低于96％的表位保守率、不低于97％的表位保守率、不低于98％的表位保守率、不低于99％的表位保守率，如通过充分的中和广谱性评估所测定的。
(3)有效中和狂犬病毒，例如，表现出不高于100ng/mL的IC50值、不高于70ng/mL的IC50值、不高于50ng/mL的IC50值、不高于20ng/mL的IC50值、不高于10ng/mL的IC50值、不高于9.5ng/mL的IC50值、不高于9.0ng/mL的IC50值、不高于8.5ng/mL的IC50值、不高于8.0ng/mL的IC50值、不高于7.5ng/mL的IC50值、不高于7.0ng/mL的IC50值、不高于6.5ng/mL的IC50值、不高于6.0ng/mL的IC50值、不高于5.5ng/mL的IC50值、不高于5.0ng/mL的IC50值、不高于4.5ng/mL的IC50值、不高于4.0ng/mL的IC50值、不高于3.5ng/mL的IC50值、不高于3.0ng/mL的IC50值、不高于2.5ng/mL的IC50值、不高于2.0ng/mL的IC50值、不高于1.8ng/mL的IC50值、不高于1.6ng/mL的IC50值、不高于1.5ng/mL的IC50值、不高于1.4ng/mL的IC50值、不高于1.3ng/mL的IC50值、不高于1.2ng/mL的IC50值、不高于1.1ng/mL的IC50值、不高于1.0ng/mL的IC50值、不高于0.8ng/mL的IC50值、不高于0.6ng/mL的IC50值、不高于0.4ng/mL的IC50值、不高于0.2ng/mL的IC50值、或更低的IC50值。
(4)有效中和狂犬病毒属中狂犬病毒之外的其他病毒，例如，至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种或更多。
在第二个方面，本发明提供了抗体组合，其包含不同的至少两种本发明所述的抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，所述不同体现为至少一个对应位置的CDR结构域的序列不同，例如，至少两种本发明所述的抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段的HCDR1的序列不同，HCDR2的序列不同，HCDR3的序列不同，LCDR1的序列不同，LCDR2的序列不同，和/或LCDR3的序列不同。在一个实施方案中，所述不同体现为至少所有对应的CDR结构域的序列都不同，例如，至少两种本发明所述的抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段的HCDR1的序列不同，HCDR2的序列不同，HCDR3的序列不同，LCDR1的序列不同，LCDR2的序列不同，并且LCDR3的序列不同。
在一些实施方案中，所述抗体组合包含作为第一抗体的根据本发明所述的抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段，以及作为第二抗体的根据本发明所述的抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述第一抗体具有包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的HCDR1，包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的HCDR2，包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的HCDR3，包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的LCDR1，包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的LCDR2，和包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的LCDR3；所述第二抗体具有包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的HCDR1，包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的HCDR2，包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的HCDR3，包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的LCDR1，包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的LCDR2，和包含如SEQ IDNO:15所示的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，所述第一抗体具有包含如SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列的HCDR1，包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的HCDR2，包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的HCDR3，包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的LCDR1，包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的LCDR2，和包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的LCDR3；所述第二抗体具有包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的HCDR1，包含如SEQID NO:8所示的氨基酸序列的HCDR2，包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的HCDR3，包含如SEQ ID NO:16或19所示的氨基酸序列的LCDR1，包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的LCDR2，和包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，所述第一抗体具有包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的HCDR1，包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的HCDR2，包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的HCDR3，包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的LCDR1，包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的LCDR2，和包含如SEQ IDNO:15所示的氨基酸序列的LCDR3；所述第二抗体具有包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的HCDR1，包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的HCDR2，包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的HCDR3，包含如SEQ ID NO:16或19所示的氨基酸序列的LCDR1，包含如SEQ IDNO:17所示的氨基酸序列的LCDR2，和包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中，所述抗体组合包含多于两种不同的本发明所述的抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段。在一些具体的实施方案中，所述抗体组合进一步包含作为第三抗体的根据本发明所述的抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段，其中第一抗体、第二抗体和第三抗体在至少一个对应位置的CDR结构域的序列不同。
第三方面，本发明提供了多核苷酸分子，其编码本文所述的抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段的任一条链。
第四方面，本发明提供了表达载体，其包含本文所述的多核苷酸分子，优选地，所述载体为真核表达载体。
第五方面，本发明提供了宿主细胞，其包含本文所述的多核苷酸分子或本文所述的表达载体，优选地，所述宿主细胞是真核细胞，更优选哺乳动物细胞。
第六方面，本发明提供了制备本文所述的抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在适合于所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下在本文所述的宿主细胞中表达所述抗体或其抗原结合片段，并任选地从所述宿主细胞回收所表达的抗体或其抗原结合片段。
第七方面，本发明提供了药物组合物，其包含本文所述的抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段，或抗体组合，以及任选地药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。在一个实施方案中，所述药物组合物进一步包含其他治疗剂、被动免疫剂或疫苗。
第八方面，本发明提供了一种预防和/或治疗受试者发生狂犬病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段、抗体组合、或药物组合物。在一个实施方案中，进一步向所述受试者联合施用一种或多种其它治疗剂、被动免疫剂或疫苗。
进一步的，本发明提供了一种预防和/或治疗受试者发生狂犬病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段、抗体组合、或药物组合物。在一个实施方案中，进一步向所述受试者联合施用一种或多种其它治疗剂、被动免疫剂或疫苗。
进一步的，本发明提供了一种预防受试者发生狂犬病的方法，其中所述受试者已经暴露于狂犬病毒属病毒，优选地已经处于被狂犬病毒属病毒感染和进展为狂犬病发病的风险中，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段、抗体组合、或药物组合物。在一个实施方案中，进一步向所述受试者联合施用一种或多种其它治疗剂、被动免疫剂或疫苗。
第九方面，本发明提供了本文所述的抗体或其抗原结合片段、本文所述的抗体组合、或本文所述的药物组合物在制备治疗剂或被动免疫剂中的用途，所述治疗剂或被动免疫剂用于在受试者中预防和/或治疗狂犬病毒属病毒感染，或预防受试者发生狂犬病。在一些实施方案中，所述受试者已经暴露于狂犬病毒属病毒，并且已经处于被狂犬病毒属病毒感染和进展为狂犬病发病的风险中。
第十方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含本文所述的抗体或其抗原结合片段、本文所述的抗体组合或本文所述的药物组合物，优选其进一步包括给药装置。
第十一方面，本发明提供了一种使用本文所述的抗体或其抗原结合片段或含有所述抗体或其抗原结合片段的检测组合物检测狂犬病毒在样品中的存在的方法，其中任选地所述抗体或其抗原结合片段是经过标记的。因而，本发明提供了一种检测样品中狂犬病毒的方法，所述方法包括使用本发明的抗体或其抗原结合片段或抗体组合的步骤，任选地所述抗体或抗体组合是经过标记的，优选地所述方法包括使所述抗体或其抗原结合片段或所述抗体组合与所述样品接触的步骤。
本发明的方案至少具备如下有益效果：
本发明方案包括大量的狂犬病毒G蛋白定点突变，并包装各种自然流行病毒株，其全面性超过任何已有平台，同时与活病毒中和试验具有良好的一致性，因此在狂犬病毒单抗表位和中和广谱性研究中具有显著的优势。因此，本发明提供了对于全球(尤其是中国境内)狂犬病毒流行株具有最大中和能力的抗体和抗体组合。
附图说明
图1所示为本发明的人源化狂犬单抗的中和活性检测。
图2所示为RABV G蛋白抗原表位分布。
图3所示为我国2010年后分离的狂犬病毒株G蛋白进化树分析。
图4所示为狂犬病毒属病毒进化分析。
图5所示为本发明的单抗和组合抗体对CVS-N2c假病毒的中和活性柱状图。
图6所示为本发明的单抗和组合抗体对CVS-N2c假病毒的中和活性折线图。
图7所示为本发明的单抗和组合抗体对表位I单位点突变株的中和效果。
图8所示为本发明的单抗和组合抗体对表位IIa单位点突变株的中和效果。
图9所示为本发明的单抗和组合抗体对表位IIb单位点突变株的中和效果。
图10所示为本发明的单抗和组合抗体对表位III单位点突变株的中和效果。
图11所示为本发明的单抗和组合抗体对表位Ⅳ&G5单位点突变株的中和效果。
图12所示为本发明的单抗和组合抗体对表位minor a单位点突变株的中和效果。
图13所示为本发明的单抗和组合抗体对已知表位外的单位点突变株的中和效果。
图14所示为本发明的单抗和组合抗体对挑战株的中和效果。
图15所示为本发明的单抗和组合抗体对挑战株的中和热图。
图16所示为本发明的单抗和组合抗体对表位内单位点突变株的中和热图。
图17单抗和组合抗体对表位外单位点突变株的中和热图。
图18单抗和组合抗体对国内狂犬代表株的中和效果。
图19单抗和组合抗体对国外狂犬代表株的中和效果。
图20所示为本发明的单抗和组合抗体对国内外狂犬代表株的中和热图。
图21所示为本发明的单抗和组合抗体对除狂犬病毒外其他狂犬病毒属病毒的中和活性。
图22所示为本发明的单抗和组合抗体对除狂犬病毒外其他狂犬病毒属病毒的中和热图。
图23所示为本发明的6株人源化单抗介导对表达狂犬病毒G蛋白的CHO细胞的ADCC作用(小图A)和CDC作用(小图B)。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请进行进一步的介绍。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。不同实施例之间可以替换或者合并组合，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些实施例获得其他的实施方式。
除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。
为了可以更容易地理解本发明，某些科技术语具体定义如下。除非本文其它部分另有明确定义，否则本文所用的科技术语或表述都具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。关于本领域的定义及术语，专业人员至少部分地可以具体参考CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写遵循本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
I.定义
在下文详细描述本发明前，应理解本发明不限于本文中描述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案，而并不意图限制本发明的范围，其仅会由所附权利要求书限制。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中普通技术人员通常的理解具有相同的含义。
为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小10％的下限和比指定数字数值大10％的上限的范围内的数字数值。
如本文所用，术语“和/或”意指可选项中的任一项或可选项的两项或多项。
如本文所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组合的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。
术语“狂犬病病毒(Rabies virus，缩写RABV)”，一般称为“狂犬病毒”，是一种RNA病毒，属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)，狂犬病毒属(Lyssavirus)，是绝大多数狂犬病的致病因子。狂犬病毒为嗜神经病毒，可感染神经系统。其具有囊膜，与包膜基质蛋白M组成结构蛋白外壳。囊膜内的核心部分是病毒的核衣壳，由单股不分节段的负链RNA及核蛋白N、磷蛋白P以及聚合酶L共同构成。糖蛋白G(G蛋白)是同源三聚体跨膜糖蛋白，在RABV外壳上形成刺突，其含有可被宿主细胞识别的结构域，同时与RABV的嗜神经性和致病性相关。人暴露于狂犬病毒主要是被染病动物或患病者抓伤或咬伤，从而牙齿或爪尖上可能沾染有带病毒的唾液进入皮肤屏障内，侵犯人体组织。一般而言，从暴露到狂犬病发病的时间间隔取决于病毒沿着周围神经进犯到中枢神经系统的距离。病毒进入人体后首先侵染肌细胞或者皮肤细胞，并在其中渡过潜伏期，而后通过肌细胞、皮肤细胞和神经细胞之间的乙酰胆碱受体进入神经细胞，沿神经细胞的轴突缓慢上行，上行到脊髓，进而入脑，并不沿血液扩散。病毒在脑内感染海马区、小脑、脑干乃至整个中枢神经系统，并在灰质大量复制，随后沿周围神经下行到达唾液腺、角膜、鼻黏膜、肺、皮肤等部位。病毒对宿主主要的损害来自内基小体(Negri bodies)，即为其废弃的蛋白质外壳在细胞内聚集形成的嗜酸性颗粒，其广泛分布在患者的中枢神经细胞中，可作为诊断指标。
术语“狂犬病(rabies)”是一种由狂犬病毒属病毒(狂犬病相关病毒)引起的人畜共患病，可于恒温动物身上造成严重脑炎，一旦发病，即当病毒迁移并侵犯到中枢神经系统、出现神经症状后，死亡率几乎为100％。绝大多数狂犬病由狂犬病病毒引起，仅有极其少数(例如，小于100例)由狂犬病毒属其他病毒引起，发病机制与狂犬病毒基本相同，因此可采用同样的原则来进行暴露后预防。
暴露后预防(Post-exposure Prophylaxis，PEP)是指是指在暴露于某种病原体(如某种病毒)后在一定时间内进行预防性治疗以防止由该病原体引起的感染或者疾病。此时病原体虽然已经侵入人体内，但尚处在潜伏期内，或由于尚未大量复制或尚未到达致病部位/组织而未给机体带来实质性的病理改变，因此通过主动免疫激发免疫系统或提供被动免疫措施(例如特异性抗体或特异性T细胞)，或通过提供非特异性/特异性药剂，在此机会期内实质性抑制或杀灭病原体，从而避免/基本避免病理改变的出现。如无特别说明，在本文中提及“预防”和“治疗”时，均包括了暴露后预防，例如，在本文中提及预防狂犬病或治疗狂犬病时，均包括了对狂犬病毒的暴露后预防；例如，在本文中提及预防狂犬病毒感染或治疗狂犬病毒感染时，均包括了对狂犬病毒的暴露后预防。
本文所用的术语“抗狂犬病毒抗体”、“抗狂犬病毒”、“狂犬病毒抗体”、“狂犬抗体”或“结合狂犬病毒的抗体”是指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲合力结合狂犬病毒。在优选的实施方案中，抗狂犬病毒抗体与狂犬病毒G蛋白结合。
术语“抗体片段”包括完整抗体的一部分。在优选的实施方案中，抗体片段为抗原结合片段。
术语“抗原结合片段”是比完整或完全抗体的氨基酸残基数要少的完整或完全抗体的一部分或一段，其能结合抗原或与完整抗体(即与抗原结合片段所来源的完整抗体)竞争结合抗原。可以通过重组DNA技术、或通过酶或化学切割完整的抗体制备抗原结合片段。抗原结合片段包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链Fv、双体抗体(diabody)、单结构域抗体(sdAb)。所述Fab片段是一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段，例如，通过木瓜蛋白酶消化完全抗体能够获得Fab片段。此外，通过胃蛋白酶在铰链区的二硫键下面消化完全抗体产生F(ab')2，其为Fab’的二聚体，是二价的抗体片段。F(ab')2可以在中性条件下通过破坏铰链区中的二硫键而被还原，由此将F(ab')2二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体基本上是具有铰链区的Fab片段(其它抗体片段的更详细的描述请参见：基础免疫学(Fundamental Immunology),W.E.Paul编辑,RavenPress,N.Y.(1993))。所述Fv片段由抗体单臂的VL和VH结构域组成。另外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由独立的基因编码，但是使用重组方法，可以将它们通过能够使这两个结构域作为单条蛋白链产生的合成性连接肽连接，在所述单条蛋白链中VL区和VH区配对以形成单链Fv(scFv)。可以通过化学方法、重组DNA方法或蛋白酶消化法获得所述抗体片段。
如本文所述定义的，与参照抗体“结合相同或重叠表位的抗体”是指这样的抗体，其在竞争测定中阻断50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的所述参照抗体与其抗原的结合，反言之，参照抗体在竞争测定中阻断50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的该抗体与其抗原的结合。
如本文所述定义的，与参照抗体竞争结合其抗原的抗体是指这样的抗体，其在竞争测定中阻断50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的所述参照抗体与其抗原的结合。反言之，参照抗体在竞争测定中阻断50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的该抗体与其抗原的结合。众多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗体是否与另一种竞争，这些测定例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定、生物光干涉测定法(例如Fortebio)或表面等离子共振(Biacore)等。
如本文所述定义的，抑制(例如竞争性抑制)参照抗体与其抗原的结合的抗体是指这样的抗体，其抑制50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的所述参照抗体与其抗原的结合。反言之，参照抗体抑制50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的该抗体与其抗原的结合。抗体与其抗原的结合可以亲和力(例如平衡解离常数)衡量。测定亲和力的方法是本领域已知的。
与参照抗体显示相同或相似的结合亲和力和/或特异性的抗体是指这样的抗体，其能够具有参照抗体的至少50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的结合亲和力和/或特异性。这可以通过本领域已知的任何测定结合亲和力和/或特异性的方法进行测定。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变区通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个互补决定区。
如本文所述定义的，“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的CDR被称作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR被称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中，各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体CDR指派系统的任一种或其组合确定，所述指派系统包括例如：基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342:877-883，Al-Lazikani等人,“Standardconformations for the canonical structures of immunoglobulins”,Journal ofMolecular Biology,273,927-948(1997))，基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4版,U.S.Department ofHealth and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(Universityof Bath)，Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(在万维网上imgt.cines.fr/上)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinitypropagation clustering)的North CDR定义。
例如，根据不同的CDR确定方案，每一个CDR的残基如下所述。
以下为采用kabat、AbM、Chothia、Contact和IMGT方案定义的CDR的区域范围。
除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。CDR也可以基于与参考CDR序列(例如本发明示例性CDR之任一)具有相同的Kabat编号位置而确定。除非另有说明，否则在本发明中，当提及抗体可变区中的残基位置(包括重链可变区残基和轻链可变区残基)时，是指根据Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中的Kabat编号系统的编号位置。
CDR也可以基于与参考CDR序列(例如本发明示例性CDR之任一)具有相同的Kabat编号位置而确定。
应该注意，基于不同的指派方案获得的同一抗体的可变区的CDR的边界可能有所差异。即不同指派方案下定义的同一抗体可变区的CDR序列有所不同。因此，在涉及用本发明定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体CDR序列，但是由于应用了不同的方案(例如不同的指派方案规则或组合)而导致其所声称的CDR边界与本发明所定义的具体CDR边界不同。
除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。在一个优选的实施方案中，本发明抗体中的HCDR和LCDR分别按照Kabat方案确定。
术语“Fc结构域”或“Fc区”在本文中用来定义免疫球蛋白重链的含有至少一部分恒定区的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。天然的免疫球蛋白“Fc结构域”或“Fc区”包含两个或三个恒定结构域，即CH2结构域、CH3结构域和可选的CH4结构域。例如，在天然抗体中，免疫球蛋白Fc结构域包含源自IgG、IgA和IgD类抗体的重链的第二和第三恒定结构域(CH2结构域和CH3结构域)；或者包含源自IgM和IgE类抗体的两条重链的第二、第三和第四恒定结构域(CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域)。除非本文中另外说明，否则Fc区或重链恒定区中的氨基酸残基编号根据如Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interes,第5版,Public Health Service,National InstitutesofHealth,Bethesda,MD,1991中所述的EU编号体系(也称作EU索引)进行编号。在本文中，术语“Fc区”、“Fc部分”和“Fc片段”不包括免疫球蛋白的重链可变区VH和轻链可变区VL以及重链恒定区CH1和轻链恒定区CL，但在一些情况下可以包括在重链恒定区N端的铰链区。“IgG形式的抗体”是指抗体的重链恒定区所属的IgG形式。所有同一型的抗体的重链恒定区都是相同的，不同型的抗体之间的重链恒定区不同。例如，IgG4形式的抗体是指其重链恒定区来自IgG4，或者IgG1形式的抗体是指其重链恒定区来自IgG1。
免疫球蛋白的“效应子功能”的例子包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)、Fc受体结合作用、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞摄取抗原、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)和B细胞活化。在本发明的一个实施方案中，本发明的狂犬病毒抗体表现出显著的效应子功能，例如，CDC和/或ADCC.
术语“嵌合抗体”是这样的抗体分子，其中(a)将恒定区或其部分改变、替换或交换，从而抗原结合位点与不同的或改变的类别、效应子功能和/或物种的恒定区或赋予嵌合抗体新性能的完全不同的分子(例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物)等连接；或(b)将可变区或其部分用具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、替换或交换。例如，小鼠抗体可以通过将其恒定区更换为来自人免疫球蛋白的恒定区进行修饰。由于更换为人类恒定区，该嵌合抗体可以保留其在识别抗原方面的特异性，同时如与原始小鼠抗体相比，具有在人类中降低的免疫原性。
“人源化抗体”是一种保留非人类抗体(例如小鼠单克隆抗体)的抗原特异性反应性，同时作为治疗药对人施用时免疫原性较低的抗体。这可以例如通过保留非人类抗原结合位点并将抗体的剩余部分替换成它们的人类相应部分(即，将恒定区以及可变区中不参与结合的部分替换为人类抗体的相应部分)来实现。
如本文所用，术语“抗”、“结合”或“特异性结合”意指结合作用对靶标或抗原是选择性的并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。结合位点与特定靶标或抗原结合的能力可以通过流式细胞术或酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域已知的常规结合测定法如通过放射性免疫测定(RIA)或生物膜薄层干涉测定法或MSD测定法或表面等离子体共振法(SPR)测定。
术语“抗体组合”是指两种或更多种抗体(例如，抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段，例如，本发明的抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段)的联合，其中，由于不同抗体的结合表位的差异和互补性，这种联合使得所述抗体组合的中和广谱性超过了抗体组合中任意一种成员抗体的中和广谱性。在任一情况下，抗体组合将比单独一种抗体提供更高的暴露后预防的成功几率。
氨基酸序列的“同一性百分数(％)”是指将候选序列与本说明书中所示的具体氨基酸序列进行比对并且如有必要的话为达到最大序列同一性百分数而引入空位后，并且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分时，候选序列中与本说明书中所示的具体氨基酸序列的氨基酸残基相同的氨基酸残基百分数。在一些实施方案中，本发明考虑本发明抗体分子的变体，所述变体相对于在本文中具体公开的抗体分子及其序列而言具有相当程度的同一性，例如同一性为至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％或更高。所述变体可以包含保守性改变，或为保守性修饰变体。
术语“宿主细胞”指已经向其中引入外源多核苷酸的细胞，包括这类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，这包括原代转化的细胞和从其衍生的子代。宿主细胞是可以用来产生本发明抗体分子的任何类型的细胞系统，包括真核细胞，例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞；和原核细胞，例如，大肠杆菌细胞。宿主细胞包括培养的细胞，也包括转基因动物、转基因植物或培养的植物组织或动物组织内部的细胞。
术语“载体”当在本文中使用时是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，其包含有效连接要表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中。表达载体包括本领域已知的所有那些，包括被掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
RFFIT被认为是一种可靠的重复性好的检测抗狂犬病毒中和抗体中和狂犬病病毒有效性(即，抑制其感染细胞的能力)的一种标准试验，其利用荧光标记的抗体测试小鼠成神经细胞的狂犬病病毒感染。RFFIT是目前为WHO、OIE以及欧洲药典推荐的检测方法，也是中国药典推荐的方法。该试验一般使用固定病毒(CVS11)进行，但也可使用从感染动物分离到的毒株。其步骤一般包括：将正常含量的病毒加入到有或没有中和抗体稀释剂的单层BHK-21或BSR细胞培养物中，并继续培养该单层，然后使用荧光标记的狂犬病核蛋白单克隆抗体检测被感染的细胞荧光灶(foci)。使用荧光显微镜显示和计数荧光灶。
另一种体外感染/中和测定的可靠方式是使用狂犬病假病毒，后者是利用由缺乏天然糖蛋白而通过工程化以包含全长的膜结合的狂犬病毒G蛋白的慢病毒产生的狂犬病毒假型病毒颗粒(RABVpp)。RABVpp一般通过共转染狂犬G蛋白和携带萤光素酶基因的慢病毒骨架产生。RABVpp特异性感染细胞系，如幼仓鼠肾细胞(BHK)或293细胞，并可由针对狂犬病G蛋白的抗体中和。当RABVpp感染细胞时，其递送可以测量其表达(光)的萤光素酶基因。狂犬病假病毒检测法在分光光度计输出时定量更多，比需要活狂犬病病毒的RFFIT检测更安全。该测定还具有以下优点：可评估来自任何目的病毒的G蛋白(例如，狂犬病毒属的任何天然的或突变的或经修饰的病毒的G蛋白)，因为一些天然狂犬病分离物难以适应RFFIT测定的细胞培养而很难通过RFFIT评估。此外，相比于活病毒，假病毒系统还具有高通量、单轮感染安全性好等优势。
术语“药物组合物”指这样的组合物，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
术语“治疗”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转疾病的症状、并发症、或生化征的发作、缓解症状或阻止或抑制疾病、病状或病症的进一步发展。在本发明中，当上下文无特别说明时，治疗包括暴露后预防。
术语“预防”包括对疾病或病症或特定疾病或病症的症状的发生或发展的抑制。在本发明中，当上下文无特别说明时，预防意指对狂犬病发病的有效防止，并且包括暴露后预防。
术语“有效量”指本发明的抗体或片段或组合物或组合的这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在需要治疗或预防的患者中产生预期效果。“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。优选地，治疗有效量是指其中的抗体或抗体片段或组合物或组合的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。“预防有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需预防结果的量。
“受试者/患者/个体样品”指从患者或受试者得到的细胞或流体的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如泪液、玻璃体液、脑脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或间隙液；来自受试者的妊娠或发育任何时间的细胞。在一些实施方案中，组织样品是肿瘤组织。组织样品可能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、等等。
II.抗体
在一些实施方案中，本发明的抗狂犬病毒抗体或其片段以高亲和力结合狂犬病毒(例如人狂犬病毒G蛋白)并将其有效中和，例如，表现出不高于100ng/mL的IC50值、不高于70ng/mL的IC50值、不高于50ng/mL的IC50值、不高于20ng/mL的IC50值、不高于10ng/mL的IC50值、不高于9.5ng/mL的IC50值、不高于9.0ng/mL的IC50值、不高于8.5ng/mL的IC50值、不高于8.0ng/mL的IC50值、不高于7.5ng/mL的IC50值、不高于7.0ng/mL的IC50值、不高于6.5ng/mL的IC50值、不高于6.0ng/mL的IC50值、不高于5.5ng/mL的IC50值、不高于5.0ng/mL的IC50值、不高于4.5ng/mL的IC50值、不高于4.0ng/mL的IC50值、不高于3.5ng/mL的IC50值、不高于3.0ng/mL的IC50值、不高于2.5ng/mL的IC50值、不高于2.0ng/mL的IC50值、不高于1.8ng/mL的IC50值、不高于1.6ng/mL的IC50值、不高于1.5ng/mL的IC50值、不高于1.4ng/mL的IC50值、不高于1.3ng/mL的IC50值、不高于1.2ng/mL的IC50值、不高于1.1ng/mL的IC50值、不高于1.0ng/mL的IC50值、不高于0.8ng/mL的IC50值、不高于0.6ng/mL的IC50值、不高于0.4ng/mL的IC50值、不高于0.2ng/mL的IC50值、或更低的IC50值。
在一些实施方案中，本发明的抗狂犬病毒抗体或其片段与狂犬病毒的已知表位结合，例如，I表位，II表位，III表位，IV表位，G5表位，和/或minorA表位，或与狂犬病毒的未知表位结合，并且所结合表位具有不低于60％的表位保守率、不低于65％的表位保守率、不低于70％的表位保守率、不低于75％的表位保守率、不低于80％的表位保守率、不低于82％的表位保守率、不低于85％的表位保守率、不低于88％的表位保守率、不低于90％的表位保守率、不低于91％的表位保守率、不低于92％的表位保守率、不低于93％的表位保守率、不低于94％的表位保守率、不低于95％的表位保守率、不低于96％的表位保守率、不低于97％的表位保守率、不低于98％的表位保守率、不低于99％的表位保守率，如通过充分的中和广谱性评估所测定的。
在一些实施方案中，本发明的抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段包含3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些实施方案中，本发明的抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段包含3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，本发明的抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段包含3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR)和3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR)。
在一些方面中，本发明的抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)。在一些方面中，本发明的抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VL)。在一些方面中，本发明的抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，所述重链可变区包含3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些实施方案中，所述轻链可变区包含3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，本发明的抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段还包含抗体重链恒定区。在一些实施方案中，本发明抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段还包含抗体轻链恒定区。在一些实施方案中，本发明抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段还包含重链恒定区和轻链恒定区。
在一些实施方案中，本发明的抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段包含抗体重链(HC)。在一些实施方案中，本发明抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段还包含抗体轻链(LC)。在一些实施方案中，本发明抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段包含氨基酸改变，所述氨基酸改变包括氨基酸的置换、插入或缺失。优选的，本文所述的氨基酸改变为氨基酸置换，优选地保守置换。
在优选的实施方案中，本发明所述的氨基酸改变发生在CDR外的区域(例如在FR中)。更优选地，本发明所述的氨基酸改变发生在重链可变区外和/或轻链可变区外的区域。
对于多肽序列，“保守性改变”包括对多肽序列的置换、缺失或添加，但不实质性改变多肽序列的期望功能活性。例如，保守性置换常常导致某个氨基酸置换为化学上相似的氨基酸。提供功能上相似氨基酸的保守性置换表是本领域熟知的。以下列出了8组含有互为保守替换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)。在一些实施方案中，术语“保守序列改变”用于指不显著影响或改变含有氨基酸序列的本发明抗体分子或结合蛋白分子的目的抗原结合特征的氨基酸修饰。例如保守修改变体相对于亲本抗体或结合蛋白保持对目的抗原至少80％,85％,90％,95％,98％,99％或更高，例如100-110％或更高的结合亲和力。
在某些实施方案中，置换发生在抗体的CDR区。通常，获得的变体相对于亲本抗体在某些生物学特性方面(例如，增加的亲和力)具有修饰(例如，改善)和/或将具有亲本抗体的基本上保留的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟抗体。
在某些实施方案中，可在本文中所提供抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，以此产生Fc区变体，以便增强例如抗体的亲和力或治疗疾病的有效性。Fc区变体可包括在一或多个氨基酸位置处包含氨基酸改变(例如置换)的人Fc区序列(例如人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。
在某些实施方案中，可能需要产生经半胱氨酸工程改造的抗体，例如“硫代MAb”，其中抗体的一或多个残基经半胱氨酸残基置换。
在某些实施方案中，本文中所提供的抗体可进一步经修饰为含有本领域中已知且轻易获得的其他非蛋白质部分。适合抗体衍生作用的部分包括，但不限于，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二烷、聚-1,3,6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。
在一些实施方案中，本发明的抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段还包括具有以下一个或多个特性的抗体或抗原结合片段：
(i)显示与本发明抗体对狂犬病毒相同或相似的结合亲和力和/或特异性；
(ii)抑制(例如，竞争性抑制)本发明抗体与狂犬病毒的结合；
(iii)与本发明抗体结合相同或重叠的表位；
(iv)与本发明抗体竞争结合狂犬病毒；
(v)具有本发明抗体的一个或多个生物学特性。
在一些实施方案中，本发明的抗狂犬病毒抗体是IgG1形式的抗体或IgG2形式的抗体或IgG3形式的抗体或IgG4形式的抗体。
在一些实施方案中，抗狂犬病毒抗体是单克隆抗体。
在一些实施方案中，抗狂犬病毒抗体是人源化抗体。
在一些实施方案中，抗狂犬病毒抗体是嵌合抗体。
在一个实施方案中，本发明的抗狂犬病毒抗体还涵盖其抗体片段，优选地抗原结合片段，优选地选自以下的抗体片段：Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、单链抗体(例如scFv)、(Fab’)2、单结构域抗体例如VHH、dAb(domain antibody)或线性抗体。
III.本发明的核酸以及包含其的宿主细胞
在一方面，本发明提供了编码以上任何抗狂犬病毒抗体或其片段的核酸。在一个实施方案中，提供包含所述核酸的载体。在一个实施方案中，载体是表达载体。在一个实施方案中，提供包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如CHO细胞或293细胞)或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是原核的。
在一方面，本发明提供了编码本文所述任何抗狂犬病毒抗体或其片段的核酸。所述核酸可以包含编码抗体的轻链可变区和/或重链可变区的氨基酸序列的核酸，或包含编码抗体的轻链和/或重链的氨基酸序列的核酸。
例如，本发明的核酸包含编码选自SEQ ID NO:1-28中任一项所示氨基酸序列的核酸，或编码与选自SEQ ID NO:1-28中任一项所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸。
如本领域技术人员明了的，因为密码子简并性，每一个抗体或多肽氨基酸序列可以由多种核酸序列编码。编码本发明分子的核酸序列可以采用本领域熟知的方法，例如通过从头固相DNA合成，或通过核酸扩增而产生。
在一方面，本发明提供编码以上任何抗体或任何抗体链的核酸。当从适宜的表达载体表达时，由所述核酸编码的多肽能够显示结合狂犬病毒(例如人狂犬病毒，例如人狂犬病毒胞外结构域)的能力。在一个实施方案中，编码本发明抗体的各条链的核酸可以在相同的载体中或在不同的载体中。在再一实施方案中，编码本发明抗体的各条链的核酸可以引入相同或不同的宿主细胞以表达。因此，在一些实施方案中，本发明的抗体的生产方法包括步骤：在适于表达所述分子的各条链的条件下，培养包含编码所述各条链的核酸的宿主细胞，产生本发明的抗体。
在一个实施方案中，提供包含所述核酸的一个或多个载体。在一个实施方案中，载体是表达载体，例如真核表达载体。载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。在一些实施方案中，载体是pcDNA载体。在一些实施方案中，载体是pcDNA3.1。在一些实施方案中，载体是pcDNATM3.4TOPO。
在一个实施方案中，提供包含所述核酸或载体的宿主细胞。用于克隆或表达编码抗体的核酸或载体的适当宿主细胞包括本文描述的原核或真核细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞例如CHO细胞(例如CHO-S，如ExpiCHO-S)或293细胞(例如293F或HEK293细胞))或适用于制备抗体或其片段的其它细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是原核的，例如是细菌，例如大肠杆菌。
例如，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是关于编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主。例如，糖基化途径已经进行“人源化”的真菌和酵母菌株导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。适于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如，可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(HEK293、293F或293T细胞)等。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞、CHO-S细胞、ExpiCHO等；以及骨髓瘤细胞系如Y0，NS0和Sp2/0。本领域已知适合产生抗体的哺乳动物宿主细胞系。
IV.本发明的抗体分子的生产和纯化
在一个实施方案中，本发明提供制备抗狂犬病毒抗体或其片段(优选的抗原结合片段)的方法，其中所述方法包括在适于表达编码所述抗体或其片段(优选的抗原结合片段)的核酸的条件下培养所述宿主细胞，以及任选地分离所述抗体或其片段(优选地抗原结合片段)。在某个实施方案中，所述方法还包括从宿主细胞回收抗狂犬病毒抗体或其片段(优选地抗原结合片段)。
可以将编码本发明抗体的多肽链的多核苷酸插入一个或多个载体中以便进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建表达载体。一旦已经制备了用于表达的包含本发明的一种或多种核酸分子的表达载体，则可以将表达载体转染或引入适宜的宿主细胞中。多种技术可以用来实现这个目的，例如，原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒的转导、病毒转染、基因枪、基于脂质体的转染或其他常规技术。
如本文所述制备的抗体可以通过已知的现有技术如高效液相色谱、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、尺寸排阻层析等纯化。用来纯化特定蛋白质的实际条件还取决于净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且这些对本领域技术人员是显而易见的。
可以通过多种熟知分析方法中的任一种方法确定本发明的抗体分子的纯度，所述熟知分析方法包括尺寸排阻层析、凝胶电泳、高效液相色谱等。
V.测定法
可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的抗狂犬病毒抗体鉴定，筛选，或表征其物理/化学特性和/或生物学活性，例如，对于暴露后预防最重要的中和广谱性。
一方面，对本发明的抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如ELISA，Western印迹，等来进行。可使用本领域已知方法来测定对狂犬病毒的结合。在一些实施方案中，使用放射性免疫测定(RIA)或生物膜薄层干涉测定法(BLI)或电化学发光(ECL)或表面等离子体共振法(SPR)或流式细胞术(FACS)测量。本文中公开了优选的示例性方法，例如，RFFIT或通过假病毒库的测定。
另一方面，可使用竞争测定法来鉴定与本文中公开的任何抗狂犬病毒抗体竞争对狂犬病毒的结合的抗体。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合与本文中公开的任何抗狂犬病毒抗体所结合表位相同或重叠的表位(例如线性或构象表位)。
VI.药物组合物和药物制剂
在一些实施方案中，本发明提供包含本文所述的任何抗狂犬病毒抗体或其片段(优选地其抗原结合片段)或其组合或其编码核酸的组合物或药物或制剂，优选地组合物为药物组合物，优选地制剂为治疗剂或被动免疫剂。
本发明的所述组合物或药物或制剂还可以包含合适的药用辅料，如本领域中已知的药用载体、药用赋形剂、包括缓冲剂、稳定剂等。
如本文所用，“药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。
对于药用辅料的使用及其用途，亦参见“Handbook of PharmaceuticalExcipients”,第八版,R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。
本发明的组合物或药物或制剂可以处于多种形式。这些形式例如包括液体、半固体和固体剂型，如液态溶液剂(例如，注射液或滴眼液)、散剂或混悬剂、脂质体剂和栓剂。优选的形式取决于预期的施用模式和治疗用途。
可以通过将具有所需纯度的本发明的抗体与一种或多种任选的药用辅料混合来制备包含本文所述的抗体的药物制剂，优选地以冻干制剂或水溶液的形式。
本发明的药物组合物或制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应证所需的，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供其它治疗剂，例如疫苗、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂等。所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。
本发明的药物组合物或制剂可以通过任何合适的方法给药，包括肠胃外给药，肺内给药和鼻内给药，并且，如果局部治疗需要，暴露部位给药或伤患处给药。肠胃外注射或输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下注射或输注。可通过任何适合途径，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射用药。本文中涵盖各种用药时程，包括，但不限于，单次给药或在多个时间点多次给药、推注给药及脉冲输注。
VII.药物组合和药盒
在一些实施方案中，本发明还提供了药物组合或药物组合产品，其包含本发明的抗狂犬病毒抗体或其片段(优选地抗原结合片段)，或抗体组合或制剂或药物，以及一种或多种其它治疗剂(例如疫苗、其它抗体、小分子药物、被动免疫剂或免疫调节剂等)。
本发明的另一个目的是提供一种成套药盒，其包含本发明的抗体或抗体组合或制剂或药物，优选地所述药盒为药物剂量单元形式。由此可以依据给药方案或药物施用间隔提供剂量单元。
在一个实施方案中，本发明的成套药盒在同一包装内包含：
-含有包含抗狂犬病毒抗体或其片段或抗体组合的药物组合物的第一容器；
-含有包含其它治疗剂或被动免疫剂的药物组合物的第二容器。
在一些实施方案中，所述组合产品用于预防或治疗狂犬病毒相关疾病，例如狂犬病或狂犬病毒感染。
IX.用途和方法
本发明一方面提供了在受试者中预防或治疗疾病的方法，包括向受试者施用本发明的抗体或其抗原结合片段，或抗体组合、组合物或药物或制剂或组合产品或药盒。
在一些实施方案中，本发明提供了一种预防和/或治疗受试者发生狂犬病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段、抗体组合、或药物组合物。在一个实施方案中，进一步向所述受试者联合施用一种或多种其它治疗剂、被动免疫剂或疫苗。
在一些实施方案中，本发明提供了一种预防和/或治疗受试者发生狂犬病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段、抗体组合、或药物组合物。在一个实施方案中，进一步向所述受试者联合施用一种或多种其它治疗剂、被动免疫剂或疫苗。
在一些实施方案中，本发明提供了一种预防受试者发生狂犬病的方法，其中所述受试者已经暴露于狂犬病毒属病毒，优选地已经处于被狂犬病毒属病毒感染和进展为狂犬病发病的风险中，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段、抗体组合、或药物组合物。在一个实施方案中，进一步向所述受试者联合施用一种或多种其它治疗剂、被动免疫剂或疫苗。
本发明的抗体或其抗原结合片段(以及包含其的免疫缀合物、组合物、药物组合物、制剂、组合产品、药盒等)可以通过任何合适的方法给药，包括肠胃外给药，肺内给药和鼻内给药，并且，如果局部治疗需要，暴露部位给药或伤患处给药。肠胃外注射或输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下注射或输注。可通过任何适合途径，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射用药。本文中涵盖各种用药时程，包括，但不限于，单次给药或在多个时间点多次给药、推注给药及脉冲输注。
在又一个方面，本发明提供了本文所述的抗体或其抗原结合片段、本文所述的抗体组合、或本文所述的药物组合物在制备治疗剂或被动免疫剂中的用途，所述治疗剂或被动免疫剂用于在受试者中预防和/或治疗狂犬病毒属病毒感染，或预防受试者发生狂犬病。在一些实施方案中，所述受试者已经暴露于狂犬病毒属病毒，并且已经处于被狂犬病毒属病毒感染和进展为狂犬病发病的风险中。
在又一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含本文所述的抗体或其抗原结合片段、本文所述的抗体组合或本文所述的药物组合物，优选其进一步包括给药装置。
在一些实施方案中，狂犬病毒抗体或其抗原结合片段、或抗体组合还能与一种或多种其它疗法例如治疗方式和/或其它治疗剂组合施用，用于本文所述的用途，例如用于预防和/或治疗狂犬病或狂犬病毒感染。
在一些实施方案中，所述其他治疗剂例如疫苗、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂。
在一些实施方案中，本文中描述的抗体组合中的成员抗体同时施用。
X.用于诊断和检测的方法、试剂盒和组合物
在某些实施方案中，本文中提供的任何抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段可以用于检测狂犬病毒(特别是人狂犬病毒)在生物样品中的存在。
在一个方面，本发明提供了一种使用本文所述的抗体或其抗原结合片段或含有所述抗体或其抗原结合片段的检测组合物检测狂犬病毒在样品中的存在的方法，其中任选地所述抗体或其抗原结合片段是经过标记的。
术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测，示例性的检测方法可以涉及免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术(例如，FACS)、抗体分子复合的磁珠、ELISA测定法、PCR-技术(例如，RT-PCR)。在某些实施方案中，生物样品是血、血清或生物来源的其他液体样品。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织。
在一个实施方案中，提供用于诊断或检测方法的抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段或抗体组合。
在一个实施方案中，提供用于诊断或检测方法的组合物或试剂盒，其包含本文提供的抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段或抗体组合。
在另一个方面中，提供检测狂犬病毒在生物样品中的存在的方法。在某些实施方案中，方法包含检测狂犬病毒G蛋白在生物样品中的存在。在某些实施方案中，所述方法包括将生物样品与如本文所述的抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段或抗体组合在允许后者与狂犬病毒结合的条件下接触，并检测在抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段或抗体组合和狂犬病毒之间是否形成复合物。复合物的形成表示存在狂犬病毒。该方法可以是体外或体内方法。
在某些实施方案中，提供标记的抗狂犬病毒抗体或其抗原结合片段。标记包括但不限于，被直接检测的标记或部分(如荧光标记、发色团标记、电子致密标记、化学发光标记和放射性标记)，以及被间接检测的部分，如酶或配体，例如，通过酶促反应或分子相互作用。
在一些实施方案中，在治疗之前，例如，在起始治疗之前或在治疗间隔后的某次治疗之前检测狂犬病毒。
实施例
通过以下实施例对本发明进行说明，但并不旨在对本发明作出任何限制。本文已经详细描述了本发明，其中也公开了其具体实施方式。对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明精神和范围的情况下针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的。
除非另有明确指明，否则本发明的实施将采用本领域技术内的常规化学、生物化学、有机化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、遗传学、免疫学和细胞生物学的方法。
实施例1、抗狂犬病毒抗体的人源化
用人用狂犬疫苗免疫Balb/c小鼠，并取免疫后小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0进行融合，筛选获得杂交瘤克隆，并测定培养上清对狂犬病毒的中和活性。
取中和活性最强的RVAB-1，-4和-11三株抗体杂交瘤细胞，进行重轻链V区基因测序。随后，根据测序结果，选择与鼠源序列同源性最高的人源胚系序列作为受体框架，将鼠源序列的CDR移植至人源框架中，并根据序列位点重要性，设计回复突变，重链轻链分别拼接人IgG1重链恒定区(SEQ IDNO:38所示的氨基酸序列)和人Igκ轻链恒定区(SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列)，得到完整的人源化抗体。
对于RVAB-1，设计获得两条人源化重链可变区序列VH1和VH2，和一条人源化轻链可变区序列VL，分别拼接人IgG1重链恒定区和人Igκ轻链恒定区之后，组合得到两种人源化抗体RVAB-1H1K和RVAB-1H2K；对于RVAB-4，设计获得两条人源化重链可变区序列VH1和VH2，和一条人源化轻链可变区序列VL，拼接恒定区后组合得到两种人源化抗体RVAB-4H1K和RVAB-4H2K；对于RVAB-11，设计获得一条人源化重链可变区序列VH和两条人源化轻链可变区序列VL-kappa1和VL-kappa2，拼接恒定区后组合得到两种人源化抗体RVAB-11HK1和RVAB-11HK2。共六株人源化抗体。
六株人源化抗体各个结构域/肽链的氨基酸序列(SEQ ID NO:)如下表4所示：
表4本发明的人源化抗体各结构域/肽链氨基酸序列(SEQ ID NO:)
采用CVS毒株检测人源化单抗及其亲本鼠源单抗的中和活性，以评价人源化对活性的影响，结果如图1所示，相比于鼠源单抗，人源化对单抗中和活性的影响不大。特别是对于单抗RVAB-4，人源化后的2株单抗活性略微降低。我们挑选人源化后活性较强的克隆，即单抗RVAB-4H1K(代号：DPAF302018-1)、RVAB-11HK2(代号：DPAF302018-2)和RVAB-1H1K(代号：DPAF302018-3)，进行后续活性评价。
实施例2、人源化抗狂犬病毒抗体的制备和纯化
将编码实施例1中记载的人源化狂犬单抗的重链和轻链的基因序列分别克隆至pcDNA3.1表达载体上，经测序确认序列的正确性后，按照试剂盒说明书，对测序正确的重轻链编码质粒分别进行质粒提取(天根生化科技(北京)有限公司，DP118)，具体提取方法如下：
1)转化了相应质粒的菌过夜摇动培养，取5ml菌液，12000rpm离心1min，吸尽上清。
2)向菌体沉淀中加入500μl BufferP1(加入RNaseA)，充分震荡混匀，悬浮裂解细菌。
3)向离心管中加入500μl BufferP2，缓慢上下颠倒8～10次，室温静置2min。
4)向离心管中加入500μl BufferP4，立即上下颠倒混匀8～10次，出现白色絮状沉淀，室温静置10min。12000rpm离心10min，吸取上清，将上清转移至除内毒素的柱子中，12000rpm离心2min，收集滤液。
5)向滤液中加340μl异丙醇，上下颠倒混匀。
6)柱平衡：向吸附柱中加入500μl BufferBL，12000rpm离心1min，弃掉废液，将吸附柱重新放回收集管中。
7)将步骤5中的混合溶液转移到平衡好的吸附柱中。
8)12000rpm离心1min，弃掉废液，将吸附柱重新放回收集管中。
9)向吸附柱中加入600μl Buffer PW(已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃掉废液，重复该步骤一次。
10)将吸附柱重新放回收集管中，12000rpm离心1min，弃掉废液，将吸附柱置于室温干燥10min。
11)将吸附柱置于一个新的收集管中，向吸附膜的中间部位加入200μl已去除内毒素的水，室温放置3min后12000rpm离心3min，收集管中的溶液即为提取的质粒。
人源化狂犬单抗的瞬时表达：
将CHO-S细胞以0.3×106/ml密度进行传代，转染前一天将细胞稀释至3×106/ml，转染当天将细胞稀释至6×106/ml。转染前将所用质粒(分别编码人源化抗体重轻链的质粒)13000rpm离心10min，取出时动作轻柔。取六孔板，每孔加入920μl OptiPROTM SFM。分别加入重链和轻链质粒(1:1，各12μg)，混匀。稀释转染试剂，分别加入150μl PEI，混匀，静置5分钟。将稀释的转染试剂全部加入稀释的质粒中，混匀静置15分钟。将上述转染混合液加入25ml细胞中，逐滴缓慢加入，然后放入细胞培养箱中进行培养。
转染后第一天，补加2.5ml PFF05，75μl丁酸钠，50μl抗细胞结团剂。
转染后第三天，补加2.5ml PFF05，250μlCF-FMG。
转染后第六天，收样。将发酵液在50ml离心管中，8000rpm离心10min，将上清收集纯化。
抗体ProteinA纯化：
1)根据试剂盒说明书，准备1ml ProteinA填料柱(Thermo,89924)，PC再生，流速2ml/min上样5CV；
2)PA1平衡，流速2ml/min，上样5CV；
3)抗体发酵液，流速0.3ml/min，全部上样；
4)PA3洗涤，流速0.3ml/min，上样1CV，流速2ml/min，上样4CV；
5)PB洗脱，流速2ml/min，洗脱5CV，收集第2和第3ml；
6)20％乙醇，流速2ml/min，洗涤5CV，4℃保存。
7)在2ml抗体洗脱液中加入Tris-HCl，将pH调至7.0左右。
8)纯化后的抗体在紫外280nm下读取吸光度，计算蛋白浓度(通常为0.5mg/ml～5mg/ml，可用于后续过程)。
对本发明的人源化单抗进行功能评价和表征，以确定其应用价值。
实施例3、用于评价人源化抗体中和效力的假病毒库的设计和制备
通过对全球狂犬流行株序列收集和分析建立的包含狂犬病毒G蛋白上单个氨基酸突变和代表性流行株的狂犬假病毒库，可用于通过病毒中和试验评价本发明的人源化狂犬病毒单抗的表位区域、表位关键氨基酸、关键氨基酸的突变率/保守率、以及对狂犬病毒流行株的广谱中和效果，此外，还可用于对本发明多个单抗的不同组合形式的广谱中和效果进行评价。
所利用的狂犬假病毒库分为两个层面：(一)用于狂犬病毒单抗表位研究的假病毒库；(二)用于狂犬病毒单抗中和广谱性评价的假病毒库。
(一)用于表位研究的狂犬病毒假病毒库构建：(1)对于已知的RABV抗原表位，包括抗原位点Ⅰ、Ⅱ(Ⅱa和Ⅱb)、Ⅲ、Ⅳ、G5和minor a共6个抗原表位中每个位点上自然存在的所有氨基酸突变进行再现；(2)抗原表位外的其他区域(除信号肽、跨膜区和胞内区)，对这些区域每个位点上氨基酸的组成和分布进行分析，对各位点氨基酸比例大于10％的氨基酸进行突变；(3)以狂犬病毒株CVS-N2c的G蛋白为原始株模板，构建上述(1)和(2)中的突变；(4)挑战株的构建，即包含某些单个氨基酸突变的街毒株，以验证(1)和(2)中部分单个氨基酸位点的影响，并评价单抗对包含这些位点突变的狂犬街毒株的中和效果。
(二)用于中和广谱性评价的狂犬病毒假病毒库构建：(1)国内狂犬代表性街毒株：选取2010年以后国内流行毒株并对G蛋白氨基酸序列进行进化树分析，结合宿主、地域、以及国内各省市狂犬病发生比例在各簇中分别选取代表流行株；(2)国外代表性狂犬街毒株：根据已有的研究数据，根据不同的抗原簇和基因簇选取代表流行株；(3)狂犬病毒属(lyssavirus)中除狂犬病毒之外的其他病毒种类各1。
3.1序列收集
通过在NCBI GenBank上检索，截止2018年2月20日，共获得了2890条RABV街毒的完整G蛋白序列(全长524个氨基酸，包含完整的毒株信息，包括毒株的分离时间、宿主和分离地点)。获得的毒株序列呈全球分布，主要来源于亚洲、非洲、南美洲和北美洲，其中中国、美国和巴西是主要的毒株来源国家。值得一提的是，印度被报道是全球狂犬病死亡数最多的国家(占亚洲死亡数59.9％，占全球死亡数35％)，但在GenBank中只获得了31条G蛋白序列，其中1例为人来源毒株。这2890条序列的宿主种类也比较多样，包含了人、狗、猫、蝙蝠等多种哺乳动物。
3.2用于表位研究的狂犬病毒假病毒库构建
狂犬病毒G蛋白是中和抗体作用的直接蛋白，在G蛋白上已鉴别出多个构象和线性抗原表位(图2)，包括：表位Ⅰ、表位Ⅱ(不连续的Ⅱa和Ⅱb)、表位Ⅲ、表位Ⅳ、G5和minor a等。其中表位Ⅰ位于G蛋白226～231位氨基酸；表位Ⅱ由两段非连续的表位Ⅱa和Ⅱb组成，表位Ⅱa位于198～200位氨基酸，表位Ⅱb位于34～42位氨基酸；表位Ⅲ为构象表位，位于330～338位氨基酸；表位Ⅳ和G5有重叠，主要位于251位氨基酸和261～264位氨基酸；抗原表位minor a位于342～343位氨基酸。在这些抗原表位中，最为主要的是表位Ⅱ和表位Ⅲ，绝大部分中和单抗结合这两个区域，其中70％的单抗结合位点为表位Ⅱ，～20％的单抗结合表位为表位Ⅲ。研究发现，表位Ⅰ、表位Ⅱ和表位Ⅲ内的氨基酸相对其他表位较为保守，然而这些表位中也存在着一定的氨基酸变异，表位Ⅰ中第231位的氨基酸变异程度较高，表位Ⅱ中第36、37和199位的氨基酸变异程度较高，而在表位Ⅲ中，第332、333、336和338位氨基酸也存在一定的变异。
通过对RABV街毒G蛋白胞外区各位点的氨基酸组成和分布进行分析，按照以下原则选择候选位点：(1)已知的RABV抗原表位，包括抗原位点Ⅰ、Ⅱ(Ⅱa和Ⅱb)、Ⅲ、Ⅳ、G5和minor a共6个抗原表位。对抗原表位内每个位点上自然存在的氨基酸变异进行突变；(2)抗原表位外的其他区域，对每个位点上氨基酸比例大于10％的氨基酸进行突变。通过定点突变，在原始病毒株CVS-N2c的G蛋白上进行候选位点的单个氨基酸突变。利用假病毒系统，包装含有单个氨基酸突变的RABV假病毒，并评价氨基酸突变对狂犬病毒单抗中和活性的影响，以确定狂犬病毒单抗识别的表位和关键氨基酸。
对2890条RABV街毒G蛋白氨基酸序列(去除信号肽的胞外区部分)进行了各位点的氨基酸组成和分布分析，并按照以下原则选择突变的候选位点：(1)对于已知的RABV抗原表位，包括抗原位点Ⅰ、Ⅱ(Ⅱa和Ⅱb)、Ⅲ、Ⅳ、G5和minor a共6个抗原位点。这些抗原表位中，对每个位点上自然存在的氨基酸变异进行突变；(2)抗原表位外的其他区域，对这些区域每个位点上氨基酸的组成和分布进行分析，对各位点氨基酸比例大于10％的氨基酸进行突变。选定突变位点后，在原始株CVS-N2c上进行单个氨基酸位点的突变，具体的突变位点如下：
(1)已知的RABV抗原表位内的氨基酸突变(65个突变)
通过对街毒G蛋白序列的分析，发现RABV G蛋白抗原表位内的氨基酸相对比较保守，如表5所示，只有3个位点的氨基酸保守率低于80％，分别为L231(72.28％)、N37(76.40％)和R264(54.22％)。L227,G229,K198,A200,L38,W335和H261这7个位点的氨基酸100％保守，这些位点在所有RABV街毒中不存在其他氨基酸种类。对于100％保守的位点不进行突变分析，而其他存在氨基酸变异的位点分别在原始株CVS-N2c上进行定点突变，共获得65个含有单个氨基酸突变的突变株，具体突变位点见表5。
表5 RABV G蛋白抗原表位区中的氨基酸分布
(2)抗原表位外其他区域的氨基酸突变(34个突变)
对其他区域各氨基酸位点上自然分布大于10％的氨基酸进行突变分析，共获得34个突变株，具体突变位点见表6。
表6RABV G蛋白抗原表位区外其他区域的突变
通过定点突变，在CVS-N2c基础上共构建了99个含有单个氨基酸突变的突变株，然后对所有突变株进行了假病毒包装制备。
包装制备RABV假病毒是利用Lipofectamine2000转染试剂(赛默飞)，通过在293T细胞(ATCC,CRL-3216)中转染RABV G蛋白表达质粒(原始质粒或突变质粒，invitrogenPCDNA3.1载体构建)，同时感染G*ΔG-VSV(水疱性口炎病毒，中检院)，具体步骤如下：
(1)取对数生长期的293T细胞，用胰酶(Gibco公司，货号：25200056)消化后计数，用DMEM完全培养基(HyClone,Logan,UT)将细胞浓度调整至4×105/ml，接种5ml细胞至T25培养瓶中(Corning公司)，在细胞培养箱中过夜培养(37℃，5％CO2)。
(2)当细胞生长汇合至一定比例时(90％左右)，制备转染溶液：向离心管中加入500μl的Opti-MEM培养基(Gibco)和20μl的Lipofectamine2000，混合均匀后室温静置5min；同时在另一个离心管中加入500μl的Opti-MEM培养基，然后加入4μg的RABV G蛋白表达质粒，混合均匀。
(3)将分别含有质粒和Lipofectamine2000的两份Opti-MEM培养基全部混合均匀，室温静置20min。
(4)转染溶液孵育即将结束时，用Opti-MEM培养基将G*ΔG-VSV假病毒稀释为7.0x104 TCID50/ml，弃去293T细胞现有的培养基并加入5ml稀释后的G*ΔG-VSV，混匀，该过程应避免细胞掉落。在细胞培养箱中培养6小时后，弃去培养瓶中的培养基，用PBS清洗一遍，然后加入8ml新鲜的DMEM完全培养基继续培养48h。
(5)培养结束后，用0.45μm的针头滤器过滤细胞上清以去除细胞碎片等杂质，在过滤后的假病毒收获液中加入FBS(终浓度至20％，Gibco)，1ml分装后-80℃保存。
制备得到的狂犬假病毒通过如下步骤滴定：
(1)取收获的RABV假病毒，在96孔白色细胞培养板中进行5倍梯度稀释(25μl假病毒加至100μl DMEM完全培养基中，共8个梯度)，每孔终体积为100μl，设置4个复孔，同时用培养基作为阴性对照。
(2)胰酶消化对数生长期的293T细胞，计数，将细胞用DMEM完全培养基调整浓度至4×105/ml。向上述96孔板中每孔加入100μl细胞混悬液，细胞培养箱中(37℃，5％CO2)培养24h。
(3)培养结束后，每孔吸取100μl上清丢弃，然后再加入100μl的Bright-GLoTM检测试剂，避光放置2min，然后读取发光值。
(4)用Reed-Muench法，根据各孔的稀释倍数和检测发光值(以阴性对照化学发光值的10倍作为cut-off值)计算RABV假病毒的50％组织培养感染量(50％tissue cultureinfectious dose，TCID50)。
制备的假病毒进行感染实验发现，C35S,S39P/F,R199G,C228S,V332F,I338F和G343W这8个突变显著降低了病毒的感染力或假病毒包装能力，无法进行中和评价。除去这8株因感染力大幅度降低无法进行评价的突变株，剩余的91个单位点突变假病毒可用于进行狂犬病毒单抗的中和活性评价，以鉴定狂犬病毒单抗的中和表位。
此外还制备了假病毒挑战株，其G蛋白是包含了对单抗中和活性有影响的单位点突变的街毒株G蛋白，目的是验证单位点突变的结果并评价单抗对这些毒株的中和活性。挑选了19株分别包含K226M、L231P、R333H、N336S以及I338T等突变的街毒株进行了评价，这19株病毒株信息见表7。
表7构建的挑战株病毒信息
3.3用于中和广谱性评价的狂犬病毒假病毒库构建
3.3.1我国狂犬流行代表株的构建
对我国2010年以后分离的狂犬病毒街毒株的G蛋白序列在氨基酸水平进行了进化树分析，结果如图3所示，这些序列分布在6个分支中(China I,II,III,IV,V和VI)，与已有文献报道一致。其中大部分序列分布在China I分支中，在2010年后的病毒G蛋白序列中未发现China V分支，因此挑选了一株2006年在重庆来源于犬的病毒株CQ-V进行构建，该病毒属于ChinaV分支。在各分支中，结合我国狂犬病的流行特点(发病率、地域、宿主等)，共挑选了16株街毒株用于假病毒的构建，毒株信息见表8。
表8构建的16株我国狂犬流行代表株信息
毒株 分支 宿主 毒株来源地区 分离时间
YN-I ChinaI Dog Yunnan 2014
CQ-I ChinaI Dog Chongqing 2016
SC-I ChinaI Dog Sichuan 2017
HN-I-dog ChinaI Dog Henan 2018
JS-I ChinaI Dog Jiangsu 2018
GX-I ChinaI Dog Guangxi 2018
Hunan-I ChinaI Human Hunan 2015
JX-I ChinaI Ferret Jiangxi 2016
GD-II ChinaII Dog Guangdong 2016
GX-II ChinaII Dog Guangxi 2013
XJ-III ChinaIII Dog Xinjiang 2018
IM-III-cattle ChinaIII Cattle InnerMongolia 2020
IM-IV ChinaIV Dog InnerMongolia 2013
CQ-V ChinaV Dog Chongqing 2006
YN-VI ChinaVI Dog Yunnan 2010
GX-VI ChinaVI Dog Guangxi 2010
3.3.2国外狂犬流行代表株的构建
基于全球狂犬病毒株的抗原性分析，挑选了6株狂犬病毒街毒用于代表株的构建，毒株信息见表9。
表9构建的6株国外狂犬流行代表株信息
毒株 宿主 分离国家 基因簇 抗原簇 分离时间
Afghanistan-1 Dog Afghanistan VII 1 2011
South Africa-1 Feline South Africa II 1 2001
USA-2 Skunk USA IV 2 2011
USA-3 Homosapiens USA IX 3 2012
India-3 Dog India II 3 2013
Brazil-4 Eptesicusfurinalis Brazil IX 4 2010
3.3.3其他狂犬病毒属病毒的构建
狂犬病毒属病毒(Lyssavirus)共包含17种病毒，感染后均可以引起狂犬病。根据病毒间的基因和抗原性差异，目前狂犬病毒属病毒被分为三个系统群(phylogroup)，其中系统群1(phylogroup I)包含经典的狂犬病病毒(RABV)以及Aravan virus(ARAV),Australian bat lyssavirus(ABLV),Bokeloh bat lyssavirus(BBLV),Duvenhage virus(DUVV),European bat-1and-2lyssaviruses(EBLV-1and EBLV-2),Gannoruwa batlyssavirus(GBLV),Irkut virus(IRKV)，Khujand virus(KHUV)；系统群2(phylogroup II)包含Lagos bat virus(LBV),Mokolavirus(MOKV)和Shimoni bat virus(SHIBV)；系统群3(phylogroup III)包含West Caucasian bat virus(WCBV),Ikoma lyssavirus(IKOV)和Lleidabat lyssavirus(LLEBV)。
分别构建了15株狂犬病毒属病毒，用于评价狂犬病毒单抗对这些病毒的中和活性，病毒信息见图4。
3.4狂犬假病毒库小结
通过以上内容，构建了用于狂犬病毒单抗表位研究的单个氨基酸突变假病毒91株、用于表位验证和确认的挑战株假病毒19株、用于中和广谱性评价的代表性流行病毒株共37株(国内流行株16株、国外流行株6株、其他狂犬病毒属病毒15株)，合计共构建了147株狂犬假病毒用于单抗的表位研究和中和广谱性评价。
实施例4、人源化狂犬病毒单抗的表位研究
发明人通过单个氨基酸突变假病毒库和挑战株病毒库，对RVAB-4H1K(代号：DPAF302018-1)、RVAB-11HK2(代号：DPAF302018-2)和RVAB-1H1K(代号：DPAF302018-3)三株狂犬病毒单抗的表位区域、识别氨基酸位点、种类以及突变频率等内容进行了研究。
4.1对原始病毒株CVS-N2c的中和活性评价
首先，在原始病毒株CVS-N2c上评价了三株狂犬单抗：抗狂犬单抗DPAF302018-1(简称DP1)、抗狂犬单抗DPAF302018-2(简称DP2)和抗狂犬单抗DPAF302018-3(简称DP3)，以及3个单抗两两组合形式的中和效果(简称DP-1+2、DP-1+3和DP-2+3)。3株单抗均能对CVS-N2c进行中和，其中DP1和DP3的IC50值在2ng/ml左右，DP2的IC50值在1ng/ml左右(表10，图5和图6，柱状图和折线图)，3种组合形式的抗体也对CVS-N2c具有良好的中和作用(表10，图6，折线图)。
表10单抗和抗体组合对CVS-N2c假病毒的IC50
DP1 DP2 DP3 DP-1+2 DP-1+3 DP-2+3
IC50(ng/ml) 2.25±0.42 0.92±0.14 1.85±0.19 1.22±0.22 2.34±0.23 1.23±0.25
4.2表位I中突变株的中和活性评价
假病毒库中共包含7个表位I的单个氨基酸位点突变株，包括：K226M、K226Q、K226R、V230I、L231H、L231P和L231S。分别检测单抗和抗体组合对这7株假病毒的中和效果，结果显示(图7)，单抗DPAF302018-1识别表位I中的第226位的赖氨酸(K226)，当K226突变为蛋氨酸(M)、天冬氨酸(Q)或精氨酸(R)后，抗体不能中和病毒(IC50大于100ng/ml)；单抗DPAF302018-3识别表位I中的第231位的亮氨酸(L231)，当L231变为脯氨酸(P)后，抗体的中和活性下降40倍左右(表11)，单抗DPAF302018-3对L231位的其他两个突变株L231H和L231S的中和活性没有影响；单抗DPAF302018-2中和效果不受表位I中氨基酸突变的影响。
3个抗体组合(DP1+2、DP1+3和DP2+3)对表位I中的突变株均能进行有效中和。虽然DP1对K226M/Q/R不能中和(IC50大于100ng/ml)、DP3对L231P活性下降40多倍，DP1和DP3抗体组合(DP1+3)能够对突变株K226M/Q/R和L231P进行有效中和，表明DP1和DP3虽然均识别表位I区域，但二者具体识别的氨基酸不同，表位不存在干扰。
进一步分析了这2株抗体表位的保守性，通过在NCBI检索自然界流行狂犬病毒株的G蛋白序列，单抗DPAF302018-3单抗表位上发生L231P突变的比例为12.94％；单抗DPAF302018-1单抗表位发生K226M/Q/R突变的比例为0.31％。
综上，单抗DPAF302018-3识别表位I中的L231，表位保守率为87.06％；单抗DPAF302018-1识别表位I中K226，表位保守率为99.42％；单抗DPAF302018-2中和效果不受表位I中氨基酸突变的影响。
表11单抗和抗体组合对单个氨基酸位点突变株的中和活性
4.3表位II中突变株的中和活性评价
表位II包括表位IIa和表位IIb，假病毒库中共包含16个表位II的单个氨基酸位点突变株，其中表位IIa包括：R199K，表位IIb包括：G34E、T36A、T36D、T36I、T36N、T36S、N37D、N37I、N37S、N37T、S39T、G40E、F41I、F41L和S42P。中和试验结果显示(图8和图9)，表位II中的16个突变株对单抗和抗体组合的中和活性基本无影响，仅有单抗DP2和DP3对G34E突变株的中和活性分别下降了6.6和4.7倍(表11)，单抗DP1对S39T中和活性下降了4.6倍，其他突变株对3株单抗的中和活性无影响。3个抗体组合对G34E突变株中和活性下降5倍左右，对表位II中的其他突变株活性无影响。
此部分结果表明3株单抗和3个抗体组合可对表位II中的突变株进行有效中和，只有个别突变(G34E和S39T)对其活性有轻微影响，3株单抗识别表位非表位II。
4.4表位III中突变株的中和活性评价
假病毒库中共包含22个表位III的单个氨基酸位点突变株，包括：K330E、K330N、K330Q、K330R、K330T、S331A、S331L、V332I、R333H、R333K、R333L、R333N、R333P、R333Q、T334N、N336D、N336G、N336K、N336S、E337D、I338T和I338V。中和试验结果显示(图10)，表位III中的22个突变株对3株单抗的中和活性无影响。抗体组合DP1+2和DP2+3仅对R333N突变株中和活性下降5倍左右(表11)，抗体组合对表位III中的其他突变株活性无影响。
此部分结果表明3株单抗和3个抗体组合可对表位III中的突变株进行有效中和，3株单抗识别表位非表位III。
4.5表位Ⅳ&G5中突变株的中和活性评价
假病毒库中共包含9个表位IV&G5的单个氨基酸位点突变株，包括：W251L、W251G、W251R、D262N、F263I、F263L、F263Y、R264H和R264Q。中和结果显示(图11)，单抗DP1识别表位IV&G5中的第251位的色氨酸(W251)，当W251变为L、G或R后，抗体不能中和病毒(IC50大于100ng/ml)，W251L/G/R自然界发生突变的比例为0.27％；单抗DP2和DP3的中和活性不受表位IV&G5中氨基酸突变的影响。虽然单抗DP1不能中和突变株W251L/G/R(IC50大于100ng/ml)，但3个抗体组合(DP1+2、DP1+3和DP2+3)对表位I中的突变株均能进行有效中和。
综上，单抗DP1除识别表位I中的L231(图7)，还识别表位IV&G5中的W251，W251的保守率为99.73％；单抗DP2和DP3不识别表位IV&G5中的氨基酸。
4.6表位minor a中突变株的中和活性评价
假病毒库中共包含3个表位minor a的单个氨基酸位点突变株，包括：K342R、K342T和G343R。中和结果显示(图12)，3株单抗和3个抗体组合的中和活性不受表位minor a中3个突变株的影响，表明3株单抗不识别表位minor a中的氨基酸。
4.7表位外突变株的中和活性评价
除已知表位(表位I、II、III、IV&G5和minor a)中的氨基酸突变，我们还对G蛋白胞外区除已知表位的其他氨基酸位点进行了突变和评价，即表位外突变株，此部分我们对自然界存在的比例大于10％的氨基酸进行了突变和假病毒构建，共有34个突变株。
中和试验结果显示(图13)，单抗DP2识别表位外第196位的精氨酸(R196)，当R196变为赖氨酸K后(R196K)，DP2抗体的中和活性下降50倍左右(表11)，R196K自然界发生突变的比例为26.37％；单抗DP1和DP3的中和活性不受表位外34个氨基酸突变的影响。3个抗体组合(DP1+2、DP1+3和DP2+3)对表位外的突变株均能进行有效中和，但包含DP2的抗体组合(DP1+2和DP2+3)对R196K的中和活性分别下降了7.2倍和4.9倍。
综上，单抗DP2识别已知表位外的R196，R196的保守率为73.63％；单抗DP1和DP3不识别已知表位外中的氨基酸。
4.8挑战株的中和活性评价
所谓挑战株，即包含了一些对单抗中和活性有影响的单位点突变的街毒株，以验证单位点突变的结果并评价单抗对这些毒株的中和活性。我们挑选了19株分别包含K226M、L231P、R333H、R333P、N336S以及I338T等突变的街毒株进行了评价，这19株病毒株信息见表7。
对挑战株的中和试验结果显示(图14和图15，表12)，单抗对挑战病毒株的中和活性与单个氨基酸突变库一致，当单抗对单个氨基酸突变病毒库中的某一氨基酸突变不能中和时，该单抗对包含此氨基酸突变的其他毒株也不能中和，即对单抗的表位进行了验证和确认。如我们发现单抗DP1不能中和单位点突变株K226M/Q/R，该单抗同样不能中和包含K226M突变的挑战株G041和G042；单抗DP3中和活性受单位点突变L231P的影响，我们发现DP3对包含L231P突变的挑战株13-I6WFZ2、16-R9W7G2、21-K9L3Z2、G048、G050和G052均不能有效中和。同时，抗体组合相比3株单抗显示出了更好的中和广谱性，如图所示，组合单抗DP1+3显示出最好的中和广谱性，可以对所有挑战株进行中和。
表12单抗和抗体组合对挑战株的中和活性
4.9.表位研究小结
通过以上单个氨基酸位点突变病毒库的评价，可以确定3株单抗识别的表位区域以及结合的关键氨基酸(表13，图16和图17)。单抗DP1识别表位I中的K226以及表位IV&G5中的W251，当病毒发生K226M/Q/R或者W251L/G/R突变后，单抗DP1不能对突变病毒株进行中和(IC50大于100ng/ml)，K226M/Q/R和W251L/G/R在自然界的流行比例合计为0.58％，即单抗DP1的表位保守率为99.42％，可对自然界中99.42％的狂犬病毒株进行中和；单抗DP2识别的表位不在已知的表位中，R196氨基酸为该单抗识别的关键氨基酸，当病毒发生R196K突变后，单抗DP2对其中和活性降低50倍左右，R196K在自然界的流行比例为26.37％，即单抗DP2的表位保守率为73.63％，可对自然界中73.63％的狂犬病毒株进行中和；单抗DP3识别表位I中的L231，当病毒发生L231P突变后，单抗DP3对其中和活性降低40倍左右，L231P在自然界的流行比例为12.94％，即单抗DP2的表位保守率为87.06％，可对自然界中87.06％的狂犬病毒株进行中和。需要注意的是，单抗DP1在本研究最高浓度下(100ng/ml)对K226M/Q/R和W251L/G/R无中和效果，而单抗DP2和DP3对R196K和L231P的中和效果降低，但仍具有一定的中和能力。三株单抗两两组合形式的抗体组合对单个氨基酸位点突变病毒库均具有较好的中和效果，相比于单抗，抗体组合中和活性无明显影响、中和广谱性增强，对于单抗逃逸的突变株可有效进行中和。
在挑战病毒株上的验证试验结果也确证了3株单抗的表位，同时抗体组合在一定程度上增强了中和广谱性，其中DP1+3具有最强的中和广谱性，能够对所有挑战株进行中和。
表13三株狂犬单抗的表位研究结果小结
实施例5、人源化狂犬病毒单抗的中和广谱性评估
如实施例3所述，发明人挑选并构建了代表中国流行特性的狂犬病毒街毒株和全球流行街毒株的假病毒库，这些代表株来源于不同的地域、宿主(狗、猫和人)，并且分布于不同的进化簇中，对这些街毒株的中和活性能够在一定程度上代表狂犬病毒单抗对自然界流行的狂犬街毒株的保护效果，即狂犬病毒单抗的中和广谱性。
同时，发明人也对同样能够引起狂犬病的狂犬病毒属病毒(lyssavirus)进行了中和活性评价。
5.1狂犬单抗对狂犬病毒代表性流行街毒株的中和效果
对前述22株来源于中国和全球的代表性狂犬病毒街毒株进行的中和试验结果显示(图18和图19)，单抗DP1能够对所有22株街毒株进行中和，且其中和活性不受毒株差异的影响，表现出较好的中和广谱性；单抗DP2不能中和来源于中国内蒙古的毒株IM-III-cattle、不能中和来源于美国的的毒株USA-2、USA-3、以及来源于巴西的毒株Brazil-4(IC50大于100ng/ml)，同时单抗DP2对国内多株街毒株的中和活性有不同程度的降低(相比于CVS-N2c，IC50上升4-65倍，见图20，表14)；单抗DP3不能中和来源于美国的的毒株USA-3和来源于巴西的毒株Brazil-4(IC50大于100ng/ml)，对剩余20株街毒株均能进行有效的中和，中和活性不受影响。
3个抗体组合(DP1+2、DP1+3和DP2+3)均显示出了良好的中和广谱性，其中DP1+2和DP1+3能够对所有22株代表性街毒株进行中和，且中和活性不受影响；DP2+3抗体组合不能中和来源于美国的的毒株USA-3和来源于巴西的毒株Brazil-4(IC50大于100ng/ml，单抗DP2和DP3对这两株毒株均无法中和)，对剩余20株街毒株均能进行有效的中和，中和活性不受影响。由此可见，不同单抗的组合增强了抗体的中和广谱性，组合形式的抗体可以中和单一抗体不能中和的街毒株(如DP1+2可以中和IM-3cattle、USA-2、USA-3和Brazil-4，且对其他毒株的中和效果强于单抗DP2；DP1+3可以中和USA-3和Brazil-4)，其中抗体组合DP1+2和DP1+3中和广谱性最强。
表14单抗和抗体组合对国内外狂犬代表株的中和活性
5.2狂犬单抗对其他狂犬病毒属病毒的中和效果
如前所述的发明人构建的15株狂犬病毒属病毒用于评价本发明的人源化狂犬病毒单抗对这些病毒的中和活性。
中和试验结果显示(图21和图22)，相比于狂犬病毒(RABV)，3株单抗不能全部中和15株狂犬病毒属病毒，其中单抗DP1的中和广谱性相对较好，可以对系统群1(phylogroupI)中的大部分毒株进行中和，但不能中和其中和DUVV和EBLV-1(IC50大于100ng/ml，表15)，同时也不能中和系统群2(phylogroup II)和系统群3(phylogroup III)中的全部病毒(IC50大于100ng/ml，表15)；单抗DP2对所有15株狂犬病毒属病毒均不能中和(IC50大于100ng/ml，表15)；单抗DP3只能对系统群1中的ARAV进行中和，对其余所有病毒不能中和(IC50大于100ng/ml，表15)。
由于DP2和DP3对狂犬病毒属病毒的中和能力有限，3个抗体组合的病毒中和谱与其中广谱性强的单抗一致，如DP1+2和DP1+3的中和谱与单抗DP1一致(可中和单抗DP1中和的病毒)，DP2+3只能对ARAV进行中和。
表15单抗和组合抗体对其他狂犬病毒属病毒的中和活性
5.3中和广谱性评价小结
通过3株单抗和3种抗体组合对22株我国和全球的代表性狂犬病毒街毒株、以及15株其他狂犬病毒属病毒的中和试验，评价了狂犬单抗和抗体组合的中和广谱性。3株单抗中，DP1中和广谱性最强，可以对本研究中所有的国内外街毒株进行有效中和，其IC50值相对于原始株CVS-N2c没有显著变化；单抗DP3也具有良好的中和广谱性，对本研究中大部分国内外街毒株进行有效中和，其IC50值相对于原始株CVS-N2c没有显著变化，仅不能中和源于美国的的毒株USA-3和来源于巴西的毒株Brazil-4(IC50大于100ng/ml)；单抗DP2中和广谱性相对DP1和DP2稍弱，不能中和来源于中国内蒙古的毒株IM-III-cattle、不能中和来源于美国的的毒株USA-2、USA-3、以及来源于巴西的毒株Brazil-4(IC50大于100ng/ml)，同时单抗DP2对国内多株街毒株的中和活性有不同程度的降低。
3个抗体组合(DP1+2、DP1+3和DP2+3)对狂犬病毒街毒株也显示出了良好的中和广谱性，其中DP1+2和DP1+3能够对所有22株代表性街毒株进行中和；DP2+3抗体组合广谱性稍弱，不能中和来源于美国的的毒株USA-3和来源于巴西的毒株Brazil-4(IC50大于100ng/ml)。
人类的狂犬病主要由狂犬病病毒(RABV)感染引起，其他狂犬病毒属病毒(Lyssavirus)感染后也可引起狂犬病但感染人的病例极少发生。对于这些狂犬病毒属病毒，单抗DP1具有较好的中和活性，可以对系统群1(phylogroup I)中的大部分毒株进行中和(不能中和DUVV和EBLV-1，IC50大于100ng/ml)，但不能中和系统群2(phylogroup II)和系统群3(phylogroup III)中的全部病毒(IC50大于100ng/ml)；单抗DP3只能对系统群1中的ARAV进行中和，而单抗DP2对所有15株狂犬病毒属病毒均不能中和(IC50大于100ng/ml)。3个抗体组合(DP1+2、DP1+3和DP2+3)中DP1+2和DP1+3广谱性较好，可中和的病毒株与单抗DP1一致；抗体组合DP2+3仅能够对ARAV进行中和，且IC50值较高。
实施例6、人源化狂犬病毒单抗的比活性评价(RFFIT法)
采用2020年版《中国药典》三部通则3512狂犬病免疫球蛋白效价测定法第二法：快速荧光灶抑制试验法(RFFIT)，根据狂犬单抗对狂犬病病毒的中和作用，将狂犬单抗和国家标准品做系列稀释，分别与狂犬病病毒CVS-11悬液混合，感染BSR细胞，然后用FITC标记抗狂犬核蛋白单抗染色并观察荧光灶减少，以测定狂犬单抗的效价和比活性。
将CVS-11病毒用DMEM培养基稀释至1X108 FFU/ml，病毒荧光病灶强度在80-95％之间。取狂犬病人免疫球蛋白国家标准品50μl加100μl稀释液(10％FBS的DMEM培养基)做1︰3稀释；取人源化抗狂犬病毒单抗DP-1、DP-2和DP-350μl加950μl稀释液(10％FBS的DMEM培养基)做1︰20稀释。然后对标准品和狂犬单抗分别进行3倍系列稀释。取稀释后的各稀释度标准品和狂犬单抗各100μl加入至96孔板中，每孔加入50μl稀释好的CVS-11病毒，5％二氧化碳培养箱37℃中和1小时。将BSR细胞密度调整至1x106个细胞/ml，然后在孵育后的96孔板各孔中加入50μl，5％二氧化碳培养箱37℃中培养24小时。将培养板中的培养液弃去，用PBS洗一遍，每孔加入预冷的80％丙酮50μl，4℃条件固定30分钟或-30℃固定10分钟。弃丙酮后每孔加入50μl经1：100稀释的FITC标记的抗狂犬病病毒核蛋白单抗，37℃孵箱中孵育60分钟。弃抗体后用PBS洗3遍。倒置荧光显微镜下记录每孔细胞的荧光染色面积。计算公式如下：
标准品lgED50＝lg(1/A)-(0.5-B/C-B)*lgn1
式中A为低于50％荧光灶比例的标准品稀释度
B为标准品低于50％荧光灶比例孔的荧光灶百分比
C为标准品高于50％荧光灶比例孔的荧光灶百分比
n1为标准品稀释倍数
狂犬单抗lgED50＝lg(1/E)-(0.5-F/G-F)*lgn2
式中E为低于50％荧光灶比例的狂犬单抗稀释度
F为狂犬单抗低于50％荧光灶比例孔的荧光灶百分比
G为狂犬单抗高于50％荧光灶比例孔的荧光灶百分比
N2为狂犬单抗稀释倍数
狂犬单抗效价(IU/ml)＝10(J-K)*L
式中J为标准品lgED50，K为狂犬单抗lgED50，L为标准品的效价(IU/ml)。
RFFIT结果如下表16所示，所测定的本发明的抗狂犬病毒人源化单抗DP-1、DP-2和 DP-3的效价分别为954IU/mg、1977IU/mg和925IU/mg。
表16
实施例7、人源化狂犬病毒单抗的效应子功能
发明人评价了6株人源化单抗对表达狂犬病毒G蛋白的CHO细胞的ADCC作用和CDC作用，结果如图23所示，6株抗体均显示了明显的ADCC活性和CDC活性，其活性水平相当。
CDC方法：
狂犬单抗与表达狂犬病毒G蛋白的CHO细胞结合后，在补体的参与下可杀伤靶细胞。在96孔细胞培养板中加入表达狂犬病毒G蛋白的CHO细胞(3×104个/孔)，37℃、5％CO2培养箱培养过夜。取细胞上清后每孔加入50μL梯度稀释的狂犬单抗(400μg/mL起始浓度，3倍等比稀释，共10个稀释度)，设双复孔，37℃孵育1小时。培养完成后每孔加入50μL的人补体稀释溶液，37℃±2℃、5％二氧化碳恒温培养箱中培养24小时。每孔加10μL CCK8稀释液。将细胞培养板放置于37℃±2℃、5％二氧化碳恒温培养箱中培养4小时后，在490nm/630nm波长下读取OD值。
ADCC方法(报告基因法)：
狂犬单抗与表达狂犬病毒G蛋白的CHO细胞结合后，其Fc段与杀伤细胞表面的Fc受体结合后，可介导杀伤细胞直接杀伤靶细胞。本试验中杀伤细胞为Jurkat-CD16-NFAT-luc细胞，其通过表面CD16分子与结合在CHO细胞表面的狂犬单抗Fc结合后，激活NFAT信号通路表达荧光素酶，再加入荧光素底物检测发光值luminescence(RLU)。在96孔全白细胞培养板中加入加入表达狂犬病毒G蛋白的CHO细胞(2×104个/孔)，37℃、5％CO2培养箱培养过夜。取上清后每孔加入50μL梯度稀释的狂犬单抗(20μg/mL起始浓度，3倍等比稀释，共10个稀释度)，设双复孔。然后每孔加入50μL细胞浓度为2×106个/mL的Jurkat-CD16-NFAT-luc细胞，37℃、5％CO2二氧化碳恒温培养箱中培养6小时。每孔加入100μL的Bright-Glo显色底物，避光反应3分钟，酶标仪读取RLU发光值。
通过以上实施例，本发明对3株狂犬单抗DP1、DP2、DP3以及抗体组合(DP1+2、DP1+3和DP2+3)开展了基于狂犬假病毒系统的表位研究和中和广谱性研究，并在狂犬活病毒上进行了比活性检测(RFFIT法)。
3株单抗均可对狂犬病毒假病毒(CVS-N2c)和活病毒(CVS-11)进行中和，IC50和比活性见下表17，其中DP2中和活性较DP1和DP3高2倍左右。
通过假病毒系统表位研究得出，单抗DP1识别表位I和表位IV&G5，识别的关键氨基酸为K226和L231，当发生K226M/Q/R或L231P突变时，单抗DP1不能中和狂犬病毒(IC50大于100ng/ml)，通过对收集的自然界流行的2890条狂犬病病毒G蛋白的序列分析发现，在自然界发生K226M/Q/R和L231P突变的比例为0.58％，表位保守率为99.42％，即单抗DP1可以对自然界99.42％的病毒株有效中和且活性不受影响，仅对0.58％的狂犬病毒在100ng/ml下不能中和；单抗DP2识别表位为非已知表位，识别的关键氨基酸为R196，当发生R196K突变时，单抗DP2的中和活性下降57倍，在自然界发生R196K突变的比例为26.37％，表位保守率为73.63％，即单抗DP2可以对自然界73.63％的病毒株有效中和且活性不受影响；单抗DP3识别表位为表位I，识别的关键氨基酸为L231，L231发生突变时仅L231P突变对单抗DP3有影响，L231H和L231S无影响，当发生L231P突变时，单抗DP3的中和活性下降41倍，在自然界发生L231P突变的比例为12.94％，表位保守率为87.06％，即单抗DP3可以对自然界87.06％的病毒株有效中和且活性不受影响。尽管单抗DP1和DP3均识别表位I，但具体识别的氨基酸表位不同，单抗DP1除表位I外还识别表位IV&G5中的氨基酸，单抗DP1可中和单抗DP3不能中和的病毒，而单抗DP3可中和单抗DP1不能中和的病毒。
对国内外狂犬病毒街毒株的中和结果显示，单抗DP1可以对全部22株街毒株进行中和；单抗DP2不能中和1株国内和3株国外街毒，同时对其他街毒株的中和活性均具有不同程度的降低；单抗DP3可以对国内街毒株全部中和，仅对国外2株街毒不能中和。对狂犬病毒街毒株的中和广谱性试验结果与表位研究中的表位保守率结果一致，即单抗DP1广谱性最强、单抗DP3广谱性稍弱、单抗DP2广谱性最低。
抗体组合(DP1+2、DP1+3和DP2+3)可增强中和广谱性，能够中和对单一单抗不能中和的突变株和街毒株，其中DP1+2和DP1+3的中和广谱性最强，可以对本研究中所有的狂犬病毒街毒株进行中和，而DP2+3不能中和国外的两个街毒株。对其他狂犬病毒属病毒，DP1+2和DP1+3也显示出强于DP2+3的中和广谱性。
综上，我们对3株单抗的表位识别区域、识别的关键氨基酸、自然界发生中和逃逸的位点和氨基酸种类、逃逸位点的比例进行了研究，同时对单抗和抗体组合的中和广谱性进行了评价。3株单抗识别的表位和表位的保守率有所不同，其中单抗DP1识别位点最为保守、其次为单抗DP3，单抗DP2表位保守率相对降低；同时，抗体组合DP1+2和DP1+3可中和本研究中所有22株狂犬病毒街毒株。
通过验证人源化抗体的效应子功能，可以预期本发明的抗体对狂犬病具有潜在的治疗作用。尽管目前对狂犬病的治疗还没有获得突破性进展，但有效的单抗有望在这一过程中发挥作用。
表17
应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上介绍仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明涉及如下序列：

Claims (27)

1.一种结合狂犬病毒的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包含如SEQ ID NO:20-24中任一项所示的重链可变区的3个互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，和/或如SEQ ID NO:25-28中任一项所示的轻链可变区的3个互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3。
2.根据权利要求1所述的结合狂犬病毒的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包含重链可变区和/或轻链可变区，其中
所述重链可变区包含：
(1)包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的HCDR1，包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的HCDR2，和包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的HCDR3；或，
(2)包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的HCDR1，包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的HCDR2，和包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的HCDR3；或，
(3)包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的HCDR1，包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的HCDR2，和包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的HCDR3；
和/或，
所述轻链可变区包含：
(1)包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的LCDR1，包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的LCDR2，和包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的LCDR3；或，
(2)包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的LCDR1，包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的LCDR2，和包含如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的LCDR3；或，
(3)包含如SEQ ID NO:16或19所示的氨基酸序列的LCDR1，包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的LCDR2，和包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的LCDR3。
3.根据权利要求1所述的结合狂犬病毒的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包含重链可变区VH和/或轻链可变区VL，其中，
(a)重链可变区VH
(i)包含与选自SEQ ID NO:20-24中任一项所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；或者，
(ii)包含选自SEQ ID NO:20-24中任一项所示的氨基酸序列或由其组成；或者，
(iii)包含与选自SEQ ID NO:20-24中任一项所示的氨基酸序列相比具有1-15个氨基酸的添加，取代或缺失或其任意组合(例如1个，2个或3个的氨基酸的添加，取代或缺失或其任意组合)的氨基酸序列；
和/或，
(b)轻链可变区VL
(i)包含与选自SEQ ID NO:25-28中任一项所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；或者，
(ii)包含选自SEQ ID NO:25-28中任一项所示的氨基酸序列或由其组成；或者
(iii)包含与选自SEQ ID NO:25-28中任一项所示的氨基酸序列相比具有1-15个氨基酸的添加，取代或缺失或其任意组合(例如1个，2个或3个的氨基酸的添加，取代或缺失或其任意组合)的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3任一项所述的结合狂犬病毒的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其是小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。
5.根据权利要求1-3任一项所述的结合狂犬病毒的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包含重链恒定区和/或轻链恒定区，所述轻链恒定区是λ链或κ链恒定区；所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4型。
6.根据权利要求1-3任一项所述的结合狂犬病毒的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包含重链和/或轻链，其中
(a)重链
(i)包含与选自SEQ ID NO:29-33中任一项的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；或者，
(ii)包含选自SEQ ID NO:29-33中任一项的的氨基酸序列或由其组成；或者，
(iii)包含与选自SEQ ID NO:29-33中任一项的的氨基酸序列相比具有1-20个氨基酸的添加，取代或缺失或其任意组合(例如1个，2个或3个的氨基酸的添加，取代或缺失或其任意组合)的氨基酸序列；
和/或，
(b)轻链
(i)包含与选自SEQ ID NO:34-37中任一项的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；或者，
(ii)包含选自SEQ ID NO:34-37中任一项的氨基酸序列或由其组成；或者
(iii)包含与选自SEQ ID NO:34-37中任一项的氨基酸序列相比具有1-20个氨基酸的添加，取代或缺失或其任意组合的氨基酸序列。
7.根据权利要求1-6任一项所述的结合狂犬病毒的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其中所述抗体是单克隆抗体。
8.根据权利要求1-6任一项所述的结合狂犬病毒的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其中所述抗原结合片段是选自以下的抗体片段：Fab、Fab’、Fd、Fab’-SH、Fv、单链抗体(例如scFv)或(Fab’)2、单结构域抗体、diabody(dAb)或线性抗体。
9.一种抗体组合，其包含：
(1)作为第一抗体的根据权利要求1-8所述的抗体或其抗原结合片段；和
(2)作为第二抗体的根据权利要求1-8所述的抗体或其抗原结合片段；
其中，第一抗体和第二抗体的至少一个对应位置的CDR结构域具有不同的氨基酸序列。
10.根据权利要求9所述的抗体组合，其特征在于，其中第一抗体和第二抗体的全部对应的CDR结构域都具有不同的氨基酸序列。
11.根据权利要求10所述的抗体组合，其中所述第一抗体具有包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的HCDR1，包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的HCDR2，包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的HCDR3，包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的LCDR1，包含如SEQID NO:11所示的氨基酸序列的LCDR2，和包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的LCDR3；所述第二抗体具有包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的HCDR1，包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的HCDR2，包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的HCDR3，包含如SEQ IDNO:13所示的氨基酸序列的LCDR1，包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的LCDR2，和包含如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的LCDR3。
12.根据权利要求10所述的抗体组合，其中所述第一抗体具有包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的HCDR1，包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的HCDR2，包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的HCDR3，包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的LCDR1，包含如SEQID NO:11所示的氨基酸序列的LCDR2，和包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的LCDR3；所述第二抗体具有包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的HCDR1，包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的HCDR2，包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的HCDR3，包含如SEQ IDNO:16或19所示的氨基酸序列的LCDR1，包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的LCDR2，和包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的LCDR3。
13.根据权利要求10所述的抗体组合，其中所述第一抗体具有包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的HCDR1，包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的HCDR2，包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的HCDR3，包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的LCDR1，包含如SEQID NO:14所示的氨基酸序列的LCDR2，和包含如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的LCDR3；所述第二抗体具有包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的HCDR1，包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的HCDR2，包含如SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列的HCDR3，包含如SEQ IDNO:16或19所示的氨基酸序列的LCDR1，包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的LCDR2，和包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的LCDR3。
14.根据权利要求9或10所述的抗体组合，其特征在于，进一步包含作为第三抗体的根据权利要求1-8所述的抗体或其抗原结合片段。
15.根据权利要求9-14中任一项所述的抗体组合，其特征在于，其进一步包含更多种不同的结合狂犬病毒的抗体或其抗原结合片段。
16.一种分离的核酸，其特征在于，编码权利要求1至8中任一项的结合狂犬病毒的抗体或其抗原结合片段的任一条链。
17.一种载体，其特征在于，包含权利要求16的核酸，所述载体是表达载体。
18.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求16的核酸或权利要求17的载体，所述宿主细胞是原核的或真核的。
19.根据权利要求18所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。
20.一种制备结合狂犬病毒的抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于，所述方法包括在适于表达抗体的情况下，培养权利要求18或19的宿主细胞，任选地所述方法还包括从所述宿主细胞回收所述抗体或其抗原结合片段。
21.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-8中任一项的结合狂犬病毒的抗体或其抗原结合片段，和/或权利要求9-15中任一项的抗体组合，以及任选地药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
22.权利要求21的药物组合物，其特征在于，包含其他治疗剂、被动免疫剂或疫苗。
23.有效量的权利要求1-8中任一项的抗体或其抗原结合片段、权利要求9-15中任一项的抗体组合、或权利要求21或22的药物组合物在制备治疗剂或被动免疫剂中的用途，其特征在于，所述治疗剂或被动免疫剂用于在受试者中预防和/或治疗狂犬病毒属病毒感染，或预防受试者发生狂犬病。
24.根据权利要求23所述的用途，其特征在于，其中所述受试者已经暴露于狂犬病毒属病毒，优选地已经处于被狂犬病毒属病毒感染和进展为狂犬病发病的风险中。
25.一种试剂盒，其包含权利要求1-8中任一项的抗体或其抗原结合片段、权利要求9-15中任一项的抗体组合、或权利要求21或22的药物组合物。
26.一种检测样品中狂犬病毒的方法，其特征在于，所述方法包括，包括使用权利要求1-8中任一项的抗体或其抗原结合片段或权利要求9-15中任一项的抗体组合的步骤，任选地所述抗体或抗体组合是经过标记的，优选地所述方法包括使所述抗体或其抗原结合片段或所述抗体组合与所述样品接触的步骤。
27.一种检测试剂盒，其特征在于，其包含权利要求1-8中任一项的抗体或其抗原结合片段或权利要求9-11中任一项的抗体组合的步骤，任选地所述抗体或抗体组合是经过标记的。
CN202311194093.1A 2023-09-15 2023-09-15 抗狂犬病毒人源化抗体和抗体组合及其用途 Withdrawn CN117683123A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311194093.1A CN117683123A (zh) 2023-09-15 2023-09-15 抗狂犬病毒人源化抗体和抗体组合及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311194093.1A CN117683123A (zh) 2023-09-15 2023-09-15 抗狂犬病毒人源化抗体和抗体组合及其用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117683123A true CN117683123A (zh) 2024-03-12

Family

ID=90134050

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311194093.1A Withdrawn CN117683123A (zh) 2023-09-15 2023-09-15 抗狂犬病毒人源化抗体和抗体组合及其用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117683123A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2099823A2 (en) * 2006-12-01 2009-09-16 Seattle Genetics, Inc. Variant target binding agents and uses thereof
CN107428819A (zh) * 2014-11-18 2017-12-01 胡默波斯生物医学公司 强力地中和狂犬病毒和其它狂犬病毒属病毒的抗体和其用途
CN116715757A (zh) * 2023-06-06 2023-09-08 长春百克生物科技股份公司 全人源抗狂犬病毒中和抗体及其用途

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2099823A2 (en) * 2006-12-01 2009-09-16 Seattle Genetics, Inc. Variant target binding agents and uses thereof
CN107428819A (zh) * 2014-11-18 2017-12-01 胡默波斯生物医学公司 强力地中和狂犬病毒和其它狂犬病毒属病毒的抗体和其用途
US20180105579A1 (en) * 2014-11-18 2018-04-19 Humabs Biomed Sa Antibodies that potently neutralize rabies virus and other lyssaviruses and uses thereof
CN116715757A (zh) * 2023-06-06 2023-09-08 长春百克生物科技股份公司 全人源抗狂犬病毒中和抗体及其用途

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110317267B (zh) 针对狂犬病病毒的双特异性抗体及其用途
CN113388031B (zh) 单克隆抗体35b5及其制备方法和用途
CN114644708B (zh) 呼吸道合胞病毒特异性结合分子
BR112019022702A2 (pt) gama de anticorpos anti-interferon e utilizações dos mesmos.
CN114478769B (zh) 抗tigit抗体、其药物组合物及用途
US20190002534A1 (en) Human antibodies against rabies and uses thereof
CN114075289A (zh) 抗cd73的抗体及其用途
CN113527473A (zh) 一种全人源单克隆抗体及其应用
CN114621343B (zh) 乙型脑炎病毒抗体2g1及其应用
CN113583116A (zh) 针对SARS-CoV-1或SARS-CoV-2的抗体及其用途
EP3911414A1 (en) Antibodies to ebola virus glycoprotein
WO2023046097A1 (zh) 抗tigit人源化抗体或其抗原结合片段及其应用
CN106749645B (zh) 一种全人源抗丙型肝炎病毒的中和抗体
CN114805579A (zh) 一种抗人ace2蛋白单克隆抗体、核酸分子及应用
CN117683123A (zh) 抗狂犬病毒人源化抗体和抗体组合及其用途
CN113651884A (zh) 人源化抗SARS-CoV-2单克隆抗体及其应用
CN113549146B (zh) 针对柯萨奇病毒b1型的单克隆抗体及其用途
WO2023011338A1 (zh) 抗CD79b×CD3双特异性抗体及其用途
EP4442276A1 (en) Combined antibodies against sarbecoviruses and uses thereof
WO2022135468A1 (zh) 抗bcma×cd3双特异性抗体及其用途
KR20220012338A (ko) 신규한 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus) 항체 및 그의 용도
TW202413405A (zh) 抗體、其抗原結合片段及其藥物用途
CN118406140A (zh) 针对SARS-CoV-2及其突变株的广谱单克隆抗体及其用途
EP4255487A1 (en) Polypeptides for detection and treatment of coronavirus infection
WO2024150074A2 (en) Coronavirus antibodies and therapeutic uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20240312

WW01 Invention patent application withdrawn after publication