BR112019022702A2 - gama de anticorpos anti-interferon e utilizações dos mesmos. - Google Patents

Abstract

o invento descrito apresenta uma gama de anticorpos anti-interferon e utilizações dos mesmos, o qual faz a explanação de um anticorpo anti- ifn-¿, bem como uma composição compreendendo o anticorpo e uma aplicação farmacêutica do anticorpo no tratamento da síndrome mediada por ifn-¿.

Description

“GAMA DE ANTICORPOS ANTI-INTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS”.

PEDIDOS RELACIONADOS

001 O presente pedido reivindica prioridade no pedido provisório dos Estados Unidos com o número de identificação 62/501,952 datado de 5 de maio de 2017,o qual é aqui incorporado para referências para todos os fins.

CAMPO TÉCNICO

002 A divulgação presente refere-se a novos anticorpos recombinantes ou qualquer fragmento de ligação ao antígeno, as quais são direcionadas contra a gama interferon (IFN-γ). A divulgação presente também se refere ao uso dos anticorpos e fragmentos das ligações de antígenos referidos acima na melhoria, tratamento ou prevenção de doenças IFN-γ intermediada.

DESCRIÇÃO DA ARTE RELACIONADA

003 Gama interferon (IFN- γ) é uma citocina que desempenha uma função importante no âmbito de imunidade inata e imunidade adaptativa. É conhecido neste meio que (IFN-γ) está relacionado com inflamações e doenças auto-inflamatórias. Por exemplo, Kine Edvardsen divulgou que células T específicas para 21 OH auto-reativas produzem uma grande quantidade de IFN-γ e as mesmas também estão presentes em pacientes com a doença de Addison (J Interferon Cytokine Res. 2015 Oct 1; 35(10): 759770). Bisping G concluiu que pacientes com doenças intestinais inflamatórias, mesmo em _estado inativo, exercem uma capacidade elevada de indução de IFN-γ em linfócitos CD8+ mediados por células epiteliais intestinais (Clin Exp Immunol. 2001 Jan;123(l):15-22.).

004 Em contraste com a função pró-inflamatória, em certas situações a expressão de IFN-γ pode acabar suprimindo as atividades de células T no organismo. Por exemplo, Benci JL mostrou que a sinalização de IFN-γ tumoral poderia regular uma um sistema de resistência multigênica ao

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2/49 imunizar o ponto de verificação (Cell, 2016, Dec 167:1540-1554). Os dados que eles apresentaram indicaram que bloqueios ou neutralizações de IFN-γ poderiam melhorar a função de subconjuntos esgotados de células T. Portanto, neutralizando agentes anti- IFN-γ, é possível aumentar a imunidade das células T.

005 Em razão das aplicações farmacêuticas de agentes anti- IFN-γ para tratamento de doenças relacionadas com inflamações, há uma necessidade constante de anti- IFN-γ anticorpos úteis para aplicações industriais e farmacêuticas.

SUMÁRIO

006 Um dos objetivos desta divulgação é fornecer um novo anticorpo e uma nova composição derivados de IFN-γ, usando os mesmos como agentes de neutralização para atividades de interferon-γ, outro objetivo da divulgação é fornecer uma composição farmacêutica para tratamentos de síndromes relacionadas com IFN-γ através da criação de anticorpos.

007 Para cumprir os objetivos mencionados acima, a divulgação fornece um anticorpo isolado que consiste em: V_H CDR1 possuindo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID N°: 120, 123, 126, 129, 144, 147, 150, ou 153; V_H CDR2 com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 121, 124, 127, 130, 145, 148, 151, ou 154; V_H CDR3 com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 122, 125, 128, 131, 146, 149, 152, ou 155; V_L CDR1 com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 132, 135, 138, 141, 156, 158, 160, ou 162; V_L CDR2 com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 133, 136, 139, 142, 157, 159, 161, ou 163; e V_L CDR3 possuindo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 134, 137, 140, ou 143.

008 A tese apresentada também fornece um anticorpo isolado que especificamente liga-se ao mesmo epítopo do anticorpo no qual foi mencionado acima, em algumas ligações o anticorpo possui características de ligações ao epítopo como descrito abaixo e em outras partes deste documento.

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009 A tese divulgada fornece um anticorpo isolado, o mesmo anticorpo se liga especificamente com um ou mais resíduos de aminoácidos, podem ser eles 30-52, 36-48, 78-92 ou 82-92 de IFN-γ humano, os aminoácidos caracterizados como 30-52 compreendem os aminoácidos da SEQ ID N°: 167, aminos ácidos caracterizados como 36-48 compreendem os aminoácidos da SEQ ID N°: 171, os que são caracterizados como 78-92 compreendem os aminoácidos da SEQ ID N°: 168 e os que são caracterizados como 82-92 compreendem os aminoácidos da SEQ ID N°: 172.

010 A divulgação presente também fornece outro tipo de anticorpo isolado, o mesmo se liga especificamente com um ou mais resíduos de aminoácidos, sendo eles caracterizados como 36-48 e 82-92 de IFN-γ humano, os aminos ácidos caracterizados como 36-48 compreendem os aminoácidos da SEQ ID N°: 171 e aqueles caracterizados como 82-92 compreendem os aminoácidos da SEQ ID N°: 172.

011 A tese divulgada também fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente em um epítopo de IFN-γ humano, o epítopo é composto por K43, Q48 e K86 de IFN-γ humano; este IFN-γ humano compreende os aminoácidos da SEQ ID N°: 166.

012 A reivindicação apresenta um polinucleotídeo isolado que codifica o anticorpo isolado que foi mencionado acima, em algumas ligações o polinucleotídeo isolado codifica um anticorpo que é referido como V_H CDRl que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 120, 123, 126, 129, 144, 147, 150 ou 153; V_H CDR2 compreende uma sequência selecionada de aminoácidos de SEQ ID N°: 121, 124, 127, 130, 145, 148, 151, ou 154; V_H CDR3 compreende uma sequência selecionada de aminoácidos de SEQ ID N°: 122, 125, 128, 131, 146, 149, 152 ou 155; V_L CDRl compreende uma sequência selecionada de aminoácidos de SEQ ID N°: 132, 135, 138, 141, 156, 158, 160, ou 162; V_L CDR2 compreende uma sequência selecionada de aminoácidos de SEQ ID N°: 133, 136, 139, 142, 157, 159, 161 ou 163; e V_L

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CDR3 compreende uma sequência selecionada de aminoácidos de SEQ ID N°: 134, 137,140 ou 143.

013 Em algumas ligações o polinucleotídeo isolado compreende a primeira sequência com pelo menos 90% de identidade com SEQ ID N°: 173, 175, 176, 177, 179 ou 181 codificando o V_H do anticorpo e a segunda sequência é compreendida com pelo menos 90% de identidade com SEQ ID N°: 174, 178, 180 ou 182 codificando o V_L do anticorpo.

014 A tese divulgada apresenta um vetor capaz de compreender o polinucleotídeo citado.

015 A tese divulgada também apresenta uma célula hospedeira isolada capaz de compreendem o vetor mencionado.

016 A tese divulgada fornece uma célula hospedeira que expressa o anticorpo isolado, no qual foi mencionado acima.

017 A tese divulgada também fornece uma composição capaz de neutralizar a atividade do interferon- γ, compreendendo o anticorpo isolado mencionado.

018 A tese divulgada fornece uma composição capaz de tratar uma síndrome de IFN- γ com uma quantidade eficaz do anticorpo isolado e um transportador farmaceuticamente aceitável.

019 A tese divulgada menciona também outro método para síndromes relacionadas com IFN- γ, administrando uma quantidade eficaz de um anticorpo isolado.

020 A tese divulgada apresenta métodos para detecção de interferon- γ em algum ambiente, são eles; (A) aplicando o anticorpo mencionado acima no ambiente; (B) encubando o ambiente com um anticorpo anti-IgG com a presença de medidores e (C) analisando os resultados nos medidores.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

021 A Figura 1 mostra os resultados da digestão de PNGase F do anticorpo 2A6 no exemplo 1. representa um grupo não tratado

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5/ 49 e “+” representa um grupo tratado com PNGase F, as setas indicam as mudanças após o uso deste tratamento.

022 A Figura 2 apresenta os resultados da análise SDS-PAGE do anticorpo 2A6, 2A6_A e 2A6_Q no exemplo 1.

023 A Figura 3 mostra as curvas obtidas com a passagem de diferentes concentrações de IFN- γ recombinante humano (0; 0,625; 1,25; 2,5; 5, 10 Nm) em relação ao MAbs de IFN- γ imobilizados por biosensores de AHC no exemplo 2.

024 A Figura 4 mostra as curvas de ligações obtidas pela passagem de diferentes concentrações de IFN- γ recombinante humano (0; 0,625; 1,25; 2,5; 5, 10, 20 Nm) em relação ao MAbs de IFN- γ imobilizados por biosensores de AHC no exemplo 2. AMG811 é um anti IFN- γ anticorpo descrito na U.S. PAT. N° 7,335,743 e foi preparado como citado anteriormente, o controle Ab é um anticorpo de controle de isotipo IgGl humano (Bio X cell; BP0297).

025 A Figura 5 mostra a presença de HLA-DR induzida por IFN- γ pode ser inibida de maneira dependente e eficaz pelos anticorpos até aqui mencionados.

026 A Figura 6 mostra o resultado de ELISA no exemplo 2, representando a afinidade das ligações de IFN- γ dos anticorpos citados.

027 A Figura 7 mostra o resultado de ELISA no exemplo 3, representando a afinidade das ligações de IFN- γ humano dos anticorpos citados (R&D systems 285-IF-100).

028 A Figura 8 mostra o resultado de ELISA no exemplo 3, representando a afinidade das ligações de IFN- γ do macaco Rhesus Cynomolgus e seus anticorpos.

029 A Figura 9 exibe as atividades neutralizantes dos anticorpos em IFN- γ.

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030 A Figura 10 mostra a inibição da produção de CXCL9 em todo o sangue por meio dos anticorpos (anti IFN- γ) apresentados no exemplo 3.

031 A Figura 11 mostra a inibição da produção de CXCL10 em todo o sangue por meio dos anticorpos (anti- IFN- γ) apresentados no exemplo 3.

032 A Figura 12 ilustra o efeito inibitório dos anticorpos em HLA-DR induzido por IFN- γ.

033 A Figura 13 ilustra o efeito inibitório dos anticorpos em PD-L1 induzido por IFN- γ.

034 A Figura 14 mostra os resultados das experiências de escaneamento de epítopos realizadas no exemplo 4.

DESCRIÇÃO DETALHADA

035 Para as descrições aqui contidas e as reivindicações anexadas, as formas singulares incluem também referências no plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Por exemplo, a referência “uma proteína” inclui mais de uma proteína e a referência “um composto” refere-se a mais de um composto. O uso das palavras “compreende”, “compreendem”, “compreendendo”, “inclui”, “incluem” e “incluindo” são intercambiáveis e não pretendem de ser limitativas. Deve ser entendido que muitos influenciadores do assunto usam o termo “compreendendo”, este termo pode ser compreendido por aqueles que dominam o assunto de algumas maneiras específicas, isto pode ser descrito como “consistido essencialmente de” ou “consistindo de”.

036 Onde uma diversidade de valores é fornecida, ao menos que o contexto expresse claramente o contrário, é entendido que cada número inteiro intermediário do valor e cada décimo de cada número inteiro interveniente do valor, ao menos que o contexto indique claramente o contrário, entre os limites superiores, inferiores, qualquer valor declarado e qualquer valor interveniente, os resultados são abrangidos pela invenção. Os limites superiores e

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7/ 49 inferiores destes intervalos menores podem ser incluídos independentemente e também estão incluídos na invenção, eles podem ser sujeitos a qualquer exclusão. Os estados possíveis incluem um ou dois limites, excluindo (i) ou (ii) ambos dos limites incluídos estão presentes na invenção. Por exemplo, “1 até 50”, inclui “2 até 25”, “5 até 20”, “25 até 50”, “1 até 10” e etc.

037 Todas as publicações, patentes, aplicações de patentes e outros documentos que falam sobre este assunto nesta divulgação são produzidos por referências para todos os fins, todas as publicações, patentes, aplicações de patentes e outros documentos foram individualmente indicados por referências para serem incorporados aqui.

038 Deve ser entendido que tanto as descrições gerais acima, os desenhos e as descrições detalhadas a seguir são exemplares explicativos e não são exclusivos desta divulgação.

039 Os termos técnicos e científicos usados nas descrições terão significados comumente entendidos por um conhecedor do conteúdo, ao menos que seja definido especificamente o contrário.

040 O termo “anticorpo”, como referido aqui, inclui anticorpos intactos, qualquer fragmento de composição ao antígeno (isto é, porção de composição ao antígeno) e cadeias únicas. Um “anticorpo” refere-se a uma glicoproteína, na qual compreende ao menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L), as quais são interligadas por ligações de dissulfeto ou pela porção de composição ao antígeno. Cada cadeia pesada é composta por uma região variável de cadeias pesadas (abreviada aqui como; V_H) e por uma região constante de cadeias pesadas, a região constante de cadeias pesadas é composta por três dominantes, CHI, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é composta por uma região variável de cadeias leves (abreviada aqui como; V_L) e uma região constante de cadeias leves, a região constante de cadeias leves é composta por um dominante CL. As regiões V_H e V_L podem ser dividas em regiões de hipervariabilidade, determinando regiões (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas como regiões (FR). Cada V_H e V_L são

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8/49 compostos por três CDRs e quatro FRs, arranjados do terminal amino para o terminal carbônico na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contém uma composição dominante que interage com um anticorpo. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar ligações de imunoglobulina para tecidos ou fatores necessários, incluindo várias células do sistema imunológico (isto é: células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema complementar clássico.

041 As extensões das regiões-quadros e CDRs são definidas de acordo com Kabat (see, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991) e pelas pesquisas da ImMunoGeneTics (IMGT) (see, Lefranc, Nucleic Acids Res 29:207-9, 2001; and online at imgt.cines.fr/IMGT_vquest/vquest?livret=0&Option=humanIg).

042 O “sistema Kabat” significa no contexto desta divulgação, o padrão de numeração dos resíduos em uma maneira constante, de acordo com Kabat (1991; Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit., NIH publication no. 91-3242U.S. Department of Health and Human services) e Chothia (1991; Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit., NIH publication no. 91-3242U.S. Department of Health and Human services). Este sistema de numeração é amplamente utilizado por indivíduos qualificados, este sistema é baseado na variabilidade sequencial e em três rotações dimensionais da variabilidade dominante das regiões que são importantes na atividade de ligações dos antígenos. Todos os resíduos das cadeias leves ou pesadas tem posições distintas no sistema de Kabat; isto é, o sistema de Kabat funciona nos CDRs assim como nas regiões-quadros, as posições de resíduos específicos de qualquer anticorpo podem ser numeradas de acordo com o sistema Kabat, as regras para identificar as regiões CDR de cadeias V_H e V_L de acordo com o sistema Kabat são encontradas em www. bioinf org. uldabs.

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043 O sistema único de numeração IMGT é uma alternativa para o sistema Kabat, no qual permite comparar a variação dominante independente do antígeno receptor, o tipo de cadeia ou a espécie [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997)/Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999)/Lefranc, M.-P., Pommié, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. No sistema único de numeração IMGT, aminoácidos conservados tem sempre as mesmas posições, por exemplo, cysteine 23 (Ist-CYS), tryptophan 41 (CONSERVED-TRP), hydrophobic amino acid 89, cysteine 104 (2nd-CYS), phenylalanine ou tryptophan 118 (J-PHE ou J-TRP). O sistema único de numeração IMGT fornece uma delimitação padronizada das regiões das estruturas (FR1-IMGT: posições 1 até 26, FR2-IMGT: 39 até 55, FR3-IMGT: 66 até 104 e FR4-IMGT: 118 até 128) e das regiões complementares determinadas: CDR1-IMGT: 27 até 38, CDR2-IMGT: 56 até 65 e CDR3-IMGT: 105 até 117. As lacunas representam posições desocupadas, os cumprimentos CFR-IMGT (apresentados entre parênteses e separados por ponto, exemplo, [8.8.13]) possuindo informações cruciais. O sistema único de numeração IMGT é usado em representações gráficas em 2D, produzido como IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immuno genetics, 53, 857-883 (2002)/Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)] e também em estruturas 3D em IMGT/3Dstrucuture-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)].

044 O termo “fragmento de composição ao antígeno” é referido aqui como um fragmento de anticorpo, como por exemplo, um anticorpo, um Fab, um Fab’, a F(ab’)₂, um fragmento F_v, um fragmento F_v estabilizado com dissulfeto (dsF_v), (DSF_V)₂, um bi-específico dsF_v (dsF_vdsF_v’), um anticorpo estabilizado com dissulfeto (anticorpo ds), uma molécula de anticorpo de cadeia única (scF_v), um interruptor scF_v (anticorpo bicovalente), um anticorpo multi-específico formado da porção de um anticorpo que compreende um ou mais CDRs ou qualquer outro fragmento de anticorpo

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10/49 que se liga em algum antígeno, porém não compreende uma estrutura de anticorpo completamente. Um fragmento de composição ao antígeno é capaz de se ligar ao mesmo antígeno do progenitor ou em fragmentos do anticorpo parental (por exemplo, ligações parentais scF_v). Em certas ligações, um fragmento de composição ao antígeno pode compreender um ou mais CDRs de um anticorpo humano que se encontra em regiões estruturais.

045 Entre os fragmentos de ligações ao antígeno acima, um Fab, na qual é uma estrutura que possui regiões variáveis de cadeias leves e cadeias pesadas, a região constante de cadeia leve, a primeira região constante de cadeia pesada (CHI) e também um lado para composição ao antígeno. Fab’ difere-se de Fab, pois Fab’ possui uma região dobradiça que inclui ao menos um resíduo de cisteína no terminal-C da cadeia pesada CHI. F(ab’)₂ é produzida quando resíduos de cisteína estão presentes na região dobradiça em Fab’ e são unidas por um vínculo de dissulfeto.

046 Um F_v é um fragmento mínimo de anticorpo, que possui somente regiões variáveis de cadeias pesadas e regiões variáveis de cadeias leves, uma técnica recombinante para a produzir o fragmento F_v é bem conhecido. “Anticorpo F_v de cadeia única” ou “scF_v” refere-se um anticorpo manipulado que consiste de uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada conectadas diretamente entre sí ou via uma sequência de ligações peptídicas. F_v com duas cadeias podem ter estruturas que possuem regiões variáveis de cadeias pesadas ligadas com regiões também variáveis de cadeias leves através de uma composição não covalente. Uma cadeia singular geralmente forma uma estrutura parecida com um diamante, assim como em cadeias duplas de F_v, onde regiões variáveis de cadeias pesadas são ligadas covalentemente em regiões variáveis de cadeias leves via uma composição peptídica ou regiões variáveis leves e pesadas são diretamente ligadas entre sí nos terminais-C. A composição peptídica incluí qualquer aminoácido, de 1 até 100 ou 2 até 50 e sequências apropriadas.

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047 O fragmento de composição ao antígeno pode ser obtido usando uma prótese (por exemplo, um anticorpo inteiro pode ser digerido com papaína para obter fragmentos Fab ou podem ser digeridos com pepsina para obter fragmentos F(ab’)₂) ^e podem ser preparados por técnicas de recombinações genéticas.

048 Um “anticorpo isolado”, como aqui citado, é referido como um anticorpo no qual é substancialmente livre de outros anticorpos, possuindo diferentes especificidades antigênicas (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente com IFN-γ é substancialmente livre de anticorpos que são especificamente ligados com outros antígenos diferentes de IFN-γ). Um anticorpo isolado que se liga especificamente com IFN-γ pode, entretanto, ter uma reatividade cruzada com outros antígenos ou até mesmo com moléculas IFN-γ de outras espécies. Além disto, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outros materiais celulares ou químicos.

049 Os termos “anticorpo monoclonal” ou “composição de anticorpo monoclonal” como citado aqui, se refere a preparação de moléculas de anticorpos de composições moleculares homogêneas, uma composição de anticorpo monoclonal possui apenas uma especialidade de composição e afinidade para um epítopo específico.

050 O termo “anticorpo humano”, como citado aqui, possui anticorpos os quais tem regiões variáveis em cada região estrutural e regiões CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana. Além disto, se o anticorpo contém uma região constante, esta região constante será também derivada de sequências de imunoglobulina germinativa. Os anticorpos humanos desta divulgação podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina germinativa (por exemplo; introdução de mutações aleatórias, mutagênese especifica em vitro ou por mutações somáticas em vivo). Entretanto, o termo “anticorpo humano”, como citado aqui, não incluí anticorpos sequenciais de CDR derivados da linha

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12/49 germinativa de outras espécies de mamíferos, como os ratos, os quais são usados para testes de sequências estruturais humanas.

051 O termo “anticorpo monoclonal humano” se refere aos anticorpos que exibem uma especificidade única de composição, o qual possui regiões variáveis em que as regiões estruturais e as regiões CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana.

052 O termo “anticorpo humano recombinante, como citado anteriormente, incluí todos os anticorpos humanos que são preparados, expressados, criados ou isolados por situações de recombinação, assim como, (a) anticorpos isolados de um animal (por exemplo; um rato) que é transgênico ou transcromossômico para genes de imunoglobulina humana ou uma preparação de hibridoma (descrita mais precisamente abaixo), (b) anticorpos isolados de uma célula hospedeira são transformados para expressar anticorpos humanos, por exemplo; transfectoma, (c) anticorpos isolados de recombinantes e combinatórias possibilidades de anticorpos humanos e (d) anticorpos preparados, expressados, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva emenda de sequências de genes de imunoglobulina humana para outras sequências de DNA. Anticorpos humanos recombinantes tem regiões variáveis, em que a estrutura e as regiões CDR são derivadas de sequências de genes de imunoglobulina humana. Em certas ligações, entretanto, ligações de anticorpos humanos podem ser sujeitos a mutações genéticas vitro (ou, quando um animal transgênico para humanos com sequências Ig é usado em mutações genéticas somáticas vivo) além disto, as regiões de sequências de aminoácidos V_H e V_L de anticorpos humanos recombinantes são sequências que, enquanto derivadas de e relacionadas com sequências de genes humanos V_H e V_L, podem não existir naturalmente dentro do repertório da linha germinativa de anticorpos humanos em vivo.

053 O termo “anticorpo humanizado” é referido como um anticorpo no qual é gerado de uma espécie não humana e compreende sequências de proteínas que veem sido modificadas para aumentar as suas

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13/49 similaridades com as variações de anticorpos produzidos naturalmente em humanos. O processo de humanização poderia ser necessário para evitar efeitos imunogênicos indesejados quando aplicando um anticorpo de origem não humana em um humano. Em comparação, o termo “anticorpo quimérico” é referido como um anticorpo feito em meio da fusão da região de composição ao antígeno (por exemplo; V_H e V_L) de uma espécie com o domínio constante de outro.

054 O termo “K_assoc” ou “K_a” se refere a associação de uma interação de antígeno-anticorpo particular, o termo “K_dis” ou “K_d” se refere a distociação de uma interação de antígeno-anticorpo, o termo “K_D” refere-se mais especificamente com a distociação constante, as quais são obtidas de K_d para K_a (por exemplo; K_d/K_a) e o mesmo é expresso como uma contração molar (M). Os valores de K_D para anticorpos podem ser determinados com o uso de métodos apropriadamente estabelecidos.

055 Um “epítopo” se refere a uma porção de um antígeno reconhecido e ligado a um anticorpo específico, o qual determina a especialidade antigênica do anticorpo. Epítopo é também conhecido como um determinante antigênico, epítopos podem ser dominantes específicos ou uma combinação de dominantes IFN-γ humano. Em algumas ligações, os dominantes específicos ou a combinação de dominantes são de IFN-γ humanos que compreendem os aminoácidos SEQ ID N°: 166.

056 Em uma composição, IFN-γ compreende SEQ ID N°: 166 e o anticorpo que se liga especificamente com um ou mais resíduos de aminoácidos caracterizados por 30-52 ou 36-48 de SEQ ID N°: 166 e aminoácidos 78-92 ou 82-92 de SEQ ID N°: 166. Em uma composição específica, o anticorpo se liga especificamente com IFN-γ nos aminoácidos 30-52 e aminoácidos 78-92 de SEQ ID N°: 166, particularmente nesta composição, os aminoácidos 30-52 e os aminoácidos 78-92 de SEQ ID N°: 166 formam o epítopo do anticorpo já citado anteriormente. Em outra composição o anticorpo se liga especificamente com o IFN-γ nos aminoácidos 36-48 e aminoácidos 82

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14/49 de SEQ ID N°: 166, nesta composição, os aminoácidos mencionados formam também o epítopo do anticorpo.

057 Um anticorpo que “se liga especificamente com IFN-γ” se refere a um anticorpo que se liga com um IFN-γ que possui ligações de valor K_d menor de que l^x10“⁸ M, menor de que l^x10“⁹ M, menor de que l^x10’¹⁰, menor de que 1 ^x10^-11 ou até mesmo valores menores.

O PRIMEIRO ASPECTO DA PRESENTE

DIVULGAÇÃO

058 No primeiro aspecto presente na divulgação, um anticorpo isolado ou qualquer porção de composição ao antígeno é produzida, estes anticorpos isolados ou porções de composição aos antígenos compreendem: (a). V_H CDR1 compreende uma sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 120, 123, 129, 144, 147, 150, ou 153;

(b) . V_H CDR2 compreende uma sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 121, 124, 127, 130, 145, 148, 151 ou 154;

(c) . V_H CDR3 compreende uma sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 122, 125, 131, 146, 149, 152, ou 155;

(d) . V_L CDR1 compreende uma sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 132, 135, 138, 141, 156, 158, 160 ou 162;

(e) . V_L CDR2 compreende uma sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 133, 136, 139, 142, 157, 159, 161 ou 163;

(f) . V_L CDR3 compreende uma sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 134, 137, 140 ou 143.

059 Em uma composição específica, um anticorpo 2A6 é produzido, então, V_H CDR1, V_H CDR2 e V_H CDR3 compreendem, respectivamente; SEQ ID N°: 120, SEQ ID N°: 121 e SEQ ID N°: 122, já V_L CDR1, V_L CDR2 e Vl CDR3 logo compreendem, respectivamente; SEQ ID N°: 132, SEQ ID N°: 133 e SEQ ID N°: 134. Alternativamente, V_H CDR1, V_H CDR2 e V_H CDR3 podem compreender este mesmo anticorpo com sequência de aminoácidos, respectivamente; SEQ ID N°: 144, SEQ ID N°: 145 e SEQ ID

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N°:146, enquanto Vl CDR1, V_L CDR2 e Vl CDR3 podem compreender, respectivamente; SEQ ID N°: 156, SEQ ID N°: 157 e SEQ ID N°: 134.

060 Em uma composição específica, um anticorpo 2B6 é produzido, então, V_H CDR1, V_H CDR2 e V_H CDR3 compreendem, respectivamente; SEQ ID N°: 123, SEQ ID N°: 124 e SEQ ID N°: 125, já V_L CDR1, V_L CDR2 e Vl CDR3 logo compreendem, respectivamente; SEQ ID N°: 135, SEQ ID N°: 136 e SEQ ID N°: 137. Alternativamente, V_H CDR1, V_H CDR2 e V_H CDR3 podem compreender este mesmo anticorpo com sequência de aminoácidos, respectivamente; SEQ ID N°: 147, SEQ ID N°: 148 e SEQ ID N°:149, enquanto V_L CDR1, V_L CDR2 e V_L CDR3 podem compreender, respectivamente; SEQ ID N°: 158, SEQ ID N°: 159 e SEQ ID N°: 137.

061 Em uma composição específica, um anticorpo 1E8 é produzido, então, V_H CDR1, V_H CDR2 e V_H CDR3 compreendem, respectivamente; SEQ ID N°: 126, SEQ ID N°: 127 e SEQ ID N°: 128, já V_L CDR1, V_L CDR2 e Vl CDR3 logo compreendem, respectivamente; SEQ ID N°: 138, SEQ ID N°: 139 e SEQ ID N°: 140. Alternativamente, V_H CDR1, V_H CDR2 e V_H CDR3 podem compreender este mesmo anticorpo com sequência de aminoácidos, respectivamente; SEQ ID N°: 150, SEQ ID N°: 151 e SEQ ID N°:152, enquanto V_L CDR1, V_L CDR2 e V_L CDR3 podem compreender, respectivamente; SEQ ID N°: 160, SEQ ID N°: 161 e SEQ ID N°: 140.

062 Em uma composição específica, um anticorpo 2F2 é produzido, então, V_H CDR1, V_H CDR2 e V_H CDR3 compreendem, respectivamente; SEQ ID N°: 129, SEQ ID N°: 130 e SEQ ID N°: 131, já V_L CDR1, V_L CDR2 e Vl CDR3 logo compreendem, respectivamente; SEQ ID N°: 141, SEQ ID N°: 142 e SEQ ID N°: 143. Alternativamente, V_H CDR1, V_H CDR2 e V_H CDR3 podem compreender este mesmo anticorpo com sequência de aminoácidos, respectivamente; SEQ ID N°: 153, SEQ ID N°: 154 e SEQ ID N°:155, enquanto V_L CDR1, V_L CDR2 e V_L CDR3 podem compreender, respectivamente; SEQ ID N°: 162, SEQ ID N°: 163 e SEQ ID N°: 143.

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063 Em uma composição específica, um anticorpo AB é produzido (“AB” compreende V_H CDRs de 2A6 e V_L CDRs de 2B6 e é também conhecido como “VH2A6/VL2B6”). Então, V_H CDR1, V_H CDR2 e V_H CDR3 compreendem, respectivamente; SEQ ID N°: 120, SEQ ID N°: 121 e SEQ ID N°: 122, já V_L CDR1, V_L CDR2 e V_L CDR3 logo compreendem, respectivamente; SEQ ID N°: 135, SEQ ID N°: 136 e SEQ ID N°: 137. Alternativamente, V_H CDR1, V_H CDR2 e V_H CDR3 podem compreender este mesmo anticorpo com sequência de aminoácidos, respectivamente; SEQ ID N°: 144, SEQ ID N°: 145 e SEQ ID N°:146, enquanto V_L CDR1, V_L CDR2 e V_L CDR3 podem compreender, respectivamente; SEQ ID N°: 158, SEQ ID N°: 159 eSEQIDN⁰: 137.

064 Em uma composição específica, um anticorpo BA é produzido (“BA” compreende V_H CDRs de 2B6 e V_L CDRs de 2A6 e é também conhecido como “VH2B6/VL2A6”). Então, V_H CDR1, V_H CDR2 e V_H CDR3 compreendem, respectivamente; SEQ ID N°: 123, SEQ ID N°: 124 e SEQ ID N°: 125, já V_L CDR1, V_L CDR2 e V_L CDR3 logo compreendem, respectivamente; SEQ ID N°: 132, SEQ ID N°: 133 e SEQ ID N°: 134. Alternativamente, V_H CDR1, V_H CDR2 e V_H CDR3 podem compreender este mesmo anticorpo com sequência de aminoácidos, respectivamente; SEQ ID N°: 147, SEQ ID N°: 148 e SEQ ID N°:149, enquanto V_L CDR1, V_L CDR2 e V_L CDR3 podem compreender, respectivamente; SEQ ID N°: 156, SEQ ID N°: 157 eSEQIDN⁰: 134.

065 Em algumas ligações, um anticorpo isolado ou um fragmento de composição ao antígeno são produzidos, compreendendo V_H CDRs e V_L CDRs que possuem qualquer sequência de aminoácidos as quais já foram citadas aqui, ainda mais, uma região V_H possui pelo menos 90% de identidade com SEQ ID N°: 109. 110, 111, ou 112 e uma região V_L possui pelo menos 90% de identidade com SEQ ID N°: 113, 114, 115 ou 116, em outras ligações estes valores de identificação podem chegar até 95%, 98% ou 99%.

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066 Em algumas ligações, um anticorpo isolado capaz de compreender cadeias leves e pesadas, em algumas ligações, as cadeias pesadas compreendem sequências V_H que possuem uma identidade de 90% com SEQ ID N°: 109, 110, 111 ou 112, já as cadeias leves nas regiões sequenciais V_L possuem uma identidade de 90% com SEQ ID N°: 113, 114, 115 ou 116. Em outras ligações, estes valores de identificação podem chegar até 95%, 98% ou 99%.

067 Em algumas ligações, um anticorpo que compreende CDRs de anticorpos 2A6, uma região sequencial V_H que possui pelo menos 90% de identidade com SEQ ID N°: 109 e uma região sequencial V_L que possui ao menos 90% de identidade com SEQ ID N°: 113 é produzido, em outras ligações estes valores podem aumentar para 95%, 98% ou para 99%.

068 Em uma composição mais específica, um anticorpo que compreende CDRs de anticorpos 2B6, uma região sequencial de V_H que possui pelo menos 90% de identidade com SEQ ID N°: 110 e uma região sequencial V_L que possui ao menos 90% de identidade com SEQ ID N° 114 é produzido, em outras ligações estes valores podem aumentar para 95%, 98% ou para 99%.

069 Em uma composição específica, um anticorpo que compreende CDRs de anticorpos 1E8, uma região sequencial de V_H que possui pelo menos 90% de identidade com SEQ ID N°: 111 e uma região sequencial V_L que possui ao menos 90% de identidade com SEQ ID N° 115 é produzido, em outras ligações estes valores podem aumentar para 95%, 98% ou para 99%.

070 Em uma composição específica, um anticorpo que compreende CDRs de anticorpos 2F2, uma região sequencial de V_H que possui pelo menos 90% de identidade com SEQ ID N°: 112 e uma região sequencial V_L que possui ao menos 90% de identidade com SEQ ID N° 116 é produzido, em outras ligações estes valores podem aumentar para 95%, 98% ou para 99%.

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071 Em uma composição específica, um anticorpo que compreende CDRs de anticorpos AB, uma região sequencial de V_H que possui pelo menos 90% de identidade com SEQ ID N°: 109 e uma região sequencial V_L que possui ao menos 90% de identidade com SEQ ID N° 114 é produzido, em outras ligações estes valores podem aumentar para 95%, 98% ou para 99%.

072 Em uma composição específica, um anticorpo que compreende CDRs de anticorpos BA, uma região sequencial de V_H que possui pelo menos 90% de identidade com SEQ ID N°: 110 e uma região sequencial V_L que possui ao menos 90% de identidade com SEQ ID N° 113 é produzido, em outras ligações estes valores podem aumentar para 95%, 98% ou para 99%.

073 Em outro tipo de composição de anticorpos, estes anticorpos são modificados para que não compreendam uma composição de glicosilação em uma região. Por exemplo, em certas ligações estes anticorpos são modificados por mutações no aminoácido asparagina, o qual se encontra na posição 76 (N76) da região V_H. Em uma composição, o aminoácido N76 pode sofrer mutações para os seguintes; alanine, arginine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glutamine, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, ou valine. Em outra composição, o aminoácido que se encontra na posição 76 (N76) modificado por mutações na região V_H, sofre mutações de alanine (A) ou glutamine (Q).

074 Em uma composição particular de um anticorpo que não compreende ligações N em locais de glicosilação, a divulgação apresenta anticorpos 2A6_A e 2A6_Q, onde N76 das cadeias pesadas sofrem mutações respectivamente para alanine e glutamine. De acordo com outro tipo de composição existente, um anticorpo isolado “2A6_Q” na região V_H compreende uma sequência que possui ao menos 90% de identidade com SEQ ID N°: 164, onde o aminoácido da posição 76 é A ou SEQ ID N°: 165, onde o aminoácido da

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19/49 posição 76 é Q, enquanto V_L compreende uma sequência que possui ao menos 90% de identidade com SEQ ID N° 113. Em outras ligações estes valores podem aumentar para 95%, 98% ou para 99%.

075 Em outra composição, o anticorpo isolado se liga especificamente em IFN-γ humano com um valor de composição K_D de menor de que 1 ^x10“⁸ M, menor de que 1 ^x10“⁹ M, menor de que l^x10“¹⁰ M, menor de que l^x10^-11 M ou até menos. Estes valores da composição K_D de IFN-γ são obtidos por uma análise de interferometria de bio-camadas.

076 Em outra composição, o anticorpo isolado mencionado inibe atividades de IFN-γ humano em IC₅₀ que possui valores menores de que 50 ng/mL, menores de que 25 ng/mL ou menores de que 10 ng/Ml. Estes valores de IC₅₀ são obtidos por uma análise de expressão HLA-DR.

077 O anticorpo mencionado na divulgação pode ter uma reatividade de cruzamento entre espécies, por conta disto, se torna muito conveniente o uso destes experimentos em várias ocasiões ou para pesquisas em animais diferentes. Por exemplo, em certas ligações o anticorpo pode reagir a cruzamentos de IFN-γ de mamíferos diferentes, como humanos, macacos Rhesus ou macacos Cynomolgus.

078 Os anticorpos isolados (exemplo; 2A6, 2B6, 2A6_A, 2A6_Q, 1E8, 2F2, AB, BA ou fragmento de ligações ao antígeno) mais complexamente compreendem características de ligações mais especificas, como a composição de um epítopo de IFN-γ humano o qual compreende uma ou mais sequências de aminoácidos de IFN-γ humano de SEQ ID N°: 166. Em outra composição, o anticorpo pode especificamente ligar um epítopo que compreende os aminoácidos 30-52 e 78-92 de IFN-γ humano, enquanto em outra composição, este anticorpo faz a mesma coisa, porém compreendendo aminoácidos 36-48 e 82-92 de IFN-γ humano.

O SEGUNDO ASPECTO DA PRESENTE DIVULGAÇÃO

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079 No segundo aspecto da presente divulgação, outro anticorpo isolado é fornecido, este anticorpo se liga especificamente também com o mesmo epítopo que o anticorpo do primeiro aspecto.

080 Em uma composição em particular, o anticorpo se liga especificamente com um ou mais resíduos de aminoácidos caracterizados em 30-52 ou 78-92 de IFN-γ humano, onde os aminoácidos 30-52 compreendem SEQ ID N°: 167 e os aminoácidos 78-92 compreendem SEQ ID N°: 168. Em outra composição o anticorpo se liga especificamente com um ou mais resíduos de aminoácidos caracterizados em 36-48 e 82-92 de IFN-γ humano, onde os aminoácidos 36-48 compreendem SEQ ID N°: 171 e os aminoácidos 82-92 compreendem SEQ ID N°: 172.

081 Em uma composição alternativa, o epítopo mencionado compreende K43, Q48, e K86 de IFN-γ humano, onde este IFN-γ humano compreende SEQ ID N°: 166. Já em outra composição, o epítopo compreende K37, E38, K43, Q46, Q48, K86 e R89 de IFN-γ humano, onde este IFN-γ humano compreende SEQ ID N°: 166.

O TERCEIRO ASPECTO DA PRESENTE DIVULGAÇÃO

082 No terceiro aspecto da divulgação, um polinucleotídeo capaz de decodificar um anticorpo é fornecido, este polinucleotídeo decodifica os anticorpos citados no primeiro e segundo aspecto da divulgação. Em uma composição em particular, este polinucleotídeo decodifica anticorpos 2A6, 2A6_A, 2A6_Q, 2B6, 1E8, 2F2, AB ou BA. Por exemplo, em algumas ligações, o polinucleotídeo isolado decodifica um anticorpo, o qual compreende um V_H CDR1 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 120, 123, 126, 129, 144, 147, 150 ou 153; V_H CDR2 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 121, 124, 127, 130, 145, 148, 151 ou 154; V_H CDR3 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 122, 125, 128, 131, 146, 149, 152, ou 155; V_L CDR1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionados de SEQ ID N°: 132,

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135, 138, 141, 156, 158, 160, ou 162; V_L CDR2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionados de SEQ ID N°: 133, 136, 139, 142, 157, 159, 161, ou 163; e V_L CDR3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionados de SEQ ID N°: 134, 137, 140, ou 143.

083 Em uma composição em particular, o polinucleotídeo mencionado decodifica o anticorpo 2A6, o qual possui ao menos 90% de identidade com SEQ ID N°: 173 e SEQ ID N: 174. Em uma composição em particular, o polinucleotídeo mencionado decodifica o anticorpo 2A6_A, o qual possui ao menos 90% de identidade com SEQ ID N°: 175 e SEQ ID N: 174. Em uma composição em particular, o polinucleotídeo mencionado decodifica o anticorpo 2A6_Q, o qual possui ao menos 90% de identidade com SEQ ID N°: 176 e SEQ ID N: 174. Em uma composição em particular, o polinucleotídeo mencionado decodifica o anticorpo 2B6, o qual possui ao menos 90% de identidade com SEQ ID N°: 177 e SEQ ID N: 178. Em uma composição em particular, o polinucleotídeo mencionado decodifica o anticorpo 1E8, o qual possui ao menos 90% de identidade com SEQ ID N°: 179 e SEQ ID N: 180. Em uma composição em particular, o polinucleotídeo mencionado decodifica o anticorpo 2F2, o qual possui ao menos 90% de identidade com SEQ ID N°: 181 e SEQ ID N: 182. Em uma composição em particular, o polinucleotídeo mencionado decodifica o anticorpo AB, o qual possui ao menos 90% de identidade com SEQ ID N°: 173 e SEQ ID N: 178. Em uma composição em particular, o polinucleotídeo mencionado decodifica o anticorpo BA, o qual possui ao menos 90% de identidade com SEQ ID N°: 174 e SEQ ID N: 177. Em outras ligações, estes valores de identidade podem aumentar para 95%, 98% até 99%.

084 Em outra composição, o polinucleotídeo compreende uma sequência de polinucleotídeos que compreendem um ou mais códons selecionados de uma expressão optimizada de um anticorpo em uma célula em mamíferos. Esta é outra maneira de melhorar a precisão e eficiência do produto. Em uma composição particular, estas células mamíferas são Chinese

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Hamster Ovary (CHO), NSO cell, Baby Hamster Kidney (BHK) SP2/0 cell, HEK 293 cell, HEK293 EBNA cell, PER.C6® cell, e COS cell.

QUARTO ASPECTO DA PRESENTE DIVULGAÇÃO

085 No quarto aspecto da divulgação, um vetor e uma célula hospedeira isolada são fornecidos, este vetor compreende os polinucleotídeos que foram citados no terceiro aspecto e é produzido para ser carregado ou expresso em qualquer tipo de células hospedeiras, assim então, os anticorpos podem ser produzidos, enquanto a célula hospedeira mencionada é selecionada do grupo que consiste de E.coli, insetos, leveduras ou células de mamíferos.

O QUINTO ASPECTO DA PRESENTE DIVULGAÇÃO

086 No quinto aspecto da divulgação, uma composição capaz de compreender um anticorpo é fornecida, esta composição é usada para neutralizar atividades de IFN-γ in vivo ou in vitro. Em outra composição, esta composição é uma composição farmacêutica para o tratamento de uma síndrome relacionada com IFN-γ, esta “síndrome relacionada com IFNγ” abrange, mas não se limita a inflamação, síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS), artrite reumatoide incluindo artrite reumatoide juvenil, doenças inflamatórias do intestino incluindo colite ulcerosa e doença de Crohn, esclerose múltipla, doença de Addison, diabetes (Tipo I), epididimite, glomerulonefrite, doença de Graves, síndrome de Guillain-Barre, doença de Hashimoto, anemia hemolítica, lúpus eritematoso sistêmico (LES), lúpus nefrite, miastenia, miastenia gravis, pênfigo, psoriática, aterosclerose, resistência à eritropoietina, doença do enxerto versus hospedeiro, rejeição de transplante, lesão hepática induzida por hepatite, cirrose biliar, lesão hepática induzida por álcool incluindo cirrose alcoólica, febre reumática, sarcoidose, esclerodermia, síndrome de Sjogren, espondiloartropatias, espondilite anquilosante, doença de Kawasaki, doença do olho seco, linfo-histiocitose hemofagocítica, síndrome de

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23/49 ativação de macrófagos, tireoidite, vasculite e etc. O termo “síndrome de IFN-γ” também engloba qualquer condição médica associada com o aumento de nível de IFN-γ ou o aumento da sensibilidade de IFN-γ.

087 Em outra composição, a composição mencionada compreende o anticorpo mencionado, este anticorpo mencionado pode ser contido em uma quantidade efetiva para razões necessárias para a composição, esta quantidade efetiva se refere com a quantidade de cada agente aditivo necessário para atingir o efeito desejado (exemplo; o tratamento da síndrome de IFN-γ), mesmo sozinhos ou com a combinação de um ou mais agentes aditivos. Uma quantidade efetiva pode variar, isto depende da condição em que a composição está sendo tratada, a severidade da condição, os parâmetros individuais do paciente incluindo idade, condição física, tamanho, gênero, peso, duração do tratamento, o estado terapêutico (se tiver algum), a maneira de administração e fatores de conhecimento e experiência daquele que cuida do caso. Estes fatores são bem conhecidos e devem ser experimentos rotineiros. Geralmente, é preferível que uma dose máxima dos componentes individuais ou combinações sejam usadas, isto é, a dose mais segura de acordo com o julgo dos médicos, entretanto, os pacientes insistem em doses menores ou doses toleráveis por conta de razões médicas, razões psicológicas ou por outras razões.

088 Certas composições de anticorpos podem ser preparadas pela mistura de um anticorpo anti-IFN-γ, estas composições possuem um nível de pureza elevado, tipicamente, estas soluções são preparadas como soluções aquosas (see e.g., US Pat. No. 6,171,586, e W02006/044908) ou como uma formulação liofilizada (see e.g., US Pat. No. 6,267,958).

089 A utilidade de transportadores em composições de anticorpos pode ser de transportadores farmaceuticamente aceitáveis, os quais geralmente incluem, mas não sem limitam apenas em protetores, excipientes, estabilizadores, conservantes, solventes, camadas, agentes antibacterianos, agentes anti-fungos, agentes isotônicos e retardadores de absorção, sendo assim, eles são fisiologicamente compatíveis. De preferência, os transportadores devem

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24/49 ser adequados para administrações intravenosas, intramuscular, subcutânea, parentérica, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por meio de injeção ou infusão). Transportadores farmaceuticamente aceitáveis são geralmente não são tóxicos, com dosagens e concentrações bem avaliadas.

090 Uma alta quantidade de transportadores farmaceuticamente aceitáveis são conhecidos por (see e.g., Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). Exemplares aceitáveis farmaceuticamente usados nas composições de anticorpo podem incluir, porém não se limitam somente em; fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, como ácido ascórbico e metionina; conservantes (como octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium chloride; benzethonium chloride; phenol, butyl ou benzyl alcohol; alkyl,methyl ou propyl paraben ; catechol; resorcinol; cyclohexanol; 3-pentanol; e m- cresol); baixo peso molecular (menos de eu 10 resíduos), polipeptídeos; proteínas, como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo, glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açucares como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; formadores de sal contra íons, como sódio, complexos metálicos (por exemplo, complexos de proteína ZN); e/ou surfactantes não iônicos, como polietileno glicol (PEG).

091 Transportadores farmaceuticamente aceitáveis e úteis para as composições de anticorpos podem incluir também agentes de dispersão intersticial, como glicoproteínas de hialuronidade solúveis (SHASEGP) (see e.g., US Pat. Publ. Nos. 2005/0260186 e 2006/0104968), como glicoproteína de hialuronidade solúvel PH-20 (por exemplo, rHuPH20 or HYLENEX®, Baxter International, Inc.).

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092 A composição mencionada pode ainda incluir excipientes farmaceuticamente aceitáveis como, agentes desintegrantes, aglutinante, lubrificante, conservante ou uma combinação de todos eles.

O SEXTO ASPECTO DA PRESENTE DIVULGAÇÃO

093 No sexto aspecto da invenção, um método para o tratamento da síndrome de IFN-γ é fornecida, este método se baseia em administrar a quantidade de anticorpo necessária em certo ser, este ser pode ser um paciente (por exemplo, um humano) que sofre da síndrome de IFN-γ. A síndrome de IFN-γ pode ser descrita acima, porém, não se limita somente nas condições ou doenças mencionadas anteriormente. Em certas composições, os anticorpos são formulados por administração, assim como composições farmacêuticas, esta composição compreende um anticorpo, como descrito aqui e com um transportador farmaceuticamente aceitável. Qualquer dos transportadores farmaceuticamente aceitáveis são conhecidos por conta do uso de anticorpos que podem ser usados neste aspecto, incluindo, mas não se limitando apenas de água, PBS soluções salinas, gelatinas, óleos, álcool ou combinações de todos eles.

094 Está comtemplado de que qualquer método conhecido sobre administração de composições farmacêuticas que compreendem anticorpos pode ser usado para administrar estas composições. De acordo com algumas composições deste sexto aspecto, a administração mencionada é entrega de qualquer modo o anticorpo ao sujeito sistematicamente ou a um tecido alvo desejado. Administração sistemática geralmente se refere a qualquer modo de administração do anticorpo em algum sujeito que absorve o anticorpo em alguma área não desejada, como, algum tecido ou órgão, de modo que o anticorpo ou sua formulação entrem no sistema circulatório do sujeito e então, o metabolismo está sujeito a outros processos.

095 De acordo com os modos de administração usados nos métodos de tratamento podem incluir, porém não se limitam somente

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26/49 em infecções, infusões, instilações e inalações. Administração por injeções podem incluir administrações intravenosas, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intraventricular, intracapsular, intra-orbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, intravítrea, transtaqueal, subcutânea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnóide, intraespinal, intracerebro espinhal e infusões intraesternais.

096 O anticorpo mencionado pode ser administrado com uma carreira farmaceuticamente aceitável, esta carreira inclui, porém não se limita apenas em água, PBS, soluções salinas, gelatinas, óleos, álcool ou uma combinação deles.

O SÉTIMO ASPECTO DA PRESENTE DIVULGAÇÃO

097 No sétimo aspecto da divulgação, um método para detectar IFN-γ em um ambiente é fornecido, este método pode ser usado em um laboratório justamente para a detecção de existência de IFN-γ em algum ser, em outra composição, este mesmo método pode ser usado para medir a quantidade de IFN-γ em algum ser. Este método compreende (A) aplicando um anticorpo; (B) encubando o ambiente com um anticorpo anti-IgG; este anticorpo anti-IgG é conjugado através de uma tabela de detecção e (C) fazendo a analise final na tabela de detecção. Em uma composição específica, este método faz parte de Western Blot ou enzyme-linked immunosorent assay (ELISA). Em uma composição mais específica, o anticorpo anti-IgG é um anticorpo caracterizado como Fc-específico.

098 Em outra composição, o ambiente pode ser um recipiente, uma membrana ou um prato que possuem amostras. A tabela de detecção mencionada se refere a uma molécula conjugada com o anticorpo antiIFN-γ para fins de detecção. Esta tabela de detecção inclui, mas não se limita apenas em peroxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidade, etiquetas fluorescentes ou uma combinação dentre eles. Em uma composição específica, a tabela de detecção mencionada é uma peroxidase; e o método ainda compreende

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27/49 o ambiente encubado com uma solução (p-Nitrophenyl phosphate), enquanto em outra composição, uma solução TMB é usada após o passo (B) e antes do passo (C). Nesta composição em específico, por conta das reações das cores, o IFN-γ pode ser detectado e a quantidade pode ser descoberta pela observação em OD₄₀5.

EXEMPLOS

099 Várias características e composições estão ilustradas nos exemplos representativos a seguir, os quais são mostrados para serem ilustrativos e não limitadores de outras possibilidades. Aqueles que tem conhecimento sobre o assunto irão compreender que os exemplos são apenas para ilustrações e serão melhores explicados nas reivindicações que estão por vir, todas as composições e recursos descritos na aplicação devem ser entendidos como intercambiáveis e combináveis com todas as composições citadas até aqui.

0100 Exemplo 1. Preparação dos anticorpos recombinantes anti-IFN-γ.

0101 Isolamento de células humanas únicas tipo B, através de uma triagem de células ativada fluorescente.

0102 Amostras de sangue venoso foram coletadas de um paciente humano com micobractérias, após um consentimento do mesmo e de acordo com o Conselho de revisão dos protocolos (Institutional Review Bor ad (IRB)- reviewed protocolos). As células mononucleares foram isoladas das amostras de sangue venoso do paciente após sofrerem uma purificação através de Ficoll-Paque (GE Healthcare) e centrifugação de gradientes de densidade de acordo com as instruções. As células mononucleares foram ressuspensas em camundongos normais a 5% (Jackson ImmunoResearch) de soluções FACS (1% FBS, 2 mM EDTA, 0.1% NaN3 in PBS) com uma concentração de l^x10⁷ célula/ml e postas em gelo por 30 minutos. Enquanto isto, 20 microgramas/litro de anticorpos CD119 anti-humanos (BioLegend) foram adicionados nas células, então células de alíquotas (l^x10⁶) foram limpas com soluções FACS e 1 micro grama de proteína recombinante IFN-γ (sistemas R&D) com l^x10⁶ de células, permanecendo no gelo por 20 minutos, foi adicionado. Antes do

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28/49 processo de triagem, células foram mantidas no gelo com um anti-humano IgG PE (BD bio science), anti-humano (IgD APC (BD bio science), anti-humano CD3 PE-Cyanine7 (eBioscience), anti-humano CD19 APC-eFluor 780 (eBioscience), anti-humano IFN- γ FITC (BD Bioscience) e 7-Aminoactinomycin D (Sigma) como marcadores de DNA por 30 minutos. Células individuais B que se ligam com IFN- γ foram fechadas em CD19⁺IgG⁺CD3 IgD FITC⁺ e então classificadas por células individuais e separadas em um total de 96 pratos que contém 18 pL/cell de uma solução caracterizada como RT-lysis (esta solução possui 200 ng hexâmetro aleatório (Termo Científico), 1 pL de Dntp-mix (Termo Científico), 0,5% v/v Igepal CA-630 (Sigma) e 40U Riboblock (Fermentas)), obtendo assim uma mistura com um total de RNA de células singulares B. Os 96 pratos foram colados com durex de alumínio (Corning) e armazenados imediatamente em 80°C.

0103 RT-PCR de células singulares e amplificação do gene de imunoglobulina (Ig).

0104 Um cDNA foi sintetizado em um volume total de 20 pL/célula nos 96 pratos mencionados acima, os quais incluem 2 pL (50 U) Maxima H transparente reversa (Termo Científico) em água tratada com DEPC em cada recipiente. O total de RNA de cada célula B que se liga com IFN-γ foram submetidas em reações de transcrições reversas (RT), as quais foram feitas em 42°C durante 10 minutos em uma etapa de recozimento, em 25 °C durante 10 minutos em uma etapa de extensão de pré-primer, em 50°C durante 45 minutos em uma etapa de polimerização e em 85°C durante 5 minutos em uma etapa de inativação enzimática. O primeiro cDNA foi armazenado em -20°C.

0105 As transcrições dos genes IgH, IgÀ, IgK V de cada célula B foram amplificadas através de técnicas de PCR, em cada técnica de PCR, primeiro ocorre uma primeira rodada começando com uma quantidade de PCR de 2.5 pL nas primeiras amostras de cDNA que foram obtidas acima como modelo e então uma segunda rodada impurificada de PCR de 2.5 pL do que foi obtido na primeira rodada é coletada como amostra. Todas as reações de PCR

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29/49 foram produzidas em um volume total de 25 pL por reação, as quais contém 0.5 misturas de primers, os detalhes sobre estas misturas de primer estão listados na tabela 1 (veja a primer listing), 200 μΜ de cada dNTP (Termo Científico) e uma quantidade de 0.5 U de uma fusão de alta fidelidade de DNA polimerase (Termo Científico). Todas as reações PCR foram produzidas com água tratada DEPC, cada rodada (primeira e segunda) das reações de PCR foram produzidas em 35 ciclos em uma temperatura de 98°C durante 10 segundos em uma etapa de desnaturação, em uma temperatura de 65°C durante 15 segundos em uma etapa de recozimento e em uma temperatura de 72°C durante 30 segundos em uma etapa de alongamento.

0106 Tabela 1

Nested-PCR	Primers	IgH V gene	IgK V gene	IgÀV gene
Primeiro round	forward primers (SEQ ID N5s:)	1-13	24-31	40-51
reverse primers (SEQ ID N5s:)	63	65	67
Segundo round	forward primers (SEQ ID N5s:)	14-23	32-39	52-62
reverse primers fSEQ ID N5s:)	64	66	68

0107 Análise da sequência do gene Ig V

0108 Produtos das cadeias PCR de V_H, V_K e V_x de cada célula B (obtidos da segunda rodada de PCR mencionada acima) foram purificadas com um kit de purificação QIAquick PCR (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante e sequenciado com primers identificados por SEQ ID N°: 64, SEQ ID N°: 66 e SEQ ID N°: 69 respectivamente (veja primer listing). As sequências obtidas foram analisadas pela MGT®, the international ImMunoGeneTics information system® (http://www.imgy.org), para identificar segmentos de genes germinativos V(D)J com maiores identidades.

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0109 As sequências de aminoácidos das regiões de variação de cadeias pesadas (VH) e as regiões de variação de cadeias leves (V_L) são codificadas pelas sequências de genes Ig V que foram obtidas, as quais são mostradas e alinhadas umas com as outras na primer listing, na qual as regiões de estruturas e as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) são determinadas por IMGT ou pelo sistema de Kabat.

0110 Clonagem de vetor de expressão.

0111 Após sequenciar, os genes específicos de primer (veja primer listing) foram escolhidos de acordo com os segmentos de alta identidade V ou J (veja a tabela 2) para conduzir uma reação PCR mais aprimorada sob uma condição de reação semelhante à reação PCR que foi realizada anteriormente, em cada produto das cadeias V_H, V_K e ν_λ de células B (obtidos da segunda rodada de PCR mencionada acima) foram usados como modelos. Os produtos PCR obtidos foram purificados como descrito acima e clonados em vetores de expressão humana IgG]λ (gentilmente fornecido por Dr. Tse-Wen Chang in Academia Sinica, Taiwan) então, para obter as quatro expressões de vetores para os quatro anticorpos identificados “2A6”, “2B6”, “2F2”, e “1E8”.

0112 Tabela 2

Anticorpo	Cadeia VH	Cadeia VL
Forward primer / reverse primer (SEQ ID N°:)
2A6	70/80	102/106
2B6	70/80	102/106
2F2	70/83	96/106
1E8	75/80	100/106

0113 Além das quatro expressões de vetores acima, os vetores para a expressão de combinação da cadeia pesada 2A6 V_H e cadeia leve 2B6 V_L (designadas como VH2A6/VL2B6 e nomeadas como “AB”) e também outra combinação de cadeia pesada 2B6 V_H e cadeia leve 2A6 V_L (designadas como VH2B6/VL2A6 e nomeadas como “BA”) foram também produzidas.

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0114 0 DNA de V_H e V_L de AMG811 foram sintetizados através do uso de uma síntese gênica nomeada como GeneArt (Termo Fsher). O vetor para a expressão de AMG811 foi construído através do uso de clonagem com base em PCR, o qual foi mencionado acima.

0115 A recombinação foi realizada por GeneArt® Seamless Cloning and Assembly Enzyme Mix (Invitrogênio), E. coli competentes foram transformados em uma temperatura de 42°C com uma quantidade de 5 pL de produto recombinante. Colônias das transformações foram rastreadas pelo uso de PCR p!gGlK-screen+ (SEQ ID N°: 117) ou pIgGD-screen+ (SEQ ID N°: 118) como os de forward primer e plgGl-screen- (SEQ ID N°: 119) como os de reverse primer, respectivamente (veja primer listing). Produtos PCR de tamanhos esperados (mais ou menos 1,800 bps) foram sequenciados para a confirmação de identidade com produtos PCR originais. O DNA plasmídeo foi isolado através do uso de QIAprep® Spin columns (Qiagen) e 3 ml de natureza bacteriana do E. coli transformado por um processo que se define em uma cultivação durante 16 horas em uma temperatura de 37°C em um caldo de Luria-Bertani que contém 100 pg/mL de ampicilina.

0116 Produção de anticorpos recombinantes.

0117 Células FreeStyle™ 293-F (Termo Científico, R79007) foram produzidas em um frasco que continha 250 ml de uma expressão média FreeStyle™ 293 (Gibco, 12338018) sob condições de concentração de l^x10⁶ de células. Transfecção transitória das células FreeStyle™ 293-F em crescimento exponencial (l,5~2^x10⁶ células/ml) foram produzidas por polietilenimina linear (PEI) com um peso molecular em volta de 25 kDa (Polysciences, Warrington, Pa) como um reagente de transfecção e um total de 88 pg de DNA plasmídeo. Após a transfecção, as células foram cultivadas por 3 dias e então colhida. A média cultivação foi centrifugada por 10 minutos em uma velocidade de 3000 rotações por minuto para remover os detritos das células FreeStyle™ 293-F e depois disto, o resultado sobrenadante foi coletado e filtrado através de um filtro 0.45 pm.

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0118 Purificação de anticorpos recombinantes.

0119 0s resultados sobrenadantes que foram obtidos acima foram subsequentemente purificados com proteína A Sepharose Fast Flow beads (GE Healthcare, 17-1279-01) para que anticorpos recombinantes pudessem ser obtidos. Resumidamente, 80mL de sobrenadantes foram adicionados com 80pL de proteína A Sepharose Fast Flow beads e distribuídas uniformemente em dois tubos de 50-ml cada, os quais foram incubados durante 24 horas em uma temperatura de 4°C sob rotações. Então, os tubos foram centrifugados em uma velocidade de 3000 rotações por minuto durante 10 minutos e depois disto, os resultantes sobrenadantes foram removidos e as esferas foram equilibradas através do processo de PBS. As esferas equilibradas foram eluídas com 0.1 M de glicina (pH 3.0) e os eluatos coletados nos tubos continham 1 M Tris (pH 8.0) e assim foram dialisados contra PBS para a obtenção de anticorpos recombinantes.

0120 Para esclarecimento, os CDRs nas cadeias V_H e V_L de cada um dos anticorpos monoclonais estão resumidos na tabela 3 e tabela 4, respectivamente. CDRs foram identificados baseados em ambos sistemas (Sistema Kabat e Sistema IMGT) por sequência de anotações e por sequências de análises retiradas da internet.

0121 Tabela 3

Anticorpo	V„CDR1	V„ CDR2	V„ CDR3
2A6	I: GFTFSNYF (SEQ ID N°. 120)	I: ISGRTKYM (SEQ ID N°. 121)	I: VRGYDHSDSNSAADLLH (SEQ ID N°. 122)
K: GFTFSNYFIH (SEQ ID N°. 144)	K: TISGRTKYMFYSDSLRG (SEQ ID N°. 145)	K: GYDHSDSNSAADLLH (SEQ ID N°. 146)
2B6	I: GFPFSRYS (SEQ ID N°. 123)	I: MTSRTNHK (SEQ ID N°. 124)	I: ARGYDTSGSDSGVDFQY (SEQ ID N°. 125)
K: GFPFSRYSMH (SEQ ID N°. 147)	K: SMTSRTNHKYYADSLKG (SEQ ID N°. 148)	K: GYDTSGSDSGVDFQY (SEQ ID N°. 149)
1E8	I: GFTFSIYS (SEQ ID N°. 126)	I: ISGSGDNT (SEQ ID N°. 127)	I: AKSGRNIISPGFDS (SEQ ID N°. 128)

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	K: GFTFSIYSMN (SEQ ID N°. 150)	K: SISGSGDNTYYADSVKG (SEQ ID N°. 151)	K: SGRNISPGFDS (SEQ ID N°. 152)
2F2	I: GFNFSDYY (SEQ ID N°. 129)	I: ISNSGSHT (SEQ ID N°. 130)	I: ARDPSIMRGTYYMDV (SEQIDN0. 131)
K: GFNFSDYYMT (SEQ ID N°. 153)	K: YISNSGSHTYYADAVKG (SEQ ID N°. 154)	K: DPSIMRGTYYMDV (SEQ ID N°. 155)
VH2A6/	I: GFTFSNYF (SEQ ID N°. 120)	I: ISGRTKYM (SEQ ID N°. 121)	I: VRGYDHSDSNSAADLLH (SEQ ID N°.122)
VL2B6	K: GFTFSNYFIH (SEQ ID N°. 144)	K: TISGRTKYMFYSDSLRG (SEQ ID N°. 145)	K: GYDHSDSNSAADLLH (SEQ ID N°. 146)
VH2B6/	GFPFSRYS (SEQ ID N°. 123)	MTSRTNHK (SEQ ID N°. 124)	ARGYDTSGSDSGVDFQY (SEQ ID N°. 125)
VL2A6	K: GFPFSRYSMH (SEQ ID N°. 147)	K: SMTSRTNHKYYADSLKG (SEQ ID N°. 148)	K: GYDTSGSDSGVDFQY (SEQ ID N°. 149)

0122 Tabela 4

Anticorpo	VL CDR1	VL CDR2	VL CDR3
2A6	I: SGSVASHY (SEQ ID N°. 132)	I: EDS (SEQ ID N°. 133)	I: QSYYGNNQVL (SEQ ID N°. 134)
K: VRSSGSVASHYVQ (SEQ ID N°. 156)	K: EDSHRPS (SEQ ID N°. 157)	K: QSYYGNNQVL (SEQ ID N°. 134)
2B6	I: RGYIASYY (SEQIDN0. 135)	I: EDT (SEQIDN0. 136)	I: QSYDDANHVI (SEQ ID N°. 137)
K: TRGRGYIASYYVQ (SEQ ID N°. 158)	K: EDTQRPS (SEQ ID N°. 159)	K: QSYDDANHVI (SEQ ID N°. 137)
1E8	I: SDYGDYK (SEQ ID N°. 138)	I: VGTGGIVG (SEQ ID N°. 139)	I: GADHGSANNFIWV (SEQ ID N°. 140)
K: TLNSDYGDYKVD (SEQ ID N°. 160)	K: VGTGGIV (SEQIDN0. 161)	K: GADHGSANNFIWV (SEQ ID N°. 140)
2F2	I: SSNIGTNP (SEQ ID N°. 141)	I: FNN (SEQ ID N°. 142)	I: ASWDDTLNGLV (SEQ ID N°. 143)
K: SGSSSNIGTNPVS (SEQ ID N°. 162)	K: FNNQRPS (SEQ ID N°. 163)	K: ASWDDTLNGLV (SEQ ID N°. 143)

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VH2A6/ VL2B6	I: RGYIASYY (SEQIDN0. 135)	I: EDT (SEQIDN0. 136)	I: QSYDDANHVI (SEQ ID N°. 137)
K: TRGRGYIASYYVQ (SEQ ID N°. 158)	K: EDTQRPS (SEQ ID N°. 159)	K: QSYDDANHVI (SEQ ID N°. 137)
VH2B6/ VL2A6	I: SGSVASHY (SEQ ID N°. 132)	I: EDS (SEQ ID N°. 133)	I: QSYYGNNQVL (SEQ ID N°. 134)
K: VRSSGSVASHYVQ (SEQ ID N°. 156)	K: EDSHRPS (SEQ ID N°. 157)	K: QSYYGNNQVL (SEQ ID N°. 134)

0123 Clonagem e Análise de mutantes Single Site Glycosylation.

0124 Quando o anticorpo 2A6 foi expresso em células mamíferas, duas bandas de cadeias foram observadas (Figura 1, linha 1). Isto é possível devido à uma modificação de pós-tradução. A sequência de consenso para glicosilação de ligações N é Asn-Xaa-Ser/Thr e mais raramente Asn-X-Cys. Anticorpos monoclonais possuem uma glicosilação conservada de N na parte Fc da posição N297. Foi observado que o anticorpo 2A6 compreende uma glicosilação em ligações N em sua região de variação (aminoácido 76° da cadeia pesada).

0125 A presença do local de glicosilação em ligações N foi confirmada por digestão PNGase F. Rapidamente, 3.5 pg de anticorpo, 1 pl de desnaturante de glicoproteína (10^x), e H₂O (se necessário) foram misturados para fazer um volume de reação total de 15 μΐ. O anticorpo foi aquecido em uma temperatura de 100°C durante 10 minutos por fins de desnaturação. O anticorpo desnaturado foi então resfriado no gelo e centrifugado durante 10 segundos. Uma reação total com mistura (30 μΐ) foi preparada por conta da adição de 3 μΐ de GlycoBuffer 2 (10^x), 3 μΐ de 10% de NP-40 e 9 μΐ de H2O. A mistura da reação foi incubada em uma temperatura de 37°C durante 1 hora e então, analisada por SDS-PAGE. A desglicosilação de anticorpos foi determinada por mudanças de mobilidades.

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0126 Seguindo a digestão PNGase F, o anticorpo sofreu uma redução de tamanho, indicando que os carboidratos da ligação N foram removidos. Somente uma banda limpa de cadeia pesada com uma massa molecular aparentemente mais baixa foi detectada (Figura 1, linha 2). Isto sugere de que esta baixa massa molecular da cadeia pesada inferior observada antes do tratamento de PNGase F se deve a glicosilação parcial de um local de glicosilação com ligação N.

0127 Este local de glicosilação ligado a ligações N é considerado um local de glicosilação parcial e isto faria com que o processo de produção de massa de anticorpos 2A6 causasse uma falta de homogeneidade molecular. Para facilitar a utilidade comercial do anticorpo 2A6, um ponto de mutação foi produzido e conduzido para remover a glicosilação ligada às ligações N.

0128 Para gerar plasmídeos mutantes de glicosilação para locais específicos, mutagênese foi realizada utilizando polimerase Q5 de NEB. Os oligonucleotídeos utilizados para a mutagênese de cada construção são os seguintes (sequência dos sentidos): c2A6_Q 5’CGTTTCTAGAGACAACGCCCAGAATTCGGTATATCTCCACA-3’ (SEQ ID N°: 169) e c2A6_A 5’CGTTTCTAGAGACAACGCCGCCAATTCGGTATATCTCCAC-3’ (SEQ ID N°: 170). Sequências que sofreram mutações foram verificadas pela sequência de DNA de cada estrutura. Após o ponto de mutação mencionado, o 76° aminoácido da região variável da cadeia pesada do anticorpo 2A6_A sofreu uma mutação de asparagina para glutamina ou alanina nomeando o anticorpo 2A6_Q (este anticorpo possui uma mutação N76Q em sua cadeia pesada) e o anticorpo 2A6_A (este anticorpo possui uma mutação N76A em sua cadeia pesada). Consequentemente, as cadeias pesadas dos anticorpos 2A6_Q e 2A6_A compreendem SEQ ID N°165 e SEQ ID N°: 164 respectivamente.

0129 Passando para o anticorpo 2A6_A e para o anticorpo 2A6_Q, uma análise SDS-PAGE mostrou que a cadeia pesada do

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36/49 anticorpo 2A6 mostrou duas bandas, onde a cadeia pesada de 2A6_A ou 2A6_Q, mostraram uma banda singular aguda com massa molecular mais baixa (Figura 2). Estes dados sugerem que o local de glicosilação de ligações N foi interrompido em 2A6_A e 2A6_Q. O status de glicosilação de 2A6, 2A_Q e 2A6_A foram estudados mais profundamente com o uso de uma análise de espectrometria de massa, um sistema UPLC, que se consiste de um sistema de bio-classe Acquity H com uma bomba quartenária UPLC (QSM), dispositivo automático de injeção de amostras (SM) equipado com um loop de 50 ul de amostra e um detector de matrizes fotodiodo (Waters). Os cromatogramas foram processados usando um software Masslynex (V4.1, Waters). Ligações de glicosilação N Asn-76 de 2A6 foram confirmadas, a substituição de Asn-76 com Ala (2A6_A) ou Gin (2A6_Q) resultaram em uma perda de sinais de glicosilação.

0130 Exemplo 2. Determinação das atividades dos anticorpos recombinantes anti-IFN- γ.

0131 Produção experimental:

0132 A. Análise de interferometria de bio-camadas (BLI).

0133 As constantes taxas de ligações cinéticas (K_a e K_d) foram medidas por interferometria de camadas (BLI, ForteBio Octet RED96). O método BLI foi realizado com o uso de AHC (captura de Anti-hlgG Fc) bio-sensores (ForteBio) para capturar cada anti-IFN-γ mAbs (750 ng/mL) para adquirir um deslocamento de 0,5 nm e em seguida os bio-sensores foram mergulhados em concentrações variáveis (por exemplo, 0, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 e 40 nM) de proteínas humanas IFN-γ recombinantes (R&D systems, 285-IF100),0. execução contém 0.1% de albumina sérica bovina (BSA), 0.1% de Tween20, 250 Mm de NaCL, 2.7 Mm de KC1, 10 Mm de Na₂HPO₄ e 1.8 Mm de ΚΗ₂ΡΟ₄ em água estéril. As constantes taxas foram calculadas por análises de ajustes nas curvas obtidas (1:1 Langmuir model) das respostas de ligação durante 5 minutos de associação e 15 minutos de interação de distociação.

0134 B. Expressão HLA-DR.

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0135 Uma quantidade de 2^x10⁵ de células THP-1 (BCRC 60430) foram cultivadas em 100 pL de Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium (Gibco, 11875-093) suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina/estreptomicina e então tratado com concentrações diferentes (por exemplo, 0,017; 0,05; 0,15; 0,45; 1,37; 4,11; 12,34; 37,03; 111,1; 333,3; 1000, 3000, 5000 e 10000 ng/mL) de anti-IFN-γ 2A6, 2B6, 1E8, e 2F2 durante 30 minutos. As células THP-1 tratadas foram estimuladas com 2 ng/mL de proteínas IFN- γ humanas recombinantes e cultivadas em uma incubadora (37°C, 5% CO2) durante 24 horas, as células que não foram estimuladas foram usadas como controle, depois disto as células estimuladas e não estimuladas continuaram com um anticorpo HLA-DR-PE (BD PharmigenTM) e então, ambas as células foram postas no gelo durante 30 minutos em um local escuro. As células foram lavadas com 2 ml de PBS e suspensas em 500 pL de PBS. A intensidade fluorescente das células que se mantiveram foi adquirida com um citômetro de fluxo inverso FACSVerse e um software FACSuite, a porcentagem de inibição da expressão de HLA-DR para cada anticorpo foi obtida pela seguinte fórmula:

A= (B/C)^x100 onde A = porcentagem de inibição da expressão de HLA-DR; B = o valor médio da intensidade fluorescente das células estimuladas; C = o valor médio da intensidade fluorescente das células não estimuladas.

0136 C. Teste ELISA do anticorpo anti-IFN-γ.

0137 Uma placa de poliestireno transparente de 96 poços e fundo plano (Nunc) foi revestida com 100 pL de proteína IFN- γ recombinante humana (2 pg/mL) ou BS A (2 pg/mL) em uma solução de bicarbonato (2 pg/mL) em cada espaço e incubada em uma temperatura de 4°C durante toda a noite. O prato foi lavado três vezes com uma solução de fosfato salina (PBS) com 0,05% Tween 20 e então a placa foi bloqueada com 5% de albumina sérica humana (Aventis) em PBS durante 2 horas em uma temperatura de 25°C. A placa foi lavada novamente com PBS, com 0,05% Tween 20, depois disto cada um dos mAbs 1E8, 2F2, 2A6, 2B6, AB e BA obtiveram duas

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38/49 concentrações diferentes, uma com o valor de 1 gg/mL e de 0.1 pg/mL, assim eles foram adicionados dentro dos espaços da placa para que fossem ligados à proteína IFN- γ recombinante humana, seguidos por um processo de reação em uma temperatura de 25°C durante 2 horas. A placa foi lavada com PBS cuidadosamente também com 0,05% Tween 20 e depois com Fc-específico alcalino conjugado com fosfatase IgG anti-humano (Cappel) e foi adicionada uma quantidade de diluição de 1 :2500. A placa foi colocada durante 90 minutos em uma temperatura de 37°C e lavada cinco vezes com PBS com 0.05% Tween 20, após a adição de uma solução de p-Nitrophenyl phosphate (pNPP) (100 pL/espaço), a placa foi colocada em uma temperatura de 37°C durante 30 minutos. O nível de absorção foi determinado em OD₄₀5 nm com um leitor de placas VICTOR X3 Multilabel (PerkinElmer).

0138 Resultados:

0139 A. Análise de interferometria de bio-camadas.

0140 A Figura 3 mostra as curvas das ligações obtidas pela passagem de concentrações diferentes de IFN-γ humano recombinante (0; 0,625; 1,25; 2,5; 5, 10 nM) sobre mAbs anti IFN-γ em biosensores AHC. As taxas de constância das ligações cinéticas dos anticorpos (K_a e K_d) e também do equilíbrio de constância de distociação (K_D = K_d/K_a) estão presentes na Tabela 5.

0141 Sobre a tabela 5, pode se notar que os anticorpos recombinantes 2A6, 2B6, 1E8 e 2F2 possuem um valor de K_D baixo, isto indica que os anticorpos presentes possuem uma grande afinidade com o IFN- γ humano.

0142 Tabela 5

mAb	Ka (1/Ms)	Kd (1/s)	KD (M)
2A6	1.08 x 106	3.97 x IO’5	3.68 x 1011
2B6	1.48 x 10b	1.08 x 10“4	7.31 x 1011
1E8	4.64 x 105	1.21 x 10’4	2.61 x 10lu
2F2	3.44 x 105	1.09 x 10“4	3.17 x 10 lu

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0143 Outra experiência incluindo AMG811 (AMG811 é um anticorpo anti- IFN- γ o qual é descrito na U.S. Pat. No. 7,335,743 e foi preparada como descrita na mesma), os anticorpos 2A6, 2B6, 2A6_A, 2A6_Q, AB, e BA mostraram que os anticorpos desta divulgação exibiram atividades anti-IFN-γ comparáveis ou até melhores de que AMG811 (Figura 4 e Tabela 6).

0144 Tabela 6

mAb	Ka (1/Ms)	Kd (1/s)	KD (M)
AMG811	2.48 x 10b	8.59 x IO’5	3.47 x 1011
2A6	2.61 x 10b	4.90 x IO’5	1.87 x 1011
2B6	3.13 x 10b	5.40 x IO’5	1.72 x 1011
2A6_A	2.32 x 10b	5.17 x IO’5	2.23 x 10’11
2A6_Q	2.41 x 10b	5.23 x IO’5	2.17 x 1011
AB	2.19 x 10b	5.46 x IO’5	2.50 x 1011
BA	2.76 x 10b	1.31 x 10’4	4.75 x 10’11

0145 B. Expressão HLA-DR.

0146 A Figura 5 apresenta à expressão de HLA-DR induzida por IFN- γ, esta indução pode ser feita com doses dependentes e efetivas em inibições de anticorpos, isto pode ser visto na Figura 5 que a porcentagem de inibição aumenta quando as concentrações de cada anticorpo anti- IFN- γ (2A6, 2B6, 1E8, e 2F2) também aumentam.

0147 O IC₅₀ (ng/mL) dos anticorpos anti- IFN- γ 2F2, 1E8, 2A6, e 2B6 foram 36,1; 8,6; 3,4; e 3,5; respectivamente. O IC₉₀ (ng/mL) dos anticorpos anti- IFN- γ 2F2, 1E8, 2A6, e 2B6 foram 507,7; 48,6; 3851,3 e 1020,5 respectivamente. Os resultados indicados acima dos anticorpos que podem efetivamente inibir atividades de IFN- γ e poderiam ser usados para o tratamento de síndromes de IFN- γ.

0148 Teste ELISA do anticorpo anti-IFN-γ.

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0149 0s resultados de absorção retirados da placa foram indicados por densidade óptica de 405 nm (OD⁴⁰⁵) por detecção de anticorpos anti-IFN-γ, os resultados do experimento estão presentes na Figura 6. Pode ser visto na Figura 6 que os mAbs com concentrações maiores (1 pg/mL) possuem uma absorção mais forte comparando-os com aqueles de concentrações menores (0.1 pg/mL). Em adição, os mAbs não foram ligados ao BSA, indicando que os anticorpos podem se ligar especificamente com IFN-γ humano.

0150 Exemplo 3. Determinação das atividades dos anticorpos anti- IFN-γ recombinantes.

0151 Neste exemplo, os anticorpos 2A6, 2A6_A, 2A6_Q, 2B6, AB e BA foram testados em suas afinidades de ligações (ELISA) e em suas atividades de neutralização (teste de células e sangue) com IFN-γ. AMG811 também foi usado como um controle positivo e como um exemplo comparativo.

0152 A. Teste ELISA de anticorpo anti- IFN-γ com o uso de IFN- γ biotinilado.

0153 IFN-γ humano recombinante (R&D systems 285-IF-100) e IFN-γ do macaco Cynomolgus (R&D systems 961 -RM-025) foram biotinilados de acordo com o manual (EZ-Link NHS-LC-Biotin; Thermo #21336) e ligados com a placa revestida com estreptavidina respectivamente, depois disto, eles foram incubados em uma sala com temperatura ambiente durante 1-2 horas, a placa foi lavada três vezes com 300 pL de uma solução para lavagem. As diluições em série do anticorpo anti-IFN-γ foram adicionadas nos espaços, depois disto, a placa foi incubada em uma sala com temperatura ambiente novamente durante 1-2 horas, então a placa foi lavada novamente da mesma forma que anteriormente. HRP IgG anti-humano foi aplicado em todos os espaços da placa e encubado em uma sala com temperatura ambiente durante 1 hora. Após o processo de lavagem, as placas receberam a adição de substrato TBM e foram analisadas sob OD₄₅₀_65o.

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0154 0s resultados foram mostrados nas Figura 7 e Figura 8. Observou-se que todos os anticorpos anti-IFN-γ testados exibiram uma boa afinidade de ligação com IFN-γ humano. Além disto, as afinidades de ligações mostradas não possuem diferenças significantes comparando-as com a afinidade de AMG811’ (Figura 7). Os anticorpos anti-IFN-γ testados também exibiram uma reatividade de cruzamento com o macaco Rhesus e o macaco Cynomolgus, porém, ainda assim, as afinidades dos macacos com IFN-γ humano foram maiores. Nos resultados, foi notável que AMG811 não exibiu nenhuma reatividade de cruzamento igual os anticorpos anti-IFN-γ (Figura 8) - uma vantagem significante dos anticorpos.

0155 B. Teste de célula de anticorpo anti-IFN-γ.

0156 Uma linha celular Luciferase estável, expressando pGL4[luc2P/GAS-RE/Hygro (Promega #CS179301) foi usada para medir a atividade de neutralização do anticorpo anti-IFN-γ. Resumidamente, linhas de células HeLa foram colocadas em placas brancas em uma quantidade de 8^X1O³. Estas células foram tratadas com lng/ml de IFN-γ e concentrações diferentes de anticorpos anti-IFN-γ para 18 h. A atividade Luciferase foi analisada com o uso do sistema de medição de Luciferase ONE-Glo™ (Promega #E6110).

0157 O resultado mostra que todos os anticorpos testados puderam neutralizar a atividade de IFN-γ (Figura 9). Todos os anticorpos testados tiveram atividades de neutralização suficientes para aplicações industriais ou farmacêuticas.

0158 C. Testes de sangue com anticorpos anti-IFN-γ.

0159 Sangues saudáveis de voluntários que foram vacinados com bacillus Calmette-Guérin (BCG) foram coletados em tubos de 10ml heparinizados. Uma quantidade de 20-μ1 de amostras de sangue foram adicionados em 80 μΐ de RPMI 1640 cultivados mediamente com ou sem BCG + IL12 (20 ng/ml) em espaços redondos na placa de micro titulação. A placa de micro titulação foi incubada em uma temperatura de 37°C e 5% de CO₂ durante

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42/49 horas. Depois da incubação, CXCL9 foi medido com o uso do kit ELISA CXCL10 (Biolegend 439905). Os níveis de citosina foram apresentados após a correção do fator de diluição. O controle do isotipo IgGl humano foi usado em um experimento como um controle negativo.

0160 Como esperado, as amostras de sangue humano produziram um nível alto de IFN- γ, CXCL9 e CXCL10, cujas produções são conhecidas por serem regulamentadas pelo IFN- γ. A inibição de IFN- γ endógeno bloquearia a produção de IFN- γ em CXCL9 e CXCL10.

0161 Nos resultados verificados, os anticorpos antiIFN-γ inibiram eficientemente a produção de CXCL9 e CXCL10 através da neutralização endógena do IFN- γ (Figura 10 e Figura 11).

0162 D. Inibição de células inibidoras T ligadas ao receptor de anticorpos anti- IFN-γ.

0163 Células THP-1 foram cultivadas de acordo com as instruções ATCC. Para testes de neutralização, 40 ng/ml de IFN-γ em 500 μΐ de RPM1-1640 foram incubados com diferentes quantidades de anticorpos antiIFN-γ durante 10 minutos e na mistura, foi adicionado uma quantidade de 4^x10⁵ células (500 μΐ). As concentrações finais de anticorpos IFN- γ foram 0, 40, 200 ou 1000 ng/ml. Após a incubação, que durou 72 horas em uma incubadora com uma temperatura de 37 °C, células permaneceram com o anticorpo PD-L1 antihumano PE (Biolegend 329706) ou anticorpo HLA-DR anti-humano FITC (Biolegend 327006), esta incubação durou 30 minutos no gelo e em um local escuro. As células foram lavadas com 2ml de solução FACS duas vezes e suspensa em 300 μΐ também com o uso da solução FACS. Os resultados foram adquiridos com um citomêtro FACSCalibur.

0164 Os resultados confirmaram que os anticorpos anti-IFN-γ foram capazes de inibir a expressão HLA-DR (Figura 12) e PD-L1 (Figura 13) apenas com o uso de doses dependentes. Junto com os resultados no teste de células e de sangue, os quais foram mencionados acima, os anticorpos

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43/49 citados não somente mostraram afinidade de ligação com IFN- γ, mas também se mostraram capazes de inibir atividades de IFN- γ.

0165 Exemplo 4. Determinação dos epítopos dos anticorpos.

0166 A. Experimento de ligações dos epítopos.

0167 Experiências de ligações dos epítopos foram conduzidas para determinar quais anticorpos anti-IFN-γ competem pela ligação direta ao IFN-γ, e então, acabam se ligando aos mesmos ou similares epítopos de IFN-γ. Resumidamente, bio-sensores revestidos com estreptavidina (FortéBio) foram usados para estudar o epítopo em um conjunto de quatro anticorpos antiIFN-γ: 1E8, 2F2, 2A6 e 2B6. No começo, 2 pg/mL de IFN- γ recombinante humano biotinilado foram adicionados aos sensores para que uma mudança de 0,5 nm fosse adquirida. Após 100 etapas estáveis e 120 etapas secundárias da linha da base, os anticorpos anti-IFN-γ primários foram individualmente carregados em uma etapa de associação durante 60 segundos em 5 pg/mL, depois disto, os anticorpos anti-IFN-γ secundários também foram incubados com um bio-sensor de associação durante 60 segundos em 5 pg/mL, ao final destes experimentos, se os sinais mostrassem uma acumulação de massa, os sinais seriam vinculados para epítopos diferentes.

0168 Os resultados dos experimentos de ligação de epítopos para quatro dos anticorpos anti-IFN-γ 2A6, 2B6, 1E8, e 2F2 estão presentes na Figura 14. Estes quatro anticorpos anti-IFN-γ se agregam em dois grupos de epítopos: Grupo I, o qual compreende 1E8 e 2F2 e Grupo II, que compreende 2A6 e 2B6. Em outras palavras, 1E8 e 2F2 possuem o mesmo epítopo IFN-γ, enquanto os anticorpos 2A6 e 2B6 possuem o mesmo epítopo IFN-γ.

0169 B. Mapeamento do epítopo em IFN-γ humano através de HDX.

0170 A troca de hidrogênio-deutério (HDX) em IFN-γ foi medida por fragmentos digeridos com pepsina, através do uso do método

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HDX MS, tanto na presença ou na ausência do anticorpo anti-IFN-γ. A proteína recombinante (15 pmol) e o complexo de anticorpo-proteico (15 pmol: 10 pmol) foram diluídos na solução (99.9% D₂O em PBS, pH 7.4) em uma proporção de 1:10 para iniciar a troca de HD, isto tudo em temperatura ambiente. Em 7 vezes em meio a todo o tempo da experiência (10s, 40s, 80s, 180s, 600s, 1800s, 3600s) uma alíquota (1,5 de proteína) foi aspirada e misturada com uma solução de préarrefeciemento (até uma concentração final de 1,5 M de guanidine hydrochloride, 150 Mm tris (2-carboxyethyl) phosphine) e 0,8% formic acid). A mistura foi analisada em um espectrômetro de massa Orbitrap, em MS e MS/MS o controle de ganho automático foi definido para 1.000 ms (leitura completa), 120 ms (MS/MS), 2^x10⁶ ions (leitura completa) e 3^X1O³ ions (MS/MS) para o tempo máximo acumulado ou ions, respectivamente, mudanças maiores de que 10% em incorporação de deutério durante o tempo de trocas foram consideradas significantes em nossa análise.

0171 Baseado nos resultados do mapeamento de epítopos através de HDR-MS, o epítopo proposto em IFN-γ humano para anticorpos 2A6_Q e 2B6 compreendem resíduos em dois segmentos descontínuos de aminoácidos: aminoácidos 30-52 e 78-92 de SEQ ID N°: 166. Mais especificamente, o epítopo proposto em IFN-γ humano para anticorpos 2A6_Q e 2B6 compreendem resíduos de outros dois segmentos descontínuos de aminoácidos: aminoácidos 36-48 e aminoácidos 82-92 de SEQ ID N°: 166. Os epítopos HDX para anticorpos anti-IFN-γ 2A6 Q e 2B6 estão na tabela 7.

0172 C. Mutagênese da leitura de Alanina.

0173 A leitura da mutagênese de alanina foi feita para identificar resíduos específicos nestas regiões, as quais são importantes para os processos de ligação. Aminoácidos entre 36-48 e 82-92 de SEQ ID N°: 166 sofreram mutações de alanina. Entre todas as mutações, onze substituições (resíduos, 39, 41, 42, 44, 45, 47, 85, 88, 91 e 92) reduziram suas atividades biológicas de IFN- γ (isto foi determinado com o uso de HeLa Stable Cell Line expressando pGL4[luc2P/GAS-RE/Hygro (Promega #CS179301)] e foram logo

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45/ 49 depois, excluídos da categoria ELISA, devido a uma possível alteração da conformação como resultado das substituições de alanina.

0174 A ligação ELISA para 2A6_Q ou 2B6 para o restante das proteínas mutantes de IFN- γ foi comparada com outro tipo de IFNγ, mutações que reduzem ligações, as quais foram evidenciadas pela redução de sinais máximos de ELISA para 20% ou menos foram consideradas significantemente influentes em ligações entre IFN- γ e anticorpos, os resultados destes experimentos estão presentes na Tabela 7. Os resultados da composição de ligação se assemelham com os resultados das regiões de ligação mapeadas através do HDX MS.

0175 Além disto, resultados da análise HDX foram colocados como Tempo vs. Redução de trocas de H. Análises destes resultados juntamente com os resultados obtidos de MS indicaram que os anticorpos ligados a um epítopo descontínuo compreendem, no mínimo, os aminoácidos 36-48 e 8292 de SEQ ID N°: 166. Análises HDX de regiões mais longas indicaram que o epítopo provavelmente se estende ainda mais e compreende os aminoácidos descontínuos 30-52 e 78-92 de IFN- γ da sequência de SEQ ID N°: 166.

0176 Conclui-se que os anticorpos 2A6, 2B6 e 2A6_Q reconheceram K37, E38, K43, Q46, Q48, K86 e R89 de IFN- γ (SEQ ID N°: 166) e eles também mostraram uma afinidade de ligação mais forte com K43, _Q48 e K86 de IFN- γ (SEQ ID N°: 166).

0177 Tabela 7

2A6_Q	Região 1	Região 2
HDX	Aminoácidos 30-52 ou	Aminoácidos 78-92 ou
	aminoácidos 36-48	aminoácidos 82-92
Digitalização de	K37, E38, K43, Q46, Q48	K86, R89

alanina

Reduçãc» 20% de ligação

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Digitalização de alanina

Redução> 50% de ligação

K43, Q48

K86

2B6	Região 1	Região 2
HDX	Aminoácidos 30-52 or	Aminoácidos 78-92 or
	aminoácidos 36-48	aminoácidos 82-92
Digitalização de alanina Redução> 20% de ligação	K37, E38, K43, Q46, Q48	K86, R89
Digitalização de alanina	K43, Q48	K86,

Redução> 50% de ligação

0178 Primer listing.

Forward primer	5’-3’ sequência	SEQ ID N°
VH1/7L	accatggactgsacctggag	1
VH2L	caccatggacacactttgctmcac	2
VH2-70L	accatggacatactttgttccacg	3
VH3L	atggagtttgggctgagctg	4
VH3-21L	atggaactggggctccgctg	5
VH3-48L	atggagttggggctgtgctg	6
VH3-49L	catggagtttgggcttagctg	7
VH3-53L	catggagttttggctgagctg	8
VH4L	catgaaacacctgtggttcttcct	9
VH4-39L	aatgaagcacctgtggttcttcct	10
VH4-59L	acatgaaacatctgtggttcttcct	11
VH5L	atggggtcaaccgccatcct	12
VH6L	aatgtctgtctccttcctcatcttcct	13
VH1/3/5Í	saggtgcagctggtgsagtc	14
VH1-3Í	caggtccagcttgtgcagtc	15
VH1-18Í	caggttcagctggtgcagtc	16

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VH1-24Í	caggtccagctggtacagtctg	17
VH2f	caggtcacctgarggagtctggt	18
VH3-23Í	gaggtgcagctgttggagtct	19
VH4f	cagstgcagctgcaggagt	20
VH4-34Í	caggtgcagctacarcagtgg	21
VH6f	caggtacagctgcagcagtca	22
VH7f	caggtgcagctggtgcaat	23
KV1L	ggtccccgctcagctcctgg	24
KV1-16L	agtcctcgctcagctcctgg	25
V2L	gctccctgctcagctcctgg	26
KV2-24L	gctccttgctcagcttctgg	27
KV3L	cctgctactctggctcccag	28
KV4L	atttctctgttgctctggatctctg	29
KV5L	cttcctcctcctttggatctctg	30
KV6L	tctgctgctctgggttccag	31
VKlf	gacatccagwtgacccagtctcc	32
VK2f	gatattgtgatgacccagactccactct	33
VK2-28Í	gatattgtgatgactcagtctccactct	34
VK3f	gaaattgtgttgacrcagtctccag	35
VK3-15Í	gaaatagtgatgacgcagtctccag	36
VK4f	gacatcgtgatgacccagtctc	37
VK5f	gaaacgacactcacgcagtctc	38
VK6f	gaaattgtgctgactcagtctcca	39
LV1L	ggtcctgggcccagtctgtg	40
LV2L	ggtcctgggcycagtctgcc	41
LV3L	gctctgwggcctcctatgagct	42
LV3-12/21L	gctctgtgacctcctatgwgctg	43
LV3-19L	gttctgtggtttcttctgagctgact	44
LV4L	ggtctctctcccwgcytgtgc	45
LV5L	gttccctctcgcaggctgtg	46
LV5/9L	gktccctctcccagcctgtg	47
LV6L	gttcttgggccaattttatgctg	48
LV7L	ggtccaattcycagrctgtggtg	49
LV8L	gagtggattctcagactgtggtga	50
LV10L	tgtcagtggtccaggcaggg	51
LV1-40/50/51Í	cagtctgtgytgacgcagcc	52
LV1-36/44/47Í	cagtctgtgctgactcagcca	53
LV2f	cagtctgccctgactcagcc	54
LV3f	tcctatgagctgacwcagcca	55
LV3-19Í	tcttctgagctgactcaggacc	56
LV4/5/9Í	cagsctgtgctgactcagcc	57
LV4-60Í	cagcctgtgctgactcaatcat	58

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LV4-69Í	cagcttgtgctgactcaatcg	59
LV6f	aattttatgctgactcagccccac	60
LV7/8Í	cagrctgtggtgacycaggagc	61
LVIOf	caggcagggctgactcagcc	62
Reverse primers
CyCHl-l	aggtgtgcacgccgctggtc	63
CyCHl-2	ggttcggggaagtagtccttgac	64
Ck543-566	gtttctcgtagtctgctttgctca	65
CK494-516	gtgctgtccttgctgtcctgct	66
CÀ156-178	ttggagggtktggtggtctccac	67
CÀ129-148	ttgacggggctgcyatctgc	68
CÀ93-113	cacrgctcccgggtagaagtc	69

Primer	5’-3’ sequência	SEQ ID N°
SL-VH1/3/5Í	gttgctacgcgtgtcctgagcsaggtgcagctggtgsagtc	70
SL-VH1-3Í	gttgctacgcgtgtcctgagccaggtccagcttgtgcagtc	71
SL-VH1-18Í	gttgctacgcgtgtcctgagccaggttcagctggtgcagtc	72
SL-VHl-24f	gttgctacgcgtgtcctgagccaggtccagctggtacagtctg	73
SL-VH2f	gttgctacgcgtgtcctgagccaggtcaccttgarggagtctg	74
SL-VH3-23f	gttgctacgcgtgtcctgagcgaggtgcagctgttggagtct	75
SL-VH4f	gttgctacgcgtgtcctgagccagstgcagctgcaggagt	76
SL-VH4-34f	gttgctacgcgtgtcctgagccaggtgcagctacarcagtgg	77
SL-VH6f	gttgctacgcgtgtcctgagccaggtacagctgcagcagtca	78
SL-VH7f	gttgctacgcgtgtcctgagccaggtgcagctggtgcaat	79
SL-JHl/4/5r	gatgggcccttggtgctagctgaggagacggtgaccagg	80
SL-JH2r	gatgggcccttggtgctagctgaggagacagtgaccagggt	81
SL-JH3r	gatgggcccttggtgctagctgaagagacggtgaccattgtc	82
SL-JH6r	gatgggcccttggtgctagctgaggagacggtgaccgtg	83
SL-VKlf	ggctcccaggtgcacgatgtgacatccagwtgacccagtctcc	84
SL-VK2Í	ggctcccaggtgcacgatgtgatattgtgatgacccagactccactct	85
SL-VK3Í	ggctcccaggtgcacgatgtgaaattgtgttgacrcagtctccag	86
SL-VK4Í	ggctcccaggtgcacgatgtgacatcgtgatgacccagtctc	87
SL-VK5Í	ggctcccaggtgcacgatgtgaaacgacactcacgcagtctc	88
SL-VK6Í	ggctcccaggtgcacgatgtgaaattgtgctgactcagtctcca	89
SL-JKlr	tgcagccaccgtacgtttgatttccaccttggtccct	90
SL-JK2r	tgcagccaccgtacgtttgatctccagcttggtccct	91
SL-JK3r	tgcagccaccgtacgtttgatatccactttggtccca	92
SL-JK4r	tgcagccaccgtacgtttgatctccaccttggtccct	93
SL-JK5r	tgcagccaccgtacgtttaatctccagtcgtgtccctt	94
SL-LV1-40/50/51Í	tccttgcttatgggtccggagtggattctcagtctgtgytgacgcagcc	95
SL-LV1-36/44/47Í	tccttgcttatgggtccggagtggattctcagtctgtgctgactcagcca	96

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SL-LV2Í	tccttgcttatgggtccggagtggattctcagtctgccctgactcagcc	97
SL-LV3Í	tccttgcttatgggtccggagtggattcttcctatgagctgacwcagcca	98
SL-LV3-19Í	tccttgcttatgggtccggagtggattcttcttctgagctgactcaggac	99
SL-LV4/5/9Í	tccttgcttatgggtccggagtggattctcagsctgtgctgactcagcc	100
SL-LV4-60/69Í	tccttgcttatgggtccggagtggattctcagyctgtgctgactcaatc	101
SL-LV6Í	tccttgcttatgggtccggagtggattctaattttatgctgactcagccc	102
SL-LV7/8Í	tccttgcttatgggtccggagtggattctcagrctgtggtgacycaggag	103
SL-LV10f	tccttgcttatgggtccggagtggattctcaggcagggctgactcagcc	104
SL-JLlr	ggccttgggctgacctaggacggtgaccttggtcc	105
SL-JL2/3Í	ggccttgggctgacctaggacggtcagcttggtcc	106
SL-JL6r	ggccttgggctgacctaggacggtcaccttggtgc	107
SL-JL7r	ggccttgggctgacctaggacggtcagctgggtgc	108

Primer	5’-3’ sequência	SEQ ID N°
plgGiK-screen+	gctcccaggtgcacgatgtg	117
plgGA-screem-	gcttatgggtccggagtggattct	118
plgGi-screen-	gatgggcccttggtgctagc	119

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Claims (47)

1. GAMA DE ANTICORPOS ANTI-INTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, um anticorpo isolado compreendendo: V_H CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID N°: 120, 123, 126, 129, 144, 147, 150 ou 153; V_H CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID N°: 121, 124, 127, 130, 145, 148, 151 ou 154; V_H CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID N°: 122, 125, 128, 131, 146, 149, 152 ou 155; V_L CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID N°: 132, 135, 138, 141, 156, 158, 160 ou 162; V_L CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID N°: 133, 136, 139, 142, 157, 159, 161 ou 163; e V_L CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID N°: 134, 137, 140 ou 143.

2. GAMA DE ANTICORPOS ANTI-INTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, o anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, em que os referidos V_H CDR1, V_H CDR2 e V_H CDR3 são SEQ ID N°: 120, SEQ ID N°: 121 e SEQ ID N°: 122, respectivamente; em que os referidos V_L CDR1, V_L CDR2 e V_L CDR3 são SEQ ID N°: 132, SEQ ID N°: 133 e SEQ ID N°: 134, respectivamente.

3. GAMA DE ANTICORPOS ANTI-INTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, o anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, em que os referidos V_H CDR1, V_H CDR2 e V_H CDR3 são SEQ ID N°: 144, SEQ ID N°: 145 e SEQ ID N°: 146, respectivamente; em que os referidos V_L CDR1, V_L CDR2, V_L CDR3 são SEQ ID N°: 156, SEQ ID N°: 157 e SEQ ID N°: 134, respectivamente.

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4. GAMA DE ANTICORPOS ANTI-INTERFERON

E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, o anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, em que os referidos V_H CDR1, V_H CDR2 e V_H CDR3 são SEQ ID N°: 123, SEQ ID N°: 124 e SEQ ID N°: 125, respectivamente; em que os referidos V_L CDR1, V_L CDR2, V_L CDR3 são SEQ ID N°: 135, SEQ ID N°: 136 e SEQ ID N°: 137, respectivamente.

5. GAMA DE ANTICORPOS ANTI-INTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, o anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, em que os referidos V_H CDR1, V_H CDR2 e V_H CDR3 são SEQ ID N°: 147, SEQ ID N°: 148 e SEQ ID N°: 149, respectivamente; em que os referidos V_L CDR1, V_L CDR2, V_L CDR3 são SEQ ID N°: 158, SEQ ID N°: 159 e SEQ ID N°: 137, respectivamente.

6. GAMA DE ANTICORPOS ANTI-INTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, o anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, em que os referidos V_H CDR1, V_H CDR2 e V_H CDR3 são SEQ ID N°: 126, SEQ ID N°: 127 e SEQ ID N°: 128, respectivamente; em que os referidos V_L CDR1, V_L CDR2, V_L CDR3 são SEQ ID N°: 138, SEQ ID N°: 139 e SEQ ID N°: 140, respectivamente.

7. GAMA DE ANTICORPOS ANTI-INTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, o anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, em que os referidos V_H CDR1, V_H CDR2 e V_H CDR3 são SEQ ID N°: 150, SEQ ID N°: 151 e SEQ ID N°: 152, respectivamente; em que os referidos V_L CDR1, V_L CDR2, V_L CDR3 são SEQ ID N°: 160, SEQ ID N°: 161 e SEQ ID N°: 140, respectivamente.

8. GAMA DE ANTICORPOS ANTI-INTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, o anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, em que os referidos V_H CDR1, V_H CDR2 e V_H CDR3 são SEQ ID N°: 129, SEQ ID N°: 130 e SEQ ID N°: 131, respectivamente; em que os referidos V_L CDR1, V_L CDR2, V_L CDR3 são SEQ ID N°: 141, SEQ ID N°: 142 e SEQ ID N°: 143, respectivamente.

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9. GAMA DE ANTICORPOS ANTI-INTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, o anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, em que os referidos V_H CDR1, V_H CDR2 e V_H CDR3 são SEQ ID N°: 153, SEQ ID NO: 154 e SEQ ID N°: 155, respectivamente; em que os referidos V_L CDR1, V_L CDR2, V_L CDR3 são SEQ ID N°: 162, SEQ ID N°: 163 e SEQ ID N°: 143, respectivamente.

10. GAMA DE ANTICORPOS ANTIINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, o anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, em que os referidos V_H CDR1, V_H CDR2 e V_H CDR3 são SEQ ID N°: 120, SEQ ID N°: 121 e SEQ ID N°: 122, respectivamente; em que os referidos V_L CDR1, V_L CDR2, V_L CDR3 são SEQ ID N°: 135, SEQ ID N°: 136 e SEQ ID N°: 137, respectivamente.

11. GAMA DE ANTICORPOS ANTIINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, o anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, em que os referidos V_H CDR1, V_H CDR2 e V_H CDR3 são SEQ ID N°: 144, SEQ ID N°: 145 e SEQ ID N°: 146, respectivamente; em que os referidos V_L CDR1, V_L CDR2, V_L CDR3 são SEQ ID N°: 158, SEQ ID N°: 159 e SEQ ID N°: 137, respectivamente.

12. GAMA DE ANTICORPOS ANTIINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, o anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, em que os referidos V_H CDR1, V_H CDR2 e V_H CDR3 são SEQ ID N°: 123, SEQ ID N°: 124 e SEQ ID N°: 125, respectivamente; em que os referidos V_L CDR1, V_L CDR2, V_L CDR3 são SEQ ID N°: 132, SEQ ID N°: 133 e SEQ ID N°: 134, respectivamente.

13. GAMA DE ANTICORPOS ANTIINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, o anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, em que os referidos V_H CDR1, V_H CDR2 e V_H CDR3 são SEQ ID N°: 147, SEQ ID N°: 148 e SEQ ID N°: 149, respectivamente; em que os referidos V_L CDR1, V_L CDR2, V_L CDR3 são SEQ ID N°: 156, SEQ ID N°: 157 e SEQ ID N°: 134, respectivamente.

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14. GAMA DE ANTICORPOS ANTIINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, ο anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, em que V_H compreende uma sequência com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID N°: 109, 110, 111 ou 112; e V_L compreende uma sequência com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID N°: 113, 114, 115 ou 116.

15. GAMA DE ANTICORPOS ΑΝΤΙINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, o anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, em que V_H não compreende um local de glicosilação ligado a N.

16. GAMA DE ANTICORPOS ΑΝΤΙINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, o anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 15, em que V_H compreende uma sequência com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID N°: 164, em que o aminoácido na posição 76 é A ou SEQ ID N°: 165, em que o aminoácido na posição 76 é Q; e V_L compreende uma sequência com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID N°: 113.

17. GAMA DE ANTICORPOS ΑΝΤΙINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, o anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, em que o anticorpo é um anticorpo de camundongo, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano.

18. GAMA DE ANTICORPOS ΑΝΤΙINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, o anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, em que o anticorpo reage de maneira cruzada com o IFN-γ do macaco humano e do macaco rhesus / macaco cinomolgo.

19. GAMA DE ANTICORPOS ΑΝΤΙINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, o

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5/11 anticorpo isolado que se liga especificamente ao mesmo epítopo que o anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 18.

20. GAMA DE ANTICORPOS ANTIINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, o anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, em que o anticorpo se liga especificamente a um ou mais resíduos de aminoácidos nos aminoácidos 30-52 ou 36-48 e aos aminoácidos 78-92 ou 82-92 do IFN-γ humano, em que os referidos aminoácidos 30-52 compreendem os aminoácidos da SEQ ID N°: 167, os referidos aminoácidos 36-48 compreendem os aminoácidos da SEQ ID N°: 171, os referidos aminoácidos 78-92 compreendem os aminoácidos da SEQ ID N°: 168 e os referidos aminoácidos 82 -92 compreendem os aminoácidos da SEQ ID N°: 172.

21. GAMA DE ANTICORPOS ANTIINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, o anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 20, em que o anticorpo se liga especificamente a um ou mais resíduos de aminoácidos nos aminoácidos 36-48 e 82-92 do IFN-γ humano, em que os referidos aminoácidos 36-48 compreendem os aminoácidos da SEQ ID N°: 171 e os referidos aminoácidos 82-92 compreendem os aminoácidos da SEQ ID N°: 172.

22. GAMA DE ANTICORPOS ANTIINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, o anticorpo isolado, em que o anticorpo se liga especificamente a um ou mais resíduos de aminoácidos nos aminoácidos 30-52 ou 36-48 e aminoácidos 78-92 ou 82-92 do IFN-γ humano, em que os referidos aminoácidos 30-52 compreendem os aminoácidos da SEQ ID N°: 167, os referidos aminoácidos 3648 compreendem os aminoácidos da SEQ ID N°: 171, os referidos aminoácidos 78-92 compreendem os aminoácidos da SEQ ID N°: 168 e os referidos aminoácidos 82-92 compreendem os aminoácidos da SEQ ID N°: 172.

23. GAMA DE ANTICORPOS ANTIINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, o

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6/11 anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 22, em que o anticorpo se liga especificamente a um ou mais resíduos de aminoácidos nos aminoácidos 36-48 e 82-92 do IFN-γ humano, em que os referidos aminoácidos 36-48 compreendem os aminoácidos da SEQ ID N°: 171, e os referidos aminoácidos 82-92 compreendem os aminoácidos da SEQ ID N°: 172.

24. GAMA DE ANTICORPOS ANTIINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, um anticorpo isolado que se liga especificamente a um epítopo do IFN-γ humano, em que o referido epítopo compreende K43, Q48 e K86 do IFN-γ humano; em que o referido IFN-γ humano compreende a SEQ ID N°: 166.

25. GAMA DE ANTICORPOS ANTIINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, o anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 24, em que o referido epítopo compreende K37, E38, K43, Q46, Q48, K86 e R89 de IFN-γ humano; em que o referido IFN-γ humano compreende a SEQ ID N°: 166.

26. GAMA DE ANTICORPOS ANTIINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, o anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, em que o referido anticorpo isolado se liga especificamente ao IFN-γ humano com um valor de ligação K_D inferior a IxlO’⁸ M, inferior a IxlO’⁹ M, inferior a 1x10’ ¹⁰M, menor que IxlO’¹¹ M, ou até menor.

27. GAMA DE ANTICORPOS ANTIINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, o anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 26, em que o valor de ligação específico ao IFN-γ K_D é medido por análise de interferometria de camada biológica.

28. GAMA DE ANTICORPOS ANTIINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, o anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, em

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7/11 que o anticorpo inibe a atividade mediada por IFN-γ humano com um valor de IC₅₀ inferior a 50 ng/mL, inferior a 25 ng/mL ou inferior a 10 ng/mL .

29. GAMA DE ANTICORPOS ANTIINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, o anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 28, em que o valor de IC₅₀ é medido por análise de expressão de HLA-DR.

30. GAMA DE ANTICORPOS ANTIINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, um polinucleotideo isolado que codifica o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, em que compreende uma primeira sequência com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID N°: 173, 175, 176, 177, 179 ou 181, que codifica V_H do anticorpo; e uma segunda sequência possuindo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID N°: 174, 178, 180 ou 182, codificando V_L do anticorpo.

31. GAMA DE ANTICORPOS ANTIINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, o polinucleotideo isolado, de acordo com a reivindicação 30, em que o polinucleotideo compreende uma sequência polinucleotídica compreendendo um ou mais códons selecionados para expressão ideal do anticorpo em uma célula de mamífero.

32. GAMA DE ANTICORPOS ANTIINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, o polinucleotideo isolado, de acordo com a reivindicação 31, em que a célula de mamífero é uma célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO), célula NS0, célula BHK, célula SP2/0, célula HEK 293, célula HEK 293 EBNA, célula PER.C6® e Célula COS.

33. GAMA DE ANTICORPOS ANTIINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, um vetor, em que compreende um polinucleotideo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 32.

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34. GAMA DE ANTICORPOS ANTIINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, uma célula hospedeira isolada compreendendo o vetor da reivindicação 33.

35. GAMA DE ANTICORPOS ΑΝΤΙINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, uma célula hospedeira isolada que expressa o anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 29.

36. GAMA DE ANTICORPOS ΑΝΤΙINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, uma célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 35, em que a célula hospedeira é selecionada do grupo que consiste em células de E.coli, inseto, levedura ou mamífero.

37. GAMA DE ANTICORPOS ΑΝΤΙINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, uma composição para neutralizar uma atividade de interferon-γ, compreendendo: um anticorpo isolado de qualquer uma das reivindicações 1 a 29 e um portador.

38. GAMA DE ANTICORPOS ΑΝΤΙINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, uma composição farmacêutica para o tratamento de uma síndrome mediada por IFN-γ, compreendendo: uma quantidade eficaz de um anticorpo isolado de qualquer uma das reivindicações 1 a 29 e um portador farmaceuticamente aceitável.

39. GAMA DE ANTICORPOS ΑΝΤΙINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, uma composição, de acordo com a reivindicação 38, em que a síndrome mediada por IFN-γ compreende inflamação, Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS), artrite reumatóide, incluindo artrite reumatóide juvenil, doenças inflamatórias intestinais, incluindo colite ulcerativa e doença de Crohn, esclerose múltipla, doença de Addison, diabetes (tipo I), epididimite, glomerulonefrite, doença de Graves, síndrome de Guillain-Barre, doença de Hashimoto, anemia hemolítica, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), nefrite lúpica, miastenia gravis,

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9/11 pênfigo, psoríase, artrite psoriática, aterosclerose, resistência à eritropoietina, doença do enxerto versus doença hospedeira, rejeição de transplante, lesão hepática autoimune induzida por hepatite, cirrose biliar, lesão hepática induzida por álcool, incluindo cirrose alcoólica, febre reumática, sarcoidose, esclerodermia, síndrome de Sjogren, espondiloartropatia, anquisolante espondilite, doença de kawasaki, linfo-histiocitose hemofagocítica, síndrome de ativação de macrófagos, tireoidite, vasculite ou uma combinação dos mesmos.

40. GAMA DE ANTICORPOS ANTIINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, um método para tratamento de uma síndrome mediada por IFN-γ, compreendendo: administrar a um sujeito em necessidade da mesma uma quantidade eficaz de um anticorpo isolado de qualquer uma das reivindicações 1 a 29.

41. GAMA DE ANTICORPOS ANTIINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, o método, de acordo com a reivindicação 40, em que a referida administração é realizada por injeção, infusão, instilação e inalação.

42. GAMA DE ANTICORPOS ANTIINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, o método, de acordo com a reivindicação 40, em que a referida administração é por injeção e a referida injeção é selecionada dentre intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intraventricular, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, intravítrea, transtraceal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, injeção e infusão subaracnóidea, intraespinal, intracerebroespinhal e intraesternal.

43. GAMA DE ANTICORPOS ANTIINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, o método, de acordo com a reivindicação 40, em que a síndrome mediada por IFNγ compreende inflamação, Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS), artrite reumatóide, incluindo artrite reumatóide juvenil, doenças inflamatórias intestinais, incluindo colite ulcerativa e doença de Crohn, esclerose múltipla,

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10/11 doença de Addison, diabetes (tipo I), epididimite, glomerulonefrite, doença de Graves, síndrome de Guillain-Barre, doença de Hashimoto, anemia hemolitica, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), nefrite lúpica, miastenia gravis, pênfigo, psoríase, artrite psoriática, aterosclerose, resistência à eritropoietina, doença do enxerto versus doença hospedeira, rejeição de transplante, lesão hepática autoimune induzida por hepatite, cirrose biliar, lesão hepática induzida por álcool, incluindo cirrose alcoólica, febre reumática, sarcoidose, esclerodermia, síndrome de Sjógren, espondiloartropatia, anquisolante espondilite, doença de Kawasaki, doença do olho seco, linfo-histiocitose hemofagocítica, síndrome de ativação de macrófagos, tireoidite, vasculite ou uma combinação destes.

44. GAMA DE ANTICORPOS ANTIINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, um método para detectar interferon-γ num ambiente, compreendendo: (a) a aplicação de um anticorpo isolado de qualquer uma das reivindicações 1 a 29 no referido ambiente; (b) incubar o referido ambiente com um anticorpo anti-IgG; em que o referido anticorpo anti-IgG é conjugado com um marcador detectável; e (c) detectar a referida etiqueta detectável.

45. GAMA DE ANTICORPOS ANTIINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, o método, de acordo com a reivindicação 44, em que o anticorpo anti-IgG é um anticorpo específico para Fc.

46. GAMA DE ANTICORPOS ANTIINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, o método, de acordo com a reivindicação 44, em que o marcador detectável compreende uma fosfatase alcalina e o método compreende ainda incubar o referido ambiente com uma solução de fosfato de p-nilrophenyl após o passo (b) e antes do passo (c).

47. GAMA DE ANTICORPOS ANTIINTERFERON E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS é caracterizado por, o

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11/11 método, de acordo com a reivindicação 44, em que a referida detecção da etapa (c) é conduzida determinando a absorvência do referido OD₄₀₅.