JPH06503467A - 上皮増殖因子受容体に関連する受容体のための遺伝子をコードしているｄｎａセグメント - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １４、図４で定義したアミノ酸配列、またはその特異的部分を持つ単離したポリ ペプチド。

１５、生物試料中のｅ　ｒ　ｂＢ−３ｍＲＮＡを検出するだめの生物学的検定法 であって： ｉ）請求項１記載のＤＮＡセグメントに生物試料を、該ＤＮＡセグメントと相補 的ＲＮＡを含有するＤＮＡ　：ＲＮＡハイブリッド分子が形成され得るような条 件下で、接触させ；　次いで ｔ、）該ハイブリッド分子中に存在する該ＤＮＡセグメントの量を決定する段階 からなることを特徴とする検定法。

１６、ｅｒｂＢ−３受容体により媒介される活性に影響する能力を、該ｅｒｂＢ −３受容体のリガントとして可能性のある同族体について試験するだめの生物学 的検定法であって。

ｉ）請求項１１記載の細胞により生産されるｅｒｂＢ−３受容体を、リガントで あると疑われている分子と接触させ、そして ｌｌ）該細胞中の該ｅｒｂＢ−３受容体により媒介された生物学的活性の量を測 鍮する段階からなることを特徴とする生物学的検定法。

１７、請求項１４記載のポリペプチドの特異的部分に０特異的である抗体。

１８　生物学試料中のｅｒｂＢ−３抗原を検出するための生物学的検定法であっ て。

ｌ）請求項１７記載の抗体に該試料を、該抗体と該抗原の特異的複合体が形成で きるような条件下で、接触させ；そして ｎ）該複合体として存在する該抗体の量を決定する段階からなることを特徴とす る検定法。

１９、治療用薬物の標的を、ｅｒｂＢ−３受容体を高レベルで持つ細胞にする方 法であって 請求項１ア記載の抗体を、またはその活性断片をを、該薬物に接合させ；そして ｉｉ）得られた接合体を、ｅｒｂＢ−３受容体を高１ノベルで持つ細胞を持つ個 体に、有効量でかつ該抗体が該細胞上の該受容体上に結合できるような有効な方 法で、投与する段階なることを特徴とする方法。

２０、治療用薬物の標的をｅｒｂＢ−３受容体を高レベルで持つ細胞にするため に、該治療用薬物に接合した請求項１７記載の抗体、またはその活性断片を使用 する方法。

明　細　書 上皮増殖因子受容体に関連する受容体のための遺伝子をコードしているＤＮＡセ グメント発明の分野 本発明は下記の２種の関連する膜走査チロシンキナーゼにより代表される受容体 タンパク質類に関する新規のタンパク質をニー　ドしている遺伝子に関するニト リ赤芽球症ウィルスのプロウィルスＤＮＡ中で初めて確認されたガン遺伝子（ｖ −ｅｒｂＢ）の正常ヒト対立遺伝子であるｅｒｂＢ遺伝子によりコードされてい る上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）と；関連遺伝子ｅｒｂＢ−２によりコード されている受容体。

特に本発明は、ここではｅｒｂＢ−３と命名される、この受容体遺伝子類の第３ 員のだめのコーディング配列をコードしているＤ　Ｎ　Ａ配列、またはその特異 的な部分上皮増殖因子受容体をコードしているがん原遺伝子類は、や体の構造が 密接に相同である若干数の異なる同族を構成する。最も高い相同度は、これらタ ンパク質の生来のチロシンキナーゼ活性にとって必須であるそれらの触媒領域に て観察される。

このような同族受容体の例は　ＥＧＦ−Ｒとガン遺伝子ｅｒｂＢ−２の関連生産 物；コロニー刺戟因子１受容体（Ｃ３Ｆ−１−Ｒ）および関連する血小板−誘導 成長因子受容体（ＰＤＧＦ−Ｒ）：インシュリン受容体（ＩＦ−Ｒ）および関連 するインシュリン一様成長因子１受容体（ＩＧＦ−１−Ｒ）；および関連するガ ン遺伝子　ｅｐｈ　と　ｅｌｋ　によりコードされている受容体を包含する。

これら同族の若干における成長因子受容体が正常な成長と発達を調節するのに重 要な役目をしていることは、よく確立されている。

ショウジヨウバエにおける最近の研究は、リガント−受容体の相互作用により媒 介される発達が如何に重要かつ多機能的であるかを強調している。頻繁に表現型 を変えるショウジヨウバエの突然変異体の増加数は、そのようなタンパク質をコ ードしている遺伝子における障害によるものであると同定されている。ＤＥＲと 命名されているショウジヨウバエのＥＧＦ−Ｒ相同染色体の遺伝子的部位は、外 胚葉起源の多数の組織成分の退化を伴う複雑な表現型を発揮する接合胚致死の弱 小域（ｆａｉｎｔｌｉｔｔｌｅ　ｂａｌｌ）に対立しているものとして同定され た。

更に、他の突然変異体は、卵子またはその周辺の母体組織のいずれにおいてもＤ ＥＲ−機能を欠如しているように見える。か（して、ＤＥＲ受容体は、卵殻と胚 の正常な形状の決定に必要な卵子と卵胞の間のりガント−受容体の相互作用にお いて重要な役目をするとしてもよいだろう。ＤＥＲが、両方の既知のヒトｅｒｂ Ｂ−関連遺伝子の副本をショウジヨウバエで発現してだけのものかどうかは判っ ていない。

これらの受容体分子の成るものは、新生物形成にも関与している。特に、ｅｒｂ ＢとｅｒｂＢ−２遺伝子の両方が、ガン遺伝子として下記の機構により活性化さ れるのが示され、そしてその機構とは、それら遺伝子がコードしている受容体タ ンパク質の触媒活性を構成的に活性化する過剰発現または突然変異を含むもので ある（バーブマン、Ｃ，１，，フング、Ｍ、Ｃ，＆ワインバーグ、Ｒ，Ａ、、１ ９８６．Ｃｅ１ｌ　４５：６４９−６５７：ジ　フィオレ、Ｐ、Ｐ、、ピーアス 、Ｊ、Ｈ，。

クラウス、Ｍ、Ｈ，、セガット、０．．　キング、Ｃ，Ｒ，。

＆　アーロンソン、Ｓ、Ａ、、１９８７゜５ｃｉｅｎｃｅ　２３７：１７８−１ ８２；ジ　フイオレ、Ｐ、Ｐ、、ビーアス、Ｊ、Ｈ，，フレミング、Ｔ。

Ｐ、、ハザン、Ｒ１，ウルリッチ、Ａ、、キング、Ｃ１Ｒ９，ツユレンシンガー 、Ｊ、＆　アーロンソン、Ｓ。

Ａ、、１９８７．Ｃｅ１ｌ　５１：１０６３−１０７０：ヴエル、Ｔ、Ｊ、、ベ グイノット、Ｌ、、　ヴアス。

Ｗ、Ｃ，、ライリンガム、Ｍ、Ｃ，，メルリノ、Ｇ。

Ｔ、、　バスタン、■、＆　ローライ、Ｄ、Ｒ，，１９８７，５ｃｉｅｎｃｅ　 ２３８：１４０８−１４１０）ｅｒｂＢとｅｒｂＢ−２の両方は、ヒト悪性腫瘍 の原因になるように関与している。ｅｒｂＢ遺伝子の増幅または過剰発現、また は両方の組み合わせが、扁平細胞ガンとダリア芽細胞腫において示された（リベ ルマン、Ｔ、Ａ、、ナスバウム、Ｈ，Ｒ，，レイシン、Ｎ、、グリス、Ｒ１，ラ ックス、■１．ツレツク、Ｒ２，フィットル、Ｎ、、ウォーターフィールド、Ｍ 、Ｄ、、ウルリツチ、Ａ、＆　シュレシンガー、Ｊ、、１９８５゜Ｎａｔｕｒｅ 　３１３：１４４−１４７）。

ｅｒｂＢ−２の増幅と過剰発現は、ヒト乳ガンと卵巣ガンに観察されている（キ ング、Ｃ，Ｒ，、クラウス。

Ｍ、Ｈ，＆　アーロンソン、Ｓ、Ａ、、１９８５゜５ｃｉｅｎｃｅ　２２９：９ ７４−９７６；スラモン。

Ｄ、Ｊ、、ゴドルフィン、Ｗ、、ジョーンズ、Ｌ、Ａ、。

ホルト、Ｊ、Ａ、、　ウォング、Ｓ、Ｇ、、キース、Ｄ。

Ｅ、、レヴイン、Ｗ、Ｊ、、スチュアー）、Ｓ、Ｇ、。

ウドヴエ、Ｊ、、ウルリッチ１人、＆ブレス、Ｍ、Ｆ、。

１９８９．５ｃｉｅｎｃｅ　２４４ニア０７−７１２）。

モしてｅｒｂＢ−２の過剰発現は、特に攻撃的な腫瘍の重要な予後の指示薬とし て報告されている（スラモン。

Ｄ、Ｊ、、他、、１９８９．上記参照）。

しかし、そのような全ての腫瘍がｅｒｂＢ−２を過剰発現しているということは 見出されておらず、そして多（のヒトの腫瘍が何れかの既知のガン遺伝子に随伴 していたというわけではない。

かくして、診断のための知識と方法を提供する追加のガン遺伝子を追求する必要 が依然としてあり、これは最終的にはヒトのガンの合理的分子治療のためになる 。

発明の要約 従来知られていなかったか又は存在することさえも予想されていなかったｅγｂ Ｂプロト−オンコジーン系に関連するレセプタープロティンをコード化している ＤＮＡセグメントを提供することが本発明の目的である。更に、ＲＮＡの発現及 び前記遺伝子の異常発現がヒトの癌に含まれるかどうかを決定することが可能な 前記遺伝子のプロティン産生物のための分析法を発展させることが本発明の目的 である。

上記目的の遂行において、本発明らは３ａｃ　Ｉ制限酵素を用いる開裂によって 産生され、約９ｋｂｐの寸法を有し、且つ減少された緊縮複合条件下でのみｖ− ｅγｂＢ遺伝子から誘導されるプローブを用いる核酸複合化によって検出可能で あるヒトゲノムＤＮＡセグメントを発見した。それ故、前記ＤＮＡセグメントは 上皮増殖因子受容体遺伝子（ＥＧＦ−Ｒ）をコード化するために知られている遺 伝子（例えば、ｅγｂＢ遺伝子）及び関連するｅγｂＢ−２遺伝子に分けられる 。部分的精製及び分子クローニング後の前記ＤＮＡセグメントのキャラクタリゼ ーションは、ｖ−ｅγｂＢ領域は相同的に３箇所のエキソン（これは、ＥＧＦ− Ｒ及びｅγｂＢ−２プロテインのチロシンキナーゼドメイン内の連続領域の各々 ６４％及び６７％のホモロジーを有するアミノ酸配列をコード化している）にマ ツプされたということを示した。ゲノムＤＮＡクローンから誘導されるプローブ は、関連するｍＲＮＡのｃＤＮＡクローン（これは、ｅＴｂＢ系の一員としてそ れを同定するための構造的特徴を有する予想された１４８ｋｄトランスメンプラ ンポリペプチドをコード化しており、この新遺伝子の名称をｅγＮ３−３とする ことを促している）を同定した。前記遺伝子は、ヒト染色体１２ｑ１１−１３に マツプされていたものであり、そして上皮起源の多種の通常組織中に６，２ｋｂ トランスクリプトとして発現されていることが示された。著しく高められたｅγ Ｉ＋Ｂ−３ｍＲＮＡレベルは、ヒト腫瘍細胞系中に認められた。

したがって、基本的態様においては、本発明はｅγｂＢ−３遺伝子又はその独自 部分をコード化したヌクレオチド配列を育するＤＮＡセグメントに関するもので ある。

ｅγｂＢ−３遺伝子の前記部分は、少な（とも１２ないし１４個のヌクレオチド （これは、ｅγＮ３−３遺伝子の前記部分に関してそれらに相補的な配列を有す るＤＮＡ又はＲＮＡセグメントを有する安定な二重体を形成するために充分であ る）を含む。更に、ｅγ１）Ｂ−３遺伝子の前記独自部分は、勿論、ｅγｂＢ又 はｅγｂＢ−２遺伝子中に存在しない配列を有する。換言すれば、ｅγｂＢ−３ 遺伝子の前記部分の配列は、何れかの他のＲＮＡセグメントの配列とは少なくと も１個のヌクレオチドを異にする。−態様において、前記ＲＮＡセグメントは、 ヒトのゲノムＤＮＡフラグメント（これは、５ａＣＩ制限酵素を用いる開裂によ り産生され、約９０ｋｂｐの寸法を有し、且つ実施例１に記載する如く、減少さ れた緊縮複合条件下でのみｖ−ｅγｂＢ遺伝子から誘導されるプローブを用いる 核酸複合化によって検出可能である）によって例示された。本開示において述べ られる核酸複合化法及びクローニング法の応用によって、過度の実験をすること なく、組み換えＤＮＡ分野における当業者は、ヒトｅγ１）Ｂ−３遺伝子以外に 哺乳動物のｅγ１）Ｂ−３遺伝子の少なくとも一部をコー　ド化しているヌクレ オチド配列からなる本発明のヒトＤＮＡフラグメントに関連するＤＮＡフラグメ ントを同定し且つ単離することができる。複合化法におけるプローブと同様に、 ｅγｂＢ−３遺伝子のゲノムＤＮＡフラグメントの応用も、本フラグメントに隣 接する重複しているフラグメントを順次単離することによって、すなわち染色体 処理として前記分野において知られている方法によって、前記分野における当業 者が全ｅγＩ）Ｂ−３遺伝子を得ることを可能とする。

本開示には、Ｖ−ｅγｂＢ遺伝子のホモロジー領域内で、ヒトのゲノム９　ｋ　 ｂ　ｐＳａｃＩ　ＤＮＡフラグメントの部分的ヌクレオチド配列か記載されてい る。しかしながら、本開示中の方法は、更に本発明に基づいて全９ｋｂｐヒトゲ ノムＤＮＡフラグメントの単離及び配列の決定を可能とする。したがって、本発 明は更に、ヒトゲノムＤＮＡセグメント（これは、Ｓａｃ　Ｉ制限酵素を用いる 開裂により産生され、約９ｋｂｐの寸法を有し、且つ実施例１に記載する如く、 減少された緊縮複合条件下でのみＶ−ｅγｂＢ遺伝子から誘導されるプローブを 用いる核酸複合化によって検出可能である）のヌクレオチド配列、又はその独自 部分を有するＤＮＡセグメントに関するものである。上記の染色体処理法の延長 によって、本発明は更に、この分野における当業者が関連するＤＮＡフラグメン ト（これは、完全なヒトｅγＩＩＩＢ−３遺伝子並びに例えばヒト以外の哺乳動 物のＣγｂＢ−３遺伝子からなる）の配列を決定することを可能とする。

本５ａｃＸＤＮＡフラグメント又は核酸複合化のためのプローブのようなその何 れかの部分の応用において、例えばイン　ビトロ　ボリメラーゼチェインリアク ション法（ＰＣＲ：アメリカ合衆国特許第４６８３２０２号明細書：アメリカ合 衆国特許第４６８３１９５号明細書：及びサイキ他、１９８５．ＳＣｉｉＳＣ１ １ｎＣ：１３５０−５４参照）によって、又は分子クローニングの標準法によっ て、前記フラグメントは増幅される。例えば、本発明のヒトｅγｂＢ−３ゲノム ＤＮＡフラグメントのクローンは、通常のヒト胸腺ＤＮＡフラグメント（本文中 でＥ３−１ゲノムクローンと称されており、本願の図２に定義された部分的制限 酵素地図、及び図３に定義された部分的ＤＮＡ配列を有している）の組み換えク ローンによって例示される。ゲノムクローンＥ３−１の単離及びキャラクタリゼ ーンヨンは、以下の実施例２に述べられている。

本発明のヒトゲノムＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列の分析は、ヌクレオチ ド配列は、翻訳されなかったイントロン配列と翻訳されたエキソンとの間の境界 を定義するスプライス部位共通配列によって接しられている３個のオープンリー ディング構造をコード化しているということを示す（図２）。３個のエキソンの 予想されたアミノ酸配列は、３箇所の領域（これは、Ｖ−ｅｒｂＢのチロシンキ ナーゼドメイン並びにヒトＥＧＦ−Ｒ及びｅｒｂＢ−２プロテイン中で隣接して いる）に非常に類似している。更に、前記１−トゲツムクローンの予想されたア ミノ酸配列は、ヒトゲノムＤＮＡクローンから誘導されるブｒＪ−ブの複合化に よって検出されるｍＲＮＡ種の相ＷＤＮＡ（ｃＤＮＡ）中のより大きいオープン リーディング構造中に含まれる。

したがって、本発明はｅｒｂＢ−３遺伝子のヌクレオチド配列を有するＤＮＡセ グメント−（この場合、ヌクレオチド配列はｅｒｂＨ−３遺伝子又はその独自部 分のアミノ酸配列をコード化している）にも関するものである。換言ずれば、ｅ γＩ）Ｂ−３アミノ酸配列の前記部分の配列は、何れかの他のＤ　Ｎ　Ａセグメ ントによってコード化された市ｒ記アミノ酸配列とは少なくとも１個のアミノ酸 残基を異にする。ｅｒｂＢ−３アミノ酸配列の前記部分は、少なくとも約４ない Ｌ　６個のアミノ酸（これは、ｅγ１）１３−３ポリペプチドの前記部分に対し て選択的な抗体のための結合部位を提供するために充分である）を含む。更に、 Ｃγｌ＋Ｂ−３アミノ酸配列の前記独自部分は、勿論、ｅγＩ）Ｂ又はｅｒｂＢ −２遺伝子中に存在しない配列を有する。特に、本発明は、前記アミノ酸配列又 はその独自部分がヒトｅｒｂＢ−３遺伝子のポリペプチド産生物のものであるよ うなりＮＡ上セグメント関するものである。前記ＤＮＡセグメントは、上記ヒト ゲノムＤＮＡクローンＥｌ−１により、並びにＥ３−６．Ｅ３−８．Ｅｉ９．Ｅ ３−１１及びＥ３−１６（これらは、以下の実施例３に記載されている）とまと めて称されているヒトｃＤＮＡにより、例示されている。前記ＤＮＡセグメント （これは、ヒ）−ｅｒｂＢ−３遺伝子の全ポリペプチド産生物のアミノ酸配列を コード化している）の好ましい態様は、図４において定義されたヌクレオチド配 列を有し且つ図４において定義された予想されたアミノ酸配列を有するヒトＣＤ ＮＡクローンＥ：３−１６である。

本発明のＤＮＡセグメントは、以下の実施例５に記載されている如く、正常及び 腫瘍組織中のｅｒｂＢ−３遺伝子の発現を検出するために有用である。それ故、 更に別の観点においては、本発明は・ｉ）本発明のＤＮＡセグメントを含むＤＮ Ａ　：　ＲＮＡ複合分子及び相補ＲＮＡが形成され得るような条件下で生物学的 試料を本発明のＤＮＡセグメントと接触させる工程：及び五）得られた複合分子 中に存在する本発明のＤＮＡセグメントの量を決定する工程、からなる生物学的 試料中のｅｒｂＢ−３ｍＲＮＡを検出するためのバイオアッセイに関するもので ある。下記実施例５に記載されている知見は、本発明の前記方法によって検出さ れるような増加したｅγ１）Ｂ−３発現は、ＥＧＦ−Ｒ（ｅｙｌ＋Ｂ）遺伝子及 びｅｒｂＢ　−２遺伝子の場合の如く、幾つかのヒトの悪性度に関する規範とな るということを示している。

勿論、ｅｒｂＢ−３ポリペプチド産生物に関して、本発明は本実施例（これは、 ｅｒｂＢ−３遺伝子のポリペプチド産生物のアミノ酸配列もコード化している） 中のＤＮＡ配列以外のＤＮＡ配列を有するＤＮＡセグメントも含むということは 遺伝子工学の分野の当業者によって理解されるであろう。例えば、一般的遺伝子 コードを参照することによって、何れかの与えられたアミノ酸配列をコード化し ている種々の配列を含む合成りＮＡ上セグメント産生ずるために、標準的な遺伝 子工学の方法が使用され得るということが知られている。ヒトｅγｂＢ−３遺伝 子のポリペプチド産生物のアミノ酸配列の少なくとも一部をコード化している前 記合成りＮＡ上セグメント、本発明の範囲内に入っている。更に、異なる個々の ものは何れかの与えられたヒト遺伝子のための僅かに異なるＤＮＡ配列を有し得 るものであり、そして幾つかの場合には、そのような突然変異性又は変性遺伝子 はポリペプチド産生物の基本的機能に影響を及ぼすことなく個々のものの間で異 なるアミノ酸配列を存するポリペプチド産生物をコード化するということが知ら れている。又別に、前記ポリペブチの基本的機能に影響を及ぼすことなく、遺伝 子工学的方法によって多数のアミノ酸置換体がポリペプチド産生物中に作られ得 るということも知られている。したがって、本発明は更に、ヒトｅγ１）Ｂ−３ のアミノ酸配列、又はその独自部分と少なくとも１個のアミノ酸を異にするアミ ノ酸配列をコード化しているヌクレオチド配列を有し、且つ何れかの他のポリペ プチドのアミノ酸配列よりもヒトｅγｂＢ−３のアミノ酸配列に大きな全般的類 似性を有するＤＮＡセグメントに関するものである。前記ＤＮＡセグメントのア ミノ酸配列は、少なくとも約４ないし６個のアミノ酸（これは、前記配列を含む ポリペプチドの部分に対して選択的な抗体のための結合部位を提供するために充 分である）を含む。好ましい態様においては、前記ＤＮＡセグメントはヒトｅγ ｂＢ−３ポリペプチドの機能を実質的に有するアミノ酸配列をコード化している 。前記の如く、予想されたｅγＩ）Ｂ−３ポリペプチドは、ｅγｂＢレセプター 系の一員としてそれを同定するための構造的特徴を有する１４８ｋｄトランスメ ンブランポリペプチドである。

ｅγ１）Ｂ−３アミノ酸配列と本発明のアミノ酸配列との類似性は、配列体制に より定義された分析方法及びバーソン（Ｐｅａｒｓｏｎ　）及びリップマン（Ｌ ｉｐｍａｎ）により述べられたアルゴリズム（Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｗ、Ｒ，＆　Ｌ ｉｐｍａｎ、Ｄ、Ｊ、、１９８８、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　Ｌｌ、Ｓ、Ａ、　８５：２４４４−４８　）の比較によって決定された。前 記比較は、アミノ酸配列の正確なホモロジーのみならず、他のもののための１個 の残部の置換（これは、観察された機能を共有する進化的に関連するプロティン の系においてしばしば起こることが知られている）をも意図している。

／′ 更に本発明は、本発明のＤＮＡ部分とベクターからなる組換えＤＮＡ分子に関す る。さらに別な見方で、本発明は、本発明のＤＮＡ部分で形質転換された細胞の 培養に関する。本発明のＤＮＡ５で形質転換されたこれらの宿主細胞には、高等 真核生物例えば動物、植物および昆虫の細胞と低級真核生物例えば酵母の細胞の 両方、ならびにバクテリア細胞例えば大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）および枯草菌（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）のそれを含めた原核生物の宿主が含まれ る。本発明のこれらの見方は、下記実施例２および３に記載されている組換えＤ ＮＡ５および細胞により例示される。

本発明のこの見方の一つの特別な具体例は、本発明のＤＮＡで形質転換された細 胞、好ましくは哺乳動物細胞からなり、ここで形質転換するＤＮＡはｅｒｂＢ− ３遺伝子の官能性ポリペプチドを産生ずべく発現させ得る。

例えばＥ３−１６ｃＤＮＡを持つｐｓＶ２ｇｐｔべ’）９−で形質転換された哺 乳動物細胞（ＣＯ３−１）は、良く知られた方法例えばマツイら（Ｍａｔｓｕｉ 　ｅｔ　ａｌ、）の１９８９年２月９日に提出された米国特許出願第０７／３０ ８．３０２号に記載されている方法〔ビールスら（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｊ、Ｈ，ｅｔ 　ａｌ、）１９８８年、　「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２３９　：　６２ ８−６３１　；およびマツイ（Ｍａｔｕｉ、　Ｔ、　）、ヘイダラン（Ｈｅｉｄ ａｒａｎ、Ｍ、）　、ミキ（Ｍｉｋｉ、Ｔ、）　、ボベスキュ−（Ｐｏｐｅｓｃ ｕ、　Ｎ、　）、ラ　ロシエル（Ｌａ　Ｒｏｃｈｅｌｌｅ、Ｗ、）、クラウス（ Ｋｒａｕｓ、　Ｍ、　）、ビールス（Ｐｉ−ｅｒｃｅ、　Ｊ、）およびアンダー ソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓ、）　１９８９年。

［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２＝１３　：　８００−８０４も参照］に従 い製造される。要約すれば、ｃＤＮＡ発現プラスミドは、読み取り枠（ｔｈｅ　 ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ）中の全ヌクレオチドを含むｅｒｂＢ−３関連ｃＤ ＮＡを、先に詳述したように、中に猿の肉腫ウィルス長末端繰り返し配列（ｌｏ ｎｇ−ｔｅｒｍｉｎａｌ−ｒｅｐｅａｔ　：　ＬＴＲ）がプロモーターとして工 作されているｐＳＶ２ｇｐｔベクター中に導入することにより構築される。その ような組換えベクター中の過渡発現（ｔｒａｎｓｉ−ｅｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉ ｎ）　ｅ　ｒ　ｂ　Ｂ−３遺伝子は、Ｃ０８−１細胞中へのトランスフェクショ ンにより達成される。

ｅｒｂＢ−３遺伝子の安定な発現は哺乳動物の発現ベクター例えばｐＺ　Ｉ　Ｐ ＮＥＯ３ＶＸベクター〔セブコ（Ｃｅｌｌｋｏ、　Ｃ，Ｌ、　）、ロバーツ（Ｒ ｏｂｅｒｔｓ、　Ｂ、　Ｅ、）およびムリガン（！Ｊｕｌｌｉｇａｎ、Ｒ，Ｃ， ）１９８４．　ｒセル（Ｃｅｌｌ）Ｊ　３７：　１０５３−６２　〕ででも得る ことができる。例えば真核生物の発現ベクターはｃＤＮＡクローンＥ３−１６に 由来する完全長ｅｒｂＢ−３コード化配列をクローン化することにより、合成オ リゴヌクレオチドを持つＤＮ、へ断片に適合するｐＺＩ　ＰＮＥＯ３ＶＸベクタ ーＤＮＡのＢａｍ８１部位中に工作された。ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、組換え発現ベ クターＤＮＡ　（ＬＴＲｅ　ｒ　ｂＢ−３）１　ｕｇでトランスフェクションさ れ、耐性標識抗生物質０４１８で選択された。

ｅｒｂＢ−３の発現を検知するため、ポリクローナルウサギ抗血清が、ｅｒｂ１ ３−３コ一ド化配列の予測されたカルボキシル末端内の合成ペプチド（アミノ酸 位ｉｔ　１１９１−１２０５）に対して引き起こされた。図８に示されているよ うにイムノプロット分析はｅｒｌ）Ｂ−３蛋白質の検知を導いた（図８Ａ）。ｅ ｒｂＢ−３蛋白質検知の特異性は、抗血清を同族ペプチドで予備培養することに より示された。さらに通常の１８０に、Ｄ　ｅｒｂＢ−３蛋白質は、組換えａｒ ｂＢ−３発現ベクターでトランスフェクションされた細胞中のポリクローナル抗 血清のみで特異的に検知されたが、ベクターでトランスフェクションされなかっ た対照ＮＩＨ３Ｔ３細胞では陰性であった。安定にトランスフェクションされた ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、ｅｒｂＢ−３特異配位子の潜在的候補のテスト・、生物学 的活性の分析ならびに天然のｅｒｂＢ−３蛋白質に対して引き起こされるモノク ローナル抗体の発生のためのｅｒｂＢ−３受容体蛋白質源として有用である。ｅ 　ｒ　ｂ　Ｂ−３特異液体は、ｅｒｂＢ−３受容体蛋白質の自己ホスホリル化の 検知、ＤＮＡ合成の刺激またはＬＴＲｅｒｂＢ−３トランスフエクンヨン処理Ｎ ＩＨ３Ｔ３細胞の形質転換された表現型の導入により同定される。

代わりに、ｅｒｂＢ−３受容体−族（ｆａｍｉｌｙ）例えば３２Ｄ細胞系・生存 および増殖のためのインターロイキン−３（ＩＩ−３）に通常依存するマウス造 血細胞系をベースとする系の受容体の機能性発現のために、他の形質転換された 細胞系が利用できる。最近の研究は、これらの細胞中のＥＧＦ−Ｒのための発現 ベクターの導入がＥＣＦマイトジェンシグナルでの効果的なカップ＋１ングを導 き、それにより３２Ｄ細胞の生存および成長の維持においてＥＧＦ−Ｒの配位子 に１１−３と置換することを許している。ＥＧＦ−Ｒについて記載されている公 知の方法〔例えばビールスら（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｊ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、）　１９８ ８年。

前記文献〕を採用することにより、本発明のＥ３−１６ｃ　Ｉ）　Ｎ　Ａが発現 して３２Ｄ細胞中に機能性受容体を産生１７、次いでそれはこねらｅｒｂＢ−３ 受容体の生物学的機能例えば第２．ノッセンノヤーへのそれらの配位子の結合能 力およびカップリング能力を試験するために有用となる。かくして本明細書記載 の発現方法と本発明のＤＮＡ５特に（４好ましいＥ３−１６ｅＤＮＡクローンを 用いることにより、当分野の通常の技術者は過度の実験をすることなくｅｒｂＢ −３調節プロセスのメカニズムを決定するために、本発明の範囲内に入る細胞系 を構築することができる。従って本発明はまた、１）配位子であるか疑わしい分 子−と機能性ｅ　ｒ　ｂ　Ｂ−３受容体を産生ずる細胞により産生されたｅｒｂ Ｂ−３受容体を接触させる段階、およびｉｉ）それらのｅｒｂＢ−３受容体によ り仲介された生物学的活性の量を測定する段階からなる、ｅｒｂＢ−３受容体に より仲介された活性に影響を及ぼす能力についてｅｒｂＢ−３受容体の配位子の 潜在性同族体をテストするためのバイオアッセイにも関する。

種々の標準組換え系、例えば上記のもの並びに当分野で公知の他のものは、当分 野で知られている受容体蛋白質単離法を用いる新規ｅｒｂＢ−３受容体蛋白質の 大量生産にも適当である。それ故、本発明は少なくとも図４に確定されたアミノ 酸配列部分を有する単離されたポリペプチドも含む。

本発明はさらに図４に確定されたアミノ酸配列を有するヒトｅｒｂＢ−３ポリペ プチドの非反復部分（ｕｎｉｑｕｅｐｏｒｔｉｏｎ）に特異な抗体またはその非 反復部分を含む。本発明のこの具体例において、その抗体は自然のままでモノク ローナルまたはポリクローナルであり、天然、組換えまたは合成化字源由来のｅ ｒｂＢ−３受容体関連ポリペプチドまたはペプチドを用いて発生させられる。そ れらの抗体は特異的に、そんなポリペプチドの配列を含むｅｒｂＢ−３蛋白質に 結合する。言い換えればこれらの抗体はｅｒｂＢ−３受容体蛋白質にのみ結合し 、ｅｒｂＢ　（ＥＧＦ−Ｒ）またはｅｒｂＢ−２蛋白質には結合しない。また本 発明の好ましい抗体は、蛋白質がその自然の（生物学的に活性な）配座（ｅｏｆ ｏｒｍａｔｉｏｎ）にあるときｅｒｂＢ−３蛋白質に結合する。本発明の抗体の 断片、例えば抗原結合活性を保持し当分野で良く知られた方法により製造され得 るＦａｂまたはＦ（ａｂ）’断片も本発明の範囲内に入る。さらに本発明は、本 発明の抗体またはその活性な断片の製薬組成物を含み、それは当分野で良（知ら れているポリペプチド投与用製薬組成物を製造するための物質および方法を用い て製造され得、そして過度の実験をすることなく本発明の抗体の投与に即応用さ れ得る。

これらの抗体およびその活性断片は、例えば新規ｅｒｂＢ−３受容体を特異的に 検知または精製するために用いることができる。そのような抗体は、高レベルの ｅｒｂ　Ｂ−３受容体を伴う組織に薬物を標的投与するために当分野で公知の種 々の方法において、例えばかかる抗体と殺細胞剤の結合体で適当な腫瘍を処置す ることにおいても使用することができる。従って、本発明はさらに、１）ｅｒｂ Ｂ−３受容体に特異的な抗体または該抗体の活性断片を治療剤に結合させる段階 ；およびＮ）得られた結合体を高レベルのｅｒｂＢ−３受容体を有する細胞を持 つ固体に効果的な量でおよび効果的な経路で投与してそれら細胞上のｅ　ｒ　ｂ 　Ｂ　−３受容体に抗体を結合可能にする段階からなる、高レベルのｅｒｂＢ　 ３受容体を有する細胞への治療剤の標的投与方法に関する。

本発明の抗体の例としてｅｒｂＢ−３蛋白質に特異的に結合する抗体を含有する ウサギ抗血清が挙げられる。

そのような受容体特異性抗血清は、配列中に６またはそれ以上のアミ７′酸を有 するｅｒｂＢ−３アミノ酸配列の非反復部分を表現している合成ペプチドに対し て生じ、上記配列はｅｒｂＢ−３ポリペプチドのこの部分に特異な抗体のための 結合部位を十分に提供する。さらに、ｅｒｂＢ−３アミノ酸配列のこの非反復部 分は、それぞれのｃＤＮＡ配列により予測されるように勿論ｅｒｂＢまたはｅｒ ｂＢ−２アミノ酸配列中に存在しない配列を包含する。本発明のｅｒｂＢ−３特 異抗ペプチド抗体の例として、ｅｒｂＢ−３ポリペプチドの予測された配列中の アミノ酸位置１１９１−１２０５を表現している配列（シングルレターアミノ酸 コードで）ＥＤＥＤＥＥＹＥＵＭＮＲＲＲ，Ｒを有する合成ペプチドに対して生 じたポリクローナルウサギ血清中の抗ペプチド抗体が挙げられる。この抗血清を 伴うｅｒ　ｂＢ−３ポリペプチドの特異的検知はヒトｅｒｂＢ−３ｃＤＮＡを持 つ発現ベクターで形質転換された哺乳動物細胞中に示される（図８Ａおよび図８ Ｂ参照）。

ペプチドに対する抗体は、標準ペプチド免疫化法に従いペプチドを化学的に合成 し、それらを担体蛋白質に結合させ、そしてそのペプチドを完全フロインドアジ ュバントと一緒にウサギに注射することにより製造される。

例えばペプチドは、標準法〔メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆ　１ｅｌｄ、Ｒ，Ｂ 、）　１９６３．　ｒジャーナル　オブ　アメリカン　ソサイエティ（Ｊ、Ａｍ ｅｒ、Ｓｏｅ、）　Ｊ　８５　：　２１４９）により固相シンセサイザー上で合 成される。租ペプチドはＨＰＬＣにより精製され、担体、キーホールリムペット ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）または 牛の千ログロブリンに例えば良く知られた方法〔例えばラーナーら（Ｌｅｒｎ− ｅｒ、Ｒ，Ａ、　ｅｔ　ａｌ、）　１９８１年、　「プロシーディングズ　オブ ザ　ナショナル　アカデミ−オブ　サイエンシズ　才ブ　Ｕ　Ｓ　Ａ　（Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　）Ｊ　７８　：　３４０３）に よりマレイミド連鎖を通じてアミノ末端システィンを担体にカップリングさせる ことにより結合される。一つの標準ペプチド免疫学的方法において、ウサギは同 体積の完全フロインドアジュバント中のｅｒｂＢ−３ペプチド−担体結合体１０ ０μｇで免疫され、次いで１０〜１４日間隔で完全フロインドアジュバント中の 結合ペプチド１００μｇで追加免疫される。１０〜１４日間隔の同量投与での付 加的な追加免疫は、例えば日常的ＥＬ　Ｉ　ＳＡ分析による測定で抗ペプチド抗 体力価がプラトー（ｐｌａｔｅａｕ）に到達するまで続けられる。

かくして本明細書に記載された一般的に公知の免疫学的方法を含めた本開示の教 唆に従い、当分野の通常の技術者はｅｒｂＢ−３特異抗体を得ることができ、そ してそれを多様な免疫学的分析に、例えば正常組織もしくは腫瘍組織における以 上に高いか低い兆候の診断的検知のために使用することができる。従って本発明 はまた生物学的サンプル中のｅｒｂＢ−３抗原を検知するための、ｉ）上記サン プルと、ｅｒｂＢ−３ポリペプチドに特異的な本発明の抗体とを、上記抗体と上 記抗原の特異コンプレックスが形成されるような条件下で接触させる段階；およ びｉｉ）それらコンプレックスの形態中に存在する上記抗体の量を測定する段階 からなるバイオアッセイにも関する。

本発明は、以下の特別の具体例と実施例の詳細な説明およびそれに含まれる図面 を参照することにより、もっと容易に理解されるであろう。

図面の簡単な説明 図ＩＡおよびＩＢは、正常ヒト胸腺（列ｌ）、ヒト乳ガン株ＭＤＡ−ＭＢ４６８ 　（列２）および５Ｋ−ＢＲ，−３（列３）からのＤＮＡ中のｙ−ｅｒｂ　Ｂ− 関連ＤＮＡフラグメントの検出を示す。ハイブリッド形成は低められた厳密性条 件（図２Ａ）または中程度の厳密性条件（図２Ｂ）で行われた。矢印はＥＧＦ− Ｒ遺伝子（ｅｒｂ　Ｂ）およびｅｒｂ　Ｂ−２のものとは異なる新規な９キロ塩 基対（ｋｂｐ）ｅｒｂ　Ｂ−関連制限フラグメントを指示している。

図２はｅｒｂ　Ｂ−３のゲノムおよびｃＤＮＡクローニングを示す。λＥ３−１ のゲノム９ｋｂｐの３ａｃ　ｌ挿入物内でのｖ−ｅγｂＢ相同の領域をプラスミ ドｐＵＣ（ｐＥ３−１）中にサブクローン化し、そしてヌクレオチド配列分析に 供した。３種の予測エキソンが黒ヌリボックスで表現されている。ｅｒｂＢ−３ ｃＤＮ八クローンは正常ヒト胎盤（斜線を付した棒）および胸部腫瘍細胞株ＭＣ Ｆ−７（白ヌキ捧）からのｍ　ＲＮ　ＡのオリゴｄＴ−供与ライブラリイから単 離された。全ヌクレオチド配列は正常ヒト胎盤からのｅｒｂ　Ｂ−３相補的ＤＮ Ａ上の両方の鎖、およびｐＥ３−１６上の５　’　ｘｈｏ　［部位の上流に対し て決定された。コード化配列は黒ヌリ棒で示され、そして３種の特徴づけられた ゲノムエキソンのスプライス結合部は垂直な白色線により示されている。ｃＤＮ Ａ地図中の黒ヌリ線は非翻訳配列を表す。制限部位・ｋ＝Ａｃｃ　ｌ　、　Ａｖ ＝Ａｖａ　［、Ｂ＝Ｂａｍ　Ｈｌ、　Ｂ　ｇ＝ｈＩｌｌ　、　Ｅ＝Ｅｃｏ　Ｒ［ 、Ｈ＝＃１Ｗｄｌｌｌ　、Ｋ＝Ｋｐｎ　ｌ　、Ｍ−ｋＬｓｔ　Ｉｔ、Ｐ＝Ｐｓｔ 　Ｉ　、５＝Ｓａｃ　Ｉ　、Ｓｍ＝ＳｍａＩ　、Ｓ　ｐ　＝Ｓｐｅ　ｌ　。

図３は、５ｃｏ　Ｒ１部位からＰｓｔ　１部位への１．５ｋｂｐ領域にある、ヒ トゲノムＤＮＡクローンＥ　３−１から誘導されたヒトｅγｂ　Ｂ−３遺伝Ｔに おけるシーｅγｂ８相同の領域のヌクレオチド配列を示す。この領域はスプライ ス結合コンセンガス配列（下線）に隣接した３つの読み伜を含む。３つのエキソ ンの予測アミノ酸配列は相当するＩ）　Ｎ　Ａ配列の上に３文字コードで示され ている。

図４はｅｒｂ　Ｂ−３ポリペプチドをコード化するｃ　ＤＮＡのヌクレオチド配 列および該ポリペプチドの予測アミノ酸配列を示す。

図５はｅｒｂＢ−３ポリペプチドとその他の受容体様チロシンギナーゼとの予測 アミノ酸配列の比較を示す。アミノ酸配列は１文字コードで示され、そして左側 に番号が付されている。推定トの細胞外ドメイン（細い斜線）はアミノ末端の予 測ンゲナル配列（太い斜線）とポリペプチド内の携−疎水性）・ランスメンプラ ン領域（太い斜線）との間に伸びている。細胞外ドメイン中の２つのシスチーイ ンクラスター（Ｃｙｓ）およびポリペプチドの細胞質部分内の予測チロランキナ ーゼドメイン（ＴＫ）は濃い斜線により囲まれている。ＴＫドメインのアミノ末 端の推定上のＡＴＰ結合部位は丸で囲まれている。カルボキシル末端ドメイン（ ＣＯＯＨ）内の可能性のある自己リン酸化部位は星印により示されている。可能 性のあるＮ結合グリコジル化部位（ｅ−−−）はアミノ酸配列の上に表記　され ている。個々のドメインにおけるｅｒｂ　Ｂ−３のｅｒｂ　Ｂ−２、ＥＧＦ−Ｒ ，ｍｅｔ　、　ｅｐｈ　、インツユリン受容体（ＩＲ）およびｆｍｓとのアミノ 酸相同の百分率は下に列挙されている。１６％より低い同一性は（−）で表記さ れている。

図６はｅｒｂ　Ｂ−３のゲノム遺伝子座の帰属がヒト染色体遺伝子座１２ｑ１３ に対して行われたことを示す。全体で１４２粒が４００バンドのイデオグラムに 局在していた。ダイアグラムに示されるように、染色体１２の特定の標識が観察 され、この場合、５１粒のうち３８粒がノくンドｑ１３に局在していた。

図７Ａおよび７Ｂはヒト乳ガン細胞株中の高めらちたｅｒｂ　Ｂ−３転写レベル を示すつＡＢ５８９乳房上皮細胞（列１）、ならびに乳ガン細胞株ＭＤＡ　ＭＢ 　４１５　（列２）およびＭＤＡ−ＭＢ　４５３　（列３）からの全細胞ＲＮＡ を１０μｇ含むノーザンブロソトをｅｒｂ　Ｂ−３ｃ　ＤＮＡプローブとハイブ リッド形成させた（図下Ａ）。シグナル減衰に続いて、同一プロットをヒトβ− アクチンｃ　ＤＮＡプローブと再び／％イブリッド形成させた（　Ｇｕｎｎｉｎ ｇ、　Ｐ、、　Ｐｏｎｔｅ、　Ｐ、、　Ｏｋａｙａｍａ、　Ｈ，、Ｅｎｇｅｌ、 　ｊ、、　Ｂｌａｕ。

Ｈ，＆　Ｋｅｄｅｓ、　Ｌ、、　１９８３．　ｋ４ｏＬ、　ＣｅｔＬ　ＥｉｏＬ 、　３ニア８７−７９５）。

図８ＡおよびＢＢはｅｒｂ　５−３−特異的抗ペプチド抗血清により検出される ようなｃ　ＤＮＡセグメントにより形質転換された細胞中のヒトｅＴｂＢ−３ポ リペプチドの発現を示す。細胞溶菌液（各試材１（１０μｇ）を五気泳動し、そ １１．てウェスタンブロッティングによる分析のためにニトロセルロース膜に転 写した。図８Ａは抗血清でのｅγｂＢ−３ポリベブヂドの検出を示す。図８Ｂは 相同ペプチドでの抗血清の予備培養を示す。抗体ブロッキングは結合特異性を示 す。列１・Ｌ　Ｔ　Ｒｅｒｂ　Ｂ−３発現ベクター１μｇで形質転換させたＮＩ Ｈ３Ｔ３細胞の選択培養液。列２　対照ＮＩＨ３Ｔ３細胞。

特定の実施態様の説明 膜スパン′ｆ口、ノンキナーゼのｅｒｂ　Ｂ　ＥＧＦ受容体ファミリーの第三の メンバーの同定およびその全長コード化配列のクローニレデが本実施例に記載さ れている。ＥＧＦ受容体のものに類似している明らかな構造ドメインの存在はリ ガ、・ドに対する細胞外結合部位の実在を示唆する。

ｅｒｂ　Ｂ−３受容体とＥＧＦ受容体との細胞外トメ−ｒンの構造的関連性はＥ 　（Ｅ　Ｆ様すガンドの増加するメンバーの１種またはそれ以−１，（Ｓｈｏｙ ａｂ、　Ｍ、、　Ｐｌｏｗｍａｎ、　Ｇ、　Ｄ、、　ＭｃＤ。

ｎａｌｄ、　Ｖ、　Ｌ、、Ｂｒａｄｌｅｙ、　Ｊ、　Ｇ、　＆　Ｔｏｄａｒｏ、 　Ｇ、　Ｊ、、１９８９゜５ｃｉｅｎｃｅ　２４３：１０７４−１０７６）がｅ ｒｂ　Ｂ−３生成物と相互作用することを示す。従って、ｅｒｂ　Ｂ−３遺伝子 は、ＥＧＦ−Ｒおよびｅｒｂ　Ｂ−２遺伝子に対して知られているように、正常 および新生物プロセスの両方において重要な役割を演じていることが期待される 。

ＥＧＦ受容体およびｅｒｂ　Ｂ−２との広範囲の線上対応性の相同にもかかわら ず、予測されたｅｒｂ　Ｂ−２内の明白な領域、コード化配列は比較的高い程度 の相違を示した。

例えば、そのカルボキシル末端ドメインはｅｒｂ　Ｂ−２またはＥＧＦ−Ｒとの 顕著な線上対応性の同一スコアを示さなかった。カルボキシル末端での相違はま た、それぞれ１４８キロダルトン（ｋｄ）　、１３８ｋｄおよび１３１ｋｄの見 積分子量を有するｅｒｂ　Ｂ−３、ｅｒｂ　Ｂ−２およびＥＧＦ−Ｒの３種のペ プチド間の大きさのわずかな違いの原因を示している。予測ｅγｂ　Ｂ−３タン パク質の最も保存された領域を表現するチロランキナーゼドメイン内で、ＡＴＰ 結合部位に比ベカルボキシル末端により近接している２９個のアミノ酸の短いス トレッチは、それぞれ２８および２５位にある予測されたｅｒｂ　Ｂ−２および ＥＧＦ−Ｒコード化配列の領域と異なっていた。それらの細胞質ドメインにおけ るより高度に相違するそのような領域はこれらの密接に関連する受容体様分子に 対して異なる機能的特異性を付与するように思われる。従って、ｅｒｂ　Ｂ−３ 遺伝子の発現における突然変異またはその他の変更はｅγｂＢおよびｅｒｂ　Ｂ −２遺伝子における欠損と関連するものとは異なるガンまたは遺伝子疾患を起こ すかもしれない。

染色体地図作成によりｅｒｂ　Ｂ−３はヒト染色体１２のｑｌｍ−１３遺伝子座 に位置決めされた。一方、関連ＥＧＦ−Ｒおよびｅｒｂ　Ｂ−２遺伝子はそれぞ れ染色体部位７ｐ１２−１３および１７ｐ１２−２１．３に位置決めされている 。従って、各遺伝子は異なるホメオボックスおよび異なるコラーゲン鎖遺伝子座 を含む領域に位置していることが明らかである。ケラヂンＩ型および■型遺伝子 はまた、それぞれ１２および１７の領域に位置し、それぞれＣγｊ＋Ｂ−３およ びｅｒｂ　Ｂ−２の異なる局在と一致している。従って、本発明のＤ　Ｎ　Ａセ グメントは、１２ｑｌｌ−１３遺伝子座近傍の染色体異常と関連するあらゆる遺 伝子性疾患の遺伝子地図作成の一助をなす新規プローブを提供する。

正常な細胞増殖のオートクラインならびにバラクラインエフェクターに対する証 拠がある。前者は、細胞増殖を刺激する同一細胞により産生される因子であり、 一方、後者の因子はその因子により影響を受けるものとは違う細胞により分泌さ れる。しかしながら、オートクライン成長因子の固在の形質転換効力は、成長因 子がパラクライン経路により標的細胞集合体に最も一般的に作用することを示唆 する。ｅｒｂ　Ｂ−３遺伝子発現のこの概観は、上皮および神経外胚葉誘導の細 胞におけるその正常発現を示す。上皮組織の異なる細胞型における３種のＣγｂ Ｂ受容体様遺伝子の比較分析は、ケラチノサイトが３種全ての遺伝子を表現する ことを示した。これに対し、メラノサイトおよびストロマ繊維芽細胞はそれぞれ ＥＧＩ−Ｒおよびｅｒｂ　Ｂ−３転写物を特異的に欠如していた。従って、メラ ノサイトおよびストロマ繊維芽細胞はそれぞれ、上皮組織において近傍に存在す るその他の細胞型により発現されるＥＧＩ−Ｒおよびｅｒｂ　Ｂ−３生成物に対 するパラクライン成長因子の源であり得る。

Ｃγｌ＋８およびｅｒｂ　Ｂ−２の両方が時々ヒト悪性疾患に関連することがわ かっているので、ｅｒｂ　Ｂ−３転写物がヒト乳ガン細胞株の重要な両分中に過 剰発現されているという今回の発見（実施例５）は、ＥＧＦ−Ｒ受容体ファミリ ーのこの新しいメンバーがいくつかのヒト悪性疾患において重要な役割を演じて いることを示す。

新規ｅｒｂ　Ｂ関連遺伝子を検出するために、ヒトゲノムＤＮＡを種々の制限エ ンドヌクレアーゼで切断し、そしてプローブとしてｖ−ｅγｂＢでのサザンプロ ット分析に供した。正常乳房上皮細胞Ａ８５８９　（Ｗａｌｅｎ、　Ｋ、　Ｈ， ＆　Ｓｔａｍｐｆｅｒ、　Ｍ、　Ｒ，、１９８９，Ｃａｎｃｅｒ、　Ｇｅｎｅｔ 、　Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ、　３７：２４９−２６１　）および不死化ケラチノサ イトＲＨＥ　Ｋ　（Ｒｈｉｍ。

、１．　Ｓ、、　Ｊａｙ、　Ｇ、、　Ａｒｎ５ｔｅｉｎ、　Ｐ、、　Ｐｒ１ｃｅ 、　Ｆ、　Ｍ、、　５ａｎｆｏｒｄ、　Ｋ、　Ｋ、　＆　Ａａｒｏｎｓｏｎ、　 Ｓ、　Ａ、、　１９８５．５ｃｉｅｎｃｅ　２２７：１２５０−５２）は以前記 載されている。正常ヒト上皮メラノサイト（ＮＨＥＭ）およびケラチノサイト（ ＮＨＥＫ）はＣ１ｏｎｅｔｉｃｓから入手された。ヒト胚繊維芽細胞（Ｒｕｂｉ ｎ、Ｊ。

Ｓ、、　０ｓａｄａ、　Ｈ，、Ｐｉｎｃｈ、　Ｐ、　Ｗ、、　Ｔａｙｌｏｒ、　 Ｗ、　Ｇ、、　Ｒｕｄｉｋ。

ｆｆ、　Ｓ、、　＆　Ａａｒｏｎｓｏｎ、　Ｓ、　Ａ、、　１９８９．　Ｐｒｏ ｃ、　Ｈａｔ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６：８０２−８０６）および乳ガン細胞株５Ｋ−ＢＲ−３ 、ＭＤＡ−ＭＢ　４６８．ＭＤＡ−ＭＢ　４５３およびＭＤＡ−ＭＢ　４１５　 （Ｋｒａｕｓ、　Ｍ、　Ｈ，、Ｐｏｐｅｓｃｕ、　Ｎ、　Ｃ，、Ａｍｓｂａｕｇ ｈ、Ｓ、Ｃ，＆　Ｋｉｎｇ、Ｃ，Ｒ，、１９８７ＥＭＢＯ，Ｊ、６：６０５−６ １０）の供給源は記載されている。核酸ＲＮＡハイブソド形成のために、ＤＮＡ およびＲＮＡを以前記載されｔ；ようにニトロセルロース膜に転写した（Ｋｒａ ｕｓ等、同上）。

高い厳密性ハイブリッド形成は５０％ホルムアミドおよび５ｘｓｓｃ中４２℃で 操作された。フィルターを０、ｌＸ５ＳＣ中５０°Ｃで洗浄した。ＤＮＡの低め られた厳密性ハイブリッド形成は３０％ホルムアミド中で行われ、次に０．６Ｘ ＳＳＣ中での洗浄され、一方、中程度の厳密性は４０％ホルムアミド中でのハイ ブリッド形成および０．２５ＸＳＳＣ中での洗浄により行われた。

図１に示された特定の結果に対して、ＤＮＡはＳａｃ　Ｉで制限され、そしてト リ赤芽球症ブ９ウィルスＤ　Ｎ　Ａ　（Ｖｅｎｎｓｔｒｏｍ、Ｂ、、Ｆｒａｎｓ ｈｉｅｒ、Ｌ、、Ｍｏ５ｃｏｖｉｃｉ、Ｃ，＆　Ｂ１５ｈｏｐ。

Ｊ、　Ｍ、、　１９８０．　Ｊ、　ｌ／ｉγｏ１．３６：５７５−５８５）にお ける上流のＢａｍＨ［部位から［（ｃｏＲ１部位に及ぶｅｒｂＢ遺伝子のガン遺 伝子ウィルス体、ｖ−ｅＴｂＢに特異的なプローブとハイブリッド形成させた。

低められた厳密性ハイブリッド形成において、４つの５ａｃ　［制限フラグメン トが検出された。２つは、ＥＧＦ−Ｒ遺伝子増幅を含むことが知られている乳ガ ン細胞株ＭＤＡ−ＭＢ　４６８　（図ＩＡ、列１，２）中での増幅によるＥＧＦ −Ｒ遺伝子フラグメ：ノトと同定され、そして１つは、増殖されたｅｒｂ　Ｂ− ２を有することが知られている別の乳ガン細胞株５Ｋ−ＢＲ−３中の高められた シグナル強度に起因するｅｒｂ　Ｂ−２特異的遺伝子フラグメントと同定された （図ＩＡ１列１．３）。しかしながら、単一９ｋｂｐＳａＣｌフラグメントは正 常ヒト胸腺、５Ｋ−ＢＲ−３および高レベルのＥＧＦ−Ｒを有する株Ａ４３１か らのＤＮＡ中に等しいシグナル強度を示した（図１人）。ハイブリッド形成の厳 密性を７℃ずつ上げたとき、このフラグメントはハイブリッド形成しなかったが 、ＥＧＦ−Ｒおよびｅｒｂ　Ｂ−２特異的制限フラグメントはプローブとしての ｖ−ｅｒｂ　Ｂで依然として検出された（図ＩＢ）。

これらを考え併せると、上記の発見は、９ｋｂｐＳａＣ［フラグメント内の新規 ｖ−ｅγｂＢ関連ＤＮＡ配列の特異的検出を示唆した。

その他の特徴づけのために、正常ヒトゲノムライブラリィを８ないし１２ｋｂｌ ）フラグメントに対して富化したＳａｃ　ｌ切断胸腺ＤＮＡから調製した。便宜 上、バクテリオファージλ５ｅｐ６−１ａｃ５がり、　Ｐｒｅｓｔｉｄｇｅおよ びり、　Ｈｏｇｎｅｓｓ　（スタッフォード大学）から入手された。

ファージλまたはその他のゲノムから誘導される別の多くのクローニングベクタ ーが当業界で十分公知である標準組換えＤＮＡ法に従ってこのＤＮＡフラグメン トのクローニングのために使用され得る。精製ファージＤＮＡをＣＱＳ末端連結 、Ｓａｃ　［での制限、および１０−４０％ショ糖連続グラジェント中での分画 に供した。ゲノムラーイブラリイが８ないし、１２ｋｂｐの分子量範囲にある正 常ヒト胸腺ＤＮＡのＳａｃ　Ｉ制限フラグメント（ショ糖グラジェント沈殿によ り単離）と精製ファージアームとの連結によりｖ４製された。低められた厳密性 条件下でｖ−ｅＴｂＢにより検出された１０の組換えクローンは、高い厳密性で ヒトＥＧＦ−Ｒまたはｅｒｂ　Ｂ−２ｃ　ＤＮＡプローブとハイブリッド形成し なかった。９ｋｂｐ挿入物を有する代表的クローンの制限地図に示されるように 、ｖ−ｅγｂＢ相同の領域は、Ｅｃｏ　Ｒ１部位から下流のＰｓｔ　１部位に及 ぶ１．５ｋｂｐセグメントへのハイブリッド形成分析により位置決めされた。

ｅｒｂ　Ｂに関連した新規ヒトゲノムＤＮＡフラグメントのクローンの一部のヌ クレオチド配列はノブオキシ鎖終結法（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、、　Ｎ１ｃｋｌｅ ｎ、　Ｓ、　＆Ｃｏｕｌｓｏｎ、　Ａ、　Ｒ，、１９７７、Ｐｒｏｃ、　Ｈａｔ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４：５４６３−６７）により鋳型として スーパーコイルプラスミドＤＮＡを用いて両方のＤＮＡＩに対して決定された。

ヌクレオチド配列はイシテリノエネティクス（ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ ）ソフトウェアを用いて組み立てられ、そして翻訳された。アミノ酸配列比較は ＮＣＩアドバンスト・サイエンティフィツク・コンピユーテイング・ラボラトリ −のコンピュ−タで実行されるピアソンおよびリップマノによる並列プログラム （Ｐｅａｒｓｏｎ、　Ｗ、　Ｒ，＆　Ｌｉｐｍａｎ、　Ｄ、　Ｊ、、　１９８８ ．同上）を用いて行われた。予測タンパク質における疎水性および親水性領域は カイトおよびトウーリトルに従って同定された（Ｋｙｔｅ、　Ｊ、　＆　Ｄｏｏ ｌｉｔｔｌｅ、　Ｒ９Ｆ、、　１９８２．　Ｊ、　ＭｏＬ、　Ｂｉｏｎ、　１５ ７：１０５−１３２）。ヌクレオチド配列分析により、Ｅｃｏ　Ｒ１からＰｓｔ 　Ｉの１，５ｋｂｐセグメントにおけるｖ−ｅｒｂＢ相同の領域がスプライス結 合コンセンサス配列に隣接した３つの読み枠を含むことが示された（図２）。こ れら３つの読み枠の予測アミノ酸配列のその他の公知タンパク質とのコンピュー タによる比較はｙ−ｅＴｂＢのチロシンキナーゼドメイン、ならびにヒトＥＧＦ −Ｒおよびｅｒｂ　Ｂ−２タンパク質において連続している３つの領域に６４％ ないし６７％の最高の同一スコアを示した。さらに、新規遺伝子中の３つの特徴 づけられたエキソンの全てのスプライス結合部はｅｒｂ　Ｂ−２で保存されてい た。その他の公知チロシンキナーゼとのアミノ酸配列相同は３９％ないし４６％ の範囲で非常に低かった。

単一６．２ｋｂ特異的ｍＲＮＡは１５０　ｂ　ｐＳｐｅ　Ｉ−ＡｃｃＩエキソン 含有フラグメントをプローブとして用いるヒト上皮細胞のノーザンプロット分析 により同定された（図２）。使用された厳密性パイブリッド形成条件下で、この プローブは５ｋｂのｅｒｂ　Ｂ−２ｍ　ＲＮ　Ａも、６ｋｂおよび１０ｋｂのＥ ＧＦ−ＲｍＲＮＡも検出しなかった。

これらの発見の全ては、本研究が、ｅｒｂ　Ｂ−３と仮に表記されている、ｅγ ｂＢプロトガン遺伝子ファミリーの新しい機能的メンバーを同定したことを示唆 した。

ｒ例３　ヒト　ｅｒｂＢ−３遺伝　のｍＲＮＡについてのｃＤＮＡｓのクローニ ングおよび　徴イ・けｅｒｂＢ−３コ一ド化配列の全体を特徴付けようと努力し て、重複ｃＤＮＡクローンを、遺伝子−特異的ゲノムニキソンまたはｃＤＮＡ断 片をプローブとして利用して、知られたｅｒｂＢ−３表現を持つ源からのオリゴ ｄＴ−プライマー化ｃＤＮＡライブラリーから単離した。簡単に、７．ｇｔｌｌ 中のオリゴｄＴ−プライマー化ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーをクローニング技 術（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ）により得た。ＭＣＦづｃＤＮＡを、リンカー−プライマ ーおよびＭｏ−ＭｕＬＶ逆転写酵素を含むオリゴｄＴを使用した５ｕｇポリＡ’ ＲＮＡからの第−鎖合成、続いてＤＮＡポリメラーゼエ、ＲＮａｓｅＨを用いた 第二鎖合成そして７４　ＤＮＡポリメラーゼ処理により製造した。二重鎖ｃＤＮ Ａを特定のリンカ−受容体ヌクレオチドを使用してλｐｃＥＶ９の５ｆｉＩサイ トへ一方向的にクローンした（［ｋｉ、Ｔ、、Ｍａｔｓｕｉ、　Ｔ、、　Ｈｅ１ ｄａｒａｎ、　１４゜Ａ、　＆　、Ａａｒｏｎｓｏｎ、　Ｓ、　、１．、１９８ ９．　Ｇｅｎｅ　８３：１３７−＋４６：　誉　ｐ召１９８９年７月２８日に出 願されたＭｉｋｉ等の米国特許出願Ｎｏ、（１７７３８６，（１５３）　、プラ ク精製に続いて、ファージＤＮＡインサートを別の特徴付はのためにｐＵＣ−ベ ースのプラスミドベクターの中（こサフ゛クローン′した。クローンは最初に制 限分析およびｍＲＮＡへのハイブリッド形成により特徴付け、そして続いてヌク レイチド配列分析を受けさせた。１．３ｋｐｂない１，４．３ｋｐｂの範囲の分 子量を有するイ〉′サートを持つｐＥ３−６、　ｐＥ３−８、　ｐＥ３−９およ びｐＥ３−１１　と名付けられたクローンをヒト胎盤ライブラリーより単離する 一方、５　ｋｐｂインサートを含むｐＥ３−１６クローンを、プローブとしてｐ Ｅ３−１１の最上流コード化配列により　ＭＣＦ−７ｃＤＮＡライブラリーをス クリーニングすることにより得た。クローンｐＥ３−８、ｐＥ３−９、ｐＥ３− １１およびｐＥ３−１６は、ポリＡ範囲（図２）において終結する同一の３゛末 端を含んでいた。

ｅｒｂＢ〜３の完全なコード化配列は、位置４６から位置４１２６での枠内（ｉ ｌ−１１−４ｒａ末端コドンまで延びる４０８０ヌクレオチドの長い単−読み取 り枠の中に含まれていた。位置１０ｏでの最上流ＡＴＧコドンは、ヌクレオチド 位置４３にて枠内停止コドンがそれより先んじておりかつ真正の開始コドンのた めのＫｏｚａｋ基準を満足するので、開始コドンらしいものであった。読み取り 枠は１４８ｋｄポリペプチドを予ｉ１１．ｌ＋する１３４２コドンを含むもので あった。末端コドンより下流では、多数の多数の停止コドンが全ての枠内に存在 した。図５に示すように、　ｅｒｂＢ−３ポリペプチドのｉ＊Ｉ！されたアミノ 酸配列は、　ＥＧＦ−ＲおよびｅｒｂＢ−２に関して最も近いトランスメン・プ ランレセプターチロシンキナーゼを予１１１１するものであった。　ｅｒｂＢ− ３の疎水はシグナル配列は、１９個のアミン末端アミノ酸残基よりなると予ｔす された。位置１９のクリシンと位置２０のでリンとの間のこのシグナル配列の開 裂は、１４５ｋｄの見積もり分子量を有する１３２３個のアミノ酸のプロセスポ リペプチドを生じさせる。

２１個のアミノ酸を包含する単−疎水性メンプランスパニング領域は、６７８＠ のアミノ酸よりなる細胞質領域から６２４個の細胞外領域を分離するコード化配 列の中で同定された（図５）。

推測上のｅｒｂＢ−３配位子−結合領域は、予測されたｅｒｂＢ−２およびＥＧ Ｆ−Ｒタンパク質とそれぞれ、アミノ酸配列が４３％および４５％同一であった 。細胞外領域の中で、プロセスｅｒｂＢ−３ポリペプチドの５０個全てのシステ ィン残基は、保存されそしてＥＧＦ−ＲおよびｅｒｂＢ−２ど比較した場合に同 様に間隔を保っていた。４７個のシスティン残基；まそねぞれ２２個および２５ 個のシスティンを含む二つのクラスターに編成されていた、構造につき折り紙付 きのこのチロシンキナーゼレセプター亜科（参昭、例えばＹａｍａｍｏｔｎ、　 Ｔ、、　Ｉｋａｗａ、　Ｓ、、　Ａｋｉｙａｍａ、　Ｔ。

、　Ｓｅｍｂａ、　Ｋ、、　Ｎｏｍｕｒａ、　Ｎ、、　Ｍｉｙａｊｉｍａ、　Ｎ 、、　５ａｉｔｏ、　Ｔ、　＆Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ、　Ｋ、、　１９８Ｇ、　Ｎ ａｔｕｒｅ　３１９　：２３０−２３４　）　、　１０個の潜在的Ｎ−結合グリ コシル化サイトはｅｒｂＢ−３細胞々（領域内に位置してじな。ＥＧＦ−ＲＪ３ よびｅｒｂＢ−２タンパ７實との比較：こおいて、これらグリコジル化サイトの うもの５個およ乙く２個（±ぞれぞね、（呆存された。これらの中で、トランス メンブラシう置載１こ近いほうのサイトは３個全てのタンパク質の中で保存され た（、図５）。

細月包質領域の由で、（立置７０２から９７８までの２７７＠のアミ７）酸の＝ ７はＥＧＦ−Ｒおよこ（ｅｒｂＢ−２の千ロシ〕、キナーゼ領域と最も広範な相 同を示した。この域において、それぞれ６０％または６２％のアミン＠残基は同 一でありそして９ｏ％または８９％のものは保存された。この範囲のアミノ酸相 同はチロシンキナーゼの最小触媒領域と合致する（　Ｈａｎｋｓ、　Ｓ、　Ｋ、 、Ｑｕｉｒ＋ｎ、　Ａ、　Ｍ、＆Ｔ（ｕｎｔｅｒ、　Ｔ、、　１９８８．５ｃｉ ｅｎｃｅ　２４１＋　４２−５２）　ａイ也のチロシンキナーゼとは、重要さの より低い相同であった（図５）、ＡＴＰ−結合す１′トについて一致した配列Ｇ ｘＧｘｘＧ（Ｈａｎｋｓ、　Ｓ、　Ｋ　等、　１９８８．上述）。はアミノ酸位 置７１６ないし７２】にて同定された。この配列並びにカルボキシル末端に向か う２１個のアミノ酸残基の所在を定める残基は、３個のｅｒｂＢ−間遠レセプタ ー間に保存された。−まとめに考えると、これらの発見Ｂ′ｉアミノ酸位置７０ ２ないし９７８間の領域をｅｒｂＢ−３タンパク質の推測上の触媒領域として定 めるものであった（図５）。

ｅｒｂＢ−３のうち、ＥＧＦ−ＲまたはｅｒｂＢ−２のいずれかと比較して最も 分化した領域は、３６４個のアミノ酸よりなるカルボキシル末端であった。この 領域：ま、高い程度の親水性およびプロリンおよびチロシン残基の頻繁な発生を 示した。これらチロシン残基の中で、位置１１９７．１１９９および１２６２の ものは、推測上のホスホリル化サイトにつＱ、ｔで一致した配列と最も近似して 合うものであった。ペプチド配列ＹＥＹＭＮは、チロシン１１９７および１１９ ９を取り囲むが、位置１２６０なじし１２６４で繰り返されそして両方の所在で 荷電された残基により包囲されていた。但し、高い局在親水性の周囲である。こ の観察は、チしシン１１９７．１１９９および１２６２がｅｒｂＢ−３タンパク 質の自動ホスボリル化サイトの候補者らしいものと示す。

見上コ４　ヒｈ　ｅｒｂＢ−３伝　の染　体地ヌ上ユｅｒｂＢ−３遺伝子の染色 体位置をｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成ｉ１　（Ｐｏｐｅｓｃｕ、　Ｎ、　Ｃ ，、Ｋｉｎｇ、　Ｃ，Ｒ，＆Ｋｒａｕｓ、　ＭＩｔ、　、　１９８９．　Ｇｅｎ ｏｍｉｃｓ　４：３６２−３６６）により、アミノ末端ｅｒｂＢ−３コー１ζ化 配列を含む３Ｉ−１−標識プラスミドを引いて決定Ｉ２、た。１１０個のヒト染 色体スプレッド全てを各染色体の同定のためのＧベンドの前におよび続いてその 後に調べＴｍ。１４２個のＫｉ織全てを４００−バンド表意文字の上に局在した 。染色体１２の特異的な標識化が１察されるとともに、５１僅の組織のうちの３ ８個のものはバ〉ドｑ１３に７局在された（図６）。従って、ｅｒｂＢ−３のゲ ノム位置は１２　ｑ　１３であると指定された。染色体１２のこの域において、 黒色唖−関連の抗原！ＪＥ４９１、ヒストン遺伝子およびラクトアルブミシにつ シｘ−この遺伝子を含むい・ζつかの遺伝子：よ既に地図作りされている。

実施例５．正常および悪ｉ生ヒト細■（こお１するｅｒｂＢ−３Ｌ兄 表現のその形式を研究するために、多くのヒト組繊をｅｒｂＢ−３転写のために 査定した。６　、２　ｋｂ　ｅｒｂＢ−３特異ｍＲＮＡは、満期の胎盤、生後ま もない皮方、胃、肺、腎臓および脳において観察された一方、皮膚繊維芽細胞、 骨格筋またはリンパ球様細胞において検出できなかった。分析された胎児組織の 中で、ｅｒｂＢ−３転写は肝臓、腎臓および脳において表現されたが、胎児心臓 または胎芽肺繊維芽細胞においては表現されなかった。これらの観察は上皮組織 および脳におけるｅｒｂＢ−３の特恵的表現を示すものである。

またｅｒｈＢ−３表現は、表皮ケラチン細胞、腸上皮細胞、メラニン細胞および 繊維芽細胞を含んで、正常ヒト上皮組織より導かｉた個々の細胞集団において研 究された。比較のため；こＥＧＦ−ＲおよびｅｒｂＢ−２転写のレベルを分析し た。表１に示すように、ｅｒｂＢ−３ｍＲＮＡレベルは表皮ケラチン細胞におい て１目対的に高く、これら細胞におけるｅｒｂＢ−２およびＥＧＦ−Ｒのそれと 匹敵し得るものであった。各転写についてのより低いが、同様の表現レベルは、 腸上皮に由来する細胞において検出された。これらの発見は鱗状上皮および腸上 皮における３個全てのレセプター様分子の成長規目す的役割と一致するものであ った。ＥＧＦ−ＲおよびｅｒｂＢ−２転写ニオまだ王宮繊維芽細胞において容易 に観察された一方、同じ細胞は検出可能なｅｒｂＢ−３ｍＲＮＡを欠いていた。

対間的に、正常ヒトメラニン細胞は、ヒト表皮ケラチン細胞と匹敵するレベルで ｅｒｂＢ−３およびｅｒｂＢ〜２の両方を表現するが、検出可能なＥＧＦ−Ｒ転 写を欠いていた。従って、これらレセプター様分升の表現形式：よ表皮組織より 導かれた特別の細胞集団においで異なっていた。

表１　ヒｈ　ｅｒｂＢ遺伝子の族員の正常表瑛形式％式％ 原発性ケラチーン細胞（ＮＨＥＫ）　ｅｒｂＢ−３’−，＋腺上皮細ｑｌ　（Ａ Ｂ５８９　）　ｅｒｂＢ−３（＋　）メラミン細胞（ＮＨＥＭ）　ｅｒｂＢ−３ ＋　＋復製ノーザンプロットｆ’ｊ：ｅｒｂＢ−３、ｅｒｂＢ−２およびＥＧＦ −Ｈについて当量（ｃｐｍ）の、同等の特異活［生のプローブでそれぞれ、ハイ ブリッド形成された。相対的シグナル強度は次の通り評価した。・−検出不可能 、（＋）　弱い陽性、十　陽性、＋十　強い陽性。

悪性プロセスにおけるｅｒｂＢ−３の巻き込まれの鉦拠を探すために、ｅｒｂＢ −３ｍＲＮＡレベルを一連のヒ１−１１細胞ラインにおいて査定した。ｅｒｂＢ −３転写は３８個の癌のうち３６個においてまた１２＠の肉臘のうちの２個にお いて検出され、−万造血源の７個の膿瘍細胞ラインは測定可能なｅｒｂＢ−３ｍ ＲＮＡを欠いていた。正常サイズ転写の顕著に高められたレベルはヒト乳癌より 導かれた７個のＭ１瘍細胞ラインのうちの６個において観察された。サウザンプ ロット分析により、雑な遺伝子転位または増幅のいずれも該細目包ラインにおい て検出された。図７Ａは、対照Ａ３５８９　非悪性ヒト乳房上皮細胞（し〜ン１ ）および二つの代表的なヒト乳房腫瘍ライン、　ＭＤＡ−ＭＢ４１５　（レーン ２）と　ＩＪＤＡ−ＭＢ４５３　（レーン３）を用いたサウザンプロット分析の 結果を示す。ヒトβ−作用ブローブを用いた同じフィルタのハイブリッド形成（ 図７Ｂ）により、實際レベルのｍＲＮＡを各レーンにおいて確かめた。デンシト メータ走査は、各腫瘍細胞ラインにおけるｅｒｂＢ−３転写が対昭細胞ラインの それより１ｏ　ｏ　（＠以上に高められていることを示した。したがって、ｅｒ ｂＢ族のこの新しい族員の過表現は、ＥＧＦ−Ｒ遺伝子およびｅｒｂＢ−２遺伝 子の場合のように、ヒト悪性種において重大な役割を演背景技術の記載および本 発明の開示を完全なものにするために、これまでに本明細書において確認された 刊行物、特許および特許明細書の各々は、ここに本明細書の中に参考に組み入れ られる。

前述の発明は明快および理解の目的のためにいくらか詳細に記載されてきた。ま た、形式および詳細における種々の変更および組合せは本発明の範囲から逸脱す ることなく行なうことができることは、明らかである。

ｋｂｐ　ｋｂｐ −２３，０２３・〇　− ｗｅ　＠　−−９，４９，４− 一４．４　４゜４− −　２．０　２．０　− ＦＩＧ、２ 特表十〇−５０３４６７（１５） （て −へ 一 ＦＩＧ、６ ｊ２３　１２３ ｋＤ　ｋＤ ４　６８　６８　酬 国際調査報告 １゛１′＋゛″″Ａｓｅｍ、ｕ″″″″　に丁／ＵＳ９０１０７０２５Ｉ＋、、 醪−−ａ−ｓ−−＝’−ＰＣＴ／ＵＳ９０１０７０２５Ａｔ＋ａ＋１１１ＩＩｐ ｎ＋ｂ＋Ｐ１７Ｔ／ＴＳＡ／２１０（ＰＡＲＴＶＩ）高調ＡＴＴＯＮＳ■部開Ｉ ＴＹ　ＯＦ　Ｉ’ＮＶ順ＩＯＮ　ＩＳ　Ｉ請αＩＮＧフロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｐ　２１１０２　 Ｃ８２１４−４ＢＣ１２Ｑ　１／６８　Ａ　７８２３−４８ＧＯＩＮ　３３１５ ３　Ｄ　８３１０−２Ｊ３３１５７４　Ａ　９０１５−２Ｊ Ｉ

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．ｅｒｂＢ−３遺伝子またはその特異的部分をコードしているヌクレオチド配 列を持つＤＮＡセグメント。
2. ２．該遺伝子が哺乳動物のｅｒｂＢ−３遺伝子である請求項１記載のＤＮＡセグ メント。
3. ３．該哺乳動物のｅｒｂＢ−３遺伝子がヒトのｅｒｂＢ−３遺伝子である請求項 ２記載のＤＮＡセグメント。
4. ４．ゲノムのＤＮＡ断片である、ヌクレオチド配列またはその特異的部分を持つ ＤＮＡセグメントであって；ＳａｃＩ制限酸素による切断により生成し、約９ｋ ｂｐの大きさを持ち、そしてレジユーズド・ストリンジェンシ−（ｒｅｄｕｃｅ ｄ　ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）ハイブリッド形成の条件下でのみｖ−ｅｒｂＢ遺伝 子から誘導されたプローブを使用する核酸ハイブリッド形成により検出できるＤ ＮＡセグメント。
5. ５．該セグメントがヒトゲノムのＤＮＡクローンＥ３−１、その特異的部分であ り、そして該クローンが図２で定義した部分的制限酵素地図と図３で定義した部 分的制限配列を持っている請求項４記載のＤＮＡセグメント。
6. ６．該ヌクレオチド配列が、ｅｒｂＢ−３遺伝子のまたはその特異的部分のアミ ノ酸配列をコードしている請求項１記載のＤＮＡセグメント。
7. ７．該アミノ酸配列が図４で定義したそれである請求項６記載のＤＮＡセグメン ト。
8. ８．図４で定義したヌクレオチド配列を持つヒトｃＤＮＡクローンＥ３−１６を 含有する請求項７記載のＤＮＡセグメント。
9. ９．ヒトｅｒｂＢ−３の、またはその特異的部分のアミノ酸配列と少なくともア ミノ酸一個分が異なるアミノ酸配列をコードし、そして他の如何なるポリペプチ ドのアミノ酸配列よりも、ヒトｅｒｂＢ−３のアミノ酸配列に全体的相同性をよ り大に持つＤＮＡセグメント。
10. １０．ヒトｅｒｂＢ−３ポリペプチドの機能を実質的に持つアミノ酸配列をコー ドしている請求項９記載のＤＮＡセグメント。
11. １１．請求項９記載のＤＮＡセグメントによりコードされているアミノ酸配列を 持つ単擁したポリペプチド。
12. １２．請求項１記載のＤＮＡセグメントとベクターを含有する組換えＤＮＡ分子 。
13. １３．請求項１記載のＤＮＡセグメントで形質転換した細胞の培養物。
14. １４．図４で定義したアミノ酸配列、またはその特異的部分を持つ単離したポリ ペプチド。
15. １５．生物試料中のｅｒｂＢ−３ｍＲＮＡを検出するための生物学的検定法であ って； ｉ）請求項１記載のＤＮＡセグメントに生物試料を、該ＤＮＡセグメントと相補 的ＲＮＡを含有するＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド分子が形成され得るような条件 下で、接触させ；次いで ｉｉ）該ハイブリッド分子中に存在する該ＤＮＡセグメントの量を決定する段階 からなることを特徴とする検定法。
16. １６．ｅｒｂＢ−３受容体により媒介される活性に影響する能力を、該ｅｒｂＢ −３受容体のリガントとして可能性のある同族体について試験するための生物学 的検定法であって； ｉ）請求項１１記載の細胞により生産されるｅｒｂＢ−３受容体を、リガントで あると疑われている分子と接触させ；そして ｉｉ）該細胞中の該ｅｒｂＢ−３受容体により媒介された生物学的活性の量を測 定する段階からなることを特徴とする生物学的検定法。
17. １７．請求項１４記載のポリペプチドの特異的部分に特異的である抗体。
18. １８．生物学試料中のｅｒｂＢ−３抗原を検出するための生物学的検定法であっ て； ｉ）請求項１７記載の抗体に該試料を、該抗体と該抗原の特異的複合体が形成で きるような条件下で、接触させ；そして ｉｉ）該複合体として存在する該抗体の量を決定する段階からなることを特徴と する検定法。
19. １９．治療用薬物の標的を、ｅｒｂＢ−３受容体を高レベルで持つ細胞にする方 法であって；ｉ）請求項１７記載の抗体を、またはその活性断片をを、該薬物に 接合させ；そして ｉｉ）得られた接合体を、ｅｒｂＢ−３受容体を高レベルで持つ細胞を持つ個体 に、有効量でかつ該抗体が該細胞上の該受容体上に結合できるような有効な方法 で、投与する段階なることを特徴とする方法。
20. ２０．治療用薬物の標的をｅｒｂＢ−３受容体を高レベルで持つ細胞にするため に、該治療用薬物に接合した請求項１７記載の抗体、またはその活性断片を使用 する方法。