CN117545504A - 抗人血清白蛋白的抗原结合蛋白 - Google Patents
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Abstract
一种能够结合人血清白蛋白的分离的抗原结合蛋白,其包含抗体重链可变区VH中的至少一个CDR,所述VH包含SEQ ID NO:26或38所示的氨基酸序列,还提供了所述抗原结合蛋白的制备方法及其用途。
Description
本申请涉及生物医药领域,具体的涉及一种能够结合人血清白蛋白的抗原结合蛋白。
目前,蛋白质药物已成功广泛应用于临床治疗,许多蛋白质药物为一些疾病提供了有效的治疗效果。然而大多数蛋白和多肽的半衰期很短,一是因为蛋白质药物会被体内的蛋白酶降解而快速清除,二是由于肾小球的过滤作用是分子量小于60KD的药物在肾脏代谢中易被清除。为了达到有效治疗,往往采用高剂量或多次、长时间用药的方案,这样一方面会增加其毒副作用,同时也给患者用药带来极大的不便。
为延长蛋白质药物在体内的半衰期,通过与具有较长半衰期的人体蛋白直接融合是一种有效方法。人血清白蛋白是人体血液中的主要蛋白,也是人体内半衰期最长的蛋白,它可以与一些药物分子结合,对药物分子提供保护作用,是一种理想的药物载体分子。因此,亟需开发能够结合人血清白蛋白的分子,提供更多有效的药物载体。
发明内容
本申请提供了一种能够识别人血清白蛋白的抗原结合蛋白,可通过筛选得到具有高亲和力的结合蛋白,所述抗原结合蛋白具有稳定的理化性质,能够与人血清白蛋白结合,延长生物药物半衰期,有利于生物药在治疗中的有益效果。
一方面,本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白,其包含抗体重链可变区VH中的至少一个CDR,所述VH包含SEQ ID NO:26或38所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述分离的抗原结合蛋白包含HCDR3,所述HCDR3包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所示分离的抗原结合蛋白的HCDR3包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述分离的抗原结合蛋白包含HCDR2,所述HCDR2包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述分离的抗原结合蛋白包含HCDR2,所述HCDR2包含SEQ ID NO:2、31或32所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述分离的抗原结合蛋白包含HCDR1,所述HCDR1包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述分离的抗原结合蛋白包含HCDR1,所述HCDR1包含SEQ ID NO:3或30所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述分离的抗原结合蛋白包含HCDR1,HCDR2和HCDR3,所述HCDR1包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列,所述HCDR2包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列,且所述HCDR3包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述分离的抗原结合蛋白的所述HCDR1包含SEQ ID NO:3或30所示的氨基酸序列,所述HCDR2包含SEQ ID NO:2、31或32所示的氨基酸序列,且所述HCDR3包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述分离的抗原结合蛋白的所述HCDR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列,所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列,且所述HCDR3包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;或者所述HCDR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列,所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列,且所述HCDR3包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列;或者所述HCDR1包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列,所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列,且所述HCDR3包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;或者所述HCDR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列,所述HCDR2包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列,且所述HCDR3包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;或者所述HCDR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列,所述HCDR2包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列,且所述HCDR3包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述分离的抗原结合蛋白包含H-FR1,所述H-FR1的C端与所述HCDR1的N端直接或间接相连,且所述H-FR1包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述分离的抗原结合蛋白的所述H-FR1包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述分离的抗原结合蛋白包含H-FR2,所述H-FR2位于所述HCDR1和HCDR2之间,且所述H-FR2包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述分离的抗原结合蛋白的所述H-FR2包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:15中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述分离的抗原结合蛋白包含H-FR3,所述H-FR3位于所述HCDR2和所述HCDR3之间,且所述H-FR3包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述分离的抗原结合蛋白的所述H-FR3包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述分离的抗原结合蛋白包含H-FR4,所述H-FR4的N端与所述HCDR3的C端直接或间接相连,且所述H-FR4包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述分离的抗原结合蛋白的所述H-FR4包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述分离的抗原结合蛋白包含H-FR1,H-FR2,H-FR3和H-FR4,所述H-FR1包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列,所述H-FR2包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列,所述H-FR3包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列,且所述H-FR4包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述分离的抗原结合蛋白包含H-FR1,H-FR2,H-FR3和H-FR4,所述H-FR1包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11中任一项所示的氨基酸序列,所述H-FR2包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:15中任一项所示的氨基酸序列,所述H-FR3包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列,且所述H-FR4包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述分离的抗原结合蛋白包含选自下组的任一组H-FR1,H-FR2,H-FR3和H-FR4:
1)所述H-FR1包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列,所述H-FR2包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列,所述H-FR3包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列,且所述H-FR4包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列;
2)所述H-FR1包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列,所述H-FR2包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列,所述H-FR3包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列,且所述H-FR4包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列;
3)所述H-FR1包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列,所述H-FR2包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列,所述H-FR3包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列,且所述H-FR4包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列;
4)所述H-FR1包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列,所述H-FR2包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列,所述H-FR3包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列,且所述H-FR4包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列;以及
5)所述H-FR1包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列,所述H-FR2包含如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列,所述H-FR3包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列,且所述H-FR4包含如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述分离的抗原结合蛋白包含VH,所述VH包含SEQ ID NO:26或38所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述分离的抗原结合蛋白的所述VH包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、和SEQ ID NO:35中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述分离的抗原结合蛋白包括抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中,所述分离的抗原结合蛋白包含抗体重链恒定区。
在某些实施方式中,所述分离的抗原结合蛋白的抗体重链恒定区源自人抗体重链恒定区。
在某些实施方式中,所述分离的抗原结合蛋白的抗体重链恒定区源自人IgG重链恒定区。
在某些实施方式中,所述分离的抗原结合蛋白的抗体重链恒定区源自人IgG1重链恒定区。
在某些实施方式中,所述抗原结合片段包括Fab,Fab’,Fv片段,F(ab’)
2,scFv,di-scFv,dAb和/或V
HH。
在某些实施方式中,所述抗原结合片段为V
HH。
在某些实施方式中,所述抗体选自下组:单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。在某些实施方式中,所述分离的抗原结合蛋白能够结合人血清白蛋白。
另一方面,本申请还提供了融合蛋白,其包含所述分离的抗原结合蛋白。
另一方面,本申请还提供了分离的核酸分子,其编码所述分离的抗原结合蛋白或所述融合蛋白。
另一方面,本申请还提供了载体,其包含所述核酸分子。
另一方面,本申请还提供了细胞,其包含所述分离的抗原结合蛋白,所述融合蛋白,所述核酸分子或所述载体。
另一方面,本申请还提供了制备所述分离的抗原结合蛋白的方法,所述方法包括在使得所述分离的抗原结合蛋白表达的条件下,培养所述的细胞。
另一方面,本申请还提供了药物组合物,其包含所述分离的抗原结合蛋白,所述核酸分子、所述载体和/或所述细胞,以及任选地药学上可接受的载剂。
另一方面,本申请还提供了一种用于检测或测定人血清白蛋白的方法,所述方法包括所述的分离的抗原结合蛋白或所述的融合蛋白。
另一方面,本申请还提供了一种试剂盒,其包含所述的分离的抗原结合蛋白,所述的融合蛋白,所述的核酸分子、所述的载体、所述的细胞和/或所述的药物组合物。
另一方面,本申请还提供了所述的分离的抗原结合蛋白,所述的融合蛋白,所述的核酸分子、所述的载体、所述的细胞、所述的药物组合物和/或所述的试剂盒在制备预防和/或治疗疾病或病症的药物中的用途。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的,本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地,本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的,而非为限制性的。
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下:
图1显示的是酵母展示文库的构建方法。
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式,熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中,术语“人血清白蛋白(Human Serum Albumin)”可以与“HSA”互换使用。在本申请中,该术语还涵盖人血清白蛋白的变体、同源物、类似物、衍生物以及功能活性片段。
在本申请中,术语“分离的”通常指从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分,那么可能是其所处的天然环境发生了改变,或从天然环境下分离出该物质,或二者情况均有发生。例如,某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽,而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”不排除混有人工或合成的物质,也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
在本申请中,术语“分离的抗原结合蛋白”通常指脱离了其天然存在状态的具有抗原结合能力的蛋白。该“分离的抗原结合蛋白”可以包含结合抗原的部分和任选地,允许抗原结合部分采用促进所述抗原结合部分结合抗原的构象的框架或构架部分。抗原结合蛋白可以包含例如抗体来源的蛋白框架区(FR)或具有移植的CDR或CDR衍生物的备选蛋白框架区或人工框架区。此类框架包括,但不限于包含被引入例如以稳定抗原结合蛋白的三维结构的突变的抗体来源的框架区以及包含例如生物相容性聚合物的完全合成的框架区。参见例如Korndorfer等,2003,Proteins:Structure,Function,andBioinformatics,53(1):121-129(2003);Roque等,Biotechnol.Prog.20:639-654(2004)。抗原结合蛋白的实例包括但不限于:人抗体、人源化抗体;嵌合抗体;重组抗体;单链抗体;双功能抗体;三功能抗体;四功能抗体;Fab,Fab’,Fv片段,F(ab’)
2,F(ab)
2,scFv,di-scFv,dAb,IgD抗体;IgE抗体;IgM抗体;IgG1抗体;IgG2抗体;IgG3抗体;或IgG4抗体以及其片段。
在本申请中,术语“CDR”也称“互补决定区”,通常指抗体可变结构域中的区域,其序列是高度可变的和/或形成结构定义环。在某些实施方案中,仅由重链组成的天然存在的骆驼抗体在缺乏轻链的情况下,其功能也能够正常且稳定。参见,例如,Hamers-Casterman et al.,Nature 363:446-448(1993);Sheriff et al,Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。抗体CDR可以通过多种编码系统来确定,如CCG、Kabat、Chothia、IMGT、综合考虑Kabat/Chothia等。这些编码系统为本领域内已知,具体可参见,例如,http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html#kabatnum。例如,所述抗原结合蛋白的氨基酸序列编号可以按照IMGT编号方案(IMGT,the international ImMunoGeneTics information system@imgt.cines.fr;http://imgt.cines.fr;Lefranc等,1999,Nucleic Acids Res.27:209-212;Ruiz等,2000Nucleic Acids Res.28:219-221;Lefranc等,2001,Nucleic Acids Res.29:207-209;Lefranc等,2003,Nucleic Acids Res.31:307-310;Lefranc等,2005,DevComp Immunol 29:185-203)。例如,所述抗原结合蛋白的CDR可以根据Kabat编号系统确定(参见例如Kabat EA&Wu TT(1971)Ann NY AcadSci 190:382-391和Kabat EAet al.,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,FifthEdition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)。
在本申请中,术语“FR”通常指抗体可变结构域的更高度保守的部分,其被称为框架区。通常,天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区,即在VH中四个(H-FR1,H-FR2,H-FR3和H-FR4),和在VL中四个(L-FR1,L-FR2,L-FR3和L-FR4)。
在本申请中,术语“可变结构域”与“可变区”可以互换使用,通常指抗体重链和/或轻链的一部分。重链和轻链的可变结构域可以分别称为“V
H”和“V
L”(或者分别称为“VH” 和“VL”)。这些结构域通常是抗体的变化最大的部分(相对于相同类型的其它抗体),且包含抗原结合位点。
在本申请中,术语“可变”通常指在抗体之间可变结构域的某些区段在序列上可能存在较大差异。可变结构域介导抗原结合并决定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而,可变性并非在整个可变结构域范围内均匀分布。它通常集中在轻链和重链可变结构域中称为高变区(CDR或HVR)的三个区段中。可变结构域的更高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区,大多数采用β-折叠构型,通过三个CDR连接,其形成环形连接,并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDR通过FR区紧密靠近地保持在一起,并且来自另一条链的CDR一同促进抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al,Sequences of Immunological Interest,Fifth Edition,National Institute of Health,Bethesda,Md.(1991))。
在本申请中,术语“抗体”通常指免疫球蛋白或其片段或其衍生物,涵盖包括抗原结合位点的任何多肽,无论其是在体外还是体内产生的。该术语包括但不限于多克隆的、单克隆的、单特异性的、非特异性的、人源化的、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂化的、突变的和移植的抗体。除非另外被术语“完整的”修饰,如在“完整的抗体”中,为了本发明的目的,术语“抗体”也包括抗体片段,比如Fab、F(ab')
2、Fv、scFv、Fd、dAb和保持抗原结合功能(例如,特异性结合HSA)的其它抗体片段。通常,这样的片段应当包括抗原结合结构域。基本的4链抗体单元是由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个基本的异四聚体单元与另外一个称为J链的多肽组成,且含有10个抗原结合位点,而IgA抗体包括2-5个可以与J链相结合聚合形成多价组合的基本4链单元。就IgG而言,4链单元一般为约150,000道尔顿。每个L链通过一个共价二硫键与H链连接,而两个H链通过一个或多个取决于H链同种型的二硫键相互连接。每个H和L链还具有规则间隔的链内二硫化桥键。每个H链在N末端具有可变结构域(VH),对于α和γ链各自继之以三个恒定结构域(CH)、对于μ和ε同种型继之以四个CH结构域。每个L链在N末端具有可变结构域(VL),在其另一端具有恒定结构域。VL与VH对应,且CL与重链的第一恒定结构域(CH1)相对应。特定的氨基酸残基被认为在轻链和重链可变结构域之间形成界面。VH和VL配对一起形成单个抗原结合位点。对于不同类别抗体的结构和性质,参见例如Basic and Clinical Immunology,8th Edition,Daniel P.Sties,Abba I.Terr and Tristram G.Parsolw(eds),Appleton&Lange,Norwalk,Conn.,1994,第71页和第6章。来自任何脊椎动物物种的L链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列被分为两种明显不同的类型中的一种,称为κ和λ。根据 重链(CH)恒定结构域的氨基酸序列,可以将免疫球蛋白分为不同的类别或同种型。目前存在五类免疫球蛋白:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,具有分别被命名为α、δ、ε、γ和μ的重链。
在本申请中,术语“抗原结合片段”通常指具有特异结合抗原(例如,HSA)能力的一个或多个片段。在本申请中,所述抗原结合片段可以包括Fab,Fab’,F(ab)
2、Fv片段、F(ab’)
2,scFv,di-scFv,dAb和/或V
HH。
在本申请中,术语“Fab”通常指抗体的抗原结合片段。如上所述,可以使用木瓜蛋白酶消化完整的抗体。抗体经木瓜蛋白酶消化后产生两个相同的抗原结合片段,即“Fab”片段,和残余的“Fc”片段(即Fc区,同上)。Fab片段可以由一条完整的L链与一条重链的可变区和该H链(V
H)的第一恒定区(C
H1)组成。
在本申请中,术语“Fab′片段”通常指人单克隆抗体的单价抗原结合片段,该片段比Fab片段稍大。例如,Fab′片段可以包括所有轻链,所有重链可变区以及重链的所有或部分第一和第二恒定区。例如,Fab′片段还可包括重链的部分或所有的220-330个氨基酸残基。
在本申请中,术语“F(ab')2”通常指通过胃蛋白酶消化完整抗体所产生的抗体片段。F(ab')2片段含有由二硫键维持在一起的两个Fab片段和部分铰链区。F(ab')2片段具有二价抗原结合活性并且能够交联抗原。
在本申请中,术语“Fv片段”通常指人单克隆抗体的单价抗原结合片段,包括所有或部分重链可变区和轻链可变区,并且缺乏重链恒定区和轻链恒定区。重链可变区和轻链可变区包括例如CDR。例如,Fv片段包括重链和轻链的约110个氨基酸的所有或部分氨基端可变区。
在本申请中,术语“scFv”通常指包含至少一个包括轻链的可变区抗体片段和至少一个包括重链的可变区的抗体片段的融合蛋白,其中所述轻链和重链可变区是邻接的(例如经由合成接头例如短的柔性多肽接头),并且能够以单链多肽形式表达,且其中所述scFv保留其所来源的完整抗体的特异性。除非特别说明,否则如本申请中使用的那样,scFv可以以任何顺序(例如相对于多肽的N末端和C末端)具有所述的VL和VH可变区,scFv可以包括VL-接头-VH或可以包括VH-接头-VL。
在本申请中,术语“dAb”通常是指具有VH域、VL域或具有VH域或VL域的抗原结合片段,参考例如Ward等人(Nature,1989Oct 12;341(6242):544-6),参考Holt等人,Trends Biotechnol.,2003,21(11):484-490;以及参考例如WO 06/030220、WO 06/003388和DomantisLtd的其它公布的专利申请。在本申请中,术语“dAb”可以包括sdAb,术语“sdAb”通常指单结构域抗原结合分子,在本申请中,该术语可以包括单域抗体,以及V
HH。
在本申请中,术语“单克隆抗体”通常指单分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体通常针对单个抗原位点具有高度特异性。而且,与常规多克隆抗体制剂(通常具有针对不同决定簇的不同抗体)不同,各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外,单克隆抗体的优点在于它们可以通过杂交瘤培养合成,不受其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征,并且不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如,本申请使用的单克隆抗体可以在杂交瘤细胞中制备,或者可以通过重组DNA方法制备。
在本申请中,术语“嵌合抗体”通常是指其中可变区源自一个物种,而恒定区源自另一个物种的抗体。通常,可变区源自实验动物诸如啮齿动物的抗体(“亲本抗体”),且恒定区源自人类抗体,使得所得嵌合抗体与亲本(例如羊驼来源)抗体相比,在人类个体中引发不良免疫反应的可能性降低。
在本申请中,术语“人源化抗体”通常是指非人抗体(例如羊驼抗体)的CDR区以外的部分或全部有的氨基酸被源自人免疫球蛋白的相应的氨基酸置换的抗体。在CDR区中,氨基酸的小的添加、缺失、插入、置换或修饰也可以是允许的,只要它们仍保留抗体结合特定抗原的能力。人源化抗体可任选地包含人类免疫球蛋白恒定区的至少一部分。“人源化抗体”保留类似于原始抗体的抗原特异性。非人(例如羊驼)抗体的“人源化”形式可以最低限度地包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在某些情形中,可以将人免疫球蛋白(受体抗体)中的CDR区残基用具有所期望性质、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)(诸如羊驼,小鼠,大鼠,家兔或非人灵长类动物)的CDR区残基替换。在某些情形中,可以将人免疫球蛋白的FR区残基用相应的非人残基替换。此外,人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有的氨基酸修饰。进行这些修饰可以是为了进一步改进抗体的性能,诸如结合亲和力。
术语“全人源抗体”通常指仅包含人类免疫球蛋白蛋白质序列的抗体。如果其是在小鼠中、在小鼠细胞中或在衍生自小鼠细胞的杂交瘤中生产,那么全人源抗体可能含有鼠糖链。类似地,“小鼠抗体”或“大鼠抗体”分别指仅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白序列的抗体。可通过噬菌体展示或其它分子生物学方法,在人体内、在具有人类免疫球蛋白种系序列的转基因动物体内生成全人源抗体。可用于制造抗体的示例性技术在美国专利:6,150,584、6,458,592、6,420,140中描述。其它技术,如使用文库,是本领域已知的。
在本申请中,术语“核酸分子”通常指任何长度的分离形式的核苷酸,脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸,或从其天然环境分离的或人工合成的类似物。
在本申请中,术语“载体”通常指可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞,使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。一种载体可能含有多种控制表达的元件,包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外,载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的成分,如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳,但不仅仅只有这些物质。
在本申请中,术语“细胞”通常指可以是或已经是受试者质粒或载体的接受者的单个细胞、细胞系或细胞培养物,其包括本发明所述的核酸分子或本发明所述的载体。细胞可以包括单个细胞的后代。由于天然、偶然或有意的突变,后代可以不一定与原始母细胞完全相同(在总DNA互补体的形态上或在基因组上)。细胞可包括用本申请所述的载体在体外转染的细胞。
在本申请中,术语“药物组合物”通常指用于预防/治疗疾病或病症的组合物。所述药物组合物可以包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞,以及任选地药学上可接受的佐剂。此外,所述药物组合物还可以包含一种或多种(药学上有效的)载剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂和/或防腐剂的合适的制剂。组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下通常对接受者无毒。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。
在本申请中,术语“药学上可接受的载剂”通常包括药剂学可接受的载体、赋形剂或稳定剂,它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。生理学可接受的载体可包括例如缓冲剂,抗氧化剂,低分子量(少于约10个残基)多肽,蛋白质,亲水性聚合物,氨基酸,单糖,二糖和其它碳水化合物,螯合剂,糖醇,成盐反荷离子,例如钠;和/或非离子表面活性剂。
在本申请中,术语“特异性结合”或“特异性的”通常指可测量的和可再现的相互作用,例如靶标和抗体之间的结合,可在分子(包括生物分子)的异质群体存在的情况决定靶标的存在。例如,特异性结合靶标(其可以为表位)的抗体可以是以比它结合其它靶标更大的亲和性、亲合力、更容易、和/或以更大的持续时间结合该靶标的抗体。在某些实施方案中,抗体特异性结合蛋白质上的表位,所述表位在不同种属的蛋白质中是保守的。在某些实施方案中,特异性结合可以包括但不要求排他性地结合。
在本申请中,术语“受试者”通常指人类或非人类动物,包括但不限于猫、狗、马、猪、奶牛、羊、兔、小鼠、大鼠或猴。
在本申请中,涉及的蛋白质、多肽和/或氨基酸序列,还应理解为至少包含以下的范围:与该所述蛋白质或多肽具备相同或类似功能的变体或同源物。
在本申请中,所述变体可以为,例如在所述蛋白质和/或所述多肽(例如,特异性结合HSA的抗体或其片段)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的蛋白质或多肽。例如,所述功能性变体可包含已经通过至少1个,例如1-30个、1-20个或1-10个,又例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失和/或插入而具有氨基酸改变的蛋白质或多肽。所述功能性变体可基本上保持改变(例如取代、缺失或添加)之前的所述蛋白质或所述多肽的生物学特性。例如,所述功能性变体可保持改变之前的所述蛋白质或所述多肽的至少60%,70%,80%,90%,或100%的生物学活性(例如抗原结合能力)。例如,所述取代可以为保守取代。
在本申请中,所述同源物可以为与所述蛋白质和/或所述多肽(例如,特异性结合HSA的抗体或其片段)的氨基酸序列具有至少约85%(例如,具有至少约85%、约87%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或更高的)序列同源性的蛋白质或多肽。
在本申请中,所述同源性通常是指两个或多个序列之间的相似性、类似或关联。可以通过以下方式计算“序列同源性百分比”:将两条待比对的序列在比较窗中进行比较,确定两条序列中存在相同核酸碱基(例如,A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如,Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目以得到匹配位置的数目,将匹配位置的数目除以比较窗中的总位置数(即,窗大小),并且将结果乘以100,以产生序列同源性百分比。为了确定序列同源性百分数而进行的比对,可以按本领域已知的多种方式实现,例如,使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数,包括为实现正在比较的全长序列范围内或目标序列区域内最大比对所需要的任何算法。所述同源性也可以通过以下的方法测定:FASTA和BLAST。对FASTA算法的描述可以参见W.R.Pearson和D.J.Lipman的“用于生物学序列比较的改进的工具”,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.),85:2444-2448,1988;和D.J.Lipman和W.R.Pearson的“快速灵敏的蛋白质相似性搜索”,Science,227:1435-1441,1989。对BLAST算法的描述可参见S.Altschul、W.Gish、W.Miller、E.W.Myers和D.Lipman的“一种基本的局部对比(alignment)搜索工具”,分子生物学杂志,215:403-410,1990。
在本申请中,术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下,也 表示“为”、“由……组成”的含义。
在本申请中,术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5%-10%的范围内变动,例如在指定数值以上或以下0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、或10%的范围内变动。
发明详述
分离的抗原结合蛋白
抗体的CDR又称互补决定区,是可变区的一部分。该区域的氨基酸残基可以与抗原或抗原表位接触。抗体CDR可以通过多种编码系统来确定,如CCG、Kabat、Chothia、IMGT、AbM、综合考虑Kabat/Chothia等。这些编码系统为本领域内已知,具体可参见,例如,http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html#kabatnum。本领域技术人员可以根据抗体的序列和结构,用不同的编码系统确定出CDR区。使用不同的编码系统,CDR区可能存在差别。在本申请中,所述CDR涵盖根据任何CDR划分方式划分得到的CDR序列;也涵盖其变体,所述变体包括所述CDR的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸。例如1-30个、1-20个或1-10个,又例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸取代、缺失和/或插入;也涵盖其同源物,所述同源物可以为与所述CDR的氨基酸序列具有至少约85%(例如,具有至少约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或更高的)序列同源性的氨基酸序列。在某些实施方式中,所述CDR通过Chothia编码系统来划分。
一方面,本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白,其包含抗体重链可变区VH中的至少一个CDR,所述VH包含SEQ ID NO:26或38所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述分离的抗原结合蛋白可以包含HCDR3,所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列。例如,所述分离的抗原结合蛋白的HCDR3可以包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。例如,所述分离的抗原结合蛋白的HCDR3可以包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述分离的抗原结合蛋白可以包含HCDR2,所述HCDR2包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。例如,所述HCDR2包含SEQ ID NO:2、31或32所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述分离的抗原结合蛋白可以包含HCDR1,所述HCDR1包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。例如,所述HCDR1包含SEQ ID NO:3或30所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述分离的抗原结合蛋白可以包含HCDR1,HCDR2和HCDR3,所述HCDR1包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列,所述HCDR2包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序 列,且所述HCDR3包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列。
例如,所述分离的抗原结合蛋白的HCDR1可以包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列,所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列,且所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。例如,所述分离的抗原结合蛋白的HCDR1可以包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列,所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列,且所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。例如,所述分离的抗原结合蛋白的所述HCDR1包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列,所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列,且所述HCDR3包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。例如,所述分离的抗原结合蛋白的所述HCDR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列,所述HCDR2包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列,且所述HCDR3包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。例如,所述分离的抗原结合蛋白的所述HCDR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列,所述HCDR2包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列,且所述HCDR3包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述分离的抗原结合蛋白可以包含H-FR1,所述H-FR1的C端与所述HCDR1的N端直接或间接相连,且所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述分离的抗原结合蛋白的H-FR1包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述分离的抗原结合蛋白可以包含H-FR2,所述H-FR2位于所述HCDR1和所述HCDR2之间,且所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述分离的抗原结合蛋白的H-FR2可以包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:15中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述分离的抗原结合蛋白可以包含H-FR3,所述H-FR3位于所述HCDR2和所述HCDR3之间,且所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述分离的抗原结合蛋白的H-FR3可以包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述分离的抗原结合蛋白可以包含H-FR4,所述H-FR4的N端与所述H-CDR3的C端直接或间接相连,且所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述分离的抗原结合蛋白的H-FR4可以包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述分离的抗原结合蛋白可以包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4。例如,所述分离的抗原结合蛋白的所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列,所 述H-FR2可以包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列,所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列,且所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。例如,所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列,所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列,所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列,且所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。例如,所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列,所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列,所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列,且所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。例如,所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列,所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列,所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列,且所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。例如,所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列,所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列,所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列,且所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。例如,所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列,所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列,所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列,且所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述分离的抗原结合蛋白的VH包含与SEQ ID NO:17所示的氨基酸相比,在以下一个或多个位置的氨基酸突变:H1,H13,H44,H45,H49,H74,H76,H79,H81,H82B,H83,H84,H108,所述位置由Chothia编码系统确定。例如,所述突变包含在位置H1由天冬氨酸D替换为谷氨酸E。例如,所述突变包含在位置H13由谷氨酸E替换为谷氨酰胺Q。例如,所述突变包含在位置H44由谷氨酸E替换为甘氨酸G。例如,所述突变包含在位置H45由精氨酸R替换为亮氨酸L。例如,所述突变包含在位置H49由丙氨酸A替换为丝氨酸S。例如,所述突变包含在位置H74由精氨酸R替换为丝氨酸S。例如,所述突变包含在位置H76由赖氨酸K替换为天冬酰胺N。例如,所述突变包含在位置H79由丝氨酸S替换为酪氨酸Y。例如,所述突变包含在位置H81由天冬氨酸D替换为谷氨酰胺Q。例如,所述突变包含在位置H82B由天冬氨酸D替换为丝氨酸S。例如,所述突变包含在位置H83由赖氨酸K替换为精氨酸R。例如,所述突变包含在位置H84由脯氨酸P替换为丙氨酸A。例如,所述突变包含在位置H108由谷氨酰胺Q替换为甲硫氨酸M。例如,所述突变包含在位置H108由谷氨酰胺Q替换为亮氨酸L。
在本申请中,所述分离的抗原结合蛋白可以包含VH,且所述VH可以包含SEQ ID NO:26或38所示的氨基酸序列。例如,所述VH可以包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。例 如,所述VH可以包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。例如,所述VH可以包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。例如,所述VH可以包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。例如,所述VH可以包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。例如,所述VH可以包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。例如,所述VH可以包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。例如,所述VH可以包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述分离的抗原结合蛋白可以包含抗体重链恒定区。在某些实施方式中,所述抗体重链恒定区源自人抗体重链恒定区。在某些实施方式中,所述抗体重链恒定区源自人IgG重链恒定区。在某些实施方式中,所述抗体重链恒定区源自人IgG1重链恒定区。在某些实施方式中,所述人IgG1重链恒定区包含人IgG1Fc。在某些实施方式中,所述人IgG1Fc包含N297A的氨基酸修饰。
在本申请中,所述分离的抗原结合蛋白可以包括抗体或其抗原结合片段。
在本申请中,所述抗原结合片段可以包括Fab,Fab’,Fv片段,F(ab’)
2,scFv,di-scFv,dAb和/或V
HH。在某些实施方式中,所述抗原结合片段为V
HH。
在本申请中,所述抗体可以选自下组:单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
在本申请中,所述分离的抗原结合蛋白可以包含单域抗体。例如,本申请所述的单域抗体包含在本申请的实施例中制备的编号为Ab0716.1、Ab0716.2、Ab0716.4、Ab0716.Hz1和/或Ab0716.Hz2的单域抗体。例如,本申请所述的单域抗体包含在本申请的实施例中制备的编号为Ab0716Am01、Ab0716Am02、或Ab0716Am06的单域抗体。
在本申请中,所述单域抗体可以包含HCDR3,且所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列。例如,所述单域抗体的HCDR3可以包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。例如,所述单域抗体的HCDR3可以包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述单域抗体可以包含HCDR2,且所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述单域抗体可以包含HCDR1,且所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述单域抗体可以包含HCDR1,HCDR2和HCDR3,所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列,所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列,且所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列。例如,所述单域抗体的HCDR1可以包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列,所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:2所 示的氨基酸序列,所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。例如,所述单域抗体的HCDR1可以包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列,所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列,所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。例如,所述单域抗体的所述HCDR1包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列,所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列,且所述HCDR3包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。例如,所述单域抗体的所述HCDR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列,所述HCDR2包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列,且所述HCDR3包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。例如,所述单域抗体的所述HCDR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列,所述HCDR2包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列,且所述HCDR3包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述单域抗体可以包含H-FR1,所述H-FR1的C端与所述HCDR1的N端直接或间接相连,且所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。例如,所述单域抗体的H-FR1可以包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。例如,所述单域抗体的H-FR1可以包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。例如,所述单域抗体的H-FR1可以包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。例如,所述单域抗体的H-FR1可以包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述单域抗体可以包含H-FR2,所述H-FR2位于所述HCDR1和所述HCDR2之间,且所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。例如,所述单域抗体的H-FR2可以包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。例如,所述单域抗体的H-FR2可以包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。例如,所述单域抗体的H-FR2可以包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。例如,所述单域抗体的H-FR2可以包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述单域抗体可以包含H-FR3,所述H-FR3位于所述HCDR2和所述HCDR3之间,且所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。例如,所述单域抗体的H-FR3可以包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。例如,所述单域抗体的H-FR3可以包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述单域抗体可以包含H-FR4,所述H-FR4的N端与所述H-CDR3的C端直接或间接相连,且所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。例如,所述单域抗体的H-FR4可以包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。例如,所述单域抗体的H-FR4可以包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。例如,所述单域抗体的H-FR4可以包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述单域抗体可以包含H-FR1,H-FR2,H-FR3和H-FR4。例如,所述H- FR1可以包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列,所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列,所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列,且所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。例如,所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列,所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列,所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列,且所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。例如,所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列,所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列,所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列,且所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。例如,所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列,所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列,所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列,且所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。例如,所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列,所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列,所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列,且所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述单域抗体可以包含V
HH,所述V
HH可以包含SEQ ID NO:26或38所示的氨基酸序列。例如,所述V
HH可以包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。例如,所述V
HH可以包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。例如,所述V
HH可以包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。例如,所述V
HH可以包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。例如,所述V
HH可以包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。例如,所述V
HH可以包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。例如,所述V
HH可以包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。例如,所述V
HH可以包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。
例如,在本申请中,单域抗体Ab0716.1的所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述H-FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示,所述H-FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示,所述H-FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示,且所述H-FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。例如,所述单域抗体Ab0716.1的V
HH的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。
例如,在本申请中,单域抗体Ab0716.2的所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示,所述H-FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示,所述H-FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示,所述H-FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示,所述H-FR4的氨基酸 序列如SEQ ID NO:7所示。例如,所述单域抗体Ab0716.2的V
HH的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。
例如,在本申请中,单域抗体Ab0716.4的所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述H-FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示,所述H-FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示,所述H-FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示,且所述H-FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。例如,所述单域抗体Ab0716.4的V
HH的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示。
例如,在本申请中,单域抗体Ab0716.Hz1的所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述H-FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示,所述H-FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示,所述H-FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示,且所述H-FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。例如,在本申请中,所述单域抗体Ab0716.Hz1的V
HH的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。
例如,在本申请中,单域抗体Ab0716.Hz2的所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述H-FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示,所述H-FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示,所述H-FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示,且所述H-FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。例如,在本申请中,所述单域抗体Ab0716.Hz2的V
HH的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。
例如,所述单域抗体Ab0716Am01的所述HCDR1包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列,所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列,且所述HCDR3包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
例如,所述单域抗体Ab0716Am02的所述HCDR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列,所述HCDR2包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列,且所述HCDR3包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
例如,所述单域抗体Ab0716Am06的所述HCDR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列,所述HCDR2包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列,且所述HCDR3包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在本申请中,所述分离的抗原结合蛋白能够结合人血清白蛋白。例如,本申请所述抗原 结合蛋白可以以小于或等于2.0×10
-9M,小于或等于1.9×10
-9M,小于或等于1.8×10
-9M,小于或等于1.7×10
-9M,小于或等于1.6×10
-9M,小于或等于1.5×10
-9M,小于或等于1.4×10
-9M,小于或等于1.3×10
-9M,小于或等于1.2×10
-9M,小于或等于1.1×10
-9M,小于或等于1.0×10
-9M,小于或等于9×10
-10M,小于或等于8×10
-10M,小于或等于7×10
-10M,小于或等于6×10
-10M,小于或等于5×10
-10M,小于或等于4.15×10
-10M,小于或等于4×10
-10M,小于或等于3.93×10
-10M,小于或等于3×10
-10M,小于或等于2×10
-10M的KD值与HSA结合。
在本申请中,所述分离的抗原结合蛋白的Tm值能够大于或等于59.5℃,大于或等于59.6℃,大于或等于59.7℃,大于或等于59.8℃,大于或等于59.9℃,大于或等于60.0℃,大于或等于60.1℃,大于或等于60.2℃,大于或等于60.5℃,大于或等于61.0℃,大于或等于61.5℃,大于或等于62℃,大于或等于62.5℃,大于或等于62.9℃,大于或等于63℃,大于或等于63.5℃,大于或等于64℃。
融合蛋白、核酸分子、载体、细胞和药物组合物
另一方面,本申请提供了融合蛋白,其可以包含本申请所述的抗原结合蛋白。
另一方面,本申请提供了分离的核酸分子,其可以编码本申请所述的分离的抗原结合蛋白。例如,其可以是通过以下方法产生或合成的:(i)在体外扩增的,例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的;(ii)通过克隆重组产生的;(iii)纯化的,例如通过酶切和凝胶电泳分级分离;或者(iv)合成的,例如通过化学合成。
另一方面,本申请提供了一种载体,其可以包含本申请所述的核酸分子。此外,所述载体中还可包含其他基因,例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外,所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的,例如,可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。所述载体可通过转化、转导或转染宿主细胞,使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。所述载体可以包括,例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者在例如遗传工程中通常使用的其他载体。例如,所述载体为表达载体。此外,所述载体还可以包括有协助其进入细胞的成分,如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳,但不仅仅只有这些物质。
另一方面,本申请提供了一种细胞,其可以包含本申请所述的核酸分子或本申请所述的载体。在某些实施方式中,每种或每个宿主细胞可包含一个或一种本申请所述的核酸分子或载体。在某些实施方式中,每种或每个宿主细胞可包含多个(例如,2个或以上)或多种(例 如,2种或以上)本申请所述的核酸分子或载体。例如,可将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中,例如真核细胞,如来自植物的细胞、真菌或酵母细胞等。在某些实施方式中,所述细胞可以是细菌细胞(例如,大肠杆菌)、酵母细胞或其它真核细胞,例如COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、CHO-K1细胞、LNCAP细胞、HeLa细胞、293T细胞、COS-1细胞、SP2/0细胞、NS0细胞或骨髓瘤细胞。
另一方面,本申请还提供了药物组合物,其可以包含所述分离的抗原结合蛋白,所述核酸分子、所述载体和/或所述细胞,以及任选地药学上可接受的载剂。
在某些实施方案中,所述药物组合物还可以包含一种或多种(药学上有效的)佐剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂和/或防腐剂的合适的制剂。组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下通常对接受者无毒。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。
在某些实施方案中,所述药物组合物还可含有多于一种活性化合物,通常为不会不利地影响彼此的具有互补活性的那些活性化合物。此类药物的类型和有效量可以取决于例如制剂中存在的拮抗剂的量和类型,以及受试者的临床参数。
在某些实施方案中,所述药学上可接受的载剂可以包括与药物给药相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收延迟剂,通常安全、无毒。
在某些实施方案中,所述药物组合物可以包含肠胃外、经皮、腔内、动脉内、鞘内和/或鼻内施用或直接注射到组织中。例如,所述药物组合物可以通过输注或注射施用于患者或者受试者。在某些实施方案中,所述药物组合物的施用可以通过不同的方式进行,例如静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或真皮内施用。在某些实施方案中,所述药物组合物可以不间断施用。所述不间断(或连续)施用可以通过患者佩戴的小泵系统来实现,以测量流入患者体内的治疗剂,如WO2015/036583所述。
制备方法
另一方面,本申请提供了制备所述分离的抗原结合蛋白的方法。所述方法可包括,在使得所述的抗原结合蛋白表达的条件下,培养所述本申请所述的宿主细胞。例如,可通过使用适当的培养基、适当的温度和培养时间等,这些方法是本领域普通技术人员所了解的。
任何适于产生单克隆抗体的方法都可用于产生本申请的抗原结合蛋白。例如,通过纳米抗体噬菌体文库淘选、扩增,构建酵母展示文库筛选所述单域抗体。
在本申请中,所述分离的抗原结合蛋白可以通过以下方法制备:选用纳米抗体噬菌体文库针对生物素标记的HSA进行淘选。以淘选后的质粒为模板扩增单域抗体,将扩增的片段与 酵母展示质粒共转入酿酒酵母,在酵母细胞壁表面展示单链抗体。
例如,本申请提供了一种用于检测或测定人血清白蛋白的方法,所述方法包括使用本申请的分离的抗原结合蛋白或本申请的融合蛋白。在本申请中,所述方法可包括体外方法,离体方法,非诊断或非治疗目的的方法。
另一方面,本申请提供了一种人血清白蛋白的试剂盒,其可包括使用所述分离的抗原结合蛋白或所述的融合蛋白。
在本申请中,所述试剂盒还可包含使用说明,所述使用说明记载用于检测人血清白蛋白的存在和/或含量的方法。例如,所述方法可包括体外方法,离体方法,非诊断或非治疗目的的方法。
另一方面,本申请提供了一种所述的分离的抗原结合蛋白或所述的融合蛋白在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒可用于检测人血清白蛋白的存在和/或含量的方法。例如,所述方法可包括体外方法,离体方法,非诊断或非治疗目的的方法。
另一方面,本申请提供了所述的分离的抗原结合蛋白,所述的融合蛋白,所述的核酸分子、所述的载体、所述的细胞、所述的药物组合物和/或所述的试剂盒用于预防、缓解和/或治疗疾病或病症。
另一方面,本申请提供了一种所述的分离的抗原结合蛋白,所述的融合蛋白,所述的核酸分子、所述的载体、所述的细胞、所述的药物组合物和/或所述的试剂盒在制备药物中的用途,所述药物用于预防、缓解和/或治疗疾病或病症。
另一方面,本申请提供了一种预防和/或治疗疾病或病症的方法,其包括向有需要的受试者施用所述的分离的抗原结合蛋白,所述的融合蛋白,所述的核酸分子、所述的载体、所述的细胞、所述的药物组合物和/或所述的试剂盒。
本申请所述药物组合物、药物组合及方法可与其他类型的癌症疗法结合使用,诸如化学疗法、手术、放射、基因疗法等。本申请中所描述的药物组合物及方法可用于其他依赖于免疫反应的疾病病状。
在本申请中,所述受试者可以包括人或非人动物。例如,所述非人动物可以选自下组:猴、鸡、鹅、猫、狗、小鼠和大鼠。此外,非人动物也可以包括任何除人以外的动物物种,例如家畜动物,或啮齿类动物,或灵长类动物,或家养动物,或家禽动物。所述人可以是高加索人、非洲人、亚洲人、闪族人,或其他种族,或各种种族的杂合体。又例如,所述人可以是老年、成年、青少年、儿童或者婴儿。
可以根据在实验动物中的有效量推测在人类中的有效量。例如,Freireich等人描述了动 物和人的剂量的相互关系(基于每平方米身体表面的毫克数)(Freireich et al.,Cancer Chemother.Rep.50,219(1966))。身体表面积可以从患者的身高和体重近似确定。参见例如Scientific Tables,Geigy Pharmaceuticals,Ardsley,N.Y.,537(1970)。
不欲被任何理论所限,下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的抗原结合蛋白、制备方法和用途等,而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1酵母展示文库构建与筛选
选用自建的纳米抗体噬菌体文库,针对生物素标记的人血清白蛋白(以下简称HSA-Biotin,acro,货号:HSA-H82E3)进行两轮淘选,获得阳性富集。以噬菌体两轮淘选后质粒为模板,设计引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增单链抗体(V
HH);PCR扩增的V
HH基因片段回收后与酵母展示质粒共转入酿酒酵母菌株EBY100(购自ATCC),通过酿酒酵母的同源重组使V
HH基因插入至酵母展示质粒中,进而实现在酵母细胞壁表面展示单链抗体,如图1。酵母展示单链抗体库命名为JYYDL032。文库JYYDL032电转后在100mL的SD-Trp培养基(Clontech,货号:630308),30℃、225转/分钟培养过夜;取1.0×10
8细胞重悬于20mL YPGP液体培养基(2%半乳糖,2%蛋白胨,1%酵母提取物,0.54%Na
2HPO
4,0.86%NaH
2PO
4·H
2O),20℃、225转/分钟培养24小时,置于4℃冰箱待用。
文库诱导后菌液,测定菌液的OD
600,按1OD为1.0×10
7细胞数计算,取1.0×10
8细胞,用磁珠分选系统进行第一轮富集:1.用20mL 1×PBSA(1×PBS+1%BSA)洗涤一次,3000转/分钟离心3分钟(以下离心均为此条件)弃上清;2.与50mL含1nM HSA-Biotin的1×PBSA,室温孵育30分钟;3.洗涤后加入抗生物素的磁珠(miltenyi,货号:130-090-485)混匀孵育10min,过磁力柱(Quadro MACS Starting Kit)收集阳性细胞。
阳性细胞经过再次培养、诱导后,取4.0×10
7细胞进行第二轮流式分选:1)用1mL 1×PBSA,离心弃上清;2)与1mL含1nM HSA-Biotin及鼠抗V5抗体(Invitrogen,货号2156578,1:1000稀释)的1×PBSA冰上孵育30min;3)离心弃上清,加入1mL 1×PBSA洗涤一次;4)加入200μL含荧光抗体的1×PBSA(SA-PE厂家eBioscience,货号:12-4317-8,按1:200稀释;羊抗鼠-647厂家Invitrogen,货号:A21235,按1:400稀释),避光冰上孵育20分钟;5)重复步骤3,加入2mL 1×PBSA重悬细胞,通过流式分选仪器收集647荧光信号与PE荧光信号均强的细胞群。分选后取部分细胞涂布于SD-Trp固体培养基(Clontech,货号:630309)平板,30℃静置培养3天。
实施例2单克隆酵母菌落测序与流式染色鉴定
JYYDL032第二轮筛选产物,涂布于SD-Trp平板,30℃静置培养3天生长出酵母单克隆菌落。挑取92个单克隆进行测序分析,最终获得3个独一的单链抗体序列(表1)。将对照抗体的序列(源自Ablynx,ALX-0761,氨基酸序列见SEQ ID NO:27)展示于酵母表面,作为阳性对照抗体,如表2对相应的酵母单克隆菌落进行流式染色分析,各取1×10
6个细胞按表2方案进行染色评估:方案1评估各克隆与HSA-Biotin结合水平,PE平均荧光信号强度(MFI)越强代表结合能力越强;方案2评估各克隆与无关抗原的非特异性结合水平,PE的MFI值越低说明非特异性越弱;方案3评估各克隆与对照抗体(内部制备)的竞争信号,APC的MFI值越低说明竞争性越强。
表1单链抗体序列测定
抗体编号 | 氨基酸序列(SEQ ID NO:) |
Ab0716.1 | SEQ ID NO:17 |
Ab0716.2 | SEQ ID NO:18 |
Ab0716.4 | SEQ ID NO:19 |
表2单克隆酵母菌落流式染色鉴定方案
根据各克隆按方案1、2、3的染色结果,综合各克隆序列的相似性,最终挑取克隆Y24A2、Y24A5、Y24B2的序列进行抗体表达,如表3。
表3 JYYDL032文库二轮筛选后酵母单克隆菌落流式染色分析结果
实施例3候选抗体表达
将各克隆的V
HH序列与IgG1Fc N297A融合,进行密码子优化,基因合成后装入表达载体pcDNA3.4(Life Technologies)。表达质粒扩增和质粒抽提后质粒转入ExpiCHO细胞(ThermoFisher Scientific,A29133),根据供应商ExpiCHO表达系统方法进行抗体瞬转表达,过程如下:在培养总体积25mL培养基中,36.5℃,8%二氧化碳浓度下培养Expi CHO细胞到密度6×10
6/mL,使用ExpiFectamine转染试剂化转各10μg抗体轻重链表达质粒到细胞;转染一天后,各取150μL和4mL ExpiCHO增强剂和ExpiCHO辅料添加到培养细胞中,继续培养至9天,4度,3500转离心取上清。混合AmMagTM Protein A磁珠(Genscript,L00695)和抗体表达上清,室温孵育2小时,PBS洗涤两次弃上清,加入适量洗脱缓冲液Protein G or A SefinoseTM Elution buffer(Sangon,C600481),充分混匀后置于试管架上静止孵育5分钟,孵育期间重悬磁珠2-3次,重复洗脱2次,洗脱后,立即加入适量中和液1M Tris-HCl,pH7.5(Sangon,B548124)中和备用,得到纯化的抗体见表4。
表4候选抗体表达、纯化数据
抗体编号 | 理论等电点 | 表达量(mg/L) |
阳性对照抗体 | 7.4 | 172 |
Ab0716.1 | 6.7 | 105 |
Ab0716.2 | 6.7 | 118 |
Ab0716.4 | 7 | 76 |
实施例4候选抗体亲和力测定
为了测定阳性对照抗体、Ab0716.1、Ab0716.2、Ab0716.4抗体与人血清白蛋白的亲和力,采用Octet RED96e(Fortebio)测定候选抗体与HSA(Acro,货号:HSA-H522a)的亲和力,抗原及抗体均用1×PBST(1×PBS:生工,B548117-0500;0.02%吐温20:sigma,P1379)稀释,抗原使用浓度为100nM,抗体使用浓度为64nM。将候选抗体样品按200μL/孔加入96孔板(Greiner bio-one,655209),设置软件参数,温度30℃、收集标准动力学信号的频率为5.0Hz;用1×PBST预湿AHC传感器(Fortébio,货号:18-0015)10分钟,然后上机检测。每个循环包含以下步骤:1)浸入缓冲液60s;2)检测抗原是否与传感器有非特异性结合;3)10mM pH1.7的甘氨酸溶液再生;4)浸入缓冲液60s;5)抗体固化在传感器上,时间为 30s;6)传感器浸入缓冲液180s;7)抗原与抗体结合,时间180s;8)抗原抗体的解离,时间10分钟;9)传感器再生。采用Fortebio的Data Analysis 12.0软件,对抗原-抗体以1:1的结合方式,测定结合速率(K
on)和解离速率(K
off),以此计算抗体的平衡解离常数(K
D),结果如表5。
表5候选抗体与HSA的亲和力测定
抗体编号 | 响应值 | K D(M) | kon(1/Ms) | kdis(1/s) |
阳性对照抗体 | 0.62 | 1.33E-08 | 1.88E+05 | 2.50E-03 |
Ab0716.1 | 0.93 | 3.93E-10 | 3.66E+05 | 1.44E-04 |
Ab0716.2 | 0.93 | 4.15E-10 | 4.12E+05 | 1.71E-04 |
Ab0716.4 | 0.81 | 1.26E-09 | 2.17E+05 | 2.75E-04 |
由表5可知,候选抗体均可与HSA结合,且亲和力显著强于阳性对照抗体。
实施例5候选抗体理化性质评估
根据实施例3和实施例4的实验结果,抗体Ab0716.1、Ab0716.2的表达量及亲和力较为理想,作为候选分子继续进行理化成药性评估,具体如下:
SEC-HPLC纯度分析
(1)将样品浓度调整至1mg/mL,混匀,12000rpm离心5min,取上清转至样品瓶,放入HPLC样品盘。设置色谱条件如下:
(2)色谱柱采用流动相(200mM磷酸盐缓冲液,pH6.8)平衡后,进样分析,用色谱软件进行数据分析,峰面积归一化法计算各个峰的峰面积百分比,百分比越高说明抗体纯度越高。
HIC-HPLC分析
(1)将样品浓度调整至1mg/ml,离心取上清待测。设置色谱条件如下:
(2)用流动相A(50mM磷酸盐缓冲液/1M硫酸铵,pH 7.0)和流动相B(50mM磷酸盐缓冲液,pH 7.0)进行梯度洗脱,记录主峰保留时间,出峰时间短则抗体亲水性强。
熔解温度(Tm)值分析
将样品浓度调整至1mg/mL,然后按照Protein Thermal Shift
TM Starter Kit说明书,取供试品溶液13μL加入至PCR管内,加入5μL Protein Thermal shift
TM Buffer,加入2μL10×染色液,使反应体积为20μL,混匀后,12000rpm离心5min以去除气泡。将检测样品置于PCR仪内,进行样品分析,记录样品的Tm值,Tm值越高表示抗体的热稳定性越好。
根据表6可知,候选抗体Ab0716.1的纯度、热稳定性、亲水性等理化指标较为理想,将Ab0716.1作为候选分子继续进行人源化,提高与人源抗体的同源性,以降低免疫原性。
表6候选抗体理化性质分析结果
实施例6候选抗体Ab0716.1人源化与表达
综合实施例3-5的实验结果,最终挑取候选抗体Ab0716.1的V
HH序列进行人源化。将Ab0716.1的V
HH序列进行IMGT/Domain Gap Align,查找与其同源性最高的人源的germline为IGHV3-23*04。Ab0716.1序列按Chothia规则编号,对H1、H13、H44、H45、H49、H74、H76、H79、H81、H82B、H83、H84、H108等位点按表7进行突变,其他位点氨基酸保持不 变。Ab0716Hz1的V
HH序列如SEQ ID NO:20所示,Ab0716Hz2的V
HH序列如SEQ ID NO:21所示。
表7候选抗体序列人源化设计
将表7中Ab0716Hz1、Ab0716Hz2的V
HH全长序列进行IMGT/Domain Gap Align分析,比较人源化前后与IGHV3-23*04的同源性;此外,将人源化后的VHH与IgG1Fc N297A融合表达,参考实施例2.1进行人源化抗体的表达、纯化,具体结果见表8。由表8可知,人源化后抗体与IGHV3-23*04的同源性提高至87%左右,且人源化抗体的表达量较为理想,继续进行后续评估。
表8人源化抗体表达量及同源性
抗体编号 | 理论等电点 | 表达量(mg/L) | 同源性 |
Ab0716.1 | 6.7 | 105 | 75.3% |
Ab0716Hz1 | 7.3 | 239 | 87.6% |
Ab0716Hz2 | 7.6 | 364 | 86.6% |
实施例7人源化抗体亲和力测定
参照实施例4的方法,测定Ab0716.1人源化抗体与人、猴、鼠来源的血清白蛋白的亲和力,结果如表9。由表9可知,虽然人源化后抗体分子Ab0716Hz1、Ab0716Hz2与人血清白蛋白的亲和力均较人源化之前有所下降,但仍与人血清白蛋白保持有较强亲和力;Ab0716Hz1、Ab0716Hz2与猴血清白蛋白亲和力较弱;Ab0716Hz1、Ab0716Hz2与鼠血清白蛋白不结合。
表9人源化抗体与人、猴、鼠血清白蛋白的亲和力测定
实施例8人源化抗体理化性质评估
将人源化后抗体分子Ab0716Hz1、Ab0716Hz2进行成药性评估,具体如下:
同实施例5,SEC-HPLC纯度分析,百分比越高说明抗体纯度越高;熔解温度(Tm)值分析,Tm值越高表示抗体的热稳定性越好;HIC-HPLC分析,出峰时间越短表示抗体的亲水性越好。
毛细管等电聚焦(iCIEF)分析
取样品溶液加入到已经充分混匀的以下体系中:1%的甲基纤维素(MC)70μL,尿素5M80μL,两性电解质Pharmalyte pH 3-10 8μL,pI marker 5.5和9.5各2μL。补加适当体积超纯水至200μL,混匀。离心取上清进样分析。分析结束后,将结果文件导入ChromPerfect软件进行图谱积分处理并计算各峰的等电点以及各峰百分比,分析候选抗体的电荷异构体分布情况。
表10人源化抗体理化性质分析结果
综合实施例6-8可知,候选抗体Ab0716.1经过人源化后获得Ab0716Hz1、Ab0716Hz2分子,与IGHV3-23*04的同源性提高至87%左右,并且人源化抗体在表达量、亲和力、理化性质等方面均符合内部成药性标准,可作为候选分子继续开发;但与猴血清白蛋白亲和力较弱,需要继续进行亲和力成熟改造,提高其与猴血清白蛋白的亲和力。
实施例9 Ab0716Hz2亲和力成熟文库设计与构建
基于实施例1-8综合考虑,最终选择抗体Ab0716Hz2对其继续进行亲和力成熟,提高其与猴血清白蛋白的亲和力。对Ab0716Hz2的抗原结合决定簇(CDR)位点的氨基酸进行随机突变,构建各CDR区的突变文库,利用酵母展示技术高通量筛选与抗原特异性结合力强的序列。将Ab0716Hz2的可变区氨基酸序列按Chothia编码规则进行编码,CDR区按Chothia定义。对重链可变区CDR1、CDR2、CDR3,设计NNK突变引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增各CDR突变文库基因片段。参考实施例1构建亲和力成熟突变文库,文库编号JYYDL184-187;文库JYYDL184-187电转后分别在100mL的SD-Trp培养基,30℃、225 转/分钟培养过夜;各取1.0×10
8菌量,重悬于20mL YPGP诱导培养基,20℃、225转/分钟培养24小时,置于4℃冰箱待用。同时将Ab0716Hz2的亲本序列展示于酵母表面,作为亲本对照使用。
实施例10 Ab0716Hz2亲和力成熟文库筛选与单克隆鉴定
JYYDL184文库诱导后菌液,取1.5×10
9细胞用磁珠分选系统进行第一轮富集:1.用50mL 1×PBSA洗涤一次,3000转/分钟离心3分钟弃上清;2.与20mL含10nM生物素标记的猴血清白蛋白(以下简称CSA-Biotin)的1×PBSA,室温孵育30分钟;3.洗涤后加入抗生物素的磁珠混匀孵育10min,过磁力柱收集阳性细胞;同理,JYYDL185-JYYDL187等文库诱导后菌液,取1.5×10
9细胞用相同方法,在10nM生物素标记的人血清白蛋白条件进行磁珠富集。
磁珠筛选后阳性细胞经过再次培养、诱导后,取2.0×10
7细胞进行第二轮流式分选:1)用1mL 1×PBSA,离心弃上清;2)与1mL含3nM CSA-Biotin及鼠抗V5抗体的1×PBSA冰上孵育30min;3)离心弃上清,加入1mL 1×PBSA洗涤一次;4)加入200μL含荧光抗体的1×PBSA(含SA-PE及羊抗鼠-647),避光冰上孵育20分钟;5)重复步骤3,加入2mL1×PBSA重悬细胞,通过流式分选仪器收集647荧光信号与PE荧光信号均强的细胞群。第二轮流式分选后细胞经过再次培养、诱导后,同第二轮方法,取2.0×10
7细胞在10nM CSA-Biotin孵育后进行第三轮流式分选,分选后取部分细胞涂布于SD-Trp固体培养基平板,30℃静置培养3天。
JYYDL184-JYYDL187第三轮筛选产物,各挑取46个单克隆进行测序分析,最终获得独一序列的酵母单克隆菌落进行流式染色分析,各取1×10
6个细胞按表11方案进行染色评估:方案1评估各克隆与人血清白蛋白的结合水平,PE平均荧光信号强度(MFI)越强代表结合能力越强;方案2评估各克隆与猴血清白蛋白的结合水平,PE的MFI值越强代表结合能力越强。
表11单克隆酵母菌落流式染色鉴定方案
方案 | 一抗 | 二抗 |
1 | 100nM HSA-Biotin,鼠抗V5 | SA-PE,羊抗鼠-647 |
2 | 100nM CSA-Biotin,鼠抗V5 | SA-PE,羊抗鼠-647 |
根据各克隆按方案1、2的染色结果,综合各克隆序列的相似性,最终挑取克隆YC225G1、YC222H4、YC226H5的序列进行抗体表达,如表12。
表12酵母单克隆菌落流式染色结果
实施例11亲和力成熟候选抗体表达
将各克隆的V
HH序列与IgG1Fc N297A融合,委托上海百英生物科技有限公司进行瞬转HEK293细胞表达、纯化,最终得到亲和力成熟候选抗体见表13。
表13亲和力成熟候选抗体表达、纯化数据
抗体编号 | 理论等电点 | 消光系数 | 表达量(mg/L) |
Ab0716Am01 | 7.6 | 1.7 | 56 |
Ab0716Am02 | 8.2 | 1.55 | 52 |
Ab0716Am06 | 7.8 | 1.55 | 81 |
实施例12候选抗体亲和力测定
同实施例7,继续测定亲和力成熟抗体Ab0716Am01、Ab0716Am02、Ab0716Am06及亲本抗体Ab0716Hz2分别与人、猴、鼠来源的血清白蛋白的亲和力,结果如表14。由表14可知,亲和力成熟后抗体Ab0716Am01、Ab0716Am02、Ab0716Am06与猴血清白蛋白的亲和力相对于亲本抗体均大幅提高;与人血清白蛋白的亲和力维持在1.41-5.0nM之间,均可以接受;亲和力前后抗体与鼠血清白蛋白均不结合。
表14人源化抗体与人、猴、鼠血清白蛋白的亲和力测定
实施例13人源化抗体理化性质评估
同实施例8,将亲和力成熟后抗体Ab0716Am01、Ab0716Am02、Ab0716Am06进行理化成药性评估,结果如表15。由表15可知,亲和力成熟后抗体Ab0716Am01、Ab0716Am02、Ab0716Am06的纯度、热稳定性、亲水性、电荷异构体等理化指标较为理想,符合内部成药性标准。
表15人源化抗体理化性质分析结果
综合实施例12-13可知,亲和力成熟后抗体Ab0716Am01、Ab0716Am02、Ab0716Am06经过亲和力成熟后与猴血清白蛋白的亲和力大幅提高,同时与人血清白蛋白维持了较好亲和力,且并且亲和力成熟抗体在表达量、亲和力、理化性质等方面均符合内部成药性标准,可作为候选分子继续开发。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的,并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的,且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。
Claims (41)
- 分离的抗原结合蛋白,其包含抗体重链可变区VH中的至少一个CDR,所述VH包含SEQ ID NO:26或38所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白,其包含HCDR3,所述HCDR3包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1或2所述的分离的抗原结合蛋白,其包含HCDR3,其中所述HCDR3包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-3中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其包含HCDR2,所述HCDR2包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-4中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其包含HCDR2,所述HCDR2包含SEQ ID NO:2、31或32所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-5中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其包含HCDR1,所述HCDR1包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-6中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其包含HCDR1,所述HCDR1包含SEQ ID NO:3或30所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-7中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其包含HCDR1,HCDR2和HCDR3,所述HCDR1包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列,所述HCDR2包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列,且所述HCDR3包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-8中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其包含HCDR1,HCDR2和HCDR3,所述HCDR1包含SEQ ID NO:3或30所示的氨基酸序列,所述HCDR2包含SEQ ID NO:2、31或32所示的氨基酸序列,且所述HCDR3包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-9中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其包含HCDR1,HCDR2和HCDR3,其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列,所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列,且所述HCDR3包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;或者所述HCDR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列,所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列,且所述HCDR3包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列;或者所述HCDR1包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列,所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列,且所述HCDR3包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;或者所述HCDR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列,所述HCDR2包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列,且所述HCDR3包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;或者所述 HCDR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列,所述HCDR2包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列,且所述HCDR3包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-10中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其包含H-FR1,所述H-FR1的C端与HCDR1的N端直接或间接相连,且所述H-FR1包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求11所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述H-FR1包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-12中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其包含H-FR2,所述H-FR2位于HCDR1和HCDR2之间,且所述H-FR2包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求13所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述H-FR2包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:15中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-14中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其包含H-FR3,所述H-FR3位于HCDR2和HCDR3之间,且所述H-FR3包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求15所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述H-FR3包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-16中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其包含H-FR4,所述H-FR4的N端与HCDR3的C端直接或间接相连,且所述H-FR4包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求17所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述H-FR4包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-18中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其包含H-FR1,H-FR2,H-FR3和H-FR4,所述H-FR1包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列,所述H-FR2包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列,所述H-FR3包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列,且所述H-FR4包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求19所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述H-FR1包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11中任一项所示的氨基酸序列,所述H-FR2包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:15中任一项所示的氨基酸序列,所述H-FR3包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列,且所述H-FR4包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-20中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其包含选自下组中的任一组 H-FR1,H-FR2,H-FR3和H-FR4:1)所述H-FR1包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列,所述H-FR2包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列,所述H-FR3包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列,且所述H-FR4包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列;2)所述H-FR1包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列,所述H-FR2包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列,所述H-FR3包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列,且所述H-FR4包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列;3)所述H-FR1包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列,所述H-FR2包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列,所述H-FR3包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列,且所述H-FR4包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列;4)所述H-FR1包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列,所述H-FR2包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列,所述H-FR3包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列,且所述H-FR4包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列;以及5)所述H-FR1包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列,所述H-FR2包含如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列,所述H-FR3包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列,且所述H-FR4包含如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-21中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其包含VH,所述VH包含SEQ ID NO:26或38所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求22所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述VH包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、和SEQ ID NO:35中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-23中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其包含抗体重链恒定区。
- 根据权利要求24所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述抗体重链恒定区源自人抗体重链恒定区。
- 根据权利要求24-25中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述抗体重链恒定区源自人IgG重链恒定区。
- 根据权利要求24-26中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述抗体重链恒定区源自人IgG1重链恒定区。
- 根据权利要求1-27中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其包括抗体或其抗原结合片段。
- 根据权利要求28所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述抗原结合片段包括Fab,Fab’, Fv片段,F(ab’) 2,scFv,di-scFv,dAb和/或V HH。
- 根据权利要求29所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述抗原结合片段为V HH。
- 根据权利要求28-30中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其中所述抗体选自下组:单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
- 根据权利要求1-31中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,其能够结合人血清白蛋白。
- 融合蛋白,其包含权利要求1-32中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
- 分离的核酸分子,其编码权利要求1-32中任一项所述的分离的抗原结合蛋白或权利要求33所述的融合蛋白。
- 载体,其包含权利要求34所述的核酸分子。
- 细胞,其包含权利要求1-32中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,权利要求33所述的融合蛋白,权利要求34所述的核酸分子或权利要求35所述的载体。
- 制备权利要求1-32中任一项所述的分离的抗原结合蛋白的方法,所述方法包括在使得权利要求1-32中任一项所述的分离的抗原结合蛋白表达的条件下,培养权利要求36所述的细胞。
- 药物组合物,其包含权利要求1-32中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,权利要求33所述的融合蛋白,权利要求34所述的核酸分子、权利要求35所述的载体和/或权利要求36所述的细胞,以及任选地药学上可接受的载剂。
- 一种用于检测或测定人血清白蛋白的方法,所述方法包括使用权利要求1-32中任一项所述的分离的抗原结合蛋白或权利要求33所述的融合蛋白。
- 一种试剂盒,其包含权利要求1-32中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,权利要求33所述的融合蛋白,权利要求34所述的核酸分子、权利要求35所述的载体、权利要求36所述的细胞和/或权利要求38所述的药物组合物。
- 权利要求1-32中任一项所述的分离的抗原结合蛋白,权利要求33所述的融合蛋白,权利要求34所述的核酸分子、权利要求35所述的载体、权利要求36所述的细胞、权利要求38所述的药物组合物和/或权利要求40所述的试剂盒在制备预防和/或治疗疾病或病症的药物中的用途。
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