CN1382059A - 预防和减少hiv感染的方法和药物成分 - Google Patents

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Abstract

尽管已经对HIV的遗传结构,HIV的几种结构和地理群有较深和广泛的理解,但是在预防和治疗爱滋病方面所取得的成功还是很有限的。这里所描述的是用es－LAPase抗体,一种或多种LAPase活性抑制剂,或它们的结合使用来预防和降低HIV感染性的方法。也描述了用es－LAPase抗体,一种或多种es－LAPase活性抑制剂,或抗雌激素化合物来预防和降低HIV感染性的方法。提出了新的药物组成。

Description

预防和减少HIV感染的方法和药物成分
此项发明阐述抑制HIV感染的方法。这一方法使用对雌激素-受激亮氨酸氨基太酶(es-LAPase)抗体或一个及更多的es-LAPase活性抑制剂，以及它们相结合。这是一个通过使用对es-LAPase抗体，一个或多个es-LAPase活性抑制剂和抗-雌激素化合物抑制HIV传染的方法。抑制HIV感染的新成分也是其中之一。
发明背景
尽管已经对HIV的遗传结构，HIV的几种结构和地理群有较深和广泛的理解，但是在预防和治疗爱滋病方面所取得的成功还是很有限的。虽然众所周知HIV及其变种是导致人类获得免疫缺陷综合症(AIDS)的主要因素，但是对导致病毒进入的早期分子机制的关键细胞因子的认识和理解还较少。
无论是在活体还是在试管进行的研究都表明HIV感染的主要目标是CD4T-细胞。在T-细胞表面的CD4糖蛋白对HIV病毒有高度亲和力。其它分子，特别是来自化学增活受体家族的分子也参与促进病毒进入靶细胞。
抑制HIV感染病人病情发展的治疗形式主要在于两种药物：逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂。尽管在减缓病毒复制方面是成功的，但受到在病毒内的高速致突变剂的限制，导致药物结合点的改变及伴随的药效丧失。解决这一问题的方法之一时同时使用几种药物来降低病毒抗药株发展的可能性。然而，这种多药物配方引起一系列的副作用，结果顺应性降低。
进一步，目前对某些特殊病人如妇女的HIV感染的治疗无特效。最近的报导发现从1991年到1995年HIV感染的妇女数量增加了63％，高于其它任何爱滋病人组，不论什么种族和感染方式。其它报导也证实了妇女(25-44岁)爱滋病发病率和死亡率增加。妇女爱滋病例增加的原因还未知。不仅妇女比男性易于感染，而且抗HIV药物对女性和男性的作用也有很大区别。例如，毒性，副作用，及血液水平也有性别差异。男性和女性激素差别被用来解释这种差别，但并没有明确的迹象。根据以上数据，必须根据男性和女性感染过程的差异制定治疗方案以改进疗效。
CD4，假定的HIV受体，和化学增活共同受体(CKR-5，CCR-5和CXCR-4)的作用是独立的，我们描述过其在HIV病毒通道的内膜上和细胞外LAPase的重要作用。
此发明通过LAPase活性与雌激素的联系克服了原来技术上的限制。这一联系被用来发现新的HIV病毒抑制剂，此抑制剂可以单独使用或与改进功效一起使用。
发明概述
这项发明涉及用es-LAPase抗体或es-LAPase活性抑制剂，或两者结合，抑制HIV感染的方法。进一步说明用es-LAPase抗体或es-LAPase活性抑制剂及抗-雌激素化合物抑制HIV感染的方法。新HIV感染抑制剂也是此发明的一部分。
因此，此研究提供了降低HIV对含有足量LAPase抑制剂T-淋巴细胞感染的方法。
此研究进一步提供了降低HIV对T-淋巴细胞的感染性的方法，这些细胞含有足量LAPase特异抗体，更具体讲，是对es-LAPase的特异性单克隆抗体。
此研究也提供了降低HIV对T-淋巴细胞的感染性的方法，这些细胞含有足量LAPase特异抗体，及LAPase抑制剂。
此研究也提供了降低HIV对T-淋巴细胞的感染性的方法，这些细胞含有足量LAPase特异抗体，LAPase抑制剂及抗雌激素化合物。
进一步，根据我们的发明，提供了预防或降低HIV感染性的方法，包括给病人所需要的有效量的含有对es-LAPase抗体药物及药物载体。
我们还提供了预防或降低HIV感染性的方法，包括给病人服用所需要的含有LAPase抑制剂药物及药物载体。
这一发明提供了预防或降低HIV感染性的方法，包括给病人服用所需要的含有对es-LAPase特异性抗体药物，LAPase抑制剂及药物载体。
这一发明还提供了预防或降低HIV感染性的方法，包括给病人服用所需要的含有es-LAPase特异性抗体，LAPase抑制剂和抗-雌激素化合物的药物及药物载体。
我们的研究还提供es-LAPase特异性抗体，LAPase抑制剂。
我们的研究还提供es-LAPase特异性抗体，LAPase抑制剂和抗-雌激素化合物。
图例解释
以下用图说明试验特点：
图一：说明乳腺癌细胞系细胞上清液中雌激素对LAPase活性的作用。
图二：原始SDS PAGE(lane1)，提纯的LAPase(lane2)的MAb 7B6 Westernblot结果。
图三：由Bestatin，thioredoxin和glutathione进行的LAPase抑制剂的动力学。
优选实施方案的描述
此项发明阐述抑制HIV感染的方法。这一方法使用对es-LAPase抗体或对es-LAPase活性抑制剂，或两者相结合。这是一个通过使用es-LAPase抗体，es-LAPase活性抑制剂和抗雌激素化合物抑制HIV传染的方法。抑制HIV感染的新成分也是其中一部分。
我们观察到CD4这一假定的HIV受体的独立作用，和B-化学增活共同受体(CKR-5，CCR-5和CXCR-4)的作用，在HIV病毒内膜上和细胞外LAPase都可以促进HIV进入T淋巴细胞。
我们的研究揭示雌激素和雌激素类似物能刺激乳腺癌母细胞和T淋巴细胞中LAPase的活性。研究目的之一是鉴别和提纯受雌激素刺激的LAPase同功酶，即es-LAPase。具体细节在本文的参考文献“对雌激素刺激的亮氨酸氨基太酶”中介绍。
另一方面是制备抗es-LAPase同功酶的抗体。抗体的制备方法是众所周知的。一般说来，通过用抗原免疫动物如小鼠，大鼠，兔，羊，马或牛来制备产生抗体的细胞。。免疫步骤及抗原浓度取决于能够提供足够量的产生抗体的细胞。这些产生抗体的细胞可以是脾细胞，淋巴细胞，淋巴结细胞或外周血淋巴细胞。
选择适当的融合启动子，使这些产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合，细胞系可以来源于各种动物如鼠，兔及人类。许多小鼠骨髓瘤细胞系是已知并可从医学科学团体及各种储存机构获得如美国分类培养收集机构。所用的这些骨髓瘤细胞对培养基应具有选择性以使未融合的骨髓瘤细胞在选择性介质中不能存活，而杂交细胞则能存活。最常用的细胞系是抗8-氮鸟票呤系，它含有较少的次黄票呤-鸟票呤-磷酸核糖转移酶，因此不能在HAT培养介质中生长。一般说来，该细胞系应是“非分泌”类，因而不产生抗体。所选的融合启动子是聚乙二醇，其分子量在1000到4000之间。也可用聚乙烯醇，病毒或电场作为融合启动子。
这些存活的细胞(杂交物)需经筛选，找出能分泌特异性抗体的细胞。通常用ELASA进行初选。进一步，将这些杂交物培养上清液加到预先涂好抗原的微滴定盘中，这里所用的抗原是es-LAPase。培养上清液的特异抗体可用第二标记抗体检测。最常用的第二抗体是用过氧化物酶标记的羊-抗-鼠IgG，可购得商品抗体。对es-LAPase呈阳性的培养液用限制稀释法克隆。第二杂交物培养液用上法进行再筛选，阳性培养液用BIAcore(Pharmacia Biosencer AB，Uppsala，Sweden)系统检测。通过测定抗体是否与抗原结合来评估培养液并测定抗原结合的动力学参数。对选择的培养液再克隆直到培养液稳定并获得克隆。刚杂交之后的融合产物含有大约80个染色体。克隆过程是选择那些仍保留抗体生产的染色体密码的细胞。克隆过程一直重复到100％的亚群呈现特异性抗体的生产，这代表杂交物“稳定”。此外杂交物培养皿可有多种克隆，其中有些可能不产生抗体。克隆过程允许选择从单一细胞衍生的阳性杂交物。
具体实验提供了被称为MAb 7B6的对es-LAPase单克隆抗体。这一单克隆抗体不能抑制LAPase的酶活性。因此，以后我们将其称为非抑制单克隆抗体。产生这一单克隆抗体的杂交瘤细胞系，根据布达佩斯协议于2000年3月23日存放在加拿大国际存放机构。
此外，此发明还包括MAb7B6和任何具有抗体活性结合区域的片段，如Fab，F(ab)2和Fv片段。这些片段可用已知技术从7B6抗体获得。
更具体的还有一些能够结合相同抗原测定物如7B6抗体的抗体和片段。包括，但并不限制在，与7A6抗体有相同抗原性却来源不同种或有不同生长环境或具不同结合亲和力的抗体。显然这一类抗体及其抗体的变种可用重组类转换和融合技术制备，这些技术可在“技术”里找到。
这些单克隆抗体可用生物反应器或从腹水中生产，这两种方法均来自“技术”里。
我们的发明还提供了减少HIV感染的方法，此法在HIV-1感染前或感染过程中将MAb 7B6与T-淋巴细胞一起恒温。这一恒温能预防和减少HIV-1对T-淋巴细胞的传染性。尽管在实例里没有介绍，这一实验在HIV感染后将T-淋巴细胞与MAb 7B6一起恒温以减少进一步感染。
单克隆抗体可以直接加到恒温介质中或结合到固体基质上。任何基质都可用作固体基质。正如每一个懂此技术的人所知，加到上面的抗体一直结合到不影响抗体与LAPase的结合。这一固体基质可以是(并不仅限于)蛋白G基质。没有任何理论限制，抗体与基质的结合能够降低抗体与epitope的非特异性结合。
许多技术能测定T-淋巴细胞对HIV的感染。三个常用的方法是病毒capsid蛋白p24产品定量，cyopathycity及用PCR测定proviral load.还有其它人们所知的测定HIV感染性水平的方法。
根据我们的研究，抗-es-LAPase抗体被用来降低HIV感染。这一实验所用浓度为50-200ng抗体/10ml细胞，细胞密度为1.0×105细胞/ml。最佳抗体量可由有经验的人通过实验决定。我们的实验之一用的抗体浓度为100ng/10ml细胞。
我们还发现含硫醇的化合物意外地抑制了es-LAPase的活性。含硫醇化合物指所有带有SH基团的化合物，例如失去半胱氨酸基的太。我们所发现的抑制es-LAPase的物质有thioredoxin和glutathione。
因此，进一步研究出一方法，在HIV感染之前和感染过程中，将es-LAPase抑制剂与T-淋巴细胞一起恒温。根据这一方法，es-LAPase活性抑制剂可以是竞争性，不竞争的(uncompetitive)或非竞争性(non-competitive)的抑制剂。这些术语的意义来自于众所周知的酶动力学理论文章。不竞争抑制剂指thioredoxin，非竞争抑制剂指glutathione。
LAPase抑制剂可以直接加到恒温介质中或结合到固体基质上。任何基质都可用作固体基质。正如每一个懂此技术的人所知，加到上面的抑制剂一直结合到不影响抑制剂与es-LAPase的结合。这一固体基质可以是，并不仅限于，DPDP，一种氨化物键合基质(Pierce，Rockford，IL，USA)。
根据我们的研究，es-LAPase活性抑制剂被用来降低HIV感染。这一实验用浓度为10-8M-10-5M的抑制剂处理细胞，细胞密度为1.0×105细胞/ml。最佳抑制剂量可由有经验的人通过实验决定。我们的实验之一用的抑制剂浓度为4-8ng/ml细胞。
因此，另一方法，在HIV感染之前和感染过程中，将es-LAPase抗体和es-LAPase抑制剂一起与T-淋巴细胞恒温。将抗体和抑制剂共同使用，其方法与前述的单独使用方法一样。
据文献报导，三苯氧氨，一种抗-雌激素化合物，能够降低HIV传染性。但是，在三苯氧氨浓度为10-6M或更高时有不完全抑制HIV感染的现象。用我们的实验方法，不仅用三苯氧氯而且用其它抗雌激素药物与esLAPase抗体和LAPase抑制剂一起使用来降低HIV感染。
我们所用的抗雌激素化合物来自于下列化合物：4-hydroxyandrostenedione，Raloxifen，3B，5-tetrahydro Norethisterone，Tamoxifene和Idoxifene。抗雌激素化合物最终浓度范围为10-6M-10-8M。该方法中其它组分得浓度如前所述。
竞争性es-LAPase抑制剂也可以和上述化合物同时使用。较适当的竞争性抑制剂为Bestatin，但也可用Amastatin作为竞争性抑制剂。
我们还发明了用es-LAPase抗体，或一种或多种es-LAPase活性抑制剂，或它们结合使用对HIV感染的或有感染危险的病人的治疗方法。还可以用es-LAPase抗体，或一种或多种es-LAPase活性抑制剂与抗雌激素一起对HIV感染的或有感染危险的病人进行治疗。我们还提供了含有es-LAPase抗体的药物组成。这些药物组成含有一个或多个LAPase活性抑制剂。进一步的药物组成有es-LAPase抗体和一个或多个LAPase活性抑制剂。还可用含有es-LAPase抗体和一个或多个LAPase活性抑制剂及抗雌激素化合物的药物。
目前发明的药物组成应含有至少一种能达到治疗量的化合物和一种有药效的药物载体。所用的抗体可以选择各种给药途径使药物活性成分能够到达哺乳动物体内的药物作用点。抗体的关键作用是能够到达并和膜键合的及细胞多余的es-LAPase结合。由于经口服和非肠道服用如静脉注射，皮下注射及肌肉注射的蛋白质需经过消化，因此，能被很好地吸收。
这一抗体可以单独用作治疗药物，也可以与前面所提到的治疗药物一起使用。虽然可以单独使用，但通常与药物载体一起用。这些载体是根据服药途径和标准药物实践选用的。
服药剂量是随一些已知因素而改变的，如药代动力学特性，给药方式和途径，年龄，健康，服药者的体重，病的性质和程度，现用的治疗方法，频率和所期望的结果。通常活性成分的每日计量为0.1到100mg/每公斤体重。常量为0.5-50，最好为1-10mg/公斤体重/天，分1到6次服用，或用缓释剂性以得到所期望的结果。
内服的剂量形式一般为每单位含1到500mg活性成分。在这些药物组成中活性成分的重量百分比为0.5-95％，取决于药物组成的总重量。
肠道给药，可将抗体与肠道药物载体一起制成液体，悬浊液，乳浊液或冻干粉末剂型。载体可以是水，盐水，Ringer溶液，葡萄糖溶液或5％人血白蛋白。也可以用脂质体和非水载体如特定的油。载体或冻干粉末可能含有附加剂以保持等渗(如氯化钠，甘露醇)及化学稳定性(如缓冲液和防腐剂)。这一制剂用常用方法灭菌。
进一步的实验，如前面所详细讨论的，把抗体与一种或多种LAPase抑制剂同时服用。加入的LAPase抑制剂剂量约为0.1-100mg/公斤体重。
如前面详细介绍过的，抗体还可以与一种或多种抗-雌激素化合物一起服用。这一例子中，加入的抗-雌激素化合物的剂量约为0.1-100mg/公斤体重。
如前所述，抗体也可以与一种或多种LAPase抑制剂及一种和多种抗-雌激素化合物联合使用。加入的LAPase抑制剂和抗-雌激素化合物剂量均为0.1-100mg/公斤体重。
药物成分的抗体和抑制剂可以和前面提到的基质溶在一起，只要基质对哺乳动物无毒。抗体和抑制剂与适当基质一起能够辅助这些化合物共同进入脂质粒。
药物组分中的LAPase抑制剂是不竞争抑制剂thioredoxin，其在分解状态下，通过分解组分中的化合物得以维持。这些化合物仅限于glutathione和cysteine。
为了更全面理解我们的发明，特举以下例子。应当理解，这些例子仅用于说明目的，在任何方面都不限制我们的研究范围。
实例
例1：雌激素调节HUT78细胞中LAPase的释放
把CD4+T-HUT78细胞与各种不同浓度的17-B-雌二醇一起培养，用G.Pulido-Cejudo等(Antiviral Research，36：167-177，1997)的方法测定LAPase的水平。
表1显示雌激素在一定剂量能促进HUT78细胞中LAPase的释放，观察到的产生最大刺激时的浓度为10-7M。
表1：细胞外与17-B-雌二醇一起培养HUT78细胞LAPase的活性
                                LAPase activity(U*×10-5/ml)B-Estradiol    Control                   17-B-Estradiol Stimulation10-5M           4.2                 10.810-6M           5.6                 20.410-7M           4.8                 148.610-8M           5.7                 110.7
*1单位LAPase定义为在pH7.5，37℃时，每分钟水解1umolL-亮氨酸-B-奈氨所需要的酶量。
在雌激素刺激后，从乳腺肿瘤母细胞中LAPase的最大释放量是在经24小时培养后，浓度为100nM时。同一期间，对照细胞上清液中LAPase没有变化。另外，测定用抗-LAP-蛋白G MAb 7B6结合抗体免疫沉淀所得的母细胞系的上清液中LAPase活性。这些结果表明，经雌激素刺激的细胞中的细胞外LAPase活性与作为对照的未经刺激的只含细胞介质的上清液进行比较。此外，在只含这种酶的纯制剂中，雌激素对LAPase活性没有作用。总之，这些结果表明，雌激素对LAPase活性的影响包括细胞调节过程。
例2：es-LAPase的提纯
人类肿瘤组织的乳腺癌母细胞用100nm 17-B-Estradiol刺激24小时，或用培养介质作对照。细胞介质为：RPMI 1640培养介质+10％FCS+100U/ml青霉素+100ug/ml链霉素。经在无缝  葡聚糖试管(MV 12，400)中用PBS降解12小时(4℃)后收集上清液。然后用HPLC-凝胶渗透色谱与DEAE-纤维素和Bestatin-琼脂糖凝胶亲和色谱从降解的细胞上清液中纯化es-LAP。简言之，将细胞上清液倒入Bio-Sil SEC-250柱(600×7.5mm)上，该柱子用含有100mM磷酸钠(pH6.8)，100mMNa2SO4，1uM ZnCl2，和10％甘油缓冲液预先平衡。然后用300ml同样的缓冲液以0.5ml/min.的流速洗涤柱子。用YM5膜高速离心将蛋白浓缩至10ml。浓缩液再经DEAE纤维素柱(2.6×28.5cm)，此柱先用50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)；1uMZnCl2；和10％(v/v)甘油平衡并洗涤。es-LApase用线性洗脱剂(0-1M NaClin Tris缓冲液)以0。5ml/min.的速度洗脱。Bestatin-亲和柱的制备是根据厂家提供的方法，用Ultralink EDC/DADPA Amide结合基质，通过用100mg纯Bestatin和EDC/DADPA基质反应制备的。在加入含LAP的洗涤液之前，将Bestatin亲和柱用10ml Tris-HCl(pH8.0)含1uM ZnCl2缓冲液平衡，再用300ml该结合缓冲液洗涤。es-LAPase用蠕动pump以0.10ml/min.的流速通过这一系统进行再循环两小时。再循环后用八倍柱容量的结合缓冲液洗涤柱子。用线性洗脱液(0-0.5M NaCl)(含有1uM ZnCl2的10nM Tris-HCl pH8.0)洗提Bestatin键合的es-LAPase。在280nm测定洗脱下来的键合es-LAP。提纯的es-LAPase分装成500ul储存于50mM Tris-HCl pH7.8和50uMZnCl2溶液中。-20ul放入聚乙烯管中。样品在110℃干燥60分钟。接著用250ul冰醋酸中和。然后使样品与500ul下列印三酮-还原印三酮溶液反应，该溶液组成为：2g印三酮，150mg还原印三酮(Sigma)溶于65ml 2-甲氧基乙醇，然后加入35ml 4M醋酸钠(pH5.5)。将试管于110℃恒温15分钟。加入2.5ml5％(v/v)乙醇，然后在570nm测定其吸收度。蛋白质含量可由吸收曲线的到，该曲线是由1-10ug BSA的样品测得的。280nm测定洗脱下来的键合LAP。提纯的LAPase分装成500ul储存于50mM Tris-HCl pH7.8和50uMZnCl2溶液中。es-LAPase蛋白浓度用Lowry等的方法测定这一方法是用BSA作为底物。从人类乳腺癌母细胞中纯化17-B-雌二醇-刺激的LAPase概括见表2。在最后一步Bestatin-亲和色谱之后，es-LAPase纯化了大约7000倍。
用亮氨酸-B-奈氨为底物的荧光法测定es-LAPase的活性(kuramochi，H.，et al.1987 J.Antibiot.，40，1605-1611)。
在100℃煮沸10分钟来终止反应，然后在4℃，780xg离心10分钟。所得结果代表三此重复测定的LAPase活性的平均值。表2：从人类乳腺母细胞中提纯LAPase的概括Step          Protein1  Total Activity2 Specific Activity2  Fold    Yield％
            (mg)     (nmole/min)      (nmole/min/mg)Supernatant      15.4    98.21               6.73              1        100Gel Permeation   4.2           82.13               19.55              3.07    83.63Cellulose DEAE   0.72    48.25               67.01             10.51    49.13Bestatin-        0.005   37.11               7422              1165     37.79Sepharose
1.根据Pulido-Cejudo等J.Chromatgr.B660 1994 37-47)的方法用印三酮测定硷水解后的蛋白含量。
2.用亮氨酸-B-奈氨作为底物用荧光法测定(Kuramochi，H.，et al.1987 J.Antibiot.40，1605-1611)。
例3：单克隆抗体的生产和纯化
产生17-B-雌二醇-刺激的LAPase鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞系7B6，免疫抗原的制备，免疫动物脾细胞的制备，脾细胞与骨髓瘤细胞的融合，及融合细胞在选择性介质中的涂铺方法均来自Campbell提出的方法和Lietzhe与Unsicker详细描述的方法。
简言之，基本的免疫反应是用提纯的es-LApase经脱盐后进行的。在第14，35，56天时用提纯的es-LApase促进，在24和45天筛选BALB/C小鼠。小鼠在第59天杀死，将反应最好的脾细胞与骨髓瘤细胞融合。用在硝化纤维上的点图免疫染色进行筛选。
用限制稀释法单细胞克隆获得杂交瘤克隆7B6。准备四个系列稀释试管，其中含有杂交瘤细胞及20％FBS+2X OPI培养液。将每种稀释液100ul加到96孔的盘中，并在每个孔中加入50ul喂养脾细胞，置于37℃，5％CO2培养箱。第七天，从各孔中取上清液，用在硝化纤维上的点图免疫染色进行筛选。
把杂交瘤克隆7B6细胞由96孔盘中转移到0.5ml培养液中，该培养液含有20％FBS+1X OPI+1X HAT放于24孔的盘中。一旦细胞浓缩，将其5mls转移至60mm盘，然后再成10ml转移至100mm盘中。当60mm盘中的细胞被认为没有次黄票呤，胸腺密定脱氧核甘，氨基票呤，7B6杂交瘤细胞将继续生长直到成指数级生长。抗-LAPase，MAb 7B6从收集的杂交瘤7B6细胞上清液中用免疫纯的IgG亲和色谱分离。用在硝酸纤维素上的点图免疫染色进行筛选。
MAb 7B6类型用Sigma的免疫分类试剂测定。即单克隆与预涂分类硝酸纤维膜结合，然后用灵敏的生物素-抗生物素蛋白-酶检测系统进行免疫测定。免疫球蛋白的类型见其性质描述。
人类乳腺癌母细胞进行ELASA分析说明MAb 7B6对NDP-Kinase和LAPase相应的活性。简言之，在96孔的盘上，每孔加入在RPMI 1640培养液中的50000母细胞+10％FCS+100U/ml青霉素+100ug/ml链霉素，于37℃，5％CO2培养24小时。除去上清液，用PBS洗涤细胞，随后用1％gluteraldehydrade的PBS溶液室温下固定1小时。用PBS洗涤，然后用casein在37℃，5％CO2封闭一小时。用PBS洗涤后，在孔里加入MAb 7B6的系列稀释液并在37℃，5％CO2培养2小时。在加入第二抗体，抗-(IgG+IgM)过氧化物酶结合的羊-抗-鼠IgG+IgM(H+L)和OPD之后，能够显示MAb7B6反应性。
在MAb 7B6被提纯后，相应的IgG 1a被固定在Pierce(Rockford.IL，USA)的DSS交叉结合系统上(按照厂家的说明进行)。
如图2所示，MAb 7B6与es-LAPase的特异反应，既在原细胞上清液中，又在经SDS PAGE及免疫电转移之后提纯的es-LAPase中。经用甲状腺球蛋白(MW670kDa)，牛r-球蛋白(MW 158kDa)，鸡卵蛋白(MW 44kDa)和马肌球蛋白(17kDa)在Bio-Sil SEC-250柱(600×7.5mm)上的凝胶渗透法分析估计的17-B-雌二醇-刺激的LAPase的分子量为315kDa.
例4：雌激素对增加HUT78细胞感染性的作用
雌激素调节的HIV引发的细胞通道作用的测定方法见G.Pulido-Cejudo等在Antiviral Research，36：176-177；1997de报导。CD4+T-HUT78细胞对HIV病毒感染敏感性是通过测定在17-B-雌二醇存在或不存在的感染细胞中逆转录酶活性来测量的。
根据对HIV感染有高灵敏性妇女的临床观察及报导的雌激素对LAPase的直接作用，测定了HIV病毒感染对HUT78的敏感性。如表3所示，在感染后3天，5天，在雌激素存在下，用逆转录酶活性测定的HIV病毒感染，大约是以无雌激素存在下感染的对照细胞的四倍。
表3：雌激素对增加感染性的作用
                           RT Activity(cpm×10-2/10ul)
         Day0(infection)   Day 3(Post infection)Day 5(Post Infection)Control                   0.82           19.82               32.44Estrogen(10-7M)    0.86           72.42              124.44
例5：es-LApase抑制剂
按照Rosen等提出的方法，从CD4+T MP6细胞提纯的人类Thioredoxin与由SIGMA-ALDRICH买的来自E.COli.的Thioredoxin活性进行比较。
Thioredoxin通过氨键共价与Ultralink EDC/DADPA键合基质连结，这一连结是根据生产者的方法，用5mg纯Thioredoxin与碳化二亚氨EDC/DADPA基质反应。
LAPase是在330nm用分光光度法进行测定，用182uM 1-亮氨酸-B-奈氨作为底物测定B-奈氨产物的形成。动力学测定是用Spectronic Genesys 5型分光光度计进行的。在30分钟期间，每6秒记录一次吸收度。酶动力学测定是用8.0×10-2U的es-LAPase在最终体积600ul重复三次测定。将下列反应混合物置于冰上，按顺序加入，es-LAPase，无钙的Hank′s溶液制成600ul，182uM 1-亮氨酸-B-奈氨。用不含es-LAPase的相应空白溶液作基线。两试管都转移到分光光度计上，最后加入1-亮氨酸-B-奈氨溶液，记录0反应时间。抑制作用试验的测定是在下列物质存在下进行的，167 uM Bestatin，167reduced Gluthathione和17uM reduced thioredoxin。
图3表明，Bestatin和两种含硫醇的多太，reduced Gluthathione和reducedthioredoxin，都有相应的抑制作用。与es-LAPase对照组相比，es-LApase在thioredoxin和glutathione存在下反应速度明显减缓。另外，与167uM reducedGluthathione培养的样品相比，es-LApase在17uM thioredoxin存在时的反应速度较慢。再者，167uM Bestatin能明显抑制es-LApase活性。如表4所示，reducedthioredoxin是有效的es-LApase活性抑制剂。表4所给的每种抑制剂的最大反应速度(Vmax)，Macheal-Menten常数(Km)，及抑制常数(Ki)，表明各种太的不同抑制性能。在这一方面，与Bestatin培养的es-LAPase的Vmax值与es-LAPase单独存在时非常相似，而Km值明显很高。这一数据证实了Bestatin对es-LAPase抑制剂作用的竞争性质。相反，与Bestatin和glutathione培养相比，用reduced thioredoxin培养的es-LAPase其Vmax，Km明显降低，Ki值适中。总之，这些数据很明显的说明reduce thioredoxin抑制es-LAPase是以不竞争方式，而与reduced glutahthione抑制es-LAPase是非竞争方式。
表4：Bestatin，reduced thiordoxin and glutathione的es-LAPase抑制常数
                  Vmax           Km              Ki
               (10-6M/min    (10-4M)        (10-6M)LApase alone        36.8±1.9    1.67±0.14       N/ABestatin 167uM      34.0±3.9    48.7±8.4        6.22±1.61Thioredoxin 17uM    5.31±0.02   0.234±0.0006    3.40±0.58Glutathione 167uM   17.2+1.5     1.78+0.25        1.53+0.40
例6：HIV的抑制作用
在用HTLVIIIb感染前12小时，HUT78细胞在单独培养液及含有抗-es-LAPase；thioredoxin；Bestatin和抗雌激素存在下，按以下所描述的组合方式，培养。在前面提到的各种因素存在下，感染细胞按以下倍数增长，25℃时，不断搅拌下，终体积为1.0ml，2小时内每个细胞有两个感染病毒微粒。将细胞用PBS洗涤，并种植于RPMI 1640，细胞密度为1.0×105细胞/ml，10％FBS，100U/ml青霉素，100mg/ml链霉素，于96孔的盘上。在第3，5，7天用光显微镜估计生成的合胞体。在适当的时间点，将选择的细胞进行补骨脂素/紫外线去活，经空气干燥后用冷丙酮固定在玻璃板上。用经改进的标准步骤(Aldovini，A.and Walker，B.D.，1990)进行间接免疫染色。在封闭缓冲液(PBS，5％羊血清)培养10分钟，然后与对照鼠血清或抗-HIV-1 gag单克隆抗体(用封闭缓冲液按1∶100稀释)在室温下反应反映30分钟。用PBS洗细胞三次，并用羊-抗-鼠-FITC抗体(Beckton andDickinson)培养30分钟。将玻片用仲亚苯基二氨/甘油处理，数荧光细胞。
在HIV-1感染HUT-78细胞后，用PCR测定各实验条件下的proviral load。
感染前，用PBS洗细胞三次并测其存活性。感染是按上述方法进行的。在所指示的时间间隔，取1.0ml培养液，用商业ELISA试剂，按生产说明，定量测定p24抗原。MAb 7B6，thioredoxin和抗-雌激素对HUT78细胞存活性的作用如下。HUT78细胞，在前述的化合物存在/不存在下，种植于RPMI 1640，细胞密度为1.0×105细胞/ml，10％FBS，100U/ml青霉素，100mg/ml链霉素。每到第三天换培养液，并用锥虫蓝染色进行排除测定。在第7天，测定多个重复培养液中的胸腺嘧定脱氧核甘的结合。所得结果代表平均值±s.d.(n＝10)。
与预先用鼠IgG1-蛋白G基质培养相比，在用HIV-1感染前7小时，用MAb7B6-蛋白G基质与HUT78细胞培养能够明显降低HIV病毒复制数。见表5。
表5：用抗-es-LApase MAb 7B6与蛋白G结合抑制HIV-1病毒复制
                   Days Post-infection
              0       3            5           7MAb 7B6           0     86±5       189±2      220±24(100ng/10ml)COntrol IgG1a        0       2014±89     4002±46    5551±92(100ng/ml)
与预先用对照肌红蛋白IgG1-蛋白G基质培养相比，在用HIV-1感染前7小时，用thioredoxin-EDC/DADPA基质与HUT78细胞培养能够明显降低HIV病毒复制数。见表6。
表6：thioredoxin-EDC/DADPA基质抑制HIV病毒复制与Bedtain-HIV抑制的比较
                     Days Post-infection
              0        3            5            7Thioredoxin       0        4±1         12±3        122±8(40ng/5ml)Bestatin          0        7±2         29±3        457±12(120ug/ml)Control/Myoglobin 0        2414±178    4122±121    5851±123(40ng/5ml)
由thioredoxin和抗-LAPase 7B6单克隆抗体调节的独立抑制作用，可以通过在HIV-1感染之前同时加入HUT-78细胞而具有协同作用(表7)。在这一方面，不考虑任何理论，thioredoxin和非抑制性LAPase 7B6单克隆抗体的协同作用提示，在HIV感染过程中既需要LAPase活性，也需要病毒蛋白相互反应。同时也提示，如Nakamura et al.报导的，在HIV感染的后期检测的血浆thioredoxin水平的提高，不仅补偿细胞间glutathione的消耗，而且也可以直接参与降低HIV病毒数。表7：用thioredoxin-EDC/DADOA和抗-LAPase 7B6结合基质协同抑制HIV-1病毒复制
                     Days Post-infection
                     0      3         5         7MAb 7B6/Thioredoxin          0      12±3    69±5     88±12(100ng/40ng/10ml)COntrol IgG1a/Myoglobin  0    1914±55  4330±26  5110±12(100ng/40ml)
如例4所示，暴露于17-B-雌二醇增加LApase活性，这又导致了HIV传染性的增加。因此，在1991-1995期间，暴露HIV病毒的妇女，不论种族和方式，HIV传染性的选择性增加可被解释为雌激素对LAPase的作用。
这些观察，与thioredoxin对LApase的不竞争性抑制作用提高了对爱滋病的预防和治疗的结合使用的可能性。
用MAb 7B6，thioredoxin和Bestatin抑制LAPase作用，与服用抗雌激素药物来阻断雌激素对LAPase活性作用及HIV感染相结合的抗HIV作用，产生了有前途的抗HIV治疗方法。因此，三苯氧氨，Droloxifene，Raloxofene，Idoxifene，4-hydroxyandrostenedion和缺诺酮的3，5-四氢衍生物都可用作抗雌激素化合物，测定它们协同thioredoxin，Bestatin和MAb 7B6抗病毒性的能力。以MAb7B6/thioredoxin结合抗病毒性质的抗雌激素作用为根据，对完全抑制HIV-1感染的最有效的结合的评估，是依据其对降低cytopathicity，p24水平和病毒量进行的。简言之，在感染后第5天测定前面所提的各种数据。在感染细胞前，同时用thioredoxin-EDC/DADPA基质和抗-es-LAPase 7B6基质培养。这一抗雌激素的抑制作用总结见表8。所有的抗雌激素化合物的浓度均10-7M。
表8：MAb 7B6和thioredoxin基质与抗雌激素结合的抗病毒作用
感染后第5天Agents                        p24           Cytopathicity    Proviral Load
                          (nmoles/ml)   (Syncytia/well)      (copies)Control(no additions)         1.82±0.003       117±6         3777±824-hydroxyandrostenedione      0.02±0.001       4.0±0.4       12Reloxifene                    0.01±0.002       3.3±0.1       83，5-tetrohydro Norethisteron 0             0              2Tamoxifen                     0             0              0Droloxifene                   0.04±.0003   5.2±0.6       14Idoxifene                     0             0              0
所有选用的参考文献，专利和专利申请见参考文献。
我们以例子解释我们的发明，但是我们的研究并不限制于这些解释。对我们发明的全面解释见下列说明。

Claims (37)

1.降低HIV对T淋巴细胞感染的方法，包括用包含足量的LAPase不竞争性抑制剂接触所说的T淋巴细胞。
2.根据权利要求1的方法，其中不竞争性抑制剂是一种含硫醇的化合物。
3.根据权利要求2的方法，其中含硫醇的化合物是硫氧还蛋白。
4.检测HIV对T淋巴细胞感染的方法，包括将所说的T淋巴细胞与足量的对es-LAPase有特异性的抗体接触。
5.根据权利要求4的方法，其中抗体是单克隆抗体。
6.根据权利要求5的方法，其中单克隆抗体是由骨髓瘤细胞系7B6(加拿大国际存放机构，#2000年3月23日)生产的。
7.根据权利要求4的方法，其中这一方法包括至少一种LAPase抑制剂与所说的T淋巴细胞接触。
8.根据权利要求7的方法，其中抑制剂是从一组含有苯丁抑制剂和含硫醇化合物中选出的。
9.根据权利要求8的方法，其中含硫醇化合物是从一组含有硫氧还蛋白和glutahthione化合物中选出的。
10.根据权利要求9的方法，其中抗体是单克隆抗体。
11.根据权利要求10的方法，其中单克隆抗体是由骨髓瘤细胞系7B6(加拿大国际存放机构，#2000年3月23日)生产的。
12.根据权利要求7的方法，其中这一方法包括至少一种抗雌激素化合物与所说的T淋巴细胞接触。
13.根据权利要求12的方法，其中抗雌激素化合物是从一组含有4-hydroandrostenedione，Raloxifene，3，5-tetrahydro Norethisterone，Tamoxifen，Droloxifene，Idoxifene化合物中选出的。
14.预防和降低HIV感染的方法，包括给病人服用能产生药效量的药物组合物，其中药物组合物包括对es-LApase的特异性抗体和药物载体。
15.根据权利要求14的方法，其中抗体是单克隆抗体。
16.根据权利要求15的方法，其中单克隆抗体是由骨髓瘤细胞系7B6(加拿大国际存放机构，#2000年3月23日)生产的。
17.预防和降低HIV感染的方法，包括给病人服用能产生药效量的药物组合物，其中药物组合物包括对LApase的不竞争性抑制剂和药物载体。
18.根据权利要求17的方法，其中不竞争性抑制剂是含硫醇化合物。
19.根据权利要求18的方法，其中含硫醇的化合物是硫氧还蛋白。
20.根据权利要求14的方法，其中药物组合物进一步包括对LApase的不竞争性抑制剂。
21.根据权利要求20的方法，其中抗体是单克隆抗体。
22.根据权利要求21的方法，其中单克隆抗体是由骨髓瘤细胞系7B6(加拿大国际存放机构，#2000年3月23日)生产的。
23.根据权利要求22的方法，其中不竞争性抑制剂是含硫醇化合物。
24..根据权利要求24的方法，其中含硫醇的化合物是硫氧还蛋白。
25.根据权利要求20的方法，其中药物组成进一步包括抗雌激素化合物。
26.根据权利要求25的方法，其中抗雌激素化合物是从一组含有4-hydroandrostenedione，Raloxifene，3，5-tetrahydro Norethisterone，Tamoxifen，Droloxifene，Idoxifene化合物中选出的。
27.一种含有es-LAPase的特异性抗体和LAPase抑制剂的药物组合物。
28.根据权利要求27的组合物，其中药物组合物中的抗体是单克隆抗体。
29.根据权利要求28的组合物，其中单克隆抗体是由骨髓瘤细胞系7B6(加拿大国际存放机构，#2000年3月23日)生产的。
30.根据权利要求27的组合物，其中抑制剂是从一组含有苯丁抑制剂和含硫醇化合物中选出的。
31.根据权利要求30的组合物，其中含硫醇化合物是从一组含有硫氧还蛋白和glutahthione化合物中选出的。
32.根据权利要求27的组合物，其中药物组合物进一步包括抗雌激素化合物。
33.根据权利要求32的组合物，其中药物组合物中的抗雌激素化合物是从一组含有4-hydroandrostenedione，Raloxifene，3，5-tetrahydro Norethisterone，Tamoxifen，Droloxifene，Idoxifene化合物中选出的。
34.降低HIV对T淋巴细胞感染的方法，包括用包含足量的LAPase不竞争性抑制剂，es-LAPase的特异性单克隆抗体和抗雌激素化合物接触所说的T淋巴细胞。
35.降低HIV对T淋巴细胞感染的方法，包括用包含足量的LAPase不竞争性抑制剂，LAPase竞争性抑制剂，es-LAPase的特异性单克隆抗体和抗雌激素化合物接触所说的T淋巴细胞。
36.含有足量的LAPase不竞争性抑制剂，es-LAPase的特异性单克隆抗体和抗雌激素化合物的组合物在制备用于治疗HIV感染或有感染危险病人的药物中的应用。
37.含有足量的LAPase不竞争性抑制剂，LAPase竞争生抑制剂，es-LAPase的特异性单克隆抗体和抗雌激素化合物的组合物在制备用于治疗HIV感染或有感染危险病人的药物中的应用。
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