WO2019128119A1 - 一种针对破伤风毒素的全人源单克隆中和抗体及其应用 - Google Patents

一种针对破伤风毒素的全人源单克隆中和抗体及其应用 Download PDF

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廖化新
王月明
袁晓辉
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珠海泰诺麦博生物技术有限公司
广州泰诺迪生物科技有限公司
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1282—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Clostridium (G)
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    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies

Abstract

一种针对破伤风毒素的全人源单克隆中和抗体。通过高通量全人源单克隆抗体研发综合技术平台开发出了全人源抗破伤风毒素中和抗体。所述中和抗体具有高亲和力、强特异性，可用于破伤风感染的预防和治疗。

Description

一种针对破伤风毒素的全人源单克隆中和抗体及其应用
本申请要求于2017年12月29日提交中国专利局、申请号为2017114867326、发明名称为“一种针对破伤风毒素的全人源单克隆中和抗体及其应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种针对破伤风毒素的全人源单克隆中和抗体及其应用。
背景技术
破伤风毒素是破伤风杆菌产生的一种神经蛋白质毒素，通过抑制性神经递质的释放，引起超反射反应和横纹肌痉挛；可导致患者全身性肌肉强直性痉挛，发展至严重者或因全身性衰竭及窒息而死亡，称之为破伤风。破伤风毒素是已知最毒的毒素之一,经纯化的破伤风毒素对小鼠的致死剂量为0.1ng/kg,对豚鼠的致死剂量为0.3ng/kg，推测对人的致死剂量为0.25ng/kg。破伤风毒素毒性极强，作用迅速。当患者感染破伤风后，体内存在大量破伤风杆菌和破伤风毒素，唯一有效的预防和治疗对策是及时注射抗破伤风毒素抗体，中和毒素使其失活并通过抗体受体的介导将毒素从体内清除。
目前市场上的抗破伤风毒素的抗体仅有马源破伤风外毒素(Tetanus antitoxin,TAT)和破伤风人血免疫球蛋白(Human tetanusimmunoglobulin,HTIG)，但临床应用都各有弊端。近年来有一些关于发明和制备人-鼠嵌合或人源/全人源抗破伤风毒素单克隆专利和文献。这些抗体虽能与破伤风毒素结合，但中和毒素的效价不高，且抗体的产业化生产问题尚未解决，均处于实验室研究或临床研究，还没有一种治疗性中和性抗体获批进入临床试验阶段。
高闻达等在申请号为201510363366.X的国内发明专利中公开了一种全人源抗破伤风毒素单克隆抗体,该抗体是由人的外周血细胞为材料与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0细胞融合后获得的抗破伤风毒素单克隆抗体；该发明表明未经工艺优化的CHO细胞的产量达到1-1.2g/L，经流加等工艺优化可达到2-5g/L；而且其效价约为0.2IU/0.5ug，即超过400IU/mg。该工作虽然显示在动物实验部分描述了毒素中和活性和小鼠存活的数据，但是并没有其他功能性试验数据和相关后续研 究报道。
因此，利用更先进的技术，寻找更加高效的、安全的抗破伤风毒素单克隆抗体在本领域中具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种安全的、高效的且特异性的针对破伤风毒素的全人源单克隆抗体，并揭示其示其可变区序列，更具体为其互补决定区(CDR)序列。
本发明的目的之二在于提供上述单克隆抗体的结合物、偶联物、试剂盒或药物组合物。
本发明的目的之三在于提供上述单克隆抗体的应用。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种针对破伤风毒素的全人源单克隆抗体，所述单克隆抗体具有重链可变区和/或轻链可变区：
所述重链可变区包括CDR1、CDR2、CDR3；
重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸；或与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列；
重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸；或与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列；
重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸；或与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列；
所述轻链可变区包括CDR1、CDR2、CDR3；
轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸；或与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列；
轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；或者经取代、缺失 或添加一个或多个氨基酸；或与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列；
轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸；或与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列。
在本发明的具体实施方案中，重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；
轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
进一步，所述重链可变区的序列如SEQ ID NO:7所示，或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸；或与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列；
进一步，所述轻链可变区的序列如SEQ ID NO:8所示，或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸；或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列。
在本发明的具体实施方案中，所述重链可变区的序列如SEQ ID NO:7所示，所述轻链可变区的序列如SEQ ID NO:8所示。
优选的，本发明的所述单克隆抗体，其重链类型为IgG1、IgG2、IgG3或Ig4。更优选为IgG1。
优选的，本发明所述单克隆抗体，其轻链类型为κ或λ。
本发明所述的单克隆抗体不仅包括可变区，还包括恒定区。
优选的，本发明所述的单克隆抗体的恒定区为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的任意一种。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种编码前面所述的单克隆抗体的DNA分子。
可以利用本领域任一已知的方法得到DNA分子序列，例如，如果已知抗体的核苷酸序列，就可以从化学合成的寡核苷酸装配出编码所述抗体的DNA分子序列。
或者，可以从来自合适来源的核酸中产生编码抗体的DNA分子。如果无法得到含有编码特定抗体的DNA分子的克隆，但已知所述抗体分子的序列，那么可以通过化学合成得到编码所述免疫球蛋白的DNA分子，或利用与所述序列的3’和5’末端可杂交的合成引物从合适的来源通过PCR扩增得到编码所述免疫球蛋白的DNA分子，或通过利用特异于所述特定基因序列的寡核苷酸探针通过克隆得到编码所述免疫球蛋白的DNA分子，以例如从cDNA文库中鉴定出编码所述抗体的cDNA克隆。然后可以利用本领域任一熟知的方法将PCR所产生的扩增DNA分子克隆到可复制的克隆载体内。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种表达载体，包括前面所述的DNA分子。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞经由前面所述的表达载体转化或转染而来。
可用于本发明的宿主细胞包括但不限于微生物，例如经含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；经含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母菌例如酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia))；经含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；经重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒(CaMV)；烟草花叶病毒(TMV)感染的或经含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或携带含有来源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或来源于哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BHK、293、3T3细胞)。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种结合物，包含与化学标记或生 物标记共价连接的前面所述的单克隆抗体。
优选的，所述化学标记为同位素标记、免疫毒素标记和/或化学药物标记；所述生物标记为生物素标记、亲和素标记或酶标记。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种偶联物，其由前面所述的单克隆抗体和/或前面所述的结合物与固体介质或半固体介质偶联形成。
固体介质或半固体介质的实例，如，酶标板、磁性或非磁性免疫微球或免疫颗粒，细胞分离介质，所述细胞分离介质的实例，如聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅，多聚糖和泛影酸钠或其衍生物。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种药物组合物，包括前面所述的免疫有效量单克隆抗体、和/或前面所述的结合物、和/或前面所述的偶联物。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种试剂盒，包括前面所述的诊断有效量单克隆抗体、和/或前面所述的结合物、和/或前面所述的偶联物。
根据本发明的又一个方面，前面所述的单克隆抗体和/或前面所述的结合物和/或前面所述的偶联物在制备破伤风毒素或破伤风梭菌感染检测产品中的应用。
优选地，所述检测产品是试剂盒、酶标板、或芯片。
根据本发明的又一个方面，前面所述的单克隆抗体和/或前面所述的结合物和/或前面所述的偶联物在制备预防破伤风梭菌感染引起的疾病药物中的用途。
根据本发明的又一个方面，所述的单克隆抗体和/或前面所述的结合物和/或前面所述的偶联物在制备治疗破伤风梭菌感染引起的疾病药物中的用途。
根据本发明的又一个方面，所述的单克隆抗体和/或前面所述的结合物和/或前面所述的偶联物在制备破伤风梭菌感染的诊断试剂中的用途。
在本发明的其它方面中，还提供了一种抗破伤风毒素单克隆抗体，其中所述抗体可变区的基因和蛋白质序列的同系物或修饰物；同系物为抗体可变区的蛋白序列，其同系性达到上述序列的60％或以上、70％或以上、80％或以上；修饰物为对所述抗体的氨基酸或其核酸序列通过取代、增加或截短进行改变的产物仍旧保留中和破伤风毒素的能力。
本发明还提供了一种检测破伤风毒素或破伤风梭菌感染的方法，所述方法包 括如下步骤:
(1)提取含有破伤风毒素或破伤风梭菌感染的样品；
(2)将步骤(1)的样品与本发明的单克隆抗体、或本发明的结合物、或本发明的偶联物接触；
(3)检测抗原抗体的免疫反应。
本文所用的术语“单克隆抗体”指从一类基本均一的群体获得的抗体，除少数可能存在的天然发生的突变外，该群体中包含的单个抗体是相同的。修饰语“单克隆”仅表示抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不能解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
本文所用的术语“单克隆抗体”不仅包括完整的免疫球蛋白，还包括单克隆抗体的免疫学活性部分，包括但不限于Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)和包括VL或VH结构域的单域抗体。包括单链抗体在内的结合抗原的抗体片段可以包括单独的可变区或与以下的全部或一部分组合的可变区：绞链区、CH1、CH2和CH3结构域；术语“单克隆抗体”还包括抗原结合片段，其包括可变区与绞链区、CH1、CH2和CH3结构域的任一组合。
本文所述的“样品”涵盖了多种样品类型，包括生物学来源的血液及其它体液样品，实体组织样品如活检组织样品或者组织培养物，或者衍生自其中的细胞或者其后代。该术语还包括在获得后已经通过任何方式处理的样品，例如用试剂处理、溶解、或者富集某些成分如蛋白质或者多核苷酸。该术语涵盖了得自任何物种的各种临床样品，也包括培养的细胞、细胞上清和细胞溶解产物。
本发明优点和有益效果如下：
本发明通过高通量全人源单克隆抗体研发综合技术平台开发出了特异性的全人源抗破伤风毒素中和抗体。
本发明的中和抗体与破伤风毒素具有极强的亲和力和结合活性，安全且高效。
本发明研发的全人源抗破伤风毒素中和抗体能够用于破伤风梭菌感染的预防和治疗。
附图说明
图1显示利用SDS-PAGE和Western blot检测TRN0010抗体表达纯化的电泳图，其中，A：SDS-PAGE；B：Western blot；
图2显示利用ELISA检测TRN0010抗体的结合活性的结果图；
图3显示TRN0010抗体的亲和性检测结果图；
图4显示TRN0010抗体对动物保护作用的结果图。
具体实施方式
本发明不限于本文所述的特定方法学、方案、细胞系、载体或试剂，因为这些是可以变化的。另外，本文所用术语只是为了描述特定的实施方案而无限制本发明的范围之意。
除非另外限定，则本文所用的所有技术和学术术语和任何缩写均具有与本领域技术人员普遍理解的含义相同的含义。尽管在实施本发明时可以使用与本文所述相似或相同的任何方法和材料，但本文还是描述了使用设备和材料。
实施例1 全人源抗破伤风毒素中和抗体的制备
1、分选细胞
一名健康志愿者注射1500IU破伤风类毒素(疫苗)，于第7天采集血液样本。然后分离单个核细胞(PBMC)；然后用BD FACSria流式细胞仪从PBMC分选出浆细胞，将形态完好的单个细胞置于96孔PCR板中，使每个孔含有一个记忆性B细胞，-80℃冰箱保存备用。
2、分离抗体可变区基因
将含有单个B细胞的96孔板加入0.5μM的各亚型重链与轻链的恒定区引物与Superscript III反转录酶，37℃孵育1小时；按以下参数进行PCR扩增：95℃15min；95℃1min，55℃1min，72℃1min，30cycles；72℃10min；4℃5min。产物cDNA-20℃保存。
以上述cDNA和相应引物为模板，PCR扩增抗破伤风毒素全人源抗体基因。
(1)PCR体系和参数设置如下：
Figure PCTCN2018090489-appb-000001
Figure PCTCN2018090489-appb-000002
PCR参数设置：预变性94℃5min，然后进行35个PCR循环，每个循环为：94℃×30s，55℃×30s，72℃×50s，最后用72℃延伸7min。
(2)用1％的琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增结果，并与DNA分子量标记LD2000判断扩增片段的大小。结果显示：分别有23条兼并引物扩增出轻链可变区基因，有21条兼并引物扩增出重链可变区基因，其大小约为500-800bp，条带单一，与轻/重链可变区基因片段的理论大小基本一致。
3、抗破伤风毒素全人源单克隆抗体真核表达载体的构建
(1)分别将上述轻链/重链基因插入pcDNA3.3(+/-)表达载体(购自Invitrogen公司)的单克隆酶切位点，构建抗破伤风毒素全人源单克隆抗体的表达载体。
(2)用上述连接产物转化DH5α感受态细菌，在含有氨苄青霉素的平板上37℃培养过夜。
(3)挑取10个单菌落用特异性引物进行PCR，反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min40s，28个循环，最后72℃再延伸5min；
(4)取5μLPCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，在阳性转化子中鉴定出了含有抗体重链或轻链基因的转化子。
验证了本发明构建的抗破伤风毒素单抗重链/轻链的重组表达载体其序列正确。
4、破伤风痉挛毒素全人源单克隆抗体的表达和鉴定
利用DNA转染试剂盒PolyFect将抗破伤风毒素全人源抗体重链/轻链表达载体共转染293细胞，以未转染质粒的空细胞对照。培养96h后，采用常规ELISA法， 用HRP标记的羊抗人IgG抗破伤风毒素全人源抗体的表达及抗体对破伤风疫苗(抗原)的特异性识别。
结果显示，共转染表达质粒载体的293细胞成功表达全人源抗体，能有效识别破伤风疫苗(抗原)，而未转染表达质粒的293细胞培养上清不能识别破伤风疫苗(抗原)。即瞬时转染293成功表达了能特异性识别破伤风疫苗(抗原)的抗破伤风毒素全人源抗体。
5、破伤风毒素全人源单克隆抗体批量生产与纯化
将中和实验鉴定的有中和活性的编号为TRN0010抗体重链与轻链的表达载体(其中，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示)共转染293细胞，转染后6-8小时换新鲜培养基，并在37℃8％CO 2培养箱中培养96小时。收集转染上清，4000rpm离心1小时，利用蛋白(Protein)A亲和层析法进行纯化。利用SDS-PAGE和Western Blot实验检验抗体的表达及纯化情况，结果见图1，证实得到较纯蛋白，约180kD左右，并可清晰观察到解链后的抗体轻、重链，注：图1A和图1B的1泳道代表的未解链蛋白，图1A和图1B的2泳道代表的蛋白Marker，图1A和图1B的3泳道代表的解链蛋白。
实施例2 TRN0010抗体的结合活性检测
用前文提到的相同的ELISA方法对表达纯化的抗体的结合活性进行检测：以破伤风毒素为抗原，并用包被液将抗原10倍稀释后包被96孔ELISA板，每孔100μl4℃过夜包被，用封闭液常温封闭2个h。将依次按3倍稀释的TRN0010抗体作为一抗37℃孵育2h，用HRP/anti-His-tag(1:2000稀释)作为二抗37℃孵育1h，加入底物显色液100μl/孔，常温避光放置5min后，用2M硫酸中止反应，用450nm波长进行比色检测，分析结果。
结果如图2所示，把表达纯化的TRN0010抗体进行大于50,000倍稀释后(抗体浓度约为：0.0002μg/ml)，TRN0010抗体依然可以与抗原结合，具有极强的结合活性。
实施例3 TRN0010抗体的亲和性检测
先进行CM5芯片偶联捕获分子，再活化芯片的葡聚糖表面，以进样时间确定偶联量，最后利用CM5芯片捕获分子捕获配体：将制备的全人源抗破伤风中和抗体作为配体。破伤风类毒素用HBS-EP缓冲液稀释作为分析物，分析物以逐渐增高的浓度依次流过芯片，分别得到信号曲线。每个浓度作为1个循环，完成1次循环后用10mmol/L的甘氨酸－盐酸再生芯片以回复到原始未结合抗原的状态。用BiaCore X-100 System软件进行单抗与破伤风类毒素(抗原)结合的亲和力和动力学分析。
结果如图3和表1所示，全人源抗破伤风中和抗体的解离常数为1.53E-04/s,平衡常数达3.68E-09M，表明该抗体具有高亲和力的特性。
表1 全人源抗破伤风中和抗体的亲和力测定结果
ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
4.15E+04 1.53E-04 3.68E-09
实施例4 抗破伤风毒素单克隆抗体对动物的保护作用实验
(1)待检抗破伤风毒素单抗的稀释
用稀释液将待检单抗稀释成100μg/ml(单抗浓度＞1mg/ml)，即与毒素等量混合后每0.4ml注射量中单抗浓度为50μg/ml。
(2)标准抗毒素稀释：
标准抗毒素用生理盐水溶解液与中性甘油(经116℃10分钟高压蒸汽灭菌)等量混合，然后用稀释液稀释，使每ml含0.5IU(即5个IU/10)；即与毒素等量混合后每0.4ml注射量中含IU/10。标准抗毒素原液的一次吸取量不应少于0.5ml。
(3)毒素稀释：
自中检所购买的冻干粉状毒素应用生理盐水溶解液与中性甘油(经116℃10分钟高压蒸汽灭菌)等量混合，然后用稀释液稀释毒素至使用量。
(4)半数致死量的测定(LD50)
将配制好的毒素用稀释液依次稀释10 2、10 3、10 4、10 5、10 6、10 7，每个稀释度至少稀释2ml，取0.2ml注射小鼠，每组4只。观察5天。根据实验结果计算出LD50， 实验组使用20倍于LD50量。
(5)单抗效价测定
混合定量吸取已稀释之标准抗破伤风毒素及不同稀释度之待检单抗分别装入小试管中，每管加入等量之稀释试验毒素，混合均匀，加塞，37℃结合1小时，立即注射。
取健康实验小白鼠28只，每组4只，分为7组。将上述中混合物分别皮下注射体重为18～22g小白鼠腹部，每只注射0.4ml(阴性对照组包括0.2ml毒素+0.2ml硼酸盐缓冲盐水；阳性对照组包括0.2ml毒素+0.2ml抗风毒素；实验组包括0.2ml毒素+0.2ml单抗)。每日上、下午各观察一次，连续一周，记录小白鼠发病与死亡情况。
结果：结果如图4所示，阴性对照小白鼠于48小时之内全部死亡，单抗浓度不超过1.85μg/mL的低剂量实验组的小鼠于96小时内也全部死亡，而阳性实验组和中、高浓度剂量(5.56μg/ml、16.67μg/ml、50μg/ml)的三个实验组的小鼠直到168小时时仍然全部存活。由于标准抗毒素的效价为10IU/ml，故可判定本发明的抗破伤风毒素单抗的效价为10IU/ml(抗体浓度为5.56μg/mL，即5.56mg/L)。
本发明的单抗剂量超过5.56μg/mL时，与标准抗毒素的效价(10IU/ml)相当，能有效地保护动物防御致死剂量破伤风毒素的攻击，与标准抗毒素的保护性基本一致。并且，本发明单抗的实际用量远低于标准抗毒素，这表明其(约0.556ug/IU)效果比标准抗毒素更佳。
虽然以上仅描述了本发明的具体实施方式范例，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更或修改均落入本发明的保护范围。
工业实用性
本发明提供了一种针对破伤风毒素的全人源单克隆中和抗体及其应用，本发明的中和抗体与破伤风毒素具有极强的亲和力和结合活性，安全且高效。本发明研发的全人源抗破伤风毒素中和抗体能够用于破伤风梭菌感染的预防和治疗，具有很强的工业实用性。
Figure PCTCN2018090489-appb-000003
Figure PCTCN2018090489-appb-000004
Figure PCTCN2018090489-appb-000005
Figure PCTCN2018090489-appb-000006

Claims (10)

  1. 一种针对破伤风毒素的全人源单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体具有重链可变区和/或轻链可变区：
    所述重链可变区包括CDR1、CDR2、CDR3；
    重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸；或与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列；
    重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸；或与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列；
    重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸；或与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列；
    所述轻链可变区包括CDR1、CDR2、CDR3；
    轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸；或与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列；
    轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸；或与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列；
    轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸；或与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列。
  2. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述重链可变区的序列如SEQ ID NO:7所示，或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸；或与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列；所述轻链可变区的序列如SEQ ID NO:8所示，或者经取代、缺失或添加一 个或多个氨基酸；或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列。
  3. 一种编码权利要求1或2所述的单克隆抗体的DNA分子。
  4. 一种表达载体，包括权利要求3所述的DNA分子。
  5. 一种宿主细胞，所述宿主细胞经由权利要求4所述的表达载体转化或转染而来。
  6. 一种结合物，包含与化学标记或生物标记共价连接的权利要求1或2所述的单克隆抗体。
  7. 一种偶联物，其由权利要求1或2所述的单克隆抗体和/或权利要求6所述的结合物与固体介质或半固体介质偶联形成。
  8. 一种药物组合物或试剂盒，包括权利要求1或2所述的单克隆抗体、和/或权利要求6所述的结合物、和/或权利要求7所述的偶联物。
  9. 权利要求1或2所述的单克隆抗体和/或权利要求6所述的结合物和/或权利要求7所述的偶联物在制备破伤风毒素或破伤风梭菌感染检测产品中的应用。
  10. 权利要求1或2所述的单克隆抗体和/或权利要求6所述的结合物和/或权利要求7所述的偶联物在制备预防和/或治疗破伤风梭菌感染引起的疾病的药物制剂中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022082918A1 (zh) * 2020-10-21 2022-04-28 北京智仁美博生物科技有限公司 针对破伤风毒素的抗体及其用途

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3733699A4 (en) * 2017-12-29 2022-06-08 Zhuhai Trinomab Biotechnology Co., Ltd. FULLY HUMANIZED MONOCLONAL NEUTRALIZING ANTIBODY FOR TETANUS TOXIN AND ITS APPLICATION
CN111848791B (zh) * 2020-08-25 2021-12-21 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种抗破伤风毒素的全人源中和抗体及应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0257195A (ja) * 1988-08-19 1990-02-26 Morinaga & Co Ltd 抗破傷風毒素ヒト型モノクローナル抗体、それを利用した破傷風毒素中和剤及びヒト型モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ
EP0562132A1 (en) * 1992-03-23 1993-09-29 SCHWEIZERISCHES SERUM- & IMPFINSTITUT BERN Monoclonal anti-tetanus toxin antibodies and pharmaceutical compositions containing them
CN1634991A (zh) * 2003-12-30 2005-07-06 龚小迪 人源抗破伤风毒素单克隆抗体及其制备方法和用途
KR100624011B1 (ko) * 2005-04-20 2006-09-19 주식회사 녹십자 항-파상풍 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마세포주
CN102206275A (zh) * 2011-04-27 2011-10-05 上海生物制品研究所 抗破伤风毒素单克隆中和抗体，其组合物及其用途
CN102875674A (zh) * 2011-10-27 2013-01-16 成都蓉生药业有限责任公司 一种抗破伤风毒素抗体及其制备方法和用途
CN105153305A (zh) * 2015-06-26 2015-12-16 安泰吉（北京）生物技术有限公司 一种全人源抗破伤风毒素单克隆抗体及其衍生物制备方法和应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101220096B (zh) * 2003-12-30 2010-09-29 龚小迪 人源抗破伤风毒素单克隆抗体的制备和应用
CN105542004B (zh) * 2016-01-12 2019-02-19 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种抗破伤风毒素的中和性单克隆抗体及其应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0257195A (ja) * 1988-08-19 1990-02-26 Morinaga & Co Ltd 抗破傷風毒素ヒト型モノクローナル抗体、それを利用した破傷風毒素中和剤及びヒト型モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ
EP0562132A1 (en) * 1992-03-23 1993-09-29 SCHWEIZERISCHES SERUM- & IMPFINSTITUT BERN Monoclonal anti-tetanus toxin antibodies and pharmaceutical compositions containing them
CN1634991A (zh) * 2003-12-30 2005-07-06 龚小迪 人源抗破伤风毒素单克隆抗体及其制备方法和用途
KR100624011B1 (ko) * 2005-04-20 2006-09-19 주식회사 녹십자 항-파상풍 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마세포주
CN102206275A (zh) * 2011-04-27 2011-10-05 上海生物制品研究所 抗破伤风毒素单克隆中和抗体，其组合物及其用途
CN102875674A (zh) * 2011-10-27 2013-01-16 成都蓉生药业有限责任公司 一种抗破伤风毒素抗体及其制备方法和用途
CN105153305A (zh) * 2015-06-26 2015-12-16 安泰吉（北京）生物技术有限公司 一种全人源抗破伤风毒素单克隆抗体及其衍生物制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MEIJER, P. J.: "AY867397.1: Homo sapiens clone 136g09 anti-tetanus toxoid immunoglobulin light chain variable region (IGL@) mRNA, partial cds", NCBI GENBANK, 26 July 2016 (2016-07-26), XP55623032 *
MEIJER, P. J.: "Isolation of Human Antibody Repertoires with Preservation of the Natural Heavy and Light Chain Pairing", J.MOL. BIOL., vol. 358, no. 3, 2 March 2006 (2006-03-02), pages 764 - 772, XP024950964, doi:10.1016/j.jmb.2006.02.040 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022082918A1 (zh) * 2020-10-21 2022-04-28 北京智仁美博生物科技有限公司 针对破伤风毒素的抗体及其用途

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