CN116990507A - 一种用于猴痘病毒感染的早期筛查的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种能够特异结合受试者样本中EEV和IEV中的至少一种状态的猴痘病毒的试剂在制备用于猴痘病毒感染的早期筛查的试剂盒中的应用。进一步的，所述受试者指未出现明显表皮症状的个体。本发明所提供的能够结合至少一种状态猴痘病毒的试剂，应用于制备猴痘病毒感染的早期筛查的试剂盒中具有更高的准确性和灵敏度。

Description

一种用于猴痘病毒感染的早期筛查的方法
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂领域，具体而言，本发明涉及了一种猴痘病毒检测试剂及包含该试剂的试剂盒及应用。
背景技术
猴痘是一种由猴痘病毒（MPV）引起的人畜共患的病毒性传染病，传染性较强，在人类之间也可以进行二次传播，主要表现为发热、皮疹和淋巴结肿大，并可能导致一系列并发症，严重病例甚至会导致死亡。2022年7月23日，世界卫生组织针对猴痘感染情况，发出全球突发公共卫生事件最高级别警报，认为在75个国家和地区传播的猴痘疫情已构成“国际关注的突发公共卫生事件”，这也意味着猴痘疫情对人类健康和社会稳定带来了很大的挑战。
猴痘的潜伏期（从感染到出现症状的间隔）长，为5-21天，多为6-13天，感染可分为两个阶段：发病期和皮肤出疹期。病毒潜伏期间所表现出的临床症状不典型，常表现为：发热、头痛、淋巴结肿大、背痛、肌肉疼痛以及精神不振等，且在发病后的1-3天才会出现皮疹，这就使得猴痘病毒具有很强的潜在传染隐患，因此，在病毒侵入机体初期能够检出就显得尤为重要。
猴痘病毒是一种包膜双链DNA病毒，属于痘病毒科的正痘病毒属，与猴痘病毒同属的常见病毒还包括：天花病毒（VAR）、牛痘病毒（CPV）以及痘苗病毒（VAC）。痘病毒存在两种形式：成熟病毒粒子（MV）和细胞外包膜病毒粒子（EV），其中EV是在MV基础上包绕一层源于内质网膜的脂质膜，这层膜可在与细胞接触后分解，露出外膜进而直接和细胞膜发生融合，随后进而进行下游的感染。而MV可以直接和细胞膜进行融合，也可以通过巨胞饮内吞进细胞，在内吞体里，外膜与内吞体膜融合释放出内膜包绕的病毒核心。病毒通过附着、入胞、脱壳、基因组复制、蛋白合成加工及组装、子代病毒释放侵入细胞，最后通过血液在体内传播。猴痘病毒又可以根据这两种形式大致划分为四种不同状态：细胞内成熟病毒（IMV）、细胞内薄膜病毒（IEV）、细胞相关包膜病毒（CEV）、以及细胞外包膜病毒（EEV），其中IMV是最早出现的病毒形态。抗体是机体在抗原的刺激下所产生的，在病毒潜伏期间抗体的效价低，难以被检出，因此检测抗原能够保证早期检测的灵敏度。而猴痘抗原一般在成痘后皮肤破损的液体中含量较大，不过一旦成痘，也就意味着失去了扼制潜在传播途径的机会。所以，为了实现早期检测，就需要从抗原含量稳定的血清入手，以高灵敏的检测方法检测出其中的病毒。
目前现有技术方案主要存在以下技术问题：（1）PCR检测是现在常用的猴痘检测常用技术手段，但是该方法耗时较长，不利于快速得出检测结果，给扼制病毒的传播带来了空窗期；（2）缺乏可以在猴痘感染者潜伏期（即早期）时进行诊断的高灵敏度、高特异性的检测试剂及技术方法。
发明内容
本发明主要提供了试剂在制备用于猴痘病毒感染的早期筛查的试剂盒中的应用。
根据本发明的一个方面，试剂在制备用于猴痘病毒感染的早期筛查的试剂盒中的应用，所述试剂包括一种或多种特异结合受试者样本中EEV和IEV中的至少一种状态的猴痘病毒的试剂；所述受试者指未出现明显表皮症状的个体。
进一步的，所述试剂还包括能够特异性结合受试者样本中IMV状态的猴痘病毒的试剂。
进一步的，所述试剂包括能够特异性识别目标蛋白B6R和/或A35R的抗体和/或抗原结合片段。
更进一步的，所述目标蛋白还包括：A29L和/或M1R；优选地，所述目标蛋白为：A35R和A29L。
进一步的，所述B6R的序列至少包括：SEQ ID NO:1，所述A35R的序列至少包括：SEQID NO:2。
更进一步的，所述A29L的序列至少包括：SEQ ID NO:3，所述M1R的序列至少包括：SEQ ID NO:4。
进一步的，所述抗体和/或抗原结合片段包括：单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、重组抗体、嵌合抗体、抗体片段、配体、拟肽、适体或辅因子等。
进一步的，所述抗体和/或抗原结合片段标记有信号生成物，所述信号生成物选自：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、异硫氰酸荧光素、异硫氰酸罗丹明、异鲁米诺、吖啶酯、三联吡啶钌、同位素、生物素、胶体金等。
进一步的，所述抗体和/或抗原结合片段包被在固相上，所述固相选自：胶乳微球、磁球、纤维素膜、玻璃、硅酸铝、聚苯乙烯等。优选所述固相是纤维素膜。
进一步的，所述受试者样本包括：血清、血浆和全血。
更进一步的，所述表皮症状指出现皮疹、斑疹、丘疹、疱疹、脓疱等可见的皮肤病变症状。
本发明提供了一种能够特异结合受试者样本中EEV和IEV中的至少一种状态的猴痘病毒的试剂在制备用于猴痘病毒感染的早期筛查的试剂盒中的应用。进一步的，所述受试者指未出现明显表皮症状的个体。更进一步的，所述表皮症状指出现皮疹、斑疹、丘疹、疱疹、脓疱等可见的皮肤病变症状。本发明所提供的能够结合至少一种状态猴痘病毒的试剂，应用于制备猴痘病毒感染的早期筛查的试剂盒中具有更高的准确性和灵敏度。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互结合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
术语解释：
IMV：细胞内成熟病毒，是最早形成的病毒粒子，在感染后6小时存在于细胞质中，在宿主之间传播。
IEV：细胞内包膜病毒，一部分细胞内成熟病毒通过复杂的包裹机制从早期内体或反式高尔基网络获得双层膜形成。
CEV：细胞相关包膜病毒，细胞内包膜病毒从包裹部位沿微管运输到细胞表面，保留在细胞表面的病毒粒子，主要用于细胞间传播。
EEV：细胞外包膜病毒，细胞内包膜病毒从包裹部位沿微管运输到细胞表面，并通过其最外层膜与质膜的融合从细胞质中释放的病毒粒子。
抗体片段：指抗体经过蛋白酶水解所形成的片段。
适体：能以极高的亲和力和特异性与靶分子结合的一段寡核苷酸序列。
拟肽：肽模拟物，根据生物活性肽与相应受体的构象、拓扑化学及电性特征，设计具有类似生物活性的非肽类似化合物。
配体：同锚定蛋白结合的任何分子。
辅因子：指与酶（酵素）结合在催化反应中必要的非蛋白质化合物。
本文所用的术语“筛查”包括确定受试者的疾病或病症的易感性或受试者是否患有特定的疾病或病症。
本文所用的术语“受试者”是指需要治疗的任何单个个体，包括未显示临床症状并且参与临床研究的任何受试者，或参与流行病学检验或用作对照的任何受试者。
猴痘病毒是一种高致死率的传染性病毒，对人类社会及个体健康带来了很大的风险，但目前因其潜伏期长，且感染初期的症状不明显，目前的检测手段仅能在发病后才能进行诊断，且灵敏度较低，不利于进行早期诊断。
针对上述缺陷，在本申请一种典型的实施方式中，提供了能够特异结合受试者样本中EEV和IEV中的至少一种状态的猴痘病毒的检测试剂。
在一些实施例中，上述检测试剂能够用来筛查早期猴痘病毒感染者或猴痘病毒携带者，所述早期猴痘病毒感染者或猴痘病毒携带者指未出现明显表皮症状的个体。所述表皮症状指出现皮疹、斑疹、丘疹、疱疹、脓疱等可见的皮肤病变症状。
上述的检测试剂包括特异性结合EEV和IEV中的至少一种状态的病毒的抗体和/或抗原结合片段。
在本申请的一些实施例中，上述检出受试者样本中EEV和IEV中的至少一种状态的病毒的检测试剂包括特异性结合目标蛋白的抗体和/或抗原结合片段，所述目标蛋白包括B6R和/或A35R。
优选的，上述检出受试者样本中EEV和IEV两种状态的病毒的检测试剂包括特异性结合目标蛋白的抗体和/或抗原结合片段，所述目标蛋白为A35R。
在本申请的一些实施例中，上述抗体和/或抗原结合片段能够特异性结合B6R蛋白，所述B6R蛋白的序列至少包括SEQ ID NO:1，和/或能够特异性结合A35R蛋白，所述A35R蛋白的序列至少包括SEQ ID NO:2。
优选地，上述抗体和/或抗原结合片段特异性结合A35R蛋白，所述A35R蛋白的序列至少包括SEQ ID NO:2。
在本申请的一些实施例中，上述检出受试者样本中EEV和IEV中至少一种状态的病毒的检测试剂还包括检测IMV状态的病毒的检测试剂。
在本申请的一些实施例中，上述检测IMV状态的病毒的检测试剂包括特异性结合目标蛋白的抗体和/或抗原结合片段，所述目标蛋白包括A29L和/或M1R。
优选地，上述检测受试者样本中IMV状态的病毒的检测试剂包括特异性结合目标蛋白的抗体和/或抗原结合片段，所述目标蛋白为A29L。
在本申请的一些实施例中，上述抗体和/或抗原结合片段特异性结合A29L蛋白，所述A29L蛋白的序列至少包括SEQ ID NO:3，和/或能够特异性结合M1R蛋白，所述M1R蛋白的序列至少包括SEQ ID NO:4。
优选地，上述抗体和/或抗原结合片段特异性结合A29L蛋白，所述A29L蛋白的序列至少包括SEQ ID NO:3。
依据上述方案，本发明选用了多种不同状态的猴痘病毒及其目标蛋白作为靶标，能够极大的降低病毒检测的非特异性识别，提高检测结果的特异性及检测结果的灵敏度。
本申请中，特异结合受试者样本中EEV、IEV、EEV和IMV、IEV和IMV中的至少一种方案状态的猴痘病毒的试剂，可以应制备用于猴痘病毒感染的早期筛查的试剂盒。其中，EEV表示细胞外包膜病毒，细胞内包膜病毒从包裹部位沿微管运输到细胞表面，并通过其最外层膜与质膜的融合从细胞质中释放的病毒粒子；IEV表示细胞内包膜病毒，一部分细胞内成熟病毒通过复杂的包裹机制从早期内体或反式高尔基网络获得双层膜形成；IMV表示细胞内成熟病毒，是最早形成的病毒粒子，在感染后6小时存在于细胞质中，在宿主之间传播。
本申请中，检测受试者样本中特定状态的猴痘病毒，是通过结合该状态下的病毒目标蛋白来实现的。其中，所述目标蛋白包括：B6R和/或A35R，还包括A29L和/或M1R。B6R(31.6KD)是宿主范围蛋白，位于猴痘病毒细胞外包膜病毒粒子（EEV）的膜上，参与补体激活的负调节。A35R（181AA）位于IEV、EEV的包膜之上，在抗体抗性传播中起作用。A29L(110AA)是猴痘病毒细胞内成熟病毒（IMV）A区中A29基因编码的表面包膜蛋白，介导病毒对宿主细胞的识别作用。M1R（250AA）是IMV的表面跨膜蛋白，同时也是病毒进入装置的附加组件。
在本申请的一些实施例中，检测样品中目标蛋白的分析方法是双抗体夹心分析法，需要选择针对同一目标蛋白的一对抗体，在非均相免疫分析体系中，其中一种抗体与固相载体连接，能够捕获待测样本中的目标蛋白；另一种抗体带有信号生成物，能够产生相应的检测信号。当目标蛋白被捕获抗体捕获，并与带有信号生成物的抗体形成夹心形式，信号生成物能够产生信号被检测到，此时指示该目标蛋白的存在，以及存在的量等。所述用于检测的抗体不仅仅局限于单克隆抗体或多克隆抗体，还包括单链抗体、重组抗体、嵌合抗体等中的一种或多种。所述的抗体可以通过常规技术手段获得，这些技术可以是本技术领域专业人员所熟知的各种不同技术中的任何一种。例如，制备多克隆抗体首先需要将含有目标蛋白的免疫原，如：具有目标蛋白多肽的细胞或分离的目标蛋白多肽，注射到适当的动物中，如：小鼠、兔或羊，优选进行一次或多次注射来增强免疫，并且定期从经过免疫的动物体内取血。然后从这些抗血清中通过使用与适当的固相支持物偶联的多肽的亲和层析方法，纯化出特异性针对目的蛋白的多克隆抗体。
所述双抗体夹心包括两种抗体，其中一种抗体连接在固相载体上，作为捕获抗体，另一种抗体连接有信号生成物，作为标记抗体。任何非竞争性的抗体的组合都可以与本文公开的方法一起使用，包括单克隆抗体、多克隆抗体及其组合。
在本申请的一些实施例中，所述检出受试者样本种EEV和IEV中的至少一种状态的病毒的检测试剂至少包括一对抗体对，所述两种抗体识别两个互不交叉的不同表位，并且这两种抗体可以同时识别某一状态的猴痘病毒。
所述抗体对可以通过常规技术手段获得，为了便于后续抗体对的筛选，制备的抗体应为单克隆抗体，通常利用杂交瘤技术进行单克隆抗体的制备。并且为了防止找不到可以配对的抗体，在免疫动物的时候，可以免疫多只动物，以获得更多的单克隆抗体。通常筛选抗体对的方法使用的时双抗夹心ELISA法，在获得单克隆抗体后，从中取出两种，一种作为捕获抗体，另一种作为标记抗体（HRP酶标记）。将捕获抗体包被在抗原板上，先加入抗原并在孵育后洗去未结合的抗原，再加入标记抗体孵育后戏曲未结合的标记抗体，最后加入显色液。如果显色，说明该两种抗体为配对抗体，如果不能显色，说明该两种抗体不能进行配对。本申请的一些实施例中，所述至少两种抗体中的至少一种抗体标记上信号生成物，所述信号生成物可以是辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）、异硫氰酸荧光素（FITC）、异硫氰酸罗丹明（TRITC）、异鲁米诺（ABEI）、吖啶酯（AE）、三联吡啶钌、同位素、生物素、胶体金等。
本申请的一些实施例中，所述配对抗体被成为抗体对。在检测猴痘病毒状态的试剂盒中，至少存在两种抗体对，这些抗体对分别能够结合不同状态的猴痘病毒的特异蛋白，从而能够形成双抗体夹心状态，通过信号生成物，指示目标蛋白的存在，从而判断猴痘病毒的存在。
本申请的一些实施例中，上述检测猴痘病毒状态的试剂中，抗体标记于胶体金上。根据胶体金标记的原理，只有在pH接近和稍高于蛋白质的等电点时，胶体金蛋白质的吸附力最强；pH过高过低都不利于两者的结合，因此标记时选择精密的酸碱度测定仪器或者试纸条，采用不同方法重复校正，并进行梯度试验找到最佳的标记pH。所述胶体金优选粒径的直径范围为40nm-60nm。胶体金的粒径在此范围内，可以保证检测的特异性和灵敏度。
本申请的一些实施例中，所述至少两种抗体中的至少另一种抗体包被在固相上，所述固相可以是：胶乳微球、磁球、纤维素膜、玻璃、硅酸铝、聚苯乙烯等。优选所述固相是纤维素膜。
在本申请的一些实施例中，检测样品中目标蛋白的分析方法是免疫竞争法，需要准备能够特异性结合目标蛋白的抗体及连接有信号生成物的标记抗原。所述抗体包被在固相上，将与标记抗原和待测样本中的抗原一同孵育。所述两种抗原竞争结合包被在固相上的捕获抗体。样本中待测抗原越多，则竞争越强，标记抗原结合捕获抗体的量就越少，发出的信号也就越少。
所述特异性结合捕获抗体的标记抗原可以是一种或多种，有一种或多种的标记。
上述检测猴痘病毒状态的抗原偶联物，需要连接特定粒径的胶体金颗粒，其中所述胶体金的粒径范围为40nm-60nm。胶体金的粒径在此范围内能够保证灵敏度，同时能够避免一定的非特异性吸附。
在本申请的一些实施例中，检测样品中目标蛋白的分析方法是胶乳比浊法，需要将目标蛋白相对应的特异性抗体包被在10nm-1μm的胶乳颗粒上，增加抗原抗体的免疫复合物，使抗原抗体结合物的体积增大，从而增大信号形成浊度。通过检测光强度的变化或光线偏转角度等即可计算出待测样本中抗原的含量。
所述特异性抗体包括一种或多种抗体，抗体包被在固相上，所述的固相可以是胶乳微球等，胶乳微球可以是大小不同粒径的微球。
本申请的另一种典型的实施方式中，提供了检出受试者样本中EEV和IEV中的至少一种状态的病毒的检测试剂在制备用于猴痘病毒感染的早期筛查的试剂盒中的应用。所述试剂盒包括一种或多种特异性识别目标蛋白的抗体，且其中一种抗体包被在固相上，为捕获抗体；另一种抗体或竞争性结合抗原偶联有信号生成物，该信号生成物能够通过形成免疫复合物而发出信号，进而能够进行检测目标蛋白的存在或其量的多少。
本申请的一些实施例中，所述检测猴痘病毒状态的试剂中，检测结果的判定规则为：其中至少一对抗体与样品中目标蛋白结合为双抗体夹心并指示其存在，则判断检测结果为阳性，即猴痘病毒的存在；若没有一对抗体与样品中目标蛋白结合为双抗体夹心，未能观测到信号指示剂的存在，则判断检测结果为阴性，即猴痘病毒不存在。在本申请的一些实施例中，用所述试剂对潜在具有交叉反应的其它病毒（如：风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒等）进行检测，若至少有一对抗体与样品某蛋白结合为双抗体夹心并指示其存在，则判断检测结果为阳性；若没有一对抗体与样品中某蛋白结合为双抗体夹心，未能观测到信号指示剂的存在，则判断检测结果为阴性。
在上述试剂盒中，除了包括上述偶联物试剂外，还包括方便检测所用的其它试剂，包括但不仅限于校准品、质控品、试剂缓冲液以及样本萃取液等中的任意一种或多种。校准品是用于对试剂内置主曲线进行校准为新的工作曲线。质控品是用于检验试剂是否能够正常使用。试剂缓冲液可以根据需要添加或者在实际检测时单独配置。样本萃取液用于采集到的样本进行前处理的步骤中，主要是使病毒裂解，并暴露或释放出目标蛋白，更便于检测试剂与其结合。
在上述的试剂盒中，优选校准品包括两个浓度不同的第一校准品（即低点校准品）和第二校准品（即高点校准品），更优选低点校准品的浓度优选0.05 pg/ml-10 pg/ml，高点校准品的浓度优选100 pg/ml-1000 pg/ml；优选质控品包括阴性质控品以及阳性质控品，进一步优选阴性质控品的浓度为0 pg/ml，阳性质控品的浓度为500 pg/ml。
在上述的试剂盒中，试剂缓冲液采用常规的缓冲液即可。在本申请中试剂缓冲液包括但不仅限于碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液等。
在上述的试剂盒中，还包括样本萃取液，其中样本萃取液的组分包括：Tris、Triton X-100、无水乙醇、NaCl、BSA、NaN3、Procline 300。所述样本萃取液可提高猴痘抗原检测的灵敏度和特异性，其保存的病灶渗出液样品可兼容常规商品化核酸提取试剂盒进行核酸提取，也可兼容用于抗原抗体类检测。所述样品萃取液保存样品期间，可灭活包膜状态病毒的活性，减少实验人员在操作过程中的感染风险。
上述试剂盒中，本发明的试剂盒用作快速检验试剂盒，包括诊断或检测的浸杆式免疫层析条。免疫层析条可以包括：(a)吸收样品的样品垫；(b)能与受试者样品的目标抗原发生结合反应的结合垫；(c)在其上形成包括针对抗原的抗体的反应线和对照线的反应膜；(d)吸收残余样品的吸收垫；和(e)支持或支撑材料。所使用的抗体对每个生物标记具有高特异性和高亲和力，并且针对其它抗原几乎没有交叉反应性。这种抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体或重组抗体。另外，快速检验试剂盒可以包括对对照材料具有特异性的抗体。其他的快速检验试剂盒可以包括诊断所需要的其他材料，如能够检测结合的抗体的试剂，例如，固定有特异性抗体和次级抗体的硝基纤维素膜、与结合有抗体的膜、吸收垫和样品垫等。
所述试剂盒的检测步骤包括，将预先经过样本萃取液处理的样本溶液，滴加至样品孔内，样本溶液由于微孔滤膜的毛细管作用，向另一端慢慢进行层析，优先与胶体金信号生成物结合，并被包被于固相的捕获抗体所捕获，未结合的物质（包括游离标记抗体）与结合区分离，最终通过胶体金的呈色条带来判定测定结果。
上述检测的样本类型包括：全血、血清、血浆。
根据本申请的另一个方面，还提供了一种检测猴痘病毒试剂在制备用于猴痘病毒感染的早期筛查的试剂盒中的应用。进一步的，上述应用为筛查早期猴痘病毒感染者或猴痘病毒携带者，所述早期病毒感染者指未出现明显表皮症状的个体。所述表皮症状指出现皮疹、斑疹、丘疹、疱疹、脓疱等可见的皮肤病变症状。
下面将结合具体的实施例进一步说明本申请的有益效果。
需要说明的是，下列实施例的患者样本均来源于临床检测确诊的样本。
实施例1：特异性单克隆抗体的制备
为了制备特异性强、灵敏度高的单克隆抗体，采用具有特定序列的A29L、B6R、A35R、M1R为免疫原，使其刺激小鼠的免疫系统，产生特异性抗体，保证该抗体对相应抗原表位的高亲和力。
1.特定抗原序列：
（1）B6R：SEQ ID NO:1：gyhsldpnav cetdkwkyen pckkmctvsd yvselydkplyevnstmtls cngetkyfrc eekngntswn dtvtcpnaec qplqlehgsc qpvkekysfg eymtincdvgyevigvsyis ctanswnvip
（2）A35R：SEQ ID NO:2：mvisllsmit msaflivrqn qcmsaneaai tdsavavaaassthrkvass ttqydhkesc nglyyqgscy ilhsdyksfe
（3）A29L：SEQ ID NO:3：reaivkayg ddneetlkqr ltnlekkitn ittkfeqiekcckhndevlf rlenha
（4）M1R：SEQ ID NO:4：qtkcdieign fyirqnhgcn itvknmcsad adaqldavlsaatetysglt peqkayvpam ftaalniqts vntvvrdfen yvkqtcnssa vvdnklkiqn viidecygapgsptnl
2.用抗原免疫动物
选用 Balb/c 小鼠，进行注射，抗原抗体复合物刺激相应 B 淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏 B 淋巴细胞。
3.骨髓瘤细胞的制备
在融合前 48h，用含 20% 小牛血清的 R/MINI-1640 培养液，将骨髓瘤细胞增殖培养。融合前 24h，再以同样培养液换液一次。取骨髓瘤细胞，离心洗涤后悬于无血清培养液中。
4.免疫小鼠脾细胞的制备
取末次免疫后第三天的小鼠，眼眶放血，分离血清冻存备用。无菌操作取出脾，制备脾细胞悬液。
5.饲养细胞准备
将小鼠致死、体表消毒和固定后，将 10mL 培养液注射至腹腔。随后吸出注入的培养液，弃上清液。用HAT 培养基将沉淀细胞悬浮，置 CO2 培养箱备用。
6.细胞融合
将骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按 1∶5～1∶10 比例混合，加入 50mL R/MINI 1640液，以 1000r/min 转速离心，弃上清液。
将离心管置 37℃水浴中，吸 1mL 50%PEG滴入离心管内静置，加 R/MINI 1640液，再加 R/MINI-1640 液 10mL，然后加 R/MINI-1640 液至 50mL，使 PEG 作用终止。以800r/min 转速离心 10min，弃全部上清液。加入HAT-R/MINI-1640 选择培养液，随后将悬浮细胞接种于 96 孔培养板。
7.选择性培养
在 HAT 培养基中，只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤 - 鸟嘌呤 - 磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，能在 HAT 培养基中存活和增殖。
8.杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化
使用酶联免疫吸附试验（ELISA）进行杂交瘤阳性克隆的筛选：
以最佳包被浓度将抗原用包被缓冲液 CBS 按 1 μg/mL 浓度用作连续 1:2 梯度稀释， 100 μl/孔加入酶标板中，覆膜密封，4 ℃ 包被12 h 以上。同时封闭，将阴性/阳性血清依次倍比稀释，100 μl 加到酶标板孔，然后依次加入二抗、底物显色，读取 OD 值。选取阳性值最高的孔予以保留并进行亚克隆。
克隆化技术：利用有限稀释法将需要再克隆的细胞株自培养孔内吸出并作细胞计数，计出 1mL的细胞数。选择单个克隆生长的阳性孔再一次进行克隆，一般直至达 100% 阳性孔率时即可，以确保抗体由单个克隆所产生。
9.亲和层析法纯化抗体
取适量腹水离心取上清，用 PBS 稀释4倍，4℃过夜，离心取上清。将纯化后的抗原固定在亲和层析柱中的硅胶填充物上，所述抗原的序列选自：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4。按柱体积1/10加样，用 0.01mol/L pH 7.4的 PBS 液洗脱，流速为 1ml/min ，再用柠檬酸缓冲液洗脱抗体，收集洗脱成分，即为纯化抗体。
利用分光光度计测定各管中蛋白质的含量，将纯化的抗体分装后在 2～8℃保存。
实施例2：抗体对的制备
即使两个抗体针对的是同一抗原分子上不同的抗原决定簇，也并不意味着这两个抗体分子一定可以同时与抗原分子结合。当一个抗体与抗原结合后，有可能会导致其他结合位点（抗原决定簇）构型的改变，从而导致其他的抗体无法正常结合到抗原上。此外，由于位阻效应的存在，也可能使两个结合位点距离较近的抗体无法同时结合在抗原上。因此，想要得到可以同时结合在抗原分子上的配对抗体，应用于检测方法中，还需要对抗体进行筛选。
1. HRP酶标抗体制备：
（1）称取5mgHRP酶，溶于0.5mL蒸馏水中；
（2）加入新配制的0.5mL（0.1mol/L）过碘酸钠溶液，4℃静置30min；
（3）加入0.5mL（0.16mol/L）乙二醇溶液，室温避光混匀，静置30min；
（4）加入含5mg抗体的水溶液1mL，混匀装入透析袋，pH9.5碳酸盐缓冲液透析，放4℃，过夜；
（5）加入0.2mL新配制的（0.5mg/mL）硼氢化钠溶液，混匀，4℃静置2h；
（6）边搅拌边滴加等体积饱和硫酸铵溶液，4℃静置1h；
（7）3000r/min离心30min，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗涤2次；
（8）沉淀物溶于少量pH7.4（0.15mol/L）磷酸盐缓冲液，透析过夜，去除铵离子后，10000r/min离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物。
2.筛选配对抗体：
采取双抗体夹心ELISA法来筛选抗体对：
取两种效价高的单克隆抗体，一种作为捕获抗体，另一种作为标记抗体（HRP酶标抗体），将捕获抗体包被在固相载体上，先加入抗原，孵育后洗去未结合的抗原，使固相载体上形成抗体抗原复合物，并于液体中的其他物质分开。再加入标记抗体，孵育后洗去未结合的标记抗体，最后加入显色液显色。如果可以显色，说明该捕获抗体与标记抗体为一对配对抗体。可进一步根据呈色的深浅进行定性或定量分析。如果不能显色，说明该捕获抗体与标记抗体不是配对抗体。如果选择的两种单克隆抗体不能进行配对，则需重新选择两种单抗，重新进行试验，直至找出可以配对的抗体。
（1）稀释：用pH9.6（0.01mol/L）碳酸盐缓冲液将单克隆抗体稀释至5μg/mL；
（2）培养：用捕获抗体包被酶标板后，4℃过夜；
（3）洗涤：用PBS/T20洗板3次，每次3min；
（4）封闭：用含3%小牛血清的PBS/T20封闭，37℃孵育1h，洗板；
（5）加抗原：加入倍比稀释的抗原溶液，37℃孵育45min，洗板；
（6）加酶标抗体：加入HRP-单克隆抗体，37℃孵育30min，洗板；
（7）显色：加入TMB显色液，轻轻震荡混匀，37℃避光反应15min；
（8）终止：加入50μL终止液终止反应；
（9）测定：酶标仪上读取各孔读取OD450值。
实施例3：抗体的特异性验证
特异性抗体制备完成之后，需要进一步实验验证其是否会与目的抗原之外的其他抗原反应，即交叉反应性的程度，利用ELISA（酶联免疫吸附实验）验证。由于经过上述实施例筛选出来的抗体为抗体对，所以也需要将每对抗体对的两株抗体与四种抗原分别进行测试。
1.包被抗原：
将A29L、B6R、A35R、M1R蛋白分别在PBS中稀释至20μg/ml，移取50μl抗原稀释液到地顶板的微孔中，使微孔包被抗原。用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育2 h。弃包被液，并在为空中加入200μlPBS，洗涤滴定板3次，最后一次洗涤后除去微孔内残留的液滴。
2.封闭：
每孔添加200μl封闭缓冲液，所述封闭缓冲液为5%血清/PBS，封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点，室温下孵育至少2 h，结束后用PBS洗涤滴定板2次。
3.孵育：
向每个孔内加入100μl的一抗稀释液，并在室温下孵育2 h。用PBS洗涤滴定板4次，最后一次洗涤后除去微孔内残留的液滴。每孔内添加100μl的标记二抗，室温下孵育1-2 h，用PBS洗涤滴定板4次。
4.检测：
在每个微孔内加入100μl底物，温育30min取出在酶标仪内进行读数。
测试结果如表一所示，在表一中，“+”表示检测结果为能够检出相应抗原，“-”表示未检出相应抗原。
表一：不同抗体的特异性检测
实验结果显示，根据实施例2所制备的抗体对具有很强的特异性，能够灵敏地检测出相应抗原，且不会产生交叉反应。
实施例4：胶体金试剂盒的制备
利用实施例2制备的抗体对，制备成胶体金试剂盒，并利用本实施例制备的试剂盒，进行后续的实施例验证。具体的制备方式如下：
1.胶体金制备：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金
取990 g的超纯水至烧瓶中，加入10 mL 1%氯金酸溶液。加热至沸腾后加入10 mL1%柠檬酸钠二水合物溶液，溶液变色后15min停止加热，室温下冷却。
2.免疫胶体金制备：①检测线（T线）：浓度1mg/mL的鼠抗人IgG抗体。②质控线（C线）：浓度1mg/mL的羊抗鼠IgG抗体。
3.免疫胶体金垫制备：
①金标垫预处理：将金标垫裁切为金标垫条，使用喷金划膜仪对每条金标垫进行预处理后干燥16 h。②免疫胶体金喷涂：使用喷金划膜仪对每条预处理过的金标垫进行喷金，喷金结束后，干燥16 h保存备用。
4.免疫NC膜制备：
将NC膜裁切后粘贴至PVC底板相应位置，划膜包被稀释液为0.01M的PB缓冲液。使用0.01M的PB缓冲液配制T线，将实施例2中制备的相应抗体对中的抗体②配制成1.0mg/mL浓度；使用0.01M的PB缓冲液配制C线，将羊抗鼠抗体配制成1.0mg/mL浓度。将划膜后的免疫NC膜干燥24h，保存备用。
5.样品垫预处理：
配制样品垫预处理液，样品垫放入样品垫预处理液中浸透，用镊子将样品垫取出沥干水、烘干，干燥后裁切收集到干燥箱中保存备用。样品垫预处理液组分为：0.5%BSA，10mM Tris，0.1% PVP10，0.1% PEG20000，0.5% Tween-20，0.15% Proclin300。
由于在本申请的技术方案中，会涉及多种抗体混合包被在T线上的方案，因此需要在此对各方案进行说明。表二列出的是后续实施例中将会遇到的方案及各包被抗体的浓度：
表二：各实施例中T线包被抗体的方案
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实施例5：不同方案对早期患者的检出情况
使用实施例4制得的胶体金试剂盒进行测试，分别通过①IMV、EEV和②IMV、EEV、IEV两种组合状态的不同方案，对早期患者进行早诊率验证，早期患者的定义是：未出现皮疹等肉眼可见的症状，但感染病毒的患者。纳入实验验证的病例样本共：60例，其中早期患者样本30例，阴性样本30例，这些患者均经过PCR实验验证为猴痘感染者。
检测时，将样本加入先加入样本萃取液中，使样本中的蛋白能够充分暴露，样本萃取液的组分包括：Tris、Triton X-100、无水乙醇、NaCl、BSA、NaN3、Procline 300。萃取过程经过3-5min之后，取30μl混合液体加入至样品垫，通过层析作用，样本中的病毒蛋白（抗原）进入金标垫，不同蛋白的抗体会与金标垫上胶体金标记的抗体反应结合，形成带有金标记的抗原抗体复合物，复合物继续层析至NC膜上的T线，与包被在NC膜表面的捕获抗体结合，形成双抗体夹心复合物，此复合物不断富集并显色。此时过剩的标记抗体继续层析至C线，被羊抗鼠IgG抗体捕获，形成免疫复合物并富集显示质控线。如样本中不含相应蛋白，则T线不显现，仅显现C线，测试结果即为阴性，记为“-”；如样本中含有相应蛋白，则T线显现，且C线显现，测试结果即为阳性，记为“+”；如C线不显现，表示该次测试无效。
灵敏度和特异度的计算方式为：灵敏度=真阳性病例/（真阳性+假阴性）*100%，特异度=真阴性病例/（真阴性+假阳性）*100%。
表三：检测IMV、EEV状态的不同抗体组合方案早诊率
在检测IMV、EEV状态的病毒时，B6R+A29L的组合方案诊断早期猴痘病毒感染者的特异度最高，为90%；B6R+A29L+M1R的组合方案灵敏度最高，为90%，但特异度最低。
表四：检测IMV、EEV、IEV状态的不同抗体组合方案早诊率
在检测IMV、EEV、IEV状态的病毒时，A35R+A29L的组合方案诊断早期猴痘病毒感染者的特异度最高，为96.33%；A35R+A29L+B6R+M1R的组合方案灵敏度最高，为100%，但特异度最低。
综合本实施例中验证的9种检测方案，A35R+A29L的组合方案诊断早期猴痘病毒感染者具有高灵敏度和高特异度，是最优选方案。
实施例6：与其它方案的检出率对比
本技术方案旨在多靶点同时检测，以提高检出率，本实施例将前述实施例中的优选方案与单靶标方案、双靶标但仅检一种病毒状态的方案进行对比，验证方式采用实施例4中制备的胶体金试剂盒来进行实验。纳入实验验证的病例样本共：60例，其中早期患者样本30例，阴性样本30例。灵敏度和特异度的计算方式为：灵敏度=真阳性病例/（真阳性+假阴性）*100%，特异度=真阴性病例/（真阴性+假阳性）*100%。
表五：与其它方案检出率对比
与单靶标方案（B6R、A29L、A35R、M1R）、双靶标但仅检一种病毒状态的方案（A29L+M1R）对比，优选方案（A29L+A35R）具有高灵敏度和高特异度。
实施例7：不同组合方案特异性
选择含有潜在交叉反应的相关病毒样本进行特异性研究，其中，实验所包含的样本量分别为：健康对照（阴性样本）45例，风疹病毒样本38例，巨细胞病毒样本 47例，单纯疱疹病毒Ⅰ样本40例，单纯疱疹病毒Ⅱ样本44例，验证方式采用实施例4中制备的胶体金来进行实验。其中作为评判标准的方案为实施例5、实施例6中的优选方案。
表六：不同抗体组合对其他病毒的检测情况
在检测方案特异性的实验中，优选方案：A35R+A29L对于其它具有潜在交叉反应可能的病毒测试中，均保持0%的阳性率；而其它方案的结果显示，能够检测靶点更多、检测出病毒状态种类越多的方案，其产生交叉反应的可能性越高、特异性越低。
与相关技术相比，本申请包括以下有益效果：
本申请利用免疫层析的技术手段，缩短了检测时间，能够快速得出检测结果，消除了扼制病毒传播的空窗期；
本申请的技术方案可以在猴痘感染者潜伏期（即早期）时进行高灵敏度、高特异性的检测。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.试剂在制备用于猴痘病毒感染的早期筛查的试剂盒中的应用，所述试剂包括一种或多种特异结合受试者样本中EEV和IEV中的至少一种状态的猴痘病毒的试剂；所述受试者指未出现明显表皮症状的个体。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂还包括能够特异性结合受试者样本中IMV状态的猴痘病毒的试剂。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括能够特异性识别目标蛋白B6R和/或A35R的抗体和/或抗原结合片段。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述目标蛋白还包括：A29L和/或M1R；优选地，所述目标蛋白为：A35R和A29L。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述B6R的序列至少包括：SEQ ID NO:1，所述A35R的序列至少包括：SEQ ID NO:2。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述A29L的序列至少包括：SEQ ID NO:3，所述M1R的序列至少包括：SEQ ID NO:4。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗体和/或抗原结合片段包括：单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、重组抗体、嵌合抗体、抗体片段、配体、拟肽、适体或辅因子等。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗体和/或抗原结合片段标记有信号生成物，所述信号生成物选自：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、异硫氰酸荧光素、异硫氰酸罗丹明、异鲁米诺、吖啶酯、三联吡啶钌、同位素、生物素、胶体金等。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗体和/或抗原结合片段包被在固相上，所述固相选自：胶乳微球、磁球、纤维素膜、玻璃、硅酸铝、聚苯乙烯等。优选所述固相是纤维素膜。
10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述受试者样本包括：血清、血浆和全血。
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