TW202313685A

TW202313685A - 抗人血清白蛋白的抗原結合蛋白

Info

Publication number: TW202313685A
Application number: TW111120882A
Authority: TW
Inventors: 顧春銀; 王宗達; 曹曉丹; 劉培培; 俗俊鄧; 忠宗潘; 學萍王
Original assignee: 大陸商上海濟煜醫藥科技有限公司; 大陸商江西濟民可信集團有限公司
Priority date: 2021-06-07
Filing date: 2022-06-06
Publication date: 2023-04-01
Also published as: CN117545504A; WO2022257868A1

Abstract

本揭露關於一種能夠結合人血清白蛋白的分離的抗原結合蛋白，其包含抗體重鏈可變區VH中的至少一個CDR，該VH包含SEQ ID NO：26或38所示的胺基酸序列，本揭露還提供了該抗原結合蛋白的製備方法及其用途。

Description

抗人血清白蛋白的抗原結合蛋白

本揭露關於生物醫藥領域，具體的關於一種能夠結合人血清白蛋白的抗原結合蛋白。

目前，蛋白質藥物已成功廣泛應用於臨床治療，許多蛋白質藥物為一些疾病提供了有效的治療效果。然而大多數蛋白和多肽的半衰期很短，一是因為蛋白質藥物會被體內的蛋白酶降解而快速清除，二是由於腎小球的過濾作用是分子量小於60KD的藥物在腎臟代謝中易被清除。為了達到有效治療，往往採用高劑量或多次、長時間用藥的方案，這樣一方面會增加其毒副作用，同時也給患者用藥帶來極大的不便。

為延長蛋白質藥物在體內的半衰期，藉由與具有較長半衰期的人體蛋白直接融合是一種有效方法。人血清白蛋白是人體血液中的主要蛋白，也是人體內半衰期最長的蛋白，它可以與一些藥物分子結合，對藥物分子提供保護作用，是一種理想的藥物載體分子。因此，亟需開發能夠結合人血清白蛋白的分子，提供更多有效的藥物載體。

本揭露提供了一種能夠識別人血清白蛋白的抗原結合蛋白，可藉由篩選得到具有高親和力的結合蛋白，該抗原結合蛋白具有穩定的理化性質，能夠與人血清白蛋白結合，延長生物藥物半衰期，有利於生物藥在治療中的有益效果。

一方面，本揭露提供了一種分離的抗原結合蛋白，其包含抗體重鏈可變區VH中的至少一個CDR，該VH包含SEQ ID NO：26或38所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含HCDR3，該HCDR3包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，所示分離的抗原結合蛋白的HCDR3包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含HCDR2，該HCDR2包含SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含HCDR2，該HCDR2包含SEQ ID NO：2、31或32所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含HCDR1，該HCDR1包含SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含HCDR1，該HCDR1包含SEQ ID NO：3或30所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，該HCDR1包含SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該HCDR1包含SEQ ID NO：3或30所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：2、31或32所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該HCDR1包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列；或者該HCDR1包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列；或者該HCDR1包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列；或者該HCDR1包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列；或者該HCDR1包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含H-FR1，該H-FR1的C端與該HCDR1的N端直接或間接相連，且該H-FR1包含SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該H-FR1包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11中任一項所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含H-FR2，該H-FR2位於該HCDR1和HCDR2之間，且該H-FR2包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該H-FR2包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：15中任一項所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含H-FR3，該H-FR3位於該HCDR2和該HCDR3之間，且該H-FR3包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該H-FR3包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含H-FR4，該H-FR4的N端與該HCDR3的C端直接或間接相連，且該H-FR4包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該H-FR4包含SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16中任一項所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4，該H-FR1包含SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列，該H-FR2包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列，該H-FR3包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列，且該H-FR4包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4，該H-FR1包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11中任一項所示的胺基酸序列，該H-FR2包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：15中任一項所示的胺基酸序列，該H-FR3包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列，且該H-FR4包含SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16中任一項所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含選自下組的任一組H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4：

1)該H-FR1包含如SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列，該H-FR2包含如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，該H-FR3包含如SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列，且該H-FR4包含如SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列；

2)該H-FR1包含如SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列，該H-FR2包含如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，該H-FR3包含如SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列，且該H-FR4包含如SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列；

3)該H-FR1包含如SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，該H-FR2包含如SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列，該H-FR3包含如SEQ ID NO： 6所示的胺基酸序列，且該H-FR4包含如SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列；

4)該H-FR1包含如SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，該H-FR2包含如SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，該H-FR3包含如SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列，且該H-FR4包含如SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列；以及

5)該H-FR1包含如SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，該H-FR2包含如SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列，該H-FR3包含如SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列，且該H-FR4包含如SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含VH，該VH包含SEQ ID NO：26或38所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的該VH包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、和SEQ ID NO：35中任一項所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包括抗體或其抗原結合片段。

在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含抗體重鏈恆定區。

在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的抗體重鏈恆定區源自人抗體重鏈恆定區。

在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的抗體重鏈恆定區源自人IgG重鏈恆定區。

在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白的抗體重鏈恆定區源自人IgG1重鏈恆定區。

在某些實施方式中，該抗原結合片段包括Fab、Fab’、Fv片段、F(ab’)₂、scFv、di-scFv、dAb和/或V_HH。

在某些實施方式中，該抗原結合片段為V_HH。

在某些實施方式中，該抗體選自下組：單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體。在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白能夠結合人血清白蛋白。

另一方面，本揭露還提供了融合蛋白，其包含該分離的抗原結合蛋白。

另一方面，本揭露還提供了分離的核酸分子，其編碼該分離的抗原結合蛋白或該融合蛋白。

另一方面，本揭露還提供了載體，其包含該核酸分子。

另一方面，本揭露還提供了細胞，其包含該分離的抗原結合蛋白、該融合蛋白、該核酸分子或該載體。

另一方面，本揭露還提供了製備該分離的抗原結合蛋白的方法，該方法包括在使得該分離的抗原結合蛋白表達的條件下，培養該細胞。

另一方面，本揭露還提供了醫藥組成物，其包含該分離的抗原結合蛋白、該核酸分子、該載體和/或該細胞，以及視需要地藥學上可接受的載劑。

另一方面，本揭露還提供了一種用於檢測或測定人血清白蛋白的方法，該方法包括該分離的抗原結合蛋白或該融合蛋白。

另一方面，本揭露還提供了一種試劑盒，其包含該分離的抗原結合蛋白、該融合蛋白、該核酸分子、該載體、該細胞和/或該醫藥組成物。

另一方面，本揭露還提供了該分離的抗原結合蛋白、該融合蛋白、該核酸分子、該載體、該細胞、該醫藥組成物和/或該試劑盒在製備預防和/或治療疾病或病症的藥物中的用途。

所屬技術領域具有通常知識者能夠從下文的詳細描述中容易地洞察到本揭露的其它方面和優勢。下文的詳細描述中僅顯示和描述了本揭露的示例性實施方式。如所屬技術領域具有通常知識者將認識到的，本揭露的內容使得所屬技術領域具有通常知識者能夠對所公開的具體實施方式進行改動而不脫離本揭露所涉及發明的精神和範圍。相應地，本揭露的圖式和說明書中的描述僅僅是示例性的，而非為限制性的。

本揭露所涉及的發明的具體特徵如所附申請專利範圍所顯示。藉由參考下文中詳細描述的示例性實施方式和圖式能夠更好地理解本揭露所涉及發明的特點和優勢。對圖式簡要說明如下：

圖1顯示的是酵母展示文庫的構建方法。

以下由特定的具體實施例說明本揭露發明的實施方式，熟悉此技術的人士可由本說明書所公開的內容容易地瞭解本揭露發明的其他優點及效果。

術語定義

在本揭露中，術語“人血清白蛋白(Human Serum Albumin)”可以與“HSA”互換使用。在本揭露中，該術語還涵蓋人血清白蛋白的變體、同源物、類似物、衍生物以及功能活性片段。

在本揭露中，術語“分離的”通常指從天然狀態下經人工手段獲得的。如果自然界中出現某一種“分離”的物質或成分，那麼可能是其所處的天然環境發生了改變，或從天然環境下分離出該物質，或二者情況均有發生。例如，某一活體動物體內天然存在某種未被分離的多聚核苷酸或多肽，而從這種天然狀態下分離出來的高純度的相同的多聚核苷酸或多肽即稱之為分離的。術語“分離的”不排除混有人工或合成的物質，也不排除存在不影響物質活性的其它不純物質。

在本揭露中，術語“分離的抗原結合蛋白”通常指脫離了其天然存在狀態的具有抗原結合能力的蛋白。該“分離的抗原結合蛋白”可以包含結合抗原的部分和視需要地，允許抗原結合部分採用促進該抗原結合部分結合抗原的構象的框架或構架部分。抗原結合蛋白可以包含例如抗體來源的蛋白框架區(FR)或具有移植的CDR或CDR衍生物的備選蛋白框架區或人工框架區。此類框架包括，但不限於包含被引入例如以穩定抗原結合蛋白的三維結構的突變的抗體來源的框架區以及包含例如生物相容性聚合物的完全合成的框架區。參見例如Korndorfer等，2003,Proteins： Structure,Function,andBioinformatics,53(1)：121-129(2003)；Roque等，Biotechnol.Prog.20：639-654(2004)。抗原結合蛋白的實例包括但不限於：人抗體、人源化抗體；嵌合抗體；重組抗體；單鏈抗體；雙功能抗體；三功能抗體；四功能抗體；Fab、Fab’、Fv片段、F(ab’)₂、F(ab)₂、scFv、di-scFv、dAb、IgD抗體；IgE抗體；IgM抗體；IgG1抗體；IgG2抗體；IgG3抗體；或IgG4抗體以及其片段。

在本揭露中，術語“CDR”也稱“互補決定區”，通常指抗體可變結構域中的區域，其序列是高度可變的和/或形成結構定義環。在某些實施方案中，僅由重鏈組成的天然存在的駱駝抗體在缺乏輕鏈的情況下，其功能也能夠正常且穩定。參見，例如，Hamers-Casterman et al.,Nature 363：446-448(1993)；Sheriff et al,Nature Struct.Biol.3：733-736(1996)。抗體CDR可以藉由多種編碼系統來確定，如CCG、Kabat、Chothia、IMGT、綜合考慮Kabat/Chothia等。這些編碼系統為本領域內已知，具體可參見，例如，http：//www.bioinf.org.uk/abs/index.html#kabatnum。例如，該抗原結合蛋白的胺基酸序列編號可以按照IMGT編號方案(IMGT,the international ImMunoGeneTics information system@imgt.cines.fr；http：//imgt.cines.fr；Lefranc等，1999,Nucleic Acids Res.27：209-212；Ruiz等，2000 Nucleic Acids Res.28：219-221；Lefranc等，2001,Nucleic Acids Res.29：207-209；Lefranc等，2003,Nucleic Acids Res.31：307-310；Lefranc等，2005,DevComp Immunol 29：185-203)。例如，該抗原結合蛋白的CDR可以根據Kabat編號系統確定(參見例如Kabat EA &Wu TT(1971)Ann NY AcadSci 190：382-391和Kabat EAet al.,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,FifthEdition, U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)。

在本揭露中，術語“FR”通常指抗體可變結構域的更高度保守的部分，其被稱為框架區。通常，天然重鏈和輕鏈的可變結構域各自包含四個FR區，即在VH中四個(H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4)，和在VL中四個(L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4)。

在本揭露中，術語“可變結構域”與“可變區”可以互換使用，通常指抗體重鏈和/或輕鏈的一部分。重鏈和輕鏈的可變結構域可以分別稱為“V_H”和“V_L”(或者分別稱為“VH”和“VL”)。這些結構域通常是抗體的變化最大的部分(相對於相同類型的其它抗體)，且包含抗原結合位點。

在本揭露中，術語“可變”通常指在抗體之間可變結構域的某些區段在序列上可能存在較大差異。可變結構域介導抗原結合並決定特定抗體對其特定抗原的特異性。然而，可變性並非在整個可變結構域範圍內均勻分佈。它通常集中在輕鏈和重鏈可變結構域中稱為高變區(CDR或HVR)的三個區段中。可變結構域的更高度保守的部分稱為框架區(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變結構域各自包含四個FR區，大多數採用β-折疊構型，藉由三個CDR連接，其形成環形連接，並且在一些情況下形成β-折疊結構的一部分。每條鏈中的CDR藉由FR區緊密靠近地保持在一起，並且來自另一條鏈的CDR一同促進抗體的抗原結合位點的形成(參見Kabat et al,Sequences of Immunological Interest,Fifth Edition,National Institute of Health,Bethesda,Md.(1991))。

在本揭露中，術語“抗體”通常指免疫球蛋白或其片段或其衍生物，涵蓋包括抗原結合位點的任何多肽，無論其是在體外還是體內產生的。該術語包括但不限於多株的、單株的、單特異性的、非特異性的、人源化的、單鏈的、嵌合的、合成的、重組的、雜化的、突變的和移植的抗體。除非另外被術語“完整的”修飾，如在“完整的抗體”中，為了本發明的目的，術語“抗體”也包括抗體片段，比如Fab、F(ab')₂、Fv、scFv、Fd、dAb和保持抗原結合功能(例如，特異性結合HSA)的其它抗體片段。通常，這樣的片段應當包括抗原結合結構域。基本的4鏈抗體單元是由兩個相同的輕(L)鏈和兩個相同的重(H)鏈組成的異四聚體糖蛋白。IgM抗體由5個基本的異四聚體單元與另外一個稱為J鏈的多肽組成，且含有10個抗原結合位點，而IgA抗體包括2-5個可以與J鏈相結合聚合形成多價組合的基本4鏈單元。就IgG而言，4鏈單元一般為約150,000道爾頓。每個L鏈藉由一個共價二硫鍵與H鏈連接，而兩個H鏈藉由一個或多個取決於H鏈同種型的二硫鍵相互連接。每個H和L鏈還具有規則間隔的鏈內二硫化橋鍵。每個H鏈在N末端具有可變結構域(VH)，對於α和γ鏈各自繼之以三個恆定結構域(CH)、對於μ和ε同種型繼之以四個CH結構域。每個L鏈在N末端具有可變結構域(VL)，在其另一端具有恆定結構域。VL與VH對應，且CL與重鏈的第一恆定結構域(CH1)相對應。特定的胺基酸殘基被認為在輕鏈和重鏈可變結構域之間形成界面。VH和VL配對一起形成單個抗原結合位點。對於不同類別抗體的結構和性質，參見例如Basic and Clinical Immunology,8th Edition,Daniel P.Sties,Abba I.Terr and Tristram G.Parsolw(eds),Appleton & Lange,Norwalk,Conn.,1994，第 71頁和第6章。來自任何脊椎動物物種的L鏈可以基於其恆定結構域的胺基酸序列被分為兩種明顯不同的類型中的一種，稱為κ和λ。根據重鏈(CH)恆定結構域的胺基酸序列，可以將免疫球蛋白分為不同的類別或同種型。目前存在五類免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，具有分別被命名為α、δ、ε、γ和μ的重鏈。

在本揭露中，術語“抗原結合片段”通常指具有特異結合抗原(例如，HSA)能力的一個或多個片段。在本揭露中，該抗原結合片段可以包括Fab、Fab’、F(ab)₂、Fv片段、F(ab’)₂、scFv、di-scFv、dAb和/或V_HH。

在本揭露中，術語“Fab”通常指抗體的抗原結合片段。如上所述，可以使用木瓜蛋白酶消化完整的抗體。抗體經木瓜蛋白酶消化後產生兩個相同的抗原結合片段，即“Fab”片段，和殘餘的“Fc”片段(即Fc區，同上)。Fab片段可以由一條完整的L鏈與一條重鏈的可變區和該H鏈(V_H)的第一恆定區(C_H1)組成。

在本揭露中，術語“Fab'片段”通常指人單株抗體的單價抗原結合片段，該片段比Fab片段稍大。例如，Fab'片段可以包括所有輕鏈，所有重鏈可變區以及重鏈的所有或部分第一和第二恆定區。例如，Fab'片段還可包括重鏈的部分或所有的220-330個胺基酸殘基。

在本揭露中，術語“F(ab')2”通常指藉由胃蛋白酶消化完整抗體所產生的抗體片段。F(ab')2片段含有由二硫鍵維持在一起的兩個Fab片段和部分鉸鏈區。F(ab')2片段具有二價抗原結合活性並且能夠交聯抗原。

在本揭露中，術語“Fv片段”通常指人單株抗體的單價抗原結合片段，包括所有或部分重鏈可變區和輕鏈可變區，並且缺乏重鏈恆定區和輕鏈恆定區。重鏈可變區和輕鏈可變區包括例如CDR。例如，Fv片段包括重鏈和輕鏈的約110個胺基酸的所有或部分胺基端可變區。

在本揭露中，術語“scFv”通常指包含至少一個包括輕鏈的可變區抗體片段和至少一個包括重鏈的可變區的抗體片段的融合蛋白，其中該輕鏈和重鏈可變區是鄰接的(例如經由合成接頭例如短的柔性多肽接頭)，並且能夠以單鏈多肽形式表達，且其中該scFv保留其所來源的完整抗體的特異性。除非特別說明，否則如本揭露中使用的那樣，scFv可以以任何順序(例如相對於多肽的N末端和C末端)具有該VL和VH可變區，scFv可以包括VL-接頭-VH或可以包括VH-接頭-VL。

在本揭露中，術語“dAb”通常是指具有VH域、VL域或具有VH域或VL域的抗原結合片段，參考例如Ward等人(Nature,1989Oct 12；341(6242)：544-6)，參考Holt等人，Trends Biotechnol.,2003,21(11)：484-490；以及參考例如WO 06/030220、WO 06/003388和DomantisLtd的其它公佈的專利申請。在本揭露中，術語“dAb”可以包括sdAb，術語“sdAb”通常指單結構域抗原結合分子，在本揭露中，該術語可以包括單域抗體，以及V_HH。

在本揭露中，術語“單株抗體”通常指單分子組成的抗體分子製備物。單株抗體通常針對單個抗原位點具有高度特異性。而且，與常規多株抗體製劑(通常具有針對不同決定簇的不同抗體)不同，各單株抗體是針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性之外，單株抗體的優點在於它們可以藉由融合瘤培養合成，不受其他免疫球蛋白污染。修飾語“單株”表示從基本上同質的抗體群體獲得的抗體的特徵，並且不被解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。例如，本揭露使用的單株抗體可以在融合瘤細胞中製備，或者可以藉由重組DNA方法製備。

在本揭露中，術語“嵌合抗體”通常是指其中可變區源自一個物種，而恆定區源自另一個物種的抗體。通常，可變區源自實驗動物諸如齧齒動物的抗體(“親本抗體”)，且恆定區源自人類抗體，使得所得嵌合抗體與親本(例如羊駝來源)抗體相比，在人類個體中引發不良免疫反應的可能性降低。

在本揭露中，術語“人源化抗體”通常是指非人抗體(例如羊駝抗體)的CDR區以外的部分或全部有的胺基酸被源自人免疫球蛋白的相應的胺基酸置換的抗體。在CDR區中，胺基酸的小的添加、缺失、插入、置換或修飾也可以是允許的，只要它們仍保留抗體結合特定抗原的能力。人源化抗體可視需要地包含人類免疫球蛋白恆定區的至少一部分。“人源化抗體”保留類似於原始抗體的抗原特異性。非人(例如羊駝)抗體的“人源化”形式可以最低限度地包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在某些情形中，可以將人免疫球蛋白(受體抗體)中的CDR區殘基用具有所期望性質、親和力和/或能力的非人物種(供體抗體)(諸如羊駝、小鼠、大鼠、家兔或非人靈長類動物)的CDR區殘基替換。在某些情形中，可以將人免疫球蛋白的FR區殘基用相應的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體中或在供體抗體中沒有的胺基酸修飾。進行這些修飾可以是為了進一步改進抗體的性能，諸如結合親和力。

術語“全人源抗體”通常指僅包含人類免疫球蛋白蛋白質序列的抗體。如果其是在小鼠中、在小鼠細胞中或在衍生自小鼠細胞的融合瘤中生產，那麼全人源抗體可能含有鼠糖鏈。類似地，“小鼠抗體”或“大鼠抗體”分別指僅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白序列的抗體。可藉由噬菌體展示或其它分子生物學方法，在人體內、在具有人類免疫球蛋白種系序列的轉基因動物體內生成全人源抗體。可用於製造抗體的示例性技術在美國專利：6,150,584、6,458,592、6,420,140中描述。其它技術，如使用文庫，是本領域已知的。

在本揭露中，術語“核酸分子”通常指任何長度的分離形式的核苷酸，脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或從其天然環境分離的或人工合成的類似物。

在本揭露中，術語“載體”通常指可將編碼某蛋白的多聚核苷酸插入其中並使蛋白獲得表達的一種核酸運載工具。載體可藉由轉化、轉導或轉染宿主細胞，使其攜帶的遺傳物質元件在宿主細胞內表達得以表達。一種載體可能含有多種控制表達的元件，包括啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、選擇元件及報告基因。另外，載體還可含有複製起始位點。載體還有可能包括有協助其進入細胞的成分，如病毒顆粒、脂質體或蛋白外殼，但不僅僅只有這些物質。

在本揭露中，術語“細胞”通常指可以是或已經是受試者質粒或載體的接受者的單個細胞、細胞系或細胞培養物，其包括本發明所述的核酸分子或本發明所述的載體。細胞可以包括單個細胞的後代。由於天然、偶然或有意的突變，後代可以不一定與原始母細胞完全相同(在總DNA互補體的形態上或在基因組上)。細胞可包括用本揭露所述的載體在體外轉染的細胞。

在本揭露中，術語“醫藥組成物”通常指用於預防/治療疾病或病症的組成物。該醫藥組成物可以包含本揭露所述的分離的抗原結合蛋白、本揭露所述的核酸分子、本揭露所述的載體和/或本揭露所述的細胞，以及視需要地藥學上可接受的佐劑。此外，該醫藥組成物還可以包含一種或多種(藥學上有效的)載劑、穩定劑、賦形劑、稀釋劑、增溶劑、表面活性劑、乳化劑和/或防腐劑的合適的製劑。組成物的可接受成分在所用劑量和濃度下通常對接受者無毒。本發明的醫藥組成物包括但不限於液體、冷凍和凍乾組成物。

在本揭露中，術語“藥學上可接受的載劑”通常包括藥劑學可接受的載體、賦形劑或穩定劑，它們在所採用的劑量和濃度對暴露於其的細胞或哺乳動物是無毒的。生理學可接受的載體可包括例如緩衝劑、抗氧化劑、低分子量(少於約10個殘基)多肽、蛋白質、親水性聚合物、胺基酸、單糖、二糖和其它碳水化合物、螯合劑、糖醇、成鹽反荷離子，例如鈉；和/或非離子表面活性劑。

在本揭露中，術語“特異性結合”或“特異性的”通常指可測量的和可再現的相互作用，例如靶標和抗體之間的結合，可在分子(包括生物分子)的異質群體存在的情況決定靶標的存在。例如，特異性結合靶標(其可以為表位)的抗體可以是以比它結合其它靶標更大的親和性、親合力、更容易、和/或以更大的持續時間結合該靶標的抗體。在某些實施方案中，抗體特異性結合蛋白質上的表位，該表位在不同種屬的蛋白質中是保守的。在某些實施方案中，特異性結合可以包括但不要求排他性地結合。

在本揭露中，術語“受試者”通常指人類或非人類動物，包括但不限於貓、狗、馬、豬、奶牛、羊、兔、小鼠、大鼠或猴。

在本揭露中，涉及的蛋白質、多肽和/或胺基酸序列，還應理解為至少包含以下的範圍：與該蛋白質或多肽具備相同或類似功能的變體或同源物。

在本揭露中，該變體可以為，例如在該蛋白質和/或該多肽(例如，特異性結合HSA的抗體或其片段)的胺基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或多個胺基酸的蛋白質或多肽。例如，該功能性變體可包含已經藉由至少1個，例如1-30個、1-20個或1-10個，又例如1個、2個、3個、4個或5個胺基酸取代、缺失和/或插入而具有胺基酸改變的蛋白質或多肽。該功能性變體可基本上保持改變(例如取代、缺失或添加)之前的該蛋白質或該多肽的生物學特性。例如，該功能性變體可保持改變之前的該蛋白質或該多肽的至少60%、70%、80%、90%、或100%的生物學活性(例如抗原結合能力)。例如，該取代可以為保守取代。

在本揭露中，該同源物可以為與該蛋白質和/或該多肽(例如，特異性結合HSA的抗體或其片段)的胺基酸序列具有至少約85%(例如，具有至少約85%、約87%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高的)序列同源性的蛋白質或多肽。

在本揭露中，該同源性通常是指兩個或多個序列之間的相似性、類似或關聯。可以藉由以下方式計算“序列同源性百分比”：將兩條待比對的序列在比較窗中進行比較，確定兩條序列中存在相同核酸鹼基(例如，A、T、C、G、I)或相同胺基酸殘基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的數目以得到匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以比較窗中的總位置數(即，窗大小)，並且將結果乘以100，以產生序列同源性百分比。為了確定序列同源性百分數而進行的比對，可以按本領域已知的多種方式實現，例如，使用可公開獲得的計算機軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。所屬技術領域具有通常知識者可以確定用於比對序列的適宜參數，包括為實現正在比較的全長序列範圍內或目標序列區域內最大比對所需要的任何算法。該同源性也可以藉由以下的方法測定：FASTA和BLAST。對FASTA算法的描述可以參見W.R.Pearson和D.J.Lipman的“用於生物學序列比較的改進的工具”，美國國家科學院烷刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)，85：2444-2448，1988；和D.J.Lipman和W.R.Pearson的“快速靈敏的蛋白質相似性搜索”，Science,227：1435-1441,1989。對BLAST算法的描述可參見S.Altschul、W.Gish、W.Miller、E.W.Myers和D.Lipman的“一種基本的局部對比(alignment)搜索工具”，分子生物學雜誌，215：403-410,1990。

在本揭露中，術語“包括”通常是指包含、總括、含有或包涵的含義。在某些情況下，也表示“為”、“由……組成”的含義。

在本揭露中，術語“約”通常是指在指定數值以上或以下0.5%-10%的範圍內變動，例如在指定數值以上或以下0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、或10%的範圍內變動。

發明詳述

分離的抗原結合蛋白

抗體的CDR又稱互補決定區，是可變區的一部分。該區域的胺基酸殘基可以與抗原或抗原表位接觸。抗體CDR可以藉由多種編碼系統來確定，如CCG、Kabat、Chothia、IMGT、AbM、綜合考慮Kabat/Chothia等。這些編碼系統為本領域內已知，具體可參見，例如，http：//www.bioinf.org.uk/abs/index.html#kabatnum。本領域技術人員可以根據抗體的序列和結構，用不同的編碼系統確定出CDR區。使用不同的編碼系統，CDR區可能存在差別。在本揭露中，該CDR涵蓋根據任何CDR劃分方式劃分得到的CDR序列；也涵蓋其變體，該變體包括該CDR的胺基酸序列經過取代、缺失和/或添加一個或多個胺基酸。例如1-30個、1-20個或1-10個，又例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個或9個胺基酸取代、缺失和/或插入；也涵蓋其同源物，該同源物可以為與該CDR的胺基酸序列具有至少約85%(例如，具有至少約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高的)序列同源性的胺基酸序列。在某些實施方式中，該CDR藉由Chothia編碼系統來劃分。

在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白可以包含HCDR3，該HCDR3可以包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列。例如，該分離的抗原結合蛋白的HCDR3可以包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。例如，該分離的抗原結合蛋白的HCDR3可以包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列。

在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白可以包含HCDR2，該HCDR2包含SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列。例如，該HCDR2包含SEQ ID NO：2、31或32所示的胺基酸序列。

在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白可以包含HCDR1，該HCDR1包含SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列。例如，該HCDR1包含SEQ ID NO：3或30所示的胺基酸序列。

在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白可以包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，該HCDR1包含SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列。

例如，該分離的抗原結合蛋白的HCDR1可以包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，該HCDR2可以包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列，且該HCDR3可以包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。例如，該分離的抗原結合蛋白的HCDR1可以包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，該HCDR2可以包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列，且該HCDR3可以包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列。例如，該分離的抗原結合蛋白的該HCDR1包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。例如，該分離的抗原結合蛋白的該HCDR1包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。例如，該分離的抗原結合蛋白的該HCDR1包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。

在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白可以包含H-FR1，該H-FR1的C端與該HCDR1的N端直接或間接相連，且該H-FR1可以包含SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列。

在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白的H-FR1包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11中任一項所示的胺基酸序列。

在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白可以包含H-FR2，該H-FR2位於該HCDR1和該HCDR2之間，且該H-FR2可以包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列。

在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白的H-FR2可以包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：15中任一項所示的胺基酸序列。

在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白可以包含H-FR3，該H-FR3位於該HCDR2和該HCDR3之間，且該H-FR3可以包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列。

在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白的H-FR3可以包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列。

在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白可以包含H-FR4，該H-FR4的N端與該H-CDR3的C端直接或間接相連，且該H-FR4可以包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列。

在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白的H-FR4可以包含SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16中任一項所示的胺基酸序列。

在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白可以包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4。例如，該分離的抗原結合蛋白的該H-FR1可以包含SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列，該H-FR2可以包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列，該H-FR3可以包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列，且該H-FR4可以包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列。例如，該H-FR1可以包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列，該H-FR2可以包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，該H-FR3可以包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列，且該H-FR4可以包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列。例如，該H-FR1可以包含SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列，該H-FR2可以包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，該H-FR3可以包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列，且該H-FR4可以包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列。例如，該H-FR1可以包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，該H-FR2可以包含SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列，該H-FR3可以包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列，且該H-FR4可以包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列。例如，該H-FR1可以包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，該H-FR2可以包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，該H-FR3可以包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列，且該H-FR4可以包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列。例如，該H-FR1可以包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，該H-FR2可以包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列，該H-FR3可以包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列，且該H-FR4可以包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。

在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白的VH包含與SEQ ID NO：17所示的胺基酸相比，在以下一個或多個位置的胺基酸突變：H1、H13、H44、H45、H49、H74、H76、H79、H81、H82B、H83、H84、H108，該位置由Chothia編碼系統確定。例如，該突變包含在位置H1由天冬胺酸D替換為谷胺酸E。例如，該突變包含在位置H13由谷胺酸E替換為穀胺醯胺Q。例如，該突變包含在位置H44由谷胺酸E替換為甘胺酸G。例如，該突變包含在位置H45由精胺酸R替換為亮胺酸L。例如，該突變包含在位置H49由丙胺酸A替換為絲胺酸S。例如，該突變包含在位置H74由精胺酸R替換為絲胺酸S。例如，該突變包含在位置H76由賴胺酸K替換為天冬醯胺N。例如，該突變包含在位置H79由絲胺酸S替換為酪胺酸Y。例如，該突變包含在位置H81由天冬胺酸D替換為穀胺醯胺Q。例如，該突變包含在位置H82B由天冬胺酸D替換為絲胺酸S。例如，該突變包含在位置H83由賴胺酸K替換為精胺酸R。例如，該突變包含在位置H84由脯胺酸P替換為丙胺酸A。例如，該突變包含在位置H108由穀胺醯胺Q替換為甲硫胺酸M。例如，該突變包含在位置H108由穀胺醯胺Q替換為亮胺酸L。

在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白可以包含VH，且該VH可以包含SEQ ID NO：26或38所示的胺基酸序列。例如，該VH可以包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列。例如，該VH可以包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列。例如，該VH可以包含SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列。例如，該VH可以包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列。例如，該VH可以包含SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列。例如，該VH可以包含SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列。例如，該VH可以包含SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列。例如，該VH可以包含SEQ ID NO：35所示的胺基酸序列。

在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白可以包含抗體重鏈恆定區。在某些實施方式中，該抗體重鏈恆定區源自人抗體重鏈恆定區。在某些實施方式中，該抗體重鏈恆定區源自人IgG重鏈恆定區。在某些實施方式中，該抗體重鏈恆定區源自人IgG1重鏈恆定區。在某些實施方式中，該人IgG1重鏈恆定區包含人IgG1 Fc。在某些實施方式中，該人IgG1 Fc包含N297A的胺基酸修飾。

在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白可以包括抗體或其抗原結合片段。

在本揭露中，該抗原結合片段可以包括Fab、Fab’、Fv片段、F(ab’)₂、scFv、di-scFv、dAb和/或V_HH。在某些實施方式中，該抗原結合片段為V_HH。

在本揭露中，該抗體可以選自下組：單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體。

在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白可以包含單域抗體。例如，本揭露所述的單域抗體包含在本揭露的實施例中製備的編號為Ab0716.1、Ab0716.2、Ab0716.4、Ab0716.Hz1和/或Ab0716.Hz2的單域抗體。例如，本揭露所述的單域抗體包含在本揭露的實施例中製備的編號為Ab0716Am01、Ab0716Am02、或Ab0716Am06的單域抗體。

在本揭露中，該單域抗體可以包含HCDR3，且該HCDR3可以包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列。例如，該單域抗體的HCDR3可以包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。例如，該單域抗體的HCDR3可以包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列。

在本揭露中，該單域抗體可以包含HCDR2，且該HCDR2可以包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列。

在本揭露中，該單域抗體可以包含HCDR1，且該HCDR1可以包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列。

在本揭露中，該單域抗體可以包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，該HCDR1可以包含SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列，該HCDR2可以包含SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列，且該HCDR3可以包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列。例如，該單域抗體的HCDR1可以包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，該HCDR2可以包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列，該HCDR3可以包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。例如，該單域抗體的HCDR1可以包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，該HCDR2可以包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列，該HCDR3可以包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列。例如，該單域抗體的該HCDR1包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。例如，該單域抗體的該HCDR1包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。例如，該單域抗體的該HCDR1包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。

在本揭露中，該單域抗體可以包含H-FR1，該H-FR1的C端與該HCDR1的N端直接或間接相連，且該H-FR1可以包含SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列。例如，該單域抗體的H-FR1可以包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列。例如，該單域抗體的H-FR1可以包含SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列。例如，該單域抗體的H-FR1可以包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列。例如，該單域抗體的H-FR1可以包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列。

在本揭露中，該單域抗體可以包含H-FR2，該H-FR2位於該HCDR1和該HCDR2之間，且該H-FR2可以包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列。例如，該單域抗體的H-FR2可以包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列。例如，該單域抗體的H-FR2可以包含SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列。例如，該單域抗體的H-FR2可以包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列。例如，該單域抗體的H-FR2可以包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列。

在本揭露中，該單域抗體可以包含H-FR3，該H-FR3位於該HCDR2和該HCDR3之間，且該H-FR3可以包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列。例如，該單域抗體的H-FR3可以包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列。例如，該單域抗體的H-FR3可以包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列。

在本揭露中，該單域抗體可以包含H-FR4，該H-FR4的N端與該H-CDR3的C端直接或間接相連，且該H-FR4可以包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列。例如，該單域抗體的H-FR4可以包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列。例如，該單域抗體的H-FR4可以包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列。例如，該單域抗體的H-FR4可以包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。

在本揭露中，該單域抗體可以包含H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4。例如，該H-FR1可以包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列，該H-FR2可以包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，該H-FR3可以包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列，且該H-FR4可以包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列。例如，該H-FR1可以包含SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列，該H-FR2可以包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，該H- FR3可以包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列，且該H-FR4可以包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列。例如，該H-FR1可以包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，該H-FR2可以包含SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列，該H-FR3可以包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列，且該H-FR4可以包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列。例如，該H-FR1可以包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，該H-FR2可以包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，該H-FR3可以包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列，且該H-FR4可以包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列。例如，該H-FR1可以包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，該H-FR2可以包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列，該H-FR3可以包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列，且該H-FR4可以包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。

在本揭露中，該單域抗體可以包含V_HH，該V_HH可以包含SEQ ID NO：26或38所示的胺基酸序列。例如，該V_HH可以包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列。例如，該V_HH可以包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列。例如，該V_HH可以包含SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列。例如，該V_HH可以包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列。例如，該V_HH可以包含SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列。例如，該V_HH可以包含SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列。例如，該V_HH可以包含SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列。例如，該V_HH可以包含SEQ ID NO：35所示的胺基酸序列。

例如，在本揭露中，單域抗體Ab0716.1的該HCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：3所示，該HCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示，該HCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：1所示，該H-FR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示，該H-FR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：5所示，該H-FR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：6所示，且該H-FR4的胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示。例如，該單域抗體Ab0716.1的V_HH的胺基酸序列如SEQ ID NO：17所示。

例如，在本揭露中，單域抗體Ab0716.2的該HCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：3所示，該HCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示，該HCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：28所示，該H-FR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：8所示，該H-FR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：5所示，該H-FR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：6所示，該H-FR4的胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示。例如，該單域抗體Ab0716.2的V_HH的胺基酸序列如SEQ ID NO：18所示。

例如，在本揭露中，單域抗體Ab0716.4的該HCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：3所示，該HCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示，該HCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：1所示，該H-FR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：9所示，該H-FR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：10所示，該H-FR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：6所示，且該H-FR4的胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示。例如，該單域抗體Ab0716.4的V_HH的胺基酸序列如SEQ ID NO：19所示。

例如，在本揭露中，單域抗體Ab0716.Hz1的該HCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：3所示，該HCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示，該HCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：1所示，該H-FR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：11所示，該H-FR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：12所示，該H-FR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：13所示，且該H-FR4的胺基酸序列如SEQ ID NO：14所示。例如，在本揭露中，該單域抗體Ab0716.Hz1的V_HH的胺基酸序列如SEQ ID NO：20所示。

例如，在本揭露中，單域抗體Ab0716.Hz2的該HCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：3所示，該HCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示，該HCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：1所示，該H-FR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：11所示，該H-FR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：15所示，該H-FR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：13所示，且該H-FR4的胺基酸序列如SEQ ID NO：16所示。例如，在本揭露中，該單域抗體Ab0716.Hz2的V_HH的胺基酸序列如SEQ ID NO：21所示。

例如，該單域抗體Ab0716Am01的該HCDR1包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。

例如，該單域抗體Ab0716Am02的該HCDR1包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。

例如，該單域抗體Ab0716Am06的該HCDR1包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。

在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白能夠結合人血清白蛋白。例如，本揭露所述抗原結合蛋白可以以小於或等於2.0×10^-9M、小於或等於1.9×10^-9M、小於或等於1.8×10^-9M、小於或等於1.7×10^-9M、小於或等於1.6×10^-9M、小於或等於1.5×10^-9M、小於或等於1.4×10^-9M、小於或等於1.3×10^-9M、小於或等於1.2×10^-9M、小於或等於1.1×10^-9M、小於或等於1.0×10^-9M、小於或等於9×10^-10M、小於或等於8×10^-10M、小於或等於7×10^-10M、小於或等於6×10^-10M、小於或等於5×10^-10M、小於或等於4.15×10^-10M、小於或等於4×10^-10M、小於或等於3.93×10^-10M、小於或等於3×10^-10M、小於或等於2×10^-10M的KD值與HSA結合。

在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白的Tm值能夠大於或等於59.5℃、大於或等於59.6℃、大於或等於59.7℃、大於或等於59.8℃、大於或等於59.9℃、大於或等於60.0℃、大於或等於60.1℃、大於或等於60.2℃、大於或等於60.5℃、大於或等於61.0℃、大於或等於61.5℃、大於或等於62℃、大於或等於62.5℃、大於或等於62.9℃、大於或等於63℃、大於或等於63.5℃、大於或等於64℃。

融合蛋白、核酸分子、載體、細胞和醫藥組成物

另一方面，本揭露提供了融合蛋白，其可以包含本揭露所述的抗原結合蛋白。

另一方面，本揭露提供了分離的核酸分子，其可以編碼本揭露所述的分離的抗原結合蛋白。例如，其可以是藉由以下方法產生或合成的：(i)在體外擴增的，例如藉由聚合酶鏈式反應(PCR)擴增產生的；(ii)藉由選殖重組產生的；(iii)純化的，例如藉由酶切和凝膠電泳分級分離；或者(iv)合成的，例如藉由化學合成。

另一方面，本揭露提供了一種載體，其可以包含本揭露所述的核酸分子。此外，該載體中還可包含其他基因，例如允許在適當的宿主細胞中和在適當的條件下選擇該載體的標記基因。此外，該載體還可包含允許編碼區在適當宿主中正確表達的表達控制元件。這樣的控制元件為本領域技術人員所熟知的，例如，可包括啟動子、核糖體結合位點、增強子和調節基因轉錄或mRNA翻譯的其他控制元件等。該載體可藉由轉化、轉導或轉染宿主細胞，使其攜帶的遺傳物質元件在宿主細胞內表達得以表達。該載體可以包括，例如質粒、黏粒、病毒、噬菌體或者在例如遺傳工程中通常使用的其他載體。例如，該載體為表達載體。此外，該載體還可以包括有協助其進入細胞的成分，如病毒顆粒、脂質體或蛋白外殼，但不僅僅只有這些物質。

另一方面，本揭露提供了一種細胞，其可以包含本揭露所述的核酸分子或本揭露所述的載體。在某些實施方式中，每種或每個宿主細胞可包含一個或一種本揭露所述的核酸分子或載體。在某些實施方式中，每種或每個宿主細胞可包含多個(例如，2個或以上)或多種(例如，2種或以上)本揭露所述的核酸分子或載體。例如，可將本揭露所述的載體引入該宿主細胞中，例如真核細胞，如來自植物的細胞、真菌或酵母細胞等。在某些實施方式中，該細胞可以是細菌細胞(例如，大腸桿菌)、酵母細胞或其它真核細胞，例如COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、CHO-K1細胞、LNCAP細胞、HeLa細胞、293T細胞、COS-1細胞、SP2/0細胞、NS0細胞或骨髓瘤細胞。

另一方面，本揭露還提供了醫藥組成物，其可以包含該分離的抗原結合蛋白，該核酸分子、該載體和/或該細胞，以及視需要地藥學上可接受的載劑。

在某些實施方案中，該醫藥組成物還可以包含一種或多種(藥學上有效的)佐劑、穩定劑、賦形劑、稀釋劑、增溶劑、表面活性劑、乳化劑和/或防腐劑的合適的製劑。組成物的可接受成分在所用劑量和濃度下通常對接受者無毒。本發明的醫藥組成物包括但不限於液體、冷凍和凍乾組成物。

在某些實施方案中，該醫藥組成物還可含有多於一種活性化合物，通常為不會不利地影響彼此的具有互補活性的那些活性化合物。此類藥物的類型和有效量可以取決於例如製劑中存在的拮抗劑的量和類型，以及受試者的臨床參數。

在某些實施方案中，該藥學上可接受的載劑可以包括與藥物給藥相容的任何和所有的溶劑、分散介質、包衣、等滲劑和吸收延遲劑，通常安全、無毒。

在某些實施方案中，該醫藥組成物可以包含腸胃外、經皮、腔內、動脈內、鞘內和/或鼻內施用或直接注射到組織中。例如，該醫藥組成物可以藉由輸注或注射施用於患者或者受試者。在某些實施方案中，該醫藥組成物的施用可以藉由不同的方式進行，例如靜脈內、腹膜內、皮下、肌肉內、局部或真皮內施用。在某些實施方案中，該醫藥組成物可以不間斷施用。該不間斷(或連續)施用可以藉由患者佩戴的小泵系統來實現，以測量流入患者體內的治療劑，如WO2015/036583所述。

製備方法

另一方面，本揭露提供了製備該分離的抗原結合蛋白的方法。該方法可包括，在使得該抗原結合蛋白表達的條件下，培養該本揭露所述的宿主細胞。例如，可藉由使用適當的培養基、適當的溫度和培養時間等，這些方法是所屬技術領域具有通常知識者所瞭解的。

任何適於產生單株抗體的方法都可用於產生本揭露的抗原結合蛋白。例如，藉由納米抗體噬菌體文庫淘選、擴增，構建酵母展示文庫篩選該單域抗體。

在本揭露中，該分離的抗原結合蛋白可以藉由以下方法製備：選用奈米抗體噬菌體文庫針對生物素標記的HSA進行淘選。以淘選後的質粒為模板擴增單域抗體，將擴增的片段與酵母展示質粒共轉入釀酒酵母，在酵母細胞壁表面展示單鏈抗體。

例如，本揭露提供了一種用於檢測或測定人血清白蛋白的方法，該方法包括使用本揭露的分離的抗原結合蛋白或本揭露的融合蛋白。在本揭露中，該方法可包括體外方法、離體方法、非診斷或非治療目的的方法。

另一方面，本揭露提供了一種人血清白蛋白的試劑盒，其可包括使用該分離的抗原結合蛋白或該融合蛋白。

在本揭露中，該試劑盒還可包含使用說明，該使用說明記載用於檢測人血清白蛋白的存在和/或含量的方法。例如，該方法可包括體外方法、離體方法、非診斷或非治療目的的方法。

另一方面，本揭露提供了一種該分離的抗原結合蛋白或該融合蛋白在製備試劑盒中的用途，該試劑盒可用於檢測人血清白蛋白的存在和/或含量的方法。例如，該方法可包括體外方法、離體方法、非診斷或非治療目的的方法。

另一方面，本揭露提供了該分離的抗原結合蛋白，該融合蛋白，該核酸分子、該載體、該細胞、該醫藥組成物和/或該試劑盒，其用於預防、緩解和/或治療疾病或病症。

另一方面，本揭露提供了一種該分離的抗原結合蛋白，該融合蛋白，該核酸分子、該載體、該細胞、該醫藥組成物和/或該試劑盒在製備藥物中的用途，該藥物用於預防、緩解和/或治療疾病或病症。

另一方面，本揭露提供了一種預防和/或治療疾病或病症的方法，其包括向有需要的受試者施用該分離的抗原結合蛋白，該融合蛋白，該核酸分子、該載體、該細胞、該醫藥組成物和/或該試劑盒。

本揭露所述醫藥組成物、藥物組合及方法可與其他類型的癌症療法結合使用，諸如化學療法、手術、放射、基因療法等。本揭露中所描述的醫藥組成物及方法可用於其他依賴於免疫反應的疾病病狀。

在本揭露中，該受試者可以包括人或非人動物。例如，該非人動物可以選自下組：猴、雞、鵝、貓、狗、小鼠和大鼠。此外，非人動物也可以包括任何除人以外的動物物種，例如家畜動物，或齧齒類動物，或靈長類動物，或家養動物，或家禽動物。該人可以是高加索人、非洲人、亞洲人、閃族人，或其他種族，或各種種族的雜合體。又例如，該人可以是老年、成年、青少年、兒童或者嬰兒。

可以根據在實驗動物中的有效量推測在人類中的有效量。例如，Freireich等人描述了動物和人的劑量的相互關係(基於每平方米身體表面的毫克數)(Freireich et al.，Cancer Chemother.Rep.50，219(1966))。身體表面積可以從患者的身高和體重近似確定。參見例如Scientific Tables，Geigy Pharmaceuticals，Ardsley，N.Y.，537(1970)。

不欲被任何理論所限，下文中的實施例僅僅是為了闡釋本揭露的抗原結合蛋白、製備方法和用途等，而不用於限制本揭露發明的範圍。

實施例

實施例1 酵母展示文庫構建與篩選

選用自建的納米抗體噬菌體文庫，針對生物素標記的人血清白蛋白(以下簡稱HSA-Biotin，acro，貨號：HSA-H82E3)進行兩輪淘選，獲得陽性富集。以噬菌體兩輪淘選後質粒為模板，設計引子進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增單鏈抗體(V_HH)；PCR擴增的V_HH基因片段回收後與酵母展示質粒共轉入釀酒酵母菌株EBY100(購自ATCC)，藉由釀酒酵母的同源重組使V_HH基因插入至酵母展示質粒中，進而實現在酵母細胞壁表面展示單鏈抗體，如圖1。酵母展示單鏈抗體庫命名為JYYDL032。文庫JYYDL032電轉後在100mL的SD-Trp培養基(Clontech，貨號：630308)，30℃、225轉/分鐘培養過夜；取1.0×10⁸細胞重新懸浮於20mL YPGP液體培養基(2%半乳糖、2%蛋白腖、1%酵母提取物、0.54% Na₂HPO₄、0.86% NaH₂PO₄．H₂O)，20℃、225轉/分鐘培養24小時，置於4℃冰箱待用。

文庫誘導後菌液，測定菌液的OD₆₀₀，按1OD為1.0×10⁷細胞數計算，取1.0×10⁸細胞，用磁珠分選系統進行第一輪富集：1.用20mL 1×PBSA(1×PBS+1%BSA)洗滌一次，3000轉/分鐘離心3分鐘(以下離心均為此條件)棄上清；2.與50mL含1nM HSA-Biotin的1×PBSA，室溫孵育30分鐘；3.洗滌後加入抗生物素的磁珠(miltenyi，貨號：130-090-485)混勻孵育10min，過磁力管柱(Quadro MACS Starting Kit)收集陽性細胞。

陽性細胞經過再次培養、誘導後，取4.0×10⁷細胞進行第二輪流式分選：1)用1mL 1×PBSA，離心棄上清；2)與1mL含1nM HSA-Biotin及鼠抗V5抗體(Invitrogen，貨號2156578，1：1000稀釋)的1×PBSA冰上孵育30min：3)離心棄上清，加入1mL 1×PBSA洗滌一次；4)加入200μL含螢光抗體的1×PBSA(SA-PE廠家eBioscience，貨號：12-4317-8，按1：200稀釋；羊抗鼠-647廠家Invitrogen，貨號：A21235，按1：400稀釋)，避光冰上孵育20分鐘；5)重複步驟3，加入2mL 1×PBSA重新懸浮細胞，藉由流式分選儀器收集647螢光信號與PE螢光信號均強的細胞群。分選後取部分細胞塗布於SD-Trp固體培養基(Clontech，貨號：630309)平板，30℃靜置培養3天。

實施例2 單株酵母菌落測序與流式染色鑑定

JYYDL032第二輪篩選產物，塗布於SD-Trp平板，30℃靜置培養3天生長出酵母單株菌落。挑取92個單株進行測序分析，最終獲得 3個獨一的單鏈抗體序列(表1)。將對照抗體的序列(源自Ablynx，ALX-0761，胺基酸序列見SEQ ID NO：27)展示於酵母表面，作為陽性對照抗體，如表2對相應的酵母單株菌落進行流式染色分析，各取1×10⁶個細胞按表2方案進行染色評估：方案1評估各株與HSA-Biotin結合水平，PE平均螢光信號強度(MFI)越強代表結合能力越強；方案2評估各株與無關抗原的非特異性結合水平，PE的MFI值越低說明非特異性越弱；方案3評估各株與對照抗體(內部製備)的競爭信號，APC的MFI值越低說明競爭性越強。

根據各株按方案1、2、3的染色結果，綜合各株序列的相似性，最終挑取株Y24A2、Y24A5、Y24B2的序列進行抗體表達，如表3。

實施例3 候選抗體表達

將各株的V_HH序列與IgG1 Fc N297A融合，進行密碼子優化，基因合成後裝入表達載體pcDNA3.4(Life Technologies)。表達質粒擴增和質粒抽提後質粒轉入ExpiCHO細胞(ThermoFisher Scientific，A29133)，根據供應商ExpiCHO表達系統方法進行抗體瞬轉表達，過程如下：在培養總體積25mL培養基中，36.5℃、8%二氧化碳濃度下培養Expi CHO細胞到密度6×10⁶/mL，使用ExpiFectamine轉染試劑化轉各10μg抗體輕重鏈表達質粒到細胞；轉染一天後，各取150μL和4mL ExpiCHO增強劑和ExpiCHO輔料添加到培養細胞中，繼續培養至9天，4度，3500轉離心取上清。混合AmMagTM Protein A磁珠(Genscript，L00695)和抗體表達上清，室溫孵育2小時，PBS洗滌兩次棄上清，加入適量沖提緩衝液Protein G or A SefinoseTM Elution buffer (Sangon,C600481)，充分混勻後置於試管架上靜止孵育5分鐘，孵育期間重新懸浮磁珠2-3次，重複沖提2次，沖提後，立即加入適量中和液1M Tris-HCl，pH7.5(Sangon,B548124)中和備用，得到純化的抗體見表4。

實施例4 候選抗體親和力測定

為了測定陽性對照抗體、Ab0716.1、Ab0716.2、Ab0716.4抗體與人血清白蛋白的親和力，採用Octet RED96e(Fortebio)測定候選抗體與HSA(Acro，貨號：HSA-H522a)的親和力，抗原及抗體均用1×PBST(1×PBS：生工，B548117-0500；0.02%吐溫20：sigma，P1379)稀釋，抗原使用濃度為100nM，抗體使用濃度為64nM。將候選抗體樣品按200μL/孔加入96孔板(Greiner bio-one，655209)，設置軟體參數，溫度30℃、收集標準動力學信號的頻率為5.0Hz；用1×PBST預濕AHC傳感器(Fortébio，貨號：18-0015)10分鐘，然後上機檢測。每個循環包含以下步驟：1)浸入緩衝液60s；2)檢測抗原是否與傳感器有非特異性結合；3)10mM pH1.7的甘胺酸溶液再生；4)浸入緩衝液60s；5)抗體固化在傳感器上，時間為30s；6)傳感器浸入緩衝液180s；7)抗原與抗體結合，時間180s；8)抗原抗體的解離，時間10分鐘；9)傳感器再生。採用Fortebio的Data Analysis 12.0軟體，對抗原-抗體以1：1的結合方式，測定結合速率(K_on)和解離速率(K_off)，以此計算抗體的平衡解離常數(K_D)，結果如表5。

由表5可知，候選抗體均可與HSA結合，且親和力顯著強於陽性對照抗體。

實施例5 候選抗體理化性質評估

根據實施例3和實施例4的實驗結果，抗體Ab0716.1、Ab0716.2的表達量及親和力較為理想，作為候選分子繼續進行理化成藥性評估，具體如下：

SEC-HPLC純度分析

(1)將樣品濃度調整至1mg/mL，混勻，12000rpm離心5min，取上清轉至樣品瓶，放入HPLC樣品盤。設置色譜條件如下：

(2)色譜管柱採用流動相(200mM磷酸鹽緩衝液，pH6.8)平衡後，進樣分析，用色譜軟體進行數據分析，峰面積歸一化法計算各個峰的峰面積百分比，百分比越高說明抗體純度越高。

HIC-HPLC分析

(1)將樣品濃度調整至1mg/ml，離心取上清待測。設置色譜條件如下：

(2)用流動相A(50mM磷酸鹽緩衝液/1M硫酸銨，pH 7.0)和流動相B(50mM磷酸鹽緩衝液，pH 7.0)進行梯度沖提，記錄主峰保留時間，出峰時間短則抗體親水性強。

熔解溫度(Tm)值分析

將樣品濃度調整至1mg/mL，然後按照Protein Thermal Shift^TM Starter Kit說明書，取供試品溶液13μL加入至PCR管內，加入5μL Protein Thermal shift^TM Buffer，加入2μL 10×染色液，使反應體積為20μL，混勻後，12000rpm離心5min以去除氣泡。將檢測樣品置於PCR儀內，進行樣品分析，記錄樣品的Tm值，Tm值越高表示抗體的熱穩定性越好。

根據表6可知，候選抗體Ab0716.1的純度、熱穩定性、親水性等理化指標較為理想，將Ab0716.1作為候選分子繼續進行人源化，提高與人源抗體的同源性，以降低免疫原性。

實施例6 候選抗體Ab0716.1人源化與表達

綜合實施例3-5的實驗結果，最終挑取候選抗體Ab0716.1的V_HH序列進行人源化。將Ab0716.1的V_HH序列進行IMGT/Domain Gap Align，查找與其同源性最高的人源的germline為IGHV3-23*04。Ab0716.1序列按Chothia規則編號，對H1、H13、H44、H45、H49、H74、H76、 H79、H81、H82B、H83、H84、H108等位點按表7進行突變，其他位點胺基酸保持不變。Ab0716Hz1的V_HH序列如SEQ ID NO：20所示，Ab0716Hz2的V_HH序列如SEQ ID NO：21所示。

將表7中Ab0716Hz1、Ab0716Hz2的V_HH全長序列進行IMGT/Domain Gap Align分析，比較人源化前後與IGHV3-23*04的同源性；此外，將人源化後的VHH與IgG1 Fc N297A融合表達，參考實施例2.1進行人源化抗體的表達、純化，具體結果見表8。由表8可知，人源化後抗體與IGHV3-23*04的同源性提高至87%左右，且人源化抗體的表達量較為理想，繼續進行後續評估。

實施例7 人源化抗體親和力測定

參照實施例4的方法，測定Ab0716.1人源化抗體與人、猴、鼠來源的血清白蛋白的親和力，結果如表9。由表9可知，雖然人源化後抗體分子Ab0716Hz1、Ab0716Hz2與人血清白蛋白的親和力均較人源化之前有所下降，但仍與人血清白蛋白保持有較強親和力；Ab0716Hz1、Ab0716Hz2與猴血清白蛋白親和力較弱；Ab0716Hz1、Ab0716Hz2與鼠血清白蛋白不結合。

實施例8 人源化抗體理化性質評估

將人源化後抗體分子Ab0716Hz1、Ab0716Hz2進行成藥性評估，具體如下：

同實施例5，SEC-HPLC純度分析，百分比越高說明抗體純度越高；熔解溫度(Tm)值分析，Tm值越高表示抗體的熱穩定性越好；HIC-HPLC分析，出峰時間越短表示抗體的親水性越好。

毛細管等電聚焦(iCIEF)分析

取樣品溶液加入到已經充分混勻的以下體系中：1%的甲基纖維素(MC)70μL，尿素5M 80μL，兩性電解質Pharmalyte pH 3-10 8μL，pI marker 5.5和9.5各2μL。補加適當體積超純水至200μL，混勻。離心取上清進樣分析。分析結束後，將結果文件導入ChromPerfect軟體進行圖譜積分處理並計算各峰的等電點以及各峰百分比，分析候選抗體的電荷異構體分佈情況。

綜合實施例6-8可知，候選抗體Ab0716.1經過人源化後獲得Ab0716Hz1、Ab0716Hz2分子，與IGHV3-23*04的同源性提高至87%左右，並且人源化抗體在表達量、親和力、理化性質等方面均符合內部成藥性標準，可作為候選分子繼續開發；但與猴血清白蛋白親和力較弱，需要繼續進行親和力成熟改造，提高其與猴血清白蛋白的親和力。

實施例9 Ab0716Hz2親和力成熟文庫設計與構建

基於實施例1-8綜合考慮，最終選擇抗體Ab0716Hz2對其繼續進行親和力成熟，提高其與猴血清白蛋白的親和力。對Ab0716Hz2的抗原結合決定簇(CDR)位點的胺基酸進行隨機突變，構建各CDR區的突變文庫，利用酵母展示技術高通量篩選與抗原特異性結合力強的序列。將Ab0716Hz2的可變區胺基酸序列按Chothia編碼規則進行編碼，CDR區按Chothia定義。對重鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3，設計NNK突變引子進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增各CDR突變文庫基因片段。參考實施例1構建親和力成熟突變文庫，文庫編號JYYDL184-187；文庫JYYDL184-187電轉後分別在100mL的SD-Trp培養基，30℃、225轉/分鐘培養過夜；各取1.0×10⁸菌量，重新懸浮於20mL YPGP誘導培養基，20℃、225轉/分鐘培養24小時，置於4℃冰箱待用。同時將Ab0716Hz2的親本序列展示於酵母表面，作為親本對照使用。

實施例10 Ab0716Hz2親和力成熟文庫篩選與單株鑑定

JYYDL184文庫誘導後菌液，取1.5×10⁹細胞用磁珠分選系統進行第一輪富集：1.用50mL 1×PBSA洗滌一次，3000轉/分鐘離心3分鐘棄上清；2.與20mL含10nM生物素標記的猴血清白蛋白(以下簡稱CSA-Biotin)的1×PBSA，室溫孵育30分鐘；3.洗滌後加入抗生物素的磁珠混勻孵育10min，過磁力管柱收集陽性細胞；同理，JYYDL185-JYYDL187等文庫誘導後菌液，取1.5×10⁹細胞用相同方法，在10nM生物素標記的人血清白蛋白條件進行磁珠富集。

磁珠篩選後陽性細胞經過再次培養、誘導後，取2.0×10⁷細胞進行第二輪流式分選：1)用1mL 1×PBSA，離心棄上清；2)與1mL含 3nM CSA-Biotin及鼠抗V5抗體的1×PBSA冰上孵育30min；3)離心棄上清，加入1mL 1×PBSA洗滌一次；4)加入200μL含螢光抗體的1×PBSA(含SA-PE及羊抗鼠-647)，避光冰上孵育20分鐘；5)重複步驟3，加入2mL 1×PBSA重新懸浮細胞，藉由流式分選儀器收集647螢光信號與PE螢光信號均強的細胞群。第二輪流式分選後細胞經過再次培養、誘導後，同第二輪方法，取2.0×10⁷細胞在10nM CSA-Biotin孵育後進行第三輪流式分選，分選後取部分細胞塗布於SD-Trp固體培養基平板，30℃靜置培養3天。

JYYDL184-JYYDL187第三輪篩選產物，各挑取46個單株進行測序分析，最終獲得獨一序列的酵母單株菌落進行流式染色分析，各取1×10⁶個細胞按表11方案進行染色評估：方案1評估各株與人血清白蛋白的結合水平，PE平均螢光信號強度(MFI)越強代表結合能力越強；方案2評估各株與猴血清白蛋白的結合水平，PE的MFI值越強代表結合能力越強。

根據各株按方案1、2的染色結果，綜合各株序列的相似性，最終挑取株YC225G1、YC222H4、YC226H5的序列進行抗體表達，如表12。

實施例11 親和力成熟候選抗體表達

將各株的V_HH序列與IgG1 Fc N297A融合，委託上海百英生物科技有限公司進行瞬轉HEK293細胞表達、純化，最終得到親和力成熟候選抗體見表13。

實施例12 候選抗體親和力測定

同實施例7，繼續測定親和力成熟抗體Ab0716Am01、Ab0716Am02、Ab0716Am06及親本抗體Ab0716Hz2分別與人、猴、鼠來源的血清白蛋白的親和力，結果如表14。由表14可知，親和力成熟後抗體Ab0716Am01、Ab0716Am02、Ab0716Am06與猴血清白蛋白的親和力相對於親本抗體均大幅提高；與人血清白蛋白的親和力維持在1.41-5.0nM之間，均可以接受；親和力前後抗體與鼠血清白蛋白均不結合。

實施例13 人源化抗體理化性質評估

同實施例8，將親和力成熟後抗體Ab0716Am01、Ab0716Am02、Ab0716Am06進行理化成藥性評估，結果如表15。由表15可知，親和力成熟後抗體Ab0716Am01、Ab0716Am02、Ab0716Am06的純度、熱穩定性、親水性、電荷異構體等理化指標較為理想，符合內部成藥性標準。

綜合實施例12-13可知，親和力成熟後抗體Ab0716Am01、Ab0716Am02、Ab0716Am06經過親和力成熟後與猴血清白蛋白的親和力大幅提高，同時與人血清白蛋白維持了較好親和力，且並且親和力成熟抗體在表達量、親和力、理化性質等方面均符合內部成藥性標準，可作為候選分子繼續開發。

前述詳細說明是以解釋和舉例的方式提供的，並非要限制所附申請專利範圍的範圍。目前本揭露所列舉的實施方式的多種變化對所屬技術領域具有通常知識者來說是顯而易見的，且保留在所附的申請專利範圍和其等同方案的範圍內。

Claims

一種分離的抗原結合蛋白，其包含抗體重鏈可變區VH中的至少一個CDR，該VH包含SEQ ID NO：26或38所示的胺基酸序列。
如請求項1所述的分離的抗原結合蛋白，其包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1包含SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列。
如請求項1或2所述的分離的抗原結合蛋白，其包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1包含SEQ ID NO：3或30所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：2、31或32所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列。
如請求項1至3中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中該HCDR1包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列；或者該HCDR1包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列；或者該HCDR1包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列；或者該HCDR1包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含 SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列；或者該HCDR1包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。
如請求項1至4中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包含VH，該VH包含SEQ ID NO：26或38所示的胺基酸序列。
如請求項5所述的分離的抗原結合蛋白，其中該VH包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、和SEQ ID NO：35中任一項所示的胺基酸序列。
如請求項1至6中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包括抗體或其抗原結合片段。
如請求項7所述的分離的抗原結合蛋白，其中該抗原結合片段為V_HH。
如請求項1至8中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其能夠結合人血清白蛋白。
一種融合蛋白，其包含如請求項1至9中任一項所述的分離的抗原結合蛋白。
一種分離的核酸分子，其編碼如請求項1至9中任一項所述的分離的抗原結合蛋白或如請求項10所述的融合蛋白。
一種載體，其包含如請求項11所述的核酸分子。
一種細胞，其包含如請求項1至9中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、如請求項10所述的融合蛋白、如請求項11所述的核酸分子或如請求項12所述的載體。
一種製備如請求項1至9中任一項所述的分離的抗原結合蛋白的方法，該方法包括在使得如請求項1至9中任一項所述的分離的抗原結合蛋白表達的條件下，培養如請求項13所述的細胞。
一種醫藥組成物，其包含如請求項1至9中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、如請求項10所述的融合蛋白、如請求項11所述的核酸分子、如請求項12所述的載體和/或如請求項13所述的細胞，以及視需要地藥學上可接受的載劑。
一種用於檢測或測定人血清白蛋白的方法，該方法包括使用如請求項1至9中任一項所述的分離的抗原結合蛋白或如請求項10所述的融合蛋白。
一種試劑盒，其包含如請求項1至9中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、如請求項10所述的融合蛋白、如請求項11所述的核酸分子、如請求項12所述的載體、如請求項13所述的細胞和/或如請求項15所述的醫藥組成物。
一種如請求項1至9中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、如請求項10所述的融合蛋白、如請求項11所述的核酸分子、如請求項12所述的載體、如請求項13所述的細胞、如請求項15所述的醫藥組成物和/或如請求項17所述的試劑盒在製備預防和/或治療疾病或病症的藥物中的用途。