CN114874330B - 靶向单链抗体的中和性单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种靶向单链抗体的中和性单克隆抗体，具体涉及一种分离的抗原结合蛋白，所述抗原包含靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体。本申请还提供了所述抗原结合蛋白在检测嵌合抗原受体中的应用。

Description

靶向单链抗体的中和性单克隆抗体
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种靶向单链抗体的中和性单克隆抗体。
背景技术
嵌合抗原T细胞(CAR-T)疗法是一种通过基因改造技术使T细胞表面表达特定抗原的单链抗体(scFv)，从而可以重定向至靶细胞并发挥杀伤效果的新型免疫疗法。CAR-T细胞是一种细胞药物，要长久发挥药效需要持续存在于体内，因而，对回输后体内CAR-T细胞的准确检测是监测药物动力学和预后预测等的基础。常用的检测患者体内是否存在CAR-T细胞以及其水平的方式是流式细胞术，即用带有荧光的可以与CAR-T细胞特异性结合的蛋白先与外周血中单个核细胞孵育，经过洗脱以后，只有CAR-T细胞会被标记上相应荧光，从而可以被流式细胞仪所识别。对于CT103A这一细胞产品来说，目前检测其在病人外周血水平的流式蛋白为BCMA蛋白，这种方法存在至少两个问题：其一，与CT103A CAR-T结合的亲和力不是特别高，易有假阴性结果；其二，可能在CAR-T以外的细胞存在BCMA受体，从而出现假阳性结果。因此，本领域急需一种CT103A scFv特异性抗体用于CT103A CAR-T的结合和/或检测分析。
发明内容
本申请制备出一批的可以结合CT103A scFv抗体，经过后续的检验验证，最后获得特异性高亲和力抗CT103A scFv抗体，且可以为中和性抗体。
一方面，本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白，所述抗原包含重链互补决定区1(HCDR1)，重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，所述抗原的所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：78所示，所述抗原的所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：77所示，且所述抗原的所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：76所示。
在一些实施方式中，所述抗原包含轻链互补决定区1(LCDR1)，轻链互补决定区2(LCDR2)和轻链互补决定区3(LCDR3)，所述抗原的所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：81所示，所述抗原的所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：80所示，且所述抗原的所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：79所示。
在一些实施方式中，所述抗原包含重链可变区，所述抗原的所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：82所示。
在一些实施方式中，所述抗原包含轻链可变区，所述抗原的所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：83所示。
在一些实施方式中，所述抗原包含单链抗体。
一方面，本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含重链可变区(VH)，所述抗原结合蛋白的所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述抗原结合蛋白的所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：1或41所示。
在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2或42所示。
在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3或43所示。
在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：1或41所示，所述抗原结合蛋白的所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2或42所示，且所述抗原结合蛋白的所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3或43所示。
在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：15或54所示。
在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白包含轻链可变区(VL)，所述抗原结合蛋白的所述轻链可变区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述抗原结合蛋白的所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：4或44所示。
在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5或45所示。
在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：6或46所示。
在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：4或44所示，所述抗原结合蛋白的所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5或45所示，且所述抗原结合蛋白的所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：6或46所示。
在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：16或55所示。
在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述重链可变区包含重链框架区1(HFR1)、重链框架区2(HFR2)、重链框架区3(HFR3)和重链框架区4(HFR4)，所述抗原结合蛋白的所述HFR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：7或47所示。
在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述HFR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：8或48所示。
在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述HFR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：9或49所示。
在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述HFR4的氨基酸序列如SEQ ID NO：10或50所示。
在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述轻链可变区包含轻链框架区1(LFR1)、轻链框架区2(LFR2)、轻链框架区3(LFR3)和轻链框架区4(LFR4)，所述抗原结合蛋白的所述LFR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：11或51所示。
在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述LFR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：12或52所示。
在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述LFR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：13或53所示。
在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述LFR4的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。
在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白包含抗体重链恒定区。
在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述抗体重链恒定区包含源自人抗体的重链恒定区。
在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述抗体重链恒定区包含源自IgG的重链恒定区。
在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白包含抗体轻链恒定区。
在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述抗体轻链恒定区包含源自人抗体的轻链恒定区。
在一些实施方式中，其包含抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方式中，其中所述抗体包含单克隆抗体。
在一些实施方式中，其中所述抗体选自以下组中的一种或多种：兔源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
在一些实施方式中，其中所述抗原结合片段选自以下组中的一种或多种：Fab，Fab′，Fv片段，F(ab')2，F(ab)2，scFv，di-scFv，VHH和dAb。
另一方面，本申请提供了一种多肽，其包含本申请所述的抗原结合蛋白。
在一些实施方式中，其包含融合蛋白。
另一方面，本申请提供了一种核酸分子，其编码本申请所述的抗原结合蛋白和/或本申请所述的多肽。
另一方面，本申请提供了一种载体，其包含本申请所述的核酸分子。
另一方面，本申请提供了一种免疫缀合物，其包含本申请所述的抗原结合蛋白和/或本申请所述的多肽。
另一方面，本申请提供了一种细胞，其包含和/或表达本申请所述的抗原结合蛋白、包含和/或表达本申请所述的多肽、包含本申请所述的核酸分子、包含本申请所述的载体和/或包含本申请所述的免疫缀合物。
另一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含本申请所述的抗原结合蛋白、本申请所述的多肽、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体、本申请所述的免疫缀合物和/或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
另一方面，本申请提供了一种试剂盒，其包含本申请所述的抗原结合蛋白、本申请所述的多肽、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体、本申请所述的免疫缀合物、本申请所述的细胞和/或本申请所述的药物组合物。
在一些实施方式中，其用于检测样品中嵌合抗原受体的存在和/或含量。
在一些实施方式中，其用于检测样品中包含嵌合抗原受体的细胞的存在和/或含量。
另一方面，本申请提供了一种制备本申请所述的抗原结合蛋白和/或本申请所述的多肽的方法，包含在使得所述抗原结合蛋白和/或所述多肽表达的条件下，培养本申请所述的细胞。
另一方面，本申请提供了本申请所述的抗原结合蛋白、本申请所述的多肽、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体、本申请所述的免疫缀合物、本申请所述的细胞和/或本申请所述的药物组合物在制备试剂盒中的用途。
在一些实施方式中，其中所述试剂盒用于检测样品中嵌合抗原受体的存在和/或含量。
另一方面，本申请提供了一种检测样品中嵌合抗原受体存在和/或含量的方法，包含施用本申请所述的抗原结合蛋白、施用本申请所述的多肽、施用本申请所述的核酸分子、施用本申请所述的载体、施用本申请所述的免疫缀合物、施用本申请所述的细胞、施用本申请所述的药物组合物和/或使用本申请所述的试剂盒。
另一方面，本申请提供了一种影响嵌合抗原受体与其特异性抗原结合的方法，包含施用本申请所述的抗原结合蛋白、施用本申请所述的多肽、施用本申请所述的核酸分子、施用本申请所述的载体、施用本申请所述的免疫缀合物、施用本申请所述的细胞、施用本申请所述的药物组合物和/或使用本申请所述的试剂盒。
另一方面，本申请提供了一种与嵌合抗原受体的特异性抗原竞争结合所述嵌合抗原受体的方法，包含施用本申请所述的抗原结合蛋白、施用本申请所述的多肽、施用本申请所述的核酸分子、施用本申请所述的载体、施用本申请所述的免疫缀合物、施用本申请所述的细胞、施用本申请所述的药物组合物和/或使用本申请所述的试剂盒。
另一方面，本申请提供了一种影响嵌合抗原受体的数量和/或功能方法，包含施用本申请所述的抗原结合蛋白、施用本申请所述的多肽、施用本申请所述的核酸分子、施用本申请所述的载体、施用本申请所述的免疫缀合物、施用本申请所述的细胞、施用本申请所述的药物组合物和/或使用本申请所述的试剂盒。
在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体的功能包含所述嵌合抗原受体与其特异性抗原结合的能力。
另一方面，本申请提供了一种影响包含嵌合抗原受体的细胞的数量和/或功能方法，包含施用本申请所述的抗原结合蛋白、施用本申请所述的多肽、施用本申请所述的核酸分子、施用本申请所述的载体、施用本申请所述的免疫缀合物、施用本申请所述的细胞、施用本申请所述的药物组合物和/或使用本申请所述的试剂盒。
在一些实施方式中，所述包含嵌合抗原受体的细胞包含免疫效应细胞。
在一些实施方式中，所述免疫效应细胞包含T淋巴细胞和/或自然杀伤(NK)细胞。
在一些实施方式中，所述包含嵌合抗原受体的细胞的功能包括所述包含嵌合抗原受体的细胞与所述嵌合抗原受体的特异性抗原结合的能力。
在一些实施方式中，所述包含嵌合抗原受体的细胞的功能包括杀伤包含所述特异性抗原的细胞的能力。
在一些实施方式中，所述包含嵌合抗原受体的细胞的功能包括抑制肿瘤体积的能力，所述肿瘤包含所述特异性抗原。
在一些实施方式中，所述特异性抗原包含B细胞成熟抗原(BCMA)或其功能活性片段。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1A-1C显示的是，检测本申请抗原结合蛋白与细胞的流式分析结果。
图2A-2B显示的是，检测本申请抗原结合蛋白与不同CAR+比例的细胞的流式分析结果。
图3显示的是，12F1、6G8与BCMA竞争结合scFv的能力。
图4A-4D显示的是，12F1和6G8的抗原结合蛋白对CT103A细胞的杀伤功能的阻断作用的结果图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“抗原”通常是指含能引起免疫学应答的一个或多个表位(线性的、成构象的或兼有)的分子。此外，术语“抗原”还可表示亚基抗原，即与该抗原天然关联的全生物体或细胞，以及杀死、减毒或灭活的细菌、病毒、真菌、寄生物或其他微生物或肿瘤细胞分离且离散的抗原。抗体如抗独特型抗体，或其片段以及能模拟抗原或抗原决定簇的合成肽模拟表位也涵盖在本文所用的抗原定义下。例如，本申请的抗原可以是指CT103A scFv蛋白，所述CT103A scFv蛋白的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：84所示。例如，本申请的抗原可以是指包含CT103A scFv的重链可变区和轻链可变区的蛋白；例如，本申请的抗原可以是指包含CT103A scFv的重链互补决定区1(HCDR1)，重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)以及轻链互补决定区1(LCDR1)，轻链互补决定区2(LCDR2)和轻链互补决定区3(LCDR3)的蛋白。
在本申请中，术语“分离的”通常是指从天然状态下经人工手段获得的。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽可以称之为分离的。术语“分离的”可以不排除混有人工或合成的物质，也可以不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
在本申请中，术语“分离的抗原结合蛋白”通常是指脱离了其天然存在状态的具有抗原结合能力的蛋白。本申请“分离的抗原结合蛋白”可以包含结合抗原的部分和任选地，允许抗原结合部分采用促进所述抗原结合部分结合抗原的构象的框架或构架部分。抗原结合蛋白可以包含例如抗体来源的蛋白框架区(FR)或具有移植的CDR或CDR衍生物的备选蛋白框架区或人工框架区。此类框架可以包括，但不限于包含被引入例如以稳定抗原结合蛋白的三维结构的突变的抗体来源的框架区以及包含例如生物相容性聚合物的完全合成的框架区。抗原结合蛋白的实例可以包括但不限于：人抗体、人源化抗体；嵌合抗体；重组抗体；单链抗体；双功能抗体；三功能抗体；四功能抗体；Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)2，F(ab)2，scFv，di-scFv，dAb，VHH，IgD抗体；IgE抗体；IgM抗体；IgG1抗体；IgG2抗体；IgG3抗体；和/或IgG4抗体以及其片段。
在本申请中，术语“CDR”也称“互补决定区”，通常是指抗体可变结构域中的区域，其序列可以是高度可变的和/或形成结构定义环。例如，抗体可以包括六个CDR；在VH中三个(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和在VL中三个(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。在某些实施方案中，仅由重链组成的天然存在的骆驼抗体在缺乏轻链的情况下，其功能也能够正常且稳定。抗体CDR可以通过多种编码系统来确定，如CCG、Kabat、Chothia、IMGT、综合考虑Kabat/Chothia等。这些编码系统为本领域内已知。例如，所述抗原结合蛋白的氨基酸序列编号可以按照IMGT编号方案。例如，所述抗原结合蛋白的CDR可以根据Kabat编号系统确定。
在本申请中，术语“FR”通常是指抗体可变结构域的更高度保守的部分，其被称为框架区。例如，天然重链和轻链的可变结构域各自可以包含四个FR区，即在VH中四个(H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4)，和在VL中四个(L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4)。
在本申请中，术语“可变结构域”与“可变区”可以互换使用，通常是指抗体重链和/或轻链的一部分。重链和轻链的可变结构域可以分别称为“VH”和“VL”(或者分别称为“VH”和“VL”)。这些结构域通常可以是抗体的变化最大的部分(相对于相同类型的其它抗体)，且可以包含抗原结合位点。在本申请中，术语“可变”通常是指在抗体之间可变结构域的某些区段在序列上可能存在较大差异。可变结构域介导抗原可以结合并决定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性可以并非在整个可变结构域范围内均匀分布。它可以通常集中在轻链和重链可变结构域中称为高变区(CDR或HVR)的三个区段中。可变结构域的更高度保守的部分可以称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自可以包含四个FR区，大多数采用β-折叠构型，通过三个CDR连接，其形成环形连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDR可以通过FR区紧密靠近地保持在一起，并且来自另一条链的CDR一同促进抗体的抗原结合位点的形成。
在本申请中，术语“抗体”通常是指免疫球蛋白或其片段或其衍生物，涵盖包括抗原结合位点的任何多肽，无论其是在体外还是体内产生的。该术语可以包括但不限于多克隆的、单克隆的、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化的、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂化的、突变的和移植的抗体。除非另外被术语“完整的”修饰，如在“完整的抗体”中，为了本发明的目的，术语“抗体”也可以包括抗体片段，比如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、VHH、dAb和保持抗原结合功能(例如，特异性结合本申请抗原)的其它抗体片段。通常，这样的片段可以包括抗原结合结构域。基本的4链抗体单元可以是由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体可以由5个基本的异四聚体单元与另外一个称为J链的多肽组成，且含有10个抗原结合位点，而IgA抗体可以包括2-5个可以与J链相结合聚合形成多价组合的基本4链单元。就IgG而言，4链单元一般可以为约150,000道尔顿。每个L链可以通过一个共价二硫键与H链连接，而两个H链可以通过一个或多个取决于H链同种型的二硫键相互连接。每个H和L链还可以具有规则间隔的链内二硫化桥键。每个H链在N末端可以具有重链可变区(VH)，对于α和γ链各自继之以三个恒定结构域(CH)、对于μ和ε同种型继之以四个CH结构域。每个L链在N末端可以具有轻链可变区(VL)，在其另一端可以具有恒定结构域。VL与VH可以对应，且轻链恒定区(CL)与重链的第一恒定结构域(CH1)可以相对应。特定的氨基酸残基可以被认为在轻链和重链可变结构域之间形成界面。VH和VL可以配对一起形成单个抗原结合位点。来自任何脊椎动物物种的L链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列被分为两种明显不同的类型中的一种，称为κ和λ。根据重链恒定区(CH)恒定结构域的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分为不同的类别或同种型。目前存在五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG例如IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4，和IgM，具有分别被命名为α、δ、ε、γ和μ的重链。
在本申请中，术语“抗原结合片段”通常是指具有特异结合抗原(例如，本申请的抗原)能力的一个或多个片段。在本申请中，所述抗原结合片段可以包括Fab，Fab’，F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2，scFv，di-scFv，VHH和/或dAb。
在本申请中，术语“Fab”通常是指抗体的抗原结合片段。如上所述，可以使用木瓜蛋白酶消化完整的抗体。抗体经木瓜蛋白酶消化后产生两个相同的抗原结合片段，即“Fab”片段，和残余的“Fc”片段(即Fc区)。Fab片段可以由一条完整的L链与一条重链的可变区和该H链(VH)的第一恒定区(CH1)组成。
在本申请中，术语“F(ab)2”通常是指抗体的抗原结合片段。例如，F(ab)2可以是由两个Fab片段连接的。
在本申请中，术语“Fab′”通常是指人单克隆抗体的单价抗原结合片段，该片段比Fab片段稍大。例如，Fab′片段可以包括所有轻链，所有重链可变区以及重链的所有或部分第一和第二恒定区。例如，Fab′片段还可包括重链的部分或所有的220-330个氨基酸残基。
在本申请中，术语“F(ab')2”通常是指通过胃蛋白酶消化完整抗体所产生的抗体片段。F(ab')2片段含有由二硫键维持在一起的两个Fab片段和部分铰链区。F(ab')2片段具有二价抗原结合活性并且能够交联抗原。
在本申请中，术语“Fv片段”通常是指人单克隆抗体的单价抗原结合片段，包括所有或部分重链可变区和轻链可变区，并且缺乏重链恒定区和轻链恒定区。重链可变区和轻链可变区包括例如CDR。例如，Fv片段包括重链和轻链的约110个氨基酸的所有或部分氨基端可变区。
在本申请中，术语“scFv”通常是指包含至少一个包括轻链的可变区抗体片段和至少一个包括重链的可变区的抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链和重链可变区是邻接的(例如经由合成接头例如短的柔性多肽接头)，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scFv保留其所来源的完整抗体的特异性。除非特别说明，否则如本申请中使用的那样，scFv可以以任何顺序(例如相对于多肽的N末端和C末端)具有所述的VL和VH可变区，scFv可以包括VL-接头-VH或可以包括VH-接头-VL。
在本申请中，术语“dAb”通常是指具有VH域或VL域组成的抗原结合片段，参考例如Ward等人(Nature,1989Oct 12；341(6242)：544-6)，参考Holt等人,TrendsBiotechnol.,2003,21(11)：484-490。
在本申请中，术语“VHH”通常是指包含重链抗体的可变抗原结合结构域的抗体(参见Vanlandschoot P.等人，2011，Antiviral Research 92，389-407)。VHH也可称为纳米抗体(Nanobody)(Nb)。
在本申请中，术语“单克隆抗体”通常是指单分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体通常针对单个抗原位点具有高度特异性。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体可以是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们可以通过杂交瘤培养合成，不受其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”可以表示从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，本申请使用的单克隆抗体可以在杂交瘤细胞中制备，或者可以通过重组DNA方法制备。
在本申请中，术语“嵌合抗体”通常是指其中可变区源自一个物种，而恒定区源自另一个物种的抗体。通常，可变区源自实验动物诸如啮齿动物的抗体(“亲本抗体”)，且恒定区源自人类抗体，使得所得嵌合抗体与亲本(例如小鼠来源)抗体相比，在人类个体中引发不良免疫反应的可能性降低。
在本申请中，术语“人源化抗体”通常是指非人抗体(例如小鼠抗体)的CDR区以外的部分或全部有的氨基酸被源自人免疫球蛋白的相应的氨基酸置换的抗体。在CDR区中，氨基酸的小的添加、缺失、插入、置换或修饰也可以是允许的，只要它们仍保留抗体结合特定抗原的能力。人源化抗体可任选地包含人类免疫球蛋白恒定区的至少一部分。“人源化抗体”可以保留类似于原始抗体的抗原特异性。非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式可以最低限度地包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在某些情形中，可以将人免疫球蛋白(受体抗体)中的CDR区残基用具有所期望性质、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠，大鼠，家兔或非人灵长类动物)的CDR区残基替换。在某些情形中，可以将人免疫球蛋白的FR区残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体中或在供体抗体中没有的氨基酸修饰。进行这些修饰可以是为了进一步改进抗体的性能，诸如结合亲和力。
在本申请中，术语“全人源抗体”通常是指仅包含人类免疫球蛋白蛋白质序列的抗体。如果其是在小鼠中、在小鼠细胞中或在衍生自小鼠细胞的杂交瘤中生产，那么全人源抗体可能含有鼠糖链。类似地，“鼠源抗体”、“小鼠抗体”或“大鼠抗体”分别指仅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白序列的抗体。可通过噬菌体展示或其它分子生物学方法，在人体内、在具有人类免疫球蛋白种系序列的转基因动物体内生成全人源抗体。可用于制造抗体的示例性技术是本领域已知的。
在本申请中，术语“抗原结合蛋白”通常是指包含结合抗原的部分的蛋白质，以及任选地允许结合抗原的部分采用促进抗原结合蛋白与抗原结合的构象的支架或骨架部分。抗原结合蛋白的实例包括但不限于抗体、抗原结合片段(Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv，VHH和/或dAb)、免疫缀合物、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段、抗体衍生物、抗体类似物或融合蛋白等，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。本申请的“分离的抗原结合蛋白”可以包含结合抗原的部分和任选地，允许抗原结合部分采用促进所述抗原结合部分结合抗原的构象的支架或构架部分。
在本申请中，术语“多肽分子”和“多肽”、“肽”可以互换使用，通常是指氨基酸残基的聚合物。术语“融合蛋白”通常是指具有至少两个共价连接在一起的部分的多肽。其中每个部分可以是具有不同特性的多肽。该特性可以是生物学性质，例如体外或体内活性。该性质也可以是简单的化学或物理性质，例如与靶分子的结合，反应的催化等。这两个部分可以通过单个肽键或通过肽接头直接连接。
在本申请中，术语“核酸分子”通常是指任何长度的分离形式的核苷酸，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或从其天然环境分离的或人工合成的类似物。
在本申请中，术语“载体”通常是指可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可以通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。一种载体可能含有多种控制表达的元件。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的成分。
在本申请中，术语“细胞”通常是指可以是或已经是受试者质粒或载体的接受者的单个细胞、细胞系或细胞培养物，其包括本申请所述的核酸分子或本申请所述的载体。细胞可以包括单个细胞的后代。由于天然、偶然或有意的突变，后代可以不一定与原始母细胞完全相同(在总DNA互补体的形态上或在基因组上)。细胞可包括用本申请所述的载体在体外转染的细胞。
在本申请中，术语“免疫缀合物”通常是指所述其他试剂(例如，化疗剂、放射性元素、细胞生长抑制剂和细胞毒性剂)与所述抗体或其抗原结合片段缀合(例如，通过连接分子共价相连)而形成的缀合物，该缀合物可以通过所述抗体或其抗原结合片段与靶细胞上的抗原特异性结合，将所述其他试剂递送至靶细胞(例如，肿瘤细胞)。
在本申请中，术语“药物组合物”通常是指用于预防/治疗疾病或病症的组合物。所述药物组合物可以包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。此外，所述药物组合物还可以包含一种或多种(药学上有效的)载剂等合适的制剂。组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下可以对接受者无毒。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。
在本申请中，术语“药学上可接受的载剂”通常是指药剂学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。生理学可接受的载体可包括合适的物质。指药剂学可接受的载剂(carrier)与基因工程中用于插入核酸的载体(vector)通常并不是同一物质。
在本申请中，术语“直接相连”可以与术语“间接相连”相对，术语“直接相连”通常是指直接连接。例如，所述直接相连可以为物质间没有间隔子而直接相连的情况。所述间隔子可以是连接子。例如，所述连接子可以为肽连接子。术语“间接相连”通常是指物质间不直接相连的情况。例如，所述间接相连可以为通过间隔子而连接的情况。例如，在本申请所述的分离的抗原结合蛋白中，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端可以直接或间接相连。
在本申请中，术语“di-scFv”通常是指二价scFv，例如可以是两个scFv分子通过短接头缀合的分子。
在本申请中，术语“特异性结合”或“特异性的”通常是指可测量的和可再现的相互作用，例如靶标和抗体之间的结合，可在分子(包括生物分子)的异质群体存在的情况决定靶标的存在。例如，特异性结合靶标(其可以为表位)的抗体可以是以比它结合其它靶标更大的亲和性、亲合力、更容易、和/或以更大的持续时间结合该靶标的抗体。在某些实施方案中，抗体特异性结合蛋白质上的表位，所述表位在不同种属的蛋白质中是保守的。在某些实施方案中，特异性结合可以包括但不要求排他性地结合。
在本申请中，术语“受试者”通常是指人类或非人类动物，包括但不限于猫、狗、马、猪、奶牛、羊、兔、小鼠、大鼠或猴。
在本申请中，涉及的蛋白质、多肽和/或氨基酸序列，还应理解为至少包含以下的范围：与该所述蛋白质或多肽具备相同或类似功能的变体或同源物。
在本申请中，所述变体可以为，例如在所述蛋白质和/或所述多肽(例如，特异性结合本申请抗原的抗体或其片段)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的蛋白质或多肽。例如，所述功能性变体可包含已经通过至少1个，例如1-30个、1-20个或1-10个，又例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失和/或插入而具有氨基酸改变的蛋白质或多肽。所述功能性变体可基本上保持改变(例如取代、缺失或添加)之前的所述蛋白质或所述多肽的生物学特性。例如，所述功能性变体可保持改变之前的所述蛋白质或所述多肽的至少60％，70％，80％，90％，或100％的生物学活性(例如抗原结合能力)。例如，所述取代可以为保守取代。例如，所述变体也可以为涵盖其功能活性片段的多肽，不限于在细胞中发生的加工和/或修饰后产生的包含所述蛋白功能活性片段的多肽。
在本申请中，所述同源物可以为与所述蛋白质和/或所述多肽(例如，特异性结合本申请抗原的抗体或其片段)的氨基酸序列具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的蛋白质或多肽。
在本申请中，所述同源性通常是指两个或多个序列之间的相似性、类似或关联。可以通过以下方式计算“序列同源性百分比”：将两条待比对的序列在比较窗中进行比较，确定两条序列中存在相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的总位置数(即，窗大小)，并且将结果乘以100，以产生序列同源性百分比。为了确定序列同源性百分数而进行的比对，可以按本领域已知的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内或目标序列区域内最大比对所需要的任何算法。所述同源性也可以通过以下的方法测定：FASTA和BLAST。对FASTA算法的描述可以参见W.R.Pearson和D.J.Lipman的“用于生物学序列比较的改进的工具”，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)，85：2444-2448，1988；和D.J.Lipman和W.R.Pearson的“快速灵敏的蛋白质相似性搜索”，Science，227：1435-1441，1989。对BLAST算法的描述可参见S.Altschul、W.Gish、W.Miller、E.W.Myers和D.Lipman的“一种基本的局部对比(alignment)搜索工具”，分子生物学杂志，215：403-410，1990。
在本申请中，术语“包含”通常是指包括、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
发明详述
一方面，本申请提供一种分离的抗原结合蛋白。抗体的CDR又称互补决定区，是可变区的一部分。该区域的氨基酸残基可以与抗原或抗原表位接触。抗体CDR可以通过多种编码系统来确定，如CCG、Kabat、Chothia、IMGT、综合考虑Kabat/Chothia等。这些编码系统为本领域内已知，具体可参见，例如www.bioinf.org.uk/abs/index.html#kabatnum。本领域技术人员可以根据抗体的序列和结构，用不同的编码系统确定出CDR区。使用不同的编码系统，CDR区可能存在差别。在本申请中，所述CDR涵盖根据任何CDR划分方式划分得到的CDR序列；也涵盖其变体，所述变体包括所述CDR的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸。例如1-30个、1-20个或1-10个，又例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸取代、缺失和/或插入；也涵盖其同源物，所述同源物可以为与所述CDR的氨基酸序列具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述CDR可以由Kabat编号方案来确定。
一方面，本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白，所述抗原可以是一种scFv。
例如，所述抗原可以包含重链互补决定区1(HCDR1)，重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，所述抗原的所述HCDR1的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：78所示。例如，所述抗原的所述HCDR2的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：77所示。例如，所述抗原的所述HCDR3的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：76所示。
例如，所述抗原可以包含轻链互补决定区1(LCDR1)，轻链互补决定区2(LCDR2)和轻链互补决定区3(LCDR3)，所述抗原的所述LCDR1的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：81所示。例如，所述抗原的所述LCDR2的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：80所示。例如，所述抗原的所述LCDR3的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：79所示。
例如，所述抗原可以包含重链可变区，所述抗原的所述重链可变区的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：82所示。
例如，所述抗原可以包含轻链可变区，所述抗原的所述轻链可变区的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：83所示。
例如，所述抗原包含单链抗体。例如，本申请的抗原可以是CT103A scFv，所述CT103AscFv的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：84所示。例如，所述抗原可以包含SEQ ID NO：84所示抗体中的重链可变区和轻链可变区。例如，所述抗原可以包含SEQ ID NO：84所示抗体中的重链互补决定区1(HCDR1)，重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，以及轻链互补决定区1(LCDR1)，轻链互补决定区2(LCDR2)和轻链互补决定区3(LCDR3)。
例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以包含重链可变区(VH)，所述抗原结合蛋白的所述重链可变区可以包含HCDR3、HCDR2和HCDR1，所述抗原结合蛋白的所述HCDR3的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：1或41所示。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有CT103A scFv结合能力。例如，所述CDR可以由Kabat编号方案来确定。例如，所述HCDR3可以包含12F1或6G8的HCDR3。例如，所述HCDR3可以包含12F1或6G8的重链可变区中的HCDR3。
例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以包含重链可变区(VH)，所述抗原结合蛋白的所述重链可变区可以包含HCDR3、HCDR2和HCDR1，所述抗原结合蛋白的所述HCDR2的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：2或42所示。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有CT103A scFv结合能力。例如，所述CDR可以由Kabat编号方案来确定。例如，所述HCDR2可以包含12F1或6G8的HCDR2。例如，所述HCDR2可以包含12F1或6G8的重链可变区中的HCDR2。
例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以包含重链可变区(VH)，所述抗原结合蛋白的所述重链可变区可以包含HCDR3、HCDR2和HCDR1，所述抗原结合蛋白的所述HCDR1的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：3或43所示。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有CT103A scFv结合能力。例如，所述CDR可以由Kabat编号方案来确定。例如，所述HCDR1可以包含12F1或6G8的HCDR1。例如，所述HCDR1可以包含12F1或6G8的重链可变区中的HCDR1。
例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以包含重链可变区(VH)，所述抗原结合蛋白的所述重链可变区可以包含HCDR3、HCDR2和HCDR1，所述抗原结合蛋白的所述HCDR3的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：1或41所示，所述抗原结合蛋白的所述HCDR2的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：2或42所示，且所述抗原结合蛋白的所述HCDR1的氨基酸序列可以如SEQ IDNO：3或43所示。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有CT103A scFv结合能力。例如，所述CDR可以由Kabat编号方案来确定。例如，所述HCDR3，HCDR2和HCDR1可以包含12F1或6G8的HCDR3，HCDR2和HCDR1。例如，所述HCDR3，HCDR2和HCDR1可以包含12F1或6G8的重链可变区中的HCDR3，HCDR2和HCDR1。
例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以包含重链可变区(VH)，所述抗原结合蛋白的所述重链可变区可以包含HCDR3、HCDR2和HCDR1，所述抗原结合蛋白的所述HCDR3的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：1所示，所述抗原结合蛋白的所述HCDR2的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：2所示，所述抗原结合蛋白的所述HCDR1的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：3所示。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有CT103A scFv结合能力。例如，所述CDR可以由Kabat编号方案来确定。例如，所述HCDR3，HCDR2和HCDR1可以包含12F1的HCDR3，HCDR2和HCDR1。例如，所述HCDR3，HCDR2和HCDR1可以包含12F1的重链可变区中的HCDR3，HCDR2和HCDR1。
例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以包含重链可变区(VH)，所述抗原结合蛋白的所述重链可变区可以包含HCDR3、HCDR2和HCDR1，所述抗原结合蛋白的所述HCDR3的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：41所示，所述抗原结合蛋白的所述HCDR2的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：42所示，所述抗原结合蛋白的所述HCDR1的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：43所示。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有CT103A scFv结合能力。例如，所述CDR可以由Kabat编号方案来确定。例如，所述HCDR3，HCDR2和HCDR1可以包含6G8的HCDR3，HCDR2和HCDR1。例如，所述HCDR3，HCDR2和HCDR1可以包含6G8的重链可变区中的HCDR3，HCDR2和HCDR1。
例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以包含轻链可变区(VL)，所述抗原结合蛋白的所述轻链可变区可以包含LCDR3、LCDR2和LCDR1，所述抗原结合蛋白的所述LCDR3的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：4或44所示。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有CT103A scFv结合能力。例如，所述CDR可以由Kabat编号方案来确定。例如，所述LCDR3可以包含12F1或6G8的LCDR3。例如，所述LCDR3可以包含12F1或6G8的轻链可变区中的LCDR3。
例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以包含轻链可变区(VL)，所述抗原结合蛋白的所述轻链可变区可以包含LCDR3、LCDR2和LCDR1，所述抗原结合蛋白的所述LCDR2的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：5或45所示。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有CT103A scFv结合能力。例如，所述CDR可以由Kabat编号方案来确定。例如，所述LCDR2可以包含12F1或6G8的LCDR2。例如，所述LCDR2可以包含12F1或6G8的轻链可变区中的LCDR2。
例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以包含轻链可变区(VL)，所述抗原结合蛋白的所述轻链可变区可以包含LCDR3、LCDR2和LCDR1，所述抗原结合蛋白的所述LCDR1的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：6或46所示。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有CT103A scFv结合能力。例如，所述CDR可以由Kabat编号方案来确定。例如，所述LCDR1可以包含12F1或6G8的LCDR1。例如，所述LCDR1可以包含12F1或6G8的轻链可变区中的LCDR1。
例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以包含轻链可变区(VL)，所述抗原结合蛋白的所述轻链可变区可以包含LCDR3、LCDR2和LCDR1，所述抗原结合蛋白的所述LCDR3的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：4或44所示，所述抗原结合蛋白的所述LCDR2的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：5或45所示，所述抗原结合蛋白的所述LCDR1的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：6或46所示。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有CT103A scFv结合能力。例如，所述CDR可以由Kabat编号方案来确定。例如，所述LCDR3，LCDR2和LCDR1可以包含12F1或6G8的LCDR3，LCDR2和LCDR1。例如，所述LCDR3，LCDR2和LCDR1可以包含12F1或6G8的轻链可变区中的LCDR3，LCDR2和LCDR1。
例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以包含轻链可变区(VL)，所述抗原结合蛋白的所述轻链可变区可以包含LCDR3、LCDR2和LCDR1，所述抗原结合蛋白的所述LCDR3的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：4所示，所述抗原结合蛋白的所述LCDR2的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：5所示，所述抗原结合蛋白的所述LCDR1的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：6所示。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有CT103A scFv结合能力。例如，所述CDR可以由Kabat编号方案来确定。例如，所述LCDR3，LCDR2和LCDR1可以包含12F1的LCDR3，LCDR2和LCDR1。例如，所述LCDR3，LCDR2和LCDR1可以包含12F1的轻链可变区中的LCDR3，LCDR2和LCDR1。
例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以包含轻链可变区(VL)，所述抗原结合蛋白的所述轻链可变区可以包含LCDR3、LCDR2和LCDR1，所述抗原结合蛋白的所述LCDR3的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：44所示，所述抗原结合蛋白的所述LCDR2的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：45所示，且所述抗原结合蛋白的所述LCDR1的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：46所示。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有CT103A scFv结合能力。例如，所述CDR可以由Kabat编号方案来确定。例如，所述LCDR3，LCDR2和LCDR1可以包含6G8的LCDR3，LCDR2和LCDR1。例如，所述LCDR3，LCDR2和LCDR1可以包含6G8的轻链可变区中的LCDR3，LCDR2和LCDR1。
例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以包含HCDR3、HCDR2、HCDR1、LCDR3、LCDR2和LCDR1，所述抗原结合蛋白的所述HCDR3的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：1或41所示，所述抗原结合蛋白的所述HCDR2的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：2或42所示，所述抗原结合蛋白的所述HCDR1的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：3或43所示，所述抗原结合蛋白的所述LCDR3的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：4或44所示，所述抗原结合蛋白的所述LCDR2的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：5或45所示，且所述抗原结合蛋白的所述LCDR1的氨基酸序列可以如SEQID NO：6或46所示。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有CT103A scFv结合能力。例如，所述CDR可以由Kabat编号方案来确定。例如，所述HCDR3、HCDR2、HCDR1、LCDR3、LCDR2和LCDR1可以包含12F1或6G8的HCDR3、HCDR2、HCDR1、LCDR3、LCDR2和LCDR1。例如，所述HCDR3、HCDR2、HCDR1、LCDR3、LCDR2和LCDR1可以包含12F1或6G8的轻链可变区中的HCDR3、HCDR2、HCDR1、LCDR3、LCDR2和LCDR1。
例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以包含HCDR3、HCDR2、HCDR1、LCDR3、LCDR2和LCDR1，所述抗原结合蛋白的所述HCDR3的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：1所示，所述抗原结合蛋白的所述HCDR2的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：2所示，所述抗原结合蛋白的所述HCDR1的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：3所示，所述抗原结合蛋白的所述LCDR3的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：4所示，所述抗原结合蛋白的所述LCDR2的氨基酸序列可以如SEQ IDNO：5所示，且所述抗原结合蛋白的所述LCDR1的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：6所示。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有CT103A scFv结合能力。例如，所述CDR可以由Kabat编号方案来确定。例如，所述HCDR3、HCDR2、HCDR1、LCDR3、LCDR2和LCDR1可以包含12F1的HCDR3、HCDR2、HCDR1、LCDR3、LCDR2和LCDR1。例如，所述HCDR3、HCDR2、HCDR1、LCDR3、LCDR2和LCDR1可以包含12F1的轻链可变区中的HCDR3、HCDR2、HCDR1、LCDR3、LCDR2和LCDR1。
例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以包含HCDR3、HCDR2、HCDR1、LCDR3、LCDR2和LCDR1，所述抗原结合蛋白的所述HCDR3的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：41所示，所述抗原结合蛋白的所述HCDR2的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：42所示，所述抗原结合蛋白的所述HCDR1的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：43所示，所述抗原结合蛋白的所述LCDR3的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：44所示，所述抗原结合蛋白的所述LCDR2的氨基酸序列可以如SEQID NO：45所示，且所述抗原结合蛋白的所述LCDR1的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：46所示。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有CT103A scFv结合能力。例如，所述CDR可以由Kabat编号方案来确定。例如，所述HCDR3、HCDR2、HCDR1、LCDR3、LCDR2和LCDR1可以包含6G8的HCDR3、HCDR2、HCDR1、LCDR3、LCDR2和LCDR1。例如，所述HCDR3、HCDR2、HCDR1、LCDR3、LCDR2和LCDR1可以包含6G8的轻链可变区中的HCDR3、HCDR2、HCDR1、LCDR3、LCDR2和LCDR1。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含H-FR1，所述H-FR1的C末端可以与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，所述H-FR1可以包含如SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含H-FR2，所述H-FR2可以位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，所述H-FR2可以包含如SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含H-FR3，所述H-FR3可以位于所述HCDR2与所述HCDR3之间。例如，所述H-FR3可以包含如SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含H-FR4，所述H-FR4的N末端可以与所述HCDR3的C末端相连。例如，所述H-FR4可以包含如SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可以包含H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4。例如，所述分离的抗原结合蛋白的H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4可分别依次包含SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。例如，所述分离的抗原结合蛋白的H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4可分别依次包含SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含L-FR1，所述L-FR1的C末端可以与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，所述L-FR1可以包含如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含L-FR2，所述L-FR2可以位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，所述L-FR2可以包含如SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含L-FR3，所述L-FR3可以位于所述LCDR2与所述LCDR3之间。例如，所述L-FR3可以包含如SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含L-FR4，所述L-FR4的N末端可以与所述LCDR3的C末端相连。例如，所述L-FR4可以包含如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可以包含L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4。例如，所述分离的抗原结合蛋白的L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4可分别依次包含SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。例如，所述分离的抗原结合蛋白的L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4可分别依次包含SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含VH，所述VH可以包含SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有CT103AscFv结合能力。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含VL，所述VL可以包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有CT103AscFv结合能力。
例如，所述VH可以包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列，且所述VL可以包含SEQID NO：16所示的氨基酸序列。例如，所述VH可以包含SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列，且所述VL可以包含SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含本申请所述的VH中的至少一个CDR。在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含本申请所述的VL中的至少一个CDR。所述CDR可以根据任何划分方式划分得到。在本申请中，所述CDR可以涵盖根据任何CDR划分方式划分得到的CDR序列；也可以涵盖其变体。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含本申请所述VH中的HCDR3，HCDR2和HCDR1。所述VH可以包含SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有CT103A scFv结合能力。在本申请中，所述CDR可以涵盖根据任何CDR划分方式划分得到的CDR序列；也可以涵盖其变体。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含本申请所述VL中的LCDR3，LCDR2和LCDR1。所述VL可以包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有CT103A scFv结合能力。在本申请中，所述CDR可以涵盖根据任何CDR划分方式划分得到的CDR序列；也可以涵盖其变体。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包括抗体重链恒定区。所述抗体重链恒定区可以源自人IgG、IgA、IgD、IgE和/或IgM重链恒定区。所述抗体重链恒定区可以源自人IgG重链恒定区。例如，所述分离的抗原结合蛋白的抗体重链恒定区可以包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包括抗体轻链恒定区。所述抗体轻链恒定区可以源自人轻链恒定区。例如，所述分离的抗原结合蛋白的抗体轻链恒定区可以包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述抗原结合片段可以包括Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)2，F(ab)2，scFv，di-scFv，VHH和/或dAb。
在某些实施方式中，所述抗体可以包括单克隆抗体。在某些实施方式中，所述抗体可以包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和/或全人源抗体。
此外，需要说明的是，本申请所述分离的抗原结合蛋白可以包含与其存在一个或多个保守序列修饰的重链和/或轻链序列。所谓“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变抗体结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸替换、添加和删除。可以通过领域内已知的标准技术，例如点突变和PCR介导的突变，将修饰引入本申请所述分离的抗原结合蛋白中。保守氨基酸替换是氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基进行替换。具有相似侧链的氨基酸残基组在领域内已知。这些氨基酸残基组包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。在某些实施方式中，本申请所述分离的抗原结合蛋白的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以用同侧链组的其他氨基酸残基替换。本领域内的技术人员知道，一些保守序列修改不会使抗原结合性消失，具体可以参见，例如，Brummell et al.,(1993)Biochem 32:1180-8；de Wildtet al.,(1997)Prot.Eng.10:835-41；Komissarov et al.,(1997)J.Biol.Chem.272:26864-26870；Hall et al.,(1992)J.Immunol.149:1605-12；Kelley and O'Connell(1993)Biochem.32:6862-35；Adib-Conquy et al.,(1998)Int.Immunol.10:341-6andBeers et al.,(2000)Clin.Can.Res.6:2835-43。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含重链，所述重链可以包含SEQ IDNO：19或SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有CT103A scFv结合能力。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含轻链，所述轻链可以包含SEQ IDNO：20或SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列。例如，本申请的分离的抗原结合蛋白可以具有CT103A scFv结合能力。
例如，所述重链可以包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列，且所述轻链可以包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列。例如，所述重链可以包含SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列，且所述轻链可以包含SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列。
一方面，本申请提供一种多肽分子、核酸分子、载体、免疫缀合物、细胞和药物组合物。
另一方面，本申请提供了多肽分子，其可以包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白。
在某些实施方式中，所述多肽分子可以包含融合蛋白。在某些实施方式中，所述多肽分子可以为融合蛋白。在某些实施方式中，所述多肽分子为多特异性(例如，双特异性，三特异性或其他多特异性)抗体。所述多特异性抗体可以包含：1)本申请所述的分离的抗原结合蛋白，以及2)一个或多个结合其他抗原、和/或结合相同抗原的其他表位的靶向部分。在某些实施方式中，本申请的多肽分子可以包含氨基酸以外的结构，例如，本申请的多肽分子可以包含核酸、多糖、脂质、小分子，以及前述的任意组合。
另一方面，本申请提供了分离的核酸分子，其可以编码本申请所述的分离的抗原结合蛋白。例如，其可以是通过以下方法产生或合成的：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的；(ii)通过克隆重组产生的；(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离；或者(iv)合成的，例如通过化学合成。
例如，编码本申请12F1的HCDR3的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：21所示。例如，编码本申请12F1的HCDR2的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：22所示。例如，编码本申请12F1的HCDR1的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：23所示。
例如，编码本申请12F1的LCDR3的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：24所示。例如，编码本申请12F1的LCDR2的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：25所示。例如，编码本申请12F1的LCDR1的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：26所示。
例如，编码本申请12F1的HFR1的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：27所示。例如，编码本申请12F1的HFR2的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：28所示。例如，编码本申请12F1的HFR3的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：29所示。例如，编码本申请12F1的HFR4的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：30所示。
例如，编码本申请12F1的LFR1的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：31所示。例如，编码本申请12F1的LFR2的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：32所示。例如，编码本申请12F1的LFR3的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：33所示。例如，编码本申请12F1的LFR4的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：34所示。
例如，编码本申请12F1的VH的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：35所示。例如，编码本申请12F1的VL的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：36所示。
例如，编码本申请12F1的重链恒定区的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：37所示。例如，编码本申请12F1的轻链恒定区的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：38所示。
例如，编码本申请12F1的重链的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：39所示。例如，编码本申请12F1的轻链的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：10所示。
例如，编码本申请6G8的HCDR3的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：58所示。例如，编码本申请6G8的HCDR2的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：59所示。例如，编码本申请6G8的HCDR1的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：60所示。
例如，编码本申请6G8的LCDR3的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：61所示。例如，编码本申请6G8的LCDR2的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：62所示。例如，编码本申请6G8的LCDR1的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：63所示。
例如，编码本申请6G8的HFR1的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：64所示。例如，编码本申请6G8的HFR2的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：65所示。例如，编码本申请6G8的HFR3的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：66所示。例如，编码本申请6G8的HFR4的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：67所示。
例如，编码本申请6G8的LFR1的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：68所示。例如，编码本申请6G8的LFR2的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：69所示。例如，编码本申请6G8的LFR3的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：70所示。例如，编码本申请6G8的LFR4的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：71所示。
例如，编码本申请6G8的VH的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：72所示。例如，编码本申请6G8的VL的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：73所示。
例如，编码本申请6G8的重链恒定区的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：37所示。例如，编码本申请6G8的轻链恒定区的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：38所示。
例如，编码本申请6G8的重链的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：74所示。例如，编码本申请6G8的轻链的核酸分子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO：75所示。
另一方面，本申请提供了一种载体，其可以包含本申请所述的核酸分子。此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。所述载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。所述载体可以包括，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者在例如遗传工程中通常使用的其他载体。例如，所述载体为表达载体。此外，所述载体还可以包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。
另一方面，本申请提供了一种细胞，其可以包含本申请所述的核酸分子或本申请所述的载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含一个或一种本申请所述的核酸分子或载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含多个(例如，2个或以上)或多种(例如，2种或以上)本申请所述的核酸分子或载体。例如，可将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如真核细胞，如来自植物的细胞、真菌或酵母细胞等。在某些实施方式中，所述细胞可以是细菌细胞(例如，大肠杆菌)、酵母细胞或其它真核细胞，例如COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、CHO-K1细胞、LNCAP细胞、HeLa细胞、293T细胞、COS-1细胞、SP2/0细胞、NS0细胞或骨髓瘤细胞。可通过本领域已知的方法将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等。
另一方面，本申请还提供了免疫缀合物，其可以包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白。
在某些实施方式中，可以将本申请所述的分离的抗原结合蛋白或其片段与另一试剂，如化学治疗剂、毒素、免疫治疗剂、成像探针、分光镜探针等的连接。该连接可以通过一个或多个共价键，或非共价相互作用，并且可以包括螯合作用。可以使用多种接头(所述接头可以为本领域所知)以形成免疫缀合物。此外，可以以融合蛋白质的形式提供免疫缀合物，其可以由编码免疫缀合物的多核苷酸表达。所述免疫缀合物还可以包含例如抗体-药物缀合物(ADC)。在ADC中，抗体和治疗剂可以通过接头交联，该接头可以是可切割的接头，例如可以是体内和/或体外可酶切的接头，例如可以是肽类接头、二硫类接头或腙类接头。
另一方面，本申请还提供了药物组合物，其可以包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的多肽分子、本申请所述的免疫缀合物、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
在某些实施方案中，所述药物组合物还可以包含一种或多种(药学上有效的)佐剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂和/或防腐剂的合适的制剂。组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下可以对接受者无毒。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。
在某些实施方案中，所述药物组合物还可含有多于一种活性化合物，通常为不会不利地影响彼此的具有互补活性的那些活性化合物。此类药物的类型和有效量可以取决于例如制剂中存在的拮抗剂的量和类型，以及受试者的临床参数。
在某些实施方案中，所述药学上可接受的载剂可以包括与药物给药相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收延迟剂，通常安全、无毒。
在某些实施方案中，所述药物组合物可以包含肠胃外、经皮、腔内、动脉内、鞘内和/或鼻内施用或直接注射到组织中。例如，所述药物组合物可以通过输注或注射施用于患者或者受试者。在某些实施方案中，所述药物组合物的施用可以通过不同的方式进行，例如静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或真皮内施用。在某些实施方案中，所述药物组合物可以不间断施用。所述不间断(或连续)施用可以通过患者佩戴的小泵系统来实现，以测量流入患者体内的治疗剂。
另一方面，本申请提供一种试剂盒。例如，其中试剂盒可以包含本申请的分离的CT103A scFv结合蛋白、包含CT103A scFv结合蛋白的多肽、编码本申请的分离的CT103AscFv结合蛋白的核酸分子、包含编码本申请的分离的CT103A scFv结合蛋白的核酸分子的载体、包含本申请的分离的CT103A scFv结合蛋白的免疫缀合物、包含上述物质的细胞、本申请的物组合物和/或本申请的药物组合。
在某些实施方式中，其中试剂盒可以用于检测样品中CT103A scFv的存在和/或含量。例如，试剂盒可以用于检测样品中包含嵌合抗原受体的细胞，例如CART细胞，的存在和/或含量。
一方面，本申请提供一种制备方法。
另一方面，本申请提供了制备本申请的分离的CT103A scFv结合蛋白和/或包含CT103A scFv结合蛋白的多肽的方法。所述方法可以包括，在使得本申请的分离的CT103AscFv结合蛋白和/或包含CT103A scFv结合蛋白的多肽表达的条件下，培养所述本申请所述的宿主细胞。例如，可通过使用适当的培养基、适当的温度和培养时间等，这些方法是本领域普通技术人员所了解的。
任何适于产生单克隆抗体的方法都可用于产生本申请的抗原结合蛋白。例如，可以用连接或天然存在的CT103A scFv或其片段，免疫动物。可以使用合适的免疫接种方法，包括佐剂、免疫刺激剂、重复加强免疫接种，可以使用一种或多种途径。例如，可以使用杂交瘤制备方法，获取已经过免疫的动物的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，经过HAT筛选出杂交瘤细胞株。
任何合适形式的CT103A scFv都可以作为免疫原(抗原)，用于产生对CT103A scFv特异的非人抗体，筛选所述抗体的生物学活性。例如，激发免疫原可以是全长的成熟人CT103A scFv，包括天然的同源二聚体，或含单个/多个表位的肽。免疫原可以单独使用，或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强剂组合使用。
嵌合人源抗体可以选自任何种类的免疫球蛋白，包括IgM、IgD、IgG、IgA或IgE。在本申请中，抗体可以是IgG抗体，可以使用IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型。可以通过用本领域的生物学测定筛选抗体实现必需恒定结构域序列的优化，以产生所需生物学活性。同样，任一类轻链都可以在本申请的化合物和方法中使用。例如，本申请的化合物和方法中可以使用κ链或其变体。
另一方面，本申请提供了本申请的抗原结合蛋白、本申请的多肽、本申请的核酸分子、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、本申请的细胞和/或本申请的药物组合物在制备试剂盒中的用途。
例如，本申请的试剂盒用于检测样品中嵌合抗原受体(CAR)的存在和/或含量。例如，试剂盒可以用于检测样品中包含嵌合抗原受体的细胞，例如CART细胞，的存在和/或含量。
另一方面，本申请提供了一种检测样品中嵌合抗原受体存在和/或含量的方法，可以包含施用本申请的抗原结合蛋白、本申请的多肽、本申请的核酸分子、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、本申请的细胞、本申请的药物组合物和/或本申请的试剂盒。例如，本申请的方法可以是体外的或离体的。例如，可以通过先将本申请的抗原结合蛋白先结合上可检测的物质，例如荧光基团，再将本申请的抗原结合蛋白与样品接触；由于本申请的抗原结合蛋白可以和嵌合抗原受体特异性结合，因此可以通过检测本申请的可检测的物质的存在和/或含量，确认样品中的嵌合抗原受体和/或包含嵌合抗原受体的细胞，例如CART细胞，的存在和/或含量。
另一方面，本申请提供了一种影响嵌合抗原受体与其特异性抗原结合的方法，可以包含施用本申请的抗原结合蛋白、本申请的多肽、本申请的核酸分子、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、本申请的细胞、本申请的药物组合物和/或本申请的试剂盒。例如，本申请的方法可以是体外的或离体的。例如，本申请的方法可以是非预防和非治疗目的的。例如，与未施用的对照组相比，施用本申请的抗原结合蛋白、本申请的多肽、本申请的核酸分子、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、本申请的细胞、本申请的药物组合物和/或本申请的试剂盒可以使得嵌合抗原受体与其特异性抗原结合的比例降低至少约50％、至少约20％、至少约15％、至少约10％、至少约5％、至少约2％、或至少约1％。
另一方面，本申请提供了一种与嵌合抗原受体的特异性抗原竞争结合所述嵌合抗原受体的方法，可以包含施用本申请的抗原结合蛋白、本申请的多肽、本申请的核酸分子、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、本申请的细胞、本申请的药物组合物和/或本申请的试剂盒。例如，本申请的方法可以是体外的或离体的。例如，本申请的方法可以是非预防和非治疗目的的。
另一方面，本申请提供了一种影响嵌合抗原受体的数量和/或功能方法，可以包含施用本申请的抗原结合蛋白、本申请的多肽、本申请的核酸分子、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、本申请的细胞、本申请的药物组合物和/或本申请的试剂盒。例如，本申请的方法可以是体外的或离体的。例如，本申请的方法可以是非预防和非治疗目的的。例如，所述嵌合抗原受体的功能可以包含所述嵌合抗原受体与其特异性抗原结合的能力。
另一方面，本申请提供了一种影响包含嵌合抗原受体的细胞的数量和/或功能方法，可以包含施用本申请的抗原结合蛋白、本申请的多肽、本申请的核酸分子、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、本申请的细胞、本申请的药物组合物和/或本申请的试剂盒。例如，本申请的方法可以是体外的或离体的。例如，本申请的方法可以是非预防和非治疗目的的。
例如，所述细胞可以包含免疫效应细胞。
例如，所述免疫效应细胞可以包含T淋巴细胞和/或自然杀伤(NK)细胞。
例如，所述细胞的功能可以包含所述细胞与所述嵌合抗原受体的特异性抗原结合的能力。
例如，所述细胞的功能可以包含杀伤包含所述特异性抗原的细胞的能力。
例如，所述细胞的功能可以包含抑制肿瘤体积的能力，所述肿瘤包含所述特异性抗原。
例如，特异性抗原可以包含B细胞成熟抗原(BCMA)或其功能活性片段。
另一方面，本申请的抗原结合蛋白、本申请的多肽、本申请的核酸分子、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、本申请的细胞、本申请的药物组合物和/或本申请的试剂盒，其可以用于影响包含嵌合抗原受体的细胞的数量和/或功能。例如所述影响可以包含减少嵌合抗原受体的细胞的数量和/或降低嵌合抗原受体的细胞的功能。例如，与未施用的对照组相比，施用本申请的抗原结合蛋白、本申请的多肽、本申请的核酸分子、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、本申请的细胞、本申请的药物组合物和/或本申请的试剂盒可以使得嵌合抗原受体的数量降低至少约50％、至少约20％、至少约15％、至少约10％、至少约5％、至少约2％、或至少约1％。例如，本申请的抗原结合蛋白可以是中和抗体，中和抗体可以是能和CT103A CAR-T的scFv特异性结合，从而可以干扰scFv与靶抗原BCMA结合，可以影响与BCMA的结合效率，可以降低CAR-T细胞对靶细胞的杀伤能力的抗体。能和CT103A scFv结合的抗原结合蛋白，也可以通过其他方式比如ADCC(antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity)效应影响CAR-T细胞的存续。
例如，所述细胞可以包含免疫效应细胞。
例如，所述免疫效应细胞可以包含T淋巴细胞和/或自然杀伤(NK)细胞。
例如，所述细胞的功能可以包含所述细胞与所述嵌合抗原受体的特异性抗原结合的能力。
例如，所述细胞的功能可以包含杀伤包含所述特异性抗原的细胞的能力。
例如，所述细胞的功能可以包含抑制肿瘤体积的能力，所述肿瘤包含所述特异性抗原。
例如，特异性抗原可以包含B细胞成熟抗原(BCMA)或其功能活性片段。
另一方面，本申请的抗原结合蛋白、本申请的多肽、本申请的核酸分子、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、本申请的细胞、本申请的药物组合物和/或本申请的试剂盒在制备药物中的应用，所述药物可以用于影响包含嵌合抗原受体的细胞的数量和/或功能。例如所述影响可以包含减少嵌合抗原受体的细胞的数量和/或降低嵌合抗原受体的细胞的功能。例如，与未施用的对照组相比，施用本申请的抗原结合蛋白、本申请的多肽、本申请的核酸分子、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、本申请的细胞、本申请的药物组合物和/或本申请的试剂盒可以使得嵌合抗原受体的数量降低至少约50％、至少约20％、至少约15％、至少约10％、至少约5％、至少约2％、或至少约1％。
例如，所述细胞可以包含免疫效应细胞。
例如，所述免疫效应细胞可以包含T淋巴细胞和/或自然杀伤(NK)细胞。
例如，所述细胞的功能可以包含所述细胞与所述嵌合抗原受体的特异性抗原结合的能力。
例如，所述细胞的功能可以包含杀伤包含所述特异性抗原的细胞的能力。
例如，所述细胞的功能可以包含抑制肿瘤体积的能力，所述肿瘤包含所述特异性抗原。
例如，特异性抗原可以包含B细胞成熟抗原(BCMA)或其功能活性片段。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的蛋白、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
技术方案
1.一种分离的抗原结合蛋白，所述抗原包含重链互补决定区1(HCDR1)，重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，所述抗原的所述HCDR1的氨基酸序列如SEQID NO：78所示，所述抗原的所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：77所示，且所述抗原的所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：76所示。
2.如技术方案1所述的抗原结合蛋白，所述抗原包含轻链互补决定区1(LCDR1)，轻链互补决定区2(LCDR2)和轻链互补决定区3(LCDR3)，所述抗原的所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：81所示，所述抗原的所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：80所示，且所述抗原的所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：79所示。
3.如技术方案1-2中任一项所述的抗原结合蛋白，所述抗原包含重链可变区，所述抗原的所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：82所示。
4.如技术方案1-3中任一项所述的抗原结合蛋白，所述抗原包含轻链可变区，所述抗原的所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：83所示。
5.如技术方案1-4中任一项所述的抗原结合蛋白，所述抗原包含单链抗体。
6.一种分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含重链可变区(VH)，所述抗原结合蛋白的所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述抗原结合蛋白的所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：1或41所示。
7.如技术方案6所述的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白的所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2或42所示。
8.如技术方案6-7中任一项所述的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白的所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3或43所示。
9.如技术方案6-8中任一项所述的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白的所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：1或41所示，所述抗原结合蛋白的所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2或42所示，且所述抗原结合蛋白的所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3或43所示。
10.如技术方案6-9中任一项所述的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白的所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：15或54所示。
11.如技术方案6-10中任一项所述的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含轻链可变区(VL)，所述抗原结合蛋白的所述轻链可变区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述抗原结合蛋白的所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：4或44所示。
12.如技术方案11所述的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白的所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5或45所示。
13.如技术方案11-12中任一项所述的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白的所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：6或46所示。
14.如技术方案11-13中任一项所述的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白的所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：4或44所示，所述抗原结合蛋白的所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5或45所示，且所述抗原结合蛋白的所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：6或46所示。
15.如技术方案11-14中任一项所述的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白的所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：16或55所示。
16.如技术方案6-15中任一项所述的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白的所述重链可变区包含重链框架区1(HFR1)、重链框架区2(HFR2)、重链框架区3(HFR3)和重链框架区4(HFR4)，所述抗原结合蛋白的所述HFR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：7或47所示。
17.如技术方案16所述的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白的所述HFR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：8或48所示。
18.如技术方案16-17中任一项所述的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白的所述HFR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：9或49所示。
19.如技术方案16-18中任一项所述的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白的所述HFR4的氨基酸序列如SEQ ID NO：10或50所示。
20.如技术方案11-19中任一项所述的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白的所述轻链可变区包含轻链框架区1(LFR1)、轻链框架区2(LFR2)、轻链框架区3(LFR3)和轻链框架区4(LFR4)，所述抗原结合蛋白的所述LFR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：11或51所示。
21.如技术方案20所述的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白的所述LFR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：12或52所示。
22.如技术方案20-21中任一项所述的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白的所述LFR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：13或53所示。
23.如技术方案20-22中任一项所述的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白的所述LFR4的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。
24.如技术方案6-23中任一项所述的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含抗体重链恒定区。
25.如技术方案24所述的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白的所述抗体重链恒定区包含源自人抗体的重链恒定区。
26.如技术方案24-25中任一项所述的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白的所述抗体重链恒定区包含源自IgG的重链恒定区。
27.如技术方案6-26中任一项所述的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含抗体轻链恒定区。
28.如技术方案27所述的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白的所述抗体轻链恒定区包含源自人抗体的轻链恒定区。
29.如技术方案6-28中任一项所述的抗原结合蛋白，其包含抗体或其抗原结合片段。
30.如技术方案29所述的抗原结合蛋白，其中所述抗体包含单克隆抗体。
31.如技术方案29-30中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗体选自以下组中的一种或多种：兔源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
32.如技术方案29-31中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合片段选自以下组中的一种或多种：Fab，Fab′，Fv片段，F(ab')2，F(ab)2，scFv，di-scFv，VHH和dAb。
33.一种多肽，其包含技术方案1-32中任一项所述的抗原结合蛋白。
34.如技术方案33所述的多肽，其包含融合蛋白。
35.一种核酸分子，其编码技术方案1-32中任一项所述的抗原结合蛋白和/或技术方案33-34中任一项所述的多肽。
36.一种载体，其包含技术方案35所述的核酸分子。
37.一种免疫缀合物，其包含技术方案1-32中任一项所述的抗原结合蛋白和/或技术方案33-34中任一项所述的多肽。
38.一种细胞，其包含和/或表达技术方案1-32中任一项所述的抗原结合蛋白、包含和/或表达技术方案33-34中任一项所述的多肽、包含技术方案35所述的核酸分子、包含技术方案36所述的载体和/或包含技术方案37所述的免疫缀合物。
39.一种药物组合物，其包含技术方案1-32中任一项所述的抗原结合蛋白、技术方案33-34中任一项所述的多肽、技术方案35所述的核酸分子、技术方案36所述的载体、技术方案37所述的免疫缀合物和/或技术方案38所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
40.一种试剂盒，其包含技术方案1-32中任一项所述的抗原结合蛋白、技术方案33-34中任一项所述的多肽、技术方案35所述的核酸分子、技术方案36所述的载体、技术方案37所述的免疫缀合物、技术方案38所述的细胞和/或技术方案39所述的药物组合物。
41.如技术方案40所述的试剂盒，其用于检测样品中嵌合抗原受体的存在和/或含量。
42.如技术方案40-41中任一项所述的试剂盒，其用于检测样品中包含嵌合抗原受体的细胞的存在和/或含量。
43.一种制备技术方案1-32中任一项所述的抗原结合蛋白和/或技术方案33-34中任一项所述的多肽的方法，包含在使得所述抗原结合蛋白和/或所述多肽表达的条件下，培养技术方案38所述的细胞。
44.技术方案1-32中任一项所述的抗原结合蛋白、技术方案33-34中任一项所述的多肽、技术方案35所述的核酸分子、技术方案36所述的载体、技术方案37所述的免疫缀合物、技术方案38所述的细胞和/或技术方案39所述的药物组合物在制备试剂盒中的用途。
45.如技术方案44所述的用途，其中所述试剂盒用于检测样品中嵌合抗原受体的存在和/或含量。
46.一种检测样品中嵌合抗原受体存在和/或含量的方法，包含施用技术方案1-32中任一项所述的抗原结合蛋白、施用技术方案33-34中任一项所述的多肽、施用技术方案35所述的核酸分子、施用技术方案36所述的载体、施用技术方案37所述的免疫缀合物、施用技术方案38所述的细胞、施用技术方案39所述的药物组合物和/或使用技术方案40-42中任一项所述的试剂盒。
47.一种影响嵌合抗原受体与其特异性抗原结合的方法，包含施用技术方案1-32中任一项所述的抗原结合蛋白、施用技术方案33-34中任一项所述的多肽、施用技术方案35所述的核酸分子、施用技术方案36所述的载体、施用技术方案37所述的免疫缀合物、施用技术方案38所述的细胞、施用技术方案39所述的药物组合物和/或使用技术方案40-42中任一项所述的试剂盒。
48.一种与嵌合抗原受体的特异性抗原竞争结合所述嵌合抗原受体的方法，包含施用技术方案1-32中任一项所述的抗原结合蛋白、施用技术方案33-34中任一项所述的多肽、施用技术方案35所述的核酸分子、施用技术方案36所述的载体、施用技术方案37所述的免疫缀合物、施用技术方案38所述的细胞、施用技术方案39所述的药物组合物和/或使用技术方案40-42中任一项所述的试剂盒。
49.一种影响嵌合抗原受体的数量和/或功能的方法，包含施用技术方案1-32中任一项所述的抗原结合蛋白、施用技术方案33-34中任一项所述的多肽、施用技术方案35所述的核酸分子、施用技术方案36所述的载体、施用技术方案37所述的免疫缀合物、施用技术方案38所述的细胞、施用技术方案39所述的药物组合物和/或使用技术方案40-42中任一项所述的试剂盒。
50.如技术方案49所述的方法，所述嵌合抗原受体的功能包含所述嵌合抗原受体与其特异性抗原结合的能力。
51.一种影响包含嵌合抗原受体的细胞的数量和/或功能的方法，包含施用技术方案1-32中任一项所述的抗原结合蛋白、施用技术方案33-34中任一项所述的多肽、施用技术方案35所述的核酸分子、施用技术方案36所述的载体、施用技术方案37所述的免疫缀合物、施用技术方案38所述的细胞、施用技术方案39所述的药物组合物和/或使用技术方案40-42中任一项所述的试剂盒。
52.如技术方案51所述的方法，所述包含嵌合抗原受体的细胞包含免疫效应细胞。
53.如技术方案52所述的方法，所述免疫效应细胞包含T淋巴细胞和/或自然杀伤(NK)细胞。
54.如技术方案51-53中任一项所述的方法，所述包含嵌合抗原受体的细胞的功能包括所述包含嵌合抗原受体的细胞与所述嵌合抗原受体的特异性抗原结合的能力。
55.如技术方案54所述的方法，所述包含嵌合抗原受体的细胞的功能包括杀伤包含所述特异性抗原的细胞的能力。
56.如技术方案51-55中任一项所述的方法，所述包含嵌合抗原受体的细胞的功能包括抑制肿瘤体积的能力，所述肿瘤包含所述嵌合抗原受体的特异性抗原。
57.如技术方案51-56中任一项所述的方法，所述嵌合抗原受体的特异性抗原包含B细胞成熟抗原(BCMA)或其功能活性片段。
实施例
实施例1
1.抗原制备
根据氨基酸序列如SEQ ID NO：84所示的序列制备抗原(CT103A scFv)质粒。质粒抽提，先摇菌(37℃220rpm过夜)，转染小试，细胞放大转染，转染后，继续培养6天后进行收样，10000rpm 20min，4℃，0.45um滤膜过滤，备用。抗原纯化：Ni柱亲和纯化，平衡缓冲液(20mM PB,500mM NaCl,pH7.4)；洗脱缓冲液(20mM PB,500mM NaCl,500mM Imidazole,pH7.4)。先用20mM PB,500mM NaCl,20mM Imidazole,pH7.4洗脱非特异结合的杂蛋白，之后目标蛋白用20mM PB,500mM NaCl,500mM Imidazole,pH7.4一步洗脱，收集Ni柱洗脱组分，透析至20mM PB,pH7.4体系。弱阴离子DEAE柱纯化,平衡缓冲液(20mM PB,pH7.4)；洗脱缓冲液(20mM PB,1M NaCl,pH7.4)。用不同浓度NaCl的缓冲液洗脱，目标蛋白在100mM NaCl洗脱。DEAE洗脱组分透析至最终体系PBS。
2.兔免疫
选择月龄3个月体重1.5kg的大耳白兔，饲养于标准动物房内，连续观察三天，确定情况正常后进行免疫。采用背部多点皮下注射和肌肉注射法进行免疫。具体程序如下：第一天，初次免疫，为更好地刺激实验动物产生免疫反应，采用弗氏完全佐剂配免疫原，每只剂量0.3mg免疫原。第7天，第二次免疫，每只剂量0.15mg免疫原(溶于0.15ml生理盐水和0.15ml弗氏不完全佐剂中)。第21天，第三次免疫，每只剂量0.15mg免疫原(溶于0.15ml生理盐水和0.15ml弗氏不完全佐剂中)。第35天，第四次免疫，每只剂量0.15mg免疫原(溶于0.15ml生理盐水和0.15ml弗氏不完全佐剂中)。第四次免疫后7天采血测血清效价。第132天，第五次免疫，每只剂量0.15mg免疫原(溶于0.15ml生理盐水和0.15ml弗氏不完全佐剂中)。第五次免疫后9天采血测血清效价。
3.免疫后取血清进行ELISA检测
96孔板包被抗原蛋白，将抗原蛋白稀释至2ug/ml，包被96孔酶标板，每孔包被50ul，37度，6小时。用含5％脱脂奶粉的PBST封闭，100ul/孔，4度孵育过夜。分别加入用PBS行梯度稀释的待检测血清100ul/孔。(血清：PBS分别为1:100,1:4000,1:8000,1:16000,1:32000，1:64000,1:128000,1:256000，1:512000)，以未免疫的大耳白兔的血清作为阴性对照，置于37度孵育2小时。倒出液体，以洗涤液洗涤3次，每次拍干。每孔加入HRP抗体(用抗体稀释液行1:5000稀释)100ul，置37度孵育2小时。倒出液体，以洗涤液洗涤3次，每次拍干。显色加入底物液100ul/孔，置暗处10min。每孔加终止液100ul终止。
4.脾脏B细胞分离
解剖动物，获取脾脏，并将脾脏剪成小块，使用研磨棒将脾脏研磨成单一的细胞。将含有细胞的培养基移入50ml离心管中，进行计数。计数完成后，离心，400g，5min，弃去上清。加入适量冻存液，冻存细胞密度为1*107个细胞/ml、1.8ml/管。冻存液配方血清：DMSO＝9：1。将细胞置于冻存盒中，置于-80度过夜。将细胞取出，转入液氮罐中保存。
5.B细分选及培养
使用流式细胞仪分选B细胞，每个孔为单个B细胞，培养2周后取阳性B上清进行检测。
6.LEM上清ELISA检测
提取阳性克隆的RNA，使用试剂盒将RNA反转程cDNA，以特异性引物扩增抗体的重链和轻莲，使用线性的DNA转染293细胞，得到LEM上清进行检测。
7.重组兔单抗表达
将本申请结合蛋白的重链和轻链序列分别构建到重组抗体表达质粒；转染前一天，消化T25细胞培养瓶内的细胞，取三分之一细胞离心后用DMEM培养基(10％FBS)稀释为2*105cells/ml密度；转染前取出DMEM培养基和转染试剂；准备好表达质粒和阳性GFP质粒，并计算转染所需质粒体积，使每孔加入1ug质粒，向每组中装有培养基的EP管里加入质粒；取一个灭菌EP管，加入DMEM培养基，然后缓慢滴加转染试剂，将转染试剂稀释液混匀后，缓慢滴加25ul混合转染试剂到质粒稀释液中，滴完后洗吹几次，并开始计时20min；缓慢滴加到24孔板细胞中，均匀加入整个孔内；在24孔板盖上写明项目编号和阳性、阴性对照，阳性对照转染GFP质粒，阴性对照不加任何试剂；将24孔板放入37度培养箱，4-6小时后，用1ml移液枪吸去培养基，每孔沿壁加入500ul DMEM(10％FBS)继续培养4天；第二天用荧光显微镜观察阳性对照孔，观察转染效率；转染四天后收取细胞上清，纯化抗体。
8.重组抗体ELISA检测
重组抗体根据本申请的ELISA检测方法检测。
本申请使用的主要试剂材料如表1所示。
表1试剂与材料
实施例2免疫血清ELISA检测
将四次免疫后的大白耳兔取血清ELISA检测，若效价合格则牺牲兔子，进行抗体纯化；若不合格再进行五次免疫。将96孔板包被抗原蛋白，抗原蛋白稀释至2ug/ml，包被96孔酶标板，每孔包被50ul，37度，6h。用含5％脱脂奶粉的PBST封闭，100ul/孔，4度孵育过夜。分别加入用PBS行梯度稀释的待检测兔血清100ul/孔。(血清:PBS分别为1:100,1:4000,1:8000,1:16000,1:32000,1:64000,1:128000,1:256000,1:512000),以未免疫的大耳白兔的血清作为阴性对照，置于37度孵育2小时。每孔加入HRP抗体(用抗体稀释液行1:5000稀释)100ul，置37度孵育2小时。显色加入底物液100ul/孔，置暗处10min。每孔加终止液100ul终止。酶标仪检测450nm处吸光值。根据ELISA检测结果分析，符合兔单抗筛选标准。四次免疫后ELISA检测结果如表2A所示，五次免疫后ELISA检测结果如表2B所示。
表2A四次免疫后ELISA检测结果
稀释比例 实验兔1 实验兔2
空白对照 0.05 0.08
阴性对照1:1K 0.0347 0.0509
阴性对照1:64K 0.08 0.06
试验组1:1K 1.03 1.02
试验组1:4K 0.98 0.9
试验组1:8K 0.9326 0.73
试验组1:16K 0.87 0.7
试验组1:32K 0.71 0.53
试验组1:64K 0.56 0.37
试验组1:128K 0.41 0.25
试验组1:256K 0.257 0.17
试验组1:512K 0.17 0.12
表2B五次免疫后ELISA检测结果
由结果可知，四次免疫后血清在1:64000稀释甚至更高稀释倍数，仍具备与抗原结合的能力。五次免疫后血清1:64000稀释甚至更高稀释倍数，仍具备与抗原结合的能力。
实施例3免疫原ELISA阳性克隆负筛选
分离选定兔子的脾脏，用流式分选仪分选的脾脏B细胞，共分选细胞和培养20*96孔板个单一B细胞克隆(经生物素化抗原富集)，取阳性B细胞上清进行检测，筛选获得分泌抗CT103A抗体的阳性细胞克隆共计91株。
CT103A的scFV抗原制备方法：质粒抽提，先摇菌(37℃220rpm过夜)，大抽质粒，质粒定量。转染小试，先筛选转染条件，根据转染结果，选择合适的转染条件放大。细胞放大转染，将细胞培养至密度为2.5*10^6cells/ml，细胞活率95％以上。根据质粒的转染终浓度0.735ug/ml，计算所需的质粒量；根据质粒的总体积为转染体积的1/20，计算稀释质粒所用培养基的体积；用计算好的培养基稀释质粒，混匀，用0.45uM的滤器过滤，RT静置5min。根据加入Plasmid：PEI的比例为1：6.7，计算所需的PEI的量；根据PEI的总体积为转染体积的1/20，计算稀释PEI所用培养基的体积；用计算好的培养基稀释PEI，混匀，RT静置5min。将稀释后的PEI和质粒，进行混合，注意混合均匀，RT静置20min。将PEI与质粒的混合物，流加至准备好的细胞中，边摇边加，混匀后放入培养。补料：转染后，继续培养6天后进行收样，10000rpm 20min 4℃，0.45um滤膜过滤，备用。
使用PH7.4的PBS(Hyclone)将抗原蛋白稀释至2ug/ml,包被96孔酶标板，每孔包被50ul,37度，6小时。用含5％脱脂奶粉的PBST封闭，100ul/孔，4度孵育过夜。取阳性血清使用RPMI1640培养基按1:10000稀释，作为阳性对照。1640培养基作为阴性对照。无菌条件下分别加入各细胞培养上清样品10ul、阳性对照50ul*2孔，37度孵育2小时。用200ulPBST洗涤3次，加入HRP二抗(1％BSA-PBST进行1:5000稀释)，每孔50ul,37度孵育1小时。用200ulPBST洗涤3次，各孔加入TMB底物显色液50ul,室温避光显色15min.每孔加入1M的H2SO4溶液50μl，终止反应，酶标仪检测450nm处吸光值。
结果如表3所示，从91株阳性克隆中进一步筛选出6G8和12F1克隆，两株克隆的OD450值小于0.1。阳性对照OD450平均约为1.11,阴性对照OD450平均约为0.031。
表3分泌抗CT103A抗体的阳性细胞克隆的检测结果
实施例4LEM上清表达及ELISA检测
为了筛选出能识别目的CT103A scFv的抗体，将负筛后得到的阳性克隆，提取RNA，使用试剂盒将RNA反转成cDNA，以特异性引物扩增抗体的重链和轻链，使用线性的DNA转染239细胞，得到LEM上清进行检测。
本实施例中包含以下步骤：
抗原包被，蛋白每孔包被抗原1μg/mL，100μl/孔，加样完成后，保鲜膜紧密包裹4℃过夜或37℃温育2小时。
洗板完成后，多道移液器加入200μl/孔封闭液，盖上锡箔纸盖，37℃温箱静置2小时；
LEM上清1:2起4个梯度3倍稀释，37℃温育1小时；
每孔加入100μl抗体稀释液1:5000稀释的HRP标记二抗，盖上锡箔纸盖，37℃温育50min。
将显色液A和B按1:1混合，每孔加入100μl，盖上锡箔纸盖，37℃温育10min，然后每孔加入100ul终止液。
测量其450nm下OD值，根据样品孔与阴性对照孔的比值来判断血清效价。
如表4A所示，本申请从15株负筛选得到的阳性克隆中进一步筛选出6G8和12F1克隆，两株克隆和本申请的作为抗原的CT103A scFv(氨基酸序列如SEQ ID NO：84所示)的结合检测结果。如表4B所示，本申请6G8和12F1克隆和同型IgG的结合检测结果。
表4A负筛选得到的阳性克隆与scFv结合的检测结果
表4B负筛选得到的阳性克隆与同型IgG结合的检测结果
结果显示，6G8和12F1克隆LEM上清与CT103A scFv可以结合，与人同型IgG克隆无结合。
实施例5重组抗体ELISA检测
本申请已经在LEM上清ELISA检测验证阳性克隆能识别目的CT103A scFv，同时均与人IgG克隆无交叉。为了进一步验证抗体的特异性，本申请设计开展如下实验，证明候选的重组兔单抗能特异的识别CT103A scfv，且与人IgG克隆无交叉。
首先，进行细胞培养及瞬时转染
所述方法包含以下步骤：
将候选的本申请克隆的重链和轻链序列分别构建到重组抗体表达质粒；转染前一天，消化T25细胞培养瓶内的细胞，取三分之一细胞离心后用DMEM培养基(10％FBS)稀释为2*105cells/ml密度，用5ml一次性移液管吹匀后，接种到24孔板，每孔500ul；准备好表达质粒和阳性GFP质粒，并计算转染所需质粒体积，使每孔加入1ug质粒；向每组中装有培养基的EP管里加入质粒；将质粒与转染试剂缓慢滴加到细胞孔板中；在24孔板盖上写明项目编号和阳性、阴性对照，阳性对照转染GFP质粒，阴性对照不加任何试剂；将24孔板放入37℃培养箱，4-6小时后，用1ml移液枪吸去培养基，每孔沿壁加入500ul DMEM培养基(10％FBS)继续培养4天；第二天用荧光显微镜观察阳性对照孔，观察转染效率；转染四天后收取细胞和上清，纯化抗体。
接着，本申请对纯化后的抗体ELISA检测
所述方法包含以下步骤：
抗原包被，蛋白每孔包被抗原1μg/mL，100μl/孔，加样完成后，4℃过夜或37℃温育2小时。洗板完成后，多道移液器加入200μl/孔封闭液,盖上锡箔纸盖，37℃温箱静置2小时。纯化后抗体原始液起8个梯度3倍稀释，37℃温育1小时。每孔加入100μl抗体稀释液1:5000稀释的HRP标记二抗，盖上锡箔纸盖，37℃温育50min。将显色液AB1:1混合，每孔加入100μl，盖上锡箔纸盖，37℃温育10min，然后每孔加入100ul终止液。测量其450nm下OD值,根据样品孔与阴性对照孔的比值来判断效价。
如表5A所示，本申请从6株重组克隆中进一步筛选出6G8和12F1克隆，两株克隆和本申请的作为抗原的CT103A scFv(氨基酸序列如SEQ ID NO：84所示)的结合检测结果。如表5B所示，本申请6G8和12F1克隆和同型IgG的结合检测结果。
表5A重组克隆与scFv结合的检测结果
表5B重组克隆与同型IgG结合的检测结果
结果显示，两次试验的6G8和12F1重组克隆与scfv可以结合，与人同型IgG克隆无结合。
实施例6细胞结合能力检测
本申请已经证明候选克隆能识别目的CT103A scfv，为了进一步证明这个结论，在本实施例中，本申请验证了在转导BCMA-CAR的Jurkat细胞与候选兔单克隆抗体的结合。
首先，发明人对已冻存的BCMA-CAR-Jurkat细胞进行复苏培养，BCMA-CAR-Jurkat细胞可以通过将氨基酸序列如SEQ ID NO：84所示的序列转染到细胞中进行制备。用1640+10％FBS培养。本申请在BCMA-CAR-Jurkat细胞上分别标记候选的单克隆抗体15min，再标记二抗PE Donkey anti-rabbit IgG(minimal x-reactivity)antibody 15min，流式检测候选单克隆抗体与BCMA-CAR-Jurkat细胞结合。
本申请将6G8、12F1这2个克隆用Alexa FluorR 647抗体标记试剂盒(AntibodyLabeling Kits)标记后，进一步检测2个候选抗体的结合能力。
所述方法包含以下步骤：
用Alexa FluorR 647Antibody Labeling Kits标记6G8和12F1克隆；标记后用Nanodrop检测抗体浓度；将标记后的抗体稀释1:2起10个梯度2倍稀释；稀释不同浓度的抗抗体标记BCMA-CAR-Jurkat细胞，室温避光孵育15min；洗涤后流式检测。
图1A-1C显示的是，检测本申请抗原结合蛋白与细胞的流式分析结果。
结果显示，本申请的6G8、12F1这2个克隆可以特异与BCMA-CAR-Jurkat细胞结合。BCMA-CAR-Jurkat细胞在与不同浓度的12F1抗体结合时，随着标记抗体浓度的减少MFI的值也逐渐减弱。阴性对照的MFI值为0.18，12F1抗体浓度稀释10次，每次稀释2倍的浓度从高到低对应的MFI值分别为：15.3、15.3、15.3、14.3、12.4、7.73、4.37、2.83、1.53、0.94；12F1抗体浓度稀释10次，每次稀释2倍的浓度从高到低对应的MFI值分别为：4.66、3.16、1.98、1.28、0.81、0.53、0.37、0.31、0.25、0.22。
实施例7用于检测CAR T细胞比例的准确度和线性评价
本申请已经证明本申请克隆与Jurkat-CAR细胞有较较强的结合能力。为了进一步证明这一结论，在本实施例中，本申请进一步验证了12F1克隆用于检测BCMA-CAR细胞的准确度和线性的能力。在Jurkat-CAR细胞上可以观察到12F1克隆满足检测CART细胞的准确度和线性要求。
本申请对已制备的CAR+比例100％的Jurkat-CAR细胞以及与Jurkat细胞稀释成不同CAR+比例：2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、60％、90％，将稀释不同CAR+比例的细胞标记12F1克隆抗体，同时设定一个不加入抗体的空白对照组，流式检测CAR+比例。
图2A-2B显示的是，检测本申请抗原结合蛋白与不同CAR+比例的细胞的流式分析结果。
从流式检测结果可以得到，本申请的12F1克隆可以满足较低比例的CAR+比例的检测准确度：原本稀释成2.5％CAR+比例的细胞根据本申请的方法检测CAR阳性比例为2.56％，原本稀释成5％CAR+比例的细胞根据本申请的方法检测CAR阳性比例为5.92％。同时也满足较高比例的CAR+比例的检测准确度:原本稀释成60％CAR+比例的细胞根据本申请的方法检测CAR阳性比例为60.4％，原本稀释成90％CAR+比例的细胞根据本申请的方法检测CAR阳性比例为90.4％。本申请对上述实验的流式检测结果进行统计分析，将稀释的不同的CAR+比例的数值与时间流式检测的CAR+比例数值进行曲线拟合，得到R2＝0.99。结果显示，12F1克隆满足检测CART细胞比例的准度研究。
实施例8与BCMA竞争结合的能力评价
本申请证明12F1、6G8这2个抗原结合蛋白能特异细胞结合，并证明12F1克隆抗原结合蛋白用于检测BCMA-CAR细胞比例的准确度和线性。为了进一步证明12F1、6G8这2个抗原结合蛋白的竞争结合能力，本申请对12F1和6G8这个2个克隆开展了如下实验。
本申请证明12F1克隆与BCMA竞争后具有较高的中和活性。
所述方法包含以下步骤：
1ug/ml的BCMA蛋白包被板，2-8℃过夜；封闭,3％BSA Blocking buffer封闭1-2小时.500RPM；12F1、6G8克隆抗原结合蛋白分别与CT103A scFv(Biotin结合的CT103A scFv)(50uL抗原结合蛋白+50uL Bitoin-drug溶液)孵育1小时,500RPM；洗板后，转板，单孔转复孔，100ul/孔，孵育1小时,500RPM。洗板后，加入SA-HRP孵育1小时.500RPM；洗板后，加入TMB显色10-15min.500RPM；加入终止液，读板。背景为培养基，血清组为免疫兔的血清。
CT103A多克隆抗体制备方法：
1.动物免疫，使用弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂乳化抗原CT103A scFv，并对兔子免疫，采集血清；
2.间接ELISA法初步检测血清效价，确认血清具备与抗原结合的能力；
3.抗体纯化，通过纯化柱亲和纯化多克隆抗体，纯化后的抗体具有与抗原结合的能力。多克隆抗体制备所需试剂和材料如表6所示。
表6主要试剂材料
名称 厂商 货号
弗氏完全佐剂 SIGMA F5881
弗氏不完全佐剂 SIGMA F5506
脱脂奶粉 伊利 无
新西兰大白兔 明天农牧科技 无
NHS-Activated Beads 4FF 天地人和生物科技 SA03902
人源IgG 源叶生物 S25766
显色液 达科为 6813521-3
表7A-7C和图3显示的是，12F1、6G8与BCMA竞争结合scFv的能力。
表7A CT103A多克隆抗体与scFv结合的检测结果
表7B 12F1与scFv结合的检测结果
表7C 6G8与scFv结合的检测结果
/>
CT103A多克隆抗体与BCMA竞争结合scFv的能力弱，在1000ng/ml的抗体浓度下，信号抑制率也只有4.7％。12F1单克隆与BCMA竞争结合scFv,在1000ng/ml、500ng/ml的抗体浓度下，信号抑制率都达90％以上。6G8单克隆具有与BCMA竞争结合scFv的能力。
实施例9对CT103A细胞的功能抑制评价
本申请已经证明12F1克隆与BCMA竞争后具有较高的中和活性。为了进一步证明12F1和6G8的抗原结合蛋白对CT103A细胞的杀伤功能的阻断作用，本申请开展如下实验，证明12F1这个抗原结合蛋白对CT103A细胞的CD107a转运的抑制。
首先，本申请将CT103A细胞中分别加入0.5ug 12F1和0.5ug 6G8抗原结合蛋白预处理，后续再和不同靶细胞(表达BCMA抗原的阳性靶细胞U266、以及不表达BCMA抗原的阴性靶细胞K562，阴性对照为培养基)共孵育，刺激活化CAR信号，介导CAR-T杀伤靶细胞和CAR-T积累CD107a。在检测前5小时，加入莫能霉素和CD107a抗体，5小时后进行CD8抗体的染色，用于检测CD8阳性细胞的CD107a的转运(分泌)的富集。
图4A-4D显示的是，12F1和6G8的抗原结合蛋白对CT103A细胞的杀伤功能的阻断作用的结果图。
结果显示，CT103A细胞未加入抗原结合蛋白，在阴性靶细胞K562无法激活CAR-T进行有效的CD107a转运，而阳性靶细胞U266能充分激活CT103A释放CD107a，阳性率在20％以上。在0.5ug 12F1抗原结合蛋白共孵育后，在阴性对照组K562几乎没有任何CD107a的转运富集，在阳性靶细胞U266刺激下，也几乎没有任何CD107a的转运富集。在0.5ug与6G8抗抗体共孵育后，在阴性对照组K562几乎没有任何CD107a的转运富集。12F1抗原结合蛋白可以对CT103A细胞CD107a转运的抑制，可以具有对CT103A细胞的杀伤功能的阻断作用。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。
提交序列表
<110> 南京驯鹿医疗技术有限公司
<120> 靶向单链抗体的中和性单克隆抗体
<130> 0085-PA-014
<160> 84
<170> PatentIn version 3.5
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Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala
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Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
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Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Ser Asn Ala
20 25 30
Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
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Phe Ile Ala Ala Tyr Gly Asp Thr His Asn Ala Thr Trp Ala Lys Gly
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Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
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Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Ser Thr Tyr
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Ala Phe Glu Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
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Gly Thr Val Ile Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Val Arg Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Glu Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
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Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Tyr Asp Ala Glu Ser
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly
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Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn
35 40 45
Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys
65 70 75 80
Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala
85 90 95
Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Met Cys Pro Pro Pro Glu Leu Pro Gly
100 105 110
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
115 120 125
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
130 135 140
Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val
145 150 155 160
Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile
165 170 175
Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly
180 185 190
Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
195 200 205
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val
210 215 220
Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser
225 230 235 240
Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu
245 250 255
Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Thr
260 265 270
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val
275 280 285
Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met
290 295 300
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser
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Pro Gly Lys
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Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp
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Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr
20 25 30
Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr
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Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr
50 55 60
Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser
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His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val Val
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Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
100
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly Val
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Gln Cys Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly
20 25 30
Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Ser
35 40 45
Asn Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr
50 55 60
Ile Gly Phe Ile Ala Ala Tyr Gly Asp Thr His Asn Ala Thr Trp Ala
65 70 75 80
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys
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Thr Leu Val Thr Val Ser Glu Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe
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Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp
165 170 175
Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg
180 185 190
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser
195 200 205
Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr
210 215 220
Lys Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Met Cys
225 230 235 240
Pro Pro Pro Glu Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
245 250 255
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
260 265 270
Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp
275 280 285
Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu
290 295 300
Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala
305 310 315 320
His Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn
325 330 335
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly
340 345 350
Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu
355 360 365
Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr
370 375 380
Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp
385 390 395 400
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Thr Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
405 410 415
Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp
420 425 430
Val Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
435 440 445
Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 20
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 12F1 LC aa
<400> 20
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Phe Glu Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser
20 25 30
Val Glu Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Ile Ile Lys Cys Gln Ala Ser
35 40 45
Gln Asn Ile Val Arg Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
50 55 60
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Asp Leu Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser
100 105 110
Tyr Tyr Asp Ala Glu Ser Phe Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val
115 120 125
Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro
130 135 140
Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val Ala
145 150 155 160
Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr
165 170 175
Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala
180 185 190
Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln
195 200 205
Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr
210 215 220
Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
225 230 235
<210> 21
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 12F1 H-CDR3 nt
<400> 21
gccagtacct atggtggtga tggtggttgg tactttaaca tt 42
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 12F1 H-CDR2 nt
<400> 22
attgctgctt atggtgacac a 21
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 12F1 H-CDR1 nt
<400> 23
ggattctccc tgaatagcaa tgca 24
<210> 24
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 12F1 L-CDR3 nt
<400> 24
caaagctatt atgatgctga gagctttaat act 33
<210> 25
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 12F1 L-CDR2 nt
<400> 25
gaagcatcc 9
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 12F1 L-CDR1 nt
<400> 26
cagaacattg tcagatac 18
<210> 27
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 12F1 HFR1 nt
<400> 27
cagtccctgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc 60
tgcaccgtct ct 72
<210> 28
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 12F1 HFR2 nt
<400> 28
atgggctggg tccgccaggc tccagggaag gggctggaat acatcggatt c 51
<210> 29
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 12F1 HFR3 nt
<400> 29
cacaacgcga cctgggcgaa aggccgattc accatctcca aaacctcgac cacggtggat 60
ctgaagatca ccagtccgac aaccgaggac acggccacct atttctgt 108
<210> 30
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 12F1 HFR4 nt
<400> 30
tggggcccag gcaccctggt caccgtctcc gaa 33
<210> 31
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 12F1 LFR1 nt
<400> 31
gcattcgaat tgacccagac tccttcctcc gtggaggcag ctgtgggagg cacagtcatc 60
atcaagtgcc aggccagt 78
<210> 32
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 12F1 LFR2 nt
<400> 32
ttatcctggt atcagcagaa accagggcag cctcccaagc tcctgatcta t 51
<210> 33
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 12F1 LFR3 nt
<400> 33
aatctggcat ctggggtccc atcgcggttc agcggcagtg gatctgggac agaattcact 60
ctcaccatca gcgacctgga gtgtgccgat gctgcgactt actactgc 108
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 12F1 LFR4 nt
<400> 34
ttcggcggag ggaccgaggt ggtggtcaaa 30
<210> 35
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 12F1 VH nt
<400> 35
cagtccctgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc 60
tgcaccgtct ctggattctc cctgaatagc aatgcaatgg gctgggtccg ccaggctcca 120
gggaaggggc tggaatacat cggattcatt gctgcttatg gtgacacaca caacgcgacc 180
tgggcgaaag gccgattcac catctccaaa acctcgacca cggtggatct gaagatcacc 240
agtccgacaa ccgaggacac ggccacctat ttctgtgcca gtacctatgg tggtgatggt 300
ggttggtact ttaacatttg gggcccaggc accctggtca ccgtctccga a 351
<210> 36
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 12F1 VL nt
<400> 36
gcattcgaat tgacccagac tccttcctcc gtggaggcag ctgtgggagg cacagtcatc 60
atcaagtgcc aggccagtca gaacattgtc agatacttat cctggtatca gcagaaacca 120
gggcagcctc ccaagctcct gatctatgaa gcatccaatc tggcatctgg ggtcccatcg 180
cggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcga cctggagtgt 240
gccgatgctg cgacttacta ctgccaaagc tattatgatg ctgagagctt taatactttc 300
ggcggaggga ccgaggtggt ggtcaaa 327
<210> 37
<211> 972
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 12F1 重链恒定区 nt
<400> 37
gggcaaccta aggctccatc agtcttccca ctggccccct gctgcgggga cacacccagc 60
tccacggtga ccctgggctg cctggtcaaa ggctacctcc cggagccagt gaccgtgacc 120
tggaactcgg gcaccctcac caatggggta cgcaccttcc cgtccgtccg gcagtcctca 180
ggcctctact cgctgagcag cgtggtgagc gtgacctcaa gcagccagcc cgtcacctgc 240
aacgtggccc acccagccac caacaccaaa gtggacaaga ccgttgcgcc ctcgacatgc 300
agcaagccca tgtgcccacc ccctgaactc ccggggggac cgtctgtctt catcttcccc 360
ccaaaaccca aggacaccct catgatctca cgcacccccg aggtcacatg cgtggtggtg 420
gacgtgagcc aggatgaccc cgaggtgcag ttcacatggt acataaacaa cgagcaggtg 480
cgcaccgccc ggccgccgct acgggagcag cagttcaaca gcacgatccg cgtggtcagc 540
accctcccca tcgcgcacca ggactggctg aggggcaagg agttcaagtg caaagtccac 600
aacaaggcac tcccggcccc catcgagaaa accatctcca aagccagagg gcagcccctg 660
gagccgaagg tctacaccat gggccctccc cgggaggagc tgagcagcag gtcggtcagc 720
ctgacctgca tgatcaacgg cttctaccct tccgacatct cggtggagtg ggagaagaac 780
gggaaggcag aggacaacta caagaccacg ccgaccgtgc tggacagcga cggctcctac 840
ttcctctaca gcaagctctc agtgcccacg agtgagtggc agcggggcga cgtcttcacc 900
tgctccgtga tgcacgaggc cttgcacaac cactacacgc agaagtccat ctcccgctct 960
ccgggtaaat ag 972
<210> 38
<211> 315
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 12F1 轻链恒定区 nt
<400> 38
ggtgatccag ttgcacctac tgtcctcatc ttcccaccag ctgctgatca ggtggcaact 60
ggaacagtca ccatcgtgtg tgtggcgaat aaatactttc ccgatgtcac cgtcacctgg 120
gaggtggatg gcaccaccca aacaactggc atcgagaaca gtaaaacacc gcagaattct 180
gcagattgta cctacaacct cagcagcact ctgacactga ccagcacaca gtacaacagc 240
cacaaagagt acacctgcaa ggtgacccag ggcacgacct cagtcgtcca gagcttcaat 300
aggggtgact gttag 315
<210> 39
<211> 1380
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 12F1 HC nt
<400> 39
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
tccctggagg agtccggggg tcgcctggtc acgcctggga cacccctgac actcacctgc 120
accgtctctg gattctccct gaatagcaat gcaatgggct gggtccgcca ggctccaggg 180
aaggggctgg aatacatcgg attcattgct gcttatggtg acacacacaa cgcgacctgg 240
gcgaaaggcc gattcaccat ctccaaaacc tcgaccacgg tggatctgaa gatcaccagt 300
ccgacaaccg aggacacggc cacctatttc tgtgccagta cctatggtgg tgatggtggt 360
tggtacttta acatttgggg cccaggcacc ctggtcaccg tctccgaagg gcaacctaag 420
gctccatcag tcttcccact ggccccctgc tgcggggaca cacccagctc cacggtgacc 480
ctgggctgcc tggtcaaagg ctacctcccg gagccagtga ccgtgacctg gaactcgggc 540
accctcacca atggggtacg caccttcccg tccgtccggc agtcctcagg cctctactcg 600
ctgagcagcg tggtgagcgt gacctcaagc agccagcccg tcacctgcaa cgtggcccac 660
ccagccacca acaccaaagt ggacaagacc gttgcgccct cgacatgcag caagcccatg 720
tgcccacccc ctgaactccc ggggggaccg tctgtcttca tcttcccccc aaaacccaag 780
gacaccctca tgatctcacg cacccccgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccag 840
gatgaccccg aggtgcagtt cacatggtac ataaacaacg agcaggtgcg caccgcccgg 900
ccgccgctac gggagcagca gttcaacagc acgatccgcg tggtcagcac cctccccatc 960
gcgcaccagg actggctgag gggcaaggag ttcaagtgca aagtccacaa caaggcactc 1020
ccggccccca tcgagaaaac catctccaaa gccagagggc agcccctgga gccgaaggtc 1080
tacaccatgg gccctccccg ggaggagctg agcagcaggt cggtcagcct gacctgcatg 1140
atcaacggct tctacccttc cgacatctcg gtggagtggg agaagaacgg gaaggcagag 1200
gacaactaca agaccacgcc gaccgtgctg gacagcgacg gctcctactt cctctacagc 1260
aagctctcag tgcccacgag tgagtggcag cggggcgacg tcttcacctg ctccgtgatg 1320
cacgaggcct tgcacaacca ctacacgcag aagtccatct cccgctctcc gggtaaatag 1380
<210> 40
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 12F1 LC nt
<400> 40
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
agatgtgcat tcgaattgac ccagactcct tcctccgtgg aggcagctgt gggaggcaca 120
gtcatcatca agtgccaggc cagtcagaac attgtcagat acttatcctg gtatcagcag 180
aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tatgaagcat ccaatctggc atctggggtc 240
ccatcgcggt tcagcggcag tggatctggg acagaattca ctctcaccat cagcgacctg 300
gagtgtgccg atgctgcgac ttactactgc caaagctatt atgatgctga gagctttaat 360
actttcggcg gagggaccga ggtggtggtc aaaggtgatc cagttgcacc tactgtcctc 420
atcttcccac cagctgctga tcaggtggca actggaacag tcaccatcgt gtgtgtggcg 480
aataaatact ttcccgatgt caccgtcacc tgggaggtgg atggcaccac ccaaacaact 540
ggcatcgaga acagtaaaac accgcagaat tctgcagatt gtacctacaa cctcagcagc 600
actctgacac tgaccagcac acagtacaac agccacaaag agtacacctg caaggtgacc 660
cagggcacga cctcagtcgt ccagagcttc aataggggtg actgttag 708
<210> 41
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 H-CDR3 aa
<400> 41
Ala Arg Trp Asp Val Asp Tyr Trp Ser Tyr Phe Asn Ile
1 5 10
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 H-CDR2 aa
<400> 42
Ile Asp Ser Ser Gly Ser Ala
1 5
<210> 43
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 H-CDR1 aa
<400> 43
Gly Phe Thr Ile Ser Ser Tyr Gly
1 5
<210> 44
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 L-CDR3 aa
<400> 44
Gln Cys Thr Tyr Tyr Glu Gly Gly Tyr Phe Phe Gly
1 5 10
<210> 45
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 L-CDR2 aa
<400> 45
Gly Thr Ser
1
<210> 46
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 L-CDR1 aa
<400> 46
Glu Asn Ile Tyr Asn Gly
1 5
<210> 47
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 HFR1 aa
<400> 47
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Lys Pro Asp Glu Thr
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser
20
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 HFR2 aa
<400> 48
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala
<210> 49
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 HFR3 aa
<400> 49
His Tyr Ala Arg Trp Ala Lys Ser Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr
1 5 10 15
Asn Glu Asn Thr Val Thr Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp
20 25 30
Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
35
<210> 50
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 HFR4 aa
<400> 50
Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 51
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 LFR1 aa
<400> 51
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Asp Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser
20 25
<210> 52
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 LFR2 aa
<400> 52
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 53
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 LFR3 aa
<400> 53
Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Asp Asp Ala Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 54
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 VH aa
<400> 54
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Lys Pro Asp Glu Thr
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Tyr Gly
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ala Ile Asp Ser Ser Gly Ser Ala His Tyr Ala Arg Trp Ala Lys Ser
50 55 60
Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Glu Asn Thr Val Thr Leu Lys
65 70 75 80
Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg
85 90 95
Trp Asp Val Asp Tyr Trp Ser Tyr Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 55
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 VL aa
<400> 55
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Asp Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Asn Gly
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Thr Tyr Tyr Glu Gly Gly
85 90 95
Tyr Phe Phe Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 56
<211> 460
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 HC aa
<400> 56
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Lys Pro
20 25 30
Asp Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Ile Ser
35 40 45
Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu
50 55 60
Trp Ile Gly Ala Ile Asp Ser Ser Gly Ser Ala His Tyr Ala Arg Trp
65 70 75 80
Ala Lys Ser Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Glu Asn Thr Val
85 90 95
Thr Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
100 105 110
Cys Ala Arg Trp Asp Val Asp Tyr Trp Ser Tyr Phe Asn Ile Trp Gly
115 120 125
Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser
130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val
145 150 155 160
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser
180 185 190
Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val
195 200 205
Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr
210 215 220
Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro
225 230 235 240
Met Cys Pro Pro Pro Glu Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe
245 250 255
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
260 265 270
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe
275 280 285
Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu
290 295 300
Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro
305 310 315 320
Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val
325 330 335
His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
340 345 350
Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg
355 360 365
Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly
370 375 380
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala
385 390 395 400
Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Thr Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
405 410 415
Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg
420 425 430
Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
435 440 445
Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 57
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 LC aa
<400> 57
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser
20 25 30
Val Ser Asp Pro Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser
35 40 45
Glu Asn Ile Tyr Asn Gly Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
50 55 60
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Asp Leu Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys
100 105 110
Thr Tyr Tyr Glu Gly Gly Tyr Phe Phe Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu
115 120 125
Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro
130 135 140
Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val
145 150 155 160
Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly
165 170 175
Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser
180 185 190
Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr
195 200 205
Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr
210 215 220
Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
225 230 235
<210> 58
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 H-CDR3 nt
<400> 58
gcgagatggg atgtggacta ttggagctac tttaacatc 39
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 H-CDR2 nt
<400> 59
attgatagta gtggtagcgc a 21
<210> 60
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 H-CDR1 nt
<400> 60
ggattcacca tcagtagcta cggc 24
<210> 61
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 L-CDR3 nt
<400> 61
caatgtactt attatgaagg tggttatttt tttggt 36
<210> 62
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 L-CDR2 nt
<400> 62
ggtacatcc 9
<210> 63
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 L-CDR1 nt
<400> 63
gagaatattt ataatggt 18
<210> 64
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 HFR1 nt
<400> 64
cagtcgctgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcaagcctg acgaaaccct gacactcacc 60
tgcacagtct ct 72
<210> 65
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 HFR2 nt
<400> 65
atgagctggg tccgccaggc tccagggaac gggctggaat ggatcggagc c 51
<210> 66
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 HFR3 nt
<400> 66
cactacgcgc gctgggcgaa aagccgatcc accatcacca gaaacaccaa cgagaacacg 60
gtgactctga aaatgaccag tctgacagcc gcggacacgg ccacctattt ctgt 114
<210> 67
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 HFR4 nt
<400> 67
tggggcccag gcaccctggt caccgtctcc tca 33
<210> 68
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 LFR1 nt
<400> 68
gatgttgtga tgacccagac tccagcctcc gtgtctgacc ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcaagtgcc aggccagt 78
<210> 69
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 LFR2 nt
<400> 69
ttggcctggt atcagcagaa accagggcag cctcccaagc tcctaatcta t 51
<210> 70
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 LFR3 nt
<400> 70
actctggcat ctggggtccc atcgcggttc agcggcagtg gatctgggac acagttcact 60
ctcaccatca gcgacctgga gtgtgacgat gctgccactt actactgt 108
<210> 71
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 LFR4 nt
<400> 71
ttcggcggag ggaccgaggt ggtggtcaag 30
<210> 72
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 VH nt
<400> 72
cagtcgctgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcaagcctg acgaaaccct gacactcacc 60
tgcacagtct ctggattcac catcagtagc tacggcatga gctgggtccg ccaggctcca 120
gggaacgggc tggaatggat cggagccatt gatagtagtg gtagcgcaca ctacgcgcgc 180
tgggcgaaaa gccgatccac catcaccaga aacaccaacg agaacacggt gactctgaaa 240
atgaccagtc tgacagccgc ggacacggcc acctatttct gtgcgagatg ggatgtggac 300
tattggagct actttaacat ctggggccca ggcaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 73
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 VL nt
<400> 73
gatgttgtga tgacccagac tccagcctcc gtgtctgacc ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcaagtgcc aggccagtga gaatatttat aatggtttgg cctggtatca gcagaaacca 120
gggcagcctc ccaagctcct aatctatggt acatccactc tggcatctgg ggtcccatcg 180
cggttcagcg gcagtggatc tgggacacag ttcactctca ccatcagcga cctggagtgt 240
gacgatgctg ccacttacta ctgtcaatgt acttattatg aaggtggtta tttttttggt 300
ttcggcggag ggaccgaggt ggtggtcaag 330
<210> 74
<211> 1383
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 HC nt
<400> 74
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
tcgctggagg agtccggggg tcgcctggtc aagcctgacg aaaccctgac actcacctgc 120
acagtctctg gattcaccat cagtagctac ggcatgagct gggtccgcca ggctccaggg 180
aacgggctgg aatggatcgg agccattgat agtagtggta gcgcacacta cgcgcgctgg 240
gcgaaaagcc gatccaccat caccagaaac accaacgaga acacggtgac tctgaaaatg 300
accagtctga cagccgcgga cacggccacc tatttctgtg cgagatggga tgtggactat 360
tggagctact ttaacatctg gggcccaggc accctggtca ccgtctcctc agggcaacct 420
aaggctccat cagtcttccc actggccccc tgctgcgggg acacacccag ctccacggtg 480
accctgggct gcctggtcaa aggctacctc ccggagccag tgaccgtgac ctggaactcg 540
ggcaccctca ccaatggggt acgcaccttc ccgtccgtcc ggcagtcctc aggcctctac 600
tcgctgagca gcgtggtgag cgtgacctca agcagccagc ccgtcacctg caacgtggcc 660
cacccagcca ccaacaccaa agtggacaag accgttgcgc cctcgacatg cagcaagccc 720
atgtgcccac cccctgaact cccgggggga ccgtctgtct tcatcttccc cccaaaaccc 780
aaggacaccc tcatgatctc acgcaccccc gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 840
caggatgacc ccgaggtgca gttcacatgg tacataaaca acgagcaggt gcgcaccgcc 900
cggccgccgc tacgggagca gcagttcaac agcacgatcc gcgtggtcag caccctcccc 960
atcgcgcacc aggactggct gaggggcaag gagttcaagt gcaaagtcca caacaaggca 1020
ctcccggccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccagag ggcagcccct ggagccgaag 1080
gtctacacca tgggccctcc ccgggaggag ctgagcagca ggtcggtcag cctgacctgc 1140
atgatcaacg gcttctaccc ttccgacatc tcggtggagt gggagaagaa cgggaaggca 1200
gaggacaact acaagaccac gccgaccgtg ctggacagcg acggctccta cttcctctac 1260
agcaagctct cagtgcccac gagtgagtgg cagcggggcg acgtcttcac ctgctccgtg 1320
atgcacgagg ccttgcacaa ccactacacg cagaagtcca tctcccgctc tccgggtaaa 1380
tag 1383
<210> 75
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6G8 LC nt
<400> 75
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
agatgtgatg ttgtgatgac ccagactcca gcctccgtgt ctgaccctgt gggaggcaca 120
gtcaccatca agtgccaggc cagtgagaat atttataatg gtttggcctg gtatcagcag 180
aaaccagggc agcctcccaa gctcctaatc tatggtacat ccactctggc atctggggtc 240
ccatcgcggt tcagcggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagcgacctg 300
gagtgtgacg atgctgccac ttactactgt caatgtactt attatgaagg tggttatttt 360
tttggtttcg gcggagggac cgaggtggtg gtcaagggtg atccagttgc acctactgtc 420
ctcatcttcc caccagctgc tgatcaggtg gcaactggaa cagtcaccat cgtgtgtgtg 480
gcgaataaat actttcccga tgtcaccgtc acctgggagg tggatggcac cacccaaaca 540
actggcatcg agaacagtaa aacaccgcag aattctgcag attgtaccta caacctcagc 600
agcactctga cactgaccag cacacagtac aacagccaca aagagtacac ctgcaaggtg 660
acccagggca cgacctcagt cgtccagagc ttcaataggg gtgactgtta g 711
<210> 76
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> scFv H-CDR3 aa
<400> 76
Ala Arg Asp Arg Gly Asp Thr Ile Leu Asp Val
1 5 10
<210> 77
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> scFv H-CDR2 aa
<400> 77
Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 78
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> scFv H-CDR1 aa
<400> 78
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr
1 5 10
<210> 79
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> scFv L-CDR3 aa
<400> 79
Gln Gln Lys Tyr Asp Leu Leu Thr
1 5
<210> 80
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> scFv L-CDR2 aa
<400> 80
Ala Ala Ser
1
<210> 81
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> scFv L-CDR1 aa
<400> 81
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 82
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> scFv VH aa
<400> 82
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Arg Gly Asp Thr Ile Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 83
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> scFv VL aa
<400> 83
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Lys Tyr Asp Leu Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 84
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> scFv 全长 aa
<400> 84
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Lys Tyr Asp Leu Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser
100 105 110
Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Leu Gln Leu
115 120 125
Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu
130 135 140
Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp
145 150 155 160
Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser
165 170 175
Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg
180 185 190
Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu
195 200 205
Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp
210 215 220
Arg Gly Asp Thr Ile Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235

Claims (11)

1. 一种分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白能够结合抗BCMA的单链抗体（scFv），所述抗BCMA的单链抗体（scFv）包含SEQ ID NO: 84所示的氨基酸序列，所述抗原结合蛋白包含重链可变区（VH），所述抗原结合蛋白的所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述抗原结合蛋白的所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述抗原结合蛋白的所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述抗原结合蛋白的所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；以及所述抗原结合蛋白包含轻链可变区（VL），所述抗原结合蛋白的所述轻链可变区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述抗原结合蛋白的所述LCDR3的氨基酸序列如SEQID NO：4所示，所述抗原结合蛋白的所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，且所述抗原结合蛋白的所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
2. 如权利要求1所述的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白的所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示；以及所述抗原结合蛋白的所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO：16所示。
3.一种多肽，其包含权利要求1-2中任一项所述的抗原结合蛋白。
4.一种核酸分子，其编码权利要求1-2中任一项所述的抗原结合蛋白或权利要求3所述的多肽。
5.一种载体，其包含权利要求4所述的核酸分子。
6.一种免疫缀合物，其包含权利要求1-2中任一项所述的抗原结合蛋白或权利要求3所述的多肽。
7.一种细胞，其包含和/或表达权利要求1-2中任一项所述的抗原结合蛋白、包含和/或表达权利要求3所述的多肽、包含权利要求4所述的核酸分子、包含权利要求5所述的载体或包含权利要求6所述的免疫缀合物。
8.一种药物组合物，其包含权利要求1-2中任一项所述的抗原结合蛋白、权利要求3所述的多肽、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的载体、权利要求6所述的免疫缀合物或权利要求7所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
9.一种试剂盒，其包含权利要求1-2中任一项所述的抗原结合蛋白、权利要求3所述的多肽、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的载体、权利要求6所述的免疫缀合物、权利要求7所述的细胞或权利要求8所述的药物组合物。
10. 一种检测样品中嵌合抗原受体存在和/或含量的方法，包含施用权利要求1-2中任一项所述的抗原结合蛋白、施用权利要求3所述的多肽、施用权利要求4所述的核酸分子、施用权利要求5所述的载体、施用权利要求6所述的免疫缀合物、施用权利要求7所述的细胞、施用权利要求8所述的药物组合物或使用权利要求9所述的试剂盒，所述方法为非疾病诊断目的的方法，所述嵌合抗原受体包含能够靶向BCMA的单链抗体（scFv），且所述靶向BCMA的单链抗体（scFv）包含SEQ ID NO: 84所示的氨基酸序列。
11. 一种权利要求1-2中任一项所述的抗原结合蛋白、权利要求3所述的多肽、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的载体、权利要求6所述的免疫缀合物、权利要求7所述的细胞、或权利要求8所述的药物组合物在制备用于检测样品中包含嵌合抗原受体的细胞的存在和/或含量的试剂盒中的用途，所述嵌合抗原受体包含能够靶向BCMA的单链抗体（scFv），且所述靶向BCMA的单链抗体（scFv）包含SEQ ID NO: 84所示的氨基酸序列。
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