CN100376680C - 双重靶效应基因嵌合重组体及其构建方法和应用 - Google Patents

双重靶效应基因嵌合重组体及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种双重靶效应基因嵌合重组体及其构建方法和应用。用特异性引物以SDF-54/R/pET-30a(+)为模板扩增SDF-54/R，并将其直接插入T-A克隆载体pMD18-T，然后在其3’-端顺次加入人类IgG1抗体重链的铰链区编码序列和Decorin成熟肽编码序列，构建成SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin/pMD18-T嵌合重组体。SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin保留对CXCR4的亲和力而失去其内在活性，并能抑制野生型SDF-1α对乳腺癌细胞的趋化迁移活性、抑制乳腺癌细胞的生长，其可作为CXCR4的新型拮抗剂——同时抑制CXCR4阳性肿瘤细胞的生长和转移，具有双重靶效应。

Description

双重靶效应基因嵌合重组体及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种既能抑制乳腺癌转移又能抑制乳腺癌生长的双重靶效应基因嵌合重组体及其构建方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤的转移并非随机性迁徙，不同种类的癌细胞按其固有的迁徙路径，向特定器官定向转移。已有多种学说试图解释这种现象。“土壤学说”假设，不同的器官提供适合特定癌细胞生长的特殊微环境；“返巢学说”认为，不同器官具有识别、吸引或捕捉特定癌细胞的能力。然而多年来对引起此现象的内在机制缺乏充分的有说服力的证据予以阐明(Phlip M.Murphy Chemokines andthe molecular basis of cancer metastasis.N Engl J Med.2001 Sep 13；345(11)：833-5.)。Muller等在趋化因子与肿瘤转移相关性方面的研究成果为“返巢学说”提供了有力的证据，他们发现人乳腺癌细胞及其转移瘤虽具有17种趋化因子受体基因，但仅趋化因子受体CXCR4(CXC chemokine receptor4)和CCR7(CC chemokine receptor7)的表达水平显著高于正常乳腺细胞。与此相应，在乳腺癌细胞常规首先转移的器官，如肺、肝、骨髓及淋巴结等CXCR4与CCR7的特异性配体：CXCL12(CXC chemokine12)和CCL21(CC chemokine 21)亦呈现高水平表达，而非常规性转移器官却呈低水平表达。由CXCR4和CCR7介导的信号促进在乳腺癌细胞肌动蛋白聚合、伪足形成，继而诱导粘附和浸润反应。动物实验表明：中和CXCR4与CXCL12的相互作用可有效削弱乳腺癌细胞向局部淋巴结和肺组织的转移。由此提出关于CXCR4与其配体CXCL12的相互作用支配乳腺癌细胞进行多步骤有序转移的特定模式：即癌组织的上皮细胞通过克隆增生，侵入局部组织，诱导血管生成和趋化因子受体CXCR4在其表面表达。当癌细胞从原发肿瘤脱离，穿过淋巴和血管壁迁移至血液循环时，表达CXCR4的癌细胞通过与配体CXCL12特异性结合的方式，被其血管内皮高表达CXCL12的组织器官所捕获，从而迁移至特定组织形成转移肿瘤(Muller A，Homey B，Soto H，et al.Involvement of chemokine receptors in breastcancer metastasis.Nature.2001 Mar 1；410(6824)：50-6)。该乳腺癌细胞转移模式的提出为有效防治乳腺癌的转移开拓出崭新的思路，即根据CXCL12的构效关系进行定向遗传改造，获得保留其对CXCR4的高亲和力，而取消其内在活性的CXCR4特异性拮抗剂SDF-1/54R(发明名称为“基质细胞衍生因子-1重组突变体SDF-1/54R的构建、制备及其应用”，专利申请号为“03146833.0”)。通过拮抗剂竞争性地阻断野生型CXCL12与CXCR4的结合，破坏原发灶与远程特定转移器官之间所存在的CXCL12梯度，切断乳腺癌转移的潜在通路，从而制约乳腺癌的转移。
新近HER-2/neu(c-ErbB-2)癌基因在乳腺癌的发生发展中所起的重要作用引起病理学家和临床医学家的高度关注。HER-2/neu基因定位于人17号染色体，编码一185KD的跨膜糖蛋白，即表皮生长因子-2受体(HER-2)。与表皮生长因子受体家族(EGFR)其它成员一样，HER-2具有酪氨酸激酶活性，介导参与调节细胞的生长与分化信号的传导。HER-2可以单体、同源或异源二聚体的形式存在与细胞膜，以异源二聚体的酪氨酸激酶活性为最强。在正常细胞表面，HER-2表达甚微，几乎无异源二聚体存在；因而介导促生长信号的能力亦相对微弱。但HER-2在许多肿瘤细胞则以异源二聚体的形式高水平表达，进而形成强烈的促生长信号。有证据提示HER-2/neu过度表达与乳腺癌的发生发展及转移密切相关。动物实验发现HER-2/neu在转基因小鼠乳腺上皮表达可诱发转移性肿瘤。临床研究表明：约20～30％的浸润性乳腺癌患者的乳腺癌细胞HER-2/neu明显扩增，HER-2高度表达，而且转移灶与原发灶癌细胞的表达水平一致；凡高水平HER-2表达的浸润性乳腺癌病例，对常化疗不敏感、预后不良、容易转移、死亡率高。Herceptin是一新近被FDA批准进入III期抗乳腺癌临床试验的重组人HER-2单克隆抗体。其临床前研究表明：Herceptin通过直接阻断HER-2的胞外段，可明显抑制HER-2表达阳性的乳腺癌细胞生长。临床中心试验表明：Herceptin与化疗药联合，可明显提高治疗反应率，延缓病程，增加生存期。以上证据支持HER-2可作为新的特异性治疗浸润性乳腺癌的靶点(M.J.Duffy Biochemical markers in breast cancer：whichones are clinically useful Clinical Biochemistry 2001；34：347-352)。
小分子富亮氨酸蛋白糖甙家族成员饰胶蛋白(Decorin)因被证实是一强的肿瘤细胞生长负性调节因子而成为肿瘤研究领域的热点。Decorin由核心蛋白及其以共价键相连的氨基糖甙链组成，未成熟肽含有359个氨基酸。内源性Decorin可被血管、结蒂组织和某些肿瘤等组织表达，尤以急性损伤组织的上皮下层表达甚强。在肿瘤组织，Decorin由其两种主要支架细胞：成纤维细胞和平滑肌细胞分泌产生并高浓度聚集于肿瘤细胞间的基质中。作为EGFR天然配体，Decorin通过与EGFR相互作用，抑制肿瘤细胞生长、浸润和远距离转移。Decorin对肿瘤细胞生长的负性调节作用以及高度浓集于肿瘤细胞侵及的微环境的特性，实际上是宿主天然抗肿瘤免疫功能的体现(Marko Stander，Ulrike Naumann and Wolfgang Wick Transforming growth factor-beta and P21：multiple molecular targets of decorin-mediated suppression of neoplastic growthCell Tissue Res 1999；296：221-227；Renato V.Iozzo，David K.Moscatello，DavidJ.McQuillan et al.Decorin is a biological ligand for the epidermal growth factor.The Journal of Biological Chemistry 1999；274(8)：4489-4492)。Manoranjan等用重组Decorin转染HER-2高表达的乳腺肉瘤细胞MDA-453，使该细胞HER-2的表达量降低约40％，其酪氨酸激酶的活性几乎完全丧失，内源性P21蛋白(一种强的细胞周期素依赖激酶抑制因子)活性增强，进而细胞持续处于周期停止、生长延迟的抑制状态。裸鼠实验显示Decorin转染HER-2高表达的乳腺肉瘤细胞MDA-453不能诱导肿瘤形成。因此，Decorin被认为是作为一种EGFR天然特异性拮抗剂，能安全有效地抑制HER-2高表达的肿瘤细胞(ManoranjanSantra，Inge Eichstetter and Renato V.Iozzo An anti-oncogenic role for Decorindown-regulation of ErbB2 leads to growth suppression and cytodifferentiation ofmammary carcinoma cells.The Journal of Biological Chemistry 2000；275(45)：35153-35161)。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种利用CXCR4的拮抗剂SDF-1/54R通过人类IgG1抗体重链的铰链区(IgG1Heavy Chain Hinge Region，IgG1HCHR)与Decorin连接构建成具有双重靶效应基因嵌合重组体SDF-1/54R-IgG1HCHR-Decorin，该基因嵌合重组体既能抑制乳腺癌转移又能抑制乳腺癌生长。
本发明的另一目的在于提供上述基因嵌合重组体的构建方法。
本发明在获得对CXCR4具高活性拮抗效应的CXCL12突变子SDF-1/54R的基础上(发明名称为“基质细胞衍生因子-1重组突变体SDF-1/54R的构建、制备及其应用”，专利申请号为“03146833.0”)，借助人类IgG1抗体重链的铰链区将重组Decorin成熟肽与CXCL12突变子SDF-1/54R连接，构建双重靶效应的Decorin与SDF-1/54R基因嵌合重组体。该嵌合体具有同步识别CXCR4和HER-2高表达的乳腺肿瘤细胞，高选择性地大量聚集乳腺原发肿瘤及其转移灶组织，封闭CXCR4，破坏在原发灶与远程特定转移器官间存在的CXCL12梯度，切断乳腺癌转移的潜在通路，利用其结构中的Decorin，特异性阻断HER-2高表达所产生的乳腺癌浸润性生长和转移产生的效应。
本发明通过如下技术方案来实现：一种人基质细胞衍生因子-1(SDF-1，stramal cell derived factor-1)重组突变体SDF-1/54R通过人类IgG1抗体重链的铰链区(IgG1 Heavy Chain Hinge Region，IgG1HCHR)与Decorin连接而形成的双重靶效应基因嵌合重组体。
所述双重靶效应基因嵌合重组体核酸编码序列为：
aagcccgtcagcctgagctacagatgcccatgccgattcttcgaaagccatgttgccagagccaacgtcaagcatctca
aaattctcaacactccaaactgtgcccttcagattgtagcccggctgaagaacaacaacagacaagtgtgcattgaccc
gaagctcgagCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAg
gatccgatgaggcttctgggataggcccagaagttcctgatgaccgcgacttcgagccctccctaggcccagtgtgcc
ccttccgctgtcaatgccatcttcgagtggtccagtgttctgatttgggtctggacaaagtgccaaaggatcttccccctga
cacaactctgctagacctgcaaaacaacaaaataaccgaaatcaaagatggagactttaagaacctgaagaaccttcac
gcattgattcttgtcaacaataaaattagcaaagttagtcctggagcatttacacctttggtgaagttggaacgactttatct
gtccaagaatcagctgaaggaattgccagaaaaaatgcccaaaactcttcaggagctgcgtgcccatgagaatgagat
caccaaagtgcgaaaagttactttcaatggactgaaccagatgattgtcatagaactgggcaccaatccgctgaagagc
tcaggaattgaaaatggggctttccagggaatgaagaagctctcctacatccgcattgctgataccaatatcaccagcat
tcctcaaggtcttcctccttcccttacggaattacatcttgatggcaacaaaatcagcagagttgatgcagctagcctgaa
aggactgaataatttggctaagttgggattgagtttcaacagcatctctgctgttgacaatggctctctggccaacacgcct
catctgagggagcttcacttggacaacaacaagcttaccagagtacctggtgggctggcagagcataagtacatccag
gttgtctaccttcataacaacaatatctctgtagttggatcaagtgacttctgcccacctggacacaacaccaaaaaggctt
cttattcgggtgtgagtcttttcagcaacccggtccagtactgggagatacagccatccaccttcagatgtgtctacgtgc
gctctgccattcaactcggaaactataag。
所述双重靶效应基因嵌合重组体氨基酸序列为：
Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser
His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro
Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln
Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Gly Ser Asp Glu Ala Ser Gly Ile Gly Pro
Glu Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe Glu Pro Ser Leu Gly Pro Val Cys
Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu Arg Val Val Gln Cys Ser Asp Leu
Gly Leu Asp Lys Val Pro Lys Asp Leu Pro Pro Asp Thr Thr Leu Leu
Asp Leu Gln Asn Asn Lys Ile Thr Glu Ile Lys Asp Gly Asp Phe Lys
Asn Leu Lys Asn Leu His Ala Leu Ile Leu Val Asn Asn Lys Ile Ser
Lys Val Ser Pro Gly Ala Phe Thr Pro Leu Val Lys Leu Glu Arg Leu
Tyr Leu Ser Lys Asn Gln Leu Lys Glu Leu Pro Glu Lys Met Pro Lys
Thr Leu Gln Glu Leu Arg Ala His Glu Asn Glu Ile Thr Lys Val Arg
Lys Val Thr Phe Asn Gly Leu Asn Gln Met Ile Val Ile Glu Leu Gly
Thr Asn Pro Leu Lys Ser Ser Gly Ile Glu Asn Gly Ala Phe Gln Gly
Met Lys Lys Leu Ser Tyr Ile Arg Ile Ala Asp Thr Asn Ile Thr Ser
Ile Pro Gln Gly Leu Pro Pro Ser Leu Thr Glu Leu His Leu Asp Gly
Asn Lys Ile Ser Arg Val Asp Ala Ala Ser Leu Lys Gly Leu Asn Asn
Leu Ala Lys Leu Gly Leu Ser Phe Asn Ser Ile Ser Ala Val Asp Asn
Gly Ser Leu Ala Asn Thr Pro His Leu Arg Glu Leu His Leu Asp Asn
Asn Lys Leu Thr Arg Val Pro Gly Gly Leu Ala Glu His Lys Tyr Ile
Gln Val Val Tyr Leu His Asn Asn Asn Ile Ser Val Val Gly Ser Ser
Asp Phe Cys Pro Pro Gly His Asn Thr Lys Lys Ala Ser Tyr Ser Gly
Val Ser Leu Phe Ser Asn Pro Val Gln Tyr Trp Glu Ile Gln Pro Ser
Thr Phe Arg Cys Val Tyr Val Arg Ser Ala Ile Gln Leu Gly Asn Tyr
Lys。
本发明用特异性引物以SDF-54/R/pET-30a(+)为模板扩增SDF-54/R，并将其直接插入T-A克隆载体pMD18-T，然后在其3’-端顺次加入人类IgG1抗体重链的铰链区编码序列和Decorin成熟肽编码序列，构建成SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin/pMD18-T嵌合重组体。
为了实现上述发明目的，所述双重靶效应基因嵌合重组体构建方法包括如下步骤：
(1)引物1和引物2以SDF-54/R/PET30a+为模板扩增SDF-54/R，在5’和3’端分别引入KpnI和XhoI酶切位点，在5’端引入肠激酶(EK，enterokinase)编码序列，去除编码序列3’端的终止密码子；SDF-54/R PCR产物直接插入T-A克隆载体pMD18-T(TAKARA，大连)并转化JM109。筛选白色的阳性菌落抽提质粒，酶切鉴定正确后进入下一步。
(2)SDF-54/R/pMD18-T重组体和IgG1HCHR分别用XhoI和BamHI进行双酶切；酶切后的IgG1HCHR/XhoI+BamHI插入酶切后的SDF-54/R/pMD18-T/XhoI+BamHI，转化JM109，挑取阳性菌落，酶切鉴定SDF-54/R-IgG1HCHR/pMD18-T正确后进入下一步。
(3)从人骨髓细胞中提取总RNA，反转录成cDNA，根据天然Decorin的基因序列设计两条Decorin特异性核苷酸引物3和引物4，用引物3和引物4PCR扩增Decorin的成熟肽编码序列，Decorin的PCR产物直接插入T-A克隆载体pMD18-T，筛选白色阳性菌落提取质粒酶切初步鉴定后进行测序确认。
(4)将Decorin从Decorin/pMD18-T用BamHI&EcoRI切下，插入同样用BamHI和EcoRI双酶切的SDF-54/R-IgG1HCHR/pMD18-T/BamHI+EcoRI，连接产物转化JM109，挑取阳性菌落PCR初步鉴定，然后测序证实，测序表明SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin/pMD18-T嵌合重组体构建完全正确。
(5)用KpnI和EcoRI将SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin从SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin/pMD18-T上切下，定向克隆至同样被KpnI和EcoRI双酶切的pET30-a(+)，转化JM109。挑取阳性克隆抽提质粒做酶切鉴定。经确证的SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin/pET30-a(+)转化BL21(DE3)，用IPTG进行诱导表达，收获裂解菌体，上清液通过Ni亲和介质进行纯化，最后用肠激酶切掉His-Tag，过HPLC柱得到纯化的SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin重组蛋白。
所述人类IgG1抗体重链的铰链区(IgG1 Heavy Chain Hinge Region，IgG1HCHR)编码序列
Figure C20051010075000101
CCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCA
Figure C20051010075000102
由上海生工合成，在5’-端带有XhoI限制性酶切位点，3’-端带有BamHI限制性酶切位点。
所述引物1为5’-ggggtaccgacgacgacgacaagaagcccgtcagcctgagctacagat-3’；
所述引物2为5’-ccgctcgagcttcgggtcaatgcacac-3’；
所述引物3为5’cgggatccgatgaggcttctgggataggcc-3’，所述引物3含有酶切位点BamHI；
所述引物4为5’ggaattcttacttatagtttccgagtt-3’，所述引物4含有酶切位点EcoRI和终止密码子。
本发明的再一目的在于提供上述双重靶效应基因嵌合重组体在抑制人乳腺癌细胞或组织的生长和转移中的应用。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
本发明SDF-1/54R-IgG1HCHR-Decorin嵌合重组体具有如下特点：1)能同步识别CXCR4和HER-2高表达的乳腺肿瘤细胞，故高选择性地大量聚集乳腺原发肿瘤及其转移灶组织；2)利用其结构中CXCR4拮抗性配体部分与CXCR4特异性结合，封闭CXCR4，破坏了在原发灶与远程特定转移器官间存在的CXCL12梯度，切断乳腺癌转移的潜在通路；3)利用其结构中Decorin，特性异性阻断HER-2高表达所产生的乳腺癌浸润性生长和转移产生的效应。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步详细说明。
实施例1
SDF-1/54R-IgG1HCHR-Decorin嵌合基因及其原核表达系统的构建
1、用引物15’-ggggtaccgacgacgacgacaagaagcccgtcagcctgagctacagat-3’和引物25’-ccgctcgagcttcgggtcaatgcacac-3’以SDF-54/R/pET30-a(+)(发明名称“基质细胞衍生因子-1重组突变体SDF-1/54R的构建、制备及其应用”，专利申请号“03146833.0”)为模板扩增SDF-54/R，在5’和3’端分别引入KpnI和XhoI酶切位点，在5’端引入EK识别位点-(Asp)4Lys编码序列以便切除最终表达的融合蛋白的His-Tag，同时去除编码序列3’端的终止密码子。PCR循环为：94℃预变性5min，然后94℃10s，55℃10s，72℃10s，32个循环，最后72℃延伸3min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离得200bp左右的条带，与理论大小一致。SDF-54/R PCR产物用TAKARA公司生产的DNA胶回收试剂盒回收目的条带，用质粒连接试剂盒(TAKARA，大连)进行连接直接插入T-A克隆载体pMD18-T(TAKARA，大连)并用CaCl2法转化JM109。筛选白色的阳性菌落，扩增并按质粒小量抽提试剂盒(Omega)的操作说明提取重组质粒，KpnI和XhoI酶切鉴定表明SDF-54/R已正确插入pMD18-T，SDF-54/R/pMD18-T初步鉴定构建成功。
2、人类IgG1抗体重链的铰链区(IgG1 Heavy Chain Hinge Region，IgG1HCHR)编码序列为
Figure C20051010075000111
CCCAAATCTTGTGACAAAACTCACAC ATG CCCACCGTGCCCA由上海生工合成，在5’-端和3’-端分别带有XhoI和BamHI限制性酶切位点。
3、SDF-54/R/pMD18-T重组体和IgG1HCHR分别用XhoI和BamHI(TAKARA，大连)进行双酶切。乙醇沉淀法纯化酶切产物IgG1HCHR/XhoI+BamHI；1％琼脂糖凝胶电泳分离，TAKARA公司生产的DNA胶回收试剂盒回收酶切产物SDF-54/R/pMD18-T/XhoI+BamHI。用DNA Ligation KitVersion2(TAKARA，大连)将IgG1HCHR/XhoI+BamHI连接入T-A克隆载体pMD18-T(TAKARA，大连)并用CaCl2法转化JM109。挑取阳性菌落，扩增并E.Z.N.A Plasmid Miniprep Kit I(按质粒小量抽提试剂盒)(Omega)的操作说明提取重组质粒。KpnI和BamHI双酶切鉴定表明IgG1HCHR已正确插入SDF-54/R/pMD18-T，初步鉴定表明SDF-54/R-IgG1HCHR/pMD18-T构建成功。
4、取正常人骨髓，用TRIZOI组织裂解液(TRIZOLLS Reagent(Invitrogen)裂解骨髓组织，并按操作说明提取总RNA，然后采用第一链反转录聚合酶链式反应合成系统(SuperScript First-Strand Synthesis System forRT-PCR，Invitrogen)按试剂盒提供的方法合成cDNA.根据GENEBANK提供的Decorin的基因序列设计引物3为5’cgggatccgatgaggcttctgggataggcc3’；引物4为5’ggaattcttacttatagtttccgagttg3’，引物3含有酶切位点BamHI，引物4含有酶切位点EcoRI和终止密码子，用引物3和引物4 PCR扩增Decorin的成熟肽编码序列。PCR循环为：94℃预变性5min，然后94℃10s，56℃10s，72℃15s，32个循环，最后72℃延伸5min。经1％琼脂糖凝胶电泳分离得1000bp左右的条带，与理论大小一致；用TAKARA公司生产的DNA胶回收试剂盒回收目的条带。回收的PCR产物采用DNA Ligation Kit Version2(质粒连接试剂盒)(TAKARA)直接连接入pMD18-T，CaCl2法转化JM109。挑取阳性菌落，扩增并按E.Z.N.APlasmid Miniprep Kit I(质粒小量抽提试剂盒)(Omega)的操作说明提取重组质粒。DNA自动测序仪(上海生工)测序鉴定表明Decorin/pMD18-T重组体构建成功。
5、将Decorin从Decorin/pMD18-T用BamHI&EcoRI切下，并用TAKARA公司生产的DNA胶回收试剂盒回收Decorin/BamHI+EcoRI，回收产物用质粒连接试剂盒(TAKARA)直接连接入同样用BamHI&EcoRI双酶切并胶回收的SDF-54/R-IgG1HCHR/pMD18-T/BamHI+EcoRI。连接产物转化JM109，挑取阳性菌落PCR初步鉴定，然后用DNA自动测序仪(上海生工)测序鉴定表明SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin/pMD18-T嵌合重组体构建完全正确。
6、用KpnI&EcoRI(TAKARA，大连)将SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin从SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin/pMD18-T上切下，用TAKARA公司生产的DNA胶回收试剂盒回收目的条带SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin/KpnI+EcoRI，DNA Ligation Kit Version2定向克隆至同样被KpnI&EcoRI双酶切的原核表达载体(NOVAGEN)pET-30a(+)，CaCl2法转化JM109。挑取阳性克隆，扩增并按质粒小量抽提试剂盒(Omega)的操作说明提取重组质粒，酶切鉴定表明SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin已正确插入pET-30a(+)，DNA自动测序仪(上海生工)测序鉴定表明SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin/pET-30a(+)嵌合重组体构建完全正确。本发明双重靶效应基因嵌合重组体核酸编码序列及氨基酸序列见序列表。
实施例2
SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin/pET-30a(+)嵌合重组体原核表达和纯化
1、经确证的SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin/pET-30a(+)重组质粒约200ng加入200ul感受态大肠杆菌BL21(DE3)(NOVAGEN)细胞中(氯化钙法制备)，轻轻混匀，在冰上放置30min，然后在42℃热休克90s，立即转到冰上放置2min，随后加入800ul LB培养液在37℃条件下振荡培养45min，取200ul铺到含50ug/ml卡那霉素的LB平板，37℃培养过夜(约12hr)，随机挑取5个阳性菌落分别接种于50ml的LB液体培养基(含50ug/ml卡那霉素)37℃振荡培养约12hr，然后分别取50ul上述培养液转接于50ml的LB液体培养基(含50ug/ml卡那霉素)37℃振荡培养约3hr，当OD600＝0.5时，分别加入终浓度为0.75mM的IPTG 37℃诱导表达3hr，3000×g离心15min收获细胞。然后按ProBondTM resinFor Purification of 6xHis-Tagged Proteins(镍固相亲和层析树脂)(Invitrogen，Catalog nos.R801-01，R801-15)的操作说明进行纯化，具体操作如下：
1)Guanidinium(盐酸胍)裂解缓冲液(6M盐酸胍，20mM NaPO4，pH7.8 500mM NaCl)至37℃。
2)重悬菌体于8ml盐酸胍裂解缓冲液中。
3)在冰上超声处理细胞裂解液5s，间隔5s，重复4次。
4)在60℃条件下缓慢振荡30min以保证菌体全部裂解。
5)3,000×g离心15min，将上清转入干净的试管中，取5μl裂解液上清用作SDS-PAGE检测样品。
6)加2mlProBondTMresin(树脂)到8ml上清液中。
7)室温下轻微振荡结合30min，800×g离心15min，去除上清液。
8)用4ml Denaturing(变性)结合缓冲液(8M尿素(Urea)，20mM NaPO4，pH7.8，500mM NaCl)重悬沉淀，在室温下振荡洗涤2min，800×g离心15min，小心去除上清液，并取50μl上清用作SDS-PAGE检测样品。此步骤重复一次。
9)用4ml变性洗涤缓冲液(8M Urea，20mM NaPO4，pH6.0，500mM NaCl)重悬沉淀，在室温下振荡洗涤2min，800×g离心15min，小心去除上清液，并取50μl上清用作SDS-PAGE检测样品。此步骤重复一次。
10)用8ml非变性洗涤缓冲液(20mM imidazole(咪唑)，20mM NaPO4，pH8.0，500mM NaCl)重悬沉淀，在室温下振荡洗涤2min，800×g离心15min，小心去除上清液，并取50μl上清用作SDS-PAGE检测样品。此步骤重复三次。
11)用8ml溶出缓冲液(500mM咪唑，20mM NaPO4，pH8.0，500mMNaCl)重悬沉淀，在室温下振荡洗涤15min，800×g离心15min，小心吸取上清于干净的试管中，并取50μl上清用作SDS-PAGE检测样品，其余保存于-80℃。
SDS-PAGE检测结果表明，SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin/pET-30a(+)重组体能够在大肠杆菌BL21(DE3)中正常表达，Ni亲和纯化出约50KD的目标蛋白带，与理论分子量49.42KD一致，纯度至少在80％以上。
12)在4℃用复性缓冲液A(3M尿素，20mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA，1mM 2-巯基乙醇(2-Mecaptoethanol)，135mM NaCl)透析上述样品16～24hr。用复性缓冲液B(1.5M尿素，20mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA，1mM 2-巯基乙醇，135mM NaCl)继续透析上述样品16～24hr。用复性缓冲液C(20mMTris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA，135mM NaCl，0.1mM GSH(还原型谷胱甘肽)，0.01mM GSSG(氧化型谷胱甘肽))继续透析上述样品16～24hr。用复性缓冲液D(20mM Tris-HCl(pH7.5)，135mM NaCl)继续透析上述样品16～24hr。
13)超滤浓缩后按说明书提供的条件用肠激酶EnterokinaseMaxTM(EKMaXTM)(Invitrogen，Catalog nos.E180-01，E180-02)切除His-Tag。
14)反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin，His-Tag和肠激酶(Enterokinase)，最后得纯化的SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin，储存于-80℃备用。
实施例3
生物活性测定
1、MTT
收集对数期MDA-MB-231细胞，调整细胞悬液浓度，接种于7块96孔板，1×103Cells/孔；置37℃、5％CO2温箱培养使细胞贴壁；加入预定终浓度的野生型嵌合体SDF-1WT-IgG1HCHR-Decorin和突变体嵌合体SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin蛋白，置37℃、5％CO2培养箱，开始计时培养，分别在第0hr(加药完毕开始计时时为0点)、24hr、48hr、72hr、96hr、120hr、144hr等时间点取出96孔板进行常规MTT检测，最后进行数据统计，以OD(490nm)值为纵轴，处理时间为横轴，描绘SDF-1WT-IgG1HCHR-Decorin和SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin对乳腺癌细胞MDA-MB-231生长的抑制效应。
2、SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin诱导MDA-MB231细胞迁徙的活性
SDF-1WT-IgG1HCHR-Decorin和SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin按照一定浓度梯度加入细胞趋化实验趋化槽的下层培养腔(液体容积为700μl)，小心将经纤连蛋白(fibronectin)预处理的上腔置入下层培养腔，并使之腔底悬浮于下腔之中。将MDA-MB-231细胞悬液加入上腔，于37℃培养8小时后，取下上腔底部滤膜，用棉刷轻轻去除膜上表面黏附的细胞，保留下表面黏附的细胞，将滤膜置入甲醇溶液固定后用苏木精伊红染色，记数滤膜下表面的细胞数。与未经任何处理的细胞相比，野生型嵌合体SDF-1WT-IgG1HCHR-Decorin明显的诱导MDA-MB-231细胞从上腔向下腔迁徙，其作用强度呈明显的剂量依赖关系；而在相同条件下，突变嵌合体SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin却没有显示出明显的诱导乳腺癌细胞迁徙的作用。
3、DF-54/R-IgG1HCHR-Decorin抑制野生型SDF-1α诱导的MDA-MB-231细胞迁徙的活性
MDA-MB-231细胞分别被不同浓度梯度的SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin(10-9～10-5Mol)于37℃预处理3hr，再加入20nM野生型SDF-1α处理5小时，以观察SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin对野生型SDF-1α诱导MDA-MB-231迁徙的抑制作用。结果表明：SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin明显抑制野生型SDF-1α诱导的MDA-MB-231迁徙，其抑制作用呈明显的剂量依赖关系。
                            双重靶效应基因嵌合重组体及其构建方法和应用.ST25
                       SEQUENCE LISTING
<110>暨南大学
<120>双重靶效应基因嵌合重组体及其构建方法和应用
<130>
<160>6
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>1203
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(162)
<223>碳末端α螺旋缺失的人基质细胞衍生因子突变体(SDF-1/54R)的编码序列
<220>
<221>CDS
<222>(163)..(168)
<223>Artificial Sequence，XhoI酶切位点
<220>
<221>CDS
<222>(169)..(210)
<223>人类IgG1抗体重链的铰链区编码序列(IgG1 Heavy Chain Hinge Region，
     IgG1HCHR)
<220>
<221>CDS
<222>(211)..(216)
<223>Artificial Sequence，BamHI酶切位点
<220>
<221>CDS
<222>(217)..(1203)
<223>Decorin基因成熟肽编码序列
<400>1
aag ccc gtc agc ctg agc tac aga tgc cca tgc cga ttc ttc gaa agc    48
Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser
1               5                   10                  15
cat gtt gcc aga gcc aac gtc aag cat ctc aaa att ctc aac act cca    96
His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro
            20                  25                  30
aac tgt gcc ctt cag att gta gcc cgg ctg aag aac aac aac aga caa    144
Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln
        35                  40                  45
gtg tgc att gac ccg aag ctc gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac    192
Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
    50                  55                  60
aca tgc cca ccg tgc cca gga tcc gat gag gct tct ggg ata ggc cca    240
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Gly Ser Asp Glu Ala Ser Gly Ile Gly Pro
65                  70                  75                  80
gaa gtt cct gat gac cgc gac ttc gag ccc tcc cta ggc cca gtg tgc    288
Glu Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe Glu Pro Ser Leu Gly Pro Val Cys
                85                  90                  95
ccc ttc cgc tgt caa tgc cat ctt cga gtg gtc cag tgt tct gat ttg    336
Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu Arg Val Val Gln Cys Ser Asp Leu
            100                 105                 110
ggt ctg gac aaa gtg cca aag gat ctt ccc cct gac aca act ctg cta    384
Gly Leu Asp Lys Val Pro Lys Asp Leu Pro Pro Asp Thr Thr Leu Leu
        115                 120                 125
gac ctg caa aac aac aaa ata acc gaa atc aaa gat gga gac ttt aag      432
Asp Leu Gln Asn Asn Lys Ile Thr Glu Ile Lys Asp Gly Asp Phe Lys
130                     135                 140
aac ctg aag aac ctt cac gca ttg att ctt gtc aac aat aaa att agc      480
Asn Leu Lys Asn Leu His Ala Leu Ile Leu Val Asn Asn Lys Ile Ser
145                 150                 155                 160
aaa gtt agt cct gga gca ttt aca cct ttg gtg aag ttg gaa cga ctt      528
Lys Val Ser Pro Gly Ala Phe Thr Pro Leu Val Lys Leu Glu Arg Leu
                165                 170                 175
tat ctg tcc aag aat cag ctg aag gaa ttg cca gaa aaa atg ccc aaa      576
Tyr Leu Ser Lys Asn Gln Leu Lys Glu Leu Pro Glu Lys Met Pro Lys
            180                 185                 190
act ctt cag gag ctg cgt gcc cat gag aat gag atc acc aaa gtg cga      624
Thr Leu Gln Glu Leu Arg Ala His Glu Asn Glu lle Thr Lys Val Arg
        195                 200                 205
aaa gtt act ttc aat gga ctg aac cag atg att gtc ata gaa ctg ggc      672
Lys Val Thr Phe Asn Gly Leu Asn Gln Met Ile Val Ile Glu Leu Gly
    210                 215                 220
acc aat ccg ctg aag agc tca gga att gaa aat ggg gct ttc cag gga      720
Thr Asn Pro Leu Lys Ser Ser Gly Ile Glu Asn Gly Ala Phe Gln Gly
225                 230                 235                 240
atg aag aag ctc tcc tac atc cgc att gct gat acc aat atc acc agc      768
Met Lys Lys Leu Ser Tyr Ile Arg Ile Ala Asp Thr Asn Ile Thr Ser
                245                 250                 255
att cct caa ggt ctt cct cct tcc ctt acg gaa tta cat ctt gat ggc      816
Ile Pro Gln Gly Leu Pro Pro Ser Leu Thr Glu Leu His Leu Asp Gly
            260                 265                 270
aac aaa atc agc aga gtt gat gca gct agc ctg aaa gga ctg aat aat      864
Asn Lys Ile Ser Arg Val Asp Ala Ala Ser Leu Lys Gly Leu Asn Asn
        275                 280                 285
ttg gct aag ttg gga ttg agt ttc aac agc atc tct gct gtt gac aat      912
Leu Ala Lys Leu Gly Leu Ser Phe Asn Ser Ile Ser Ala Val Asp Asn
    290                 295                 300
ggc tct ctg gcc aac acg cct cat ctg agg gag ctt cac ttg gac aac      960
Gly Ser Leu Ala Asn Thr Pro His Leu Arg Glu Leu His Leu Asp Asn
305                 310                 315                 320
aac aag ctt acc aga gta cct ggt ggg ctg gca gag cat aag tac atc      1008
Asn Lys Leu Thr Arg Val Pro Gly Gly Leu Ala Glu His Lys Tyr Ile
                325                 330                 335
cag gtt gtc tac ctt cat aac aac aat atc tct gta gtt gga tca agt      1056
Gln Val Val Tyr Leu His Asn Asn Asn Ile Ser Val Val Gly Ser Ser
            340                 345                 350
gac ttc tgc cca cct gga cac aac acc aaa aag gct tct tat tcg ggt      1104
Asp Phe Cys Pro Pro Gly His Asn Thr Lys Lys Ala Ser Tyr Ser Gly
        355                 360                 365
gtg agt ctt ttc agc aac ccg gtc cag tac tgg gag ata cag cca tcc      1152
Val Ser Leu Phe Ser Asn Pro Val Gln Tyr Trp Glu Ile Gln Pro Ser
    370                 375                 380
acc ttc aga tgt gtc tac gtg cgc tct gcc att caa ctc gga aac tat      1200
Thr Phe Arg Cys Val Tyr Val Arg Ser Ala Ile Gln Leu Gly Asn Tyr
385                 390                 395                 400
aag                                                                  1203
Lys
<210>2
<211>401
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>2
Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser
1               5                   10                  15
His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro
            20                  25                  30
Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln
        35                  40                  45
Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
    50                  55                  60
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Gly Ser Asp Glu Ala Ser Gly Ile Gly Pro
65                  70                  75                  80
Glu Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe Glu Pro Ser Leu Gly Pro Val Cys
                85                  90                  95
Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu Arg Val Val Gln Cys Ser Asp Leu
            100                 105                 110
Gly Leu Asp Lys Val Pro Lys Asp Leu Pro Pro Asp Thr Thr Leu Leu
        115                 120                 125
Asp Leu Gln Asn Asn Lys Ile Thr Glu Ile Lys Asp Gly Asp Phe Lys
    130                 135                 140
Asn Leu Lys Asn Leu His Ala Leu Ile Leu VaL Asn Asn Lys Ile Ser
l45                 150                 155                 160
Lys Val Ser Pro Gly Ala Phe Thr Pro Leu Val Lys Leu Glu Arg Leu
                165                 170                 l75
Tyr Leu Ser Lys Asn Gln Leu Lys Glu Leu Pro Glu Lys Met Pro Lys
            180                 185                 190
Thr Leu Gln Glu Leu Arg Ala His Glu Asn Glu Ile Thr Lys Val Arg
        195                 200                 205
Lys Val Thr Phe Asn Gly Leu Asn Gln Met Ile Val Ile Glu Leu Gly
    210                 215                 220
Thr Asn Pro Leu Lys Ser Ser Gly Ile Glu Asn Gly Ala Phe Gln Gly
225                 230                 235                 240
Met Lys Lys Leu Ser Tyr Ile Arg Ile Ala Asp Thr Asn Ile Thr Ser
                245                 250                 255
Ile Pro Gln Gly Leu Pro Pro Ser Leu Thr Glu Leu His Leu Asp Gly
            260                 265                 270
Asn Lys Ile Ser Arg Val Asp Ala Ala Ser Leu Lys Gly Leu Asn Asn
        275                 280                 285
Leu Ala Lys Leu Gly Leu Ser Phe Asn Ser Ile Ser Ala Val Asp Asn
    290                 295                 300
Gly Ser Leu Ala Asn Thr Pro His Leu Arg Glu Leu His Leu Asp Asn
305                 310                 315                 320
Asn Lys Leu Thr Arg Val Pro Gly Gly Leu Ala Gl Lis Lys Tyr Ile
                325                 330                335
Gln Val Val Tyr Leu His Asn Asn Asn Ile Ser Val Val Gly Ser Ser
            340                 345                 350
Asp Phe Cys Pro Pro Gly His Asn Thr Lys Lys Ala Ser Tyr Ser Gly
        355                 360                 365
Val Ser Leu Phe Ser Asn Pro Val Gln Tyr Trp Glu Ile Gln Pro Ser
    370                 375                 380
Thr Phe Arg Cys Val Tyr Val Arg Ser Ala Ile Gln Leu Gly Asn Tyr
385                 390                 395                 400
Lys
<210>3
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>根据人SDF-1序列设计的5’-末端引物，用以克隆人SDF-1/54R
<400>3
ggggtaccga cgacgacgac aagaagcccg tcagcctgag ctacagat                    48
<210>4
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>根据人SDF-1序列设计的3’-末端引物，用以克隆人SDF-1/54R
<400>4
ccgctcgagc ttcgggtcaa tgcacac                                           27
<210>5
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>根据人Decorin基因cDNA序列设计的5’-末端引物，用以克隆人Decorin基因成
     熟肽编码序列
<400>5
cgggatccga tgaggcttct gggataggcc                                       30
<210>6
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>根据人Decorin基因cDNA序列设计的3’-末端引物，用以克隆人Decorin基因成
     熟肽编码序列
<400>6
ggaattctta cttatagttt ccgagttg                                         28

Claims (4)

1.一种双重靶效应基因嵌合重组体，其特征在于，所述双重靶效应基因嵌合重组体核酸编码序列为：
aagcccgtcagcctgagctacagatgcccatgccgattcttcgaaagccatgttgccagagccaacgtcaagcatctcaa
aattctcaacactccaaactgtgcccttcagattgtagcccggctgaagaacaacaacagacaagtgtgcattgacccgaa
gctcgagCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAggatcc
gatgaggcttctgggataggcccagaagttcctgatgaccgcgacttcgagccctccctaggcccagtgtgccccttccg
ctgtcaatgccatcttcgagtggtccagtgttctgatttgggtctggacaaagtgccaaaggatcttccccctgacacaactct
gctagacctgcaaaacaacaaaataaccgaaatcaaagatggagactttaagaacctgaagaaccttcacgcattgattctt
gtcaacaataaaattagcaaagttagtcctggagcatttacacctttggtgaagttggaacgactttatctgtccaagaatcag
ctgaaggaattgccagaaaaaatgcccaaaactcttcaggagctgcgtgcccatgagaatgagatcaccaaagtgcgaa
aagttactttcaatggactgaaccagatgattgtcatagaactgggcaccaatccgctgaagagctcaggaattgaaaatgg
ggctttccagggaatgaagaagctctcctacatccgcattgctgataccaatatcaccagcattcctcaaggtcttcctccttc
ccttacggaattacatcttgatggcaacaaaatcagcagagttgatgcagctagcctgaaaggactgaataatttggctaag
ttgggattgagtttcaacagcatctctgctgttgacaatggctctctggccaacacgcctcatctgagggagcttcacttgga
caacaacaagcttaccagagtacctggtgggctggcagagcataagtacatccaggttgtctaccttcataacaacaatatc
tctgtagttggatcaagtgacttctgcccacctggacacaacaccaaaaaggcttcttattcgggtgtgagtcttttcagcaac
ccggtccagtactgggagatacagccatccaccttcagatgtgtctacgtgcgctctgccattcaactcggaaactataag；
所述双重靶效应基因嵌合重组体氨基酸序列为：
Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser
His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro
Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln
Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Gly Ser Asp Glu Ala Ser Gly Ile Gly Pro
Glu Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe Glu Pro Ser Leu Gly Pro Val Cys
Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu Arg Val Val Gln Cys Ser Asp Leu
Gly Leu Asp Lys Val Pro Lys Asp Leu Pro Pro Asp Thr Thr Leu Leu
Asp Leu Gln Asn Asn Lys Ile Thr Glu Ile Lys Asp Gly Asp Phe Lys
Asn Leu Lys Asn Leu His Ala Leu Ile Leu Val Asn Asn Lys Ile Ser
Lys Val Ser Pro Gly Ala Phe Thr Pro Leu Val Lys Leu Glu Arg Leu
Tyr Leu Ser Lys Asn Gln Leu Lys Glu Leu Pro Glu Lys Met Pro Lys
Thr Leu Gln Glu Leu Arg Ala His Glu Asn Glu Ile Thr Lys Val Arg
Lys Val Thr Phe Asn Gly Leu Asn Gln Met Ile Val Ile Glu Leu Gly
Thr Asn Pro Leu Lys Ser Ser Gly Ile Glu Asn Gly Ala Phe Gln Gly
Met Lys Lys Leu Ser Tyr Ile Arg Ile Ala Asp Thr Asn Ile Thr Ser
Ile Pro Gln Gly Leu Pro Pro Ser Leu Thr Glu Leu His Leu Asp Gly
Asn Lys Ile Ser Arg Val Asp Ala Ala Ser Leu Lys Gly Leu Asn Asn
Leu Ala Lys Leu Gly Leu Ser Phe Asn Ser Ile Ser Ala Val Asp Asn
Gly Ser Leu Ala Asn Thr Pro His Leu Arg Glu Leu His Leu Asp Asn
Asn Lys Leu Thr Arg Val Pro Gly Gly Leu Ala Glu His Lys Tyr Ile
Gln Val Val Tyr Leu His Asn Asn Asn Ile Ser Val Val Gly Ser Ser
Asp Phe Cys Pro Pro Gly His Asn Thr Lys Lys Ala Ser Tyr Ser Gly
Val Ser Leu Phe Ser Asn Pro Val Gln Tyr Trp Glu Ile Gln Pro Ser
Thr Phe Arg Cys Val Tyr Val Arg Ser Ala Ile Gln Leu Gly Asn Tyr
Lys；
所述双重靶效应是指既能抑制乳腺癌转移又能抑制乳腺癌生长的双重靶效应。
2.根据权利要求1所述的一种双重靶效应基因嵌合重组体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
(1)引物1和引物2以SDF-54/R/pET-30a(+)为模板扩增SDF-54/R，在5’和3’端分别引入KpnI和XhoI酶切位点，在5’端引入肠激酶编码序列，去除编码序列3’端的终止密码子；SDF-54/R PCR产物直接插入T-A克隆载体pMD18-T并转化JM109，筛选白色的阳性菌落抽提质粒，酶切鉴定；
(2)SDF-54/R/pMD18-T重组体和人类IgG1抗体重链的铰链区编码序列分别用XhoI和BamHI进行双酶切，酶切后的IgG1HCHR/XhoI+BamHI插入酶切后的SDF-54/R/pMD18-T/XhoI+BamHI，转化JM109，挑取阳性菌落，酶切鉴定SDF-54/R-IgG1HCHR/pMD18-T；
(3)从人骨髓细胞中提取总RNA，反转录成cDNA，根据天然Decorin的基因序列设计两条Decorin特异性核苷酸引物3和引物4，用引物3和引物4PCR扩增Decorin的成熟肽编码序列，Decorin的PCR产物直接插入T-A克隆载体pMD18-T，筛选白色阳性菌落，提取质粒，酶切初步鉴定后进行测序确认；
(4)将Decorin从Decorin/pMD18-T用BamHI&EcoRI切下，插入同样用BamHI和EcoRI双酶切的SDF-54/R-IgG1HCHR/pMD18-T/BamHI+EcoRI，连接产物转化JM109，挑取阳性菌落PCR初步鉴定，然后测序证实；测序表明SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin/pMD18-T嵌合重组体构建正确；
(5)KpnI和EcoRI将SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin从SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin/pMD18-T上切下，定向克隆至同样被KpnI和EcoRI双酶切的pET-30a(+)，转化JM109；挑取阳性克隆抽提质粒做酶切鉴定；经确证的SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin/pET-30a(+)转化BL21，用IPTG进行诱导表达，收获裂解菌体，上清液通过Ni亲和介质进行纯化，最后用肠激酶切掉His-Tag，过HPLC柱得到纯化的SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin重组蛋白；
所述引物1为5’-ggggtaccgacgacgacgacaagaagcccgtcagcctgagctacagat-3’；其5’-端具有Kpn I酶切位点和EK识别位点-(Asp)4Lys的编码序列；
所述引物2为5’-ccgctcgagcttcgggtcaatgcacac-3’；其5’-端具有XhoI酶切位点；
所述引物3为5’-cgggatccgatgaggcttctgggataggcc-3’；所述引物3含有酶切位点BamHI；
所述引物4为5’-ggaattcttacttatagtttccgagttg-3’，所述引物4含有酶切位点EcoRI和终止密码子。
3.根据权利要求2所述的双重靶效应基因嵌合重组体的构建方法，其特征在于，所述人类IgG1抗体重链的铰链区编码序列为：
ctcgagCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAggatcc，
其5’-端带有XhoI限制性酶切位点，3’-端带有BamHI限制性酶切位点。
4.根据权利要求1所述的一种双重靶效应基因嵌合重组体在抑制人乳腺癌细胞或组织的生长和转移中的应用。
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