CN108490174A - 检测car的细胞的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测CAR阳性细胞的方法及其应用。具体地，本发明提供了一种用于检测CAR阳性细胞的检测试剂，所述检测试剂包括：(a)第一检测试剂，所述第一检测试剂是第一抗体，所述第一抗体为多克隆抗体，并且所述多克隆抗体特异性结合于CAR的胞外的抗原结合域；和(b)第二检测试剂，所述第二检测试剂特异性结合于第一抗体或偶联于第一抗体的标记物。本发明的检测试剂和方法灵敏度高、特异性好、检测结果更为准确性。

Description

检测CAR的细胞的方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术和医学领域，具体涉及一种检测表达CAR-T的细胞的方法及其应用。
背景技术
随着肿瘤免疫治疗的发展，结合了抗体和免疫细胞优势的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)-T细胞免疫治疗受到极大关注。
CAR主要由细胞膜外抗原结合区和细胞内信号转导区通过铰链区及跨膜区构成。膜外抗原结合区具有特异性识别并结合靶细胞表面抗原的功能，其构成源于单克隆抗体的单链可变区结构域(Single Chain Variable Fragment，scFv)，由重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)组成。细胞内信号转导区主要由共刺激信号和T细胞受体(TCR)的CD3zeta链组成。表达CAR的T细胞(CAR-T)通过scFv与靶细胞抗原结合后，胞内信号转导区将信号传入T细胞，从而激活T细胞，分泌穿孔素、颗粒酶及细胞因子等，发挥杀伤作用。
目前FDA批准上市了两款CAR-T细胞药物，分别是诺华制药(Novartis)的Kymriah，和吉利德公司(Gilead)的Yescarta。两款药物均针对CD19阳性B细胞肿瘤，采用了相同的抗原结合区，即来源于鼠单克隆抗体FMC63的scFv。
构建CAR-T细胞需要将CAR基因通过病毒或非病毒系统转染并整合到T细胞基因组上。当该基因正常表达，在细胞膜上形成跨膜的CAR结构时，CAR-T细胞才具有识别和杀伤靶细胞的活性。因此，准确检测表达CAR的阳性T细胞是CAR-T药物质量控制的关键步骤，也是临床上对病人治疗剂量控制、过程监控及伴随诊断的重要环节。
常见的对于CAR-T细胞进行检测的方法有两种类型：检测CAR基因阳性T细胞和检测CAR蛋白阳性T细胞。
对于检测CAR基因阳性T细胞而言，定量实时聚合酶联反应(Quantitative RealTime PCR,qPCR)是检测CAR基因阳性T细胞的主要方法。通过qPCR可以检测细胞基因组上整合的CAR基因，以及CAR基因的拷贝数。但该方法不能准确反映表达CAR的阳性T细胞，因为有一部分整合了CAR基因的T细胞没有正常表达CAR(Jennifer N.Brudno,et al.,Journal ofClinical Oncology,2016)，这些T细胞带来的假阳性降低了qPCR方法应用的准确性。此外，qPCR方法无法满足对T细胞多种表面标志物(CD3、CD4、CD8等等)同时检测的需求，这进一步限制了qPCR方法的应用。
对于检测CAR蛋白阳性T细胞而言，现有检测试剂包括抗鼠IgG(Fab’)2(JacksonImmunoResearch公司)、Protein L(Zhi li Zheng,et al.,Journal of TranslationalMedicine,2012)、CD19/Fc(Satiro N De Oliveira,et al.,Journal of TranslationalMedicine,2013)、GFP-CD19(专利申请号201610354642.0)、鼠单克隆抗体(Pub.No.:US20170342164A1，克隆号136.20.1)等。然而，现有的这些检测试剂仍具有一些缺点，检测效果难以令人满意。其中，抗鼠IgG(Fab’)2和Protein L检测CD19 CAR的特异性较差，无法区分鼠源不同scFv构建的不同靶点CAR(例如CD22CAR、CD123CAR等)。CD19/Fc和GFP-CD19均依赖于CD19蛋白与CD19 CAR上的scFv部分的结合，由于该scFv与CD19的亲和力显著低于完整抗体(FMC63)与CD19的亲和力(IAN C.Nicholson,et al.,Molecular Immunology,1997)，因此CD19/Fc和GFP-CD19检测CD19 CAR的灵敏度也较低。鼠单克隆抗体(克隆号136.20.1)检测CD19 CAR，依赖于该单抗对CD19 CAR上scFv的结合，由于二者是同一种属(鼠源)，亲和力较低，因此该单抗检测仍存在灵敏度不高的缺陷。
因此，本领域迫切需要开发检测灵敏高、准确性高的CAR阳性细胞检测试剂以及检测方法，以满足CAR-T药物质量控制、临床治疗和伴随诊断的需求。
发明内容
本发明的目的就是提供一种检测灵敏高、准确性高的CAR阳性细胞检测试剂及其应用。
在本发明的第一方面，提供了一种用于检测CAR阳性细胞的检测试剂，所述检测试剂包括：
(a)第一检测试剂，所述第一检测试剂是第一抗体，所述第一抗体为多克隆抗体，并且所述多克隆抗体特异性结合于CAR的胞外的抗原结合域；和
(b)第二检测试剂，所述第二检测试剂特异性结合于第一抗体或偶联于第一抗体的标记物；
并且所述检测试剂的检测灵敏度≥5个CAR阳性细胞/1000个细胞。
在另一优选例中，所述的CAR靶向选自下组的靶点(或特异性结合选自下组的抗原)：SLAMF7、白细胞介素6受体(IL6R)、IL-7/3R、IL7/4/3R、IL4R、IL-13R、IL-11Ra、NY-ESO-1、甲胎蛋白(AFP)、glypican-3(GPC3)、BCMA、BAFF-R、TACI、LeY、CD5、CD10、CD13、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD30、CD33、CD34、CD37、CD38、CD40、CD41、CD47、CD53、CD61、CD64、CD68、CD69、CD72、CD73、CD74、CD75、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD117、CD123、CD135、CD138、CD171、CD179、CD267、CD269、CD276(B7H3)、Flt3受体、CS1、ROR1、c-Met、FcRn2、CXCR4、CXCR5、CXCR7、EGFRvIII、GD-2、MAGE A3、glycolipid F77、PSMA、FLT3、TAG72、PSCA、VEGFR2、SSEA-4、CD44v6、EPCAM、或其组合。
在另一优选例中，所述的CAR靶向CD19。
在另一优选例中，所述CAR为CD19 CAR。
在另一优选例中，所述CAR中的抗原结合域(scFv)为来源于鼠抗体的scFv，较佳地来源于鼠单克隆抗体的scFv。
在另一优选例中，所述CAR中的抗原结合域(scFv)为来源于鼠抗人抗体的scFv，较佳地来源于鼠抗人单克隆抗体的scFv。
在另一优选例中，所述的第一抗体是未经修饰的多克隆抗体。
在另一优选例中，所述的第二检测试剂是特异性针对所述第一抗体的第二抗体。
在另一优选例中，所述的第一抗体是生物素化的多克隆抗体，而且所述的第二检测试剂是生物素特异结合的亲和素avidin或者链霉亲和素streptavidin。
在另一优选例中，所述检测试剂的检测灵敏度≥2个CAR阳性细胞/1000个细胞，更佳地≥1个CAR阳性细胞/1000个细胞。
在另一优选例中，所述的多克隆抗体为兔源多克隆抗体。
在另一优选例中，所述第一抗体和第二抗体来自不同的哺乳动物物种。
在另一优选例中，所述的第一抗体是兔源，而第二抗体是驴源或羊源的。
在另一优选例中，所述的CAR阳性细胞包括CAR免疫细胞和CAR非免疫细胞。
在另一优选例中，所述的CAR阳性细胞选自下组：T细胞、NK细胞、CIK细胞、NKT细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述的CAR阳性细胞包括：HEK-293T细胞、Jurkat细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述的多克隆抗体还具有以下一种或多种特征：
(i)与CD19 CAR scFv重组蛋白的结合的效价为1:1000-1:20000，较佳地1：2000-1：10000；
(ii)与CD19 CAR scFv重组蛋白的亲和力解离常数为10-10-10-12M，
在另一优选例中，所述的多克隆抗体特异性识别和结合于基于抗CD19单克隆抗体FMC63的scFv构建的CD19 CAR。
在另一优选例中，所述的CD19 CAR的胞外的抗原结合域具有SEQ ID No.:1所示的氨基酸序列：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID No.:1)
在另一优选例中，所述的CD19 CAR scFv重组蛋白具有CD19 CAR scFv-His tag结构。
在另一优选例中，所述的CD19 CAR scFv重组蛋白具有SEQ ID No.:2所述的氨基酸序列：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSHHHHHH(SEQ ID No.:2)。
在另一优选例中，所述的多克隆抗体通过以下方法制备：
(a)提供CD19 CAR scFv重组蛋白；和
(b)用所述的重组蛋白免疫兔，从而获得针对所述CD19 CAR scFv重组蛋白的抗血清(即多克隆抗体)。
在另一优选例中，所述的CD19 CAR scFv重组蛋白具有SEQ ID No.:2所述的氨基酸序列：
在另一优选例中，所述CD19 CAR scFv重组蛋白包括真核表达或原核表达的重组蛋白。
在另一优选例中，所述的CD19 CAR scFv重组蛋白是大肠杆菌表达的重组蛋白。
在另一优选例中，所述的CD19 CAR scFv重组蛋白是经过复性处理的。
在另一优选例中，所述的CD19 CAR scFv重组蛋白是真核表达的。
在另一优选例中，所述的CD19 CAR scFv重组蛋白是通过以下方法制备获得：
(s1)提供一表达质粒，所述表达质粒含有CD19 CAR scFv重组蛋白的表达盒；
(s2)用所述表达质粒转染真核宿主细胞，从而获得经转染的真核宿主细胞；
(s3)在适合表达的条件下，培养所述经转染的真核宿主细胞，从而表达所述重组蛋白；和
(s4)从所述培养体系中分离所述的重组蛋白。
在另一优选例中，所述的表达包括分泌型表达(即分泌到细胞培养液)。
在另一优选例中，所述的真核宿主细胞选自下组：HEK-293T细胞、CHO细胞、COS-1细胞、COS-7细胞。
在本发明的第二方面，提供了一种制备第一抗体的方法，所述第一抗体为多克隆抗体，并且所述多克隆抗体特异性结合于CD19 CAR的胞外的抗原结合域；
所述方法包括以下步骤：
(a)提供CD19 CAR scFv重组蛋白；和
(b)用所述的重组蛋白免疫兔，从而获得针对所述CD19 CAR scFv重组蛋白的抗血清(即多克隆抗体)。
在另一优选例中，所述的CD19 CAR scFv重组蛋白具有SEQ ID No.:1或2所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述方法还包括任选的步骤
(c)将(b)中获得的多克隆抗体进行分离和/或纯化；和
(d)任选地对所述经分离和/或纯化的多克隆抗体进行性能测定。
在另一优选例中，所述的性能测定包括选自下组的一种或多种检测：
(i)特异性检测；
(ii)效价检测；
(iii)灵敏度检测。
在本发明的第三方面，提供了一种CAR检测试剂盒，所述检测试剂盒：
(t1)第一容器，以及位于所述第一容器内的第一抗体，所述第一抗体为多克隆抗体，并且所述多克隆抗体特异性结合于CAR的胞外的抗原结合域；和
(t2)第二容器，以及位于所述第二容器的特异性针对所述多克隆抗体的第二抗体；以及
(t0)说明书。
在另一优选例中，所述的第二抗体是抗兔IgG的抗体。
在另一优选例中，所述的第二抗体选自下组：驴抗兔IgG的抗体、羊抗兔IgG的抗体。
在另一优选例中，所述的第二抗体带有可检测标记。
在另一优选例中，所述的可检测标记包括荧光。
在另一优选例中，所述的第二抗体是荧光标记的二抗。
在另一优选例中，所述检测试剂盒还包括含有一种或多种选自下组的额外的检测试剂：
(t3)第三容器，以及位于所述第三容器内的封闭剂；
(t4)第四容器，以及位于所述第四容器内的阳性对照(如CD19 CAR scFv重组蛋白)；和
(t5)第五容器，以及位于所述第五容器内的阴性对照试剂。
在另一优选例中，所述的额外的检测试剂位于相同或不同的容器中。
在另一优选例中，所述的说明书记载了检测CD19 CAR阳性细胞的方法。
在本发明的第四方面，提供了一种如权利要求1所述的检测试剂的用途，用于制备检测CAR阳性细胞的试剂或试剂盒。
在另一优选例中，所述的CAR阳性细胞包括CAR免疫细胞和CAR非免疫细胞。
在另一优选例中，所述的CAR阳性细胞选自下组：T细胞、NK细胞、CIK细胞、NKT细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述的CAR阳性细胞包括：HEK-293T细胞、Jurkat细胞、或其组合。
在本发明的第五方面，提供了一种检测CAR阳性细胞的方法，包括步骤：
(I)提供权利要求1所述的检测试剂；
(II)用所述的检测试剂对待检测的细胞群进行检测，从而获得CAR阳性细胞的定性或定量检测结果。
在另一优选例中，所述的方法包括步骤：
(1)取0.5×105-5×105待测细胞，用含封闭剂的缓冲液(如PBS，含1％封闭剂)洗涤1-3次；
(2)用50-200μl含封闭剂以及第一抗体(多克隆抗体)的缓冲液(如PBS，含1％封闭剂，以及0.5-2％所述多克隆抗体如R19mcar)重悬细胞，并在2-15℃(较佳地4±2℃下放置一段时间T1(如20-90分钟，较佳地约30-60min)；
(3)用缓冲液(如PBS)洗涤细胞1-3次；
(4)用50-200μl含带有可检测标记物(如荧光基团)的第二抗体的缓冲液(PBS，含0.5-2％二抗)重悬细胞，并在2-15℃(较佳地4±2℃下放置一段时间T2(如10-60分钟，较佳地约20-40min)
(5)用缓冲液(如PBS)洗涤细胞1-3次；
(6)用一定量(如100-500μl)缓冲液(如PBS)重悬细胞，并在流式细胞仪上机进行检测。
在另一优选例中，所述方法为体外检测方法。
在另一优选例中，所述方法是非诊断性和非治疗性方法。
在另一优选例中，所述方法是质控方法。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明兔抗血清检测CD19 CAR-T细胞的结果。
图2显示了本发明兔抗血清的效价检测结果。
图3显示了用本发明兔抗血清R19mcar及其他试剂对CD19 CAR-T细胞的检测结果比较。
图4显示了用本发明兔抗血清R19mcar检测CD19 CAR-T的结果，其中与现有的鼠单抗136.20.1的检测结果进行了比较。A-采用对照的鼠单抗136.20.1检测CAR-T细胞；B-用本发明的R19mcar检测CAR-T细胞；C-鼠单抗检测CAR-T细胞；D-用本发明的R19mcar检测CAR-T细胞。
图5显示了用本发明兔抗血清R19mcar检测CD19 CAR-T的结果，其中与CD19/Fc的数据以及鼠单抗136.20.1数据进行了比较。
图6显示了采用不同试剂对CD19 CAR-T和CD22CAR-T进行检测的结果比较。
图7显示了免疫荧光检测CD19 CAR阳性细胞的结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，首次意外地开发了一种对CAR-T细胞的检测灵敏度高、准确性好且特异性好的检测试剂。本发明的检测试剂是基于优化的、具有特定的正确构型的重组抗原而制备的兔多抗。实验结果表明，基于本发明检测试剂的检测方法，不仅可直接针对CAR-T细胞上的胞外抗原结合区，而且检测灵敏度远高于目前现有的各类检测试剂，此外，本发明的检测试剂对于阳性CAR-T细胞和阴性CAR-T细胞的区分度非常高，检测结果更为准确。在此基础上完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“本发明第一抗体”、“本发明多克隆抗体”、“本发明多抗”、“本发明抗血清”、“本发明兔抗血清”等可互换使用，指采用本发明的经优化的具有特定的正确构型的重组抗原，对兔进行免疫而制备的与所述重组抗原特异性结合的兔抗血清(即兔多抗)。在本发明中，所述重组抗原对应于CAR结构中的胞外抗原结合区。例如，当针对CD19CAR-T细胞进行检测时，一种典型的重组抗原是FMC63 scFv。
如本文所用，术语“多克隆抗体”，是指包含不同的抗体分子的组合物，这些抗体分子能够结合到相同或不同抗原上的多种不同的特异性抗原决定簇或与之反应。
如本文所用，术语“CAR”是指嵌合抗原受体，包括胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子。
如本文所用，“单链可变区片段(scFv)”是指源自抗体的单链多肽，其保留了结合抗原的能力。scFv的实例包括通过重组DNA技术形成的抗体多肽，其中免疫球蛋白重链(H链)和轻链(L链)片段的Fv区经由间隔序列连接。
本发明多抗
本发明的检测试剂的一个重要特征是第一抗体，所述第一抗体为多克隆抗体，并且所述多克隆抗体特异性结合于CD19 CAR的胞外的抗原结合域。
当本发明的第一抗体与相应的第二抗体(所述的第二抗体是特异性针对所述第一抗体)联用时，不仅可以特异性地进行检测，而且检测灵敏度可高达≥1个CD19 CAR阳性细胞/1000个细胞。
在另一优选例中，所述的多克隆抗体为兔源多克隆抗体。
在另一优选例中，所述第一抗体和第二抗体来自不同的哺乳动物物种。
在另一优选例中，所述的第一抗体是兔源，而第二抗体是驴源或羊源的。
在另一优选例中，所述的多克隆抗体还具有以下一种或多种特征：
(i)与CD19 CAR scFv重组蛋白的结合的效价为1:1000-1:20000，较佳地1：2000-1：10000；
(ii)与CD19 CAR scFv重组蛋白的亲和力解离常数为10-10-10-12M，
试剂盒
本发明还提供了一种用于检测CD19 CAR检测试剂盒，所述检测试剂盒：
(t1)第一容器，以及位于所述第一容器内的第一抗体，所述第一抗体为多克隆抗体，并且所述多克隆抗体特异性结合于CD19 CAR的胞外的抗原结合域；和
(t2)第二容器，以及位于所述第二容器的特异性针对所述多克隆抗体的第二抗体；以及
(t0)说明书。
在另一优选例中，所述的第二抗体是抗兔IgG的抗体。
在另一优选例中，所述的第二抗体选自下组：驴抗兔IgG的抗体、羊抗兔IgG的抗体。
在另一优选例中，所述的第二抗体带有可检测标记。
在另一优选例中，所述的可检测标记包括荧光。
在另一优选例中，所述的第二抗体是荧光标记的二抗。
在另一优选例中，所述检测试剂盒还包括含有一种或多种选自下组的额外的检测试剂：
(t3)第三容器，以及位于所述第三容器内的封闭剂；
(t4)第四容器，以及位于所述第四容器内的阳性对照(如CD19 CAR scFv重组蛋白)；和
(t5)第五容器，以及位于所述第五容器内的阴性对照试剂。
在另一优选例中，所述的额外的检测试剂位于相同或不同的容器中。
在另一优选例中，所述的说明书记载了检测CD19 CAR阳性细胞的方法。
检测方法
本发明还提供了一种基于本发明多抗，对CAR阳性细胞进行检测的方法。由于本发明的多抗对于相匹配或相应的CAR的抗原结合区有高亲和力和高特异性，因此本发明的多抗可用于高效、灵敏而准确地检测CAR阳性细胞。
对于可用本发明方法检测的CAR阳性细胞，代表性的例子包括(但并不限于)：T细胞、NK细胞、NKT细胞、CIK细胞等多种不同细胞。例如，以本发明针对FMC63 scFv的兔多克隆抗体(R19mcar)为例，可以用于相应的CD19 CAR阳性细胞的检测(包括T、NK、NKT或CIK细胞)。
本发明的检测方法，可用于科研、细胞药品研发、细胞药品质量控制，细胞药品临床治疗监测、临床病人伴随诊断等方面。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明兔抗体的亲和力(解离常数Kd在10-10-10-12M水平)相对于鼠单抗(Kd在10-9-10-10M水平)，可提高10-1000倍，因此基于本发明多抗开发的CAR阳性细胞的检测试剂盒，检测灵敏度高、特异性好。
(b)本发明的检测试剂和方法对于CAR阳性细胞和CAR阴性细胞的区分度非常高，检测结果更为准确性。
(c)本发明多抗对于鼠源的scFv具有更高的亲和力(显著优于鼠源单抗)。
(d)本发明的兔多抗检测试剂，相比抗鼠IgG(Fab’)2、Protein L、CD19/Fc、GFP-CD19、鼠单克隆抗体等现有检测试剂，能更特异、更灵敏、更高效地检测CD19 CAR阳性细胞。
(e)本发明兔多抗以及试剂盒的生产成本显著降低，因此应用于CAR-T药物质量控制以及临床治疗和伴随诊断更有优势。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
通用方法
1.T细胞的激活及CD19 CAR慢病毒感染
(1)取0.5x106T细胞(0.5×106/ml)，置于24孔板中；
(2)按说明书指导将包被抗CD3/CD28的磁珠用R10培养液洗3次；
(3)将磁珠按3：1(磁珠：细胞)比例加入T细胞，放置37℃、5％C02培养箱中培养过夜；
(4)T细胞激活12-24小时后，离心24孔板，去掉800μl上清培养液；
(5)在室温下融化慢病毒颗粒，轻轻混匀，将1ml慢病毒颗粒加入0.5×106T细胞(200μl)中，加入polybrene至终浓度8μg/ml，置离心机中2500转，1.5小时，离心结束后，放置37℃、5％C02培养箱中培养过夜；
(6)离心过夜培养的24孔板，去掉大部分含慢病毒颗粒的上清培养液，加入新鲜的R10培养液，扩增T细胞；
(7)每2天计数T细胞，加入IL-2 50IU/ml，维持T细胞在0.5-1×106/ml；
(8)3-5天后，取2×105细胞，通过流式细胞仪检测CD19 CAR-T细胞。
2.流式细胞仪检测CD19 CAR-T细胞
(1)取2×105CD19 CAR慢病毒感染的T细胞，用PBS洗2次，用100μl PBS重悬细胞；
(2)加入相应稀释比例的检测抗体(或其他检测试剂)，4℃，放置45min；
(3)PBS洗2次；
(4)加入荧光二抗，4℃，避光放置30min；
(5)PBS洗2次；
(6)300μl PBS重悬，流式细胞仪上机检测。
实施例1.
FMC63scFv兔多克隆抗体(R19mcar)的制备方法
1.重组抗原的制备和纯化
构建含CD19 CAR scFv-His tag重组抗原序列(氨基酸序列如SEQ ID No.:2所示)的表达质粒，转染HEK-293T细胞。重组抗原经HEK-293T细胞表达并分泌到细胞培养液中，进而利用Ni亲和层析柱纯化这个蛋白。
(1)将HEK-293T细胞贴壁培养于10cm培养皿中，37℃，5％CO2培养过夜。
(2)依据Lipofectamine 2000说明书，将含CD19 CAR scFv-His tag重组抗原序列的表达质粒，转染HEK-293T细胞。
(3)转染后第六天收获培养液，离心去细胞，获得上清液。
(4)依据QIAGEN公司Ni-NTA Superflow说明书，纯化上清液中的抗原蛋白。
2.多抗的制备
用纯化的重组蛋白作为抗原，免疫兔子，方法如下：
(1)将0.5ml的佛氏完全佐剂与的0.5ml抗原(200μg)充分混匀。
(2)1只兔子免疫4个部位(背部和大腿根部均可)，每个部位250ul。
(3)免疫周期为20天，免疫完后7-10天取血检测抗血清效价，总共免疫4-5次。
3.多抗的纯化
通过proteinA从兔血清中分离纯化兔多抗。方法如下：
(1)样品制备：将3ml兔抗血清离心后取上清，并用4倍体积平衡缓冲液(20mMNa2HPO4，0.15M NaCl，pH 7.0)进行稀释处理；
(2)装柱操作：充分摇匀以重悬树脂(Protein-A介质)，吸取3ml浆液至新的层析柱中，层析柱中预先加入3ml平衡缓冲液，让树脂自然沉降，流出平衡缓冲液，加入10ml平衡缓冲液至层析柱中平衡树脂，按约1ml/min的流速流出平衡缓冲液；
(3)层析纯化：将样品按照约1ml/min的流速上样至层析柱中，收集流出液，用于后续测定树脂的结合能力。用20ml的平衡缓冲液洗涤树脂，流速维持约2ml/min。用10ml洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸，pH 3.0)洗脱抗体，流速维持约1ml/min，收集含有目的免疫球蛋白的洗脱液，并立刻加入1/10洗脱缓冲液体积的中和缓冲液(1M Tris，pH 8.5)，调节pH至7.4。用超滤管浓缩至1-1.5ml后用分光光度计进行检测。
结果：
(1)经纯化后，重组抗原浓度为0.1-3.0mg/ml
(2)在4只经免疫的兔子中，有3只产生了高效价的抗血清，取效价最高的抗血清(命名为：R19mcar)用于后续实验。
(3)经纯化后，抗体浓度为0.1-2.0mg/ml
实施例2.
抗血清检测CD19 CAR-T细胞
在本实施例中，采用实施例1制备的兔多克隆抗体，通过流式细胞仪法，对CD19CAR-T细胞进行检测。
在流式检测中，检测抗体为抗血清(稀释比例见图1所示)，荧光二抗为驴抗兔二抗(Alexa Fluor 488荧光标记)。
结果表明，用相同抗原免疫兔(4只)和小鼠(6只)，完成免疫后，取动物血清进行检测。4只免疫兔中，3只成功产生特异性抗体，兔血清按1：1000稀释使用，可正常检测CD19CAR阳性T细胞。
与兔的免疫结果相反，6只免疫小鼠都没有产生特异性抗体，鼠血清无法检测CD19CAR阳性T细胞。
上述结果说明，对于实施例1.1中所制备的重组抗原，可以高效地在兔中产生特异性的针对CD19 CAR抗体。
另外，取效价最高的抗血清(命名为：R19mcar)用于后续实验。
实施例3.
兔抗血清效价检测
流式检测方法同实施例2，其中检测抗体为抗血清R19mcar的梯度稀释液(稀释比例见图2)，荧光二抗为驴抗兔二抗(Alexa Fluor 488荧光标记)。
结果如图2所示。本发明的阳性兔抗血清的1：100到1：5000稀释液，均可正常检测CD19 CAR阳性T细胞，说明效价达至少≥1：5000。
实施例4.
不同检测试剂对CD19 CAR-T细胞的检测
在本实施例中，采用不同的检测，对CD19 CAR-T细胞进行检测。该CD19 CAR-T细胞群含有CAR阳性T细胞。
流式检测方法同实施例2，其中使用的检测抗体(试剂)分别为本发明的抗血清R19mcar、Rabbit anti mouse(Fab’)2(Alexa Fluor 488荧光标记)、Goat anti mouse(Fab’)2(Alexa Fluor 488荧光标记)、GFP-CD19、Protein L(biotin标记)。R19mcar对应的荧光二抗为驴抗兔二抗(Alexa Fluor 488荧光标记)，Protein L(biotin标记)对应试剂为FITC-Streptavidin。
结果如图3所示，其中，
(a)采用本发明的抗血清R19car时，CD19 CAR-T阳性细胞与阴性细胞分群明显(在流式细胞图中，阳性细胞群以虚线圈出)。
(b)与此相反，其他试剂均无法清晰区分开阳性和阴性细胞。
因此，就检测准确性和信号强度而言，R19mcar远远优于Rabbit anti mouse(Fab’)2、Goat anti mouse(Fab’)2、GFP-CD19、Protein L等检测试剂。
由于本发明抗血清的具有高准确性，且能够明显区分CAR阳性和阴性细胞，因此可以方便而准确地统计CD19 CAR阳性T细胞，这对于药物质控、临床治疗十分重要。
实施例5.
R19mcar检测CD19 CAR-T细胞
流式检测方法同实施例2，其中检测抗体为R19mcar，荧光二抗为驴抗兔二抗(Alexa Fluor 488荧光标记)。与鼠单抗136.20.1相比，R19mcar检测CD19 CAR-T的阳性和阴性细胞分群更清晰。
如图4A所示，采用对照的鼠单抗136.20.1检测CAR-T细胞时，阳性信号与阴性信号部分重叠(框)。
如图4B所示，当用本发明的R19mcar检测CAR-T细胞时，阳性信号与阴性信号完全分开(框)。
如图4C所示，鼠单抗检测CAR-T细胞时，不论CD4阳性还是CD8阳性CAR-T，都无法与阴性T细胞完全分开(框)。
如图4D所示，当用本发明的R19mcar检测CAR-T细胞时，阳性信号与阴性信号完全分开(框)。
因此，就检测准确性和信号强度而言，本发明的多抗R19mcar远远优于鼠单抗136.20.1。
此外，配合特异性针对CD4和/或CD8的检测方法，本发明方法可以进一步有效区分CAR阳性的CD4阳性T细胞和CD8阳性T细胞二个亚群。
实施例6.
R19mcar与其他试剂比较检测灵敏度分析
在本实施例中，用于检测的CD19 CAR-T细胞用阴性T细胞按相应比例稀释。流式检测方法同实施例2，其中检测抗体为R19mcar，荧光二抗为驴抗兔二抗(Alexa Fluor 488荧光标记)。
结果如图5所示。当R19mcar检测稀释比例到1/1024时，CD19 CAR阳性T细胞百分比为0.15％(原始未稀释时为57.0％)。
鼠单抗136.20.1检测稀释比例到1/1000时，CD19 CAR阳性T细胞百分比为0.300％(原始未稀释时为87.2％)，二者在1/1000稀释比例条件下，灵敏度相当。
此外，已有文献报道，CD19/Fc(文中编号为AF488-CD19sIg1-4)可以检测到0.5％CAR-T阳性细胞，对应的最高稀释比例为1/128。
因此，就检测灵敏度而言，R19mcar优于鼠单抗136.20.1，更远远优于CD19/Fc。
实施例7.
R19mcar与Protein L比较检测特异性
流式检测方法同实施例2，其中检测抗体(试剂)分别为R19mcar和Protein L(biotin标记)。R19mcar对应的荧光二抗为驴抗兔二抗(Alexa Fluor 488荧光标记)，Protein L(biotin标记)对应试剂为FITC-Streptavidin。
目前临床在研包括靶向CD22在内的多种CAR-T，并开展多种CAR-T续灌治疗和双靶向CAR-T开发。准确检测和区分不同CAR-T对于药物研发、质控、临床治疗十分重要。
如图6所示，R19mcar可以特异性检测CD19 CAR-T，不识别CD22CAR-T(实线框)；而Protein L识别两种CAR-T，检测信号相似(虚线框)，检测无特异性。因此，在检测特异性上，R19mcar优于Protein L，以及和Protein L机理类似、无CAR-T靶点特异性的检测试剂(抗鼠IgG(Fab’)2)。
实施例8.
R19mcar检测CD19 CAR-T细胞
在本实施例中，采用实施例1制备的兔多克隆抗体，通过免疫荧光法，对CD19 CAR-T细胞进行检测。方法如下：
(1)室温下用4％甲醛固定细胞20分钟，方法是将甲醛直接加入培养基中并调整细胞至1×106/ml；
(2)将1mL细胞溶液加入到1.5ml微量离心管中，在微型离心机中离心30秒；
(3)倒出上清液并将细胞沉淀重悬于1ml PBS中，离心倒出上清液，并将细胞沉淀重悬于200μl PBS中；
(4)将5μL细胞悬液加入涂有明胶的载玻片，并用移液管尖端涂抹；
(5)将玻片置于热板上(低热)，并使液体慢慢蒸发，使用屏障笔用疏水性屏障环绕细胞斑点并风干；
(6)在400μL洗涤缓冲液(含0.1％BSA的PBS)中洗涤含有固定细胞的载玻片两次；
(7)加入400μL封闭缓冲液(含10％驴血清的PBS)阻断非特异性染色，在室温下孵育35分钟，弃去封闭缓冲液；
(8)在稀释缓冲液(含1％BSA、1％驴血清的PBS)中按1：100稀释R19mcar抗体，在室温下孵育1小时；
(9)在400μL洗涤缓冲液中洗涤两次；
(10)在稀释缓冲液中按照1：1000稀释Alexa488山羊抗兔Ig(H+L)二抗，在室温下避光孵育1小时；
(11)用400μL洗涤缓冲液冲洗两次；
(12)每孔加入300μL稀释的DAPI溶液(1：1000)，并在室温下孵育2-5分钟；
(13)用PBS冲洗一次，用水冲洗一次；
(14)小心吸除水分，将1滴防淬灭封片剂滴在显微镜载玻片上，并使用适当尺寸的盖玻片；
(15)荧光显微镜观察。
用不带GFP标签的CD19 CAR慢病毒感染Jurkat细胞，获得CD19 CAR-Jurkat。免疫荧光结果如图7所示(左图，CD19 CAR-Jurkat；右图，Jurkat)，R19mcar可清晰染出阳性细胞，膜上绿色信号代表CD19 CAR在细胞膜上正常展示。未感染CD19 CAR慢病毒的Jurkat细胞则无绿色荧光信号。
实施例9
一种使用R19mcar的CD19 CAR阳性细胞流式检测试剂盒
制备一试剂盒，它包括以下试剂：
(a)第一容器以及位于所述第一容器中的R19mcar；
(b)第二容器以及位于所述第二容器中的荧光二抗(其中，荧光可选用FITC、PE、Alexa Fluor 488等不同的荧光)；
(c)第三容器以及位于所述第三容器中的NC(阴性对照试剂)；和
(d)第四容器以及位于所述第三容器中的封闭剂。
该试剂盒使用方法如下：
(1)取2×105待测细胞，用PBS(含1％封闭剂)洗2次；
(2)用100μl PBS(含1％封闭剂、1％R19mcar)重悬细胞，4℃，放置45min；
(3)PBS洗2次；
(4)用100μl PBS(含1％荧光二抗)重悬细胞，4℃，避光放置30min；
(5)PBS洗2次；
(6)300μl PBS重悬，流式细胞仪上机检测。
用所述试剂盒对CD19 CAR-T细胞进行检测，结果表明，该试剂盒具有灵敏度高、特异性好的效果。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海尚珞生物医药科技有限公司
<120> 检测CAR的细胞的方法及其应用
<130> P2018-0730
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln
195 200 205
Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
210 215 220
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 2
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln
195 200 205
Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
210 215 220
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser His His His His His His
245

Claims (10)

1.一种用于检测CAR阳性细胞的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括：
(a)第一检测试剂，所述第一检测试剂是第一抗体，所述第一抗体为多克隆抗体，并且所述多克隆抗体特异性结合于CAR的胞外的抗原结合域；和
(b)第二检测试剂，所述第二检测试剂特异性结合于第一抗体或偶联于第一抗体的标记物；
并且所述检测试剂的检测灵敏度≥5个CAR阳性细胞/1000个细胞。
2.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述的CAR靶向选自下组的靶点：SLAMF7、白细胞介素6受体(IL6R)、IL-7/3R、IL7/4/3R、IL4R、IL-13R、IL-11Ra、NY-ESO-1、甲胎蛋白(AFP)、glypican-3(GPC3)、BCMA、BAFF-R、TACI、LeY、CD5、CD10、CD13、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD30、CD33、CD34、CD37、CD38、CD40、CD41、CD47、CD53、CD61、CD64、CD68、CD69、CD72、CD73、CD74、CD75、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD117、CD123、CD135、CD138、CD171、CD179、CD267、CD269、CD276(B7H3)、Flt3受体、CS1、ROR1、c-Met、FcRn2、CXCR4、CXCR5、CXCR7、EGFRvIII、GD-2、MAGE A3、glycolipid F77、PSMA、FLT3、TAG72、PSCA、VEGFR2、SSEA-4、CD44v6、EPCAM、或其组合。
3.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述的多克隆抗体为兔源多克隆抗体。
4.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述的CAR的胞外的抗原结合域具有SEQID No.:1所示的氨基酸序列。
5.一种制备第一抗体的方法，其特征在于，所述第一抗体为多克隆抗体，并且所述多克隆抗体特异性结合于CAR的胞外的抗原结合域；
所述方法包括以下步骤：
(a)提供CAR scFv重组蛋白；和
(b)用所述的重组蛋白免疫兔，从而获得针对所述CAR scFv重组蛋白的抗血清(即多克隆抗体)。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的CAR靶向选自下组的靶点：SLAMF7、白细胞介素6受体(IL6R)、IL-7/3R、IL7/4/3R、IL4R、IL-13R、IL-11Ra、NY-ESO-1、甲胎蛋白(AFP)、glypican-3(GPC3)、BCMA、BAFF-R、TACI、LeY、CD5、CD10、CD13、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD30、CD33、CD34、CD37、CD38、CD40、CD41、CD47、CD53、CD61、CD64、CD68、CD69、CD72、CD73、CD74、CD75、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD117、CD123、CD135、CD138、CD171、CD179、CD267、CD269、CD276(B7H3)、Flt3受体、CS1、ROR1、c-Met、FcRn2、CXCR4、CXCR5、CXCR7、EGFRvIII、GD-2、MAGE A3、glycolipid F77、PSMA、FLT3、TAG72、PSCA、VEGFR2、SSEA-4、CD44v6、EPCAM、或其组合。
7.一种CAR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒：
(t1)第一容器，以及位于所述第一容器内的第一抗体，所述第一抗体为多克隆抗体，并且所述多克隆抗体特异性结合于CAR的胞外的抗原结合域；和
(t2)第二容器，以及位于所述第二容器的特异性针对所述多克隆抗体的第二抗体；以及
(t0)说明书。
8.如权利要求7所述的CAR检测试剂盒，其特征在于，所述的CAR靶向选自下组的靶点：SLAMF7、白细胞介素6受体(IL6R)、IL-7/3R、IL7/4/3R、IL4R、IL-13R、IL-11Ra、NY-ESO-1、甲胎蛋白(AFP)、glypican-3(GPC3)、BCMA、BAFF-R、TACI、LeY、CD5、CD10、CD13、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD30、CD33、CD34、CD37、CD38、CD40、CD41、CD47、CD53、CD61、CD64、CD68、CD69、CD72、CD73、CD74、CD75、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD117、CD123、CD135、CD138、CD171、CD179、CD267、CD269、CD276(B7H3)、Flt3受体、CS1、ROR1、c-Met、FcRn2、CXCR4、CXCR5、CXCR7、EGFRvIII、GD-2、MAGE A3、glycolipid F77、PSMA、FLT3、TAG72、PSCA、VEGFR2、SSEA-4、CD44v6、EPCAM、或其组合。
9.如权利要求1所述的检测试剂的用途，其特征在于，用于制备检测CAR阳性细胞的试剂或试剂盒。
10.一种检测CAR阳性细胞的方法，其特征在于，包括步骤：
(I)提供权利要求1所述的检测试剂；
(II)用所述的检测试剂对待检测的细胞群进行检测，从而获得CAR阳性细胞的定性或定量检测结果。
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