KR20220137723A - 항-cd3 및 항-cd123 이중 특이성 항체 및 이의 용도 - Google Patents

항-cd3 및 항-cd123 이중 특이성 항체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 출원은 인간 CD3E에 대한 항원 결합부 및/또는 인간 CD123에 대한 항원 결합부를 포함하는 이중 특이성 항체를 제공한다. 이 밖에, 본 출원은 상기 이중 특이성 항체의 의학적 및 생물학적 용도를 더 제공한다.

Description

항-CD3 및 항-CD123 이중 특이성 항체 및 이의 용도
본 출원은 대체로 항체 약물 분야에 관한 것이고, 구체적으로, 본 출원은 인간 CD3E에 대한 항원 결합부 및/또는 인간 CD123에 대한 항원 결합부를 포함하는 이중 특이성 항체 및 이의 의학적 및 생물학적 용도를 제공한다.
본 출원은 2020년 2월 5일에 제출한 출원번호가 202010080449.9인 중국 특허 출원의 우선권을 주장하는 바, 상기 출원의 모든 내용은 통합되어 본 출원에 원용된다.
이중 특이성 항체(bispecific antibody, BsAb)는 두 개의 상이한 항원 결합 부위를 포함하는 인공 항체이다. 이중 특이성 항체는 생물 의학 분야, 특히 종양 면역 치료 분야에서 널리 사용된다. CD3을 표적으로 하는 이중 특이성 항체의 하나의 암(arm)은 T 세포 표면의 TCR 수용체 복합체 중의 CD3E 서브유닛에 결합할 수 있고, 다른 하나의 암은 종양 항원을 표적으로 한다. 이러한 방식을 통해, 이중 특이성 항체는 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 비의존적 방식으로 종양 세포를 특이적으로 살상하도록 T 세포를 재지정할 수 있다.
이중 특이성 항체의 플랫폼은 많고 구조가 복잡하다. 항체의 구조에 따라 크게 Fc 단편이 있는 항체와 Fc 단편이 없는 항체의 두 가지로 나눌 수 있다. Fc 단편이 없는 이중 특이성 항체는 2개의 항체의 VH 영역 및 VL 영역으로 구성되거나 Fab 단편으로 구성되는데, 이러한 이중 특이성 항체는 주로 BiTE, DART, TandAbs, bi-nanobody 등이 대표적이다. 이러한 이중 특이성 항체의 장점은 경쇄-중쇄 불일치가 없는 것이고 단점은 반감기가 짧아 임상 적용이 불편한 것이다. Fc 단편이 있는 이중 특이성 항체는 기존의 단클론 항체의 구조를 유지하고 Fc 단편의 생물학적 기능을 매개할 수 있다. 이러한 이중 특이성 항체는 KIH IgG, crossmab, DVD-Ig, Triomab 등이 대표적이고, 체내 반감기가 길며 ADCC, CDC 활성을 가질 수 있다(Hongyan Liu, Abhishek Saxena, Sachdev S. Sidhu, et al. Fc engineering for Developing Therapeutic Bispecifc Antibodies and Novel Scaffolds. Front. Immunol. 2017;8:38).
따라서, 당업계에서 이중 특이성 항체의 광범위한 적용성을 고려하여 새로운 이중 특이성 항체의 개발이 필요하다.
제1 방면에 따르면, 본 출원은 인간 CD3E에 대한 항원 결합부를 포함하는 이중 특이성 항체를 제공하되, 상기 인간 CD3E에 대한 항원 결합부는,
서열번호 1로 표시되는 HCDR1(중쇄 CDR1),
서열번호 2로 표시되는 HCDR2(중쇄 CDR2),
서열번호 3으로 표시되는 HCDR3(중쇄 CDR3),
서열번호 4로 표시되는 LCDR1(경쇄 CDR1),
서열번호 5로 표시되는 LCDR2(경쇄 CDR2), 및
서열번호 6으로 표시되는 LCDR3(경쇄 CDR3)을 포함하고;
여기서, HCDR 및 LCDR은 Kabat에 따라 정의된다.
제2 방면에 따르면, 본 출원은 인간 CD123에 대한 항원 결합부를 포함하는 이중 특이성 항체를 제공하되, 상기 인간 CD123에 대한 항원 결합부는,
서열번호 7로 표시되는 HCDR1(중쇄 CDR1),
서열번호 8로 표시되는 HCDR2(중쇄 CDR2),
서열번호 9로 표시되는 HCDR3(중쇄 CDR3),
서열번호 4로 표시되는 LCDR1(경쇄 CDR1),
서열번호 5로 표시되는 LCDR2(경쇄 CDR2), 및
서열번호 6으로 표시되는 LCDR3(경쇄 CDR3)을 포함하고;
여기서, HCDR 및 LCDR은 Kabat에 따라 정의된다.
제3 방면에 따르면, 본 출원은 인간 CD3E에 대한 항원 결합부 및 인간 CD123에 대한 항원 결합부를 포함하는 이중 특이성 항체를 제공한다.
제3 방면의 일부 구현 방식에 있어서, 상기 인간 CD3E에 대한 항원 결합부는,
서열번호 1로 표시되는 HCDR1,
서열번호 2로 표시되는 HCDR2,
서열번호 3으로 표시되는 HCDR3,
서열번호 4로 표시되는 LCDR1,
서열번호 5로 표시되는 LCDR2, 및
서열번호 6으로 표시되는 LCDR3을 포함하고;
여기서, HCDR 및 LCDR은 Kabat에 따라 정의된다.
제3 방면의 일부 구현 방식에 있어서, 상기 인간 CD123에 대한 항원 결합부는,
서열번호 7로 표시되는 HCDR1,
서열번호 8로 표시되는 HCDR2,
서열번호 9로 표시되는 HCDR3,
서열번호 4로 표시되는 LCDR1,
서열번호 5로 표시되는 LCDR2, 및
서열번호 6으로 표시되는 LCDR3을 포함하고;
여기서, HCDR 및 LCDR은 Kabat에 따라 정의된다.
제3 방면의 일부 구현 방식에 있어서, 상기 인간 CD3E에 대한 항원 결합부 및 상기 인간 CD123에 대한 항원 결합부는 동일한 경쇄 가변 영역을 포함한다.
제3 방면의 일부 구현 방식에 있어서, 상기 이중 특이성 항체는 동일한 힌지 영역을 갖는 2개의 중쇄 불변 영역을 포함하는 IgG1 항체이고, 상기 힌지 영역의 아미노산 서열은 서열번호 10으로 표시된다.
제3 방면의 일부 구현 방식에 있어서, 상기 이중 특이성 항체는 제1 중쇄 불변 영역 및 제2 중쇄 불변 영역을 포함하는 IgG1 항체이고, 여기서, 상기 제1 중쇄 불변 영역의 354번째 및 366번째 아미노산은 각각 C 및 W이며, 상기 제2 중쇄 불변 영역의 349번째, 366번째, 368번째 및 407번째 아미노산은 각각 C, S, A 및 V이고; 항체 불변 영역의 아미노산 위치는 EU 넘버링에 따라 확정된다.
제3 방면의 일부 구현 방식에 있어서, 상기 이중 특이성 항체는 제1 중쇄 불변 영역 및 제2 중쇄 불변 영역을 포함하는 IgG1 항체이고, 여기서, 상기 제1 중쇄 불변 영역 및 제2 중쇄 불변 영역의 234번째, 235번째 및 331번째 아미노산은 각각 F, E 및 S이고; 항체 불변 영역의 아미노산 위치는 EU 넘버링에 따라 확정된다.
제1 방면 및 제3 방면의 일부 구현 방식에 있어서, 상기 인간 CD3E에 대한 항원 결합부는 서열번호 11로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 12로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
제2 방면 및 제3 방면의 일부 구현 방식에 있어서, 상기 인간 CD123에 대한 항원 결합부는 서열번호 13으로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 12로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
상기 어느 하나의 방면의 일부 구현 방식에 있어서, 상기 인간 CD3E에 대한 항원 결합부는 단쇄 항체(scfv) 또는 Fab 단편을 포함한다.
상기 어느 하나의 방면의 일부 구현 방식에 있어서, 상기 인간 CD123에 대한 항원 결합부는 단쇄 항체(scfv) 또는 Fab 단편을 포함한다.
제3 방면의 일부 구현 방식에 있어서, 상기 항체는 제1 암 및 제2 암을 갖고, 상기 제1 암은 인간 CD3E에 대한 항원 결합부를 포함하며, 상기 제2 암은 인간 CD123에 대한 항원 결합부를 포함하고,
상기 제1 암은 서열번호 11로 표시되는 중쇄 가변 영역 아미노산 서열, 서열번호 31로 표시되는 중쇄 불변 영역 아미노산 서열, 서열번호 12로 표시되는 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 32로 표시되는 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함하며;
상기 제2 암은 서열번호 13으로 표시되는 중쇄 가변 영역 아미노산 서열, 서열번호 30으로 표시되는 중쇄 불변 영역 아미노산 서열, 서열번호 12로 표시되는 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 32로 표시되는 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다.
제4 방면에 따르면, 본 출원은 제1 방면 내지 제3 방면 중 어느 한 방면에 따른 이중 특이성 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
제4 방면의 일부 구현 방식에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 CD123 양성 종양을 예방 또는 치료하는 데 사용된다.
제5 방면에 따르면, 본 출원은 CD123 양성 종양을 예방 또는 치료하기 위한 약물의 제조에서 제1 방면 내지 제3 방면 중 어느 한 방면에 따른 이중 특이성 항체, 또는 제4 방면에 따른 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
제6 방면에 따르면, 본 출원은 제1 방면 내지 제3 방면 중 어느 한 방면에 따른 이중 특이성 항체, 또는 제4 방면에 따른 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 CD123 양성 종양을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
도 1은 유세포 분석기를 이용하여 세포 표면의 CD123에 대한 재조합 항-CD123 단클론 항체의 특이적인 결합을 분석한 결과를 나타낸다.
도 2는 유세포 분석기를 이용하여 MV-4-11 세포 표면의 CD123에 대한 H7A3 인간화 돌연변이체 H7A3-h2-m5+L27E5의 결합을 분석한 결과를 나타낸다.
도 3은 ELISA를 이용하여 CD3E 및 CD123 이 두 가지 항원에 대한 이중 특이성 항체 CD3EХCD123의 결합을 분석한 결과를 나타낸다.
도 4는 유세포 분석기를 이용하여 Jurkat-Dual 세포 표면의 CD3E에 대한 이중 특이성 항체 CD3EХCD123의 결합 능력을 분석한 결과를 나타낸다.
도 5는 유세포 분석기를 이용하여 MV-4-11 세포 표면의 CD123에 대한 이중 특이성 항체 CD3EХCD123의 결합 능력을 분석한 결과를 나타낸다.
도 6은 CD123 양성 종양 세포의 존재 하에 이중 특이성 항체 CD3ХCD123에 의한 Jurkat-Dual 활성화의 결과를 나타내고, 여기서, A부분은 이중 특이성 항체 CD3ХCD123, 항-CD3E 단클론 항체 H3B8+L27E5, 항-CD123 단클론 항체 H7A3-h2-m5+L27E5, 및 항-CD3E 단클론 항체 H3B8+L27E5 및 항-CD123 단클론 항체 H7A3-h2-m5+L27E5의 병용군에 의한 Jurkat-Dual 활성화의 결과이며; B부분은 CD123 양성 표적 세포의 존재 하에 이중 특이성 항체 CD3ХCD123, 이중 특이성 항체 대조 샘플 Xmab14045 및 HIgG에 의한 Jurkat-Dual 활성화의 결과, 및 CD123 음성 표적 세포의 존재 하에 이중 특이성 항체 CD3ХCD123 및 이중 특이성 항체 대조 샘플 Xmab14045에 의한 Jurkat-Dual 활성화의 결과이다.
도 7은 CD123 양성 종양 세포에 대한 이중 특이성 항체 CD3EХCD123에 의해 매개되는 정제된 T 세포의 살상 결과를 나타낸다.
도 8은 유세포 분석기를 이용하여 CD123 양성 종양 세포의 존재 하에 이중 특이성 항체 CD3EХCD123에 의한 T 세포의 특이적 활성화, CD69 발현의 상향 조절을 검출한 결과를 나탄낸다.
도 9는 유세포 분석기를 이용하여 CD123 양성 종양 세포의 존재 하에 이중 특이성 항체 CD3EХCD123에 의한 T 세포 증식의 촉진을 검출한 결과를 나타내고, 여기서, A부분은 CD123 양성 종양 세포의 존재 하에 이중 특이성 항체 CD3ХCD123, 항-CD3E 단클론 항체 H3B8+L27E5, 항-CD123 단클론 항체 H7A3-h2-m5+L27E5, 및 항-CD3E 단클론 항체 H3B8+L27E5 및 항-CD123 단클론 항체 H7A3-h2-m5+L27E5의 병용군에 의한 T 세포 증식의 촉진의 결과이며; B부분은 CD123 양성 종양 세포의 존재 하에 이중 특이성 항체 CD3ХCD123 및 이중 특이성 항체 대조 샘플 Xmab14045에 의한 T 세포 증식의 촉진의 결과이다.
도 10은 이중 특이성 항체 CD3EХCD123에 의해 치료되는 hCD34+ 인간화 MV-4-11 세포 종양 모델 마우스의 종양 부피의 변화를 나타낸다.
서열의 설명
서열번호 1은 항-인간 CD3E 단클론 항체 H3B8+L27E5의 중쇄 가변 영역 H3B8의 HCDR1의 아미노산 서열이다.
서열번호 2는 항-인간 CD3E 단클론 항체 H3B8+L27E5의 중쇄 가변 영역 H3B8의 HCDR2의 아미노산 서열이다.
서열번호 3은 항-인간 CD3E 단클론 항체 H3B8+L27E5의 중쇄 가변 영역 H3B8의 HCDR3의 아미노산 서열이다.
서열번호 4는 경쇄 가변 영역 L27E5의 LCDR1의 아미노산 서열이다.
서열번호 5는 경쇄 가변 영역 L27E5의 LCDR2의 아미노산 서열이다.
서열번호 6은 경쇄 가변 영역 L27E5의 LCDR3의 아미노산 서열이다.
서열번호 7은 항-인간 CD123 단클론 항체 H7A3-h2-m5+L27E5의 중쇄 가변 영역 H7A3-h2-m5의 HCDR1의 아미노산 서열이다.
서열번호 8은 항-인간 CD123 단클론 항체 H7A3-h2-m5+L27E5의 중쇄 가변 영역 H7A3-h2-m5의 HCDR2의 아미노산 서열이다.
서열번호 9는 항-인간 CD123 단클론 항체 H7A3-h2-m5+L27E5의 중쇄 가변 영역 H7A3-h2-m5의 HCDR3의 아미노산 서열이다.
서열번호 10은 힌지 영역의 아미노산 서열이다.
서열번호 11은 래트 단클론 항체 WM03-C6의 인간화 중쇄 돌연변이체 H3B8의 아미노산 서열이다.
서열번호 12는 래트 단클론 항체 WM03-C6의 인간화 경쇄 돌연변이체 L27E5의 아미노산 서열이다.
서열번호 13은 인간화 버전 H7A3-h2-m5의 아미노산 서열이다.
서열번호 14는 인간(Homo sapiens) CD3E 세포외 영역(hCD3E)의 아미노산 서열이다.
서열번호 15는 인간(Homo sapiens) CD3D 세포외 영역(hCD3D)의 아미노산 서열이다.
서열번호 16은 필리핀 원숭이(Macaca fascicularis) CD3E 세포외 영역(mfCD3E)의 아미노산 서열이다.
서열번호 17은 필리핀 원숭이(Macaca fascicularis) CD3D 세포외 영역(mfCD3D)의 아미노산 서열이다.
서열번호 18은 마우스(Mus musculus) CD3E 세포외 영역(mCD3E)의 아미노산 서열이다.
서열번호 19는 마우스(Mus musculus) CD3D 세포외 영역(mCD3D)의 아미노산 서열이다.
서열번호 20은 인간(Homo sapiens) CD123 서브타입 1 세포외 영역(hCD123-SP1)의 아미노산 서열이다.
서열번호 21은 필리핀 원숭이(Macaca fascicularis) CD123 서브타입 1 세포외 영역(mfCD123-SP1)의 아미노산 서열이다.
서열번호 22는 마우스(Mus musculus) CD123 서브타입 1 세포외 영역(mCD123-SP1)의 아미노산 서열이다.
서열번호 23은 His 태그의 아미노산 서열이다.
서열번호 24는 마우스(Mus musculus) IgG2a 항체의 Fc 단편(mFc)의 아미노산 서열이다.
서열번호 25는 헤테로다이머의 인간 IgG1 서브타입의 Fc 돌연변이체 FcK의 아미노산 서열이다.
서열번호 26은 헤테로다이머의 인간 IgG1 서브타입의 Fc 돌연변이체 FcH의 아미노산 서열이다.
서열번호 27은 인간(Homo sapiens) IgG1 서브타입 항체 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열이다.
서열번호 28은 인간 IgG1 서브타입 항체 중쇄 불변 영역 돌연변이체 IgG1H의 아미노산 서열이다.
서열번호 29는 인간 IgG1 서브타입 항체 중쇄 불변 영역 돌연변이체 IgG1K의 아미노산 서열이다.
서열번호 30은 인간 IgG1 서브타입 항체 중쇄 불변 영역 돌연변이체 IgG1m3-H의 아미노산 서열이다.
서열번호 31은 인간 IgG1 서브타입 항체 중쇄 불변 영역 돌연변이체 IgG1m3-K의 아미노산 서열이다.
서열번호 32는 인간(Homo sapiens) κ 서브타입 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열이다.
서열번호 33은 인간(Homo sapiens) λ 서브타입 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열이다.
서열번호 34는 단클론 항체 WM03-C6의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열이다.
서열번호 35는 단클론 항체 WM03-C6의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열번호 36은 항-인간 CD123의 단쇄 항체 S8F3의 아미노산 서열이다.
서열번호 37은 항-인간 CD123의 단쇄 항체 S8F3의 중쇄 가변 영역 S8F3VH의 아미노산 서열이다.
서열번호 38은 항-CD123 항체 CSL362의 중쇄 아미노산 서열이다.
서열번호 39는 항-CD123 항체 CSL362의 경쇄 아미노산 서열이다.
서열번호 40은 Hole 돌이변이를 포함하는 IgG1m3 서브타입의 Xmab14045의 CD123-결합 중쇄의 아미노산 서열이다.
서열번호 41은 Knob 돌이변이를 포함하는 IgG1m3 서브타입의 Xmab14045의 CD3E-결합 scFv 구조의 아미노산 서열이다.
서열번호 42는 Xmab14045의 경쇄의 아미노산 서열이다.
정의
하기 정의 및 방법은 본 출원을 보다 잘 정의하고 본 출원의 실천에 있어서 당업자를 안내하기 위해 제공된다. 달리 명시되지 않는 한, 본 출원에서 사용된 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다. 본 명세서에서 인용된 모든 특허 문헌, 학술 논문 및 다른 공개 출판물의 모든 내용은 통합되어 본 출원에 인용된다.
본 명세서에서 항체 구조를 설명할 경우, 아미노산 위치 넘버링과 관련된 설명은 인간 IgG1 항체의 EU 넘버링(EU numbering) 정의를 참조하며, 이는 당업자에게 공지된 것이고 당업자가 용이하게 찾을 수 있는 것이다. 이 외에, 본 명세서에서 EU 넘버링 위치와 결합하여 돌연변이를 설명할 경우, 천연 항체 서열에 관하여 발생하는 돌연변이를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "Fc 단편”, "Fc 도메인”, "Fc 부분” 또는 유사한 용어는 항체 중쇄 불변 영역의 일부분을 의미하고, 힌지 영역(hinge), 및 불변 영역의 CH2 단편과 CH3 단편을 포함한다. 인간 IgG1 항체의 EU 넘버링 정의를 참조하면, Fc 단편은 항체 불변 영역에서 216-447번째의 아미노산 서열이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "Fab(fragment antigen binding) 단편”, "Fab 부분” 또는 유사한 용어는 완전한 항체를 파파인으로 처리한 후 생성되는 항원에 결합할 수 있는 항체 단편을 의미하고, 완전한 경쇄(VL-CL), 중쇄 가변 영역 및 CH1 단편(VH-CH1)을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "단쇄 항체(scfv, single chain fragment variable)"는 일반적으로 유전공학 기술에 의해 구축된 단쇄 구조를 갖는 항체를 의미하고, 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)의 하나의 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이에 일반적으로 유연한 링커(linker)가 설계되어, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 항원에 결합될 수 있는 정확한 형태로 접힐 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항원 결합부”는 항체 구조 중 항원 결합 능력을 결정하는 부분을 의미한다. 당업자는 항체 구조 중 항원 결합 능력을 결정하는 주요 부분은 CDR이므로, CDR도 항원 결합부의 핵심 구성 부분인 것으로 이해할 수 있다. 이중 특이성 항체의 구축에서, "항원 결합부”의 예시는 단쇄 항체(scfv) 또는 Fab 단편을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "이중 특이성 항체”는 2개의 상이한 항원에 결합하는 능력을 갖는 항체를 의미하고, 이는 2개의 Fc 단편 및 이들에 각각 융합된 2개의 항원 결합부로 구성될 수 있다.
일부 구현 방식에 있서, 본 명세서에서 "이중 특이성 항체”는 인간 IgG1 항체 기반의 이중 특이성 항체를 의미하고, 본 명세서에서 설명된 변형된 구조를 제외하고 인간 IgG1 항체의 기본 특징 및 기능을 갖는다. 본 명세서에서의 "이중 특이성 항체”가 인간 IgG2 항체와 같은 다른 면역글로불린 서브타입에 기초할 수도 있다는 것은 당업자에게 공지된 것이다.
상보성 결정 영역(CDR, 일반적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3임)이 가변 영역에서 항체의 친화력 및 특이성에 가장 큰 영향을 미치는 영역이라는 것은 당업자에게 공지된 것이다. VH 또는 VL의 CDR 서열은 두 가지 일반적인 방식(즉, kabat 정의 및 Chothia 정의)이 있다(예를 들어, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991); A1-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948(1997); 및 Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA86:9268-9272(1989)를 참조). 주어진 항체의 가변 영역 서열에 대해, Kabat 정의 또는 Chothia 정의에 따라 VH 및 VL 서열 중 CDR 영역의 서열을 확정할 수 있다. 본 출원의 구현 방식에 있어서, Kabat를 이용하여 CDR 서열을 정의한다.
주어진 항체의 가변 영역 서열에 대해, 다양한 방식을 통해 가변 영역 서열 중 CDR 영역의 서열을 분석할 수 있으며, 예를 들어, 온라인 소프트웨어 Abysis를 이용하여 확정할 수 있다(http://www.abysis.org/).
본 명세서에서 사용된 용어 "특이적 결합”은 항원 에피토프에 대한 항체의 결합과 같은 두 분자 간의 비-무작위 결합 반응을 의미한다.
CD3 분자는 T 세포막의 중요한 분화 항원이자 성숙한 T 세포의 특징적인 마커이다. CD3은 γ, δ, ε 및 ζ의 4개 사슬 또는 γ, δ, ε, ζ 및 η의 5개 사슬(ζ 및 η는 호모 이성질체)으로 구성되며, CD3γε, CD3δε 및 CD3ζζ(또는 CD3ζη)의 3가지의 다이머로 구성되고 T 세포막에 발현된다. CD3γ, δ 및 ε의 3개 사슬은 고도로 보존된 산성 아미노산 잔기(γ는 글루탐산이고, δ 및 ε은 아스파르트산임)를 포함하고, 염다리를 통해 T 세포 수용체(TCR)의 α 및 β 사슬에 있는 염기성 아미노산 잔기에 비공유 결합으로 연결되어 안정적인 TCR -CD3 복합체 구조를 형성할 수 있다. 해당 복합체는 T 세포 활성화 신호를 전달하고 TCR 구조를 안정화시킬 수 있다. CD3의 각 사슬의 세포내 영역은 모두 ITAM(면역수용체 티로신 기반 활성화 모티브) 구조를 포함하며, 이 구조는 CD3 분자가 세포내 신호 전달을 매개하는 기초가 된다. TCR이 항원(MHC 분자가 제시하는 항원 펩티드)을 특이적으로 인식하여 결합한 후, T 세포내의 티로신 단백질 키나아제가 ITAM의 티로신 잔기를 인산화하고 SH2 도메인을 포함하는 티로신 단백질 키나아제(ZAP-70)를 모집하여 신호를 T 세포의 세포질 내로 전달하여, 세포내 활성화 기전을 개시하므로, CD3은 항원이 TCR에 의해 인식되어 생성된 활성화 신호를 전달하는 기능을 가지며, T 세포 활성화를 유도하는 첫 번째 신호이다.
인간 인터루킨-3(IL-3) 수용체 α 사슬로도 알려진 CD123은 분자량이 약 40 KDa인 시토카인 수용체 슈퍼패밀리의 구성원에 속하며 I형 막관통 당단백질이다. 인터루킨-3 수용체는 α 사슬(CD123)과 β 사슬(CD131)에 의해 형성된 헤테로다이머이다. IL-3이 CD123에 결합한 후, CD131은 신호 전달을 제공하여 조혈 세포 및 면역 세포의 기능을 조절하고 내피 세포 증식을 자극한다(Testa et al, Biomark Res.2:4(2014)).
CD123은 주로 골수 전구 세포, 형질세포양 수지상 세포, 단핵구, 호염기구 및 소량의 B 세포의 서브그룹에서 발현된다(Munoz L et al,Haematologica.86(12):1261-9). AML 환자의 약 80 %는 CD123을 과발현하는 모세포를 갖고, 연구에 따르면 CD123 항원의 과발현은 AML의 불량한 예후 및 낮은 완화율에 대응되는 것으로 나타났다(Testa U et al,Blood. 2002;100(8)). 대부분의 AML 환자는 초기 치료에 잘 반응하지만 일부 환자(60-80 %)는 완전한 완화를 달성하기 위해 강화 요법이 필요하다.
제1 방면에 따르면, 본 출원은 인간 CD3E에 대한 항원 결합부를 포함하는 이중 특이성 항체를 제공하되, 상기 인간 CD3E에 대한 항원 결합부는,
서열번호 1로 표시되는 HCDR1,
서열번호 2로 표시되는 HCDR2,
서열번호 3으로 표시되는 HCDR3,
서열번호 4로 표시되는 LCDR1,
서열번호 5로 표시되는 LCDR2, 및
서열번호 6으로 표시되는 LCDR3을 포함하고;
여기서, HCDR 및 LCDR은 Kabat에 따라 정의된다.
제2 방면에 따르면, 본 출원은 인간 CD123에 대한 항원 결합부를 포함하는 이중 특이성 항체를 제공하되, 상기 인간 CD123에 대한 항원 결합부는,
서열번호 7로 표시되는 HCDR1,
서열번호 8로 표시되는 HCDR2,
서열번호 9로 표시되는 HCDR3,
서열번호 4로 표시되는 LCDR1,
서열번호 5로 표시되는 LCDR2, 및
서열번호 6으로 표시되는 LCDR3을 포함하고;
여기서, HCDR 및 LCDR은 Kabat에 따라 정의된다.
제3 방면에 따르면, 본 출원은 인간 CD3E에 대한 항원 결합부 및 인간 CD123에 대한 항원 결합부를 포함하는 이중 특이성 항체를 제공한다.
제3 방면의 일부 구현 방식에 있어서, 상기 인간 CD3E에 대한 항원 결합부는,
서열번호 1로 표시되는 HCDR1,
서열번호 2로 표시되는 HCDR2,
서열번호 3으로 표시되는 HCDR3,
서열번호 4로 표시되는 LCDR1,
서열번호 5로 표시되는 LCDR2, 및
서열번호 6으로 표시되는 LCDR3을 포함하고;
여기서, HCDR 및 LCDR은 Kabat에 따라 정의된다.
제3 방면의 일부 구현 방식에서, 상기 인간 CD123에 대한 항원 결합부는,
서열번호 7로 표시되는 HCDR1,
서열번호 8로 표시되는 HCDR2,
서열번호 9로 표시되는 HCDR3,
서열번호 4로 표시되는 LCDR1,
서열번호 5로 표시되는 LCDR2, 및
서열번호 6으로 표시되는 LCDR3을 포함하고;
여기서, HCDR 및 LCDR은 Kabat에 따라 정의된다.
제3 방면의 일부 구현 방식에 있어서, 상기 인간 CD3E에 대한 항원 결합부 및 상기 인간 CD123에 대한 항원 결합부는 동일한 경쇄 가변 영역을 포함한다.
제3 방면의 일부 구체적인 구현 방식에 있어서, 상기 인간 CD3E에 대한 항원 결합부 및 상기 인간 CD123에 대한 항원 결합부는 동일한 경쇄를 포함하고, 해당 구현 방식은 경쇄 및 중쇄의 정확한 조립에 유리하므로, 마찬가지로 바람직한 구현 방식이다.
제3 방면의 일부 구현 방식에 있어서, 상기 이중 특이성 항체는 동일한 힌지 영역을 갖는 2개의 중쇄 불변 영역을 포함하는 IgG1 항체이고, 상기 힌지 영역의 아미노산 서열은 서열번호 10으로 표시되며, 이는 천연 인간 IgG1 항체 불변 영역의 216-230번째 서열을 대체하고, 항체 불변 영역의 아미노산 위치는 EU 넘버링에 따라 결정된다.
제3 방면의 일부 구현 방식에 있어서, 상기 이중 특이성 항체는 제1 중쇄 불변 영역 및 제2 중쇄 불변 영역을 포함하는 IgG1 항체이고, 여기서, 제1 중쇄 불변 영역의 354번째 및 366번째 아미노산은 각각 C 및 W이며, 제2 중쇄 불변 영역의 349번째, 366번째, 368번째 및 407번째 아미노산은 각각 C, S, A 및 V이고; 항체 불변 영역의 아미노산 위치는 EU 넘버링에 따라 결정된다.
항체 Fc 도메인을 유지하는 이중 특이성 항체를 구축할 경우, 이중 특이성 항체의 구조는 다음과 같은 두 가지 관점에서 최적화될 수 있는 바, 하나는 중쇄의 헤테로머화(heteromerization)이고 다른 하나는 경쇄와 중쇄의 정확한 조립이다. 일부 구현 방식에서, 두 가지 Fc 단편은 중쇄 헤테로머화를 확보할 수 있는 돌연변이를 포함한다. KIH 기술(knob-in-hole, KIH)은 중쇄 헤테로머화를 해결하는 전략이다. 일반적으로, KIH 기술은 CH3 영역의 아미노산 서열을 변형시켜 이종 반 항체의 페어링에 유리한 구조를 형성하는 기술로서, 이중 특이성 항체를 구성하는 동시에 정상 항체의 구조를 최대한 유지할 수 있다. 일부 구현 방식에서, 사용된 KIH 기술은, 하나의 Fc 단편의 354번째 및 366번째 아미노산이 각각 C 및 W이고 다른 하나의 Fc 단편의 349번째, 366번째, 368번째 및 407번째 아미노산이 각각 C, S, A 및 V이도록 하는 기술을 포함한다. KIH 기술에 관한 지침은, 예를 들어 "An efficient route to human bispecific IgG", A. Margaret Merchant et al., Nature Biotechnology, Volume 16, 1998을 참조할 수 있고, 이 문헌의 전체는 통합되어 본 출원에 인용된다.
제3 방면의 일부 구현 방식에 있어서, 상기 이중 특이성 항체는 제1 중쇄 불변 영역 및 제2 중쇄 불변 영역을 포함하는 IgG1 항체이고, 여기서, 제1 중쇄 불변 영역 및 제2 중쇄 불변 영역의 234번째, 235번째 및 331번째 아미노산은 각각 F, E 및 S이며; 항체 불변 영역의 아미노산 위치는 EU 넘버링에 따라 결정된다.
제3 방면의 일부 구현 방식에 있어서, 2개의 중쇄 불변 영역의 CH2 단편의 234번째, 235번째 및 331번째 아미노산은 각각 F, E 및 S이고, 이는 Fc 단편에 의해 매개되는 항체 의존성 세포 독성(ADCC)을 감소시킬 수 있음으로써, 체내에서 이중 특이성 항체로 인한 부작용을 줄일 수 있다. 상기 돌연변이에 관한 지침은, 예를 들어 "The binding affinity of human IgG for its high affinity Fc receptor is determined by multiple amino acids in the CH2 domain and is modulated by the hinge region", Stephen M. Canfield et al., J. Exp. Med. Volume 173, 1991을 참조할 수 있고, 이 문헌의 전체는 통합되어 본 출원에 인용된다.
제1 방면 및 제3 방면의 일부 구현 방식에 있어서, 인간 CD3E에 대한 항원 결합부는 서열번호 11(서열번호 1로 표시되는 HCDR1, 서열번호 2로 표시되는 HCDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 HCDR3을 포함함)로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 12로 표시되는 경쇄 가변 영역(서열번호 4로 표시되는 LCDR1, 서열번호 5로 표시되는 LCDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 LCDR3을 포함함)을 포함한다.
제2 방면 및 제3 방면의 일부 구현 방식에 있어서, 인간 CD123에 대한 항원 결합부는 서열번호 13(서열번호 7로 표시되는 HCDR1, 서열번호 8로 표시되는 HCDR2 및 서열번호 9로 표시되는 HCDR3을 포함함)으로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 12로 표시되는 경쇄 가변 영역(서열번호 4로 표시되는 LCDR1, 서열번호 5로 표시되는 LCDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 LCDR3을 포함함)을 포함한다.
상기 어느 하나의 방면의 일부 구현 방식에 있어서, 상기 인간 CD3E에 대한 항원 결합부는 단쇄 항체(scfv) 또는 Fab 단편을 포함한다.
상기 어느 하나의 방면의 일부 구현 방식에 있어서, 상기 인간 CD123에 대한 항원 결합부는 단쇄 항체(scfv) 또는 Fab 단편을 포함한다.
이중 특이성 항체는 두 가지 상이한 항원에 대해 2개의 상이한 항원 결합부를 갖고, 항원 결합부는 단쇄 항체(scfv) 또는 Fab 단편의 두 가지 형태를 포함할 수 있으므로, 주어진 두 가지 항원에 대해, 이중 특이성 항체의 항원 결합부의 구성은 Fab+Fab, Fab+scfv, scfv+Fab 및 scfv+scfv의 네 가지 조합 방식을 가질 수 있다.
상기 어느 하나의 방면의 일부 구체적인 구현 방식에 있어서, 상기 인간 CD3E에 대한 항원 결합부는 Fab 단편을 포함하고, 상기 인간 CD123에 대한 항원 결합부는 Fab 단편을 포함한다.
상기 어느 하나의 방면의 일부 구체적인 구현 방식에 있어서, 상기 인간 CD3E에 대한 항원 결합부는 Fab 단편을 포함하고, 상기 인간 CD123에 대한 항원 결합부는 단쇄 항체(scfv)를 포함한다.
상기 어느 하나의 방면의 일부 구체적인 구현 방식에 있어서, 상기 인간 CD3E에 대한 항원 결합부는 단쇄 항체(scfv)를 포함하고, 상기 인간 CD123에 대한 항원 결합부는 Fab 단편을 포함한다.
상기 어느 하나의 방면의 일부 구체적인 구현 방식에 있어서, 상기 인간 CD3E에 대한 항원 결합부는 단쇄 항체(scfv)를 포함하고, 상기 인간 CD123에 대한 항원 결합부는 단쇄 항체(scfv)를 포함한다.
본 명세서에 있어서, 이중 특이성 항체는 또한 2개의 "암(arm)"을 갖는 것으로 설명되고, 중간을 경계로 하여 이중 특이성 항체는 2개의 암으로 나뉠 수 있다. 이중 특이성 항체의 암은 Fc 단편 및 항원 결합부(Fab 단편 또는 단쇄 항체)로 구성될 수 있다. Fc 단편 및 Fab 단편으로 구성된 암의 경우, 구조가 일반적인 항체와 유사하고 완전한 중쇄 및 경쇄를 포함하므로, 이러한 암의 구조는 Fc+Fab로 표시될 수 있거나 중쇄(Fc+Fab 중의 중쇄 가변 영역 및 CH1 단편)+경쇄(Fab 중의 경쇄 부분)으로 표시될 수 있다. 2개의 암이 모두 Fab 단편에 의해 형성된 항원 결합부를 포함할 경우, 이렇게 형성된 이중 특이성 항체의 구조는 천연 항체에 가까우므로, 이는 바람직한 구현 방식이다.
제3 방면의 일부 구현 방식에 있어서, 상기 항체는 제1 암 및 제2 암을 갖고, 여기서, 제1 암은 인간 CD3E에 대한 항원 결합부를 포함하며, 제2 암은 인간 CD123에 대한 항원 결합부를 포함하고,
상기 제1 암은 서열번호 11로 표시되는 중쇄 가변 영역 아미노산 서열, 서열번호 31로 표시되는 중쇄 불변 영역 아미노산 서열, 서열번호 12로 표시되는 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 32로 표시되는 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함하며;
상기 제2 암은 서열번호 13으로 표시되는 중쇄 가변 영역 아미노산 서열, 서열번호 30으로 표시되는 중쇄 불변 영역 아미노산 서열, 서열번호 12로 표시되는 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 32로 표시되는 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다.
상기 어느 하나의 방면의 일부 구현 방식에 있어서, 상기 이중 특이성 항체의 중쇄 불변 영역은 IgG1H, IgG1K, IgG1m3-H 또는 IgG1m3-K와 같은 인간 IgG1 서브타입 또는 선택된 인간 IgG1 서브타입의 다양한 돌연변이체이다.
상기 어느 하나의 방면의 일부 구현 방식에 있어서, 상기 이중 특이성 항체의 경쇄 불변 영역은 인간 κ 서브타입 또는 인간 λ 서브타입이고, 바람직하게는 인간 κ 서브타입이다.
제4 방면에 따르면, 본 출원은 제1 방면 내지 제3 방면 중 어느 한 방면에 따른 이중 특이성 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일부 구현 방식에 있어서, 상기 약학 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 희석제 등을 더 포함한다.
일부 구현 방식에 있어서, 상기 약학 조성물은 급성 골수성 백혈병(AML) 및 모구 형질세포양 수지상세포 종양(BPDCN)과 같은 CD123 양성 종양을 예방 또는 치료하는 데 사용된다.
일부 구현 방식에 있어서, 약학 조성물은 활석분, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일과 같은 윤활제; 습윤제; 유화제; 현탁제; 벤조산, 소르브산 및 칼슘 프로피오네이트와 같은 방부제; 감미제 및/또는 향미제 등을 더 포함할 수 있다.
일부 구현 방식에 있어서, 본 출원의 약학 조성물을 정제, 환제, 분말, 로젠지, 엘릭시르, 현탁액, 유제, 용액, 시럽, 좌제 또는 캡슐 등 형태로 제형화할 수 있다.
일부 구현 방식에 있어서, 임의의 생리학적으로 허용 가능한 투여 방식을 이용하여 본 출원의 약학 조성물을 전달할 수 있고, 이러한 투여 방식은 경구 투여, 비경구 투여, 비강 투여, 직장 투여, 복강내 투여, 혈관내 주사, 피하 투여, 경피 투여, 흡입 투여 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
일부 구현 방식에 있어서, 원하는 순도의 시약을 경우에 따른 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 등과 혼합함으로써, 치료 용도를 위한 약학 조성물을 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 조제하여 저장할 수 있다.
제5 방면에 따르면, 본 출원은 CD123 양성 종양을 예방 또는 치료하기 위한 약제의 제조에서 제1 방면 내지 제3 방면 중 어느 한 방면에 따른 이중 특이성 항체, 또는 제4 방면에 따른 약학 조성물의 용도를 제공한다.
제5 방면의 일부 구현 방식에 있어서, 상기 CD123 양성 종양은 급성 골수성 백혈병(AML) 및 모구 형질세포양 수지상세포 종양(BPDCN)으로부터 선택된다.
제6 방면에 따르면, 본 출원은 제1 방면 내지 제3 방면 중 어느 한 방면에 따른 이중 특이성 항체, 또는 제4 방면에 따른 약학 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 CD123 양성 종양의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
제6 방면의 일부 구현 방식에 있어서, 상기 CD123 양성 종양은 급성 골수성 백혈병(AML) 및 모구 형질세포양 수지상세포 종양(BPDCN)으로부터 선택된다.
이상의 상세한 설명은 당업자가 본 출원의 내용을 보다 명확하게 이해하도록 하기 위한 것일 뿐 어떠한 측면에서도 제한하고자 하는 것이 아님을 이해해야 한다. 당업자는 상기 구현 방식에 대해 다양한 수정 및 변형을 진행할 수 있다.
이하의 실시예는 단지 설명을 위한 것이며 본 출원의 범위를 제한하는 것을 목적으로 하지 않는다.
실시예
실시예 1: 재조합 단백질의 제조
CD3EХCD123 이중 특이성 항체의 제조 및 동정 과정에서는 인간 CD3E 세포외 영역(hCD3E, 서열번호 14), 인간 CD3D 세포외 영역(hCD3D, 서열번호 15), 원숭이 CD3E 세포외 영역(mfCD3E, 서열번호 16), 원숭이 CD3D 세포외 영역(mfCD3D, 서열번호 17), 마우스 CD3E 세포외 영역(mCD3E, 서열번호 18), 마우스 CD3D 세포외 영역(mCD3D, 서열번호 19) 및 인간 CD123 서브타입 1 세포외 영역(hCD123-SP1, 서열번호 20), 원숭이 CD123 서브타입 1 세포외 영역(mfCD123-SP1, 서열번호 21), 및 마우스 CD123 서브타입 1 세포외 영역(mCD123-SP1, 서열번호 22)을 포함하는 다양한 상이한 재조합 단백질을 사용할 필요가 있다. 이러한 재조합 단백질은 모두 번역 후 변형(예를 들어, 글리코실화 또는 이황화 결합 등)이 많으므로, 포유 동물 세포 발현 시스템을 사용하면 재조합 단백질의 구조 및 기능을 유지하는 데 더 유리하다. 이 밖에, 정제의 편의를 위해, 비항체류 재조합 단백질은 C-말단에 His 태그(서열번호 23), 또는 마우스 항체 IgG2a의 Fc 단편(mFc, 서열번호 24)을 추가하거나, KIH(Knob-Into-Hole) 기술에 기반하여 헤테로다이머의 인간 IgG1 서브타입의 Fc 돌연변이체(FcK, 서열번호 25 또는 FcH, 서열번호 26)를 형성한다. 재조합 항체를 제조할 경우, 항체 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1 서브타입 (서열번호 27) 또는 선택된 인간 IgG1 서브타입의 다양한 돌연변이체일 수 있는데, 예를 들어, IgG1H(서열번호 28), IgG1K(서열번호 29), IgG1m3-H(서열번호 30) 또는 IgG1m3-K(서열번호 31)일 수 있고, 경쇄 불변 영역은 인간 κ 서브타입(서열번호 32) 또는 인간 λ 서브타입(서열번호 33)이다.
Uniprot 데이터베이스의 다양한 목적 재조합 단백질의 아미노산 서열에 따라, 상기 다양한 재조합 단백질의 유전자(His 태그, mFc 또는 Fc 코딩 유전자를 포함함)를 설계 및 합성하였다. 통상적인 분자 생물학 기술을 이용하여, 합성된 다양한 재조합 단백질 유전자를 적합한 진핵세포 발현 벡터(예를 들어, invitrogen사의 pcDNA3.1 등)에 클로닝한 다음, 리포솜(예를 들어, invitrogen사의 293fectin 등) 또는 다른 형질감염 시약(예를 들어, PEI 등)을 이용하여, 제조된 재조합 단백질 발현 플라스미드를 HEK293 세포(예를 들어, invitrogen사의 HEK293F)에 형질감염시키고, 무혈청 현탁액 배양 조건에서 3-5일 동안 배양하였다. 다음, 원심분리 등 방식을 통해 배양 상청액을 얻었다.His 태그의 융합으로 발현된 재조합 단백질은 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피 컬럼(예를 들어, GE사의 HisTrap FF 등)을 이용하여 배양 상청액에서 재조합 단백질을 1단계 정제하였다. mFc 융합으로 발현된 재조합 단백질 및 재조합 항체는 ProteinA/G 친화성 크로마토그래피 컬럼(예를 들어, GE사의 Mabselect SURE 등)으로 1단계 정제하였다. 다음, 탈염 컬럼(예를 들어, GE사의 Hitrap desaulting 등)을 이용하여 재조합 단백질 저장 완충액을 PBS(pH 7.0) 또는 다른 적합한 완충액으로 교체하였다. 필요한 경우, 항체 샘플을 여과 멸균한 다음 나누어 넣고 -20 ℃에서 보관하였다.
실시예 2: 경쇄 고정화를 기반으로 하는 CD123 마우스 면역 라이브러리의 구축
공통의 경쇄를 기반으로 하는 CD3EХCD123 이중 특이성 항체를 구축하기 위해, 특정 항-CD3E 단클론 항체 경쇄 가변 영역을 선택하여 CD123 항원 체내 친화성 성숙을 거친 마우스 중쇄 가변 영역과 매칭되도록 하고, 통상적인 분자 생물학적 수단을 이용하여 CD123에 대한 특이성 항체를 스크리닝하기 위한 단쇄 항체(scFv) 라이브러리를 구축하였다.
hCD123-SP1-His 및 mfCD123-SP1-His 재조합 단백질을 이용하여 6-8 주령의 BALB/c 마우스를 교차 면역화한 후, 비장 세포를 수집하였다. 마우스 림프구 분리액(Dakewe Biotech Co., Ltd., CAT#DKW33-R0100)을 이용하여 마우스 비장 림프구를 분리하고, 세포 총 RNA 추출 키트(Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd., CAT#DP430)를 이용하여, 분리된 림프구에 대해 총 RNA 추출을 수행한다. 추출된 총 RNA를 주형으로 사용하고, 첫 번째 사슬 cDNA 합성 키트(Thermo scientific, CAT#K1621)를 이용하여 항체의 중쇄 가변 영역을 합성하였다. 통상적인 분자 생물학적 수단을 이용하여, PCR 증폭을 통해 인간 및 필리핀 원숭이 CD3E를 특이적으로 인식하는 래트 단클론 항체 WM03-C6(특허 WO_2016_116626_A1에서 단클론 항체 20E5-F10의 서열을 참조, 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 서열번호 34로 표시되고, 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 서열번호 35로 표시됨) 경쇄 가변 영역, 및 CD123 재조합 항원으로 면역화하여 얻은 마우스 중쇄 가변 영역을 얻은 다음, 오버랩 확장 PCR 기술을 이용하여 단쇄 항체(scFv)를 구축하고, 제조된 마우스 단쇄 항체 유전자를 담체 pADSCFV-S(실험 기술 프로세스는 중국 특허 출원 제201510097117.0호의 실시예 1을 참조할 수 있음)에 클로닝하여 scFv 라이브러리를 구축하였다. 이 항체 라이브러리의 라이브러리 용량은 1.2Х10E8에 달하며, 정확도는 65 %이다.
실시예 3: 경쇄 고정화의 CD123 마우스 면역 라이브러리의 스크리닝
3.1 항-인간 CD123 마우스 단쇄 항체의 스크리닝
실시예 1에서 제조된 재조합 hCD123-SP1-his를 항원으로 사용하고, 고상 스크리닝 전략(실험 방안은 파지 디스플레이를 참조: 일반 실험 가이드/(미국)클락슨(Clackson,T.), (미국)로만(Lowman,H.B.) 편집; 마란(MaLan) 등 번역, 화학 공업 출판사, 2008.5)을 이용하여, 실시예 2에서 구축된 마우스 단쇄 항체를 디스플레이하는 파지 라이브러리를 스크리닝하며, 결합, 용출, 중화, 감염 및 증폭의 방식으로 총 3회의 스크리닝을 수행하여 최종적으로 인간 CD123에 특이적으로 결합하는 하나의 단쇄 항체 S8F3(서열번호 36)을 얻었다.
통상적인 분자 생물학적 수단을 이용하여, S8F3의 중쇄 가변 영역 S8F3VH(서열번호 37) 및 경쇄 가변 영역 WM03-C6VK(서열번호 35)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 인간 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 융합된 진핵세포 발현 벡터(예를 들어, invitrogen사의 pcDNA3.1 등)에 각각 클로닝하고, 전체 항체 S8F3VH+C6VK를 조합 발현하였다. 동시에, 미국 특허 US_2014_0178364_A1을 참조하여 항-CD123 항체 CSL362(중쇄 아미노산 서열은 서열번호 38로 표시되고, 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 39로 표시됨)를 제조하여 후속 연구를 위한 양성 대조 항체로 사용하였다.
3.2 재조합 항-CD123 단클론 항체의 친화력 분석
Biacore X100을 이용하여 표면 플라즈몬 공명 기술을 통해 항-CD123 항체의 친화력을 측정하였다. 아미노 커플링 키트(BR-1000-50), 인간 항체 포획 키트(BR-1008-39), CM5 칩(BR100012) 및 pH 7.4의 10Х HBS-EP(BR100669) 등 관련 시약 및 소모품은 모두 GE healthcare에서 구입되었다. 키트의 지침에 따라, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, EDC) 및 N-히드록시숙신이미드(N-Hydroxysuccinimide, NHS)를 사용하여 카르복실화 CM5 칩 표면을 활성화시키고, 항-인간 IgG(Fc) 항체(포획 항체)를 10 mM의 pH 5.0 아세트산나트륨으로 25 μg/mL로 희석한 다음, 10 μL/min의 유속으로 주사하여 약 10000개의 응답 단위(RU)의 커플링량을 구현하였다. 포획 항체를 주사한 후, 1 M의 에탄올아민을 주사하여 반응하지 않은 그룹을 차단하였다. 동역학 측정에 있어서, 항-CD123 항체(S8F3VH+C6VK 및 CSL362)를 0.5-1 μg/mL로 희석하고, 10 μL/min로 주사하여 약 100 RU의 항체가 항-인간 Fc 항체에 의해 포획되도록 보장하였다. 다음, hCD123-SP1-his를 일련의 농도 구배(예를 들어, 2.47 nM, 7.4 nM, 22.2 nM, 66.7 nM, 200 nM)로 설정하고, 25 ℃에서 30 μL/min로 낮은 농도에서 높은 농도로 주사하며, 결합 시간은 120 s이고, 해리 시간은 600 -2400 s이며, 10 μL/min로 3 M의 MgCl2 용액을 주사하여 칩 표면을 30 s 동안 재생시켰다. Biacore X100 평가 소프트웨어 2.0.1 버전을 사용하여 1:1 결합 모델을 통해 결합 및 해리 센서그램을 피팅하여 결합 속도(Kon) 및 해리 속도(Koff)를 계산하였다. 비율 Koff/Kon로 해리 평형 상수(KD)를 계산하였다. 피팅 결과는 표 1과 같다.
hCD123-SP1-his에 대한 재조합 항-CD123 단클론 항체의 결합 친화력 상수
Kon Koff KD
S8F3VH+C6VK 4.546E+5 3.651E-3 8.030E-9
CSL362 1.324E+5 7.931E-5 5.991E-10
3.3 세포 표면 CD123 항원에 대한 재조합 항-CD123 단클론 항체 결합의 동정
대수성장기의 KG-1a(인간 급성 골수성 백혈병 세포, 중국 의과학원 기초 의학 연구소 세포 자원 센터에서 구입됨)를 취하여 원심분리 후 1%의 BSA가 함유된 PBS 완충액에 2Х106개/mL로 재현탁하고, 100 μL/웰로 96웰 V형 바닥 플레이트에 분포하며, 원심분리 후 상청액을 제거하였다. PBS로 측정하고자 하는 샘플 S8F3VH+C6VK, 대조 샘플 CSL362 및 HigG 무관 항체(GenScript A01006, 인간 IgG 대조(전체 분자), Purifie)를 각각 5 μg/mL 및 0.5 μg/mL의 최종 농도로 조제하고, 세포가 함유된 웰에 첨가하며, 4 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 다음, 200 μL의 PBS로 3회 세척하고, 양-항-인간 IgG-FITC(Zhongshan Jinqiao, ZF-0308) 2차 항체(100 μL/웰)를 첨가하며, 4 ℃에서 암 조건 하에 30분 동안 배양하였다. 그 다음, 200 μL의 PBS로 3회 세척하고, 100 μL의 PBS로 재현탁한 후 유세포 분석기(ACEA, Novocyte)를 사용하여 FITC 채널을 검출하였다. 결과는 S8F3VH+C6VK가 CD123 양성 세포 KG-1a에 특이적으로 결합할 수 있음을 보여준다(도 1).
실시예 4: WM03-C6 단클론 항체의 인간화 및 활성 동정
4.1 WM03-C6 인간화 설계
래트 단클론 항체 WM03-C6에 대해 인간화 연구를 수행하여 그 면역원성을 감소시켰다. 인간화 방안은 고전적인 프레임워크 이식 전략을 사용하였다(J immunol.169,1119-1125,2002). WM03-C6의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 각각 IMGT 데이터베이스의 인간 항체 생식계열 유전자 서열과 비교하고, 적합한 생식계열 유전자 서열을 선택하여 항체의 프레임워크 영역 1 내지 3(FR1+FR2+FR3)을 제공하며, 적합한 J 영역 유전자 서열을 선택하여 프레임워크 영역 4(FR4)를 제공하였다. 이 주형은 항체의 상대적 전체 길이, CDR의 크기, 항체의 프레임워크 영역(FR)과 초가변 영역(CDR) 사이의 연결 부분에 위치한 아미노산 잔기, 서열의 전체적인 상동성 등과 같은 다양한 요인에 따라 선택될 수 있다. 선택된 주형은 가능한 한 부모 상보성 결정 영역(CDR)의 적합한 배열을 유지하기 위해 여러 서열의 혼합물 또는 공통 주형일 수 있다. 동시에, 항체의 초가변 영역(CDR)에서 탈아미노화 부위(NG)로 인해 발생할 수 있는 단백질 이질성을 피하기 위해 인간화된 항체의 경쇄 및 중쇄를 돌연변이로 설계하였다. 마지막으로 인간화 경쇄 돌연변이체 L27E5(서열번호 12) 및 인간화 중쇄 돌연변이체 H3B8(서열번호 11)을 얻었다.
4.2 WM03-C6 인간화 단클론 항체의 친화력 분석
실시예 3.2를 참조하여 항-인간 IgG(Fc) 항체를 CM5 칩 표면에 커플링하고, 항-CD3E 항체(WM03-C6 및 H3B8+L27E5)를 0.5 ~ 1 μg/mL로 희석하며, 10 μL/min로 주사하여 약 350-400 RU의 항체가 항-인간 Fc 항체에 의해 포획되도록 보장하였다. 다음, hCD3E-his를 일련의 농도 구배(예를 들어, 6.17 nM, 18.5 nM, 55.6 nM, 167 nM, 500 nM)로 설정하고, 25 ℃에서 30 μL/min로 낮은 농도에서 높은 농도로 주사하며, 결합 시간은 120 s이고, 해리 시간은 600-1800 s이며, 10 μL/min로 3 M의 MgCl2 용액을 주사하여 칩 표면을 30 s 동안 재생시켰다. Biacore X100 평가 소프트웨어 2.0.1 버전을 사용하여 1:1 결합 모델을 통해 결합 및 해리 센서그램을 피팅하여 결합 속도(Kon) 및 해리 속도(Koff)를 계산하였다. 비율 Koff/Kon로 해리 평형 상수(KD)를 계산하였다. 피팅 결과는 표 2와 같다.
hCD3E-his에 대한 WM03-C6 인간화 단클론 항체의 결합 친화력 상수
Kon Koff KD
WM03-C6 2.716E+4 2.879E-4 1.060E-8
H3B8+L27E5 2.084E+4 9.928E-4 4.763E-8
실시예 5: S8F3의 시험관내 친화성 성숙
표적 항원에 대한 이중 특이성 항체의 특이성을 향상시키고 투여 과정에서 이중 특이성 항체의 조직 분포 및 살상 효율을 향상시키기 위해, S8F3 중쇄 가변 영역에 대해 시험관내 친화성 성숙을 수행하였다. 통상적인 분자 생물학적 수단을 이용하여 S8F3중쇄 가변 영역의 CDR3에 돌연변이를 도입하여 S8F3VH를 기반으로 하는 CDR3 돌연변이 라이브러리를 구축하였다. 설계된 돌연변이 방안은 표 3과 같으며, 구축된 라이브러리 용량은 1.7Х10E8이고, 정확도는 86 %이다.
S8F3VH-CDR3 돌연변이 라이브러리의 설계 방안
초기 아미노산 설계 아미노산 동의 코돈
L L, F, V 또는 I NTC
R R, T, K, S 또는 N AVW
Y Y 또는 F TWC
G G, S, D, N, I 또는 V RDT
N N, D, T 또는 A RMC
Y Y 또는 F TWC
G G, V, A 또는 D GNT
D D, N, Y, S, T 또는 A DMC
A A, T, N, D, I 또는 V RHT
M M, V, T, A, K 또는 E RHG
D D, N, Y, S, T 또는 A DMC
D D, Y, F 또는 V KWT
이중 담체 파지 디스플레이 시스템(실험 기술 프로세스는 중국 특허 출원 제201510097117.0호의 실시예 5를 참조)을 기반으로 고상 스크리닝 방법을 통해, hCD123-SP1 항원을 이용하여, 구축된 S8F3VH-CDR3 돌연변이 라이브러리를 3회 스크리닝하고 농축하여 친화력이 향상된 중쇄 가변 영역 돌연변이체 H7A3을 최종적으로 얻었다. 획득된 H7A3 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 인간 중쇄 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 융합된 진핵세포 발현 벡터에 클로닝하고, L27E5 경쇄 발현 벡터와 결합하여 전체 항체를 조합 발현시켰다.
실시예 3.2를 참조하여 Biacore X100으로 S8F3 중쇄 돌연변이체 H7A3의 친화력을 측정하였고, 결과는 표 4와 같다.
hCD123-SP1-his에 대한 S8F3 중쇄 돌연변이체의 결합 친화력 상수
Kon Koff KD
S8F3VH+L27E5 4.384E+4 1.455E-4 3.319E-9
H7A3+L27E5 2.698E+5 6.638E-5 2.46E-10
실시예 6: H7A3의 인간화 및 이의 활성 동정
항-인간 CD123 마우스 단클론 항체 중쇄 H7A3의 인간화에는 고전적인 프레임워크 이식 전략이 사용되었다. 실시예 4를 참조하여 H7A3의 중쇄 가변 영역에 대해 CDR 이식을 수행하여 인간화 버전 H7A3VH-h2를 얻고, 동시에 항체의 배열 및 친화력을 보장하기 위해, 인간화 항체 프레임워크 영역의 일부 핵심 아미노산(예를 들어, I69, R71, T73, A75)을 역돌연변이시켜 인간화 버전 H7A3-h2-m5(서열번호 13)를 최종적으로 얻었다. 인간화 항체의 아미노산 서열에 따라 항체 가변 영역 유전자를 설계 및 합성하고, 진핵세포 발현 벡터에 클로닝하여 공통 경쇄 L27E5와 결합하여 인간 IgG1 버전 전체 항체를 발현하였다.
실시예 3.2를 참조하여 Biacore X100으로 H7A3 인간화 버전 H7A3-h2-m5의 친화력을 측정하였고, 결과는 표 5와 같다.
hCD123-SP1-his에 대한 H7A3 인간화 버전의 결합 친화력 상수
Kon Koff KD
H7A3+L27E5 3.054E+5 6.889E-5 2.256E-10
H7A3-h2-m5+L27E5 3.144E+5 7.671E-5 2.440E-10
대수성장기의 MV-4-11(인간 급성 단핵구 백혈병 세포, NANJING COBIOER BIOSCIENCES CO.,LTD에서 구입)를 취하여 원심분리 후 1%의 BSA가 함유된 PBS 완충액에 2Х106개/mL로 재현탁하고, 100 μL/웰로 96웰 V형 바닥 플레이트에 분포하며, 원심분리 후 상청액을 제거하였다. PBS로 측정하고자 하는 샘플 H7A3-h2-m5+L27E5, 대조 샘플 CSL362 및 HIgG 무관 항체(GenScript A01006, 인간 IgG 대조(전체 분자), Purifie)를 모두 100 nM의 최종 농도에서 시작하여 3배 구배 희석하여 총 9개의 농도로 조제하고, 세포가 함유된 웰에 첨가하며, 4 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 다음, 200 μL의 PBS로 3회 세척하고, 양-항-인간 IgG-FITC(Zhongshan Jinqiao, ZF-0308)를 100 μL/웰로 첨가하며, 4 ℃에서 암 조건 하에 30분 동안 배양하였다. 그 다음, 200 μL의 PBS로 3회 세척하고, 100 μL의 PBS로 재현탁한 후 유세포 분석기(ACEA, Novocyte)를 사용하여 FITC 채널을 검출하였다. 결과는 도 2에 도시된 바와 같고, H7A3-h2-m5+L27E5는 CD123 양성 세포 MV-4-11에 잘 결합할 수 있고, KD값은 3.1 nM이다.
실시예 7: 이중 특이성 항체의 제조
CD3E 단클론 항체의 중쇄 가변 영역 H3B8 및 CD123 단클론 항체의 중쇄 가변 영역 H7A3-h2-m5를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 적합한 진핵세포 발현 벡터에 각각 클로닝하여, 공통 경쇄를 기반으로 하는 헤테로다이머를 구축하였다. 즉, CD3E 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 Knob 돌연변이된 IgG1 불변 영역 IgG1m3-K를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 융합된 진핵세포 발현 벡터에 클로닝하고, CD123 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 Hole 돌연변이된 IgG1 불변 영역 IgG1m3-H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 포함된 진핵세포 발현 벡터에 클로닝하며, 공통 경쇄 L27E5의 가변 영역 VK를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 인간 경쇄 불변 영역 CK를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 융합된 진핵세포 발현 벡터에 클로닝하였다. 동시에, 후보 분자와 임상에서 연구 중인 CD3EХCD123 이중 특이성 항체의 생물학적 활성을 비교하기 위해, 특허 WO2017210443를 참조하여 동일한 Fc 구조를 기반으로 하는 Xmab14045(서열번호 40, 서열번호 41, 및 서열번호 42)를 구축하였다.
H3B8-IgG1m3-K를 발현하고, H7A3-h2-m5-IgG1m3-H를 발현하고 L27E5-CK를 발현하는 구축된 3개의 진핵세포 발현 벡터를 리포솜을 이용하여 HEK293F 세포에 공동 형질감염시키고, 무혈청 현탁액 배양 조건에서 3-5일 동안 배양한 다음, 원심분리 등 방식을 통해 배양 상청액을 얻었다. 배양 상청액 중 이중 특이성 항체는 ProteinA/G 친화성 크로마토그래피 컬럼(예를 들어, GE사의 Mabselect SURE 등)으로 정제한 다음, 탈염 컬럼(예를 들어, GE사의 Hitrap desaulting 등)을 이용하여 재조합 단백질 저장 완충액을 PBS(pH 7.0) 또는 다른 적합한 완충액으로 교체하였다. 탈염 후 단백질 용액을 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 Superdex200(GE)을 사용하여 정제하여 목적 단백질을 얻었다. 필요한 경우, 항체 샘플을 여과 멸균한 다음 나누어 넣고 -20 ℃에서 보관하여 비축하였다.
실시예 8: 이중 특이성 항체의 친화력 분석
실시예 3.2 및 실시예 4.2를 참조하여, Biacore X100을 이용하여 표면 플라즈몬 공명 기술을 통해 항-CD3E 단클론 항체 H3B8+L27E5, 항-CD123 단클론 항체 H7A3-h2-m5+L27E5, CD3ХCD123 이중 특이성 항체(CD3ХCD123 BsAb) 및 Xmab14045 대조 항체의 친화력을 측정하고, 친화력 피팅 결과는 표 6 및 표 7과 같다.
hCD123-SP1-his에 대한 CD3ХCD123 이중 특이성 항체의 결합 친화력 상수
Kon Koff KD
H7A3-h2-m5+L27E5 2.337E+5 5.137E-5 2.198E-10
CD3ХCD123 BsAb 2.254E+5 4.015E-5 1.781E-10
Xmab14045 9.671E+4 8.188E-5 8.467E-10
CD3E에 대한 CD3ХCD123 이중 특이성 항체의 결합 친화력 상수
hCD3E-his mfCD3E-his
Kon Koff KD Kon Koff KD
H3B8+L27E5 5.607E+4 7.108E-4 1.268E-8 1.233E+5 6.492E-4 5.263E-9
CD3ХCD123BsAb 5.646E+4 7.967E-4 1.411E-8 1.368E+5 1.571E-3 1.149E-8
Xmab14045 5.648E+5 3.674E-4 6.505E-10 8.633E+5 8.074E-4 9.352E-10
실시예 9: CD3E 및 CD123 이 2가지 항원을 동시에 인식하는 이중 특이성 항체의 능력 동정
통상적인 ELISA 방법을 이용하여 CD3E 및 CD123 이 2가지 항원에 대한 CD3ХCD123 이중 특이성 항체(CD3ХCD123 BsAb)의 동시 결합을 검출하였다. CD123-SP1-mFc 항원을 96웰 ELISA 플레이트(3 μg/mL, 100 μL/웰)에 4 ℃에서 밤새 코팅하였다. 차단액 PBS-0.1%Tween20-3% 우유를 이용하여 37 ℃에서 1시간 동안 차단한 후, 항-CD123 단클론 항체 H7A3-h2-m5+L27E5, 항-CD3E 단클론 항체 H3B8+L27E5 및 CD3ХCD123 이중 특이성 항체(10 μg/mL, 100 μL/웰)를 각각 첨가하고, 각각 2개의 중복 웰을 설정하며, 37 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. PBS-0.1%Tween20으로 ELISA 플레이트를 세척한 다음, CD3E-his 항원(1 μg/mL, 100 μL/웰)을 첨가하고, 37 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. PBS-0.1%Tween20으로 ELISA 플레이트를 세척한 다음, HRP 마우스 항-his IgG(Beijing ComWin Biotech Co.,Ltd., cw0285M)를 첨가하고, 37 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. PBS-0.1%Tween20으로 ELISA 플레이트를 세척하고, OPD 기질 발색액을 첨가하며, 5-10분 후 1 M의 H2SO4를 사용하여 발색을 멈추고, 마이크로플레이트 리더로 492nm/630nm 이중 파장에서 광학 밀도 값을 측정하였다. ELISA 분석 결과는 도 3에 도시된 바와 같고, CD3ХCD123 이중 특이성 항체는 CD3E 및 CD123 이 2가지 항원을 동시에 인식할 수 있다.
실시예 10: 세포 표면 CD3E 및 CD123에 대한 이중 특이성 항체의 인식 능력 동정
10.1 세포 표면 CD3E에 대한 이중 특이성 항체의 인식 능력 동정
대수성장기의 Jurkat-Dual 세포(Invivogen, jktd-isnf에서 구입)를 취하여 원심분리 후 1%의 BSA가 함유된 PBS 완충액에 2Х106개/mL로 재현탁하고, 100 μL/웰로 96웰 V형 바닥 플레이트에 분포하며, 원심분리 후 상청액을 제거하였다. PBS로 샘플, 이중 특이성 항체 대조 샘플 Xmab14045, 항-CD3E 단클론 항체 H3B8+L27E5, HIgG 무관 항체(GenScript A01006, 인간 IgG 대조(전체 분자, Purifie) 및 CD3ХCD123 이중 특이성 항체(CD3ХCD123 BsAb)를 모두 400 nM을 시작 농도로 하고, 처음 3개의 포인트를 2배로 희석하며, 마지막 5개의 농도 포인트를 3배로 희석하되, 총 8개의 농도로 희석하고, 세포가 함유된 웰에 첨가하며, 4 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 다음, 200 μL의 PBS로 3회 세척하고, 양-항-인간 IgG-FITC(Zhongshan Jinqiao, ZF-0308)를 100 μL/웰로 첨가하며, 4 ℃에서 암 조건 하에 30분 동안 배양하였다. 그 다음, 200 μL의 PBS로 3회 세척하고, 100 μL의 PBS로 재현탁한 후 유세포 분석기(ACEA, Novocyte)를 사용하여 FITC 채널을 검출하였다. 결과는 CD3ХCD123 이중 특이성 항체가 Jurkat-Dual 세포 표면의 CD3E에 결합할 수 있고 결합 강도가 대조 샘플 Xmab14045보다 약하며 실시예 9의 친화력 측정 결과와 일치함을 보여준다(도 4).
10.2 세포 표면 CD123에 대한 이중 특이성 항체의 인식 능력 동정
대수성장기의 MV-4-11 세포를 취하여 원심분리 후 1%의 BSA가 함유된 PBS 완충액에 2Х106개/mL로 재현탁하고, 100 μL/웰로 96웰 V형 바닥 플레이트에 분포하며, 원심분리 후 상청액을 제거하였다. PBS로 샘플, 이중 특이성 항체 대조 샘플 Xmab14045, 항-CD123 단클론 항체 H7A3-h2-m5+L27E5, CD3ХCD123 이중 특이성 항체(CD3ХCD123 BsAb) 및 HIgG 무관 항체(GenScript A01006, 인간 IgG 대조(전체 분자, Purifie)를 모두 100 nM의 최종 농도에서 시작하여 3배 구배 희석하여 총 9개의 농도로 희석하고, 세포가 함유된 96웰 플레이트에 첨가하며, 4 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 다음, 200 μL의 PBS로 3회 세척하고, 양-항-인간 IgG-FITC(Zhongshan Jinqiao, ZF-0308)를 100 μL/웰로 첨가하며, 4 ℃에서 암 조건 하에 30분 동안 배양하였다. 그 다음, 200 μL의 PBS로 3회 세척하고, 100 μL의 PBS로 재현탁한 후 유세포 분석기(ACEA, Novocyte)를 사용하여 FITC 채널을 검출하였다. 결과는 CD3ХCD123 이중 특이성 항체가 CD123 양성 세포 MV-4-11 표면의 CD123에 잘 결합할 수 있고 KD값이 7.08 nM로 Xmab14045(KD=6.07nM)에 상당한 것을 보여준다(도 5).
실시예 11: Jurkat-Dual 세포 특이성 활성화에 대한 이중 특이성 항체의 매개
대수성장기의 MV-4-11 세포(CD123+ 세포)를 수집하여 원심분리 후 1640 배지에 2Х106개/mL로 재현탁하고, 50 μL/웰로 세포 플레이트에 분포하며, 원심분리 후 상청액을 제거하였다. 대수성장기의 Jurkat-Dual 세포(Invivogen에서 구입)를 수집하여 1640 배지에 2Х106개/mL로 재현탁하고, 50 μL/웰로 세포 플레이트에 첨가하여 1:1의 최종 E:T 비율을 얻었다. 다음, 시작 농도가 6 nM이고 4배 구배 희석한 8개의 농도 포인트의 CD3ХCD123 이중 특이성 항체(CD3ХCD123 BsAb, 50 μL/웰)를 첨가하였다. 시스템 대조에는 이중 특이성 항체 대조 샘플 Xmab14045, 항-CD3E 단클론 항체 H3B8+L27E5, 항-CD123 단클론 항체 H7A3-h2-m5+L27E5, H3B8+L27E5 및 H7A3-h2-m5+L27E5의 병용군(H3B8+L27E5&H7A3-h2-m5+L27E5) 및 CD123 음성 표적 세포(BAF3 세포) 대조군 및 HIgG 무관 항체(GenScript A01006, 인간 IgG 대조(전체 분자), Purifie)가 설정되어 있고, 사용 농도는 모두 CD3ХCD123 이중 특이성 항체의 농도와 같다. 20시간 동안 배양한 후, 상청액을 취하고, QUANTI-Luc?? 지침(QUANTI-Luc, Invivogen, rep-qlc2)을 참조하여 상이한 조건 하에서 Jurkat-Dual 세포의 특이적 활성화에 대한 종양 세포의 매개를 검출 및 분석하였다(도 6의 A부분 및 B부분).
실시예 12: 정제된 T 세포 표면 활성화 분자의 발현 및 CD123 양성 종양 세포의 살상에 대한 CD3ХCD123 이중 특이성 항체의 매개
12.1 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 분리
혈액은 정상 지원자(각 50 mL)로부터 수집되었으며 모든 지원자는 사전 동의서에 서명하였다.
지원자 선발 기준은 다음과 같다.
1. 18세 이상;
2. HIV, HBV 감염 없음;
3. 혈액 정기 검사 정상;
4. 임신 또는 모유 수유 중인 여성이 아님;
Ficoll 밀도 구배 원심분리법에 의해 지원자 전혈 세포로부터 PBMC를 분리하여 1640 배지에서 배양하였다.
12.2 정제된 T 세포에 의한 CD123 양성 종양 세포의 살상에 대한 이중 특이성 항체의 매개 검출
대수성장기의 MV-4-11 세포(CD123+ 세포)를 수집하여 원심분리 후 1640 배지에 1Х106개/mL로 재현탁하고, 50 μL/웰로 세포 플레이트에 분포하였다. 다음, 시작 농도가 1 nM이고 4배 구배 희석한 8개의 농도 포인트의 CD3ХCD123 이중 특이성 항체(CD3ХCD123 BsAb, 50 μL/웰)를 첨가하였다. T 세포 음성 분류 키트 지침(BD IMaq human T lymphocyte enrichment set-DM, BD, 557874)을 참조하여 PBMC에서 정제된 T 세포(5Х106몸/mL, 50 μL/웰)를 분류하여 얻고, 최종 효과 대 목표 비율은 5:1이다. 동시에 단독 표적 세포 대조(MV-4-11 세포), 단독 효과기 세포 대조(T), 및 단독 배지 블랭크 대조를 설정하고, 배지를 사용하여 150 μL의 부피까지 보충하였다. 20시간 동안 배양한 후, 상청액을 취하고, cytoTox96® 비방사성 세포 독성 검출 시약의 지침(cytoTox96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay, promega, G1780)을 참조하여 CD3ХCD123 이중 특이성 항체에 의해 매개되는 종양 세포에 대한 T 세포의 살상률을 검출 및 분석하였다. 결과는 CD3ХCD123 이중 특이성 항체가 CD123 양성 종양 세포에 대한 T 세포의 살상을 특이적으로 매개할 수 있고 CD123 음성 종양 세포(BAF3 세포)에 대해서는 살상 효과를 나타내지 않음을 보여준다(도 7).
12.3 T 세포가 이중 특이성 항체에 의해 특이적으로 활성화된 후 표면 활성화 분자 발현의 동정
12.2 실험에 있어서, 상청액 세포를 꺼내 PBS로 2회 세척하고, 항-인간 CD3-APC(ebioscience, 17-0037-42) 및 항-인간 CD69-PE(ebioscience, 11-0069-42) 플로우 항체(flow antibody)를 첨가하여 4 ℃에서 암 조건 하에 30분 동안 배양한 다음, PBS로 2회 세척하고, 100 μL의 PBS로 재현탁한 후 유세포 분석기(ACEA, Novocyte)로 검출하고, CD3ХCD123 이중 특이성 항체(CD3ХCD123 BsAb)로 처리된 CD3 양성 세포 집단(MV-4-11 세포) 중 활성화 마커 CD69의 발현 차이를 비교하였다. 결과는 양성 종양 세포의 존재 하에 CD3ХCD123 이중 특이성 항체가 T 세포 표면 CD69의 발현을 특이적으로 상향 조절할 수 있고 CD123 음성 종양 세포(BAF3 세포)가 T 세포 표면 CD69의 발현을 상향 조절할 수 없음을 보여준다(도 8).
실시예 13: 이중 특이성 항체에 의해 매개되는 T 세포 시험관내 증식 실험
13.1 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 분리
실시예 12.1을 참조하여 PBMC를 분류하여 얻었다.
13.2 이중 특이성 항체에 의해 매개되는 T 세포 시험관내 증식 실험
T 세포 음성 분리 키트 지침(BD IMaq human T lymphocyte enrichment set-DM, BD, 557874)을 참조하여 PBMC에서 정제된 T 세포를 분류하여 얻었다. CFSE 염색 지침을 참조하여 정제된 T 세포를 염색하고(CFSE, eBioscience, 65-0850-84), 1640 배지에 2Х106개/mL로 재현탁하며, 50 μL/웰로 세포 배양 플레이트에 첨가하였다. 대수성장기의 MV-4-11 세포(CD123+ 세포)를 수집하여 원심분리 후 1640 배지에 5Х105개/mL로 재현탁하고, 50 μL/웰로 세포 플레이트에 분포하며, 최종 효과 대 목표 비율은 4:1이다. 다음, 시작 농도가 0.25 nM이고 4배 구배 희석한 8개의 농도 포인트의 CD3ХCD123 이중 특이성 항체(CD3ХCD123 BsAb, 50 μL/웰) 및 Xmab14045를 첨가하였다. 또한 각각 단독 항-CD3E 단클론 항체 H3B8+L27E5, 단독 항-CD123 단클론 항체 H7A3-h2-m5+L27E5 및 H3B8+L27E5 및 H7A3-h2-m5+L27E5의 병용(H3B8+L27E5&H7A3-h2-m5+L27E5)인 0.25 nM의 농도 포인트의 대조를 설정하였다. 이 밖에, CD123 음성 종양 세포(BAF3 세포)의 존재 하에서 CD3ХCD123 이중 특이성 항체의 0.25 nM의 농도 포인트의 대조를 설정하였다. 5일 동안 배양한 후, PBS로 2회 세척하고, 항-인간 CD3-APC(ebioscience, 17-0037-42) 플로우 항체로 4 ℃에서 암 조건 하에 30분 동안 배양한 다음, PBS로 2회 세척하고, 100 μL의 PBS로 재현탁한 후 유세포 분석기(ACEA, Novocyte)로 T 세포 증식 상황을 검출하였다(도 9의 A부분 및 B부분).
실시예 14: CD34 + 마우스 모델에서 이중 특이성 항체의 활성 동정
42마리(32마리를 그룹화하고, 10마리를 비축함)의 20-24 주령의 암컷 hCD34+ 인간화 마우스(Peng Li Biomedical Technology(Shanghai) Co., Ltd.에서 구입)를 선택하고, 100 μL의 1Х107개의 MV-4-11 세포를 100 μL의 Matrigel과 균일하게 혼합한 후, 마우스의 오른쪽 등에 피하 주사하고, 접종 전에 마우스를 3-4 % 이소플루란으로 마취시켰다. 종양이 평균 약 50-80 mm3로 성장했을 때, 32마리의 종양 보유 마우스를 말초 혈액 중 hCD45+의 비율 및 종양 부피에 따라 군당 8마리씩 4개 군으로 무작위로 나누었다. 그룹화하여 투여한 당일을 0일째로 정의하였다. 실험은 CD3ХCD123 이중 특이성 항체 0.01 mg/kg군, 0.1 mg/kg군, 0.5 mg/kg군 및 음성 대조군(IgG1m3, 0.5 mg/kg)의 4개 군으로 나누어 각 군에 8마리씩 하여, 0일째, 3일째, 7일째, 14일째 및 21일째에 꼬리 정맥 주사에 의해 투여하되, 총 5회 투여하였다. 상대적 종양 억제율(TGI)에 따라 치료 효과를 평가하고, 동물의 체중 변화 및 폐사 상황에 따라 안전성을 평가하였다.
실험 과정에서 동물의 정신 상태는 대체로 양호하였고, 체내 실험 종료 시(24일째), 음성 대조군(IgG1m3 i.v. 0.5 mg/kg 용량군, G1군)에 비해, 투여군 동물은 대조군에 비해 체중에는 유의한 차이가 없었다(P>0.05). CD3ХCD123 이중 특이성 항체는 0.5 mg/kg 용량에서(G2군), 종양 성장을 유의하게 억제하는 작용을 하고, 상대적 종양 억제율 TGI(%)는 97.35%이였다. 또한 6마리 동물의 종양은 거의 완전히 사라졌으므로, 같은 시간 동안 음성 대조군(G1군)에 비해 극히 유의한 차이를 보였다(p<0.001). CD3ХCD123 이중 특이성 항체 0.1 mg/kg 용량군(G3군)의 동물에 투여한 후 종양 부피의 성장이 느려졌고, 상대적 종양 억제율 TGI(%)은 52.08%이므로, 같은 시간 동안 음성 대조군(G1군)에 비해 유의한 차이를 보였고(p<0.05), G4는 CD3ХCD123 이중 특이성 항체 0.01 mg/kg 용량군이다. CD3ХCD123 이중 특이성 항체와 종양 성장은 현저한 용량-효과 관계를 가지고 있으며, 각 군의 동물의 각 시간대 종양 성장 상황은 도 10에 도시된 바와 같다. 여기서, G1군과 비교할 때 일원 분산 분석/Dunnett t 검정 통계를 사용할 경우, *는 P<0.05를 나타내고, **는 P<0.01을 나타내며, ***는 P<0.001을 나타낸다. 반복 측정/Bonferroni 보정 통계를 사용할 경우, ###는 P<0.001을 나타낸다.
비록 위에서 일반적인 설명 및 구체적인 구현 방식으로 본 출원을 상세하게 설명하였지만, 본 출원을 바탕으로 이에 대해 일부 수정 또는 개선을 진행할 수 있고, 이는 당업자에게 있어서 자명한 것이다. 따라서, 본 출원의 사상을 벗어나지 않고 진행한 모든 이러한 수정 또는 개선은 모두 본 출원의 보호범위에 속한다.

Claims (13)

  1. 인간 CD3E에 대한 항원 결합부를 포함하는 이중 특이성 항체로서,
    상기 인간 CD3E에 대한 항원 결합부는,
    서열번호 1로 표시되는 HCDR1,
    서열번호 2로 표시되는 HCDR2,
    서열번호 3으로 표시되는 HCDR3,
    서열번호 4로 표시되는 LCDR1,
    서열번호 5로 표시되는 LCDR2, 및
    서열번호 6으로 표시되는 LCDR3을 포함하고;
    HCDR 및 LCDR은 Kabat에 따라 정의되는, 이중 특이성 항체.
  2. 인간 CD123에 대한 항원 결합부를 포함하는 이중 특이성 항체로서,
    상기 인간 CD123에 대한 항원 결합부는,
    서열번호 7로 표시되는 HCDR1,
    서열번호 8로 표시되는 HCDR2,
    서열번호 9로 표시되는 HCDR3,
    서열번호 4로 표시되는 LCDR1,
    서열번호 5로 표시되는 LCDR2, 및
    서열번호 6으로 표시되는 LCDR3을 포함하고;
    HCDR 및 LCDR은 Kabat에 따라 정의되는, 이중 특이성 항체.
  3. 인간 CD3E에 대한 항원 결합부 및 인간 CD123에 대한 항원 결합부를 포함하는 이중 특이성 항체로서,
    바람직하게는, 상기 인간 CD3E에 대한 항원 결합부는,
    서열번호 1로 표시되는 HCDR1,
    서열번호 2로 표시되는 HCDR2,
    서열번호 3으로 표시되는 HCDR3,
    서열번호 4로 표시되는 LCDR1,
    서열번호 5로 표시되는 LCDR2, 및
    서열번호 6으로 표시되는 LCDR3을 포함하고/하거나;
    상기 인간 CD123에 대한 항원 결합부는,
    서열번호 7로 표시되는 HCDR1,
    서열번호 8로 표시되는 HCDR2,
    서열번호 9로 표시되는 HCDR3,
    서열번호 4로 표시되는 LCDR1,
    서열번호 5로 표시되는 LCDR2, 및
    서열번호 6으로 표시되는 LCDR3을 포함하고;
    HCDR 및 LCDR은 Kabat에 따라 정의되는, 이중 특이성 항체.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 인간 CD3E에 대한 항원 결합부 및 상기 인간 CD123에 대한 항원 결합부는 동일한 경쇄 가변 영역을 포함하고, 바람직하게는, 동일한 경쇄를 포함하고/하거나;
    상기 이중 특이성 항체는 동일한 힌지 영역을 갖는 2개의 중쇄 불변 영역을 포함하는 IgG1 항체이고, 상기 힌지 영역의 아미노산 서열은 서열번호 10으로 표시되는, 이중 특이성 항체.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 이중 특이성 항체는 제1 중쇄 불변 영역 및 제2 중쇄 불변 영역을 포함하는 IgG1 항체이고,
    상기 제1 중쇄 불변 영역의 354번째 및 366번째 아미노산은 각각 C 및 W이며, 상기 제2 중쇄 불변 영역의 349번째, 366번째, 368번째 및 407번째 아미노산은 각각 C, S, A 및 V이고/이거나;
    상기 제1 중쇄 불변 영역 및 제2 중쇄 불변 영역의 234번째, 235번째 및 331번째 아미노산은 각각 F, E 및 S이고;
    항체 불변 영역의 아미노산 위치는 EU 넘버링(EU numbering)에 따라 확정되는, 이중 특이성 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인간 CD3E에 대한 항원 결합부는 서열번호 11로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 12로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함하고/하거나;
    상기 인간 CD123에 대한 항원 결합부는 서열번호 13으로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 12로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 이중 특이성 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인간 CD3E에 대한 항원 결합부 및/또는 상기 인간 CD123에 대한 항원 결합부는 단쇄 항체(scfv) 또는 Fab 단편을 포함하고;
    바람직하게는, 상기 인간 CD3E에 대한 항원 결합부는 Fab 단편을 포함하고, 상기 인간 CD123에 대한 항원 결합부는 Fab 단편을 포함하거나;
    상기 인간 CD3E에 대한 항원 결합부는 Fab 단편을 포함하고, 상기 인간 CD123에 대한 항원 결합부는 단쇄 항체(scfv)를 포함하거나;
    상기 인간 CD3E에 대한 항원 결합부는 단쇄 항체(scfv)를 포함하고, 상기 인간 CD123에 대한 항원 결합부는 Fab 단편을 포함하거나;
    상기 인간 CD3E에 대한 항원 결합부는 단쇄 항체(scfv)를 포함하고, 상기 인간 CD123에 대한 항원 결합부는 단쇄 항체(scfv)를 포함하는, 이중 특이성 항체.
  8. 제3항에 있어서,
    상기 항체는 제1 암 및 제2 암을 갖고, 상기 제1 암은 인간 CD3E에 대한 항원 결합부를 포함하며, 상기 제2 암은 인간 CD123에 대한 항원 결합부를 포함하고,
    상기 제1 암은 서열번호 11로 표시되는 중쇄 가변 영역 아미노산 서열, 서열번호 31로 표시되는 중쇄 불변 영역 아미노산 서열, 서열번호 12로 표시되는 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 32로 표시되는 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함하며;
    상기 제2 암은 서열번호 13으로 표시되는 중쇄 가변 영역 아미노산 서열, 서열번호 30으로 표시되는 중쇄 불변 영역 아미노산 서열, 서열번호 12로 표시되는 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 32로 표시되는 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함하는, 이중 특이성 항체.
  9. 이중 특이성 항체에 있어서,
    인간 CD3E에 대한 항원 결합부 및 인간 CD123에 대한 항원 결합부를 포함하고;
    상기 이중 특이성 항체는 동일한 힌지 영역을 갖는 2개의 중쇄 불변 영역을 포함하는 IgG1 항체이고, 상기 힌지 영역의 아미노산 서열은 서열번호 10으로 표시되는, 이중 특이성 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 이중 특이성 항체를 포함하는 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    CD123 양성 종양, 바람직하게는, 급성 골수성 백혈병(AML) 및 모구 형질세포양 수지상세포 종양(BPDCN)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 CD123 양성 종양을 예방 또는 치료하기 위해 사용되는 약학 조성물.
  12. CD123 양성 종양, 바람직하게는, 급성 골수성 백혈병(AML) 및 모구 형질세포양 수지상세포 종양(BPDCN)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 CD123 양성 종양을 예방 또는 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 이중 특이성 항체, 또는 제10항 또는 제11항에 따른 약학 조성물의 용도.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 이중 특이성 항체, 또는 제10항 또는 제11항에 따른 약학 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, CD123 양성 종양, 바람직하게는, 급성 골수성 백혈병(AML) 및 모구 형질세포양 수지상세포 종양(BPDCN)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 CD123 양성 종양을 예방 또는 치료하는 방법.
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