CN102492039A - 全人源抗人her2单抗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗人HER2单抗。本发明特别与高亲和力、低解离速率的抗人HER2单抗有关。本发明的优选抗人HER2单抗包含全人源Fc区和框架区以及通过分子进化获取的全人源轻链和/或重链的CDR区。本发明还披露了这种全人源抗体组成的药物组合物在人疾病的治疗中的应用以及在治疗中使用这种全人源抗体的方法。

Description

全人源抗人HER2单抗

技术领域

本发明涉及抗人HER2单抗。本发明特别与高亲和力低解离速率的抗人HER2单抗有关。本发明的优选抗人HER2单抗包含全人源Fc区和框架区以及通过分子进化获取的全人源的轻链和/或重链可变区。本发明还披露了这种全人源抗体组成的药物组合物在人疾病的治疗中的应用以及在治疗中使用这种全人源抗体的方法。

背景技术

人表皮生长因子受体2(简称HER2)，也称之为HER2/neu、ErbB-2、CD340和p185，是一种由表皮生长因子受体的同源基因HER2/neu编码的蛋白，它可导致乳腺癌侵袭性显著提高(Dank M.2001，Orv Hetil.18；142(46)：2563-8)，在25～30％的乳腺癌病人的过量表达常常与基因扩增有关。

HER2是ErbB蛋白家族，即由四种结构上相关的穿膜受体酪氨酸激酶构成的表皮生长因子受体(EGFR)中的一员，它可以通过多种信号传导途径调节细胞的生长、存活和分化。该家族包括ErbB-1(也称为表皮生长因子受体，EGFR)、ErbB-2(在人和啮齿类中也称为HER2和neu)、ErbB-3(也称为Her3)和ErbB-4(也称为Her4)(Yeon CH，Pegram MD，2005，Invest New Drugs.23(5)：391-409)。人体缺乏ErbB信号可导致神经退行性疾病如多发性硬化和Alzheimer症(Bublil EM and Yarden Y.2007，Curr Opin Cell Biol.19(2)：124-134)。小鼠中ErbB家族中任何成员的丢失都将造成包括肺、皮肤、心脏和大脑等器官的缺陷，从而导致胚胎死亡。ErbB过量则可导致多种类型的实体瘤。在人的许多肿瘤中发现了ErbB-1和ErbB-2，其信号过量可能是这些肿瘤发展和恶化的关键因子(Cho HS andLeahy DJ，2002，Science，297(5585)：1330-1333)。

HER2的功能

HER2是一种位于细胞膜表面的受体酪氨酸激酶，通常与导致细胞生长和分化的信号传导有关。它是由HER2/neu基因编码的，也是一个已知的原癌基因。HER2是一个孤立的受体，EGF家族配体中没有任何一个可以激活它。但是，ErbB受体与配体结合时可发生二聚体化，HER2是ErbB家族中其他成员青睐的二聚体化对象(Olayioye MA，2001，Breast CancerRes，3(6)：385-389)。HER2基因是位于人第17号染色体的17q21-q22区域(Coussens L；Yang-Feng TL，Liao YC，et al，1985，.Science，230(4730)：1132-1139)。

HER2与癌症

研究发现，在25～30％的乳腺癌病人中会发生HER2基因的扩增。这种扩增事件不仅是一种孤立的不良预后因子，也是阿霉素为基础的联合化疗提高疗效、Hercetpin治疗效果的预测因子，还是降低对激素疗法反应的监测指标(Yeon CH，Pegram MD，2005，Invest NewDrugs，23(5)：391-409)。该受体在乳腺癌中的过量表达将增加复发和不良预后。由于有预后和对Herceptin反应预测的功能，进行HER2/neu检查是乳腺癌治疗中的常规项目。该基因在其他肿瘤如卵巢癌、胃癌和侵袭性子宫癌(例如浆液性子宫癌)中也有过量表达。

HER2与GRB7基因紧密连锁，因此会发生共扩增。GRB7也是一个原癌基因，在乳腺癌、睾丸种系细胞癌、胃癌和食道癌中是活动的。已经证明，ER+/HER2+和ER-/HER2+乳腺癌可以从抑制PI3K/AKT途径的药物获益(Estrogen Receptor Status of HER2+BreastCancer Correlates with Response to Anti-HER Therapies.ScienceDaily，May 6，2010)。已经知道HER2的成簇可能在肿瘤发生上起重要作用(Nagy P，et al，1999，J Cell Sci.112，1733-1741；Rainer Kaufmann，et al，2010，J Microscopy，doi：10.1111/j.1365-2818.2010.03436.x)。

以HER2为靶点的药物

HER2基因在大约25～30％的乳腺癌中是过量表达的或扩增的。HER2过量表达或扩增的乳腺癌病人无病存活期和总存活期都会缩短。有证据表明，HER2蛋白是过量表达HER2的肿瘤进行抗体治疗的独特而理想的靶点。以HER2胞外区的一个表位为靶点的Herceptin因疗效突出，副作用小，已在临床上大量应用(Tokuda Y，2003，Int J Clin Oncol，8(4)：224-9)。临床前和临床研究证明，该抗体在单用或与化学药物联用都有显著的抗肿瘤活性(Yeon CH，Pegram MD，2005，Invest New Drugs，23(5)：391-409)，对HER2过量表达的转移性乳腺癌也有明显疗效。该抗体的作用机理包括破坏DNA的修复和诱导ADCC效应(Dank M，2001，Orv Hetil，142(46)：2563-8)。

Herceptin仅仅对HER2/neu受体过量表达的癌症有效。Heceptin在与HER2结合后的作用机理之一是通过增加p27来阻止细胞的分化(XF Le，Franz Pruefer，Robert Bast，2005，Cell Cycle，4(1)：87-95)。HER2蛋白的表达是受雌激素受体调控的。雌二醇和三苯氧胺可通过雌激素受体正常下调HER2的表达。但是，当共激活因子AIB-3超过PAX2时，则在三苯氧胺作用下上调HER2的表达，从而导致抗三苯氧胺乳腺癌(Hurtado A，Holmes KA，Geistlinger TR，et al，2008，Nature，456(7222)：663-666)。

Herceptin不仅对HER2阳性的乳腺癌有效果显著，对侵袭性子宫癌等也有疗效。例如，抗HER2单抗Herceptin已被FDA批准用于治疗HER2过量表达的乳腺癌和转移性胃癌，并正在研究用于其他癌症的可能性(Loredana Vecchione，et al.k 2009，Expert Opinion onInvestigational Drugs，18(7)：945-955)，在治疗子宫乳头状浆液性腺癌上也获得一定疗效。

另一个以HER2为靶点的抗体药物是Pertuzumab单抗(de Bono，et al，2007，J ClinOnco，25(3)：257-262)。该抗体可通过抑制HER2和HER3受体的二聚化来抑制肿瘤的生长，目前已在临床后期。它通过与HER2结合来抑制HER2与其他HER受体的二聚体化。有人认为，二聚体化可导致肿瘤生长减缓。

抗HER2抗体治疗包括单独注射抗人HER2抗体或与其他抗体或化学治疗剂联用。

尽管对HER2在乳腺癌发展中的实际功能和机理尚不明了，但它仍然是控制或者杀死HER2阳性肿瘤细胞的重要靶点。特别是，表达HER2的肿瘤细胞，例如乳腺癌，使其成为抗体疗法的重要靶点。然而，至今已经获得的结果在支持HER2是乳腺癌免疫疗法的有用靶点的同时，由于仍有HAMA或HACA反应且剂量高至440mg/剂量，因注射间隔短需要频繁注射，现有的人源化抗体还不是十分理想的治疗剂。

因此，在抗HER2抗体治疗方面需要更为有效的能够预防和治疗多种与HER2相关的疾病(包括但不限于乳腺癌)方面需要更好的治疗性抗体。

PEG化是一种改进蛋白特性的技术。共价结合到药物或蛋白分子上的PEG可以“遮蔽”这些制剂，使其免疫原性和抗原性降低，免受受体免疫系统的攻击，从而增加其在溶液中的流体动力学体积，并可通过降低肾排除延长其在循环系统中的半衰期。PEG化还可以给疏水药物和蛋白提供水溶性。因此，PEG化可用于改善抗体，尤其是scFv和Fab这种半衰期短的分子的特性。

我们所需要的抗人HER2单抗应当具有更高的亲和力和低解离速率，使接受治疗的乳腺癌病人不易复发，注射到人体后不引起或极少引起HAMA或HACA反应，在循环系统中半衰期长，从而延长注射间隔，降低治疗费用。

发明内容

发明概述

本发明提供了全人源抗人HER2单抗的氨基酸序列与应用。特别是，本发明的这种分子对人HER2分子具有高亲和力和低解离速率。

本发明中，所述抗体分子的重链和轻链是全人源的，尽管嵌合的或人源化的也可以使用，但是用于人体时，全人源的可以避免很多副作用，例如HAMA和HACA反应引起的那些副作用。

本发明的某些实施例提供了包括抗人HER2单抗分子的组合物，所述分子包含：(a)一个包含Fc片段和SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列等部分构成的完整的或不完整的轻链；和(b)一个由Fc片段和SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列等部分构成的完整的或不完整的轻链。

本发明的抗人HER2单抗分子包括重链和轻链，所述轻链包含如SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7所示氨基酸序列或其一部分，所述重链包含如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列或其一部分。

本发明的优选抗人HER2单抗包含全人源Fc区和框架区以及通过分子进化获取的全人源的轻链和/或重链可变区。

本发明中的轻链和重链的框架区都是全人源的，其框架区来自人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM亚型；优选的是来自人IgG1，最优选的是来自IgG1 kappa。

本发明中，重链和轻链的Fc区都是全人源的，其Fc区来自人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM亚型，优选的是人IgG1。本发明所述抗体分子的Fc可以是天然的，也可以是修饰过的。所述Fc区可以是采用任何有效的基因工程方法或其他方法改造过的，其效应功能得到提高或降低的变异体。

本发明的全人源框架和Fc区是直接或间接从人体得到的。所述的直接方法包括但不限于基因组DNA克隆、cDNA、cDNA文库。所述的间接方法包括但不限于根据包括但不限于GenBank或其他出版物提供的生物信息为基础部分合成或完全从头合成完整的DNA。DNA合成技术包括但不限于以PCR为基础的DNA合成方法。

在某些实施例中，所述抗人HER2抗体分子包括全长分子或其一个片段(例如Fv、Fab、F(ab)₂等。在特定实施例中，所述抗人HER2抗体分子包含一个单域(即CDR)、单链Fv、Fab或F(ab)₂等。

在某些实施例中，轻链包括全人源框架。在另一些实施例中，轻链可变区包含一种人源的种系框架。在特定的实施例中，所述轻链包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列或其一部分；在特定的实施例中，重链可变区包含人的种系框架区。在另外一些实施例中，所述重链包含如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列或其一部分。

在某些情况下，所述抗人HER2抗体分子可以是为延长其在循环系统中的半衰期用化学方法进行了PEG修饰的。PEG修饰是通过活化scFv、Fab或F(ab)₂分子上截短的铰链区的一个氨基酸残基实现的，方法是Chapman AP等的论文中描述的(PEG)-lysyl maleimide方案(Chapman AP，et al，1999，Nature Biotechnology，17：780-783)。其他替代方法的细节可以在许多出版物中找到，例如Knight DM，et al，2004，Platelets，15(7)：409-18和美国专利US5824784。

在某些实施例中，所述抗人HER2单抗分子包含由轻链和重链组成的Fab分子。所述轻链包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，所述重链包括SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

在某些实施例中，所述抗人HER2抗体分子包含一种Fab，并进一步包含完整的Fc区，从而形成全长的单抗分子，或者进一步包含Fc的一部分，从而形成不完整的单抗分子。

此外，Fc区应当具有补体依赖的细胞毒作用(CDC)和抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)。这些功能可以通过氨基酸替换进行修饰，以减少或消除或增强其效应功能。

本发明的抗人HER2抗体分子是在真核或原核受体细胞中表达的。在某些实施例中，编码轻链和/或重链的核酸序列包含在一种质粒或其他表达载体中。

本发明提供了在治疗中使用这种抗体的方法。这些方法包括：(1)一种包含本发明所述抗人HER2抗体分子的药物组合物。(2)对客体施用这种药物组合物。所述客体是指具有本品适应症症状的病人。在某些实施例中，所述适应症可从以下疾病中选择：①HER2阳性乳腺癌；②其他与HER2有关的疾病，例如：HER2阳性的卵巢癌、胃癌、子宫癌。

发明详述

本发明提供了抗人HER2单抗分子。特别是，本发明提供了具有高亲和力和低解离速率的抗人HER2单抗分子。优选地，本发明所述的所述抗人HER2单抗分子由具有全人源框架的轻链和/或重链组成的。为方便描述，本发明就此内容分成以下几方面进行描述。I.抗人HER2单抗分子；II.制备抗人HER2单抗分子；III.用于治疗的配方和使用方法；以及IV.抗人HER2抗体分子的其他用途。

I.抗人HER2抗体分子

本发明的单抗可以用多种技术获得，包括但不限于Kohler和Milstein(1975，Nature256：495)发表的标准的杂交瘤技术。尽管原则上这一技术是受偏爱的，但其他获得单抗的技术也可以应用，例如转基因小鼠或杂交瘤技术。小鼠细胞杂交瘤技术已经十分成熟，免疫和融合伙伴已经十分清楚。但是，用小鼠或其他非人动物杂交瘤产生的抗体会引起HAMA反应，从而导致用于人体疾病治疗时会引起副作用。以这些抗体为基础获得的嵌合的或人源化的单抗用于人体时仍然能够引起HACA反应，从而导致类似的免疫反应，尽管比原型分子轻微。全人源杂交瘤技术仍然处于开发状态，尚不足以获得用于人类疾病治疗的单抗。

对于人类疾病治疗来说，需要全人源抗体以减少或消除引起副作用的HAMA或HACA反应。尽管转基因小鼠已经有很成功的记录，其他技术也是可以选择的。

抗体库技术，特别是由CAT及其他机构建立的全人源抗体库技术就是其中一种值得考虑的选择。CAT建立的技术在一些治疗性抗体的开发上获得了某种程度的成功，引起了国际上的关注，但是它依然有非常明显的问题，即获得高亲和力scFv分子的几率很低。这就需要对该技术进行改进，以满足治疗性抗体的需要。

本发明对现有抗体库技术的最重要的改进有：(1)用3000位来自于不同民族和地区的健康成年人血样构建了超大规模全人源天然Fab抗体库，称之为HuLib。显然，与已发表的抗体库相比，该抗体库具有更丰富的遗传变异。对于熟知本领域的人员来说，不难理解这将大大提高遗传复杂性和通过淘筛或其他方法获得高亲和力Fab分子的可能性。此处可以使用的其他抗体库可以是合成的或部分合成的，也可以是scFv，起始材料也可以是其他非人动物，例如小鼠。(2)为了提高亲和力和改变获得的Fab分子亲和力以外的其他性状以满足治疗的需要，采用了分子进化技术。通过分子进化改进的分子可以借助哺乳动物细胞、酵母菌细胞或细菌细胞进行生产。

本发明中的原型Fab分子是用人HER2作为抗原在上述抗体库进行淘筛获得的，它将被用做后续分子进化的原型分子以获得亲和力等技术指标达到治疗性药物要求的候选单抗。

本发明的分子进化技术是通过PCR引入突变的，它包括：(1)关键氨基酸(KA)扫描。KA扫描被用来在人工进化之前检定最有意义、最有可能获得有用突变体的位点，以减少无效突变。KA扫描是检定可以通过任何可能的突变方案并通过亲和力测定获得有效突变体的氨基酸位点的过程。若一个具有一个特定氨基酸位点突变的突变子的亲和力发生了变化，该位点就是有用的突变位点，反之亦然。基于这样的扫描方法就可以确定有效的和无效的突变位点，并可借助Cunningham和Wells(1998，Science，244：1081-1085)的方法在设计突变方案之前对各位点进行分类。借此可以大大简化突变设计的数据处理，并减少甚至避免无效突变，这又使突变后亚库的构建和淘筛大大简化。(2)突变引物设计。突变引物设计是这一技术中获得足够数量的有用突变的关键步骤，本发明中采用了GCR引物设计方案，详细情况见PCT/CN2009/074839。本发明中所述的目标区域(即拟突变的区域)是一个抗体分子的CDR区，优先选择的是轻链和重链的CDR3。本发明中，所述的随机突变优先选择的是在每一个有用突变位点以19种或20种天然氨基酸进行饱和随机突变。(3)此外，根据Kabat计数法确定的目标CDR的侧翼序列也有一些氨基酸对于产生对亲和力有意义的突变子是重要的，至少在某些情况下，某种程度上是这样。因此，KA扫描应当覆盖CDR及其侧翼氨基酸以获得更广泛的亲和力改善的变异。

在本发明，有用的氨基酸位点可以用本领域熟知的方法突变为随机氨基酸或特定的氨基酸。突变为拟定的氨基酸序列可以通过改变编码该氨基酸的核酸序列来实现。这种编码在特定CDR区具有一个或多个突变的突变子的核酸分子可以用本领域熟知的方法获得。所述的突变方法包括但不限于对已经提前制备的编码CDR区的核酸进行定点突变、寡核苷酸介导的突变、位点特异性突变或随机PCR突变、表达框突变等。制备这种取代突变子的一种优选方法是定点突变。这一技术在本领域是广为熟知的(例如Carter等，1985，NAR，13：4431-4443和Kunkel等，1987，PNAS，82：488-492)。以PCR为基础的突变方法，其突变核苷酸被置入到了引物中，从而使相应的PCR产物带有突变，这也是可达到此目的的一种优选的方法，详细情况可参考Vallette等，1989，NAR，723-733。本发明中最佳的突变方法是用根据GCR方法或其他可用的方法设计引物，通过PCR在特定的位点进行随机突变。必要时可以同时对一个以上的位点进行突变从而获得具有多个突变的突变子。

本发明采用Kabat方法编码各个CDR区(EA等，1991，Sequences of proteins ofimmunological interest，5th ed.U.S.Department of Health and Human Services，National Institutes of Health，Bethesda，Md.)。

在某些实施例中，抗人HER2单抗分子由一条全人源轻链和一条全人源重链组成。对于本领域技术人员，不难理解当本发明的抗人HER2单抗分子用于人体治疗疾病时将很少或没有免疫反应。

本发明的某些实施例中，抗人HER2单抗分子带有Fc区，其优选来源是直接从人种系或通过其他途径例如全长DNA合成、人基因组库等获得。

本发明提供亲和力高、解离速率低的抗人HER2单抗，该单抗在低剂量下是有效的。本领域技术人员不难理解，本发明的抗人HER2单抗分子特别适合用于人体疾病的治疗，它不像带有鼠源成分的嵌合型抗人HER2单抗分子(例如Rituxan)那样容易引发HACA反应。

本发明所述的CDR可以与任何类型的框架区整合为有功能的scFv、Fab和/或进一步与Fc区整合从而形成有功能的全长抗体分子。优选的CDR区与全人源框架区或其亚区和种系的或经过修饰的Fc区进行整合。可以用于与本发明的CDR区整合的全人源框架包括但不限于KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和POM(见(1)Kabat et al，1991，Sequencesof Proteins of Immunological Interest，US Department of Health and Human Services，and(2)NIH，USA；and Wu et al，1970，J Exp Med 132：211-250)。

II.产生结合HER2分子的方法

本发明的抗体或抗体片段可以通过轻链和重链基因在受体细胞中的重组表达来实现。所述受体细胞可以是哺乳动物细胞，也可以是酵母或细菌细胞。

本发明中轻链和重链的表达可以通过瞬时或稳定表达来实现。两种表达策略都包括用一种或多种带有编码抗体轻链和重链的DNA片段的表达载体转染(哺乳动物和酵母系统)或转化(细菌系统)受体细胞，从而使轻链和重链在受体细胞中表达，优选的表达方式是分泌到培养基中，可以用本领域技术人员熟知的层析等方法从中回收抗体。标准的重组DNA方法可以有效地用于轻链和重链基因的获得、克隆至表达载体以及引入到受体细胞。

本发明中在分子进化之前或之后通过淘筛获得的抗体分子是Fab形式的。这种形式可以通过本领域的技术人员熟知的基因工程技术方便地进一步转换成scFv、全长抗体或其他形式。

本发明中，一旦通过上述方法获得了编码所需VL和VH区的DNA片段，就可以用标准基因工程方法进一步转换成全长的抗体轻链和重链基因、Fab片段基因或scFv基因。

为获得全长轻链基因，可以把编码VL区的DNA整合到人轻链恒定区。优先选择的是人κ或λ恒定区，最优先选择的是人κ恒定区。为了获得全长重链基因，可以把编码VH区的DNA整合到重链的恒定区。重链恒定区可以从以下几种中选择，IgG，、IgA、IgE、IgM或IgD。优先选择的是IgG1～IgG4，最优先选择IgG1(γ)的恒定区。

为了获得单链Fv基因，可以用PCR方法从上述Fab分子进一步获得VH-和VL-DNA编码区，然后用(Gly4Ser)3编码区作Linker把两个片段连接成一个完整分子，使得所述VH和VL序列可以用McCafferty等(1990，Nature，348：552-554)描述的方法以单链Fv蛋白的方式在E.coli中表达。

为了表达本发明所述的抗体或抗体的片段，可以把其相应的轻链和重链编码序列插入到表达载体的转录和翻译控制序列之间。本发明所述的表达载体包含调控序列如启动子、增强子等。所述的表达载体及其控制序列应当与受体细胞兼容。编码轻链和重链的基因可以分别插入到两个独立的载体，也可以插入到同一个载体。所述表达载体可以预置了恒定区，也可以不预置恒定区。如果一个抗体基因只含有可变区，应当使用预置了恒定区的表达载体。

除了转录和翻译调控序列，本发明的表达载体还含有：(1)在每一个表达框有一个信号肽序列，它可以促进抗体从受体细胞分泌到培养基中；(2)至少一个复制起点；(3)一个或多个选择标记基因，借此可方便地对引入了表达载体的受体细胞进行筛选。典型的选择标记基因可为受体细胞提供抗性，例如细菌对抗生素的抗性，哺乳动物细胞或其他受体细胞对G418、潮霉素和MTX等的抗性。所有这些信息对本领域的人员都已经广为熟知。优选的用于本发明的受体细胞包括具有或不具有DHFR的CHO细胞系、HEK293细胞系。抗体的表达是通过培养携带有上述表达载体的受体细胞，然后对产物进行纯化进行的。

本发明的受体细胞也可以用来生产截短的抗体片段，如Fab或scFv。为此目的，尽管哺乳动物或其他受体细胞也可以使用，但以E.coli为代表的细菌是优先选择的受体细胞。

本发明中抗体或抗体片段的回收和纯化主要包括：(1)对样品进行调适，即为纯化做准备。首先要去除细胞、细胞碎片、脂质和凝聚物。为此，可先离心，然后0.45μm过滤的方法。(2)层析，包括但不限于亲和、离子交换、分子筛的等层析方法。在有些情况下，超滤或透析也可选用。本发明优先选择的纯化方法是：Protein A/G亲和后在目标抗体可结合到柱子上、阴离子可穿过的低pH下进行阳离子交换层析。也可以在抗体分子可穿过，但阴离子可结合到柱子上的高pH下用阴离子层析。在离子交换层析中，许多具有不同等电点的杂蛋白可以被去除。(3)如有必要，可用分子筛对已经获得的原液进行进一步纯化。

为获得高纯度的单抗，本发明中在过滤后经过GE HealthCare生产的单抗selectSuRe，Capto S和Capto Q进行纯化。为建立更有效的方法，也可以使用包括单抗selectSuRe和CaptoA dhere两种组分的两步法。

III.制剂及其应用

本发明的抗人HER2单抗，包括全长的和截短的，都是治疗或诊断与HER2相关的人体疾病的有用材料。如上所述，抗人HER2单抗可用于治疗人乳腺癌以及其他HER2阳性疾病，例如：卵巢癌、胃癌、子宫癌。

熟知本领域的人会知道，与各种放射性或非放射性标记物偶联的抗人HER2对于诊断和治疗是有用的。可用于此目的放射性标记物包括但不限于¹³¹I、¹²⁵I、⁹⁹Tc和⁹⁰Y，可用于此目地的非放射标记物包括但不限于酶(例如HRP、AP等)、荧光染料、毒素等。

在优选的案例中，接受治疗的客体是非免疫抑制的(如SLE和RA病人)。尽管机理仍然不清楚，但本领域的技术人员很清楚，本发明的抗人HER2抗体分子引起HACA反应的可能性比以前知道的抗人HER2抗体要低很多，特别是对非免疫抑制的病人来说更是如此。因此，非免疫抑制的病人可以不用过分顾忌引起副作用的HACA反应。此外，本发明的抗体分子的亲和能力显著提高，因此其有效剂量可明显降低，这进一步避免了可能的HACA反应。

本发明的抗人HER2单抗分子可以与包括但不限于化疗或放疗等其他抗肿瘤治疗方法联用，在某些情况下，也可以与一些细胞因子，如G-CSF联用。

本发明的抗人HER2抗体分子可以制备成适于给病人使用的剂型，其含有一种人HER2结合分子，例如抗体或抗体片段，和一种或多种作为医药可接受的载体，例如溶剂、分散介质、包裹剂、抗生素、抗真菌物质、等渗物质、减缓吸收物质以及其他的生理学上能接受的物质。可接受的载体物质包括以下一种或多种：水、盐、磷酸盐缓冲液、葡聚糖、甘油、乙醇等，可单用或组合使用。优选的等渗剂是糖、聚乙醇如甘露醇、山梨醇，也可以是氯化钠。最优先选择的等渗剂是海藻糖。所述载体可进一步含有微量辅助物质，如润湿剂、乳化剂、防腐剂或缓冲液，这些物质有助于提高所述分子的货架期或有效性。

本发明的组分可以形成多种多样的形式，例如注射或输液、分散液或悬浮液等。本发明的优选方式是注射液或输液。

IV.抗人HER2单抗的其他应用

本发明的抗人HER2单抗可用于样品中HER2定性或定量免疫检测。免疫检测是一种检测在含有复杂混合物的溶液中是某种物质是否存在或浓度的方法。除了结合的特异性外，所有免疫检测的主要共同特点是可产生可检测的信号。当今，多数免疫检测方法都依赖于与可测标记相关的分析试剂。本发明可用的标记可以从以下物质中选择：放射性同位素、酶、荧光物质、磷光物质和合学发光染料、磁性颗粒、染料、金和银等的胶体、金属螯合剂、辅酶等。本发明中优选方案是酶(例如HRP和AP)，以及荧光染料。其中最选的是HRP和AP等酶。

本领域中的许多检测方法都是广为熟知并在临床或科学研究中广泛应用，例如疾病检测、生物化学研究等。

附图说明

图1是Fab表达载体pGP10结构示意图。其中，Plac是在E.coli中表达的启动子，ompA和pelB是信号肽编码序列，GPIII是噬菌体尾部蛋白GPIII的编码序列，MCS1和MCS2是Fab轻链和重链的克隆位点。

图2是全长抗体分子在哺乳动物细胞(如CHO、HEK293等)瞬时或稳定表达的双元表达载体pGP6C构建过程及结构示意图。为了在哺乳动物细胞表达抗体的轻链和重链，用如下方法构建了双表达框表达载体。(1)用PCR为基础的全基因合成方法(Xiong AS等，2004，NAR，32(12)：e98.)按照GenBank Accession No.AB608262.1序列资料合成人IgG1轻链(Kappa)恒定区CL，5′-增加多克隆位点PstI/NheI/BglII/EcoRI/EcoRV/XhoI，3′-端增加SV40 poly A信号编码区(简写为pASV40)5′-端22个碱基(以pCI-Neo为模板)，以便于通过重叠PCR与Pcmv片段进行拼接。片段长度为345bp。(2)以P3(ttccctttagtgagggtt aatg，pASV405′-端引物区)和P4(ccggatcgatccttatcggattt/ACCACATTTGTAG AGGTTTTACTTG，Pcmv 3′-端引物区/pA 5′-端引物区)为引物，pCI-Neo为模板扩增pASV40片段，长度为295bp。以P1(ctgcag(PstI)gctagcagatctgaattc gatatcctcgag，多克隆位点-CL片段5-端引物区)和P4为引物进行重叠PCR对上述两个片段拼接，获得多克隆位点-CL-pA片段，长度为618bp。(3)以P5(caagtaaaacctctacaaatgtggta/aaatccgataaggatcgatccgg，pASV403′-端引物区/Pcmv 5′-端引物)和P6(ggtacc(Kpni)CTGTGGAGAGAAAGG CAAAGTG，KpnI位点/PCMV 3′-端引物区)为引物，pCI-Neo(Invitrogen)为模板进行PCR扩增，获得1151bp片段。用P1和P6为引物通过重叠对上述两个片段拼接，其最终结构为：PstI-多克隆位点-CL-pA-PCMV-KpnI，长度为1791bp。该片段克隆至pUC57上，测序验证无误后，插入到phCMV1(Gene Therapy Systems，Inc.)载体的PstI/KpnI位点，即构成预置了CL的双表达框表达载体。最后，把根据GenBank Accession No.BC092518.1人工合成的人CH(Gamma)片段插入到上述载体的Acc65I/NotI位点，即构成预置了人轻链恒定区CL和重链恒定区CH的双表达框载体pGP6C。

图3A-图3B是分子进化后获得的Fab分子、原型分子、阳性对照和阴性对照的亲和力比较图。亲和力以Friguet测定。图3A是A2D5，B5F4，C3A6E5D2，F2G6及其原型E3F2、阳性对照h4D5Fab和阴性对照C2B8Fab的亲和力比较图。图3B是A6E7，B2F7，D3E5，F5E2，H2D3及其原型G6E7、阳性对照h2C4Fab和阴性对照C2B8Fab的亲和力比较图。图4是全长F2G6F、H2D3F及其阳性对照h4D5F和h2C4F亲和力比较图，亲和力为Friguet法测定。

图5是F2G6F、H2D3F及其阳性对照h4D5F和h2C4F从HER2解离的速率比较图。

图6是抗HER2单抗F2G6F、H2D3F及其阳性对照h4D5F和h2C4F、阴性对照C2B8F对荷SKBR3肿瘤的裸鼠肿瘤生长的抑制作用比较图。

图7是抗HER2单抗h4D5F、F2G6F、h2C4F、H2D3F诱导HER2阳性细胞SKBR3和HER2阴性细胞A431发生CDC效应比较图，阴性对照是C2B8F。图中数据是加入上述抗体后2小时和6小时诱导细胞裂解的情况，人血清为补体供源。

图8是以MNC细胞作为效应细胞，抗HER2抗体诱导HER2阳性的SKBR3和HER2阴性的A431细胞ADCC作用的比较图，C2B8F为阴性对照。结果表明，所有抗HER2抗体都能诱导SKBR3的ADCC，但对A431无效。C2B8F对两种细胞都没有裂解作用。

具体实施方式

以下实施例是为了说明或进一步阐释本发明的某些优选的实施例以及某些论点，并非要限制本发明的范围。

实施例1.大规模全人源抗体库构建

这一实施例描述如何构建Fab形式的超大规模全人源天然抗体库。本发明的Fab抗体库是用来自不同地区、不同民族的3000多名健康成人的血样，参照以下文献构建的，详细构建过程在文献目录之后描述。

1.Dantas，BC，et al，2005，Construction of a human Fab phage display libraryfrom antibody repertoires of osteosarcoma patients.Gene.Mo.Res，4(2)：126-140.

2.Hiroshi，T，et al，1999，Preparation of Recombinant Human Monoclonal AntibodyFab Fragments Specific for Entamoeba histolytica，Clinical and DiagnosticLabor Immunol，May 1999，383-387.

3.Wu，BP，et al，2001，Construction and selection of the natural immune Fabantibody phage display library from patients with colorectal cancer，WorldJ Gastroenterol，7(6)：811-815.

4.Lee，CV，et al，2004，High-affinity Human Antibodies from Phage-displayedSynthetic Fab Libraries with a Single Framework Scaffold，J Mol Biol，340，1073-1093.

5.Michael H，et al，2005，Antibody phage display，Mod Asp Immunobiol，15：47-49.

6.De Haard HJ，et al，1999，A large non-immunized human Fab fragment phagelibrary that permits rapid isolation and kinetic analysis of high affinityantibodie.J Biol Chem，1999，274：18218-18230.

7.Fellouse，FA，2007，High-throughput generation of synthetic antibodies fromhighly functional minimalist phage-displayed libraries.J Mol Biol 373，924-940.

1.血样和cDNA合成

取每个供体的血样1毫升混合，用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞，然后用Invitrogen或Roche公司的试剂盒分离总mRNA，用GIBCO的逆转录试剂盒合成cDNA的第一链。操作按照制造商的说明书进行。

2.扩增重链和轻链的Fab区

为了扩增编码κ和λ轻链以及γ重链的Fd区，采用了表1所示的引物组。除了上述轻链或重链的互补序列外，引物上带有特定的酶切位点和保护碱基以便于克隆。用100μl体系进行PCR扩增，正义链和反义链引物均采用1mM终浓度，PCR按下述条件进行25个循环：94℃30秒，50℃30秒，72℃1分钟；94℃4分钟预变性，72℃5分钟延伸。用QIAquickPCR Purification Kit(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)纯化扩增的DNA片段。纯化的片段用SacI/HindIII或XhoI/SpeI酶切后琼脂糖电泳分离，用QIAEX Gel Extraction Kit进行胶回收。

表1.用于人免疫球蛋白基因PCR扩增的引物组，下划线部分是增加的酶切位点，兼并密码为：M＝A or C，Y＝C or T，W＝A or T，R＝A or G，H＝A，C，or T，S＝C or G，and K＝T or G.

Kappa轻链，5’引物(SacI)	Lambda轻链，3’引物(HindIII)
		VK1：ctgagctcgmcatycagwtgacccagtctcc	VLC：gtaagcttgaamatkctgtagsggccactgt
Vk2a：ctgagctcgatrttgtgatgacycagwctcc
		Vk3a：ctgagctcgaaattgtgwtgacgcagtctcc	Gamma重链5’引物(XhoI)
VK4：ctgagctcgacatcgwghtgacccagtctcc	VH1a：gactcgagatggcccaggtgcagctggtgca
		Kappa轻链3’引物(HindIII)	VH1b：gactcgagatggcccagrtycagctggtgca
VKC：gcaagcttacactctcccctgttgaagctctt	VH2a：gactcgagatggcccagstrcagctgcagsa
			VH3a：gactcgagatggccsargtgcagktggtgga
Lambda轻链，5’引物(SacI)	VH3b：gactcgagatggccccagtgtgaggtgcagc
		VL1a：ctgagctccagtctgysctgactcagccw	VH4c：gactcgagatggcccaggtgcagctacagsa
VL1b：ctgagctccagtctgtgytgacgcagccg
		VL2a：ctgagctcmackttataytgactcaaccg	Gamma重链，3’引物(SpeI)
VL2b：ctgagctccagactgtggtaacycaggag	FDG1：ctactagttgtgtgagttttgtcacaagattt
		VL3a：ctgagctctcctatgwgctgactcagcca	FDG2：ctactagttttgcgctcaactgtcttgtccac
VL3b：ctgagctctcttctgagctgactcaggac	FDG3：ctactagttgtgtgagttgtgtcaccaagtgg
			FDG4：ctactagttgggggaccatatttggactcaac

3.Fab轻链和重链PCR产物克隆到表达载体pCOMb3M

把编码轻链的DNA连接到表达载体pCOMb3M(在pCOMb3H的SacI/XbaI位点之间增加了一个HindIII位点，以方便克隆轻链和重链，pCOMb3H详细序列见GenBank Accession No.AF268280，其结构示意图见附图1。)。然后，把编码Fd重链的DNA连接到上述插入了轻链基因的pGP10，从而形成pCOMb3M/Fab。连接好的载体DNA在1.2％琼脂糖凝胶电泳上与未连接的DNA分离后电击转化大肠杆菌TG1细胞。DNA样品应当完全脱盐。

4.转化

新接种的E.coli TG1菌株250RPM振荡培养至A600约0.5～0.7(大约2～2.5小时)，然后用冰冷的含10％甘油的1mM HEPES(pH7.0)洗涤细胞两次，然后分成100μl的小份，并进行电击。

电击在BIO-RAD Gene Pulser上进行，条件是：25μF，2.5kV，200 ohms(100μl)，所有用具和液体均在冰浴预冷。100ng pGP10/Fab DNA水溶液加入到电击杯，立即进行电击。获得的时间常数是4.5～5msec。电击后的细胞立即用1ml新鲜的LB-G或2×YT-G培养基重悬。上述电击共进行10次，所获细胞混合后在含有6ml无抗生素2×YT-G的50毫升离心管中37℃、250RPM培养1小时。然后，加入75μl 20mg/ml的氨苄青霉素和6×10¹⁰pfu的M13K07，以拯救pGP10/Fab噬粒。1000×g离心20min收获上清，得噬粒悬浮液。

上述过程共重复200次电击，每次可获得约0.67～5.66×10⁸克隆，混合所得噬粒悬浮液，即为超大规模全人源抗体库，称之为HuLib。200次电击的总库容为6.2×10¹⁰分子。拯救的库分成500μl的小份(含约2.7×10¹²噬菌体颗粒)，立即使用或4℃保存备用。

实施例2.用人HER2对全人源抗体库淘筛

以自备h4D5Fab和h2c4Fab为阳性对照，C2B8Fab为阴性对照，以重组人HER2为抗原对上述HuLib进行淘筛。淘筛过程如下：

把1小份HuLib加入到预先用重组人HER2蛋白包被的25毫升细胞培养方瓶中，37℃温育1小时。然后，用含有1％Tween-20的PBS洗涤20次后，加入1ml对数期的TG1细胞，37℃震荡培养16小时。上清转移到一只新的50ml试管，12000rpm离心10分钟。取500μl上清，按照上述方法再次淘筛，总计进行4轮。最后一轮完毕后，获得的细菌细胞悬液稀释至100000细胞/毫升，在含0.1％氨苄青霉素的1.5％琼脂培养平板上筛选，以获得单斑。用上述平板的单斑接种10块96孔深孔板，每孔加入0.25ml带氨苄青霉素的LB培养基，每孔一个单斑，37℃震荡培养16小时后，5000rpm离心20分钟，按孔收取上清，转移至新的96深孔板，4℃保存备用。

用10μg/ml的重组人HER2包被10块96孔免疫板，从上述单斑上清保存物中每孔取10μl转移至包被的板，37℃温育1小时后，有含1％Tween-20的PBS洗涤20次后，加入1μl HRP标记的羊抗M13单抗，37℃温育30分钟，如上洗涤10次。然后，加入200μl含有0.025％DAB和1μl 1％H₂O₂的PBS，读取595nm光密度。0D值最高的孔就是亲和力最高的Fab。

依据上述OD值，鉴定出了1207个OD值比两个阳性对照都高的克隆，进一步亲和力分析发现，B5C3、F3D5、D6C2、C4D9、E5D11、G6E7、H3D7和E3F2值较高，其中G6E7、H3D7和E3F2是最高的。

用Friguent等(Friguet B，et al，1985，J.Immunol.Methods，77：305-319)方法对G6E7、H3D7和E3F2的测定发现，它们的亲和力常数(Ka)为21.34，35.78和18.76nM。

竞争性ELISA试验证明，E3F2和D6C2与h4D5Fab竞争，G6E7与h2C4Fab竞争。根据以上结果，确定以E3F2和G6E7为进化的原型分子。

根据DNA测序结果推断的E3F2Fab轻链和重链的氨基酸序列为SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2，G6E7Fab轻链和重链的氨基酸序列分别为为：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。这些重链和轻链的CDR区的氨基酸序列见实施例3的表2.

实施例3分子进化

用Cunningham and Wells(1989，Science，244：1081-1085)的方法对E3F2和G6E7克隆的所有CDR进行分析，鉴定出对甘氨酸取代敏感的残基，这些残基即为优选的突变位点。下表是E3F2和G6E7中的优选氨基酸位点，其中带下划线的是对取代极为敏感的，带点的是对取代比较敏感的，它们都是优选的突变位点。

表2.克隆的优选突变氨基酸位点

用寡核苷酸介导的随机突变(Kunkel法)对上述优选位点进行突变，通过淘筛可获得对这些位点进一步改良的抗体分子。简要过程是：为了在上述优选位点引入突变，根据Kunkel法设计了突变引物，并以pCOMb3M为载体构建了Fab次级抗体库。采用实施例2以及本领域熟知的方法，以人HER2为抗原对该次级库进行四轮常规淘筛。

以轻链的CDR1为例来进一步说明引物的设计和合成。确定的编码在优选位点带有随机突变的轻链CDR1的引物为：

5’-nnnTCCGCCTCCnnnnnnTCCGGCTCCnnnnnnnnnnnn-3’，N为A、T、C或G。

这一序列与其5’-和3’-端侧翼序列整合后形成如下片段：

5’-gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcnnnTCCGCCTCCnnnnnnTCCGGCTCCnnnnnnnnnnnntggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctat-3’

这一序列编码轻链CDR1，在其优选位点及侧翼序列引入了随机突变。

用本领域熟知的化学法或PCR法合成上述序列。带有优选突变的其他CDR区以此方法进行设计并与其侧翼序列拼接。拼接可以用本领域熟知的重叠PCR进行。通过重叠PCR，可以把这些片段进一步拼接成编码Fab轻链和重链的序列。

把上述序列插入到pCOM3bM，然后引入到E.coli菌株TG1，即可构成所述Fab次级库。按实施例2的方法以重组人HER2为抗原对次级库进行四轮淘筛时，从E3F2次级库中获得了176个OD值超过阳性对照h4D5Fab的克隆，其中A2D5、B5F4、C3A6、E5D2和F2G6亲和力最高；从G6E7次级库获得了145个阳性克隆，其中A6E7、B2F7、D3E5、F5E2和H2D3亲和力最高。上述这些克隆的亲和力分布及其与阳性对照的比较见图3。

对F2G6和H2D3进行了DNA测序。SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6是根据测序结果推测的F2G6的轻链和重链氨基酸序列。SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8是根据测序结果推测的H2D3轻链和重链的氨基酸序列。

对F2G6、h4D5Fab、h2C4Fab和H2D3进行了竞争性试验，发现F2G6和h4D5Fab、h2C4Fab和H2D3分别存在竞争关系，但F2G6和H2D3不存在竞争。这说明，和h4D5Fab与h2C4Fab一样，F2G6和H2D3对HER2的识别表位不同。

实施例4.全长重组蛋白制备

用pGP6C做表达载体、DG44为受体细胞获得了稳转细胞系，对F2G6和H2D3全长蛋白进行了表达，详细操作描述如下。

pGP6C的构建详见附图2。

把F2G6和H2D3的重链和轻链可变区克隆到已预置了恒定区和信号肽序列编码区的双表达框表达载体pGP6C。

上述重组表达载体称之为pGP6C/F2G6F(或pGP6C/H2D3F)，用来瞬转DG44细胞，以检查是否可以产生正确的全长抗体分子及其表达是否正常。如结构正确、表达正常，则用Kpn2酶切线性化pGP6C/F2G6F(或pGP6C/H2D3F)载体。

用上述线性化的载体DNA转染DHFR的预先适应了无血清悬浮培养的DG44受体细胞。转染可用电击或LipFamine2000或其他转染试剂进行，同时进行三个转染。转染完毕，所述细胞在50nM G418压力下进行选择，培养2周。然后转移至96孔板培养至70％覆盖度，换成选择培养基(含5％透析胎牛血清和适当水平的G418)进行筛选，并监控其生长情况，直至为转染的细胞死去，只留下转染的细胞。所述带有转染细胞的板生长大约4周，直至形成细胞团。镜检观察产生的细胞团，至适当大小(大于孔底面积的＞60％)，并确认每孔只有一个细胞团。根据对细胞上清的IgGκ ELISA检测结果，从960个转染子中筛选出98个表达水平相对较高的，并对其进行了静态培养鉴定。对选出的细胞系在EX302无血清培养基(JRH产品)中进行悬浮培养，用ELISA法进一步检定其表达水平并对细胞生长速率进行观察。根据收获上清的抗体浓度和可接受的生长特性，选出了两个最好的细胞系在EX302无血清培养基中进行批式摇瓶培养。用Protein A HPLC法测定，每个细胞系都可产生对F2G6和H2D3的全长抗体分子，产率在10～33pg/cell/day。

以Invitrogen的mRNA纯化试剂盒分离纯化mRNA后按常规方法进行反转录，把获得的cDNA克隆至pUC57，菌落PCR鉴定阳性克隆后，进行DNA测序，证实两个克隆都有全长的轻链和重链编码区。根据DNA测序结果推断的氨基酸序列与预期相同。

用GE Heal thcare的重组抗体的纯化单抗Select/Capto S/Capto Q方案对重组抗体进行纯化。

实施例5.分子进化后亲和力测定

亲和力测定和比较

本发明中，h4D5F指已商品化的全长抗人Her2单抗Trastuzumab，为人源化结构，商品名为Herceptin(赫赛汀)，h4D5Fab指其Fab形式；h2C4F指已商品化的全长抗人Her2单抗Pertuzumab，为人源化结构，商品名为Omnitarg；C2B8F指全长抗人CD20单抗Rituximab，为人鼠嵌合结构，商品名为Rituxan and MabThera(美罗华)，C2B8Fab指其Fab形式，无论是其全长还是其Fab形式均与人Her2无关。

应当指出，本发明中采用的阴性对照C2B8Fab及其全长形式C2B8F是与人Her2无关的人鼠嵌合型抗人CD20单抗，其商品名称为Rituxan。

本研究所用蛋白样品都是用荷有Fab轻链和重链编码区的pCOM3bM转入DH5a后进行表达，并经Protein L亲和层析和分子筛抛光后获得的。制备的样品包括本发明的各分子、阳性对照h4D5Fab和h2C4Fab，以及阴性对照C2B8Fab。

用ELISA方法测定了A2D5、B5F4、C3A6、E5D2、F2G6及其原型分子E3F2的亲和力，阳性对照为自备h4D5Fab。同样地，还测定了A6E7、B2F7、D3E5、F5E2、H2D3及其原型分子G6E7的亲和力。

简而言之，抗体和HER2在溶液中共温育至平衡，然后用ELISA法测定溶液中的自由抗体并用Friguent等的方法(1985，J Immunol Methods，77：305-319)计算亲和力(Kd)。根据测定结果，确定F2G6和H2D3分别为两个不同表位的高亲和力Fab。这两个克隆被用来进一步测定生物活性的候选分子以评价其临床应用价值。

图3A是A2D5、B5F4、C3A6、E5D2、F2G6、其原型分子E3F2和阳性对照h4D5Fab的亲和力比较。由图可见，与原型相比，分子进化获得的F2G6的亲和力得到显著改善。这种改善的生物学意义将在后续试验中进一步验。

图3B是A6E7、B2F7、D3E5、F5E2、H2D3、其原型G6E7和自备阳性对照h2C4Fab的亲和力比较。由图可见，分子进化后获得的H2D3比其原型G6E7的亲和力有很大提高。

在另一个试验中，按照上述方法对全长抗人HER2抗体F2G6F、H2D3F、h4D5F和h2C4F的亲和力进行了比较，其结果示于图4。图4的结果说明，F2G6F和H2D3F在亲和力方面比其相应阳性对照h4D5F和h2C4F有了很大提高。

解离速率试验

为了测定这些单抗的解离速率，下用1ml SKBR3细胞在有azide/2DOG存在的情况与2μg/ml¹²⁵I标记的抗体37℃温育2小时以达到最大结合。离心1.5分钟后，弃上清，沉淀快速溶于1ml培养基并立即转移到含有在37℃保温的9ml培养基的15-ml尖底离心管并混匀。此后2小时在不同时间取样，每次取0.4ml。样品置于phthalate油进行分离以测定仍然存在于细胞表面的放射性抗体的水平。如图5所示，F2G6F和H2D3F从HER2解离的速率明显比其相应阳性对照h4D5F和h2C4F从HER2解离的速率低。

实施例6诱导凋亡

用HER2阳性的SKBR3为靶细胞，C2B8-Fab为阴性对照，对抗人HER2抗体诱导细胞凋亡能力进行了试验。

加入抗HER2抗体后即可诱导凋亡。加入抗体后5到7天对细胞进行计数并进行MTT试验。表3是上述试验的结果。

表3.抗人HER2Fab分子诱导凋亡效果

数据显示，对细胞施用抗人HER2抗体(包括待测样品F2G6和H2D3及其阳性对照)均可诱导细胞凋亡并导致活细胞比例的降低。但施用阴性对照抗体C2B8Fab无此效果。结果还显示，F2G6和H2D3Fab引起的活细胞比例降低比其相应的阳性对照h4D5Fab和h2C4Fab更高。这说明，F2G6和H2D3杀伤HER2阳性细胞的能力比其相应阳性对照更强。

实施例7.抗活体肿瘤功能试验

用SKBR3细胞对裸鼠皮下接种，每鼠5×10⁶细胞。在肿瘤体积达到0.3×0.3×0.3CM时，注射本发明所述的单抗F2G6F和H2D3F、其阳性对照h4D5F和h2C4F以及阴性对照C2B8F。在注射后的第0、10、15、20、25和30天分别测量肿瘤体积，结果示于图6.

图6说明，与阴性对照C2B8F相比，施用任何一种抗HER2抗体都能显著抑制肿瘤的生长，而本发明的F2G6F和H2D3F比其相应阳性对照的抑制作用更为强烈。

实施例8.抗人HER2单抗的CDC试验

用HER2阳性细胞系SKBR3和HER2阴性对照细胞系A431对抗HER2抗体h4D5F、F2G6F、h2C4F、H2D3F和阴性对照C2B8F进行CDC试验。用细胞解离液把靶细胞和对照细胞从培养皿解离后转移到圆底96孔板，每孔2～10⁴细胞，采用三重复设计。进行CDC试验时，细胞与人血清温育，终体积为200μl/孔。对照细胞和靶细胞在无效应细胞、或者在仅仅加入了血清或抗体的情况下进行温育。用LDH测定试剂盒(Roche)测定乳酸脱氢酶LDH的释放来判断肿瘤细胞裂解情况。CDC效应以在人血清存在时测出的细胞裂解百分数表示，以1％Triton X-100裂解靶细胞释放LDH的最大量作为100％。

靶细胞和对照细胞在有或无人血清(补体源)与10μg/ml所述抗体温育2或6小时后测定裂解情况。如图7所示，在有人血清时，SKBR3细胞可被F2G6F和H2D3F更有效地裂解，2小时的平均裂解率达65％，6小时时达80％，但阳性对照h2C4F只有50％。如同预期，未观察到h4D5F和C2B8F的裂解作用。这与h4D5F无CDC作用的报道一致(Drebrin et al，1988)。在无人血清时SKBR3细胞不能被F2G6F、H2D3F和h2C4F裂解。此外，HER2阴性细胞在有人血清时也不能被HER2抗体诱导裂解。在无血清情况下，SKBR3不能被裂解(数据未给出)。

无论有血清或是无血清，Her2阴性细胞均不发生裂解(数据未给出)。

实施例9.抗HER2抗体的ADCC试验

为测定抗HER2抗体是否具有动员免疫效应细胞的功能，对PBL诱导肿瘤细胞裂解进行了试验。

用细胞解离液把靶细胞和对照细胞从培养皿解离后转移到圆底96孔板，每孔2～10⁴细胞，采用三重复设计，终体积为200μl/孔。进行ADCC试验时，用抗体(3μg/ml，无血清培养基配制)和新鲜制备的外周血淋巴细胞(PBL)对细胞进行处理，37℃温育3至4小时。对照细胞和靶细胞在无效应细胞、或者在仅仅加入了血清或抗体的情况下进行温育。用LDH测定试剂盒(Roche)测定乳酸脱氢酶LDH的释放以研究肿瘤细胞裂解情况。ADCC效应以在人血清和抗体存在时测出的细胞裂解百分数表示，以1％Triton X-100裂解靶细胞释放的最大量LDH作为100％。

为了测定抗人HER2抗体诱发ADCC作用，在有(3μg/ml)或无抗HER2抗体的情况下SKBR3和A431细胞与不同浓度效应细胞PBL温育3小时。如图8A所示，在PBL存在的情况下，受试抗人HER2抗体F2G6F和H2D3F都能有效地诱导SKBR3靶细胞裂解，细胞裂解的程度前者可超过70％，后者达到65％。但阳性对照h4D5F和h2C4F只能诱导略高于40％左右的细胞裂解。图8A数据还表明，(1)阴性对照抗体C2B8F和缺失了Fc片段的Fab分子也都不能诱导ADCC，(2)就诱导ADCC的作用而言，F2G6F显著超过其对应的阳性对照h4D5F，H2D3F显著超过其对应的阳性对照h2C4F。

图8B表明，所有抗HER2抗体均对HER2阴性细胞A431无诱导作用。细胞毒作用的基线可在PBL或仅仅有抗HER2抗体存在的情况下来测定。

Claims (9)

1.一种全人源抗人HER2单抗，其特征在于，所述全人源抗人HER2单抗能特异性地与人HER2结合。

2.如权利要求1所述的全人源抗人HER2单抗，其特征在于，所述全人源抗人HER2单抗为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、分泌型IgA、IgD或IgE型的抗体。

3.如权利要求1所述的全人源抗人HER2单抗，其特征在于，所述全人源抗人HER2单抗包括轻链与重链；所述轻链包含如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7所示氨基酸序列或其一部分，所述重链包含如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8所示氨基酸序列或其一部分。

4.如权利要求3所述的全人源抗人HER2单抗，其特征在于，所述全人源抗人HER2单抗是一种全长的抗体、抗体的一个片段或片段组合物或单链抗体。

5.如权利要求3所述的全人源抗人HER2单抗，其特征在于，所述全人源抗人HER2单抗为scFv、Fab、F(ab′)₂，或具有与人HER2结合能力的其他形式。

6.如权利要求1所述的全人源抗人HER2单抗，其特征在于，所述全人源抗人HER2单抗是PEG化的或非PEG化的。

7.一种转染子、真核或原核受体细胞，其特征在于，所述转染子、真核或原核受体细胞能产生权利要求3所述抗体或权利要求3所述抗体一部分的抗体，其中，权利要求3所述抗体一部分的抗体选自权利要求3所述抗体的scFv、Fab、F(ab)₂、F(ab′)₂或其他形式的能与人HER2结合的抗体。

8.一种用于治疗或预防与人HER2或HER2表达细胞有关的疾病的药物组合物，包括有效治疗剂量的如权利要求1-6中任一权利要求所述全人源抗人HER2单抗及药学上可接受的辅料。

9.一种用于治疗或预防乳腺癌的药物组合物，包括有效治疗剂量的如权利要求1-6中任一权利要求所述全人源抗人HER2单抗及药学上可接受的辅料。

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