MXPA01010995A - Un anticuerpo monoclonal contra la leucina aminopeptidasa estimulada por estrogenos. - Google Patents

Abstract

La identificacion y la caracterizacion de los factores de riesgo y sus implicaciones moleculares en la patofisiologia de las enfermedades humanas tales como el cancer; es esencial para disenar ensayos de diagnostico eficientes y compuestos terapeuticos. Los esteroides estrogenicos, bajo condiciones fisiologicas normales, han demostrado que juegan una funcion critica en varios tejidos. La respuesta de tal variedad de tejidos a la estimulacion con estrogenos puede explicar en parte su papel activo en el desarrollo y progreso de diferentes enfermedades humanas, sobre todo el cancer mamario. En la busqueda de los factores celulares que responden a estrogenos en celulas maternas de carcinomas mamarios primarios humanos obtenidos de biopsias de tumores, dos marcadores celulares, se identifico una isoenzima de la supuesta leucina aminopeptidasa (LAPasa; EC 3.4.11. 1). Los resultados han demostrado que este marcador se encuentra elevado en el suero de mujeres con carcinomas invasivos de los conductos o carcinomas metastasicos. Un anticuerpo monoclonal contra el marcador celular ha sido producido. El invento se refiere al uso de los anticuerpos monoclonales para LAPasa para las pruebas en sangre, confirmativas de cancer mamario.

Description

UN ANTICUERPO MONOCLONAL CONTRA LA LEUCINA AMINOPEPTIDASA ESTIMULADA POR ESTRÓGENOS El presente invento se relaciona con un anticuerpo monoclonal que demuestra una unión especifica a la isoenzima de la Leucina Aminopeptidasa- que responde a los estrógenos (es-LAPasa). El presente invento también se relaciona con la línea celular de hibridoma, conocido como 7B6, y el anticuerpo monoclonal producido por la misma. El presente invento adicionalmente se relaciona con un sistema de diagnóstico que usa al anticuerpo monoclonal de la línea celular de hibridoma 7B6, para detectar en sangre, suero o plasma los niveles de la isoenzima de la leucina aminopeptidasa que responde a estrógenos. El anticuerpo es particularmente útil para pruebas de diagnóstico rápido para el cáncer mamario.

ANTECEDENTES DEL INVENTO La identificación y caracterización de los factores de riesgo y sus implicaciones moleculares en la patofisiología de las enfermedades humanas tales como el cáncer mamario es esencial para diseñar ensayos de diagnóstico eficientes y compuestos terapéuticos. Entre los diversos factores de riesgo asociados con el inicio de eventos tempranos que conducen al cáncer mamario, el estrógeno y los compuestos parecidos al estrógeno con una actividad que imita a la de los estrógenos siguen siendo las determinantes más importantes en los eventos tempranos y el progreso de la carcinogenesis mamaria. Bajo condiciones fisiológicas normales, hay varios tejidos por medio de los cuales se ha demostrado que los esteroides estrogénicos juegan una función crítica. Estos incluyen el desarrollo del aparato reproductor, sobre todo órganos secundarios, tales como las glándulas mamarias. Además, los estrógenos también están involucrados en la regulación fina del crecimiento óseo, en la función hepática y cardiovascular y en el ciclo del estro, probablemente a través de la inducción de la proliferación celular en los tejidos blanco [Sutherland, R.L., pp. 197-215, Elsevier Science Publishing B.V., Amsterdam; Shekhar, P.V.M., et al. J. Nati. Cáncer Inst., 89: 1774-1782.]. La respuesta de tal variedad de tejidos al estimulo de los estrógenos puede explicar, en parte, su papel activo en el desarrollo y progreso de diferentes carcinomas humanos y en particular del cáncer mamario. Aunque los mecanismos moleculares precisos mediante los cuales la estimulación estrógenica regula diversas funciones fisiológicas requiere una elucidación adicional, este esteroide participa en los eventos "inmediatos tempranos" y en los "tempranos" de la función celular. A este respecto, parece que los eventos tempranos inmediatos inducidos por el estrógeno conducen a una proliferación celular elevada con más probabilidad a través de la reducción en el ciclo celular, acelerando la velocidad a la cual las células progresan de la fase Gi hacia la fase S. Recientemente, se ha propuesto que el estrógeno promueve la proliferación celular co-activando a concentraciones de estrógeno similares, la expresión de la ciclina Dl-CdK4 y la ciclina E-Cdk2, dos péptidos reguladores de Gi críticos y potencialmente interrelacionados [Prall, O.W.J., et al., J. Biol. Chem., 212 10882-10894].

Hay ensayos de diagnóstico disponibles para el cáncer mamario. Por ejemplo, las técnicas de imagen tales como los ultrasonidos y los rayos X (mamografías) se usan ampliamente para detectar tumores. Estas técnicas de imagen, sin embargo, sufren de una limitación en la resolución de la imagen lo que evita la detección de tumores por debajo de cierto tamaño.

El análisis histológico de las biopsias también es un procedimiento común para el diagnóstico de cáncer mamario y esta técnica se basa en la identificación de fenotipos visibles de las células. Sin embargo, este análisis es de alguna manera subjetivo y depende de la habilidad del que realiza el examen.

Los ensayos de diagnóstico molecular también están disponibles. Entre los más confiables se encuentra un ensayo que mide los receptores de estrógeno y progesterona en las células obtenidas de las biopsias. Este ensayo es útil para determinar si un tipo particular de cáncer responderá a la terapia hormonal.

La citometría de flujo también puede usarse para medir parámetros, tales como el contenido de ADN y la proporción de células en una fase particular del ciclo celular, que se correlacione con la presencia de células cancerosas.

Sin embargo, la histología, el análisis de los receptores de estrógeno y progesterona y la citometría de flujo todas requieren que las biopsias se tomen y que la muestra se procese extensivamente.

Por lo tanto, hay necesidad de métodos más rápidos -y menos invasivos para diagnosticar el cáncer mamario. En particular, son deseables los ensayos sensibles para detectar la presencia de marcadores celulares, preferentemente en la sangre, que reflejan la presencia de metástasis.

Aún más deseable, dado el papel importante del estrógeno en el progreso del cáncer mamario, son los marcadores celulares, diferentes a los receptores de estrógeno y progesterona, que respondan al estrógeno.

RESUMEN DEL INVENTO El presente invento se relaciona con un anticuerpo monoclonal que demuestra unión especifica a la leucina aminopeptidasa estimulada por estrógenos (es-LAPasa). El presente invento adicionalmente se relaciona con un sistema de diagnóstico que usa un anticuerpo monoclonal para detectar los niveles de es-LAPasa en sangre, suero, plasma o tejidos.

De esta manera, de acuerdo con el presente invento se proporciona un anticuerpo monoclonal que es especifico para la es-LAPasa.

En una representación posterior del presente invento se proporciona un método para detectar el cáncer mamario en una paciente mediante la determinación del nivel de es-LAPasa en una muestra.

Este invento también está dirigido a un método para detectar cáncer metastásico en pacientes mediante la determinación del nivel de es-LAPasa en una muestra.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIAGRAMAS Estas y otras características se volverán más aparentes a partir de la siguiente descripción en la cual se hace referencia a los diagramas adjuntos en donde: FIGURA 1 muestra el efecto del estrógeno sobre la actividad de la LAPasa en suplementos celulares de líneas celulares maternas primarias de cáncer mamario.

FIGURA 2 muestra la cinética de la inhibición de la LAPasa mediante Bestatina, tioredoxina y glutatión.

DESCRIPCIÓN DE LA REPRESENTACIÓN PREFERIDA El presente invento se relaciona con un anticuerpo monoclonal que demuestra unión especifica a la leucina aminopeptidasa humana estimulada por estrógenos (es-LAPasa) ya sea la forma soluble o la asociada a la membrana. El presente invento se relaciona con un sistema de diagnóstico que usa el anticuerpo monoclonal para detectar los niveles de es-LAPasa en sangre, suero, plasma o tejido.

La búsqueda de los factores celulares que responden a los estrógenos en las células maternas de carcinomas mamarios humanos primarios obtenidos de biopsias de tumores, el inventor aisló una isoenzima de la supuesta leucina aminopeptidasa (LAPasa; EC 3.4.11.1). esta isoenzima de la LAPasa se libera al ambiente extracelular de las células maternas de carcinomas mamarios humanos parecidas a células epiteliales al incubar con Estradiol. La activación con estrógenos fue dependiente de la dosis con una activación inducida óptima de la LAPasa a 100 nM.

Para obtener una isoenzima de la leucina aminopeptidasa que responda a los estrógenos, se incubaron con estrógeno células de biopsias de carcinoma mamario humano parecidas a células epiteliales. Más preferentemente con Estradiol a concentraciones de entre 10"8M y 10"5M y preferentemente a una concentración de 10"7M. Con referencia a la figura 1 se observa que esta incubación promueve la liberación de es-LAPasa. La enzima se purifico de sobrenadantes celulares mediante HPLC por permeación en gel seguida de una DEAE-Celulosa y una cromatografía de afinidad de Bestatina-Sepharose. La es-LAPasa purificada presenta un peso molecular de 315 kDa estimado por la permeación en gel en una columna Bio-Sil™ SEC-250 (600x7.5 mm) usando tiroglobulina (MM 670kDa); gama globulina bovina (MM 18 kDa); ovoalbúmina de pollo (MM 44 kDa) y mioglobina de caballo (17kDa). La isoenzima de la LAPasa del presente invento puede distinguirse de esta manera de otras isoenzimas reportadas en la literatura y las cuales presentan diferentes pesos moleculares.

El anticuerpo monoclonal del presente invento se preparó mediante procedimientos convencionales, generalmente siguiendo los métodos de Campbell (Campbell, A.M. (1984). Amsterdam, Elsevier: 219-223.) y Lietzke y Unsicker (Lietzke, R. et al., (1985) J. Immunol. Methods, 76:223-228). De acuerdo con este-método, el cultivo de tejido de células de mieloma de ratón adaptadas se fusionan con las células productoras de anticuerpos de ratones inmunizados para obtener células híbridas que produzcan grandes cantidades de una sola molécula de anticuerpo. En general, las células productoras de anticuerpo se preparan mediante la inmunización del animal, por ejemplo, ratón, rata, conejo, oveja, caballo, o bovino, con un antígeno. El esquema de inmunización y la concentración del antígeno en suspensión es tal como para proporcionar cantidades útiles de células productoras de anticuerpo cebadas adecuadamente. Estas células productoras de anticuerpo puede que sean células del bazo, timocitos, células del nodulo linfático y/o linfocitos de la sangre periférica.

Las células productoras de anticuerpo entonces se fusionan con las células de mieloma, se pueden usar las líneas celulares que provienen de diferentes animales tales como ratones, ratas, y humanos, usando un promotor adecuado de la fusión. Se conocen muchas líneas celulares de mieloma de ratón y están disponibles generalmente con miembros de la comunidad académica y diversos depósitos, tales como American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. La línea celular de mieloma usada debe ser preferentemente sensible al medio para que las células de mieloma que no se fusionen no sobrevivan en un medio selectivo, y los híbridos si puedan sobrevivir. La línea celular más comúnmente usada es una línea celular resistente a la 8-azaguanina, la cual carece de la enzima hipoxantina-guanina-fosforibosil-transferasa y por lo tanto no crecerá en el medio HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina). En general, la línea celular también es preferentemente del tipo "no-secretora", en que esta no produce ningún anticuerpo. El promotor preferido de la fusión es el polietilenglicol que tiene un peso molecular promedio de 1000 a 4000. Otros promotores de la fusión tales como el alcohol polivinilico, un virus o un campo eléctrico también pueden usarse.

Las células inmortalizadas (hibridoma) entonces pueden examinarse por pruebas de tamizaje para elegir a aquellas que secreten anticuerpos de la especificidad correcta. El tamizaje inicial generalmente se lleva a cabo usando un ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA). Específicamente, los sobrenadantes de los cultivos de hibridomas se agregan a placas de microtitulación o membranas de nitrocelulosa las cuales han sido previamente recubiertas con el antígeno, en esta caso la es-LAPasa purificada. Un anticuerpo especifico ligado de los sobrenadantes de los cultivos puede detectarse usando un segundo anticuerpo marcado , por ejemplo, IgG anti-ratón de cabra marcado con peroxidasa el cual está disponible comercialmente. Los cultivos que son positivos contra el antígeno de es-LAPasa entonces se someten a clonación mediante el método de dilución limitante. Los cultivos secundarios de hibridoma entonces se re-examinan por tamizaje como se describe anteriormente. Los cultivos entonces se evalúan para determinar si el anticuerpo se une o no y para determinar el perfil cinético de la unión del antígeno. Los cultivos elegidos; basándose en estos resultados se someten a una clonación adicional hasta que se obtenga la estabilidad y clonabilidad del cultivo. Inmediatamente después de la hibridización, los productos de la fusión tendrán aproximadamente 80 cromosomas, y como estas células continúan dividiéndose , éstas perderán aleatoriamente algunos de estos cromosomas. El proceso de clonación es para elegir a aquellas células que todavía tengan los cromosomas que codifican para la producción de anticuerpos. El proceso de clonación se repite hasta que el 100% de la sub-población muestre la producción de un anticuerpo especifico, lo cual es indicativo de la "estabilidad" del hibridoma. Además, los pozos de cultivo de hibridoma con frecuencia tienen múltiples colonias algunas de las cuales puede que no produzcan anticuerpos. El proceso de clonación permite la selección de un híbrido positivo el cual proviene de una sola célula.

En una representación del presente invento se proporciona un anticuerpo monoclonal, el cual se ha nombrado Mab 7B6. La línea celular de hibridoma que produce este anticuerpo monoclonal se ha depositado en la Autoridad Internacional de Canadá el 23 de marzo de 2000, bajo el número de acceso IDAC-230300-1. Este anticuerpo monoclonal es del subtipo IgGla. Este reconoce la forma soluble y la asociada a la membrana de la es-LAPasa. Una persona entrenada en el área reconocerá que otros anticuerpos, policlonales y monoclonales pueden prepararse de acuerdo con el presente invento. En un aspecto de este invento, el Mab 7B6 puede acoplarse a una matriz sólida. La matriz puede ser, pero no se limita a, una matriz de Proteína G. El Mab 7B6 acoplado a una matriz puede usarse para inmunoprecipitar a la es-LAPasa. Esta inmunoprecipitación puede reducir la unión no-selectiva del anticuerpo. El inmunoprecipitado puede ser útil para determinar la actividad de la enzima o para realizar otros ensayos.

El presente invento también abarca el anticuerpo del presente invento y cualquiera de los fragmentos del mismo que contengan la región de unión activa del anticuerpo tales como los fragmentos Fab, F(ab)2 y FV. Estos fragmentos pueden obtenerse del anticuerpo 7B6 usando las técnicas bien conocidas para las persona entrenadas en el área (Rousseaux y col. Methods Enzymology, 121 :663-69, Academic Press, 1986).

Una representación posterior del presente invento abarca anticuerpos o fragmentos de los mismos capaces de unirse a la misma determinante antigénica que el anticuerpo 7B6. Incluyendo, pero no limitándose a, anticuerpos que posean la misma especificidad antigénica que el anticuerpo 7B6 pero provenientes de diferentes especies o que tengan diferente isotipo o que presenten diferentes afinidades de unión. Se cree que las variantes de clase e isotipo del anticuerpo del presente invento pueden prepararse usando técnicas de cambio recombinante de clase y técnicas de fusión que son bien conocidas por personas entrenadas en el área (vea por ejemplo: Tamaña et al. Eur. J. Immunol, 13:614, 1983; Oi et al., Biotechnologies, 4(3):214-221, Liu et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA), 84:3439-43, 1987; Neuberger et al., Nature 312:604-608, 1984 y Spira et al. J. Immunol. Meth., 74:307-15, 1-984).

El anticuerpo monoclonal del presente invento puede producirse ya sea usando un bioreactor o a partir de líquido de ascitis, ambos procedimientos son bien conocidos en el área.

El anticuerpo monoclonal del presente invento puede usarse en un sistema de inmunoensayo para determinar los niveles de es-LAPasa en sangre, suero, plasma o tejido.

Los inmunoensayos actuales utilizan un método de anticuerpo doble para detectar la presencia de un antígeno. Estas técnicas se revisan en "Basic Principales of Antigen-Antibody Reaction", Elvin A. Labat, (Methods in Enzymology, 70, 3-70, 1980). Con frecuencia se hace referencia a tales sistemas como sistemas de formato rápido debido a que se adaptan a determinaciones rápidas de la presencia de un analito. El sistema requiere alta afinidad entre el anticuerpo y el analito. De acuerdo con una representación del presente invento, la presencia de es-LAPasa se determina usando un par de anticuerpos, cada uno especifico para es-LAPasa. Uno de los pares de anticuerpos mencionados se refiere aquí como "anticuerpo detector" y el otro anticuerpo del par mencionado, se refiere aquí como "anticuerpo de captura". Los anticuerpos monoclonales del presente invento pueden usarse ya sea como anticuerpo de captura o anticuerpo detector. Los anticuerpos monoclonales del presente invento también pueden usarse como anticuerpos de captura y de detección, juntos en un solo ensayo. Una representación del presente invento de esta manera usa el método del sandwich con dos anticuerpos para detectar la es-LAPasa en una muestra de líquido biológico. En este método, el analito queda atrapado en medio del anticuerpo detector y del anticuerpo de captura, el anticuerpo de captura se inmoviliza irreversiblemente sobre un soporte sólido. El anticuerpo detector contendrá una etiqueta detectable, para identificar la presencia del sandwich anticuerpo-antígeno y de esta manera la presencia del analito.

Las primeras formas comunes de soportes sólidos fueron placas, tubos o cuentas de poliestireno que eran bien conocidas en el campo del radioinmunoensayo y el inmunoensayo por enzimas. Más recientemente, se han empleado una serie de materiales porosos tales como el nylon, la nitrocelulosa, el acetato de celulosa, las fibras de vidrio y otros polímeros porosos como soportes sólidos.

Una representación del presente invento usa un aparato de inmunoensayo del tipo de flujo continuo. Valkirs et al. (Patente EUA No. 4,632,901) revela un aparato que contiene al anticuerpo, especifico para el analito que es el antígeno, unido a una membrana porosa o a un filtro al cual se agrega una muestra líquida. Conforme el líquido fluye a través de la membrana, los analitos blanco se unen al anticuerpo. La adición de la muestra es seguida por la adición de un anticuerpo marcado. La detección visual del anticuerpo marcado proporciona una indicación de la presencia del analito. blanco en la muestra.

Otro ejemplo de un aparato de flujo continuo es revelado por Kromer et al. (EP-A 0 229 359), que describió un sistema de liberación- -de reactivo que contiene una matriz saturada con un reactivo o componentes de los mismos dispersos en un polímero soluble en agua para controlar la velocidad de disolución del reactivo a liberarse a una matriz de reacción posicionada por debajo de la matriz.

En los ensayos del tipo migratorios, una membrana se impregna con los reactivos necesarios para realizar el ensayo. Se proporciona una zona de detección del analito en la cual el analito marcado se une y se lee el ensayo. Por ejemplo, vea Tom et al. (Patente EUA No. 4,366,241), y Zuk (EP-A 0143 574). Los aparatos para ensayos de migración normalmente incorporan dentro de ellos reactivos a los que se les hayan anexado etiquetas coloridas de esta manera permitirán la detección visible de los resultados del ensayo sin la adición de sustancias adicionales. Vea por ejemplo Bernstein (Patente EUA No. 4,770,853), may et al. (WO 88/08534), y Ching et al. (EP-A 0 299 428). El anticuerpo monoclonal del presente estudio puede usarse en todos estos tipos conocidos de aparatos de flujo continuo.

Las etiquetas directas son un ejemplo de etiquetas que pueden usarse de acuerdo con el presente invento. Una etiqueta directa se ha definido como una identidad, la cual en su estado natural, es fácilmente visible, ya sea a simple vista, o con la ayuda de un filtro óptico y/o estimulación aplicada, por ejemplo la luz UV para promover la fluorescencia. Entre los ejemplos de etiquetas coloridas, que pueden usarse de acuerdo con el presente invento, incluyen a partículas sol metálicas, por ejemplo, partículas sol de oro como aquellas descritas por Leuvering (Patente EUA No. 4,313,734); partículas sol de colorantes tales como las descritas por Gribnau et al. (Patente EUA No. 4,373,9 32) y May et al. (WO 88/08534); o colorantes encapsulados en liposomas como son descritos por Campbell et al (Patente EUA 4,703,017). Otras etiquetas directas incluyen a un radionucleotido, una entidad fluorescente o una entidad luminiscente. Además de estos aparatos de mareaje directo, también se pueden usar marcas indirectas compuestas por enzimas de acuerdo con el presente invento. Diversos tipos de inmunoensayos ligados a enzimas son bien conocidos en el área, por ejemplo, fosfatasa alcalina y preoxidas de rábano, lisozima, glucosa-6- •- fosfato deshidrogenasa, lactato deshidrogenasa, ureasa, estas y otras han sido discutidas a detalle por Eva Engvall en Enzime Immunoassay ELISA and EMIT in Methods in Enzymology, 70.419-439, 1980 y en la Patente EUA No 4,857,453.

Otros ejemplos de aparatos para diagnostico biológico, que pueden usarse para la detección de la es-LAPasa, usando los anticuerpos monoclonales del presente invento, incluyen los aparatos descritos por G. Grenner, P.B. Diagnostics Systems, Inc., en las Patentes EUA 4,906,439 y 4,918,025.

En una representación del presente invento, la prueba diagnostica usa un tubo con muestra de sangre el cual se usa comúnmente para obtener las muestras de sangre de los pacientes. La pared interior del tubo actúa como portador de los anticuerpos monoclonales o policlonales y los agentes requeridos o los medios de detección, necesarios para producir una señal medible. En esta representación el anticuerpo de captura se inmoviliza sobre la pared del tubo de ensayo. Después de obtener la muestra del paciente, el usuario simplemente agita la muestra con el anticuerpo detector en el tubo para que el anticuerpo detector reaccione con cualquier es-LAPasa en la sangre. En este ejemplo de anticuerpos monoclonales del presente invento puede ser el anticuerpo de captura o el anticuerpo detector. Puede que sea necesario usar una muestra en donde los eritrocitos hayan sido extraídos, para que los eritrocitos no interfieran con el análisis de los resultados. Si el analito está presente en la sangre, quedará atrapado en el sandwich entre el anticuerpo de captura y el anticuerpo detector el cual contiene una etiqueta adecuada para la detección directa o reacciona con los reactivos en un ensayo indirecto. El soporte sólido (el tubo de ensayo) entonces puede enjuagarse para descartar el material etiquetado libre sin unirse. Se puede usar una variedad de soportes sólidos de acuerdo con este método, por ejemplo, paredes del tubo de ensayo, tazas de plástico, cuentas, bolas de plástico y cilindros incluyendo las placas de microtitulación, papel y fibra de vidrio.

Actualmente hay varios tipos de aparatos automáticos de ensayo que pueden emprender ensayos de formato rápido en una serie de muestras contemporáneamente. Estos aparatos automatizados de análisis incluyen a los aparatos de ensayo de acceso continuo / aleatorio. Los ejemplos de tales sistemas incluyen a OPUS™ de PB Diagnostic System, Inc. Y al IMX™ Analyzer presentado por Abbott Laboratories del Norte de Chicago, Illinois en 1988. En general, una muestra del líquido de prueba se proporciona típicamente en una taza de muestra y todos los pasos del proceso incluyendo la transferencia de la muestra con pipeta hacia el elemento de prueba del ensayo, la incubación y la lectura de la señal obtenida se llevan a cabo automáticamente. Los sistemas automatizados de ensayo generalmente incluyen una serie de estaciones de trabajo cada una de las cuales realiza uno de los pasos en el procedimiento de prueba. El elemento del ensayo puede transportarse de una estación de trabajo a la siguiente mediante diversos medios tales como el carrusel o la repisa movible para permitir que los pasos de la prueba se logren secuencialmente. Los elementos del ensayo también pueden incluir reservorios para almacenar reactivos, líquidos de mezcla, para diluir las muestras, etc. Los elementos del ensayo también incluyen una abertura para permitir la administración de una cantidad predeterminada de líquido de muestra, y si es necesario, cualquier otro agente requerido a una membrana porosa. El elemento de la muestra también puede incluir una ventana para permitir la visualización de la señal obtenida como resultado de los pasos del proceso, típicamente un cambio fluorescente o colorimétrico en los reactivos presentes sobre la membrana porosa a ser leídos, tales como por medio de un espectroscopio o fluorometro que se incluyen dentro del sistema de ensayo.

Los instrumentos automatizados de ensayo de PB Diagnostic Systems, Inc. Se describen en las patentes EUA 5,051,237; 5,138,868; 5,141,871 y 5,147,609.

Una descripción del IMX™ Analyzer se incluye en el "Sistema Analizador de - Inmunoquímica Automatizado Abbott IMX" por Fiore, M. Et al., Clinical Chemistry, 35, No. 9, 1988. Un ejemplo adicional de estos analizadores ha sido descrito en la Patente EUA No 4,956,148 titulada "Repisa de fijación y Cartucho desechable de muestra" emitido para C.J. Grandone el 1 de septiembre de 1990, y asignado a Abbott Laboratories, el cual describe un carrusel para soportar una pluralidad de celdas de reacción para usarse en conexión con el sistema Abbott IMX™. Un desarrollo posterior en el área ha sido descrito en la Solicitud de Patente canadiense 2,069,531, Chadwick M. Dunn et al., asignada a Abbott Laboratories en donde el sistema analizador inmunoquímico, descrito en esta aplicación anterior, tiene la capacidad de examinar hasta tres o cuatro analitos en un mismo lote durante una sola corrida usando la instrumentación actualmente disponible. El sistema descrito en la solicitud Canadiense mencionado anteriormente permite a los usuarios agrupar tres lotes pequeños de ensayos en lugar de correr tres análisis por separado. El anticuerpo monoclonal del presente invento puede usarse en estos analizadores automáticos.

Una clase adicional de sistemas analizadores inmunoquímicos, en el cual los anticuerpos monoclonales del presente invento pueden usarse, son los biosensores o sistemas inmunosensores ópticos. En general un biosensor óptico es un dispositivo el cual usa cuantitativamente los principios ópticos para convertir las concentraciones químicas o bioquímicas o actividades de interés a señales eléctricas. Estos sistemas pueden agruparse dentro de cuatro categorías principales: técnicas de reflexión; resonancia plasmon de superficie; técnicas de fibra óptica y dispositivos ópticos integrados. Las técnicas de reflexión incluyen a la elipsometría, ala espectroscopia de reflexión integral múltiple, y los dispositivos de llenado capilar fluorescentes. Las técnicas de fibra óptica incluyen a la fluorescencia de campo evanescente, el tubo capilar de fibra óptica, y a los sensores fluorescentes de fibra óptica. Los dispositivos ópticos integrados incluyen a la fluorescencia de campo evanescente , al inmunosensor acoplador de la graduación de entrada, interferometro Mach-Zehnder, Interferometro Hartman y sensores de interferometro de diferencia. Estos ejemplos de inmunosensores ópticos se describen en general en un artículo de revisión de G.A. Robins (Advances in Biosensors), Vol. 1, pp 229-256, 1991. Una descripción más especifica de estos dispositivos se encuentra por ejemplo en las Patentes EUA 4,810,658; 4,978,503; 5,186,897; R.A. Brady et al. (Phil. Trans. R. Soc. Land. B 316, 143-160, 1987) y G.A. Robinson et al. (en Sensors and Actuatoirs, Elsevier, 1992).

Otro método inmunoquímico de análisis es la citometría de flujo. En la citometría de flujo la muestra que contiene el antígeno se hace reaccionar con una forma marcada fluorescentemente del anticuerpo monoclonal del presente invento. La muestra se pasa en frente de un rayo láser de una longitud de onda dada capaz de excitar el cromóforo que está en el anticuerpo. Cada partícula o célula que tengan el anticuerpo unido a ellas fluorescerá y será detectada. Esta técnica permite el análisis de tipos de células especificas y en particular de tipos de células sanguíneas especificas. Por lo tanto se usa para la detección de la célula B que presenta el antígeno de la es-LAPasa.

En una representación del presente invento, los analitos se detectan en una muestra de sangre, suero, plasma o tejidos usando el anticuerpo monoclonal del presente invento, en un dispositivo compuesto por un filtro de membrana o un soporte sólido con una sección de detección y una sección de captura. La sección de detección contiene un anticuerpo (un anticuerpo detector), el cual reaccionará con la es-LAPasa. El anticuerpo detector se inmoviliza reversiblemente sobre el soporte sólido y migrará con la muestra, cuando esté en uso. Se prefiere que el anticuerpo detector está marcado, por ejemplo con un radionucleotido, una enzima, una entidad fluorescente, una entidad luminiscente o una etiqueta colorida tal como las descritas en el trabajo anterior, y discutidas anteriormente. La sección de captura contiene un anticuerpo de captura, el cual se inmoviliza irreversiblemente sobre el soporte sólido. Los anticuerpos, el anticuerpo de captura y el detector, y los reactivos necesarios se inmovilizan sobre el soporte sólido usando técnicas estándar reconocidas en el área, como se revela en los dispositivos de inmunoensayo del tipo de flujo continuo discutidos anteriormente. En general, los anticuerpos se absorben sobre los soportes sólidos como resultado de las interacciones hidrofóbicas entre las subestructuras proteicas no-polares y el material no-polar de la matriz de soporte.

De acuerdo con esta representación del presente invento, si la es-LAPasa está presente en la sangre, esta reaccionará con el anticuerpo y se detectará en la sección del detección y migrará al filtro de membrana hacia la sección de captura en donde el analito se unirá posteriormente con el anticuerpo de captura. De esta manera, la es-LAPasa quedará atrapada entre el anticuerpo de captura y el anticuerpo detector, el cual contiene una etiqueta adecuada.

En este ejemplo del presente invento, si el anticuerpo detector está etiquetado con una etiqueta de color o una enzima producirá una marca colorida, la sangre del paciente primero requerirá centrifugación o alguna pre-filtración para retirar los eritrocitos para que el color de los eritrocitos no interfiera con las etiquetas coloridas. Si se van a usar etiquetas radiactivas o fluorescentes, puede que no se requiera el paso de centrifugación o de pre-filtración. En esta representación, el anticuerpo monoclonal del presente invento puede ser el anticuerpo de captura o el anticuerpo detector. En una representación, el anticuerpo monoclonal del presente invento es un anticuerpo de captura. El anticuerpo detector puede ser otro de los anticuerpos monoclonales para es-LAPasa, los anticuerpos monoclonales reactivos a otras isoformas de LAPasa, o anticuerpos policlonales anti- es-LAPasa. Se pueden usar ya sea anticuerpos policlonales de pollo, conejo, cabra o ratón. Muchos de esos anticuerpos son conocidos y pueden prepararse y etiquetarse mediante métodos conocidos.

Este sistema de inmunoensayo generalmente se describe en la Patente EUA No. 5,290,678. El anticuerpo de este invento es particularmente útil en este sistema debido a su alta afinidad por la es-LAPasa.

En una representación posterior de este invento, el anticuerpo monoclonal 7B6 también puede usarse para monitorear a los pacientes que están en riesgo de desarrollar cáncer mamario ya que la es-LAPasa sérica se ve afectada por los estrógenos y los estrógenos han sido identificados como factores importantes en el progreso de ciertos tipos de cáncer mamario. Las personas en riesgo pueden ser aquellas que consumen anticonceptivos basados en estrógenos, terapia de reemplazo hormonal o personas con-patrones hormonales anormales.

Como sería reconocido por una persona entrenada en el área, las representaciones anteriormente descritas de este invento puede que tengan que ser modificadas para distinguir entre la forma soluble o la forma asociada a la membrana de la es-LAPasa.

Como sería reconocido por alguien entrenado en el área, un nivel basal de la es-LAPasa puede estar presente en pacientes normales. De esta manera, en el presente invento, en ciertas representaciones, se determinarán los niveles de es-LAPasa por encima de lo normal. Esto puede lograrse ya sea Comparando los resultados con los resultados de una paciente normal, o ajustando el inmunoensayo para que sólo los valores por encima de cierto umbral se muestren como un resultado positivo.

Como se indicará claramente en los ejemplos infra (posteriores) , los niveles de es-LAPasa se correlacionan con el cáncer mamario y la presencia de metástasis en pacientes con cáncer mamario. De esta manera, el anticuerpo monoclonal 7B6 del presente invento, junto con las representaciones descritas supra (anteriormente) es particularmente útil como una nueva herramienta de diagnóstico.

Para que el invento descrito aquí pueda entenderse más, se establecen los siguientes ejemplos. Se debe entender que estos ejemplos son con propósitos ilustrativos solamente y no se construyen para limitar el alcance de este invento de ninguna manera.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Aislamiento y purificación de la Leucina Aminopeptidasa (LAPasa) dependiente de Estradiol.

Las células primarias maternas de carcinoma mamario obtenidas de biopsias de tumores se estimularon con 17-ß-Estradiol por 24 horas o medio de cultivo para células solo como control. El medio de cultivo para células fue el medio RPMI 1640 + FCS al 10% + Penicilina 100 U/ml + Estreptomicina 100 µg/ml. Entonces los sobrenadantes celulares se recolectaron y se dializaron contra PBS en mangueras de celulosa sin suturas (MW 12,400) durante 12 horas a 4°C. LAP se purificó subsiguientemente a partir de los sobrenadantes celulares dializados usando HPLC por permeación en gel seguida de DEAE-Celulosa y cromatografía de afinidad Bestatina-Sepharose. Explicado brevemente, el sobrenadante celular se aplicó a una columna Bio-Sil SEC-250 (600x7.5 mm) previamente equilibrada en un buffer que contiene buffer de fosfato de sodio 100 mM a pH 6.8, Na2S0 100 mM, ZnCl2 1 µM y glicerol al 10%o. La columna se lavo con 300 ml del mismo buffer a un flujo de 0.5 ml/min. La proteína se concentró a 10 ml mediante ultrafiltración usando una membrana YM5 (5000 M.W. cutoff, Amicon Div., Danvers, MA., USA). El concentrado se aplicó a una columna de celulosa DEAE (2.6 cm X 28.5 cm) equilibrada y lavada con buffer Tris-HCl 50 mM a pH 7.5; ZnCl2 1 µm; y glicerol al 10% (v/v). La es-LAPasa se eluyó usando un gradiente lineal (NaCl 0 a 1M en buffer Tris) a una velocidad de flujo de 0.50 ml/min. Se preparó una columna afinidad a Bestatina usando Ultralink EDC/Matriz de enlaces amida DADPA (Pierce, Rockford, IL; USA) haciendo reaccionar 100 mg de Bestatina pura con la matriz carbodiimida EDC/DADPA siguiendo el procedimiento proporcionado por el fabricante. Antes de cargar el eluyente que contiene la es-LAPasa, la columna de afinidad a Bestatina se equilibró con Tris-HCl 10 mM a pH 8.0 que contenía ZnCl2 1 µm y se lavo con 300 ml de este buffer de unión. La es-LAPasa se recirculó a través del sistema usando una bomba peristáltica a una velocidad de flujo de 0.10 ml/min, durante 2 horas. Después de esta recirculación, la columna se lavo con ocho volúmenes de de buffer de unión. La es-LAPasa unida a la Bestatina se eluyó con un gradiente lineal (NaCl 0-0.5) preparado en buffer de unión Tris-HCl 10 mM a pH 8.0 que contiene ZnCl2.lµM. La elusión de la es-LAPasa unida se monitoreo midiendo la absorbancia a 280 nm. Las fracciones purificadas de es-LAPasa se distribuyeron en alícuotas de 500 µl y se almacenaron hasta su uso posterior en Tris-HCl 50 mM a pH 7.8 y ZnCl2 50 µm. Se determinó la concentración de proteína de es-LAPasa después de cada paso de purificación como lo describe Pulido-Cejudo [J. Chromatogr. B 660 (1994) 37-47)]. Explicado brevemente, las muestras (100 - 200 µl) se dializaron contra agua deionizada y 2 a 20 µl de cada uno se colocaron en tubos de polipropileno. Las muestras se secaron durante 60 minutos a 110°C durante 90 minutos y subsiguientemente se neutralizaron con 250 µl de ácido acético glacial. Las muestras entonces se hicieron reaccionar con 500 µl de la siguiente solución de ninhidrina-hidrindantina: 2g de ninhidrina y 150 mg de hidrindantina (Sigma) se disolvieron en 65 ml de 2.metoxietanol y después se agregaron a 35 ml de acetato de sodio 4M (pH 5.5). Los tubos se incubaron a 110°C durante 15 minutos. Antes de leer la absorbancia de las muestras a 570 nm, se agregaron 2.5 ml de etanol al 5%(v/v). Se determinó el contenido de proteína mediante interpolación en una curva de absorbancoia obtenida con las muestras de BSA (1-10 µg). Un resumen del pliegue (fold) de purificación de la LAPasa estimulada por 17-ß-Estradiol a partir de células maternas de carcinomas mamarios humanos se establece en la Tabla 1.

Tabla 1 Resumen de la Purificación de LAP de células maternas humanas de cáncer mamario 1- la cantidad de proteína se determino después de la hidrólisis alcalina y de la detección cuantitativa de ninhidrina del material hidrolizado como lo describe Pulido- Cejudo et al. [J. Chromatogr. B 660 (1994) 34-47)]. 2- determinado fluorometricamente usando leucina-ß-naftilamida como un sustrato como lo describe [Kuramochi, H., et al. (1987) J. Antibiot., 40, 1605-1611].

Ejemplo 2: A) Producción y purificación de anticuerpos monoclonales En la producción de la línea celular 7B6 de hibridoma que secreta el anticuerpo monoclonal de ratón contra la LAPasa estimulada por 17-ß-Estradiol, los protocolos para la preparación de antígenos para inmunización, la preparación de las células de bazo de animales inmunes, la fusión de las células de bazo con células de mieloma yel cultivo en placas de las células fusionadas en medios selectivos se condujo siguiendo los lineamientos detallados, descritos por Campbell [Burdon RH, Knippenberg PHV (eds): Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Ámsterdam, Elsevier, p219 (1984)] y por Lietzke y Unsicker [Leitzke R. Unsicker K: A Statistical Approach to Determine monoclonality after limiting cell plating of a hybridoma clone, J Immunol Methods 76:223 (1985)].

Explicado brevemente, la inmunización primaria se realizo con es-LAPasa purificada seguida del proceso de salting out. Se realizaron estímulos con es-LAPasa purificada en los días 14, 35 y 56. Se exploraron mediante pruebas de tamizaje los ratones BALB/c en los días 24 y 45. Los ratones se sacrificaron en el día 59 y las células del bazo del ratón con mejor respuesta se fusionaron con células de mieloma. Se realizó el tamizaje mediante una inmunotinción de la mancha puntual sobre nitrocelulosa.

El clon de hibridoma 7B6 se obtuvo mediante la clonación de una sola célula usando diluciones limitantes. Se prepararon cuatro tubos de dilución en serie que contenían células de hibridoma con suplemento para medio con FBS al 20% + 2X OPI. 100 µl de cada dilución se cultivaron en pozos de una placa con 96-pozos con 50 µl de células de alimento para las células de bazo en cada pozo y se colocaron dentro de un incubador a 37°C con 5% de CO2. En el día 7, el sobrenadante de cada pozo se retiró y se sometió a las pruebas de tamizaje mediante inmunotinción de manchas puntuales sobre nitrocelulosa.

B) Expansión del clon de hibridoma 7B6 Las células 7B6 clonadas del hibridoma se transfirieron de la placa de 96 pozos a 0.5 ml de medio complementado con FBS al 20% + 1XHAT en una placa de 24 pozos. Una vez que las células estaban densas, se transfirieron a 5 ml en un recipiente de 60 mm y después se transfirieron a 10 ml en un recipiente de 100 mm. Una vez en el recipiente de 60 mm, a las células se les excluyó la hipoxantina, timidina y aminopterina. Las células 7B6 de hibridoma continuaron creciendo hasta la fase log del crecimiento. El anticuerpo Mab 7B6 anti- es-LAPasa se aisló a partir del sobrenadante de células de hibridoma 7B6 recolectado mediante cromatografía de afinidad usando IgG inmunopura como lo describe el fabricante. El tamizaje se realizó mediante una inmunotinción de manchas puntuales sobre nitrocelulosa.

C) Inmunotipificación de Mab 7B6 El isotipo de Mab 7B6 se determinó usando el Kit de inmunotipificación de Sigma.

Explicado de manera breve, el ensayo involucra la unión de Mab 7B6 a una membrana de nitrocelulosa de isotipificación precubierta seguida de la inmunodetección usando un sistema enzimático de detección sensible a biotina-avidina-. El isotipo de la inmunoglobulina se revela por autodescripción.

D) Inmovilización de Mab 7B6 a la matriz de la proteína G.

Después de la purificación del Mab 7B6, subsiguientemente se inmovilizo el isotipo IgGl correspondiente a un sistema DSS de enlace cruzado de Pierce (Rockford, IL, USA) de acuerdo con los procedimientos descritos por el fabricante. Se usaron las matrices de Mab 7 B6 Proteina G para inmunoprecipitar selectivamente la actividad de la LAPasa de las fracciones del plasma o unidas a la membrana celular antes de determinar la actividad de la LAPasa.

Ejemplo 3: Análisis ELISA de la línea celular materna de carcinoma mamario humano Los análisis ELISA de las líneas celulares maternas de carcinoma mamario humano se condujeron para demostrar la reactividad de Mab 7B6 contra la LAP humana. Explicado de manera breve, 50000 células maternas se cultivaron por pozo en una placa de 96 pozos en medio 1640 RPMI + FCS al 10% + Penicilina 100 U/ml + Estreptomicina 100 µg/ml. Las células en los pozos se cultivaron a 37°C con 5% de CO2 durante 24 horas. Los sobrenadantes celulares se retiraron, las células se lavaron con PBS y se fijaron subsiguientemente con glutaraldehído al 1% en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. El lavado con PBS ocurrió antes de bloquear con caseína durante 1 hora a 37°C con 5% de CO2. después de otro lavado con PBS, se agregaron diluciones en serie de Mab 7B6 a los pozos y se dejo incubando durante 2 horas a 37°C con CO2 al 5%. La demostración de la reactividad de Mab 7B6 fue evidente al agregar el segundo anticuerpo, anti-(IgG + IgM) de cabra conjugado con peroxidasa anti IgG de ratón + IgM (H+L) seguido de sustrato, OPD. Un resumen de las lecturas tomadas a 490 nm se establecen en la Tabla 2.

Tabla 2 Resumen de la reactividad de Mab 7B6 contra células maternas de carcinoma mamario humano.

Ejemplo 4: Niveles de LAPasa en sobrenadantes de células después de la estimulación con estrógenos.

Las células maternas primarias de carcinoma mamario se incubaron con 17-ß-Estradiol durante 24 horas y el medio de cultivo para células solo como control. La LAPasa que estaba en sobrenadantes se aisló usando cuentas de Mab 7B6(igGia)-proteína G-LA asa preparadas enlazando covalentemente al anticuerpo monoclonal. La actividad de la LAPasa de los sobrenadantes inmunoprecipitados por LAPasa se determinó fluorometricamente usando leucina-ß-naftilamida como sustrato, como lo describe Kuramochi et al. [Kuramochi, H. Et al., (1987) J. Antibiot., 40:1605-1511].

Las preparaciones purificadas de la enzima obtenidas de Sigma se incubaron con 17-ß-Estradiol 100 nM durante 24 horas. La actividad de la LAPasa se determinó fluorometricamente usando leucina-ß.naftilamida como el sustrato descrito por Kuramochi et al. [Kuramochi, H. Et al., (1987) J. Antibiot., 40:1605-1611].

Después de la estimulación con estrógenos, se observó la liberación máxima de LAPasa a una concentración de estrógenos de 100 nM después de 24 horas de incubación (véa la Fig. 1).

Durante el mismo periodo, la LAPasa en los sobrenadantes celulares de las células control permaneció sin cambio. Además, la actividad de la LAPasa se determino en sobrenadantes de líneas celulares maternas inmunoprecipitadas con Anticuerpos unidos a la matriz de Mab 7B6(_gGia)-proteína G-LAPasa. Estos resultados muestran que la actividad de la LAPasa extracelular de las células estimuladas con estrógenos (100 nM) fue de 7J x 10" 5 U/ml en comparación con el 6-.4 x 10"6 U/ml detectado en el sobrenadante de células maternas incubadas durante 24 horas con medio de cultivo para células solo como control. Además no hubo efecto de la incubación del estrógeno sobre la actividad de la LAPasa en preparaciones purificadas de esta enzima sola. De manera colectiva, estos resultados sugieren que el efecto del estrógeno en la actividad de la LAPasa abarca un proceso mediado por células.

Ejemplo 5: LAPasa que responde al estrógeno en mujeres con cáncer mamario.

La unión del Mab 7B6 a las células maternas detectadas mediante inmuno flujocitometrí a puede usarse para detectar células circulantes parecidas a células epiteliales en mujeres con cáncer mamario. Además, los inmunoprecipitados del plasma que usaron Mab 7B6 consistentemente muestran niveles más altos de LAPasa en mujeres con carcinomas no invasivos de los conductos y carcinomas metástasicos cuando se comparan con los niveles plasmáticos de mujeres sanas.

A) Actividad de la LAPasa en plasma de mujeres con cáncer mamario primario La actividad de la LAPasa en el plasma de pacientes con recaídas con cáncer mamario primario comparadas con los controles de edades correspondientes de mujeres sanas, se determinó fluorometricamente usando leucina-ß-naftilamida como el sustrato como lo describe Kuramochi et al. La reacción se detuvo calentando a ebullición las muestras a 100°C durante 10 minutos, seguido por centrifugación a 780 X g a 4°C durante 10 minutos. Los valores obtenidos representan el promedio de la actividad de la LAPasa determinada por triplicado en 16 pacientes de cada grupo de prueba.

La actividad de la LAPasa se determinó usando inmunoprecipitados plasmáticos obtenidos mediante inmunoprecipitación usando matrices covalentes de Mab 7B6(gGia)-Proteína G-LAPasa. Explicado de manera breve, el plasma se centrífugo a 500 x g durante 10 minutos a 4°C. El plasma se retiró mediante aspiración y se centrífugo una vez más a 500x g durante 5 minutos a 4°C. El plasma resultante se diluyo 1 :10 con PBS y 800µl de dilución de plasma se agregaron a las cuentas de Mab 7B6(igo?a)-G-LAPasa que contenían 5 µg de anticuerpo en 200 µl de cuentas pre-incubadas con buffer de bloqueo [Tris-HCl 50 mM; leche deshidratada descremada al 0.5% (NFDM-Non-Fat Dried Milk)]. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente (~22°C) durante 15 minutos con agitación suave y constante en tubos Eppendorf pre-cubiertos con BSA al 0.5%. Después de la incubación las muestras se centrifugaron a 250x g en la microcentrifuga Eppendorf-Microfuge y se retiraron los sobrenadantes a temperatura ambiente. Las cuentas que contenían actividad LAPasa se lavaron inmediatamente con PBS; NFDM al 0.5%) y finalmente se resuspendieron en solución de Hank libre de calcio haciendo un volumen final de reacción de 600 µl y 1 -leucina-ß-naftilamida 182 µM. Se uso un blanco correspondiente sin cuentas LAPasa-Mab 7B6(igcia) covalentes- recubiertas con NFDM al 0.5% como valor basal.

Usando la inmunoprecipitación selectiva del plasma incubado con la matriz- -anti- LAPasa Mab-Proteína G, se encontró que la actividad de LAPasa en el plasma de mujeres con enfermedad metástasica fue cuatro ordenes de magnitud más alta que en la población control. Tal aumento en la actividad de LAPasa fue menos predominante en pacientes con carcinoma de los conductos in situ (DCIS). En la Tabla 3 se proporciona un resumen de los resultados.

Tabla 3 Niveles de actividad de LAPasa en el lasma de mu eres con cáncer mamario Una unidad de LAPasa se define como la cantidad de enzima requerida para hidrolizar 1 µmol de L-leucina-ß-naftilamida por minuto a pH 7.5 y 37°C.

B) Detección por citometría de flujo de células de carcinoma mamario parecidas a células de epitelio La tinción indirecta por inmunofluorescencia de las células de biopsias parecidas a células epiteliales se realizo incubando las células adherentes con anticuerpos Mab 7B6 pre-adsorbido de suero humano? • Explicado de manera breve, las células confluentes se lavaron inmediatamente con PBS y se incubaron a 37°C con 20 µl de anticuerpos Mab 7B6 (200 µg/ml) o IgGl de ratón control en un volumen final de 2 ml. Después de 20 minutos las celdas de incubación se lavaron inmediatamente una vez más con PBS y se incubaron con anti-lgG-PE de ratón o con conjugados anti-IgG-FITC de ratón durante 15 minutos.

Las células se lavaron subsiguientemente tres veces con PBS, se tripsinizaron parcialmente y se analizaron en'un citometro de flujo equipado con un láser iónico de argón enfriado con aire operando a 10 mwatt. La excitación simultánea de los conjugados FITC y PE se logro fijando la longitud de onda de excitación a 488 nm.

Como se muestra en la Tabla 4, el Mab 7B6 puede usarse para detectar la LAPasa unida a la membrana en las células aisladas a partir de carcinomas mamarios humanos parecidos a células epiteliales. El tamizaje de la reactividad de la LAPasa en las células circulantes se examino en mujeres normales y se comparo con aquellas con carcinoma de los conductos in situ y con carcinomas mamarios metástasicos. Explicado de manera breve, la sangre entera se centrífugo y se removió la capa amarillenta. Las células dentro de la capa amarillenta se lavaron inmediatamente con PBS y se incubaron con Mab 7B6 [20 µl de anticuerpos Mab 7B6 (200 µg/ml) o IgGl de ratón control* en un volumen final de 2 ml de PBS; NFDM al 0.5%. El % de células Mab 7B6 en esta fracción se estimo subsiguientemente mediante citometría de flujo.

Tabla 4 LAPasa unida a la membrana en células aisladas de carcinomas mamarios humanos parecidas a células epiteliales.

C) Niveles de LAPasa en el plasma de mujeres con cáncer mamario primario Los niveles de LAPasa en el plasma de mujeres con cáncer mamario primario comparadas con las mujeres control sanas de edades correspondientes, se determinaron por ELISA usando el anticuerpo monoclonal Mab 7B6.

Los inmunoprecipitados de plasma que usan Mab 7B6 consistentemente muestran niveles más altos de LAPasa en mujeres con carcinomas no invasivos de los conductos o carcinomas metástasicos cuando se compararon con los niveles plasmáticos de mujeres sanas. Un resumen de los resultados obtenidos se establece en la tabla 5.

Tabla 5 Niveles de LAPasa en el plasma de mujeres con cáncer mamario Todas las referencias citadas y las Patentes o solicitudes de patentes se incorporan aquí mediante referencias.

El presente invento se ha definido en términos de ciertos ejemplos, los que no deben ser limitantes. El alcance total del presente invento se define en las siguientes declaraciones.

Ejemplo 6: Inhibidores de la es-LAPasa La Tioredoxina humana se purificó a partir de las células CD +T MP6 como lo describen Rosen y col. [Rosen, A. Y col. (1995) Int. Immunol. 7, 625-633] se comparo con la actividad de la tioredoxina de E. coli comprada a SIGMA-ALDRICH Canadá )Oakville, Ontario, Canadá).

La tioredoxina se unió covalentemente a través de un enlace amida a la matriz de unión Ultralink EDC/DADPA (Pierce, Rockford, IL USA) haciendo reaccionar 5 mg de Tioredoxina purificada con. , la matriz carbodiimida EDC/DADPA siguiendo el procedimiento proporcionado por el fabricante.

Las mediciones de la LAPasa se realizaron espectrofotométricamente a 330 nm para medir la formación de producto de ß-naftilamina, usando 1 -leucina-ß-naftilamida 182µM como el sustrato. Los ensayos cinéticos se realizaron usando un espectrofotómetro Spectronic Génesis 5 de Milton Roy (Rochester, NY). La absorbancia se registró cada sesenta segundos, durante un. periodo de 30 minutos. Los ensayos cinéticos de las enzimas se realizaron usando 8.0 x 10"2U de es-LAPasa en un volumen final de reacción de 600µl y muestras por triplicado. La mezcla de reacción contenía los siguientes materiales agregados en orden y todos mantenidos en hielo antes de usarse: es-LAPasa, solución de Hank libre de calcio haciendo un volumen final de 600µl y 1-leucina-ß-naftilamida 182µM. Un blanco correspondiente sin es-LAPasa se uso como valor basal. Ambas celdas se transfirieron al espectrofotómetro en donde la solución de 1 -leucina-ß-naftilamida se agregó al último, marcando el tiempo cero de la reacción. Los estudios de inhibición se llevaron a cabo en la presencia de Bestatina 167µM, glutatión reducido 167µM y tioredoxina reducida 17µM.

La Figura 2 muestra el efecto inhibitorio de la Bestatina y los dos péptidos que contienen tiol, la tioredoxina reducida y el glutatión reducido respectivamente. La Es-LAPasa mostró velocidades significativamente más lentas de reacción en presencia de tioredoxina y glutatión en comparación al observado en la es-LAPasa control. Además, las velocidades de reacción de la es-LAPasa fueron más lentas en presencia de tioredoxina 17µM cuando se comparó con la observada en las muestras incubadas con glutatión reducido 167µM. Además, la Bestatina 167µM inhibe claramente la actividad de la es-LAPasa. Como se muestra en la Tabla 6, la tioredoxina reducida es un inhibidor efectivo de la actividad de la es-LAPasa. El análisis de las máximas velocidades de reacción (Vmax), las constantes de Michaelis-Menten (Km) y las constantes de inhibición (Ki) para cada inhibidor como se presentan en la Tabla 6 revela diferencias significativas en las propiedades inhibitorias de cada péptido. Al respecto, la es-LAPasa incubada con Bestatina muestra un valor de Vmax muy similar al observado con la es-LAPasa sola y un valor Km significativamente mayor. Estos datos confirman la naturaleza competitiva de la inhibición de la es-LAPasa. Por el contrario, la es-LAPasa incubada con tioredoxina reducida conduce a una Vmax significativamente más baja y una Km con un valor Ki intermedio cuando se comparó con aquellas obtenidas para Bestatina y glutatión. Colectivamente estos datos sugieren que la tioredoxina reducida inhibe a la es-LAPasa en una modalidad incompetitiva mientras que la inhibición de la es-LAPasa por glutatión reducido es no competitiva.

Tabla 6 Constantes de Inhibición de es-LAPasa por bestatina, tioredoxina reducida y glutatión Vmax Km Ki (10"6 M/min) (10"4M) (10"6M) LAPasa sola 36.8 ±1.9 1.67 ±0.14 N/A Bestatina 167 µM 34.0 ±3.9 48.7 ±8.4 6.22 ±1.61 Tioredoxina 17 µM 5.31 ±0.02 0.234 ± 0.006 3.40 ±0.58 Glutatión 167 µM 17.2 ±1.5 1J8±0.25 1.53 ±0.40

Claims (15)

LAS REPRESENTACIONES DEL INVENTO EN LAS CUALES SE RECLAMA UNA PROPIEDAD DEL PRIVILEGIO, SE DEFINEN DE LA SIGUIENTE MANERA:

1. Anticuerpos monoclonales específicos para leucina aminopeptidasa humana estimulada por estrógenos soluble o asociada a la membrana.

2. Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la declaración 1, especifico para la es-LAPasa humana, producido por la línea celular de hibridoma 7B6, depositado con la Autoridad Internacional de depósito de Canadá bajo el número de acceso IDAC-230300-1.

3. Una línea celular de hibridoma, la cual produce un anticuerpo monoclonal especifico para la es-LAPasa-soluble o asociada a la membrana.

4. La línea celular de hibridoma de acuerdo con la declaración 3, depositada en la Autoridad Internacional de Depósitos de Canadá bajo el número de Acceso IDAC-230300-1.

5. Un método para detectar el cáncer mamario en una paciente determinando el nivel de es-LAPasa en una muestra.

6. El método de acuerdo con la declaración 5 en donde el nivel de es-LAPasa se determina mediante un método elegido del grupo que consiste en: determinación de la actividad de la es-LAPasa en una muestra, y la determinación de la presencia de es-LAPasa en una muestra mediante inmunoensayo.

7. El método de acuerdo con la declaración 6 en donde la presencia de es-LAPasa se determina mediante un inmunoensayo usando un anticuerpo monoclonal el cual es especifico para la es-LAPasa soluble o asociada a la membrana.

8. El método de acuerdo con la declaración 7 en donde el anticuerpo monoclonal es producido por la línea celular de hibridoma 7B6, depositado con la Autoridad Internacional de Depósitos de Canadá bajo el número de acceso IDAC-230300-1.

9. Un método para detectar cáncer metastásico en una paciente determinando el nivel de es-LAPasa en una muestra.

10. El método de acuerdo con la declaración 9 en donde el nivel de es-LAPasa se determina mediante un método elegido del grupo que consiste en: determinación de la actividad de la es-LAPasa en una muestra, y determinación de la presencia de es-LAPasa en una muestra mediante un inmunoensayo.

11. El método de acuerdo con la declaración 10 en donde la presencia de es-LAPasa está determinada mediante un inmunoensayo usando un anticuerpo monoclonal que es especifico para la es-LAPasa soluble y la es-LAPasa asociada a la membrana.

12. El método de acuerdo con la declaración 11 en donde el- -anticuerpo monoclonal es producido por la línea celular de hibridoma 7B6, depositado con la Autoridad Internacional de Depósitos de Canadá, bajo el número de acceso IDAC-230300-1.

13. Un anticuerpo monoclonal, específico para la es-LAPasa humana, producido por el hibridoma de la línea celular 7B6, depositado en la Autoridad Internacional de Depósito de Canadá bajo el número de acceso IDAC 230300-1, Marzo 23, 2000.

14. Un método de detección de cáncer de mama en un paciente mediante la determinación de los niveles de es-LAPasa en una muestra mediante un inmunoensayo utilizando el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma de la línea celular 7B6, depositado en la Autoridad Internacional de Depósito de Canadá bajo el número de acceso IDAC 230300-1, Marzo 23, 2000.

15. Un método de detección de cáncer metastático en un paciente mediante la determinación de los niveles de es-LAPasa en una muestra mediante un inmunoensayo utilizando el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma de la línea celular 7B6, depositado en la Autoridad Internacional de Depósito de Canadá bajo el número de acceso IDAC 230300-1, Marzo 23, 2000.