CN116715757A - 全人源抗狂犬病毒中和抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种全人源抗狂犬病毒的单克隆中和抗体，所述抗体的重链包含分别如SEQ ID NOs：1‑3所示的三个互补决定区，所述抗体的轻链包含分别如SEQ ID NOs：4‑6所示的三个互补决定区。本发明的抗体针对狂犬病毒糖蛋白的构象表位，具有较高的狂犬病毒抗原结合活性和较高的狂犬病毒中和活性。
Description
技术领域
本发明属于细胞免疫学、分子生物学领域，涉及一种全人源抗狂犬病毒的单克隆中和抗体。
背景技术
狂犬病(Rabies)是狂犬病毒所致的急性传染病，为人兽共患病，多见于犬、狼、猫等肉食动物，动物间通过互相撕咬而传播病毒，人多因被病兽咬伤而感染。我国的狂犬病主要由犬传播。感染后临床表现为特有的恐水、怕风、咽肌痉挛、进行性瘫痪等。狂犬病毒属于弹状病毒科狂犬病毒属，基因组单链RNA病毒。人患狂犬病后的病死率接近100％，故应加强预防措施。
根据世界卫生组织(WHO)建议，对于严重暴露者应同时进行主动和被动免疫治疗，以获得快速有效的保护作用。狂犬病疫苗是灭活后对人体无害的狂犬病毒(也就是无害抗原)，需要15-20天才产生足够抗体，刺激机体产生抗狂犬病毒的主动免疫作用。被动免疫制剂是含有特异性抗体的免疫血清，能够立即特异性地中和狂犬病病毒，短期内起到紧急预防狂犬病的作用。
抗体的发展经历了从鼠源抗体到人鼠嵌合抗体、人源化抗体，最终到通过转基因小鼠和噬菌体展示文库等筛选全人源单克隆抗体的阶段。早期的人鼠嵌合抗体虽降低了免疫原性，减轻了单抗异源性产生的排斥反应，维持了亲本抗体特异性结合抗原的能力，但是人鼠嵌合抗体的鼠源性仍然高达30％左右，还是容易引起人抗鼠抗体(human anti-MouseAntibody，HAMA)反应。为减少鼠源成分，研究者进一步用人的骨架区(FR)替代鼠FR，形成更为完全的人源化抗体，即除了3个互补决定区(CDR)是鼠源的以外，其余抗体结构全部是人源的，这种抗体又称CDR移植抗体(CDR grafted antibody)或改型抗体(Reshapedantibody)。全人源抗体是指抗体的全部序列均为人源序列，利用基因编辑技术，将动物体细胞中抗体基因进行人抗体基因替换，动物免疫后直接产生全人源化的抗体。随着抗体技术发展，抗体新药进入临床的数量明显增加，其中，主要以人源化抗体和全人源抗体为主。
从1986年首个抗体药物Orthoclone上市以来，到2017年2月17日共上市了63个针对狂犬病的抗体药物，平均每年上市2.5个抗体药物，且速度越来越快。从鼠源到全人源，单克隆抗体在患者体内引起人抗鼠免疫反应的概率逐步降低，治疗效果和安全性逐步提高，因此全人源单克隆抗体是未来发展的趋势。当前国内外狂犬单抗市场空缺较大，印度血清研究所研发的重组抗狂犬病毒单抗注射液SII RMab(Rabishield)已于2016年12月在印度批准上市；印度Zydus Cadila研发的鼠源单抗混合制剂RabiMabs(Twinrab)于2019年9月在印度获得批准，RabiMabs是两种鼠源抗狂犬病毒单抗M777-16-3和62-71-3形成的复方制剂。2022年1月25日华北制药研发的重组人源狂犬病抗体奥木替韦单抗注射液(Ormutivimab injection)上市，其需与人用狂犬病疫苗联用，发挥被动免疫作用。目前全球市场上尚无用于防治狂犬病的全人源单克隆抗体，该类产品一旦上市并规模化生产，将极大地降低狂犬病的防治成本，具有传统血液制品和疫苗不可比拟的竞争优势。因此，本领域迫切需要开发具有高亲和力的完全人源的抗狂犬病病毒抗体，以满足对于严重暴露者进行被动免疫治疗的需要，改善狂犬病防治困难的现状。
发明内容
本发明的目的在于提供一种全人源抗狂犬病毒的单克隆中和抗体、其编码序列及其在预防或治疗中的应用。所述抗体的重链、轻链可变区以及恒定区序列均来源于人体，因此具有免疫原性低、安全性高的特点。
第一方面，本发明提供了一种全人源抗狂犬病毒的单克隆中和抗体RVG-314或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链包含轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中：
(1)所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO：2所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；或
(2)所述HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1-3经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而获得的氨基酸序列，且分别与SEQ ID NO：1-3功能相同；或
(3)所述HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO：1-3具有80％以上同一性；并且
(4)所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQID NO：5所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；或
(5)所述LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：4-6经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而获得的氨基酸序列，且分别与SEQ ID NO：4-6功能相同；或
(6)所述LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO：4-6具有80％以上同一性。
优选地，重链互补决定区HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；重链互补决定区HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；重链互补决定区HCDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示；轻链互补决定区LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；轻链互补决定区LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；轻链互补决定区LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
在一个具体实施方案中，所述抗体重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；或者，所述抗体的重链的氨基酸序列为SEQ ID NO：7经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而获得的氨基酸序列，且与SEQ ID NO：7功能相同；或者，所述抗体的重链的氨基酸序列与SEQID NO：7具有80％以上同一性；并且
所述抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；或者，所述抗体的轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO：8经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而获得的氨基酸序列，且与SEQ ID NO：8功能相同；或者，所述抗体的轻链的氨基酸序列与SEQ ID NO：8具有80％以上同一性。
所述抗体包括人源与非人源抗体，包括与本发明的抗体具有相同功能的改造及优化的一切抗体。
在具体实施方案中，所述抗原结合片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段和/或单链抗体。
其中，Fab是指含有一条轻链的可变区和恒定区和一条重链的可变区和恒定区经二硫键结合起来的抗体分子的一部分。
Fab’是指包含了部分铰链区的Fab片段。
F(ab’)2指的是Fab’的二聚体。
Fv指的是含有抗体重链可变区、轻链可变区并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。
单链抗体指的是由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过一个肽链连接而成的工程抗体。
在具体实施方案中，所述抗体为完整的抗体分子。
所述抗体在本发明中指包含两个抗原结合区及Fc区的抗体；优选地，所述抗体具有功能性Fc区。
第二方面，本发明提供了一种分离的DNA，所述DNA包含编码第一方面的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列；优选地，所述DNA包含SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。
第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包含第二方面的DNA。
所述表达载体包括质粒、噬菌粒、柯斯质粒、人工染色体、噬菌体、动物病毒；优选地，所述载体为环状质粒；更优选地，所述载体为pcDNA3.3。
第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含第二方面的DNA或第三方面的表达载体。
所述宿主细胞包括原核细胞、HEK293细胞、真菌细胞、COS细胞、CHO细胞、BHK细胞、昆虫细胞或人细胞的动物细胞；优选地，所述宿主细胞是哺乳动物细胞；更优选地，所述宿主细胞为HEK 293i细胞。
第五方面，本发明提供了一种检测狂犬病毒的装置，包括第一方面的抗体或其抗原结合片段。
在具体实施方案中，所述装置包括但不限于试纸、试剂盒或芯片。凡是能够检测出狂犬病毒的检测装置均包括在本发明的范围之内。
第六方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含第一方面的抗体或其抗原结合片段以及可药用的载体。
第七方面，本发明提供了第一方面的抗体或其抗原结合片段在制备用于检测狂犬病毒的装置中的用途。
在具体实施方案中，所述装置包括但不限于试纸、试剂盒或芯片。
第八方面，本发明提供了第一方面的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗由狂犬病毒感染引起的疾病的药物制剂中的用途。
优选地，所述疾病是狂犬病。
本发明提供了一种全新的全人源抗狂犬病毒的单克隆中和抗体，该抗体特异性强，与现有的其他抗狂犬病毒血清或抗体相比具有抗原亲和力高、中和效果好、免疫原性低的特点，可作为生物工程抗体类药物快速建立狂犬病毒的免疫保护。
附图说明
图1显示利用非还原SDS-PAGE和Western Blot鉴定表达纯化后的RVG-314抗体针对的表位类型；
图2显示利用ELISA检测RVG-314抗体的抗原结合活性。
具体实施方式
本发明公开了一种全人源抗狂犬病毒的单克隆中和抗体，下面以具体实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但本发明并不限于这些实施例。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。除非另有说明，本文使用的制剂和设备均为普通市售品。
实施例1：RVG-314抗体表达与纯化
1.RVG-314抗体的表达载体构建：
将编码本发明的抗体(命名为RVG-314)的重链与轻链的核苷酸序列SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10，利用TA克隆的方法将其同时连接到商用载体pcDNA3.3上，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受细胞(购自TransGen公司)中，在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板中37℃过夜培养，即可获得转化后菌落。
挑取10个单菌落用特异性引物进行PCR检测，94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min 40s，28个循环，72℃再延伸5min。取5μL PCR产物进行电泳检测，在阳性转化子中鉴定出含有抗体RVG-314重链和轻链基因的转化子。
2.抗体大量表达与纯化
将上述阳性转化子通过质粒小提试剂盒(购自天根)进行质粒快速提取，具体步骤参照试剂盒说明书。随后，在175cm2细胞培养瓶中用转染试剂PolyFect共转染人胚胎肾细胞HEK293i细胞，转染后6-8小时更换含有2％胎牛血清的新鲜DMEM培养基，72小时后收集细胞上清，4000rpm离心1h，利用蛋白A(protein A)亲和层析法进行抗体纯化。
实施例2：RVG314抗体针对的表位类型鉴定
将不同浓度的狂犬病毒G蛋白RVG-hFC-13(由珠海泰诺麦博生物技术有限公司提供，浓度为3.1mg/ml和5.5mg/ml)分别进行变性非还原电泳，分别将RVG-314和阳性对照(奥木替韦单抗)抗体作为一抗进行结合，AP标记的抗人IgG(H+L)作为二抗进行染色。结果如图1所示。
图1a(左图)表明，本发明的RVG-314单克隆抗体不能与变性后的狂犬病毒G蛋白RVG-hFC-13结合；图1b(右图)表明，阳性对照单抗能与变性狂犬病毒G蛋白结合。这表明，RVG-314单抗是针对狂犬病毒G蛋白的构象表位，而非线性表位。
实施例3：RVG-314抗体结合活性检测
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测定本发明的RVG-314抗体与抗原的结合活性。以人用狂犬病疫苗(Vero细胞，1.0mL/支，6.3IU/ml，由吉林惠康生物药业有限公司提供)为抗原，并用包被液(PBS)将抗原50倍稀释后包被于酶标板，每孔100μl，4℃过夜包被，并用封闭液室温封闭2个小时。将RVG-314抗体和作为阳性对照的奥木替韦单抗(购自华北制药)(二者起始浓度均为400ng/ml，2倍梯度稀释，共12个稀释度)作为一抗，常温孵育2个小时，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG(1：2000稀释)作为二抗，常温孵育1个小时，加入底物显色液100μl/孔，常温避光放置5min后，用2M硫酸中止反应，采用450nm/630nm双波长进行吸光度检测。
结果如表1和图2所示。与阳性对照相比，本发明的RVG-314抗体具有更高的抗原结合活性，并在一定范围内存在剂量效应——抗体浓度越高，其抗原结合活性越高。即使在将RVG-314抗体进行2000倍稀释之后(抗体浓度约为0.2ng/ml)，其依然可以结合抗原。
表1RVG-314抗体的抗原结合活性测定
实施例4：RVG-314抗体中和活性检测(快速荧光灶抑制实验法)
采用快速荧光灶抑制实验法(RFFIT)对表达纯化后的RVG-314抗体的中和活性进行检测。将RVG-314抗体分别与狂犬病毒aG株(由ATCC提供，50μL/孔)、狂犬病毒PM株(由ATCC提供，50μL/孔)、狂犬病毒CVS-11株(由中国食品药品检定研究院提供，50μL/孔)于96孔培养板中混匀，37℃孵育1h。然后每孔加入金黄仓鼠肾细胞(BSR)悬液，37℃培养24h。将细胞用PBS洗涤2次，加入80％丙酮，4℃固定30min后，弃去丙酮，PBS洗一次晾干后，每孔加入50μl FITC标记的小鼠抗狂犬病毒核蛋白单抗(1∶100稀释，由ABMAX提供)。37℃孵育30min，PBS洗3次，每孔加80％甘油50μL，于荧光显微镜下观察，计数每孔中的荧光灶数。具体操作步骤可参照《中国药典2020年版》。
结果如表2所示：针对狂犬病毒aG株，RVG-314抗体的中和效价约为10280.00IU/ml；针对狂犬病毒PM株，RVG-314抗体的保护效价约为5430.00IU/ml；针对狂犬病毒CVS-11株，RVG-314抗体的保护效价约为6980.00IU/ml。这证明本发明的RVG-314抗体具有较高的狂犬病毒中和活性。
表2
虽然以上仅描述了本发明的具体实施方式范例，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更或修改均落入本发明的保护范围。
序列表
SEQ ID NO：1表示本发明的抗体RVG-314的重链CDR1(HCDR1)的氨基酸序列，具体序列为：GGSISSVNYY；
SEQ ID NO：2表示本发明的抗体RVG-314的重链CDR2(HCDR2)的氨基酸序列，具体序列为：IYYNGVT；
SEQ ID NO：3表示本发明的抗体RVG-314的重链CDR3(HCDR3)的氨基酸序列，具体序列为：AREAIRTNWFDP；
SEQ ID NO：4表示本发明的抗体RVG-314的轻链CDR1(LCDR1)的氨基酸序列，具体序列为：GGSSNIGSNPVN；
SEQ ID NO：5表示本发明的抗体RVG-314的轻链CDR2(LCDR2)的氨基酸序列，具体序列为：NNNQRPS；
SEQ ID NO：6表示本发明的抗体RVG-314的轻链CDR3(LCDR3)的氨基酸序列，具体序列为：AAWDDSLNGHW；
SEQ ID NO：7表示本发明的抗体RVG-314的重链的氨基酸序列，具体序列为：
SEQ ID NO：8表示本发明的抗体RVG-314的轻链的氨基酸序列，具体序列为：
SEQ ID NO：9表示编码本发明的抗体RVG-314的重链的DNA序列，其具体序列为：
SEQ ID NO：10表示编码本发明的抗体RVG-314的轻链的DNA序列，其具体序列为：
Claims (15)
1.一种全人源抗狂犬病毒的单克隆中和抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链包含轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中：
(1)所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；或
(2)所述HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1-3经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而获得的氨基酸序列，且分别与SEQ ID NO：1-3功能相同；或
(3)所述HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO：1-3具有80％以上同一性；并且
(4)所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO：5所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；或
(5)所述LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：4-6经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而获得的氨基酸序列，且分别与SEQ ID NO：4-6功能相同；或
(6)所述LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO：4-6具有80％以上同一性。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中重链互补决定区HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；重链互补决定区HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；重链互补决定区HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；轻链互补决定区LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；轻链互补决定区LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；轻链互补决定区LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；或者，所述抗体的重链的氨基酸序列为SEQ ID NO：7经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而获得的氨基酸序列，且与SEQ ID NO：7功能相同；或者，所述抗体的重链的氨基酸序列与SEQ ID NO：7具有80％以上同一性；并且
所述抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；或者，所述抗体的轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO：8经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而获得的氨基酸序列，且与SEQ IDNO：8功能相同；或者，所述抗体的轻链的氨基酸序列与SEQ ID NO：8具有80％以上同一性。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包括人源与非人源抗体。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段和/或单链抗体。
6.一种分离的DNA，所述DNA包含编码权利要求1-5中任一项的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列；优选地，所述DNA包含SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。
7.一种表达载体，所述表达载体包含权利要求6的DNA。
8.根据权利要求7所述的表达载体，包括质粒、噬菌粒、柯斯质粒、人工染色体、噬菌体、动物病毒；优选地，所述表达载体为环状质粒；更优选地，所述表达载体为pcDNA3.3。
9.一种宿主细胞，其包含权利要求6的DNA或权利要求7或8的表达载体。
10.根据权利要求9所述的宿主细胞，包括原核细胞、HEK293细胞、真菌细胞、COS细胞、CHO细胞、BHK细胞、昆虫细胞或人细胞的动物细胞；优选地，所述宿主细胞是哺乳动物细胞；更优选地，所述宿主细胞为HEK 293i细胞。
11.一种检测狂犬病毒的装置，包括权利要求1-5中任一项的抗体或其抗原结合片段。
12.根据权利要求11所述的装置，所述装置为试纸、试剂盒或芯片。
13.一种药物组合物，其包含权利要求1-5中任一项的抗体或其抗原结合片段以及可药用的载体。
14.权利要求1-5中任一项的抗体或其抗原结合片段在制备用于检测狂犬病毒的装置中的用途；优选地，所述装置包括但不限于试纸、试剂盒或芯片。
15.权利要求1-5中任一项的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗由狂犬病毒感染引起的疾病的药物制剂中的用途；优选地，所述疾病是狂犬病。
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|---|---|---|---|---|
| CN117683123A (zh) * | 2023-09-15 | 2024-03-12 | 东普安凤(北京)生物技术有限公司 | 抗狂犬病毒人源化抗体和抗体组合及其用途 |
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| CN117683123A (zh) * | 2023-09-15 | 2024-03-12 | 东普安凤(北京)生物技术有限公司 | 抗狂犬病毒人源化抗体和抗体组合及其用途 |
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