CN105264382A - 基于检测her3活化辅助癌症的诊断、预后和治疗的系统和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了基于HER3激活的检测而促进癌症的诊断、预后和治疗的系统和方法。所述系统和方法包括分析样品中活化HER3标志物的存在或不存在，如通过HER2-HER3异二聚体、HER3磷酸化或PI3K募集至活化HER3(HER3/PI3K复合物)指示的。可单独地或与其它生物标志物结合地测量活化HER3标志物表达的量。

Description

基于检测HER3活化辅助癌症的诊断、预后和治疗的系统和方法

相关申请的交叉引用

本申请根据美国的35U.S.C.§119(e)要求2013年4月5日递交的美国临时申请61/809,083的权益和优先权，将其通过引用整体并入本文。

发明领域

本发明一般涉及基于检测HER3活化辅助癌症的诊断、预后和治疗的系统和方法。

发明背景

与细胞增殖、存活和迁移有关的酪氨酸激酶受体超家族的某些成员是人表皮生长因子受体或HER蛋白家族。这些HER蛋白包括HER1(也被称为EGFR和ErbB1)、HER2(ErbB2)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)。这些个体细胞表面受体各自的表达水平已被评估为癌症生物标志物。

已知HER受体存在配体诱导和非配体依赖性两种形式的二聚化和活化，包括在HER2扩增的细胞中形成HER2-HER3异二聚体。二聚化之后发生受体反式激活和磷酸化、各种胞质蛋白质募集至磷酸化的受体，从而触发包括磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt、PKC、MAPK和Ras信号传导途径的各种信号级联放大。

HER3是ErbB受体家族的独特成员。与HER1和HER2不同，它不能形成同型二聚体并缺乏胞内激酶活性。虽然它具有弱酪氨酸激酶活性，但是HER3通常被认为是无活性的“假激酶”。然而，HER3的C末端区域含有六个共有的磷酸酪氨酸位点(其结合PI3K的SH2结构域)，表明HER3在PI3K/Akt途径的活化中的关键作用。HER3也是一种机制，通过该机制，尽管其他ErbB激酶被显著抑制，HER信号传导活性仍然能够被活化。Sergina,N.V.,etal.,Nature445(7126):437-441(2007)。在任何其他HER蛋白中均没有注意到HER3的这种独特能力。最近的研究表明，HER3的表达和从细胞核向膜易位还导致了对靶向EGFR或HER2疗法的抗性。Sergina,N.V.,etal.,Nature445(7126):437-441(2007)；Hsieh,A.C.andMoasser,M.M.,Brit.J.Cancer97(4):453-457(2007)。

HER3的上调常见于各种恶性肿瘤，诸如乳腺癌、结肠直肠癌、头颈部鳞细胞癌(SCCHN)、葡萄膜黑色素瘤以及胃癌、卵巢癌、前列腺癌和膀胱癌。一般见Jiang,N.,Chemother.Res.Pract.2012:id817304。在人乳腺癌中，HER3的mRNA和蛋白质均上调。已报道相较于正常乳腺组织，HER3蛋白质在50-70％的人乳腺癌中过表达并且似乎与转移、肿瘤大小和局部复发的风险有关。HER3mRNA或蛋白质的增加常见于诸如结肠癌的肿瘤并与淋巴结转移和更短的疾病进展时间有关。在SCCHN中，HER3的高表达似乎与增加的转移和降低的总生存期有关。此外，HER3的表达与SCCHN中对HER1抑制剂吉非替尼的抗性相关。这表明HER3的表达在癌发生中发挥显著作用，并且会是抗癌疗法的合理目标。因为它的功能高度依赖于与其他成员的异二聚化，HER3不能通过过表达或突变活化来转化细胞。它的主要结合伴侣是HER2，并且它在HER2转化和加速人癌症的进展中起着重要作用。此外，HER3还已经被鉴定为药物敏感性的潜在标志物。一般见Mukherjee,A.,etal.,PLOSOne6(1):e16443(2011)。

尽管在开发靶向HER1和HER2的药物疗法中的进步，仍然有大量文献记载了抗性机制。一般见Jiang,N.,Chemother.Res.Pract.2012:id817304。具体地，补偿性HER3信号和持续的PI3K/Akt活化已被暗示为在对HER靶向疗法的抗性中起着重要作用。这种抗性的潜在机制包括膜的HER3表达上调、HER3配体调蛋白(heregulin)表达增加和与其他受体酪氨酸激酶(例如MET)协作。同时抑制HER3和其他家族成员的HER3抑制剂和泛ErbB抑制剂均已被开发出来，并且它们中的许多正处于临床开发阶段。大部分开发中的HER3抑制剂靶向该蛋白的胞外结构域。因为HER3缺乏酶促催化活性，所以不能使用酪氨酸激酶抑制剂抑制它的功能。除了单克隆抗体之外，用其他ErbB家族成员抑制HER3的二聚化也是一种有效的方法。培妥珠单抗靶向HER2的二聚化界面从而破坏配体诱导的HER2-HER3二聚化。

因为HER3靶向疗法在临床前研究中正显示出有希望的结果，所以评估个体是否具有高水平的活化HER3并由此为HER3作用剂的适当候选者将是有用的。迄今没有开发出这样做的有效的方法。发明人正是注意到这个局限性而开发了本发明。

发明简述

在一个方面，本发明提供通过检测HER3的活化辅助癌症的诊断、预后和治疗的系统和方法。

在另一个方面，本发明提供用于测量肿瘤中活化HER3的量的方法，其包括：(a)测量肿瘤样品中总HER3的量和该样品中HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合体中至少一种的量；(b)确定HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合体中至少一种与HER3总蛋白的比；以及(c)如果(i)该样品中总HER3的量大于参照群体的总HER3的中位量并且(ii)该样品中HER2-HER3异二聚体与总HER3的比、磷酸化的HER3与总HER3的比或HER3/PI3K复合体与总HER3的比中至少一个大于参照群体中HER2-HER3异二聚体与总HER3的比、磷酸化的HER3与总HER3的比或HER3/PI3K复合体与总HER3的比中至少一个的中位比例，则表明该肿瘤具有大量的活化HER3。

在另一个方面，本发明提供治疗患有癌症的受试者的方法，其包括：(a)测量受试者的肿瘤样品中HER3总蛋白的量和HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合体中至少一种的量；(b)确定HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合体中至少一种的量与总HER3的量的比；(c)确定受试者是否患有特征为具有高水平的活化HER3的癌症，其中高水平的活化HER3包含：(i)该样品中总HER3的量大于与该受试者患有同类型癌症的受试者参照群体的总HER3的中位量并且(ii)该样品中HER2-HER3同型二聚体的量与总HER3的量的比、磷酸化的HER1的量与总HER3的量的比或HER3-PI3K复合体的量与总HER3的量的比中至少一个比例大于与该受试者患有同类型癌症的受试者参照群体中的HER2-HER3同型二聚体的量与总HER3的量的比、磷酸化的HER3的量与总HER3的量的比或HER3-PI3K复合体的量与总HER3的量的比中至少一个的中位比；以及(d)如果该受试者患有特征为具有高水平的活化HER3的癌症，则向该受试者施用HER3靶向疗法。

在另一个方面，本发明提供用于预测患有癌症的受试者对HER3作用剂的应答的方法，其包括：(a)测量受试者的肿瘤样品中HER3总蛋白的量和HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合体中至少一种的量；(b)确定HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合体中至少一种的量与总HER3的量的比；(c)确定受试者是否患有特征为具有高水平的活化HER3的癌症，其中高水平的活化HER3包含：(i)该样品中总HER3的量大于与该受试者患有同类型癌症的受试者参照群体的总HER3的中位量并且(ii)该样品中HER2-HER3同型二聚体的量与总HER3的量的比、磷酸化的HER1的量与总HER3的量的比或HER3-PI3K复合体的量与总HER3的量的比中至少一个比例大于与该受试者患有同类型癌症的受试者参照群体中的HER2-HER3同型二聚体的量与总HER3的量的比、磷酸化的HER3的量与总HER3的量的比或HER3-PI3K复合体的量与总HER3的量的比中至少一个的中位比；以及(d)如果该受试者的癌症被表征为具有高水平的活化HER3，则表明该受试者更有可能对该HER3作用剂作出应答。

在另一个方面，本发明包括系统，其包含第一计算装置，该第一计算装置与数据库进行通讯；在该第一计算装置上执行的第一应用，该第一应用被配置为接收多个受试者的多个实验室测试结果并将所述多个实验室测试结果存储于所述数据库中，其中所述多个实验室测试结果包含在受试者的肿瘤样品中所测量的总HER3的量和HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合体中至少一种的量；第二计算装置，该第二计算装置与所述数据库通讯；以及在该第二计算装置上执行的第二应用，该第二应用被配置为查询所述数据库的来自所述多个受试者中受试者的实验室测试结果；接收来自所述数据库的该受试者的实验室测试结果；至少部分基于所接收的该受试者的实验室测试结果确定测试结果，所述实验室测试结果包含在从该受试者获得的肿瘤样品中总HER3的量和HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合体中至少一种与HER3总蛋白的比；产生该受试者的测试结果报告，该测试结果报告包含该肿瘤样品中活化HER3的量并至少部分基于该受试者的测试结果；以及将患者的测试结果报告传输给第三计算装置。

在另一个方面，本发明包括方法，其包括接收数据库中的多个实验室测试结果，其中所述多个实验室测试结果包含在受试者的肿瘤样品中所测量的总HER3的量和HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合体中至少一种的量；将所述多个实验室测试结果存储于所述数据库中；查询所述数据库中来自所述多个受试者的受试者的实验室测试结果；接收来自所述数据库中该受试者的实验室测试结果；至少部分基于所接收的该受试者的实验室测试结果确定测试结果，所述测试结果包含在从该受试者获得的肿瘤样品中总HER3的量和HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合体中至少一种与HER3总蛋白的比；产生该受试者的测试结果报告，该测试结果报告包含该肿瘤样品中活化HER3的量并至少部分基于该受试者的测试结果；以及将该患者的测试结果报告传输给计算装置。

本发明提到这些说明性实施方案不是用来限制或限定本发明，而是提供实例帮助理解本发明。在发明详述部分讨论了说明性实施方案，其提供本发明的进一步的说明。可以通过查阅本说明书进一步理解本发明的各种实施方案所提供的优点。

附图简述

通过参考以下非限制性的附图来更好地理解本发明。

图1是示意图，其显示的是按照本发明的某些实施方案的各种测定形式的示意图。显示的测定形式是用于示例目的的HER2-HER3异二聚体检测；可以依照本文所述修改该测定用于检测其他目标。小图A和B显示的是光释放的形式，而小图C显示的是还原(DTT)的形式。小图A描绘的是福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样品的分析，而小图B描绘的是组织裂解物样品的分析。在光释放的形式中，弥散性活性单线态氧可以用来响应于由光对切割诱导剂的光诱导而切割报道分子和HER3抗体之间的共价接头。由附接于HER2抗体的切割探针产生活性单线态氧。在还原的形式中，还原剂被用于诱导报道分子和HER3抗体之间的共价接头的切割。切割后，可以进行报道分子的毛细管电泳(CE)分离并通过电泳图进行评估。X轴显示切割的报道分子从毛细管洗脱的时间，Y轴显示荧光强度。荧光峰v1和v2表示两种不同的报道分子的洗脱。“HER3”代表HER3单体；“HER2”代表HER2单体；“B”代表生物素分子；“S”代表链霉抗生物素分子，“标记”(Tag)代表报道分子，并且“hv”代表光能。

图2显示的是按照本发明的某些实施方案的测定结果的一系列图，所述测定结果用于检测某些生物标志物以确定所评估的乳腺肿瘤样品的批次之间的一致性。细胞系对照样品数据示于每幅图的左侧，而乳腺肿瘤样品数据示于每幅图的右侧。以相对峰面积(RPA)测得的每种样品的荧光强度示于Y轴。小图A和B分别显示的是测量总HER2和总HER3水平的测定的结果。小图C、D和E分别显示的是测量HER2-HER3异二聚体、在第1289位的酪氨酸处磷酸化的HER3和HER3/PI3K复合体水平的测定的结果。

图3显示的是针对来自三个合并群组的1090例乳腺癌组织样本依照测定所评估的总HER2测量值的散点图。将测定的测量值与依照在中心测试实验室使用参考方法所确定的HER2状态(HER2阳性或HER2阴性)(被称为“中心HER2阳性”和“中心HER2阴性”)进行比较。该比较用于定义样品的状态。

图4显示的是描绘在图3中所测量的生物标志物水平的分布的散点图，基于所述样品按照本发明的某些实施方案基于分析被确定为HER2阳性或HER2阴性进行分离。

图5显示的是说明按照本发明的某些实施方案在图3中所测量的标志物之间的统计学关系的图。小图A显示的是HER2-HER3异二聚体和总HER2之间的相关性，小图B显示的是HER2-HER3异二聚体和总HER3之间的相关性，而小图C显示的是HER2-HER3异二聚体和磷酸化的HER3之间的相关性。

图6显示的是说明按照本发明的某些实施方案在图3中所测量的标志物之间的统计学关系的图。小图A显示的是磷酸化的HER3和总HER2之间的相关性，小图B显示的是磷酸化的HER3和总HER3之间的相关性。

图7显示的是按照本发明的某些实施方案对肿瘤样品中生物标志物水平进行的配对比较。使用测定测量生物标志物水平。小图A显示的是所有所评估的乳腺肿瘤样品的数据。小图B显示的是阴性(低HER2)肿瘤样品的数据。小图B显示的是阳性(高HER2)肿瘤样品的数据。将具有显著p值(p<0.05)的Spearman相关性系数用下划线表示。

图8显示的是说明按照本发明的某些实施方案肿瘤样品中生物标志物水平的热度图。使用测定测量生物标志物水平。小图A是所有乳腺肿瘤样品的热度图。小图B显示的是两个热度图，一个是阴性(低HER2)肿瘤样品的图(左图)，一个是阳性(高HER2)肿瘤样品的图(右图)。在每幅图中，将样品从最高HER2水平(右)往最低水平(左)进行排序。样品编号沿着每幅热度图的底部标示出来，并且在测定中分析的生物标志物示于每幅热度图的左侧。以深灰色显示呈现最高表达的样品(>第90百分位数)；并且以浅灰色显示具有低表达的样品(<第10百分位数)。以黑色显示呈现中等表达的样品(第50百分位数)。标有箭头的样品是被认为具有最高水平的活化HER3的样品。

图9显示的是按照本发明的某些实施方案由依照测定所测量的生物标志物水平对乳腺肿瘤样品进行的等级聚类分析。小图A显示的是由分析表征为HER2阴性的样品(低HER2)的分析。小图B显示的是由分析表征为HER2阳性的样品(高HER2)的分析。样品编号示于每幅图的底部。所分析的生物标志物示于每幅图的左侧：总HER2(H2T)；在第1289位的酪氨酸处磷酸化的HER3(p-HER3)；HER2-HER3异二聚体(H23D)；总HER3(H3T)和HER3/PI3K复合体(HER3-PI3K)。以黑色或深灰色显示表达高水平的活化HER3的肿瘤并与如热度图分析(图8)中所示的表达高水平的活化HER3的肿瘤相对应。

图10描绘的是描绘按照本发明的某些实施方案示例性计算环境中示例性计算装置的系统图。

图11描绘的是说明按照本发明的某些实施方案用于实验室报告系统的系统和方法的操作的方框图。

发明详述

本发明的实施方案提供基于检测HER3活化来辅助癌症的诊断、预后和治疗的系统和方法。某些实施方案涉及测量患有癌症的受试者的生物学样品中活化HER3蛋白的量的水平。

定义和缩略语

除非另有说明，在本文中所使用的术语“大约”是指大于或小于该术语所修饰的值不超过10％的值。例如，术语“大约5μg/kg”表示4.5μg/kg至5.5μg/kg的范围。作为另一个例子，“大约1小时”表示48分钟至72分钟的范围。

在本文中所使用的术语“活化HER3”是指能够引发下游信号传导途径的HER3的分子形式。例如，HER3的活化形式包括HER2/HER3异二聚体、磷酸化的HER3和与PI3K复合在一起的HER3。例如，可以通过测量HER2-HER3异二聚体的形成、HER3的磷酸化或者PI3K募集至活化HER3蛋白来检测活化HER3。磷酸化的HER3可以在第1289位的酪氨酸残基处或在另外几个酪氨酸残基中的一个或更多个的位置被磷酸化。此外，可以通过检测与活化HER3蛋白相关的其他蛋白质(即，在该信号传导途径下游的蛋白质)的募集和/或磷酸化来检测活化HER3。

在本文中所使用的术语“抗体”是指特异性结合另一分子的特定空间和极性组织的免疫球蛋白(并由此被定义为与其互补)。抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体或重组抗体，并可以由本领域熟知的技术(诸如宿主免疫和血清收集)(多克隆抗体)或通过制备连续杂交细胞系并收集分泌的蛋白质(单克隆抗体)、或者克隆并表达至少编码天然抗体的特异性结合需要的氨基酸序列的核苷酸序列或其经诱变处理的形式进行制备。抗体可以包括完整的免疫球蛋白或其片段，该免疫球蛋白包括各种类别和同种型，诸如IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3、IgM等。其片段可以包括Fab、Fv和F(ab’)₂、Fab’等。抗体也可以是本领域技术人员已知的保留特异性特定结合部位的结合活性的单链抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体、人源化抗体或任何其他抗体衍生物。此外，只要针对特定结合部位的结合亲和力得到保持就可适当使用免疫球蛋白或其片段的聚集体、聚合物和缀合物。用于免疫测定的抗体和抗体衍生物的生产和选择，包括采用可释放的分子标记(如以下所述)的这种测定的介绍可见于容易获得的教科书和手册，例如，HarlowandLane,1988,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork；HowardandBethell,2001,BasicMethodsinAntibodyProductionandCharacterization,CRCPress；Wild,ed.,1994,TheImmunoassayHandbook,StocktonPress,NewYork。

“抗体组成物”是指通过附接至标签或其他化学部分而被进一步修饰的如上所定义的抗体。

在本文中所使用的“抗体结合组成物”是指包含与分子结合的一种或更多种抗体或抗原结合片段并从所述抗体或抗体结合片段获得其结合特异性的分子或分子复合体。抗体结合组成物包括但不限于(i)抗体对，其中第一抗体与目标分子特异性结合，第二抗体与第一抗体的恒定区特异性结合；生物素化的抗体，其与目标分子和链霉抗生物素蛋白特异性结合，该蛋白经由生物素部分被诸如分子标记或光敏剂等的部分衍生化；(ii)抗体，其特异性针对目标分子并缀合至诸如葡聚糖的聚合物，其进而直接通过共价键或间接经由链霉抗生物素-生物素连接被诸如分子标记或光敏剂的部分衍生化；(iii)抗体，其特异性针对目标分子并缀合至珠、微珠或其他固相支持物，其进而直接或间接被诸如分子标记或光敏剂或含有后者的聚合物的部分衍生化。

“抗原决定簇”或“表位”在本文中可互换使用，是指单个抗体分子与其结合的分子(通常为蛋白质)的表面上的部位。一般而言，蛋白质具有几个或许多不同的抗原决定簇并且与不同特异性的抗体反应。一个优选的抗原决定簇是蛋白质的磷酸化部位。

术语“方面”和“实施方案”在本文中互换使用。

在本文中“结合化合物”应当是指能够与目标蛋白质或分子特异性结合或与所关注的分析物稳定形成复合体(诸如蛋白质的复合体)的抗体结合组成物、抗体、肽、细胞表面受体的肽或非肽配体、蛋白质、寡核苷酸、寡核苷酸类似物(诸如肽核酸)、凝集素或任何其他分子实体。在一个方面，结合化合物包含附接至结合部分的一种或更多种分子标记，所述结合化合物可由下式代表。

“结合部分”是指分子标记可以被直接或间接附接于其上、且能够与分析物特异性结合的任何分子。结合部分包括但不限于具有高达大约1000道尔顿的分子量并含有选自氢、碳、氧、氮、硫和磷的原子的抗体、抗体结合组成物、肽、蛋白质、核酸和有机分子。优选地，结合部分是抗体或抗体结合组成物。

在本文中所使用的“癌症”和“癌性的”是指或描述通常特征为不受调控的细胞生长的生理病况有机体(包括哺乳动物)。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。所述癌症的更特定的例子包括鳞状细胞癌、肺癌(例如小细胞肺癌或非小细胞肺癌)、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝脏癌和各种类型的头颈部癌。

“化学治疗剂”是指用于治疗癌症的化学物质，主要是细胞毒剂或细胞生长抑制剂。化学治疗剂可以具有特定的蛋白质目标(例如HER2、HER3)，它们对目标起作用而具有抗癌效果。化学治疗剂应当包括如本文所述的紫杉醇之类的化合物。

在本文中所使用的短语“可切割的连接”是指可在不降解分子标记的结构或不影响分子标记的检测特征的条件下被切割的化学连接基团，所述分子标记通过该可切割的连接连接至结合部分。

“切割诱导部分”或“切割剂”在本文中可互换使用，是指(1)产生能够切割可切割的连接的活性物质的基团(例如通过氧化)，以及(2)能够直接切割可切割的连接的化学化合物(例如通过还原)。优选地，活性物质为呈现短寿命活性的化学物质，使得其切割诱导效果仅在其产生部位附近。能够直接切割可切割的连接的化学化合物的例子是诸如二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、2-巯基乙醇或硼氢化钠之类的还原剂。

在本文中所使用的“切割探针”是指包含切割诱导部分和能够与目标蛋白质或分子特异性结合或与所关注的分析物稳定形成复合体(诸如蛋白质的复合体)的抗体结合组成物、抗体组成物、抗体、肽、细胞表面受体的肽或非肽配体、蛋白质、诸如生物素或链霉抗生物素、寡核苷酸、寡核苷酸类似物(诸如肽核酸)、凝集素或任何其他分子实体的试剂，所述切割诱导部分是产生能够切割可切割的连接的活性物质的基团。

“FFPE”或“福尔马林固定石蜡包埋”是指作为被固定(特别是常规福尔马林固定)、石蜡包埋的样品的一组细胞或一定量的组织。所述样品通常(无限制地)以封固于显微镜载玻片或等同表面上的固定组织的薄切片(例如3-10μm厚)的形式被用于受体复合体的测定。所述样品还通常经历常规再水合操作和任选地作为测定测量的一部分或测定测量之前的抗原修复操作。在一些实施方案中，所述切片是被切到带正电的玻璃面上的大约5μm厚的固定组织切片。

在本文中所使用的“大于或等于”(即≥或>＝)可以在某些替代性的实施方案中表示“大于”(>)。而且，在本文中所使用的“小于或等于”(即≤或<＝)可以在某些替代性的实施方案中表示“小于”(<)。

在本文中所使用的“危害比”是指用于产生相对风险的估计值的统计学方法。“危害比”是一组对比另一组的预测危害之间的比。例如，可以对用HER3作用剂与不用HER3作用剂治疗的患者群体进行比较，评估该HER3作用剂是否能够有效提高至疾病远端复发的时间。然后可以将该危害比与独立性测量值(诸如活化HER3与总HER3的比)进行比较。在危害比小于1的活化HER3与总HER3的比中，用HER3作用剂进行治疗具有功效的机会更大。在危害比无法与1区别开的活化HER3与总HER3的比中，用HER3作用剂进行治疗具有功效的机会更低。

在本文中可互换使用的“HER1”、“Her1”、“Her-1”、“EGFR”、“ErbB1”等是指如例如Cohenetal.,1980,J.Biol.Chem.255:4834-42和GenBank登录号NM_005228(见http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_005228)中所述的天然的HER1及其等位基因变体。除非另有说明，在本文中所使用的术语“HER1”、“Her1”、“Her-1”、“EGFR”、“ErbB1”等是指人的蛋白质。在本文中编码HER1的基因被称为“erbB1”。在本文中所使用的H1T应当是指总HER1表达。

在本文中可互换使用“Her-2”、“ErbB2”、“c-Erb-B2”、“HER2”、“Her2”和“neu”，是指如例如Sembaetal.,1985,Proc.Nat.Acad.Sci.USA82:6497-650和Yamamotoetal.,1986,Nature319:230-234和GenBank登录号X03363中所述的天然的Her-2及其等位基因变体。除非另有说明，在本文中所使用的术语“Her-2”、“ErbB2”、“c-Erb-B2”、“HER2”和“Her2”是指人的蛋白质。在本文中编码Her2的基因被称为“erbB2”。在本文中所使用的H2T应当是指总Her-2的表达。HER2/HER3异二聚体可以被称为H23D或H2/3。

在本文中所使用的“HER2作用剂”或“HER2靶向治疗”是指能够抑制HER2或表达HER2的细胞或HER2阳性癌细胞的生物学活性的化合物。所述生物学活性包括但不限于二聚化、自磷酸化、另一受体的磷酸化或由另一受体的磷酸化、信号转导等。生物学活性可以包括但不限于细胞存活和细胞增殖，并且所述活性被HER2作用剂抑制可导致直接或间接的细胞杀伤(例如抗体依赖性细胞毒作用(ADCC))、蛋白复合体或复合体形成的破坏、蛋白质运输的调节或酶抑制作用。生物学活性也可以包括如本申请所述的患者应答。应当理解的是，在本文中所使用的HER2作用剂涵盖了能够干扰、阻断、减少或调节HER2与能够结合HER2的配体之间的相互作用的分子。HER2作用剂还包括抑制HER2和另一生物学目标的双特异性作用剂(例如双特异性抗体或双重激酶抑制剂)。示例性HER2靶向剂包括但不限于BIBW2992、HKI-272、4D5、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、曲妥珠单抗美坦辛(trastuzumabemtansine)、AEE-788和拉帕替尼。

在本文中可互换使用“Her-3”、“ErbB3”、“c-Erb-B3”、“HER3”和“Her3”，是指如例如Kraus,M.H.,Issing,W.,Miki,T.,Popescu,N.C.,andAaronson,S.A.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86,9193-9197、Plowman,G.D.,Whitney,G.S.,Neubauer,M.G.,Green,J.M.,McDonald,V.L.,Todaro,G.J.,Shoyab,M.(1990)Proc.Natl.Acad.SciUSA87,4905-4090和GenBank登录号NM_001005915和NM_001982中所述的天然的HER3及其等位基因变体。除非另有说明，在本文中所使用的术语“HER3”、“Her3”、“Her-3”、“ErbB3”等是指人的蛋白质。在本文中编码HER3的基因被称为“erbB3”。在本文中所使用的H3T应当是指总HER3表达。HER2/HER3异二聚体可以被称为H23D或H2/3。

在本文中所使用的“HER3作用剂”或“HER3靶向疗法”是指能够抑制HER3或表达HER3的细胞或HER3阳性癌细胞的生物学活性的化合物。所述生物学活性包括但不限于二聚化、自磷酸化、另一受体的磷酸化或由另一受体磷酸化、信号转导等。生物学活性可以包括但不限于细胞存活和细胞增殖，并且所述活性被HER3作用剂抑制可导致直接或间接的细胞杀伤(例如抗体依赖性细胞毒作用(ADCC))、蛋白复合体或复合体形成的破坏、蛋白质运输的调节或酶抑制作用。生物学活性也可以包括如本申请所述的患者应答。应当理解的是，在本文中所使用的HER3作用剂涵盖了能够干扰、阻断、减少或调节HER3与能够结合HER3的配体之间的相互作用的分子。HER3作用剂还包括抑制HER3和另一生物学目标的双特异性作用剂(例如双特异性抗体或双重激酶抑制剂)。示例性HER3作用剂包括但不限于靶向HER3、PI3K、Akt、mTOR、ERK1/2或PYK2的大分子(诸如抗体)或小分子(诸如小分子激酶抑制剂)。例如HER3靶向剂包括但不限于U3-1289/AMG888、MM-121/SAR256212、MM-111、MEHD7945A、AZD-8931、LJM716、Av-203和帕妥珠单抗(结合HER2而阻断HER2-HER3异二聚体的形成)。

在本文中所使用的“HER3/PI3K复合体”是指磷脂酰肌醇3-激酶的调节亚基p85(p85)与其结合的活化HER3。HER3是能够直接活化PI3K/Akt途径的主要HER家族成员。一般而言，一旦HER3与另一HER蛋白(例如HER2)二聚化，则HER3被活化，这导致该蛋白质的胞质结构域中的酪氨酸的磷酸化。这些磷酸化的酪氨酸残基作为p85-PI3K结合的募集部位，这活化PI3K的催化亚基p110-PI3KCa，进而导致经由PI3K/Akt途径的细胞内信号传导。在本文中所使用的HER3/PI3K复合体可以被称为“HER3-PI3激酶”。

在本文中所使用的“HER3阳性”或“HER3活化的”癌症、癌细胞、受试者或患者是指具有升高水平的活化HER3水平的癌细胞、受试者或患者。

短语“活化HER3与HER3总蛋白的比”是指根据本领域技术人员可用的任意单个定量方法描述受试者组织(例如肿瘤)的样品中活化HER3分子的量除以HER3的总量的测量值。

“高”是指比正常更大、比标准(诸如预定的测量值或一亚组测量值)更大的测量值，或比另一亚组的测量值相对更大的测量值。例如高总HER3是指比在正常/健康的细胞中或者在另外某些癌细胞中所正常观察到的HER3的测量值更大的HER3测量值。例如高HER3是指比一组特定的样品(健康的样品或肿瘤)中正常、平均、中位HER3测量值更大的HER3测量值。高HER3也可以是指等于或大于预定的测量值(诸如预定的截断值)的测量值。高HER3也可以是指这样的HER3测量值，其中高HER3亚群比另一亚群具有相对更高的HER3水平。例如(但非限制性地)根据本说明书，可以通过围绕数学上确定的点(诸如但不限于中位值)分组样品来建立两个不同的患者亚群，从而建立测量值高的亚群(即高于中位值)和测量值低的另一亚群。可以通过本领域技术人员已知的任何方法测量HER3，例如但不限于使用或使用任何标准免疫组化(IHC)方法。

作为另一个例子，高活化HER3水平是指比在一组特定的生物学样品(健康/正常的细胞或肿瘤样品)中所观察到的活化HER3的测量值更大的活化HER3的测量值。高活化HER3也可以是指大于预定测量值(诸如预定的截断值)的测量值。高活化HER3也可以是指这样的活化HER3的测量值，其中高度活化HER3亚群比另一亚群具有相对更高水平的活化HER3。可以通过本领域已知的方法测量活化HER3，诸如荧光共振能量转移(FRET)、生物发光共振能量转移(BRET)、邻位连接测定(PLA)、二聚体特异性抗体或(MonogramBiosciences,CA)或本领域技术人员熟知的任何其他方法。

在一些情况下，“高”的表达水平可以包含非常高的表达范围和“中等高”的表达范围，其中中等高是大于正常、但小于“非常高”的表达水平。作为另一个例子，高活化HER3与总HER3的比可以是指具有大于低比亚群的测量值的一个或更多个亚群的活化HER3与总HER3的比。

在本文中所使用的“适度高”、“中等(medium)”或“中间(intermediate)”是指大于“低”且小于非常“高”的测量值。例如“中等”可以被用于描述落入总HER3和活化HER3与总HER3比的测量值的中部范围的一个或更多个亚群。

在本文中所使用的“有可能”是指物品、对象、事物或人会出现的概率增加。因此，在一个例子中，有可能对用HER3作用剂(诸如西妥昔单抗)进行治疗作出应答的受试者相对于参照受试者或受试者组而言对用HER3作用剂进行治疗作出应答的概率增加。

在本文中所使用的“长”是指比正常更大、比标准(诸如预定的测量值)更大的时间测量值，或比另一亚群的测量值相对更长的亚群测量值。例如，相应于患者的寿命，长的时间进展是指比患有同类型癌症的受试者中所观察到的正常或平均或中位时间进展更长的时间进展。可以根据本领域技术人员可用的任意方法确定时间进展是否是长的。长可以包括例如没有进展。在一个实施方案中，“长”是指比疾病中重大事件发生需要的中位时程更大的时间。

术语“低”是指比正常更小、比标准(诸如预定的测量值)更小的测量值，或比另一亚群的测量值相对更小的亚群测量值。例如低总HER3是指比在正常/健康的细胞中或者在另外某些癌细胞中所正常观察到的HER3测量值更小的HER3测量值。例如低HER3是指比一组特定的样品(健康的样品或肿瘤)中正常、平均、中位HER3测量值更小的HER3测量值。低HER3也可以是指小于预定测量值(诸如预定的截断值)的测量值。低HER3也可以是指这样的测量值，其中低HER3亚群相对低于另一亚群。例如，但非限制地，根据本说明书，可以通过围绕数学上确定的点(诸如但不限于中位值)分组样品来建立两个不同的患者亚群，从而相应于测量值高的另一亚群建立测量值低的亚群(即小于中位值)。可以通过本领域技术人员已知的任何方法测量HER3，例如但不限于使用测定或使用任何标准免疫组化(IHC)方法。

作为另一个例子，低的活化HER3是指比在一特定组的生物学样品(健康/正常的细胞或肿瘤样品)中所观察到的活化HER3的正常测量值更小的活化HER3的测量值。低的活化HER3也可以是指小于预定测量值(诸如预定的截断值)的测量值。低的活化HER3也可以是指这样的测量值，其中低的活化HER3亚群比另一亚群相对更少。可以通过本领域已知的方法测量含有HER3的二聚体(例如HER2/HER异二聚体)，诸如荧光共振能量转移(FRET)、生物发光共振能量转移(BRET)、邻位连接测定(PLA)、二聚体特异性抗体或或本领域技术人员熟知的任何其他方法。作为另一个例子，低的活化HER3与总HER3比可以是指具有比中等或高比亚群更小的测量值的一个或更多个亚群的活化HER3与总HER3比。可以根据本领域技术人员可用的任意各个定量方法确定低的活化HER3与总HER3比。本文提供了低的HER3表达值的范围的例子。

在本文中所使用的“分子标记”是指能够从待分离的分子中基于一种或更多种物理、化学或光学差异与其他分子区分开的分子，包括但不限于电泳迁移率、分子量、形状、溶解度、pKa、疏水性、电荷、荷质比、极性等。在一个方面，多种或一组分子标记的不同之处在于电泳迁移率和光学检测特性，这些分子标记可以通过电泳进行分离。在另一个方面，多种或一组分子标记可以在分子量、形状、溶解度、pKa、疏水性、电荷、极性方面有所不同，这些分子标记可以通过正相或反相HPLC、离子交换HPLC、毛细管电色谱法、质谱法、气相色谱法等技术进行分离。依照本文所述，报道分子是一类分子标记。

在本文中所使用的“最佳截断值”是指对呈现允许最佳区分某个属性的两个类别之间的某些属性的受试者的预定测量值。例如，求出允许最佳区别两个类别(例如高H3T表达和低H3T表达)之间的最佳截断值的值。最佳截断值被用于分离具有低于或高于所述最佳截断值的数值的受试者，以优化预测模型，例如但不限于最大化模型的特异性、最大化模型的灵敏度、最大化结果的差异或最小化来自危害比或应答差异的p值。

“总生存期”或“OS”是指从治疗开始到死亡或删改(censor)所测量的时间。删改可以来自研究结束或治疗改变。总生存可以指概率，例如在特定时间活着的Kaplan-Meier图中代表的概率，该时间是从治疗开始到死亡或删改之间的时间。

“光敏剂”应当是指当被光活化时将分子氧转换成单线态氧的光吸收分子。

“RECIST”应当是指代表“实体瘤中的应答评价标准”的简称，是定义治疗期间癌症患者何时改善(“应答”)、保持相同(“稳定”)或恶化(“进展”)的一组公开的规则。依照RECIST标准所定义的应答已经被公开在例如JournaloftheNationalCancerInstitute,Vol.92,No.3,February2,2000，并且RECIST标准可以包括其他类似的公开定义和规则集。本领域技术人员将会理解在本文中所使用的RECIST标准涉及的定义，诸如“PR”、“CR”、“SD”和“PD”。

可互换使用“相对峰面积”或“RPA”，应当是指特定报道分子的荧光测量值和具有已知和恒定浓度的已知荧光内标的荧光测量值之间的比。

在本文中所使用的“应答”、对治疗作出“应答”以及该动词的其他形式是指受试者对Her-2作用剂治疗的反应。作为一个例子，如果受试者肿瘤的生长被延缓大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，则该受试者对Her-2作用剂治疗作出应答。在另一个例子中，如果依照由任何合适的测量(例如根据质量或体积)所确定，受试者的肿瘤缩减大约5％、10％、20％、30％、40％、50％或更多，则该受试者对Her-2作用剂治疗作出应答。在另一个例子中，如果受试者的预期寿命超过未施用治疗时预测的预期寿命延长大约5％、10％、20％、30％、40％、50％或更多，则该受试者对Her-2作用剂治疗作出应答。在另一个例子中，如果受试者具有增加的无疾病生存期、总生存期或增加的疾病进展时间，则该受试者对Her-2作用剂治疗作出应答。几种方法可以用于确定患者是否对治疗作出应答，包括如上所述的RECIST标准。

术语“样品”、“组织样品”、“患者样品”、“患者细胞或组织样品”或“样本”各自是指从受试者或患者的组织获得的类似细胞集合。该组织样品的来源可以为实体组织例如来自新鲜、冷冻和/或保存的器官或组织样品或活组织检查或抽吸物；血或任何血成分；体液，诸如脑脊液、羊水、腹膜液或组织液；或来自受试者妊娠或发育中任何时间的细胞。组织样品可以含有实际上不与组织天然混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养剂、抗生素等。可以常规方式固定细胞(例如福尔马林固定石蜡包埋(FFPE))。

在本文中所使用的“短”是指比正常更短、比标准(诸如预定的测量值)更短的时间测量值，或比另一亚群的测量值相对更短的亚群测量值。例如，相应于患者的寿命，短的时间进展是指比患有同类型癌症的受试者中所观察到的正常或平均或中位时间进展更短的时间进展。可以根据本领域技术人员可用的任意方法确定时间进展是否是短的。在一个实施方案中，“短”是指比疾病中重大事件发生需要的中位时程更少的时间。

在本文中所使用的“重大事件”应当是指本领域技术人员确定为患者疾病中临床上重要的事件。重大事件的例子包括例如但不限于初始诊断、死亡、复发、确定患者疾病为转移性的、患者疾病的复发或患者的疾病从上述任一个阶段到另一个阶段的进展。重大事件可以是用于评估总生存期(OS)、无进展生存期(PFS)、无疾病生存期(DFS)或疾病进展时间(TTP)的任何临床上重要的事件。一些重大事件可以使用RECIST或由本领域技术人员确定的其他应答标准进行确定。

在本文中所使用的术语“受试者”和“患者”可互换使用。在本文中所使用的术语“受试者”是指动物，优选哺乳动物，包括非灵长类动物(例如牛、猪、马、驴、山羊、骆驼、猫、狗、豚鼠、大鼠、小鼠、绵羊)和灵长类动物(例如猴(诸如猕猴(cynomolgousmonkey))、大猩猩、黑猩猩和人)。

在本文中所使用的“时程”应当是指初始事件和随后事件之间的时间的量。例如，对应于患者的癌症，时程可以涉及患者的疾病，并且可以通过使用例如RECIST标准或其他应答标准精确地测量疾病过程中临床上重要的事件来测量。例如，初始事件可以是诊断，随后事件可以是转移。

“疾病进展时间”或“TTP”是指从治疗开始到癌症的进展或删选所测量的时间。删选可以来自研究结束或来自治疗改变。疾病进展时间也可以被表示为概率，例如在Kaplan-Meier图中，其中疾病进展时间可以代表无进展超过特定时间(治疗开始到进展或删选之间的时间)的概率。

“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”和该词的其他形式是指施用药剂以阻碍癌症的生长、以引起癌症重量或体积变小、以延长受试者的预期生存时间和/或到肿瘤进展的时间等。

“不太可能”是指事件、物品、对象、事物或人相对于参照会出现的概率降低。因此，不太可能对HER3作用剂治疗作出应答的受试者相对于参照受试者或受试者组对HER3作用剂治疗作出应答的概率降低。

在本文中可互换使用和“测定”，是指单个和多重免疫测定(均为单标记和多标记的形式)以及进行和采用所述测定的材料、方法和技术，包括但不限于与那些测定有关的试剂、分析操作和软件(MonogramBiocsiences,CA)。在测定情形中的标签是被称为报道分子的可检测部分。所述测定被公开于本申请中，以及美国专利7,648,828和美国专利申请2010/0143927、2010/0233732和2010/0210034，将其通过引用整体并入本文。

在本文中所使用的“报道分子”或“vTag”是用于指被附接至在测定中所使用的抗体的可检测部分(MonogramBiosciences,CA)。

涉及HER3的分析的方法

本发明的方面和实施方案提供了基于检测HER3的活化辅助癌症的诊断、预后和治疗的系统和方法。在某些实施方案中，所述方法涉及确定患有癌症的受试者是否有可能对HER3作用剂治疗作出应答和/或在患有癌症的受试者中用于预测疾病的时程和/或在该疾病的时程中重大事件的概率。在某些实施方案中，所述方法包括检测活化HER3(单独或与对如本文所述的HER3作用剂治疗作出应答有关的其他生物标志物组合)并确定受试者是否有可能对HER3作用剂单独治疗或与另一作用剂(例如HER2作用剂)组合治疗作出应答。在某些实施方案中，所述方法包括在患有癌症的受试者中测量作为生物标志物或与生物标志物组合的活化HER3并预测与疾病进展有关的时程或在疾病的时程中重大事件的概率。在一些实施方案中，所述方法包括测量活化HER3并给受试者确定适当的治疗(例如HER3靶向剂)。

在一个方面，本发明提供用于测量肿瘤中活化HER3的量的方法，其包括：(a)提供肿瘤样品；(b)测量该样品中总HER3的量和该样品中HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合体中至少一种的量；以及(c)确定HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合体中至少一种与HER3总蛋白的比。

在另一个方面，本发明提供用于测量肿瘤中活化HER3的量的方法，其包括(a)测量肿瘤样品中总HER3的量和该样品中HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合体中至少一种的量；(b)确定HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合体中至少一种与HER3总蛋白的比；以及(c)如果(i)该样品中总HER3的量大于参照群体的总HER3的中位量并且(ii)该样品中HER2-HER3异二聚体与总HER3的比、磷酸化的HER3与总HER3的比或HER3/PI3K复合体与总HER3的比中至少一个比大于参照群体中HER2-HER3异二聚体与总HER3的比、磷酸化的HER3与总HER3的比或HER3/PI3K复合体与总HER3的比中至少一个的中位比，则表明该肿瘤具有大量的活化HER3。

在另一个方面，本发明提供治疗患有癌症的受试者的方法，其包括：(a)通过(i)测量受试者的肿瘤样品中HER3总蛋白的量和HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合体中至少一种的量，以及(ii)确定该肿瘤样品是否包含升高量的HER3总蛋白和HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合体中至少一种，从而确定受试者的癌症是否具有大量的活化HER3；以及(b)向该受试者施用HER3靶向疗法。

在另一个方面，本发明提供治疗患有癌症的受试者的方法，其包括：(a)测量受试者的肿瘤样品中HER3总蛋白的量和HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合体中至少一种的量；(b)确定HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合体中至少一种的量与总HER3的量的比；(c)确定受试者是否患有特征为具有高水平的活化HER3的癌症，其中高水平的活化HER3包含：(i)该样品中的总HER3的量大于与该受试者患有同类型癌症的受试者参照群体的总HER3的中位量，并且(ii)该样品中HER2-HER3同型二聚体的量与总HER3的量的比、磷酸化的HER1的量与总HER3的量的比或HER3-PI3K复合体的量与总HER3的量的比中至少一个比大于与该受试者患有同类型癌症的受试者参照群体中的HER2-HER3同型二聚体的量与总HER3的量的比、磷酸化的HER3的量与总HER3的量的比或HER3-PI3K复合体的量与总HER3的量的比中至少一个的中位比；以及(d)如果该受试者患有特征为具有高水平的活化HER3的癌症，则向该受试者施用HER3靶向疗法。

在另一个方面，本发明提供用于预测患有癌症的受试者对HER3作用剂的应答的方法，其包括：(a)测量受试者的肿瘤样品中HER3总蛋白的量和HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合体中至少一种的量；(b)如果(i)该样品中总HER3的量大于参照群体的总HER3的中位量并且(ii)该样品中HER2-HER3异二聚体与总HER3的比、磷酸化的HER3与总HER3的比或HER3/PI3K复合体与总HER3的比中至少一个比大于参照群体中HER2-HER3异二聚体与总HER3的比、磷酸化的HER3与总HER3的比或HER3/PI3K复合体与总HER3的比中至少一个的中位比，则表明该受试者更有可能对HER3作用剂作出应答。在本发明的某些方面，对HER3作用剂的应答包括在诊断或治疗开始到在受试者用HER3作用剂进行治疗期间重大事件发生之间有更长的疾病时程。在本发明的一些方面，重大事件包括癌症从一个阶段进展至一个更晚期的阶段、进展成转移性疾病、复发、手术或死亡中的至少一个。

在另一个方面，本发明提供用于预测患有癌症的受试者对HER3作用剂的应答的方法，其包括：(a)测量受试者的肿瘤样品中HER3总蛋白的量和HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合体中至少一种的量；(b)确定HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合体中至少一种的量与总HER3的量的比；(c)确定受试者是否患有特征为具有高水平的活化HER3的癌症，其中高水平的活化HER3包含：(i)该样品中总HER3的量大于与该受试者患有同类型癌症的受试者参照群体的总HER3的中位量并且(ii)该样品中HER2-HER3同型二聚体的量与总HER3的量的比、磷酸化的HER1的量与总HER3的量的比或HER3-PI3K复合体的量与总HER3的量的比中至少一个比大于与该受试者患有同类型癌症的受试者参照群体中的HER2-HER3同型二聚体的量与总HER3的量的比、磷酸化的HER3的量与总HER3的量的比或HER3-PI3K复合体的量与总HER3的量的比中至少一个的中位比；以及(d)如果该受试者的癌症被表征为具有高水平的活化HER3，则表明该受试者更有可能对该HER3作用剂作出应答。在本发明的一些方面，所述方法可以进一步包括，如果该受试者患有HER2阳性癌症，则表明该受试者更有可能对HER2靶向剂和HER3靶向剂的联合疗法作出应答。在本发明的某些方面，对HER3作用剂的应答包括在诊断或治疗开始和在受试者用HER3作用剂进行治疗的同时重大事件发生之间更长的疾病时程。在本发明的一些方面，重大事件包括癌症从一个阶段进展至一个更晚期的阶段、进展成转移性疾病、复发、手术或死亡中的至少一个。

本发明与上述各个实施方案有关的另外的方面和实施方案描述如下。

在本发明的一些实施方案中，所述方法可以进一步包括，如果(i)该样品中总HER3的量大于参照群体的总HER3的中位量并且(ii)该样品中HER2-HER3异二聚体与总HER3的比、磷酸化的HER3与总HER3的比或HER3/PI3K复合体与总HER3的比中至少一个比大于该参照群体中HER2-HER3异二聚体与总HER3的比、磷酸化的HER3与总HER3的比或HER3/PI3K复合体与总HER3的比中至少一个的中位比，则表明该肿瘤/癌症具有大量的活化HER3。在本发明的某些实施方案中，通过确定选自在生物学样品或肿瘤样品中存在的HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3和HER3/PI3K复合体之中的至少两种HER3实体的量来检测癌症/肿瘤中活化HER3的量。

在本发明的一些实施方案中，通过使用HER3磷酸特异性抗体或HER3泛磷酸抗体检测生物学样品或肿瘤样品中磷酸化的HER3的量。在某些实施方案中，通过使用结合在HER3的第1289位酪氨酸残基处磷酸化的HER3蛋白的磷酸特异性抗体检测肿瘤中磷酸化的HER3的量。

在本发明的一些实施方案中，上述方法所涉及的癌症/肿瘤可以包含结肠直肠癌、胃癌、乳腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、头颈部癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、脑癌、子宫内膜癌、胰腺癌、前列腺癌或子宫颈癌中的至少一种。在一个实施方案中，癌症为乳腺癌。在一些实施方案中，肿瘤可以包含乳腺癌。在一些实施方案中，癌症是转移或复发的。在一些实施方案中，癌症是早期癌症。备选地，可以分析或监测可能对HER3作用剂敏感的任何癌症。

在一些实施方案中，本发明涉及HER3-靶向剂的用途。HER3-靶向剂可以是本领域普通技术人员已知的任何此类试剂。在某些实施方案中，HER3-靶向剂包括HER3特异性抗体，包括双特异性抗体或蛋白激酶抑制剂。在某些实施方案中，HER3-靶向剂是U3-1289/AMG888、MM-121/SAR256212、MM-111、MEHD7945A、AZD-8931、LJM716、Av-203或培妥珠单抗(结合HER2但阻断HER2-HER3异二聚体形成)的至少一种。同样地，可使用本文所述的方法评估其它HER3靶向剂。

在本发明的每一个方法的某些实施方案中，对样品分析至少一个其它生物标志物。例如，在一些实施方案中，还可测量所述至少一个其它生物标志物。例如，在一些实施方案中，所述其它生物标志物可包含总HER2。在其它实施方案中，所述至少一个其它生物标志物选自PTEN、MET、STK11、BRAF、KRAS、NRAS、MAP3K1、AKT1、IGF1R、PI3KR1、CCND1、STAT5、FGFR-1和FGFR-4。

在某些实施方案中，所述方法包括检测来自受试者的癌症的生物样品中的总HER3和/或活化HER3的量，其中如果总HER3和活化HER3的量高，则所述患者可能对HER3-作用剂产生响应和/或所述患者具有长时间进程。

因此，在某些实施方案中，本发明包括使来自受试者的生物样品中的活化HER3的量的相对水平与受试者将对利用HER3-作用剂的治疗产生响应的可能性的预后相关联的方法，其包括：(a)检测来自受试者的癌症的生物样品中活化HER3的量；和(b)将活化HER3的量与所述受试者将对利用HER3-作用剂的治疗产生响应的可能性的预后相关联。

在某些实施方案中，如果活化HER3的量等于或高于第一截断值，则受试者的预后是可能对HER3-作用剂产生响应。或者，如果活化HER3的量低于所述第一截断值水平，则受试者的预后是将不可能对HER3作用剂产生响应。在一些实施方案中，第一截断值包括具有相同癌症的受试者参照群体中活化HER3的中位数水平。在某些实施方案中，参照群体中的活化HER3的中位数水平包括预定的测量值。在一些实施方案中，活化HER3是总HER3加上HER2/HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物的至少一个对总HER3的比率的测量值。

同样地，在某些实施方案中，预定测量值是通过将多个受试者样品分成至少2个亚组来产生，其中第一亚组包含在生物样品中具有低水平的总HER3分子的样品，其中所述低水平包括具有等于或低于阈水平(截断值)的总HER3分子的量；并且其中所述第二亚组包含具有高水平的总HER3分子的样品，其中所述高水平包括具有高于阈水平(截断值)的活化HER3分子的量。在所述方法的其它实施方案中，通过基于活化HER3的水平(如通过检测HER2/HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物的量测定的)将高水平总HER3亚组分成至少2个亚组来产生预定测量值。在一些实施方案中，截断值是参照群体中的中位数。

在某些实施方案中，所述方法包括检测来自受试者的癌症的生物样品中总HER3和/或活化HER3的量，其中如果总HER3和/或活化HER3的量高，则所述患者可能对HER3-作用剂产生响应和/或所述患者具有长的时间进程。在一些实施方案中，测量活化HER3。

在其它实施方案中，本发明涉及用于预测患有具有升高水平的活化HER3的癌症的受试者的疾病时间进程的方法。在其它实施方案中，本发明涉及用于预测具有HER3阳性癌症的受试者中重大事件的概率的方法。例如，本发明的一些实施方案包括用于预测患有癌症并且正用HER3-作用剂治疗的受试者是否可能具有重大事件的方法，其包括以下步骤：(a)检测来自受试者癌症的生物样品中总HER3和/或活化HER3的量；和(b)将总HER3和/或活化HER3的量与所述受试者将有重大事件的可能性相关联。在一些实施方案中，所述重大事件是癌症诊断与癌症从一个分期至更晚期的进展、进展至转移性疾病、复发、手术或死亡中至少一个进展之间的时间。同样地，在某些实施方案中，所述方法还可包括预测可发生重大事件的时间进程。在某些实施方案中，时间进程通过测定患者的疾病过程中重大事件之间的时间来测量，其中所述测量能预示患者是否具有长的时间进程。在一个方面和实施方案中，重大事件是从初步诊断至死亡的进展。在另一个方面和实施方案中，重大事件是从初步诊断至转移性疾病的进展。在另一个方面和实施方案中，重大事件是从初步诊断至复发的进展。在另一个方面和实施方案中，重大事件是从转移性疾病至死亡的进展。在另一个方面和实施方案中，重大事件是从转移性疾病至复发的进展。在另一个方面和实施方案中，重大事件是从复发至死亡的进展。在某些实施方案中，针对总存活率、至进展的时间和/或使用RECIST或其他响应标准测量时间进程。

在另一个实施方案中，本发明包括用于确定患有具有升高水平的活化HER3的癌症的受试者是否可能对利用HER3-作用剂的治疗产生响应和/或具有长的疾病时间进程的方法。

在某些实施方案中，可对受试者施用包括HER3作用剂的联合治疗。所述联合治疗可包括(但不限于)HER3-作用剂与本领域普通技术人员已知的任何化学治疗剂中的一种或多种组合。优选地，化学治疗剂具有与HER3作用剂不同的作用机制。例如，所述化学治疗剂可以是抗代谢物(例如，5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲氨蝶呤(MTX)、氟达拉滨等)、抗微管剂(例如，长春新碱；长春碱；紫杉烷类诸如紫杉醇和多西紫杉醇等)、烷化剂(例如，环磷酰胺、美法仑，双氯乙亚硝脲等)、铂试剂(例如，顺铂、卡铂、奥沙利铂、JM-216、CI-973等)、蒽环类抗生素(例如，阿霉素、柔红霉素等)、抗生素药物(例如，丝裂霉素-C、放线菌素D等)、拓扑异构酶抑制剂(例如，依托泊苷、喜树碱等)或本领域普通技术人员已知的其它任何化学治疗剂。

可用于本发明的各种实施方案中的化学治疗剂的具体实例，包括本发明的药物组合物、剂型和试剂盒，包括但不限于，阿糖胞苷、美法仑、托泊替康、氟达拉滨、依托泊苷、伊达比星、柔红霉素、米托蒽醌、顺铂、紫杉醇和环磷酰胺。

可以使用的其它化疗剂包括阿巴瑞克、阿地白介素、阿仑单抗、阿利维a酸、别嘌呤醇、六甲蜜胺、氨磷汀、阿那曲唑、三氧化二砷、天冬酰胺酶、活卡介苗、贝伐珠单抗、贝沙罗汀、博来霉素、硼替佐米、白消安、卡普睾酮、喜树碱、卡培他滨铂、卡铂、卡莫司汀、塞来考昔、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、西那卡塞、顺铂、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、阿法达贝泊汀、柔红霉素、尼白介素、右雷佐生、多西紫杉醇、阿霉素、屈他雄酮、Elliott’sB液、表柔比星、阿法依伯汀、雌氮芥、依托泊苷、依西美坦、非格司亭、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟维司群、吉西他滨、吉姆单抗奥佐米星、吉非替尼、戈舍瑞林、羟基脲、替伊莫单抗、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、干扰素α-2a、干扰素α-2b、伊立替康、来曲唑、亚叶酸、左旋咪唑、洛莫司汀、氮芥、甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、甲氧沙林、甲泼尼龙、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、诺龙、诺非单抗、奥利默森、奥普瑞白介素、奥沙利铂、紫杉醇、帕米膦酸、培加酶、培门冬酶、培非司亭、培美曲塞、喷司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、聚苯丙生、卟菲尔、甲基苄肼、阿的拉布立酶、利妥昔单抗、沙格司亭、链脲霉素、滑石粉、他莫昔芬、特罗凯、替莫唑胺、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、塞替派、拓扑替康、托瑞米芬、托西莫、曲妥珠单抗、维甲酸、尿嘧啶芥、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、唑来膦酸盐和其它化学治疗剂。

在另一个方面，本发明涉及用于确定具有HER3活化癌症的受试者是否可能对除了HER3-作用剂以外还利用至少一种化学治疗剂的治疗产生响应和/或患者是否可能具有短的时间进程的方法。在某些实施方案中，所述方法包括测量来自受试者癌症的生物样品中HER3和/或活化HER3的量，其中如果HER3和/或活化HER3的水平高或非常高，那么所述患者不太可能对除了HER3作用剂以外还利用至少一种化学治疗剂的治疗产生响应。

在另一个方面，本发明涉及用于确定具有HER3阳性癌症的受试者是否可能对除了HER3-作用剂以外还利用至少一种化学治疗剂的治疗产生响应的方法。在某些实施方案中，所述方法包括测量来自受试者癌症的生物样品中活化HER3的量，其中如果活化HER3的水平高，则所述患者可能对除了HER3-作用剂以外还利用至少一种化学治疗剂的治疗产生响应。在某些实施方案中，所述生物样品包含FFPE组织。在某些实施方案中，所述癌症是转移性的或复发性的。在一些实施方案中，可监测可能对HER3-作用剂敏感的任何癌症。HER3-作用剂可以是任何HER3-作用剂。在某些实施方案中，HER3-作用剂是本文所述的药剂之一。或者，可评估本领域中已知的其它另外的化学治疗剂。在某些实施方案中，针对总存活率、至进展的时间和/或使用RECIST标准测量响应的可能性或时间进程。

HER2靶向剂可以是本领域普通技术人员已知的任何此类药剂。在某些实施方案中，HER2靶向剂可以是BIBW2992、HKI-272、4D5、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine、AEE-788或拉帕替尼中的至少一种。在某些实施方案中，针对总存活率、至进展的时间和/或使用RECIST或其它响应标准测量响应的可能性。

在一些实施方案中，本发明可以进一步包括测定生物样品中总HER2蛋白的量，和确定所述受试者是否具有HER2阳性癌症或HER2阴性癌症。在本发明的一些实施方案中，已通过免疫组织化学或原位杂交分析(例如，在集中式测试实验室)表征了HER2阴性癌症和HER2阳性癌症。在一些实施方案中，如果受试者具有HER2阳性癌症，本发明还可包括施用包含HER-2靶向治疗和HER3靶向治疗的综合疗法。在本发明的一些实施方案中，如果受试者具有HER2阳性癌症，则所述方法还可包括指示所述受试者更可能对HER2靶向剂和HER3靶向剂的综合疗法产生响应。

在某些实施方案中，本发明还可以包括：确定总HER2蛋白的量是否低于第一截断值(包含对应于HER2阳性癌症的参照群体中总HER2蛋白表达的底部第五百分位的总HER2蛋白水平)(即，HER2阴性)，总HER2蛋白的量是否高于第二截断值(包含对应于HER2阴性癌症的参照群体中总HER2蛋白表达的顶部第95百分位的总HER2蛋白水平(即，HER2阳性)，或总HER2蛋白的量是否高于第一截断值但低于第二截断值(即，HER2阳性)。在某些实施方案中，如果肿瘤样品中总HER2蛋白的量高于第一截断值，则本发明还可包括施用包含HER-2靶向治疗和HER3靶向治疗的综合疗法。在某些实施方案中，如果生物样品中总HER2蛋白的量高于第一截断值，则本发明还可包括指示所述受试者更可能对HER2靶向剂和HER3靶向剂的综合疗法产生响应。

如本文中所论述的，在某些实施方案中，使用能够测量测量和/或定量样品中蛋白质-蛋白质相互作用的量的测定法来测量活化HER3的量。可使用用于直接测量样品中总HER3表达和/或活化HER3的量的本领域普通技术人员已知的任何方法。例如，可将测定HER3表达的量的任何定量测定用于测定有多少信号被细胞或癌症产生，代表HER3表达或激活。此类方法可包括，但不一定限于，测定、FRET、BRET、生物分子荧光互补和邻位连接测定。在一些实施方案中，可将测定中产生的信号与从不同测定中产生的信号比较以确定两个测定之间的对应关系。

在某些实施方案中，通过将具有癌症的受试者的生物样品与具有通过可裂解的连键附接于其的分子标签和具有裂解诱导部分的裂解探针的结合化合物接触，并检测分子标签是否被释放以及什么分子标签被释放，由此测定所述量。图1提供了根据本发明的实施方案的各种测定形式的示意图。固定组织切片，随后使之结合于具有裂解诱导剂的第一抗体和连接于可检测部分(例如，报告分子)的第二抗体。例如，如图1A中所示，将第一抗体缀合于生物素，并将第二抗体缀合于报告分子。随后可将链霉抗生物素蛋白官能化的敏化剂染料结合于缀合有生物素的抗体。可进行裂解诱导剂的光诱导以使单线态氧释放，这诱导报告分子裂解到溶液中。随后收集溶液并将其通过毛细管电泳进行分析。在一些实施方案中，以微孔板形式进行该测定，如图1B所示。例如，将样品添加到微孔板的孔中，随后添加抗体：将特异于一个靶蛋白的第一抗体缀合于生物素，并将特异于第二靶蛋白的第二抗体缀合于报告分子。涂覆有链霉抗生物素蛋白官能化的敏化剂染料的珠粒可用于捕获缀合有生物素的抗体。可进行裂解诱导剂的光诱导，以使单线态氧释放，这诱导报告分子裂解到溶液中。然后从每一个孔收集所述溶液并通过毛细管电泳分析。在一些实施方案中，所述报告分子的裂解可由DTT而非光敏诱导的裂解引起，如图1C所示。

检测测定法的实例描述于本文中以及共同拥有的美国专利申请公开号2009/0191559(其通过引用整体并入本文，描述总HER2和HER2同二聚体的检测)中。类似的策略可用于测量其它生物标志物诸如HER1、HER3、cMET、p-95等。参见例如美国专利号7,648,828和美国专利申请号2010/0143927、2010/0233732和2010/0210034。

在某些实施方案中，一种或多种测定形式可用于测量HER生物标志物水平。例如，当测量总HER3水平时，可使用结合HER3的胞外结构域的第一抗体。随后可利用附接了报告分子的第二抗体特异性结合第一抗体。在该测定形式的某些实施方案中，如图1C所示，可用还原剂(例如，DTT)裂解报告分子。

当测量总HER2、总HER3和磷酸化的HER3的量时，可使用两种第一抗体，这两种第一抗体均特异于靶蛋白。一种第一抗体可附接有亚甲蓝染料并结合HER2或HER3胞内结构域。第二种第一抗体被缀合于报告分子，并且还可结合HER2或HER3的胞内结构域。在光敏作用后，亚甲蓝染料释放单线态氧，当分子非常接近时这导致报告分子的裂解。所述两种第一抗体可以是相同的，或可结合于HER分子的两种不同表位。当测量HER3磷酸化时，缀合有报告分子的抗体可结合磷酸化的表位(例如，氨基酸位置1289)。

例如，在本发明的一些实施方案中，测量来自受试者的肿瘤样品或生物样品中总HER3蛋白的量可包括以下步骤：a)将所述肿瘤样品或生物样品与HER3抗体组合物接触；b)将HER3抗体组合物与标记的结合组合物接触，其中所述标记的结合组合物包含通过可裂解连键附接于其上的分子标签，并且其中所述标记的结合组合物特异性结合HER3抗体组合物；c)裂解被标记的结合组合物中的可裂解接头，从而释放分子标签；和d)定量所述释放的分子标签以测定肿瘤样品或生物样品中HER3蛋白的量。

同样地，在本发明的一些实施方案中，测量来自受试者的肿瘤样品或生物样品中总HER3蛋白的量可包括以下步骤：a)将肿瘤样品或生物样品与在第一结合位点上特异性结合HER3蛋白的第一HER3抗体组合物接触，其中所述第一HER3结合组合物包含通过可裂解连键附接于其上的分子标签：b)将所述肿瘤样品与在第二结合位点上特异性结合HER3蛋白的裂解探针接触，其中当与其处于有效接近度时，所述裂解探针裂解HER3抗体组合物的可裂解连键；c)裂解HER3抗体组合物的可裂解接头，从而释放分子标签；和d)定量所述释放的分子标签以测定肿瘤样品或生物样品中HER3蛋白的量。

当测量HER2-HER3异二聚体和HER3/PI3K复合物时，测定形式通常使用各结合每一种待检测蛋白质的两种第一抗体和特异性结合一种或另一种第一抗体的两种第二抗体。结合HER2和HER3的第一抗体可特异性结合胞外结构域或胞内结构域。在本发明的一些实施方案中，当检测到HER3/PI3K复合物时，结合HER3的第一抗体特异性结合胞内结构域。例如，对于HER2/HER3异二聚体的检测，可将HER2第一抗体与缀合了报告分子的第二抗体结合使用，并且可将HER3抗体与缀合了光敏剂(例如，亚甲蓝)的第二抗体结合使用。或者，作为替代结构，可将报告分子缀合于结合HER3抗体的第二抗体，以及可将光敏剂缀合于结合HER2抗体的第二抗体。在光敏作用后，如果第二抗体彼此紧密接近(例如，如果HER2/HER3异二聚体已形成)，则可裂解报告分子。随后，可例如通过电泳分离裂解的报告分子。可将相同的测定形式用于使用结合HER3和PI3K的第一抗体检测HER3/PI3K复合物。此外，可将经修饰的形式用于HER2/HER3异二聚体和HER3/PI3K复合物的检测，如本文中别处所述。

在用于HER2-HER3异二聚体和HER3/PI3K复合物的检测的其它测定形式中，将分子标签(例如，报告分子)和具有裂解诱导-部分(例如，光敏剂)的裂解探针直接缀合于第一抗体并且不使用第二抗体。结合HER2和HER3的第一抗体可特异性结合胞外结构域或胞内结构域。在本发明的一些实施方案中，当将检测HER3/PI3K复合物时，结合HER3的第一抗体特异性结合胞内结构域。例如，在本发明的一些实施方案中，测量来自所述受试者的肿瘤样品或生物样品中HER2-HER3异二聚体或HER3/PI3K复合物的量可包括以下步骤：a)将肿瘤样品或生物样品与包含通过可裂解连键附接于其上的分子标签的抗体组合物接触；b)将肿瘤样品或生物样品与裂解探针接触，其中当与其处于有效接近度时，所述裂解探针裂解抗体组合物的可裂解连键；c)裂解抗体组合物的可裂解接头，从而释放分子标签；和d)定量所述释放的分子标签以测定肿瘤样品或生物样品中HER2-HER3异二聚体或HER3/PI3K复合物的量，其中对于HER2-HER3异二聚体的测量，所述抗体组合物特异性结合HER3并且所述裂解探针特异性结合HER2，或所述抗体组合物特异性结合HER2并且所述裂解探针特异性结合HER3，其中对于HER3/PI3K复合的测量，所述抗体组合物特异性结合HER3并且所述裂解探测特异性结合PI3K，或所述抗体组合物特异性结合PI3K并且所述裂解探针特异性结合HER3。

此外，在本发明的一些实施方案中，测量来自受试者的肿瘤样品或生物样品中HER2-HER3异二聚体的量可包括以下步骤：a)将肿瘤样品或生物样品与HER2抗体组合物接触；b)将肿瘤样品或生物样品与HER3抗体组合物接触；c)将肿瘤样品或生物样品与结合HER2抗体组合物或HER3抗体组合物的第一结合组合物接触，其中所述第一结合组合物包含接通过可裂解连键附接于其上的分子标签；d)将肿瘤样品或生物样品与裂解探针接触，其中当与其处于有效接近度时，所述裂解探针裂解结合组合物的可裂解连键；e)裂解抗体组合物的可裂解接头，从而释放分子标签；和f)定量所释放的分子标签以测定肿瘤样品或生物样品中HER-HER3异二聚体的量，其中如果抗体结合组合物特异性结合HER3，则所述裂解探针特异性结合HER2，或如果抗体结合组合物特异性结合HER2，则所述裂解探针特异性结合HER3。

此外，在本发明的其它实施方案中，测量来自受试者的肿瘤样品或生物样品中HER3/PI3K复合物的量可包括以下步骤：a)将肿瘤样品或生物样品与HER3抗体组合物和PI3K抗体结合组合物接触，其中一种抗体组合物包含通过可裂解连键附接于其上的分子标签，另一种抗体组合物包含当与其处于有效接近度时裂解结合组合物的可裂解连键的裂解探针；b)裂解可裂解接头以释放分子标签；和c)定量所释放的分子标记以测定肿瘤样品或生物样品中HER3/PI3K复合物的量。

同样地，在本发明的一些实施方案中，测量来自受试者的肿瘤样品或生物样品中磷酸化的HER3的量可包括以下步骤：a)将肿瘤样品或生物样品与在第一结合位点特异性结合HER3蛋白的第一HER3抗体组合物接触，其中第一HER3抗体组合物包含通过可裂解连键附接于其上的分子标签；b)将肿瘤样品或生物样品与在第二结合位点特异性结合HER3蛋白的第二HER3抗体组合物，其中所述第二HER3抗体组合物包含当与其处于有效接近度时裂解HER3抗体组合物的可裂解连键的裂解诱导部分，并且所述第二结合位点包含HER3磷酸化位点；c)裂解第一HER3抗体组合物的可裂解接头，从而释放分子标签；和d)定量所释放的分子标签以测定肿瘤样品或生物样品中磷酸化的HER3的量。

在一些实施方案中，适用于本发明的系统和方法中的样品可来自多种来源，包括细胞培养物、动物组织、患者活检组织等。优选地，样品是人患者的样品。使用常规技术制备样品以用于生物标志物的分析，所述技术可取决于获取样品的来源。对于活检组织和医学样本，以下参考资料中提供了指导：BancroftJD&StevensA，编辑1977,TheoryandPracticeofHistologicalTechniques,ChurchillLivingstone,Edinburgh；Pearse,1980,Histochemistry.Theoryandapplied，第4版，ChurchillLivingstone,Edinburgh。在一些实施方案中，样品包含FFPE样品。

可使用的患者组织样品包括、但不限于结直肠癌、胃癌、乳腺癌、黑素瘤、卵巢癌、头颈癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、脑癌、子宫内膜癌、胰腺癌、前列腺癌或子宫颈癌。组织样品可通过各种方法获得，包括手术切除、抽吸或活检。所述组织可以是新鲜或冷冻的。在一个实施方案中，对已被固定和包埋在石蜡中的组织样品进行本发明的测定法，随后进行脱蜡的步骤。可通过常规方法固定组织样品(即，保存)。参见，例如，LeeG.Luna,HT(ASCP)编辑，1960,ManualofHistologicalStainingMethodoftheArmedForcesInstituteofPathology第3版，TheBlakstonDivisionMcGraw-HillBookCompany,NewYork；UlrekaV.Mikel，编辑，1994,TheArmedForcesInstituteofPathologyAdvancedLaboratoryMethodsinHistologyandPathology,ArmedForcesInstituteofPathology,AmericanRegistryofPathology,Washington,D.C。本领域内的普通技术人员将理解，由对组织进行组织学染色或其它分析的目的来决定固定剂的选择。本领域普通技术人员中也将理解，固定的长度取决于组织样品的尺寸和所使用的固定剂。

通常地，首先固定组织样品，然后利用递增系列的醇脱水，渗透和用石蜡或其它切片介质进行包埋，以使组织样品可被切片。或者，可将组织切片并且固定所获得的切片。例如，可按照由上文中提供的参考资料所描述的常规技术，通过常规方法在石蜡中包埋和处理组织样品。可使用的石蜡的实例包括、但不限于Paraplast、Broloid和Tissuemay。在包埋组织样品后，就可按照常规技术利用切片机来对样品进行切片。切片可具有在约3微米至约12微米范围内的厚度，优选地在约5微米至约10微米范围内的厚度。在一个方面，切片可具有约10mm²至约1cm²的面积。切割后，就可通过几个标准方法将所述切片附着于载玻片。载玻片粘合剂的实例包括、但不限于硅烷、明胶和多聚-L-赖氨酸。可将石蜡包埋的切片附着于带正电的载玻片和/或涂覆有多聚-L-赖氨酸的载玻片。

如果石蜡已被用作包埋材料，则通常将组织切片脱蜡和再水化，随后检测生物标志物。可通过几个常规标准方法将组织切片进行脱蜡。例如，可按照由上文中提供的参考资料描述的常规技术使用二甲苯和逐渐递减系列的醇。或者，可使用商购可得的脱蜡非有机试剂诸如(CMS,Houston,Tex.)。

哺乳动物组织培养细胞或者新鲜或冷冻的组织可通过常规细胞裂解技术(例如，0.14MNaCl、1.5mMMgC1₂、10mMTris-Cl(pH8.6)、0.5％NonidetP-40，以及如果需要，蛋白酶和/或磷酸酶抑制剂)来制备。对于新鲜哺乳动物组织，样品制剂还可包括组织分解步骤，诸如粉碎、切碎、研磨或声波处理。

使用可释放的分子标签通过测量活化HER3群体可提供许多有利方面，包括：(1)从测定混合物分离释放的分子标签可提供极大地降低的本底和灵敏度的显著增加；和(2)被专门设计成方便分离和检测的分子标签的使用提供了方便的多重应用能力，从而多个受体复合物组分可在同一测定中被容易地同时测量。采用此类标签的测定可具有多种形式并且公开于以下参考文献中：美国专利号7,105,308和6,627,400；公开的美国专利申请号2002/0013126、2003/0170915、2002/0146726、2009/0191559、2010/0143927、2010/0233732和2010/0210034；和国际专利公开号WO2004/011900，其每一个通过引用整体并入本文。例如，可使用能基于待分离的分子间的一个或多个物理、化学或光学差异(包括电泳迁移率、分子量、形状、溶解度、pKa、疏水性、电荷、荷/质比或极性)区分分子的多种分离技术。在一个方面，多个或一套分子标签在电泳迁移率和光学检测特性方面不同，并且通过电泳来分离。在另一个方面，多个或一组分子标签可在分子量、形状、溶解度、pKa、疏水性、电荷、极性方面不同，并且通过正相或反相HPLC、离子交换HPLC、毛细管电色谱、质谱法或气相色谱来分离。

提供了成组的分子标签，所述分子标签可在它们从结合化合物上释放后通过分离技术分离成不同的条带或峰。此类峰的鉴定和定量提供了对蛋白质、蛋白质复合物和翻译后修饰的蛋白质的存在和/或量的测量或特征谱。在一些实施方案中，组内的分子标签的化学性质可以不同。在其它实施方案中，成组的分子标签可以是化学上相关的。例如，分子标签可以全部是肽，可由相同的基本结构单元或单体的不同组合组成，或可使用相同的基本骨架(其具有不同的取代基以赋予不同的分离特性)来合成。多个分子标签的数量可因几个因素而改变，包括所采用的分离模式、在用于检测的分子标签上使用的标记、结合部分的敏感性和可裂解连键被裂解的效率)。

可通过包括对代表样品中总细胞数目和/或样品中特定亚型细胞的数目的细胞或组织靶的测量，来对组织样品直接进行的测量标准化。由于可包含显著级分的正常细胞的患者样品(特别是肿瘤样品)中细胞和组织的异质性，因此附加测量可以是优选的，或者甚至是必要的。

如上所述，可以提供含有多种不同结合化合物的混合物，其中每一种不同的结合化合物具有通过可裂解连键附接的一个或多个分子标签。结合化合物、可裂解连键和分子标签的性质可广泛地变化。结合化合物可包含抗体结合组合物、抗体组合物、抗体、肽、细胞表面受体的肽或非肽配体、蛋白质、寡核苷酸、寡核苷酸类似物诸如肽核酸、凝集素或任何其它分子实体(其能够特异性结合靶蛋白或分子或与目标分析物形成稳定的复合物，诸如活化HER3)。在一个方面，结合化合物可由下式表示：

B-(L-E)_k

其中B是结合部分；L是可裂解连键，以及E是分子标签。在均质测定中，可裂解连键L可以是氧化不稳定的连键，并且更优选地，其为可被单线态氧裂解的连键。或者，其可以是对通过还原例如通过DTT的裂解敏感的连键。部分“-(L-E)_K”表示单个结合化合物可具有通过可裂解连键附接的多个分子标签。在一个方面，k是大于或等于1的整数，但在其它实施方案中，k可以大于数百，例如100至500，或k大于数百至多达数千，例如500-5000。通常地，多种不同类型的结合化合物的每一种具有不同的分子标签E。可通过常规化学的方式将可裂解连键(例如氧化不稳定的连键)和分子标签E附接于B。

在一些实施方案中，B是特异性结合靶(诸如HER3上的抗原决定簇)的抗体结合组成物或抗体组成物。在本文中所示的实施例中提供了特异于HER3表位的抗体。可从多种商购可得的抗体(单克隆或多克隆抗体)容易地形成抗体组成物。具体地，在美国专利号5,677,171、5,772,997、5,968,511、5,480,968、5,811,098(其每一个通过引用整体并入本文)中公开了特异于表皮生长因子受体的抗体。美国专利5,599,681(据此通过引用整体并入)公开了特异于蛋白质的磷酸化位点的抗体。商业供应商，诸如CellSignalingTechnology(Beverly,MA)、BiosourceInternational(Camarillo,CA)和Upstate(Charlottesville,VA)也提供单克隆和多克隆抗体。

可裂解连键L实际上可以是在不降解释放的分子标签E的结构或不影响其检测特征的条件下可被裂解的任何化学连接基团。在某些实施方案中，用于均质测定形式的裂解探针具有可裂解连键L，所述连键被由在短距离上起作用的切割探针产生的裂解剂裂解，从而只有与裂解探针紧邻的可裂解连键被切割。通常地，此类试剂必须通过对反应混合物产生物理或化学变化来激活，从而所述试剂产生寿命短的活性种类，其扩散至可裂解连键而实现裂解。在均质形式中，优选地将裂解试剂附接于结合部分，诸如抗体，所述结合部分在激活之前将所述裂解剂靶向至与具有可释放分子标签的结合化合物邻近的特定位点。

在非均质形式中，因为特异性结合的结合化合物与未结合的结合化合物分离，因此可裂解连键和裂解剂有更广泛选择可供使用。可裂解连键可以不仅包括对与局部作用反应性种类诸如过氧化氢、单线态氧等的反应不稳定的连键，而且还包括对于在整个反应混合物中起作用的试剂不稳定的连键，诸如碱不稳定性连键、光可裂解的连键、可通过还原裂解的连键、可通过氧化裂解的连键、酸不稳定性连键和可通过特定蛋白酶裂解的肽连键。描述许多此类连键的参考文献包括Greene和Wuts,1991,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis，第2版，JohnWiley&Sons,NewYork；Hermanson,1996,BioconjugateTechniques,AcademicPress,NewYork；和美国专利号5,565,324。光可裂解的连键还包括美国专利号5,986,076中公开的那些连键。

在一些实施方案中，商购可得的可裂解试剂系统可用于本发明。在一些实施方案中，裂解探针包含直接裂解可裂解连键以释放标签的化合物。例如，可使用异功能剂诸如可从供应商诸如PierceChemicalCompany(Rockford,IL)获得的N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶二硫基)甲苯(SMPT)等在抗体结合组成物与分子标签之间引入二硫键。通过此类连键引入的二硫键可通过用还原剂诸如二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓醇(DTE)、2-巯基乙醇或硼氢化钠来断裂。实现二硫键裂解的还原剂的常见浓度在约1mM至100mM的范围内。可使用同双功能NHS酯交联剂二琥珀酰亚胺酒石酸酯(DST)(可获自Pierce，其含有对利用高碘酸钠(例如，15mM高碘酸，在生理pH下持续4小时)的裂解易感的中央顺式二醇)在抗体结合组成物与分子标签之间引入氧化不稳定性连键。含有酯化间隔子组件的连键可用强亲核试剂诸如羟胺，例如0.1N羟胺，pH8.5在37℃下3-6小时来裂解。此类间隔子可用可获自Pierce(Rockford,IL)的同双功能交联剂诸如乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸酯)(EGS)来引入。碱不稳定性连键可用砜基团引入。可用于在可裂解连键中引入砜基团的同双功能交联剂包括双[2-(琥珀酰亚胺基氧羰基氧)乙基]砜(BSOCOES)和4,4-二氟-3,3-二硝基苯基砜(DFDNPS)。用于裂解的示例性碱性条件包括，通过加入Tris碱(含6M尿素，0.1％SDS和0.1％SDS)调节至pH11.6的0.1M磷酸钠，于37℃温育2小时。

当L是氧化不稳定的时，L可以是硫醚或其硒类似物；或烯烃，其含有碳-碳双键，其中双键裂解成氧代基团时释放分子标签E。举例说明性的氧化不稳定性连键公开于美国专利号6,627,400和5,622,929中和公开的美国专利申请号2002/0013126和2003/0170915中，所述专利和专利申请的每一个据此通过引用整体并入本文。

当通过气相色谱或质谱进行多个分子标签的分离时，本发明中的分子标签E可包含如以下参考文献中描述的电泳标签：参见，例如，Zhang等人，2002,BioconjugateChem.13:1002-1012；Giese,1983,Anal.Chem.2:165-168；和美国专利号4,650,750；5,360,819；5,516,931和5,602,273，其每一个据此通过引用整体并入本文。

分子标签E优选是相对于活性种类尤其是单线态氧而言稳定的并且包括检测或报告基团的水溶性有机化合物。另外地，E可在尺寸和结构上具有很大的变化。在一个方面，E具有在约50至约2500道尔顿，更优选约50至约1500道尔顿范围内的分子量。E可包含用于产生电化学、荧光或生色信号的检测基团。在使用通过质量进行检测的实施方案中，E可能没有用于检测目的的分开部分。优选地，所述检测基团产生荧光信号。

选择多个分子标签内的分子标签以使得每一个都有相对于同一多个分子标签内的其它成员而言独特的分离特性和/或独特的光学特性。在一个方面，色谱或电泳分离特征是在本领域中常规的一组标准分离条件(例如，电压、柱压力、柱类型、流动相或电泳分离介质)下的保留时间。在另一个方面，光学特性是在给定波长或波长带下的荧光性质，如发射光谱、荧光寿命或荧光强度。优选地，荧光性质是荧光强度。例如，多个分子标签中的每一个可以具有相同的荧光发射特性，但每一个彼此在独特的保留时间上不同。在另一方面，多个分子标签中的一个或两个或更多个分子标签可具有相同的迁移或保留时间，但它们将具有独特的荧光特性，例如光谱上可分辨的发射光谱，从而所述多个分子标签中的所有成员可通过分子分离和荧光测定的组合来区分。

优选地，释放的分子标签通过电泳分离和检测基团的荧光来检测。在此类实施方案中，具有基本相同的荧光特性的分子标签具有不同的电泳迁移率，从而在分离条件下在电泳图谱中形成不同的峰。优选地，在常规筛分基质存在或不存在的情况下通过常规毛细管电泳装置分离本发明的多个分子标签。在电泳分离过程中或之后，通过记录分离的化合物的荧光信号和迁移时间(或迁移距离)或通过构建分子标签的相对荧光和迁移顺序的图表(例如，作为电泳图谱)来检测或鉴定分子标签。优选地，分子标签的存在、不存在和/或量通过使用如由公布的美国专利申请号2003/0170734A1(其据此通过引用整体并入)公开的一个或多个标准来测量。

多个分子标记还可被设计用于通过基于一个或多个物理特性的色谱来分离，所述物理特性包括分子量、形状、溶解度、pKa、疏水性、电荷、极性等，例如，如在公开的美国专利号7,255,999(其据此通过引用整体并入)中公开的。基于参数诸如柱类型、固相、流动相等选择色谱分离技术，随后选择可被分离以在单个操作中形成不同峰或条带的多个分子标签。几个因素决定了哪个HPLC技术被选择用于本发明，包括待检测的分子标签的数量(即，多个分子标签的大小)、将在测定中产生的每一种分子标签的估计的量、合成作为一组待用于多重测定的候选物的分子标签的可获得性和容易性、所采用的检测方式和HPLC仪、柱子和溶剂的可获得性、鲁棒性(robustness)、成本和操作容易性。通常地，适合用于分析有限量的样品和提供最高分辨率分离的柱子和技术是有利。用于制备此类选择的指导可见于文献，诸如，例如，Snyder等，1988,PracticalHPLCMethodDevelopment,JohnWiley&Sons,NewYork；Millner,1999,HighResolutionChromatography:APracticalApproach,OxfordUniversityPress,NewYork；Chi-SanWu,1999,ColumnHandbookforSizeExclusionChromatography,AcademicPress,SanDiego；andOliver,1989,HPLCofMacromolecules:APracticalApproach,OxfordUniversityPress,Oxford,England中。

在一个方面，分子标签E为(M，D)，其中M是调整迁移率的部分，D为检测部分。符号“(M，D)”用于表示M和D部分的排列顺序可以使得任一部分能与可裂解连键L相邻。即，“B-L-(M，D)”指示两种形式中任一个的结合化合物：“BLDM”或“BLMD”。

检测部分D可以是荧光标记或染料、生色标记或染料或者电化学标记。优选地，D是荧光染料。用于本发明的示例性荧光染料包括水溶性罗丹明染料、荧光素、4,7-二氯荧光素、苯并氧杂蒽黄染料和能量转移染料，如在以下参考文献中中公开的：HandbookofMolecularProbesandResearchReagents，第8版.(2002),MolecularProbes,Eugene,OR；美国专利号6,191,278、6,372,907、6,096,723、5,945,526、4,997,928和4,318,846；和Lee等，1997,NucleicAcidsResearch25:2816-2822。优选地，D是荧光素或荧光素衍生物。

在每一种结合化合物被不同的分子标签分别衍生化后，将其与其它结合化合物汇合以形成多个结合化合物。通常地，每一个不同种类的结合化合物以相同的比例存在于组合物中；然而，比例可随设计选择而变化，以使得一种或一个亚组的特定结合化合物以更高或更低的比例存在(这取决于特定实施方案或测定的需要或要求)。可影响这种设计选择的因素包括、但不限于对于特定靶的抗体亲和力和亲合力、靶的相对发生率、分子标签的检测部分的荧光特性等。

在一些实施方案中，裂解诱导部分或裂解剂是产生能够裂解可裂解连键(优选地通过氧化)的活性种类的化学基团。优选地，活性种类是展现短暂活性(以便其裂解诱导作用仅存在于其生成部位的附近)的化学种类。活性种类是固有地短暂的，从而其不会在其生成的附近之外产生显著本底，或使用高效地清除活性种类以使其不可用于在与其生成位点的短距离外与可裂解连键反应的清除剂。举例说明性的活性种类包括单线态氧、过氧化氢、NADH和羟基自由基、苯氧自由基、超氧化物等。引起氧化的活性种类的举例说明性猝灭剂包括多烯类、类胡萝卜素类、维生素E、维生素C、酪氨酸、组氨酸和谷胱甘肽的氨基酸-吡咯N-缀合物。参见，例如，Beutner等，2000,Meth.Enzymol.319:226-241。

设计使用裂解诱导部分和可裂解连键的测定中的一个考虑是，当结合于受体复合物时它们彼此不会相距太远以致于由可裂解诱导部分产生的活性种类不能高效地裂解可裂解连键。在一个方面中，可裂解连键优选地在结合的可裂解诱导部分的约1000nm之内，优选在约20-200nm之内。更优选，对于产生单线态氧的光敏剂裂解诱导部分而言，可裂解连键在受体复合物中在光敏剂的约20-100nm之内。裂解诱导部分可有效地裂解可裂解连键(即，切割足够的分子标签，以产生可检测的信号)的范围在本文中被称为其“有效接近度”。本领域普通技术人员将认识到，特定敏化剂的有效接近度可取决于特定测定设计的细节，并且可通过常规实验来测定或修改。

敏化剂是可被诱导以产生反应性中间体或种类(通常地单线态氧)的化合物。优选地，根据本发明所使用的敏化剂是光敏剂。包括在本发明范围内的其它敏化剂是这样的化合物，其在通过热、光、电离照射或化学活化后被激发时将释放单线态氧的分子。这类化合物的最有名的成员包括内过氧化物诸如1,4-二羧乙基-1,4-萘内过氧化物、9,10-二苯基蒽-9,10-内过氧化物和5,6,11,12-四苯基萘5,12-内过氧化物。加热或这些化合物对光的直接吸收释放单线态氧。其它敏化剂由DiMascio等，1994,FEBSLett.355:287；和Kanofsky,1983,J.Biol.Chem.258:5991-5993；Pierlot等，2000,Meth.Enzymol.319:3-20公开。

可通过共价或非共价键将光敏剂直接或间接地附接于种类特异性试剂的结合剂上。用于构造此类组成物，特别是用于作为结合剂的抗体的指导可在例如光动力疗法、免疫诊断学等领域中的文献中获得。示例性指导可见于Ullman等，1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91,5426-5430；Strong等，1994,Ann.NewYorkAcad.Sci.745:297-320；Yarmush等，1993,Crit.Rev.TherapeuticDrugCarrierSyst.10:197-252；和美国专利号5,340,716、5,516,636、5,709,994和6,251,581。

许多种类的光源可用于光激活光敏剂来产生单线态氧。可使用多色和单色源，只要该源足够强而在实际时间阶段中产生足够的单线态氧即可。照射的长度取决于光敏剂的性质、可裂解连键的性质、照射源的功率及其与样品的距离。一般地，照射的时期可为大于约1微秒至长达约10分钟，通常在约1毫秒至约60秒的范围内。照射的强度和长度应当足以激发至少约0.1％的光敏剂分子，通常至少约30％的光敏剂分子，优选地基本上所有光敏剂分子。示例性光源包括激光器，诸如例如氦氖激光器、氩激光器、YAG激光器、He/Cd激光器和红宝石激光器；光电二极管；汞、钠和氙气灯；白炽灯诸如钨及钨/卤素和闪光灯。适用于本发明方法的示例性光活化装置公开于国际专利公开号WO03/051669中。在此类实施方案中，光活化装置是安装在壳体中的发光二极管(LED)阵列，其允许96孔板中的所有孔同时照明。

可用于本发明的光敏剂的实例是具有上述性质的那些光敏剂和由美国专利号5,536,834、5,763,602、5,565,552、5,709,994、5,340,716、5,516,636、6,251,581和6,001,673；公开的欧洲专利申请号0484027；Martin等，MethodsEnzymol.186:635-645；和Yarmush等，1993,Crit.Rev.TherapeuticDrugCarrierSyst.10:197-252中公开的那些光敏剂。关于敏化剂，在某些实施方案中，可通过共价或非共价地附接于载体的表面或掺入载体的实体内将光敏剂与固相载体结合。一般地，将光敏剂以获得单线态氧的必需量所必需的量与载体结合。通常地，按照常规方法凭经验确定光敏剂的量。

在一个实施方案中，将光敏剂掺入胶乳颗粒以形成光敏剂珠粒，例如，如由美国专利号5,709,994和6,346,384；和国际专利公开号WO01/84157公开的。或者，可通过胶乳上的氯甲基基团将光敏剂诸如玫瑰红共价附接至0.5微米胶乳珠上以提供酯连接基团来制备光敏剂珠粒，如在J.Amer.Chem.Soc.,97:3741(1975)中描述的。可以例如在常规的96孔或384孔微量滴定板等中进行采用胶乳颗粒、光敏剂珠粒的方法，所述微量滴定板具有形成孔的一个壁(例如底部)的过滤膜，其允许通过施加真空来除去试剂。如果结合化合物的特异性结合所需的缓冲液与单线态氧产生或分离所需的缓冲液不同，这允许缓冲液的便利更换。例如，在抗体结合化合物或抗体组合物的情况下，需要高盐缓冲液。如果使用释放的标签的电泳分离，则较好的性能可通过将缓冲液更换为具有适于电泳的较低盐浓度的缓冲液来实现。

作为实例，裂解探针可包含第一半抗原化抗体和利用多个光敏剂分子衍生的第二抗半抗原结合蛋白。优选的第一半抗原化抗体为生物素化的抗体并且优选的第二抗半抗原结合蛋白可以是抗生物素抗体或链霉抗生物素蛋白。此类第一和第二试剂的其它组合在本领域中是公知的。此类试剂的示例性组合由Haugland,2002,HandbookofFluorescentProbesandResearchReagents，第9版，MolecularProbes,Eugene,OR教导。此类试剂的示例性组合如下所述。具有可释放的标签(“mT₁”和“mT₂”)的结合化合物和利用生物素衍生化的第一抗体特异性地结合于膜中的受体二聚体的不同表位。将生物素特异性结合蛋白，例如链霉抗生物素蛋白附接于生物素，从而将多个光敏剂与结合化合物有效靠近。生物素特异性结合蛋白还可以是抗生物素抗体，并且可利用常规偶联化学例如Hermanson(同上)通过蛋白质上的游离胺基附接光敏剂。用于此类用途的示例性光敏剂是如公布的欧洲专利申请0510688中所公开的方法制备的亚甲蓝的NHS酯。

方法以及具体条件和材料的以下一般性讨论是通过举例说明而非限制的方式进行的。本领域普通技术人员将理解可如何改造本文所述的方法以适用于其它应用，特别对于使用不同的样品、细胞类型和靶标复合物的应用。

在进行本发明的方法中，产生测定组分的组合，包括待测试的样品、结合化合物和任选地裂解探针。通常地，可以以任何顺序组合测定组分。然而，在某些应用中，添加的顺序可以是相关的。例如，人们可能希望定量监测竞争性结合或监测组装复合物的稳定性。在此类应用中，可分阶段组装反应物。

每一种试剂的量一般可凭经验来确定。测定中使用的样品的量将通过存在的靶复合物的预测数目以及分离装置和用于监测测定的信号的检测来确定。一般地，可以以相对于样品中靶分子的预期量摩尔量过量的用量，通常以摩尔数过量至少约1.5倍，更理想地过量约10倍或更多倍来提供结合化合物和裂解探针的量。在具体应用中，取决于结合剂的亲和力和存在于单个细胞上的靶分子的预期数目，所使用的浓度可以更高或更低。当测定化合物对寡聚细胞表面复合物的形成的作用时，可在探针添加之前、与之同时或之后将所述化合物添加至细胞，这取决于待监测的作用。

可组合测定混合物，并且在提供探针对细胞表面分子的结合的条件(通常在水性介质中，通常在由在约10至200mM范围内的浓度的缓冲液维持的生理pH(相当于培养细胞的pH值)下)下温育。可使用常规缓冲剂以及必要时其它常规添加剂，诸如盐、生长介质、稳定剂等。通常使用生理恒定温度。温育温度通常在约4℃至70℃，通常地约15℃至45℃，更通常地约25℃至37℃的范围内。

在组装测定混合物并温育(以允许探针结合于细胞表面分子)后，可处理混合物以激活裂解剂来从结合化合物裂解标签，所述结合化合物处于与裂解剂有效接近度内，从而将对应的标签从细胞表面释放至溶液中。该处理的性质将取决于所述裂解剂的作用机制。例如，当将光敏剂用作裂解剂时，裂解的激活可包括以适合于所使用的特定敏化剂的光波长照射所述混合物。

裂解后，随后分析样品以测定已释放的标签的身份。当应用使用多种结合化合物的测定时，通常将在它们的检测之前分离释放的标签。在设计用于测定的标签的过程中确定用于分离和检测的方法。优选的分离模式采用电泳，其中基于它们的电泳迁移率的已知差异分离各种标签。

如上所述，在一些实施方案中，如果测定反应条件可干扰所使用的分离技术，则可能有必要在分子标签的裂解和分离之前除去或更换测定反应缓冲液。例如，测定条件可包括盐浓度(例如，特异性结合所需的)，当基于电泳迁移率分离分子标签时，所述盐浓度会破坏分离性能。因此，可以例如在裂解分子标签之前除去此类高盐缓冲液，并用适合于通过过滤、抽吸、稀释或其它手段进行电泳分离的另一种缓冲液来替代。

在某些实施方案中，可对受试者施用联合治疗，其包括HER3作用剂。联合治疗可包括但不限于HER3-作用剂与对于本领域普通技术人员来说已知的任何化学治疗剂中的一种或多种组合。优选地，化学治疗剂具有与HER3作用剂不同的作用机制。例如，化学治疗剂可以是抗代谢药(例如，5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲氨蝶呤(MTX)、氟达拉滨等)、抗微管剂(例如，长春新碱；长春碱；紫杉烷类诸如紫杉醇和多西紫杉醇等)、烷化剂(例如，环磷酰胺、美法仑、双氯乙亚硝脲等)、铂试剂(例如，顺铂、卡铂、奥沙利铂、JM-216、CI-973等)、蒽环类(例如，阿霉素、柔红霉素等)、抗生素药物(例如，丝裂霉素-C、放线菌素D等)、拓扑异构酶抑制剂(例如，依托泊苷、喜树碱等)或本领域普通技术人员已知的其它任何化学治疗剂。

可用于本发明的各种实施方案(包括本发明的药物组合物、剂型和试剂盒)中的化学治疗剂的具体实例包括、但不限于阿糖胞苷、美法仑、托泊替康、氟达拉滨、依托泊苷、伊达比星、柔红霉素、米托蒽醌、顺铂紫杉醇和环磷酰胺。

可使用的其它化学治疗剂包括阿巴瑞克、阿地白介素、阿仑单抗、阿利维a酸、别嘌呤醇、六甲蜜胺、氨磷汀、阿那曲唑、三氧化二砷、天冬酰胺酶、卡介苗活、贝伐珠单抗、贝沙罗汀、博来霉素、硼替佐米、白消安、卡普睾酮、喜树碱、卡培他滨铂、卡铂、卡莫司汀、塞来考昔、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、西那卡塞、顺铂、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、阿法达贝泊汀、柔红霉素、尼白介素、右雷佐生、多西紫杉醇、阿霉素、屈他雄酮、Elliott′sB液、表柔比星、阿法依伯汀、雌氮芥、依托泊苷、依西美坦、非格司亭、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟维司群、吉西他滨、吉姆单抗奥佐米星、吉非替尼、戈舍瑞林、羟基脲、替伊莫单抗、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、干扰素α-2a、干扰素α-2b、伊立替康、来曲唑、亚叶酸、左旋咪唑、洛莫司汀、氮芥、甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、甲氧沙林、甲泼尼龙、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、诺龙、诺非单抗、奥利默森、奥普瑞白介素、奥沙利铂、紫杉醇、帕米膦酸、培加酶、培门冬酶、培非司亭、培美曲塞、喷司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、聚苯丙生、卟菲尔、甲基苄肼、阿的拉布立酶、利妥昔单抗、沙格司亭、链脲霉素、滑石粉、他莫昔芬、特罗凯、替莫唑胺、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、塞替派、拓扑替康、托瑞米芬、托西莫、曲妥珠单抗、维甲酸、尿嘧啶芥、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春瑞滨和唑来膦酸盐。

在另一个方面，本发明涉及用于确定具有HER3激活癌症的受试者是否不可能对除了HER3-作用剂以外还利用至少一种化学治疗剂的治疗产生响应和/或患者有可能具有短的时间进程的方法。在某些实施方案中，所述方法包括测量来自受试者癌症的生物样品中HER3和/或活化HER3的量，其中，如果HER3和/或活化HER3的水平高或非常高，则所述患者不太可能对除了HER3-作用剂以外还利用至少一种化学治疗剂的治疗产生响应。

在另一个方面，本发明涉及用于确定具有HER3阳性癌症的受试者是否可能对除了HER3作用剂以外还利用至少一种化学治疗剂的治疗产生响应。在某些实施方案中，所述方法包括测量来自受试者癌症的生物样品中的活化HER3的量，其中如果活化HER3的水平高，则所述患者可能对除了HER3作用剂以外还利用至少一种化学治疗剂的治疗产生响应。在某些实施方案中，所述生物样品包括FFPE组织样品。在某些实施方案中，所述癌症是转移性的或复发性的。在一些实施方案中，可监测可能对HER3作用剂敏感的任何癌症。所述HER3作用剂可以是任何HER3作用剂。在某些实施方案中，所述HER3作用剂是本文所述的试剂之一。或者，可评估本领域中已知的其它另外的化学治疗剂。在某些实施方案中，针对总体存活率、至进展的时间和/或使用RECIST标准测量响应的可能性或时间进程。

利用活化HER3测量值的系统

在另一个方面，本发明包括包含下述的系统第一计算设备、与数据库通信的第一计算设备的系统；在第一计算设备上执行的第一应用程序，所述第一应用程序被配置成接收多个受试者的多个实验室测试结果，并将所述多个实验室测试结果存储在数据库中，其中所述多个实验室测试结果包括在来自受试者的肿瘤样品中测量的总HER3的量和HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物的量中的至少一个；第二计算设备，其与数据库通信；和在第二计算设备上执行的第二应用程序，所述第二应用程序被配置成：从数据库查询来自多个受试者的受试者的实验室测试结果；从数据库接收所述受试者的实验室测试结果；至少部分基于对该受试者接收的实验室测试结果确定测试结果，所述测试结果包括从受试者获得的肿瘤样品中总HER3的量和HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物中至少一个比总HER3蛋白的比率；产生受试者的测试结果报告，所述测试结果报告包括肿瘤样品中活化HER3的量，至少部分基于受试者的测试结果；和将患者的测试结果报告发送至第三计算设备。

在一些实施方案中，本发明包括系统，例如，图10中显示的系统1000。系统1000包括各种组件。如本文中所用，术语“组件”被宽泛地定义，包括适合于进行所引述的方法的任何合适的设备或装置的集合。所述组件不需要一体地连接或彼此以任何特定的方式放置。实施方案包括组件彼此之间的任何合适的排列。例如，所述组件不必在同一个房间中。但在一些实施方案中，组件被彼此连接在一个整体单元中。在一些实施方案中，同一部件可以执行多种功能。

系统1000可以包括一个或多个计算设备1001。计算设备1001的典型实例包括通用计算机、打印机、编程的微处理器、微控制器、外围集成电路元件以及能够执行构成本技术的方法的步骤的其它设备或设备排列。

计算设备1001包括内存1004。内存1004可包括随机存取存储器(RAM)和只读存储器(ROM)，以及可移动媒体设备、存储卡、闪存卡等。计算设备1001还可以包括存储设备1014。存储设备1014可以是硬盘驱动器或可移动存储驱动器，诸如软盘驱动器、光盘驱动器等。存储设备1014还可以是用于将计算机程序或其它指令加载至计算设备1001中的其它类似装置。

计算设备1001还包括处理器1002。处理器1002执行一套存储在一个或多个存储元件(例如，内存1004或存储设备1014)中的指令，以处理输入数据。根据需要，存储元件还可保存数据或其它信息。存储元件可以以信息源或物理存储1004元件的形式中存在于处理机中。

计算设备1001通常包括操作系统，其提供用于该计算设备1001的一般管理和操作的可执行程序指令，并且通常将包括存储指令的计算机可读存储介质(例如，硬盘、随机存取存储器、只读存储器等)，当由服务器的处理器执行时，允许计算设备1001进行其预期功能。用于操作系统和计算设备1001的一般功能的合适方式是已知的或是商购可得的，并且由本领域普通技术人员(特别地根据本文的公开内容)来容易地执行。

如上所讨论的，一些实施方案包括被配置来执行计算机可执行程序指令和/或访问存储在内存1004中的信息的处理器1002。所述指令可包括由编译器和/或解析器从以任何合适的计算机编程语言(包括，例如，C、C++、C#、VisualBasic、Java、Python、Perl、JavaScript和ActionScript(AdobeSystems,MountainView,Calif.))编写的代码产生的处理器专用指令。用于通过计算设备1001执行的该组指令可包括指示处理器1002执行特定任务，诸如构成本技术的方法中的步骤的各种命令。该组指令可以以软件程序的形式存在。此外，该软件可以以单个程序的集合、程序模块(具有更大的程序)或程序模块的一部分的形式存在，如在本技术中。该软件还可包括以面向对象编程的形式存在的模块化编程。由处理器处理输入数据可响应于用户命令、先前处理的结果或由另一个处理机做出的请求。

在一些实施方案中，计算设备1001可包括单个处理器1002。在其它实施方案中，计算设备1001包括两个或多个处理器。这样的处理器1002可包括微处理器、数字信号处理器(DSP)、应用专用集成电路(ASIC)、现场可编程门阵列(FPGA)和状态机。此类处理器还可包括可编程电子器件诸如PLC、可编程中断控制器(PIC)、可编程逻辑器件(PLD)、可编程只读存储器(PROM中)、电子性可编程只读存储器(EPROM或EEPROM)或其它类似设备。处理器1002被连接至通信总线1006。通信总线1006可被连接至一个或多个其它组件，例如处理器1002、输入装置(例如，鼠标、键盘、控制器、触摸屏或小键盘)以及输出设备(例如，显示器1008、打印机或扬声器)。

计算设备1001还可以包括网络组件1010。所述网络组件1010允许计算设备1001通过I/O接口连接至一个或多个网络1016和/或其它数据库(例如，数据库1018)。虽然在图10中被描述为单个网络1016，但网络1016可包括任何数目的网络。网络组件1010允许将数据发送至网络1016和/或数据库传或者从其接收所述数据。网络组件1010可包括调制解调器、以太网卡或能使计算设备1001连接至数据库和/或网络1016诸如LAN、MAN、WAN和因特网的任何类似的装置。网络组件1010可包括网络接口。在一些实施方案中，网络接口被配置来用于通过有线或无线通信链接进行通信。例如，网络接口1010可允许经由以太网、IEEE802.111(Wi-Fi)、802.16(Wi-Max)、蓝牙、红外线等在网络上通信。作为另一实例，网络接口可允许在网络诸如CDMA、GSM、UMTS或其它蜂窝通信网络上进行通信。在一些实施方案中，网络接口1010可允许与另一个设备点对点连接，诸如经由通用串行总线(USB)、1394FireWire、串行或并行连接或类似接口。合适的计算设备1001的一些实施方案可包括两个或更多个网络接口1010以用于在一个或多个网络上进行通信。在一些实施方案中，计算设备除了网络接口1010以外还可包括数据库1018或用其代替网络接口1010。

系统1000可包括各种数据存储和如上论述的其它内存和存储介质。它们可以驻留在各种位置，例如在对于一个或多个计算设备1001来说是本地的(和/或驻留于其中的)的或对于网络1016上的任何或所有计算设备1001来说是远程的存储介质上。在特定的一组实施方案中，该信息可驻留在本领域普通技术人员所熟知的存储区域网络(SAN)。类似地，在适当的情况下可本地和/或远程地存储用于执行归功于计算机、服务器或其它网络设备的功能的任何必要文件。

计算设备1001还可包括计算机可读存储介质读取器。计算机可读存储介质读取器可与计算机可读存储介质连接，或者被配置成接收计算机可读存储介质，所述存储介质代表用于暂时和/或更长久地含有、存储、发送和检索计算机可读信息的远程、本地、固定和/或可移动存储设备以及存储介质。系统1000和各种设备通常还包括许多软件应用程序、模块、服务或位于至少一个工作存储设备内的其它元件，包括操作系统和应用程序，诸如客户端应用程序或Web浏览器。应当理解，替代性的实施方案可具有许多来自上述方案的变化。例如，也可使用定制的硬件和/或可在硬件、软件(包括可移植软件，诸如小应用程序)或两者中执行特定元件。此外，可使用至其它计算设备1020、1040，诸如网络输入/输出设备的连接。

用于包含代码或代码的部分的存储介质和计算机可读介质可包括本领域已知的或使用的任何适当的介质，包括存储介质和通信介质，诸如但不限于在用于存储和/或发送信息诸如计算机可读指令、数据结构、程序模块或其它数据的任何方法或技术中执行的易失性和非易失性的、可移动的和非可移动的介质，包括RAM、ROM、EEPROM、闪存或其它存储器技术、CD-ROM、数字式多功能盘(DVD)或其它光盘存储器、磁带盒、磁带、磁盘存储或其它磁存储设备，或可用于存储所需信息且可由系统1000设备访问的任何其它介质。基于本文提供的公开内容和教导，本领域的普通技术人员将理解实现所述各种实施方案的其它方式和/或方法。

计算机可读介质可以包括、但不限于能够提供具有计算机可读指令的处理器的电子、光学、磁或其它存储设备。其它实例包括、但不限于软盘、CD-ROM、DVD、磁盘、存储芯片、ROM、RAM、SRAM、DRAM、内容可寻址存储器(CAM)、DDR、闪速存储器，诸如NAND闪存或NOR闪存、ASIC、已配置的处理器、光存储器、磁带或其它磁存储器，或计算机处理器可从其读取指令的任何其它介质。在一个实施方案，计算设备1001可包括单一类型的计算机可读介质诸如随机存取存储器(RAM)。在其它实施方案中，计算设备1001可包括两个或更多个类型的计算机可读介质诸如随机存取存储器(RAM)、磁盘驱动器和高速缓存。计算设备1001可与一个或多个外部计算机可读介质诸如外部硬盘驱动器或外部DVD驱动器通信。

计算设备1001还可包括I/O组件1012，其可用于促进至输入和输出设备的有线或无线连接。合适的计算设备1001的一些实施方案可包括多个外部或内部设备诸如鼠标器、CD-ROM、DVD、键盘、显示器、音频扬声器、一个或多个麦克风或任何其它输入或输出设备，或与所述外部或内部设备保持通信。例如，计算设备可与各种用户界面设备和显示器1008保持通信。显示器1008可使用任何适当的技术，包括、但不限于LCD、LED、CRT等。

系统1000可以包括许多计算设备1001。例如，在一个实施方案中，系统1000包括一个计算设备1001。在图10所示的实例中，系统1000包括多个计算设备1001、1020、1024、1028、1030。计算设备可具有相同或不同的类型。例如，在一些实施方案中，计算设备1001可以包括台式计算机，而计算设备1024可以包括打印机。此外，在一些实施方案中，计算设备可存在于相同或不同的位置。例如，在图10中所示的实施方案中，一个计算设备1001可现场位于测试中心，而另一个计算设备1028可异地位于医疗保健提供者的办公室。

系统1000还包括数据库1018。所述一个或多个计算设备1001与数据库1018保持通信。在一些实施方案中，数据库可包括例如MySQL数据库。数据库1018可包含可通过一个或多个计算设备(例如，计算设备1001、1020或1028)检索的数据。在一些实施方案中，数据库1018本身可以是计算设备1030的部分。数据库1018可包括与受试者信息、受试者样品信息、参照群体、癌症治疗选择、医疗保健提供者的信息、实验室测试结果和实验室检测报告相关的数据。例如，与受试者相关的数据可包括受试者姓名、地址、电话号码、受试者识别号、与所述受试者相关的提供者、病史(包括，例如，疾病状态诸如癌症状态、HER2状态、先前的测试结果)、药物和/或治疗、亲戚、卫生保健提供者计划、帐户余额、访问信息或与一个或多个受试者相关的其它信息。与受试者样品相关的数据可包括受试者姓名、地址、电话号码、受试者识别号、采集日期、样本类型(例如，收集物的性质、制备方法)，疾病状态(如癌症类型，包括HER2状态或其它生物标志物状态；其它状态)、中心检测实验室结果、样品的处理/分析日期、实验室测试结果、与受试者相关的提供者、病史(包括，例如，疾病状态诸如癌症状态、HER2状态、先前的测试结果)、药物和/或治疗、亲戚、医疗保健提供者计划、帐户余额、访问信息或与一个或多个受试者相关的其它信息。与参照群体相关的数据可包括参照群体受试者信息、参照群体受试者样品的信息以及与临床研究参与相关的信息、来自参考群体受试者的肿瘤样品中测量的总HER3的中位数量和HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物的中位数量中的至少一个，和获自对照群体受试者的肿瘤样品中HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物对总HER3蛋白的至少一个的中位数比率。可包括每一个单独的受试者和作为整体的参照群体的数据。在一些实施方案中，参照群体包括具有与受试者相同类型的癌症的受试者。与医疗保健提供者相关的数据可包括姓名、地址、电话号码、人员、用户名、密码、其它安全信息、访问级别和与一个或多个提供者相关的信息。与实验室测试结果相关的数据可包括在来自多个受试者的肿瘤样品中测量的总HER3的量中以及HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物的量的至少一个，并且还可包括获自受试者的肿瘤样品中HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物比总HER3蛋白的至少一个的比率。与测试结果报告相关的数据可包括肿瘤样品中活化HER3的量并且至少部分基于受试者的测试结果，包括在来自多个受试者的肿瘤样品中测量的总HER3的量以及HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物的量中的至少一个，获自多个受试者的肿瘤样品中的HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物比总HER3蛋白的至少一个的比率，和参照群体信息。

在一些实施方案中，系统1000可以执行一个或多个应用程序。可在任何数目的计算设备(例如，计算装置1001、1020、1024、1028或1030)上执行所述所述一个或多个应用程序。在一些实施方案中，系统1000可以执行被配置来接收多个实验室测试结果的应用程序。在一些实施方案中，多个实验室测试结果可以是针对多个受试者。在其它实施方案中，多个实验室测试结果可以是针对单个受试者。系统1000可将多个实验室测试结果存储在数据库1018中。

系统1000还可以执行被配置为查询数据库1018以获得与一个或多个受试者相关的实验室测试结果的应用程序。系统1000可至少部分地基于对一个或多个受试者的接收实验室测试结果确定测试结果。在一些实施方案中，测试结果可包括在获自受试者的肿瘤样品中测量的总HER3量和HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物中至少一个的量。在一些实施方案中，测试结果可包括在获自受试者的肿瘤样品中测量的总HER3的量以HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物比总HER3蛋白的至少一个的比率。

在一些实施方案中，基于测试结果，系统1000可产生一个或多个受试者的测试结果报告。测试结果报告可以包括，例如，肿瘤样品中活化HER3的量。在一些实施方案中，测试结果报告可包括肿瘤样品中活化HER3的量并且至少部分地基于针对所述一个或多个受试者的测试结果。例如，在一些实施方案中，测试结果报告可包括获自所述一个或多个受试者的肿瘤样品中测量的总HER3的量和HER-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物中至少一个的量，获自所述一个或多个受试者的肿瘤样品中测量的HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物比总HER3蛋白中至少一个的比率，和/或具有与受试者相同类型的癌症的受试者参照群体中HER3蛋白的中位数量和HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物比总HER3蛋白中至少一个的中位数比率。在一些实施方案中，通过将获自受试者的肿瘤样品中总HER3的量和HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物比总HER3中至少一个的比率与受试者参照群体中HER3的中位数量和HER-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物比总HER3蛋白中至少一个的中位数比率相比较来产生测试结果报告。在一些实施方案中，参照群体包含具有与受试者相同类型的癌症的受试者。

在一些实施方案中，测试结果报告包括以下信息：如果(i)样品中总HER3的量高于参照群体的总HER3的中位数量和(ii)样品中的HER-HER3异二聚体比总HER3、磷酸化的HER3比总HER3或HER3/PI3K复合物比总HER3中至少一个的比率高于参照群体中的HER-HER3异二聚体比总HER3、磷酸化的HER3比总HER3或HER3/PI3K复合物比总HER3中至少一个的中位数比率，则来自受试者的肿瘤样品具有高量的活化HER3。在一些实施方案中，测试结果报告包括以下信息：如果来自受试者的肿瘤样品被表征为具有高水平的活化HER3，则受试者更可能对HER3靶向治疗产生响应，其中高水平的活化HER3包括：(i)来自受试者的肿瘤样品中的总HER3的量高于具有与所述受试者相同类型的癌症的受试者参照群体的总HER3的中位数量和(ii)肿瘤样品中的HER2-HER3同二聚体的量比总HER3的量、磷酸化的HER1的量比总HER3的量或HER3-PI3K复合物的量比总HER3的量中至少一个的比率高于具有与所述受试者相同类型的癌症的受试者参照群体中的HER2-HER3同二聚体的量比总HER3的量、磷酸化的HER3的量对总HER3的量或HER3-PI3K复合物的量比总HER3的量中至少一个的中位数比率。在一些实施方案中，测试结果报告可包括关于HER3靶向药物的信息。

在一些实施方案中，试验结果报告还可包括在来自受试者的样品中测量的总HER2蛋白的量。测试结果报告从而可包括受试者是否具有HER2阳性癌症或HER2阴性肿瘤的信息。在一些实施方案中，已通过免疫组织化学或原位杂交分析(例如，在集中式测试实验室)鉴定了所述HER2阴性癌症和HER2阳性癌症。在一些实施方案中，测试结果报告还可包括以下信息：如果受试者具有HER2阳性癌症，则包含HER-2靶向治疗和HER3靶向治疗的综合疗法将是适当的疗法。在一些实施方案中，测试结果报告还可包括这样的信息，所述信息指示如果受试者具有HER2阳性癌症，则所述受试者更可能对HER2靶向剂和HER3靶向剂的综合疗法产生响应。在某些实施方案中，测试结果报告还可包括以下信息：受试者样品中的总HER2蛋白的量是否低于第一截断值(所述第一截断值包含对应于HER2阳性癌症的参照群体中的总HER2蛋白表达的底部第五百分位的总HER2蛋白水平)(即，HER2阴性)，总HER2蛋白的量是否高于第二截断值(所述第二截断值包含对应于HER2阴性癌症参照群体中总HER2蛋白表达的顶部第95百分位的总HER2蛋白水平)(即，HER2阳性)，或总HER2蛋白的量是否高于第一截断值但低于第二截断值(即，HER2阳性)。在某些实施方案中，测试结果报告还可包括以下信息：如果肿瘤样品中的总HER2蛋白的量高于第一截断值，则包含HER-2靶向治疗和HER3靶向治疗的综合疗法将是用于受试者的适当的治疗。在某些实施方案中，测试结果报告还可包含这样的信息，所述信息指示如果生物样品中的总HER2蛋白的量高于第一截断值，则受试者更可能对HER2靶向剂和HER3靶向剂的综合疗法产生响应。在一些实施方案中，测试结果报告可包括关于HER3靶向药物和/或HER2靶向药物的信息。

在一些实施方案中，系统1000可发送测试结果报告。在一些实施方案中，系统1000可将测试报告发送至计算设备，例如计算设备1020。在一些实施方案中，系统1000可将测试结果报告发送至一个或多个接收者。在一些实施方案中，接收者可以是受试者或医疗保健提供者。在一些实施方案中，所述系统可通过电子邮件(例如，与受试者的医疗保健提供者关联的电子邮件帐户)、SMS或文本信息发送测试结果报告。

在一些实施方案中，系统1000可将测试结果报告存储在数据库1018中。此外，系统1000可将电子通知提供给计算设备1028。可将计算设备1028与医疗保健提供者1026相关联，所述医疗保健提供者可与所述受试者关联。在一些实施方案中，电子通知可包括电子邮件、文本消息或推送通知。电子通知可指示测试报告已可获得，例如可以从数据库1018下载。

利用活化HER3测量值的方法

本发明的其它方面包括以下方法，所述方法包括：接收数据库中的多个实验室测试结果，其中所述多个实验室测试结果包括在来自受试者的肿瘤样品中测量的总HER3的量以及HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物的量中的至少一个；将所述多个实验室测试结果存储在数据库中；查询数据库中来自所述多个受试者的受试者的实验室测试结果；接收来自数据库的所述受试者的实验室测试结果；部分地基于所接收的对于该受试者的实验室测试结果确定测试结果，所述测试结果包括获自所述受试者的肿瘤样品中总HER3的量和HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物比总HER3蛋白中至少一个的比率；产生受试者的测试结果报告，所述测试结果报告包括肿瘤样品中的活化HER3的量并且至少部分基于受试者的测试结果；和将受试者的测试结果报告发送至计算设备。

图11是用于根据一个实施方案进行用于通过检测HER3激活来促进癌症的诊断、预后和治疗的方法的步骤流程图。在一些实施方案中，可在由处理器例如通用计算机、移动设备或服务器中的处理器执行的程序代码中执行图11中的步骤。在一些实施方案中，这些步骤可由一组处理器来执行。在一些实施方案中，图11所示的一个或多个步骤可被省略或以不同的顺序进行。类似地，在一些实施方案中，还可进行图11中未显示的其它步骤。参照上文中关于图10中所示的系统1000所描述的组件来描述下面的步骤。

方法1100始于步骤1102，此时处理器1002接收多个受试者的多个实验室测试结果。在一些实施方案中，所述多个实验室测试结果可包括在来自该多个受试者的肿瘤样品中测量的总HER3的量和HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物的量中的至少一个。

方法1100继续进行至步骤1104，此时处理器1002将所述多个实验室测试结果存储在数据库1018中。在一些实施方案中，处理器1002可通过LAN、WAN或因特网与数据库1018保持通信。在其它实施方案中，数据库1018对于装有处理器1002的计算设备1001来说可以是内部的，并且处理器1002可通过总线1006或其它硬件配置与数据库1018保持通信。处理器1002可将与多个实验室测试结果相关的数据发送至数据库1018。

方法1100继续进行至步骤1106，此时处理器1002查询数据库1018以获得来自所述多个受试者的受试者的实验室测试结果。处理器1002可通过将一个或多个命令发送至数据库1018(和/或装有数据库1018的计算设备1030)来查询数据库。装有数据库1018的计算设备1030可进行一个或多个步骤，以从数据库1018检索实验室测试结果数据。此外，装有数据库1018的计算设备1030可将查询的实验室测试结果数据发送到处理器1002。

方法1100继续进行至步骤1108，此时处理器1002从数据库1018接收受试者的实验室测试结果。在一些实施方案中，处理器1002可通过LAN、WAN或因特网连接接收实验室测试结果数据。在一些实施方案中，处理器1002可将实验室测试结果的数据存储在内存1004中。

方法1100继续进行至步骤1110，此时处理器1002至少部分地基于接收的受试者的实验室测试结果确定测试结果。在一些实施方案中，测试结果可包括与受试者相关的肿瘤样品中的活化HER3的量。在一些实施方案中，处理器1002可至少部分地基于接收的受试者的实验室测试结果确定测试结果，所述测试结果包括总HER3的量和HER2/HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物的量中至少一个，并且还可包括获自受试者的肿瘤样品中HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物比总HER3蛋白中至少一个的比率。在一些实施方案中，处理器1002还可测定关于参照群体中活化HER3的量的信息，如通过HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物比总HER3蛋白中至少一个的比率测量的。例如，在一些实施方案中，处理器1002可测定在获自受试者的肿瘤样品中测量的总HER3的量和HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物比总HER3蛋白中至少一个的比率。在一些实施方案中，处理器1002还可以测定在获自受试者的肿瘤样品中测量的HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物比总HER3蛋白中至少一个的比率。在一些实施方案中，处理器1002可将获自受试者的肿瘤样品中的总HER3的量和HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物比获自受试者的肿瘤样品中测量的总HER3蛋白中至少一个的比率，与具有与所述受试者相同类型的癌症的受试者参照群体中的HER3的中位数量和HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物比总HER3蛋白中至少一个的中位数比率相比较。

方法1100继续进行至步骤1112，此时处理器1002产生受试者的测试结果报告，所述测试结果报告包括肿瘤样品中的活化HER3的量。测试结果报告可包括关于活化HER3的量的另外的测定信息。在一些实施方案中，测试结果报告可包括肿瘤样品中的活化HER3的量，并且至少部分地基于受试者的测试结果。例如，在一些实施方案中，测试报告可包括在获自受试者的肿瘤样品中测量的总HER3的量和HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物中至少一个的量，在获自受试者的肿瘤样品中测量的HER-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物比总HER3蛋白中至少一个的比率，和/或具有与所述受试者相同种类的癌症的受试者参照群体中的HER3的中位数量和HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物比总HER3蛋白中至少一个的中位数比率。在一些实施方案中，测试结果报告包括以下信息：如果(i)样品中的总HER3的量高于参照群体的总HER3的中位数量和(ii)样品中的HER2-HER3异二聚体比总HER3、磷酸化的HER3比总HER3、或HER3/PI3K复合物比总HER3中至少一个的比率高于参照群体中的HER2-HER3异二聚体比总HER3、磷酸化的HER3比总HER3、或HER3/PI3K复合物比总HER3中至少一个的中位数比率，则来自所述受试者的肿瘤样品具有高含量的活化HER3。在一些实施方案中，测试结果报告包括以下信息：如果来自受试者的肿瘤样品被表征为具有高水平的活化HER3，则所述受试者更可能对HER3靶向治疗产生响应，其中高水平的活化HER3包括(i)来自受试者的肿瘤样品中的总HER3的量高于具有与所述受试者相同类型的癌症的受试者参照群体的总HER3的中位数量，和(ii)肿瘤样品中的HER2-HER3同二聚体的量比总HER3的量、磷酸化的HER1的量比总HER3的量、或HER3-PI3K复合物的量比总HER3的量中至少一个的比率高于具有与所述受试者相同类型的癌症的受试者参照群体中的HER2-HER3同二聚体的量比总HER3的量、磷酸化的HER3的量比总HER3的量、或HER3-PI3K复合物的量比总HER3的量中至少一个的中位数比率。在一些实施方案中，测试结果报告可包括关于HER3靶向药物的信息。

在一些实施方案中，测试结果报告还可包括在来自受试者的样品中测量的总HER2蛋白的量。测试结果报告从而可包括受试者是否具有HER2阳性癌症或HER2阴性癌症的信息。在一些实施方案中，已通过免疫组织化学或原位杂交分析(例如，在集中式测试实验室)表征了HER2阴性癌症和HER2阳性癌症。在一些实施方案中，测试结果报告还可包括信息：如果受试者具有HER2阳性癌症，则包含HER-2靶向治疗和HER3靶向治疗的综合疗法将是适当的治疗。在一些实施方案中，测试结果报告还可包括信息，所述信息指示如果受试者具有HER2阳性癌症，则所述受试者更可能对HER2靶向剂和HER3靶向剂的综合疗法产生响应。在某些实施方案中，测试结果报告还可包括以下信息：受试者样品中总HER2蛋白的量是否低于第一截断值(所述第一截断值包含对应于HER2阳性癌症的参照群体中的总HER2蛋白表达的底部第五百分位的总HER2蛋白水平)(即，HER2阴性)，总HER2蛋白的量是否高于第二截断值(所述第二截断值包含对应于HER2阴性癌症的参照群体中总HER2蛋白表达的顶部第95百分位的总HER2蛋白水平)(即，HER2阳性)，或总HER2蛋白的量是否高于第一截断值但低于第二截断值(即，HER2阳性)。在某些实施方案中，测试结果报告还可包括信息：如果肿瘤样品中的总HER2蛋白的量高于第一截断值，则包含HER-2靶向治疗和HER3靶向治疗的综合疗法将是用于该受试者的适当的治疗。在某些实施方案中，测试结果报告还可包含信息，所述信息指示如果生物样品中的总HER2蛋白的量高于第一截断值，则受试者更可能对HER2靶向剂和HER3靶向剂的综合疗法产生响应。在一些实施方案中，测试结果报告可包括关于HER3靶向药物和/或HER2靶向药物的信息。

方法1100继续进行至步骤1114，此时处理器1002将受试者的测试结果报告存储在数据库1018中。处理器1002可将与测试结果报告相关的数据发送到数据库1018。在一些实施方案中，医疗保健提供者(例如，患者的医疗保健提供者)可以能够访问存储的测试结果报告。例如，在一些实施方案中，医疗保健提供者可以能够直接或间接查询数据库1018。

方法1100继续进行至步骤1116，此时处理器1002为计算设备1028提供电子通知。所述电子通知可指示测试报告可获得，例如可以从数据库1018下载。在一些实施方案中中，计算设备1028可与医疗保健提供者1026或受试者相关联。在一些实施方案中，所述电子通知可包括电子邮件、文本消息或推送通知。

方法1100继续进行至步骤1118，此时处理器1002将受试者的测试结果报告发送至计算设备1020。在一些实施方案中，处理器1002可将测试结果报告发送至与受试者相关的计算设备1020。在一些实施方案中，处理器1002可将测试结果报告发送至与医疗保健提供者相关联的计算设备1026。在一些实施方案中，处理器1002可通过电子邮件(例如，与受试者的医疗保健提供者关联的电子邮件帐户)、SMS或文本消息发送测试结果报告。

应当理解，前述内容涉及本发明的某些实施方案，并且可在不背离本发明的范围的情况下做出许多变化。本发明通过下列实施例来进一步举例说明，不以任何方式将所述实施例解释为对其范围施加限制。相反，应清楚地理解，可能具有各种其它实施方案、修改及其等同物，本领域技术人员在阅读本文的描述后可以预见它们而不脱离本发明的精神和/或所附权利要求的范围。

本申请中提及的所有印刷专利和出版物据此通过引用整体并入本文。

实施例

通过参考以下非限制性实施例可更好地理解本发明。

实施例1

组织样品

对56个乳腺肿瘤样本进行了评估：38个购自Asterand,Inc.(Detroit,MI)，以及18个获自AstraZeneca。这些样品已被表征为HER2阳性或HER2阴性，如通过IHC测定的。大部分样品是导管癌。将测定用于测量这些样品中的总HER2蛋白，并使用实施例7中所述的截断值将它们表征为HER2阳性(n＝24)、HER2阴性(n＝27)，和不明确的(n＝5)。

实施例2

固定、处理和石蜡包埋

将所有组织(0.3-1.0gm)在切下后15-30分钟内固定或快速冷冻。如由供应商的标准操作程序所指示的，将所有组织在中性缓冲的福尔马林(10％NBF)中等同地固定，这与用于制备用于HER2测试的乳腺肿瘤组织的ASCO/CAP指导和用于HER3固定(即，10％NBF，在4℃持续约24小时)的其它方法一致。独立研究已经显示，在以类似方式收集和处理的异种移植肿瘤中表达的磷酸化的HER的保存(Mukherjee等人，2011)。

将所有细胞系在37℃和5％CO₂下维持在Dulbecco’smodifiedEagle培养基(DMEM)：F12(50:50)，10％FBS，1％PSQ(10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素)和2mML-谷氨酰胺中。对于每一个细胞系，将细胞在至少10个150-mm培养板皿上生长至接近汇合。在除去培养基后，将细胞用冷的1×PBS洗1次，并将15ml10％NBF(中性缓冲福尔马林)添加至每一个板。将细胞在4℃固定过夜(>16小时)。在除去固定剂溶液后，通过用残留固定液刮取而收获细胞并以3200×g离心15分钟。将细胞沉淀物转移至橡胶O型环，用滤纸包裹，并放置在处理盒中。将自动Tissue-Tek处理器用于脱水和石蜡输注处理。简而言之，将细胞沉淀与递增浓度的酒精、Clear-Rite清除剂(二甲苯替代品)和石蜡接触。处理后，使用石蜡包埋台将细胞沉淀物包埋在块中。用于细胞沉淀处理的所有溶剂获自Richard-AllenScientific。

实施例3

切片术

用切片机(LEICA)切取5μm厚的切片，并将其置于标记了序号的带正电荷的载玻片(VWR)上。将载玻片风干30分钟，随后在设置在60℃的加热烘箱中烘烤1小时。在4℃储存所有样品载玻片以供将来测定。对于每一个样品，用苏木精和伊红(H&E)对一个载玻片染色，并由病理学家检查其肿瘤内容物。鉴定非肿瘤成分并将其大块切掉以提供≥70％的肿瘤富集。

实施例4

抗体缀合物试剂

使用针对HER2的胞内结构域、HER3的胞内结合域和HER3的磷酸化酪氨酸1289的单克隆抗体被使用。针对HER2和HER3的第一抗体和其它试剂购自Labvision(HER2目录号：MS-325和MS-599，HER3目录号：MS-310)；CellSignaling(HER2目录号：2165；磷酸-HER3pY1289目录号：4791)；Millipore(PI3K(Ab6)目录号：05-212)和SouthernBiotech(山羊抗-小鼠IgG目录号：1030-01，山羊F(ab’)2抗-兔IgG目录号：4052-01)。单克隆抗体B9A11是由MonogramBiosciences(CA)针对HER3产生的专利单克隆抗体(ATCC号PTA-10574)。

按照例如上文中和美国专利号7,105,308和7,255,999(其通过引用整体并入)中描述的方案，合成并纯化缀合有报告分子(Pro11和Pro125)和缀合有链霉抗生物素蛋白的亚甲蓝(“分子剪刀”)。按照制造商的方案使用磺基-NHS-LC-LC-生物素(Pierce)作为接头制备缀合有报告分子的抗体和缀合有生物素的抗体，并通过HPLC(安捷伦)纯化缀合产物。在某些实验中，将报告分子或生物素缀合于第一抗体。取决于测定形式，将报告分子或生物素缀合于结合第一抗体的第二抗体。

在以下描述的实验中，将报告分子Pro11在测定中用于测量HER2、HER3、HER2-HER3异二聚体、HER3pY1289和HER3/PI3K复合物。用于检测HER-HER3异二聚体的测定形式使用未缀合的第一抗HER3小鼠单克隆抗体(B9A11)和未缀合的第一抗HER2兔单克隆第一抗体。随后通过缀合了报告分子Pro11的第二抗体山羊抗小鼠IgG和缀合了生物素的第二山羊F(ab’)2抗兔IgG的结合分别检测这些第一抗体的靶结合。用于HER3/PI3K复合物的检测的测试形式包括将生物素缀合于抗HER3抗体B9A11，和将报告分子Pro11缀合于p85-PI3K抗体(Ab6)。在HER3/PI3K复合物测定形式中未使用第二抗体。

实施例5

测定

各种测定形式示于图1中。可改进测定形式以使用福尔马林固定、石蜡包埋的(FFPE)组织样品(小图A)或组织裂解液样品(小图B)。另外，可使用光释放形式(小图A和B)或使用还原形式(例如使用DTT)(小图C)来从与它们结合的抗体切割报告分子。在光释放形式中，扩散的反应性单线态氧例如响应于通过光(“hv”)对裂解诱导剂的光诱导来裂解报告分子与HER3抗体之间的共价连接子。在还原形式中，还原剂诸如例如DTT可用于裂解报告分子与HER3抗体之间的共价连接子。裂解后，可进行毛细管电泳(CE)分离来分离出裂解的报告分子(标签)，其可在电泳图谱中被可视化。所得电泳图谱的x轴显示裂解的报告分子从毛细管(即，基于电泳迁移率)洗脱的时间，并且荧光强度显示在y轴上。当将测定格式化来检测不止一种蛋白靶的量或存在情况时，可将靶特异性抗体缀合于具有不同电泳迁移率的报告分子，以使得可在电泳图谱上鉴定和定量每一种标签。

以下方法描述了可用于测量生物样品中的生物标志物水平的一般光释放测定。

通常如(Sperinde等人，2010,Clin.CancerRes.16(16):4226-4235；Shi,Y.，等人，2009,Diagn.Mol.Pathol.18(1):11-21)中一样进行脱蜡和抗原修复。使用一系列溶剂对FFPE样品进行脱石蜡/再水化。简言之，将载玻片依次浸渍在二甲苯(2×，5分钟)、100％乙醇(2×，5分钟)、70％乙醇(2×，5分钟)和去离子水(2×，5分钟)中。使用微波炉(SpacemakerII，GE)，在含有250mL的1×柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)(LabVision)的培养皿中进行再水化样品的热诱导的表位修复(在功率10下进行3分钟，随后在功率3下进行10分钟)。在于室温冷却20分钟后，用去离子水漂洗载玻片一次。使用疏水笔(Zymed)在载玻片上于切片周围画上疏水圈以将试剂保留在载玻片上。随后用含有1xPBS中的1％小鼠血清、1.5％BSA以及蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Roche)的混合物的封闭缓冲液封闭样品，持续1小时。

在利用抽吸除去封闭缓冲液后，添加在封闭缓冲液中制备的缀合有报告分子和生物素的抗体的混合物，并将结合反应物在湿盒中于4℃振荡下温育过夜。抽吸抗体混合物，用在1XPBS中含有0.25％TritonX-100的缓冲液洗涤样品，并添加1xPBS中的浓度为2.5μg/mL的缀合有链霉抗生物素蛋白的亚甲蓝。使用两个细胞系和乳腺组织样品基于信号特异性和测定动态范围最优化全部抗体和链霉抗生物素蛋白-光敏剂缀合物的浓度。在于室温培养1小时后，抽吸链霉抗生物素蛋白-亚甲蓝试剂，并在洗涤缓冲液中洗涤样品一次，随后进行3次去离子水的更换。将含有3pM荧光素的照明缓冲液和0.01xPBS中的两个CE内部标志物(MF和ML)添加在样品切片上。使用配备有电子冰块/冷却器块(TorreyPineScientific)的内部LED阵列照明装置通过光激活裂解在～4℃下释放结合的报告分子。从上述载玻片上的组织切片收集含有释放的报告分子的CE样品，随后分离CE样品中的释放的报告分子，并在30℃下于6kV和50秒的CE注射条件下在ABI3100CE仪(22-cm毛细管阵列)上对其进行检测。

还原(DTT)释放测定形式式是类似的，但具有以下一般差异。在通过抽吸除去封闭缓冲液后，将在封闭缓冲液中含有生物标志物特异性抗体(例如，HER3抗体)的溶液添加至载玻片，并在4℃于湿盒中在温和摇动的条件下放置过夜。抽吸抗体溶液，并将样品用含有0.25％TritonX-100的PBS洗涤5分钟，然后用单独的PBS洗涤5分钟。抽吸后，添加封闭缓冲液中的用报告分子标记的第二抗体。将第二抗体在室温下于湿盒中温育1.5小时。然后将载玻片用去离子水，随后用含有0.25％TritonX-100的PBS漂洗5分钟。随后将载玻片装入机架和浸没在去离子水中6次。在将载玻片离心后，将100μL捕获缓冲液(于0.01×PBS中含有1.0mM二硫苏糖醇(DTT)、3pM荧光素和两种CE内部标志物(MF和ML))添加在样品切片上。将载玻片在湿盒中温育2小时以允许报告分子释放。将捕获缓冲器从每一个载玻片转移至CE96孔板，随后在不含DTT的捕获缓冲液中适当地稀释(通常为10倍)。分离CE样品中的释放的报告分子，并在6kV和50秒的CE注射条件下于ABI3100CE仪(22-cm毛细管阵列，AppliedBiosystems)上对其进行检测。

可使用与如上所述类似的测定(但使用蛋白质特异性抗体)来检测本文所述的生物标志物。这些测定在下文表1中得以鉴定。这些测定的每一个使用具有1XPBS中的10％山羊血清(Sigma)、1mg/mlhIgG(Sigma)、1.5％BSA以及蛋白酶和磷酸酶抑制剂的混合物(Roche)的封闭级缓冲液。在表1中也指示了用于这些测定的缀合有报告分子和生物素的抗体的浓度。

用于不同测定形式的读出值是RPAxIBxBNF/TA。如下定义该读出值：RPA＝通过毛细管电泳纯化和定量的所释放的VeraTag相对于校正恢复的内部标准(例如，荧光素峰面积)的荧光相对峰面积；IB＝在荧光标签的光激活和释放过程中使用的照明缓冲液的体积；BNF＝从每一批中测定的对照细胞系获得的用于就批间信号变化进行标准化的批标准化因子；TA＝通过利用H&E染色的测定后染色测定的和由被许可的病理学家测量的样品肿瘤面积。这用于将荧光测定信号针对肿瘤的量进行标准化。

实施例6

测定的批次一致性

由于所评估的肿瘤样品的数目，对成批的肿瘤样品进行测定。也评估每一批的细胞系对照以标准化批之间的测量。肿瘤样品的生物标志物测量的散点图示于图2中。每一个样品的荧光强度示于y轴上，以相对峰面积(RPA)测量。对照细胞系测量值在每一个图的左侧上，肿瘤样品测量值在每一个图的右侧上。实点表示信号，空心点表示本底。

图2中的小图A和B分别显示来自测量总HER2和HER3的水平的测定的结果。图2的小图C、D和E分别显示来自测量活化HER3，尤其是HER2-HER3异二聚体、在酪氨酸1289上被磷酸化的HER3(磷酸化的-HER3)和HER3/PI3K复合物的水平的测定的结果。

发现细胞系对照的测量值在批之间是一致的，这表明测定测量值在批间的分析重现性。

实施例7

使用HER2测定表征肿瘤

先前按照Huang等，Am.J.Clin.Pathol.134:303-311(2010)中描述的方法对基于总HER2水平表征肿瘤样品的测定建立了截断值。使用测定(MonogramBiosciences,CA)来测定1,090个乳腺癌样品的总HER2表达，所述乳腺癌样品先前已在中心测试机构使用免疫组织化学(IHC)和/或原位杂交(ISH)(即，FISH阳性，IHC3+评分，或IHC2+和FISH+)，按照当前的临床标准指导表征为HER2阳性或HER2阴性。该数据在图3中显示为散点图。将HER2阳性的截断值设置为大于(高于)通过参考法分类为HER2阴性的样品(IHC0，IHC1+或IHC2+/ISH-或ISH-)的HER2表达的第95百分位的表达。将HER2阴性的截断值设置为小于(低于)通过参考法分类为HER2阳性的样品(IHC3+或IHC2+/ISH+或ISH+)的HER2表达的第5百分位的表达。HER2不明确状态被设置为落在HER2阳性样品的第5百分位截断值与HER2阴性样品的第95百分位截断值之间(即，两个截断值之间)的重叠区的表达水平。

实施例8

HER2阳性与HER2阴性乳腺癌之间的生物标志物水平不同

显示乳腺肿瘤样品中不同生物标志物的量的图表示于图4中。所评估的生物标志物为：总HER2(H2T)、总HER3(H3T)、HER2-HER3异二聚体(H23D)、在酪氨酸1289上磷酸化的HER3(磷酸化的-HER3)和HER3/PI3K复合物(HER3-PI3激酶)。参见图4，分别为小图A-E。使用如实施例5中描述的测定来测量生物标志物水平。使用分散法将生物标志物水平绘图。样品数目被标示于x轴上，测定读出值(RPAxIBxBNF/TA)示于y轴上。进行Mann-Whitney统计分析以确定HER2阴性癌症与HER2阳性癌症之间的平均生物标志物水平是否不同。HER3的分布和中位数水平在高和低HER2乳腺肿瘤中相似时，但当与低HER2肿瘤相比较时，测量为HER2-HER3异二聚体和磷酸化的HER3的活化HER3的分布和中位数水平在高HER2乳腺肿瘤中显著更大，这支持了HER2在HER3信号传导中的主要作用。

实施例9

生物标志物水平关联和Spearman相关系数分析

进行生物标志物水平的统计分析以确定每一个生物标志物的水平是否与肿瘤样品中的任何其它生物标志物的水平相关。使用如实施例5中描述的测定来测量生物标志物水平。进行Spearman秩相关检验分析以鉴定生物标志物的每一个成对比较的Spearman秩相关系数(Spearman’srankcorrelationcoefficient)(Spearman)和p值。

举例说明图3中测量的标志物(高对比低的总HER2)与活化HER3之间的统计关系水平的图表示于图5中。小图A显示HER2-HER3异二聚体与总HER2之间的相关性。小图B显示HER2-HER3异二聚体与总HER3之间的相关性。小图C显示HER2-HER3异二聚体与磷酸化的HER3之间的相关性。虽然在HER2-HER3异二聚体与总HER2之间以及HER2-HER3异二聚体与总HER3之间存在显著的相关性，但对于总HER2，相关性更大(Spearmanr＝0.8641对比0.3572)，从而支持HER2在HER3信号传导中的主要作用。HER2-HER3异二聚体与磷酸化的HER3之间的显著的总体相关性在给定的样品中是一致的，如通过两个不同方法测量的。

举例说明图3中测量的标志物3(高对比低的总HER2)与磷酸化的HER3之间的统计关系的图表示于图6中。小图A显示磷酸化的HER3与总HER2之间的相关性。小图B显示磷酸化的HER3与总HER3之间的相关性。在两种情况下，磷酸化的HER3与总HER2之间以及磷酸化的HER3与总HER3之间的总体相关性都是显著的，然而，通过磷酸化的HER3测量的HER3活化与总HER2的相关性比与总HER3的相关性更密切(Spearmanr＝0.7291；p<0.0001对比0.2865；p<0.0307)。概述该统计分析的结果的表示于图7中(小图A：所有样品；小图B：HER2阴性样品；小图C：HER2阳性样品)。具有显著p-值(p<0.05)的Spearman秩相关系数加以下划线。

实施例10

举例说明标志物水平的相关性的热图

使用测定来测量生物标志物水平，并将其绘制于热图上以确定每一种癌症的一个亚组样品是否可被鉴定为具有高度活化HER3。由于HER3靶向治疗更可能有效地治疗被HER3激活显著驱动的癌症，因此鉴定具有HER3激活的癌症的受试者可帮助鉴定将对HER3靶向治疗更好地产生响应的受试者。将如通过测定测量的不同生物标志物的水平绘制在热图上以鉴定表达模式。

图8显示样品的热图。小图A是显示从高至低HER2状态分选的所有乳腺癌肿瘤样品的生物标志物水平的热图。图B显示其中已基于HER2状态分离肿瘤样品的两个热图。

在每一个热图的底部标示了每一个肿瘤样品的样品编号，并且测定中分析的生物标志物示于每一个热图的左边。显示最高表达(≥第90百分位)的样品以深灰色显示；具有中等表达(第50百分位)的样品以黑色显示，具有低表达(≤第10百分位)的样品以浅灰色显示。中间阴影反映中间表达水平。具有最高水平的活化HER3的样品用箭头标记。基于中等至高总HER3测量值结合HER2-HER3异二聚体、HER3磷酸化和HER3/PI3K复合物(即，PI3K募集至活化HER3)中至少一个的高水平的评估将样品分类为具有最高水平的活化HER3。

例如，图8A中的样品6具有中等水平的总HER2，但极高水平的HER2-HER3异二聚体。由于二聚化是受体激活所必需的，因此极高水平的二聚化可能表示增加的HER3受体激活。另一个实例是图8A中的样品19，其具有中等水平的总HER2，但极高水平的HER3磷酸化-1289水平。由于HER3在位置1289上的磷酸化激活HER3信号传导，因此高水平的该生物标志物也被认为表示样品中增加的HER3激活。剖析HER3途径的热图允许鉴定未通过单独的HER2状态的分层看到的HER3激活样品。通过总HER2分级的热图鉴定了一个亚组的样品，其在聚类分析(实施例11)后分组。磷酸化-HER3和HER3-PI3激酶复合物与总HER2水平显著相关(图7)，但HER2低乳腺癌样品的亚组中磷酸化的-HER3和HER3-PI3激酶复合物的高水平表明除了扩增的HER2外还存在另外的HER3激活机制。

实施例11

乳腺癌样品的层次聚类分析

图9显示根据如通过测定测量的生物标志物水平进行肿瘤样品的层次聚类分析。小图A显示HER2阴性乳腺癌样品的分析，小图B显示HER2阳性乳腺癌样品的分析。样品编号示于图的底部。所分析的生物标志物沿着图的左侧显示：HER3/PI3K复合物(HER3-PI3K)、总HER3(H3T)、HER2-HER3异二聚体(H23D)、总HER2(H2T)和在酪氨酸1289处磷酸化的HER3(p-HER3)。表达最高水平的活化HER3的肿瘤聚类至图的右侧。所得的树形图鉴定了具有活化HER3的肿瘤亚组，其与通过H2T分级的热图鉴定的那些肿瘤亚组相同。

本申请中提及的所有印刷专利和出版物据此通过该引用整体并入本文。

虽然已举例说明和描述了本发明的优选实施方案中，但应理解，可在不背离本发明精神和范围的情况下在其中进行各种变化。

Claims (28)

1.一种用于测量肿瘤中的活化HER3的量的方法，其包括：

(a)测量肿瘤样品中总HER3的量和样品中HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物中至少一个的量；

(b)测定HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物中至少一个比总HER3蛋白的比率；和

(c)如果(i)所述样品中总HER3的量高于参照群体的总HER3的中位数是，和(ii)样品中HER2-HER3异二聚体比总HER3、磷酸化的HER3比总HER3、或HER3/PI3K复合物比总HER3中至少一个的比率高于所述参照群体中HER2-HER3异二聚体比总HER3、磷酸化的HER3比总HER3或HER3/PI3K复合物比总HER3中至少一个的中位数比率，则指示所述肿瘤具有高含量的活化HER3。

2.一种治疗癌症的方法，其包括：

(a)测量来自所述受试者的肿瘤样品中总HER3蛋白以及HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物中至少一个的量；

(b)测定HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物中至少一个的量比总HER3的比率；

(c)确定受试者是否具有特征为具有高水平的活化HER3的癌症，其中高水平的活化HER3包括(i)所述样品中的总HER3的量高于具有与所述受试者相同类型的癌症的受试者参照群体的总HER3的中位数量和(ii)所述样品中HER2-HER3同二聚体的量比总HER3的量、磷酸化的HER1的量比总HER3的量或HER3-PI3K复合物的量比总HER3的量中至少一个的比率，高于具有与所述受试者相同类型的癌症的受试者参照群体中的HER-HER3同二聚体的量比总HER3的量、磷酸化的HER3的量比总HER3的量或HER3-PI3K复合物的量比总HER3的量中至少一个的中位数比率；和

(d)如果所述受试者具有特征为高水平的活化HER3的癌症，则对所述受试者施用HER3靶向治疗。

3.一种用于预测具有癌症的受试者对HER3靶向治疗的响应性的方法，其包括：

(a)测量来自受试者癌症的生物样品中的总HER3蛋白的量和HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物中至少一个的量；

(b)测定HER2-HER3异二聚体、磷酸化的HER3或HER3/PI3K复合物中至少一个的量比总HER3的量的比率；

(c)测定受试者是否具有特征为具有高水平的活化HER3的癌症，其中高水平的活化HER3包括(i)所述样品中的总HER3的量高于具有与所述受试者相同类型的癌症的受试者参照群体的总HER3的中位数量和(ii)所述样品中的HER2-HER3同二聚体的量比总HER3的量、磷酸化的HER1的量比总HER3的量或HER3-PI3K复合物的量比总HER3的量中至少一个的比率，高于具有与所述受试者相同类型的癌症的受试者参照群体中的HER-HER3同二聚体的量比总HER3的量、磷酸化的HER3的量比总HER3的量或HER3-PI3K复合物的量比总HER3的量中至少一个的中位数比率；和

(d)如果所述受试者的癌症特征为具有高水平的活化HER3，则指示所述受试者更可能对所述HER3靶向治疗产生响应。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述肿瘤包括结直肠癌、胃癌、乳腺癌、黑素瘤、卵巢癌、头颈癌、肺癌、脑癌、子宫内膜癌、胰腺癌、前列腺癌或宫颈癌中的至少一种。

5.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述肿瘤包括乳腺癌。

6.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述生物样品中的磷酸化的HER3的量通过使用HER3磷酸化特异性或HER3泛磷酸化抗体来检测。

7.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述肿瘤中的磷酸化的HER3的量通过使用结合在HER3的位置1289上的酪氨酸残基处被磷酸化的HER3蛋白的磷酸化特异性抗体来检测。

8.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述肿瘤中的活化HER3的量通过测定存在于所述肿瘤样品中的HER2-HER3异二聚体的量比总HER3的量的比率、磷酸化的HER3的量比总HER3的量的比率和HER3/PI3K复合物的量比总HER3的比率中至少两个来检测。

9.权利要求1-3中任一项的方法，其中使用能够测量所述肿瘤样品中蛋白质-蛋白质相互作用的量的测定法来测量HER2-HER3异二聚体和HER3/PI3K复合物的量。

10.权利要求1-3中任一项的方法，其中测量来自所述受试者的肿瘤样品中的总HER3蛋白的量包括以下步骤：

a)将所述肿瘤样品与HER3抗体组成物接触；

b)将所述HER3抗体组成物与标记的结合组成物接触，其中所述标记的结合组成物包含通过可裂解连键附接于其上的分子标签，并且其中所述标记的结合组成物特异性结合所述HER3抗体组成物；

c)裂解所述标记的结合组成物的可裂解连键，从而释放所述分子标签；和

d)定量所述释放的分子标签以测定所述肿瘤样品中的HER3蛋白的量。

11.权利要求1-3中任一项的方法，其中测量来自所述受试者的肿瘤样品中的总HER3蛋白的量包括以下步骤：

a)将所述肿瘤样品与在第一结合位点特异性结合HER3蛋白的第一HER3抗体组成物接触，其中所述第一HER3结合组成物包含通过可裂解连键附接于其上的分子标签：

b)将所述肿瘤样品与在第二结合位点特异性结合HER3蛋白的裂解探针接触，其中当与其处于有效接近度时，所述裂解探针裂解所述HER3抗体组成物的可裂解连键；

c)裂解所述HER3抗体组成物的可裂解接头，从而释放所述分子标签；和

d)定量所述释放的分子标签以测定所述肿瘤样品中的HER3蛋白的量。

12.权利要求1-3中任一项的方法，其中测量来自所述受试者的肿瘤样品中的HER2-HER3异二聚体或HER3/PI3K复合物的量包括以下步骤：

a)将所述肿瘤样品与包含通过可裂解连键附接于其上的分子标签的抗体组成物接触；

b)将所述肿瘤样品与裂解探针接触，其中当与其处于有效接近度时，所述裂解探针裂解所述抗体组成物的可裂解连键；

c)裂解所述抗体组成物的可裂解接头，从而释放所述分子标签；和

d)定量所述释放的分子标签以测定所述肿瘤样品中的HER2-HER3异二聚体或HER3/PI3K复合物的量，

其中对于HER2-HER3异二聚体的测量，所述抗体组成物特异性结合HER3并且所述裂解探针特异性结合HER2，或所述抗体组成物特异性结合HER2并且所述裂解探针特异性结合HER3，以及其中对于HER3/PI3K复合物的测量，所述抗体组成物特异性结合HER3并且所述裂解探针特异性结合PI3K，或所述抗体组成物特异性结合PI3K并且所述裂解探针特异性结合HER3。

13.权利要求1-3中任一项的方法，其中测量来自所述受试者的肿瘤样品中的HER2-HER3异二聚体的量包括以下步骤：

a)将所述肿瘤样品与HER2抗体组成物接触；

b)将所述肿瘤样品与HER3抗体组成物接触；

c)将所述肿瘤样品与结合所述HER2抗体组成物或所述HER3抗体组成物的第一结合组成物接触，其中所述第一结合组成物包含通过可裂解连键附接于其上的分子标签；

d)将所述肿瘤样品与裂解探针接触，其中当与其处于有效接近度时，所述裂解探针裂解所述结合组成物的可裂解连键；

e)裂解所述抗体组成物的可裂解连键，从而释放所述分子标签；和

f)定量所述释放的分子标签以测定所述肿瘤样品中的HER2-HER3异二聚体的量，

其中如果所述抗体结合组成物特异性结合HER3，则所述裂解探针特异性结合HER2，或如果所述抗体结合组成物特异性结合HER2，则所述裂解探针特异性结合HER3。

14.权利要求1-3中任一项的方法，其中测量来自所述受试者的肿瘤样品中的HER3/PI3K复合物的量包括以下步骤：

a)将所述肿瘤样品与HER3抗体组成物和PI3K抗体结合成物接触，其中一种抗体组成物包含通过可裂解连键附接于其上的分子标签，另一种抗体组成物包含当与其处于有效接近度时裂解所述结合组成物的可裂解连键的裂解探针；

b)裂解可裂解连键以释放所述分子标签；和

c)定量所述释放的分子标签以测定所述肿瘤样品中的HER3/PI3K复合物的量。

15.权利要求1-3中任一项的方法，其中测量来自所述受试者的肿瘤样品中的磷酸化的HER3的量包括以下步骤：

a)将所述肿瘤样品与在第一结合位点特异性结合HER3蛋白的第一HER3抗体组成物接触，其中所述第一HER3抗体组成物包含通过可裂解连键附接于其上的分子标签；

b)将所述肿瘤样品与在第二结合位点特异性结合HER3蛋白的第二HER3抗体组成物接触，其中所述第二HER3抗体组成物包含当与其处于有效接近度时裂解所述HER3抗体组成物的可裂解连键的裂解诱导部分，并且其中所述第二结合位点包含HER3磷酸化位点；

c)裂解所述第一HER3抗体组成物的可裂解接头，从而释放所述分子标签；和

d)定量所述释放的分子标签以测定所述肿瘤样品中的磷酸化的HER3蛋白的量。

16.权利要求2或3的方法，其中所述HER3靶向治疗包含选自U3-1289/AMG888、MM-121/SAR256212、MM-111、MEHD7945A、AZD-8931、LJM716、Av-203和培妥珠单抗中的至少一种药剂。

17.权利要求2的方法，其还包括测量总HER2蛋白的量和确定所述受试者是否具有HER2阳性癌症或HER2阴性癌症。

18.权利要求2的方法，其还包括确定总HER2蛋白的量是否低于第一截断值，总HER2蛋白的量是否高于第二截断值，或总HER2蛋白的量是否高于第一截断值但低于第二截断值，所述第一截断值包含对应于HER2阳性癌症的参照群体中的总HER2蛋白表达的底部第五百分位的总HER2蛋白水平，所述第二截断值包含对应于HER2阴性癌症的参照群体中的总HER2蛋白表达的顶部第95百分位的总HER2蛋白的水平。

19.权利要求17的方法，其还包括，如果所述受试者具有HER2阳性癌症，则施用包含HER2靶向治疗和HER3靶向治疗的综合疗法。

20.权利要求18的方法，其还包括，如果所述肿瘤样品中的总HER2蛋白的量高于所述第一截断值，则施用包含HER2靶向治疗和HER3靶向治疗的综合疗法。

21.权利要求19或20的方法，其中所述HER2靶向治疗包含选自BIBW2992、HKI-272、4D5、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine、AEE-788、拉帕替尼、奈拉替尼、ARRY-380和ARRY-543中的至少一种药剂。

22.权利要求3的方法，其中对HER3靶向剂的响应性包括诊断与受试者正进行HER3作用剂治疗时重大事件的发生之间有更长的疾病时间进程。

23.权利要求22的方法，其中所述重大事件包含癌症从一个分期至更晚期、至转移性疾病、复发、手术或死亡的进展中的至少一个。

24.权利要求3的方法，其还包括测量总HER2蛋白的量和确定所述受试者是否具有HER2阳性癌症或HER2阴性癌症。

25.权利要求3的方法，其还包括确定总HER2蛋白的量是否低于第一截断值，总HER2蛋白的量是否高于第二截断值，或总HER2蛋白的量是否高于第一截断值但低于第二截断值，所述第一截断值包含对应于HER2阳性癌症的参照群体中的总HER2蛋白表达的底部第五百分位的总HER2蛋白水平，所述第二截断值包含对应于HER2阴性癌症的参照群体中的总HER2蛋白表达的顶部第95百分位的总HER2蛋白的水平。

26.权利要求24的方法，其还包括，如果所述受试者具有HER2阳性癌症，则指示所述受试者更可能对HER2靶向剂和HER3靶向剂的综合疗法产生响应。

27.权利要求25的方法，其还包括，如果所述生物样品中的总HER2蛋白的量高于所述第一截断值，则指示所述受试者更可能对HER2靶向剂和HER3靶向剂的综合疗法产生响应。

28.权利要求26或27的方法，其中所述HER2靶向治疗包含选自BIBW2992、HKI-272、4D5、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine、AEE-788、拉帕替尼、奈拉替尼、ARRY-380和ARRY-543中的至少一种药剂。