CN112646032A - 靶向bcma的具有人猴交叉的人源化单克隆抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种分离的靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的单克隆抗体，其中，所述抗体既能结合人BCMA也能结合猴BCMA。本发明还涉及编码该抗体的核酸，以及一种生产单克隆抗体的方法，以及包含本发明抗体的药物组合物。
Description
技术领域
本发明涉及特异性结合B细胞成熟抗原(BCMA)，包括同时特异性结合人BCMA和猴BCMA抗原的单克隆抗体及其片段。
本发明涉及特异性结合BCMA并且抑制BAFF和APRIL对BCMA受体结合的单克隆抗体及其片段。
本发明还涉及特异性结合BCMA并且具有优异内吞效应的单克隆抗体及其片段。
背景技术
B细胞于骨髓中成熟并成为浆细胞，能够分泌抗体对抗外来的病毒或细菌。当浆细胞发生癌变成为骨髓瘤细胞后，会不断增殖出更多恶性的骨髓瘤细胞并分泌大量无用的抗体。骨髓瘤通常生长在脊柱、颅骨、骨盆、胸腔等位置，表现为一种肿瘤或者是溶骨性病变。骨髓瘤的病情通常是渐进式，从意义未明的单克隆丙种球蛋白血症(MGUS)到低风险冒烟型多发性骨髓瘤再到高危冒烟型多发性骨髓瘤(SMM)，最终进展成多发性骨髓瘤(NatureReviews Disease Primers,2017,3,17046.)。多发性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)主要的表征包括高血钙症、肾功能减退、贫血、骨骼功能障碍等，伴随剧烈的骨疼痛和容易发生反复性骨折(Nature Reviews Clinical Oncology,2012,9(3),135–143.)。据国际骨髓瘤基金会统计，仅截止2017年8月，全球患病人数达75万人左右，每年新发病例约为11.40万人，并有近9万人死于该疾病。
B细胞成熟抗原(BCMA)，属于肿瘤坏死因子超家族的一员，主要表达于记忆细胞、浆母细胞和浆细胞表面，而在其他细胞表面几乎不表达，另一方面，BCMA属于细胞表面的跨膜受体，其基因定位于16号染色体的TNFRSF17位点。有文献报道(Blood Cancer Journal,2015,5(2),e282–e282.)，BCMA缺陷的小鼠在表观和B细胞数量上都较为正常，但其浆细胞的存活能力极差。
BCMA的配体包括B细胞活化因子(BAFF)和诱导增殖配体(APRIL)。其中，BAFF的受体还包括BAFF-R和TACI，APRIL的受体还包括TACI。BCMA信号通路主要的作用是促进B细胞的生存、分化和调节性T细胞的激活等，相反的，TACI信号通路抑制B细胞的成熟(Naturereviews immunology,2009,9(7):491.)。对于这三种受体而言(BAFF-R、TACI和BCMA)，在B细胞发育过程中，未成熟B细胞、迁移中的B细胞和初始B细胞表面只表达BAFF-R；GC B细胞表面均有表达BAFF-R和BCMA；记忆细胞表面均有表达BAFF-R、TACI和BCMA；浆母细胞或浆细胞表面均表达TACI和BCMA；而当浆细胞发生癌变成为多发性骨髓瘤细胞后，其表面高度表达BCMA，有可能表达TACI而不表达BAFF-R(Nature reviews immunology,2009,9(7):491.)。由此可知，大部分的B细胞都不表达BCMA，另外，研究表明其他器官的细胞也几乎不表达BCMA。临床上，多发性骨髓瘤病人血清中BCMA、BAFF和APRIL的含量更高且总生存期和预后更差。因此，在治疗多发性骨髓瘤方面，BCMA是一种优于CD19等的新靶点，其特异性高且靶点副作用更小。因此，开发针对BCMA靶点的具有阻断效应或内吞效应的抗体药物不仅能够提高多发性骨髓瘤的治疗效果，还能极大降低治疗的副作用，并且可以产生巨大的经济和社会价值。
目前，在ADC(抗体药物偶联物(antibody-drug conjugate，ADC))药物方面，GlaxoGroup公司和Seattle Genetics公司共同开发的Belantamab mafodotin(简称为GSK2857916)效果显著，在35例过度预治疗(大多数患者至少接受了5种疗法且治疗失败)R/R MM患者中，ORR达到了60％，中位PFS(Progression-Free-Survival(无进展生存期))为12个月(NCT03848845)。在CAR-T细胞方面，新基和蓝鸟生物的CAR-T细胞疗法Idecabtagenevicleucel(简称为bb2121)，在33例既往已接受至少3种疗法失败的R/R MM患者中，总缓解率达到了85％，中位PFS为11.8个月(NCT02658929)。在双特异性抗体方面，安进的AMG 420是进展最快的疗法，这类抗体较传统抗体小，由两个抗体域片段连接而成，具有很好的活性，但半衰期比全长抗体短(NCT02514239)。就临床结果而言，针对BMCA靶点的药物，无论是单抗、双抗、ADC还是CAR-T细胞治疗，都取得了令人瞩目的结果，并且临床结果表明，BCMA靶点带来的副作用也远低于其他靶点。
发明内容
基于上述背景，本发明意在开发出新型的靶向BCMA的抗体。
本发明以BCMA作为免疫原免疫小鼠，通过噬菌体展示技术，构建并筛选抗体文库，获得同时结合人和猴BCMA抗原的单克隆抗体。后续通过抗体人源化改造，将鼠源单克隆抗体改造为人源化抗体，通过亲和、阻断和内吞等功能实验证实人源化候选抗体表现出了优异的功能，在细胞水平的内吞功能优于竞品GSK2857916。
本说明书内公开的所有专利和参考文献通过引用清楚和完整地并入本文。
在本发明涉及一种分离的靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的单克隆抗体，其中，所述抗体既能结合人BCMA也能结合猴BCMA。
在一具体方面中，本发明的抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ IDNO:1或2所示的重链互补决定区1(CDR-H1)，和/或包含SEQ ID NO:3或4所示的重链互补决定区2(CDR-H2)，和/或包含SEQ ID NO:5或6所示的重链互补决定区3(CDR-H3)。
在一具体方面中，本发明的抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:7或8所示的轻链互补决定区1(CDR-L1)，和/或包含SEQ ID NO:9或10所示的轻链互补决定区2(CDR-L2)，和/或包含SEQ ID NO:11或12所示的轻链互补决定区3(CDR-L3)。
在一具体方面中，本发明的抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1或2所示的重链互补决定区1(CDR-H1)，和/或包含SEQ ID NO:3或4所示的重链互补决定区2(CDR-H2)，和/或包含SEQ ID NO:5或6所示的重链互补决定区3(CDR-H3)；所述轻链可变区包含SEQ ID NO:7或8所示的轻链互补决定区1(CDR-L1)，和/或包含SEQ ID NO:9或10所示的轻链互补决定区2(CDR-L2)，和/或包含SEQ ID NO:11或12所示的轻链互补决定区3(CDR-L3)。
在一具体方面中，本发明的抗体包含上述抗体的变体，且具备与上述本发明所述的抗体相同或相似的活性。
在一具体方面中，本发明的抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:13或14所示的氨基酸序列、或上述序列的变体。
在一具体方面中，本发明的抗体包含重链可变区，所述重链可变区具有SEQ IDNO:15或16所示的氨基酸序列、或上述序列的变体。
在一具体方面中，本发明的抗体包含轻链可变区和重链可变区，其中，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:13或14所示的氨基酸序列、或上述序列的变体，所述重链可变区具有SEQ ID NO:15或16所示的氨基酸序列、或上述序列的变体。
在一具体方面中，本发明的抗体的重链可变区包含SEQ ID NO:1所示的CDR-H1，SEQ ID NO:3所示的CDR-H2和SEQ ID NO:5所示的CDR-H3。
在一具体方面中，本发明的抗体的重链可变区包含SEQ ID NO:2所示的CDR-H1，SEQ ID NO:4所示的CDR-H2和SEQ ID NO:6所示的CDR-H3。
在一具体方面中，本发明的抗体的轻链可变区包含SEQ ID NO:7所示的CDR-L1，SEQ ID NO:9所示的CDR-L2和SEQ ID NO:11所示的CDR-L3。
在一具体方面中，本发明的抗体的轻链可变区包含SEQ ID NO:8所示的CDR-L1，SEQ ID NO:10所示的CDR-L2和SEQ ID NO:12所示的CDR-L3。
在一具体方面中，本发明的抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:13或14所示的序列，或具有与上述任一序列至少80％，例如，85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相似性的序列。
在一具体方面中，本发明的抗体的重链可变区具有SEQ ID NO:15或16所示的序列，或具有与上述任一序列至少80％，例如，85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相似性的序列。
在一具体方面中，本发明的抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中，重链可变区包含SEQ ID NO:1所示的CDR-H1，SEQ ID NO:3所示的CDR-H2和SEQ ID NO:5所示的CDR-H3；轻链可变区包含包含SEQ ID NO:7所示的CDR-L1，SEQ ID NO:9所示的CDR-L2和SEQ ID NO:11所示的CDR-L3。
进一步，所述抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:13所示的序列，或具有与上述任一序列至少80％，例如，85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相似性的序列；所述抗体的重链可变区具有SEQ ID NO:15所示的序列，或具有与上述任一序列至少80％，例如，85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相似性的序列。
在一具体方面中，本发明的抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中，重链可变区包含SEQ ID NO:2所示的CDR-H1，SEQ ID NO:4所示的CDR-H2和SEQ ID NO:6所示的CDR-H3；轻链可变区包含包含SEQ ID NO:8所示的CDR-L1，SEQ ID NO:10所示的CDR-L2和SEQ IDNO:12所示的CDR-L3。
进一步，所述抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:14所示的序列，或具有与上述任一序列至少80％，例如，85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相似性的序列；所述抗体的重链可变区具有SEQ ID NO:16所示的序列，或具有与上述任一序列至少80％，例如，85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相似性的序列。
本发明还涉及一种靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的单克隆抗体，该抗体与上述本发明所述的抗体识别相同的抗原决定部位。
本发明还涉及一种靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的单克隆抗体，该抗体与上述本发明所述的抗体竞争性结合B细胞成熟抗原(BCMA)。
本发明还涉及编码上述本发明的抗体的核酸。
本发明还涉及一种表达载体，其包含上述本发明所述的核酸。
本发明还涉及一种宿主细胞，其包含上述本发明所述的表达载体或基因组中整合有本发明所述的核酸。
本发明还涉及一种生产单克隆抗体的方法，所述方法包括培养本发明所述的宿主细胞从而生产上述本发明所述的单克隆抗体。
本发明还涉及一种药物组合物，其包含本发明所述的单克隆抗体和药学上可接受的载体。
本发明还涉及一种药盒或制品，其包括本发明所述的单克隆抗体或本发明所述的药物组合物。
本发明还涉及一种治疗与BCMA的表达相关的疾病的方法，其包括：向有此需要的受试者给药本发明所述的单克隆抗体或本发明所述的药物组合物或本发明所述的药盒或制品。
在一具体方面，上述疾病选自B细胞急性淋巴性白血病、T细胞急性淋巴性白血病、急性淋巴性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、伯基特淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病，小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴瘤、恶性淋巴增殖状况、MALT淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突细胞瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、骨髓瘤、MGUS、浆细胞瘤、系统性淀粉样蛋白轻链淀粉样变性和POEMS综合征。
在一具体方面，上述疾病为多发性骨髓瘤。
本发明还涉及本发明的单克隆抗体在制备用于治疗与BCMA的表达相关的疾病的药物中的用途。
在一具体方面，上述疾病选自B细胞急性淋巴性白血病、T细胞急性淋巴性白血病、急性淋巴性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、伯基特淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病，小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴瘤、恶性淋巴增殖状况、MALT淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突细胞瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、骨髓瘤、MGUS、浆细胞瘤、系统性淀粉样蛋白轻链淀粉样变性和POEMS综合征。
在一具体方面，上述疾病为多发性骨髓瘤。
具体来说，本发明涉及如下方面：
1.一种分离的靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的单克隆抗体，其中，所述抗体既能结合人BCMA也能结合猴BCMA。
2.根据项1所述的单克隆抗体，所述抗体选自以下的任一种：
(1)抗体，其包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1或2所示的重链互补决定区1(CDR-H1)，和/或包含SEQ ID NO:3或4所示的重链互补决定区2(CDR-H2)，和/或包含SEQ ID NO:5或6所示的重链互补决定区3(CDR-H3)；
(2)抗体，其包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:7或8所示的轻链互补决定区1(CDR-L1)，和/或包含SEQ ID NO:9或10所示的轻链互补决定区2(CDR-L2)，和/或包含SEQ ID NO:11或12所示的轻链互补决定区3(CDR-L3)；
(3)抗体，包含(1)所述抗体的重链可变区及(2)所述抗体的轻链可变区；
(4)抗体，(1)～(3)中任一项所述的抗体的变体，且具备与(1)～(3)中任一项所述的抗体相同或相似的活性。
3.如项1或2所述的抗体，其特征在于，所述抗体选自以下的任一种：
(1)抗体，包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:13或14所示的氨基酸序列、或上述序列的变体；
(2)抗体，包含重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:15或16所示的氨基酸序列、或上述序列的变体；
(3)抗体，包含(1)所述抗体的重链可变区及(2)所述抗体的轻链可变区。
4.如项1～3中任一项所述的抗体，其特征在于，所述的抗体的重链可变区包含SEQID NO:1所示的CDR-H1，SEQ ID NO:3所示的CDR-H2和SEQ ID NO:5所示的CDR-H3。
5.如项1～3中任一项所述的抗体，其特征在于，所述的抗体的重链可变区包含SEQID NO:2所示的CDR-H1，SEQ ID NO:4所示的CDR-H2和SEQ ID NO:6所示的CDR-H3。
6.如项1～3中任一项所述的抗体，其特征在于，所述的抗体的轻链可变区包含SEQID NO:7所示的CDR-L1，SEQ ID NO:9所示的CDR-L2和SEQ ID NO:11所示的CDR-L3。
7.如项1～3中任一项所述的抗体，其特征在于，所述的抗体的轻链可变区包含SEQID NO:8所示的CDR-L1，SEQ ID NO:10所示的CDR-L2和SEQ ID NO:12所示的CDR-L3。
8.根据项1～3中任一项所述的抗体，其特征在于，所述的抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:13或14所示的序列，或具有与上述任一序列至少80％，例如，85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相似性的序列。
9.根据项1～3中任一项所述的抗体，其特征在于，所述的抗体的重链可变区具有SEQ ID NO:15或16所示的序列，或具有与上述任一序列至少80％，例如，85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相似性的序列。
10.一种靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的单克隆抗体，其特征在于，该抗体与项1-9中任一项所述的抗体识别相同的抗原决定部位。
11.一种靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的单克隆抗体，其特征在于，该抗体与项1-9中任一项所述的抗体竞争性结合B细胞成熟抗原(BCMA)。
12.编码项1-11中任一项所述的抗体的核酸。
13.一种表达载体，其包含项12所述的核酸。
14.一种宿主细胞，其包含项13所述的表达载体或基因组中整合有项12所述的核酸。
15.一种生产单克隆抗体的方法，所述方法包括培养根据项14所述的宿主细胞从而生产根据项1～11中任一项所述的单克隆抗体。
16.一种药物组合物，其包含根据项1～11中任一项所述的单克隆抗体和药学上可接受的载体。
17.一种药盒或制品，其包括根据项1～11中任一项所述的单克隆抗体或根据项16所述的药物组合物。
18.一种治疗与BCMA的表达相关的疾病的方法，其包括：
向有此需要的受试者给药根据项1～11中任一项所述的单克隆抗体或根据项16所述的药物组合物或项17所述的药盒或制品。
19.根据项18所述的方法，其中，所述疾病选自B细胞急性淋巴性白血病、T细胞急性淋巴性白血病、急性淋巴性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、伯基特淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病，小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴瘤、恶性淋巴增殖状况、MALT淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突细胞瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、骨髓瘤、MGUS、浆细胞瘤、系统性淀粉样蛋白轻链淀粉样变性和POEMS综合征。
20.根据项18或19所述的方法，其中，所述疾病为多发性骨髓瘤。
21.根据项1～11中任一项所述的单克隆抗体在制备用于治疗与BCMA的表达相关的疾病的药物中的用途。
22.根据项21所述的用途，其中，所述疾病选自B细胞急性淋巴性白血病、T细胞急性淋巴性白血病、急性淋巴性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、伯基特淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病，小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴瘤、恶性淋巴增殖状况、MALT淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突细胞瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、骨髓瘤、MGUS、浆细胞瘤、系统性淀粉样蛋白轻链淀粉样变性和POEMS综合征。
23.根据项21或22所述的用途，其中，所述疾病为多发性骨髓瘤。
本发明的效果
相比于Belantamab mafodotin抗体(简称为GSK2857916)，本发明涉及的抗体既能结合人BCMA也能结合猴BCMA，在亲和水平方面，与之接近甚至更好。本发明涉及的抗体在阻断BCMA结合其配体BAFF或APRIL效果方面，与GSK2857916接近甚至更好。本发明涉及的抗体在内吞效果方面，具有比GSK2857916更好的内吞效果。本发明涉及的抗体在热稳定性方面，具有比GSK2857916更好的热稳定性。本发明涉及的抗体，在免疫原性方面，为人源化后的抗体，具有更低的免疫原性。
附图说明
图1显示抗体产生的过程，显示靶向BCMA的具有人猴交叉的抗体产生的过程。
图2显示重组蛋白BCMA、BAFF和APRIL活性测定，结果显示各蛋白活性正常。图2(A)显示不同标签(Fc和His)的人和猴BCMA抗原和阳性对照抗体GSK2857916的结合结果。图2(B)显示人BCMA抗原和不同浓度包板的BAFF的结合结果。图2(C)显示人BCMA抗原和不同浓度包板的APRIL的结合结果。
图3显示候选抗体与过表达人或猴BCMA的细胞结合测定，结果表明候选抗体具有人猴交叉的特性。图3(A)显示通过FACS确定部分候选抗体与过表达人BCMA的HEK293细胞的结合。图3(B)显示通过FACS确定部分候选抗体与过表达猴BCMA的CHO细胞的结合。
图4显示部分候选抗体与人、猴BCMA交叉亲和活性检测结果。图4(A)显示部分候选抗体在Elisa水平上与人BCMA的亲和效果，结果表明，部分候选抗体相比于GSK2857916抗体有接近甚至更好的亲和效果。图4(B)显示部分候选抗体在Elisa水平上与猴BCMA的亲和效果，结果表明，部分候选抗体相比于GSK2857916抗体有接近甚至更好的亲和效果。
图5显示部分候选抗体阻断效果检测结果。图5(A)显示部分候选抗体在Elisa水平上阻断BCMA与BAFF的结合，结果表明，部分候选抗体相比于GSK2857916抗体有接近甚至更好的阻断效果。图5(B)和显示部分候选抗体在Elisa水平上阻断BCMA与APRIL的结合，结果表明，部分候选抗体相比于GSK2857916抗体有接近甚至更好的阻断效果。
图6显示内吞效果测定结果。图6(A)和(B)显示部分候选抗体在人骨髓瘤细胞系H929细胞上的内吞效果，结果表明，部分候选抗体相比于GSK2857916抗体有更好的内吞效果。
图7显示候选抗体各个功能汇总，其中图7展示了部分候选抗体在表达人BCMA的HEK293细胞上的亲和效果，表达猴BCMA的CHO细胞上的亲和效果，Elisa水平上和人、猴BCMA的亲和效果，Elisa水平上阻断BAFF与BCMA结合的效果、Elisa水平上阻断APRIL与BCMA结合的效果，以及抗体在人骨髓瘤细胞H929上的内吞效果；其中‘+’数量从多到少，代表抗体亲和、阻断及内吞效果由强到弱，结果表明，抗体SY14-3rd-5-6-7和SY14-3rd-5-6-32表现出了更优异的综合效果。
图8显示人源化后抗体(5-6-7-hu-2)与人、猴BCMA交叉亲和活性检测结果。图8(A)显示检测SY14-3rd-5-6-7(又称5-6-7或5-6-7-WT)抗体人源化前后，在Elisa水平上与人BCMA的亲和效果，结果表明，抗体人源化后与人BCMA的亲和力和人源化前保持一致。图8(B)显示检测SY14-3rd-5-6-7抗体人源化前后，在Elisa水平上与猴BCMA的亲和效果，结果表明，抗体人源化后与猴BCMA的亲和力和人源化前保持一致。
图9显示人源化后抗体(5-6-32-hu-2)与人、猴BCMA交叉亲和活性检测结果，图9(A)显示检测SY14-3rd-5-6-32(又称5-6-32或5-6-32-WT)抗体人源化前后，在Elisa水平上与人BCMA的亲和效果，结果表明，抗体人源化后与人BCMA的亲和力依旧优于阳性抗体(GSK2857916)。图9(B)检测SY14-3rd-5-6-32抗体人源化前后，在Elisa水平上与猴BCMA的亲和效果，结果表明，抗体人源化后与猴BCMA的亲和力依旧优于阳性抗体GSK2857916。
图10显示人源化后抗体(5-6-7-hu-2)阻断效果检测结果，图10(A)显示检测SY14-3rd-5-6-7(又称5-6-7或5-6-7-WT)抗体人源化后，在Elisa水平上阻断BCMA与BAFF结合的能力，结果表明，抗体人源化后阻断BCMA结合BAFF的效果稍差于阳性抗体(GSK2857916)。图10(B)显示检测SY14-3rd-5-6-7抗体人源化后，在Elisa水平上阻断BCMA与APRIL结合的能力，结果表明，抗体人源化后阻断BCMA结合APRIL的效果稍差于阳性抗体(GSK2857916)。
图11显示人源化后抗体(5-6-32-hu-2)阻断效果检测结果，图11(A)显示检测SY14-3rd-5-6-32(又称5-6-32或5-6-32-WT)抗体人源化后，在Elisa水平上阻断BCMA与BAFF结合的能力，结果表明，抗体人源化后阻断BCMA结合BAFF的效果稍差于阳性抗体(GSK2857916)。图11(B)显示检测SY14-3rd-5-6-32抗体人源化后，在Elisa水平上阻断BCMA与APRIL结合的能力，结果表明，抗体人源化后阻断BCMA与APRIL的效果稍差于阳性抗体(GSK2857916)。
图12显示人源化前后抗体在高表达人、猴BCMA的细胞结合活性测定结果，图12(A)显示检测5-6-7和5-6-32抗体人源化前后与过表达人BCMA的HEK293细胞的结合能力，结果表明抗体人源化后与之的结合能力和人源化前保持一致并且优于GSK2857916抗体。图12(B)显示检测5-6-7和5-6-32抗体人源化前后与过表达猴BCMA的CHO细胞的结合能力，结果表明抗体人源化后与之的结合能力和人源化前保持一致并且优于GSK2857916抗体。图12(C)显示检测5-6-7和5-6-32抗体人源化前后与骨髓瘤细胞系H929细胞的结合能力，结果表明抗体人源化后与之的结合能力和人源化前保持一致并且优于GSK2857916抗体。
图13显示抗体人源化前后在H929细胞上的内吞效果测定结果，图13(A)显示检测5-6-7抗体人源化前后，在表达BCMA的人骨髓瘤细胞系H929细胞上内吞的效果，结果表明抗体人源化后内吞效果和人源化前保持一致并且优于GSK2857916抗体。图13(B)显示检测5-6-32抗体人源化前后，在表达BCMA的人骨髓瘤细胞系H929细胞上内吞的效果，结果表明抗体人源化后内吞效果和人源化前保持一致并且优于GSK2857916抗体。
图14显示人源化抗体各个功能汇总结果，图14展示了人源化抗体的人源化程度，在表达人BCMA的HEK293细胞上的亲和效果，在表达猴BCMA的CHO细胞上的亲和效果，在Elisa水平上和人、猴BCMA的亲和效果，阻断BAFF与BCMA结合效果、阻断APRIL与BCMA结合效果，以及抗体在人骨髓瘤细胞H929上的内吞效果；其中‘+’数量从多到少，代表抗体亲和、阻断及内吞效果由强至弱。结果表明，抗体人源化后各个功能和人源化前保持一致，人源化抗体部分功能接近或优于GSK2857916抗体。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
本说明书中提及的科技术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义，如有冲突以本说明书中的定义为准。
一般而言，本说明书中采用的术语具有如下含义。
在本说明书中，“分离的”抗体是已经与它的天然环境的组分分离的抗体。在某些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，所述纯度通过例如电泳(例如，SDS-PAGE等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)来确定。
本文中的术语“BCMA”，也是B细胞成熟抗原，也称为CD269，是肿瘤坏死因子受体超家族成员，即TNFRSF17(Thompson等人,J.Exp.Medicine,192(1):129-135,2000)。人BCMA几乎排他性地在浆细胞和多发性骨髓瘤细胞中表达(参见例如Novak等人,Blood,103(2):689-694,2004；Neri等人,Clinical Cancer Research,73(19):5903-5909；Felix等人,Mol.Oncology,9(7):1348-58,2015)。BCMA可结合B细胞活化因子(BAFF)和增殖诱导配体(APRIL)(例如Mackay等人,2003和Kalled等人,Immunological Review,204:43-54,2005)。BCMA可以是针对多发性骨髓瘤的免疫治疗剂的合适肿瘤抗原靶标。
“抗原(Ag)”是指可以刺激动物中的抗体产生或T细胞应答的化合物、组合物或物质，包括注射或吸收到动物中的组合物(例如包括癌症特异性蛋白的组合物)。抗原与特异性体液或细胞免疫的产物(包括由异源抗原(例如所公开的抗原)诱导的产物)反应。在特定实施例中，靶抗原是BCMA多肽的表位。
“表位”或“抗原决定子”是指抗原的被结合剂结合的区。表位可以由连续氨基酸或经蛋白质的三级折叠并接的不连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂时通常保留，而通过三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理时通常消失。表位通常在独特空间构象中包括至少3个，并且更通常至少5个、约9个或约8-10个氨基酸。
抗体包括其抗原结合片段，例如骆驼Ig、Ig NAR、Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、F(ab)'3片段、Fv、单链Fv蛋白(“scFv”)、双-scFv、(scFv)2、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)和单结构域抗体(sdAb，纳米抗体)以及负责抗原结合的全长抗体的部分。所述术语还包括经遗传工程改造的形式，例如嵌合抗体(例如人类化鼠抗体)、杂结合抗体(例如双特异性抗体)和其抗原结合片段。还参看皮尔斯目录与手册(Pierce Catalog and Handbook),1994-1995(皮尔斯化学公司(PierceChemical Co.),罗克福德(Rockford),伊利诺伊州(IL))；Kuby,免疫学杂志,第3版,W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman&Co.),纽约,1997。
如技术人员所理解并且如本文别处所描述，完全抗体包含两个重链和两个轻链。每个重链由可变区以及第一、第二和第三恒定区组成，而每个轻链由可变区和恒定区组成。哺乳动物重链分类为α、δ、ε、γ和μ。哺乳动物轻链分类为λ或κ。包含α、δ、ε、γ和μ重链的免疫球蛋白分类为免疫球蛋白(Ig)A、IgD、IgE、IgG和IgM。完全抗体形成“Y”形状。Y的茎由两个重链的第二和第三恒定区(并且对于IgE和IgM，第四恒定区)结合在一起组成，并且二硫键(链间)在铰链中形成。重链γ、α和δ具有由三个串联(成一行)Ig结构域构成的恒定区，和用于增加柔性的铰链区；重链μ和ε具有由四个免疫球蛋白结构域构成的恒定区。第二和第三恒定区分别称为“CH2结构域”和“CH3结构域”。Y的每个臂包括结合到单个轻链的可变和恒定区的单个重链的可变区和第一恒定区。轻链和重链的可变区负责抗原结合。
轻链和重链可变区含有间杂有三个高变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)的“构架”区。CDR可以通过常规方法定义或鉴别，例如通过根据Kabat等人的序列(Wu,TT和Kabat,E.A.,实验医学杂志132(2):211-50,(1970)；Borden,P.和Kabat E.A.,PNAS,84:2440-2443(1987)；参看Kabat等人,免疫学感兴趣的蛋白质的序列(Sequences of ProteinsofImmunological Interest),美国卫生和公众服务部(U.S.Department of HealthandHuman Services),1991，其在此以引用的方式并入)，或通过根据Chothia等人的结构(Choithia,C.和Lesk,A.M.,分子生物学杂志(J Mol.Biol.),196(4):901-917(1987)；Choithia,C.等人,自然(Nature),342:877-883(1989))。
不同轻链或重链的构架区的序列在物种(例如人类)内具有相对保存性。抗体的构架区(其是成分轻链和重链的组合构架区)用以在三维空间中定位和比对CDR。CDR主要负责结合到抗原的表位。每个链的CDR通常称为CDR1、CDR2和CDR3，从N末端开始依序编号，并且通常还通过特定CDR所位于的链鉴别。因此，位于抗体的重链的可变结构域中的CDR称为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，而位于抗体的轻链的可变结构域中的CDR称为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。具有不同特异性(即针对不同抗原有不同组合位点)的抗体具有不同CDR。尽管抗体与抗体之间的CDR不同，但CDR内仅有限数目的氨基酸位置直接参与抗原结合。CDR内的这些位置称为特异性决定残基(SDR)。适用于构建本文所涵盖的人类化BCMA CAR的轻链CDR的说明性实例包括(但不限于)SEQ ID NO:1-3中所阐述的CDR序列。适用于构建本文所涵盖的人类化BCMA CAR的重链CDR的说明性实例包括(但不限于)SEQ ID NO:4-6中所阐述的CDR序列。
提及“VH”或“VH”是指免疫球蛋白重链的可变区，包括抗体、Fv、scFv、dsFv、Fab或如本文所公开的其它抗体片段的重链可变区。提及“VL”或“VL”是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括抗体、Fv、scFv、dsFv、Fab或如本文所公开的其它抗体片段的轻链可变区。
“单克隆抗体”是由B淋巴细胞的单个克隆或由其中已经转染单个抗体的轻链和重链基因的细胞产生的抗体。单克隆抗体通过本领域的技术人员已知的方法产生，例如通过由骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合体制备杂交抗体形成细胞。单克隆抗体包括人类化单克隆抗体。
“Fv”是含有完全抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施例中，双链Fv种类由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域呈紧密非共价缔合的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中，一个重链可变结构域与一个轻链可变结构域可以通过柔性肽连接子共价连接，使得轻链和重链可以按类似于双链Fv种类的“二聚”结构缔合。在这一配置中，每个可变结构域的三个高变区(HVR)相互作用以定义VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。六个HVR共同地赋予对抗体的抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或包含仅三个对抗原具有特异性的HVR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，但亲和力低于完整结合位点。
Fab片断含有重链可变结构域和轻链可变结构域并且还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab′片段与Fab片段不同之处在于，重链CH1结构域的羧基末端增添了几个残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab′-SH是本文关于Fab′的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基携有游离硫醇基。F(ab′)2抗体片段最初是作为其间具有铰链半胱氨酸的Fab′片段对产生。还已知抗体片段的其它化学偶合。
如上所述，本发明涉及一种分离的靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的单克隆抗体，其中，所述抗体既能结合人BCMA也能结合猴BCMA。具体来说，在本发明中，利用流式细胞仪操作方法(FACS方法)验证了本发明的抗体对表达人和猴BCMA细胞的亲和效果。本发明所得到的单克隆抗体对于人BCMA-HEK293细胞的亲和效果都优于阳性对照抗体(GSK2857916)。本发明所得到的单克隆抗体对于猴BCMA-CHO细胞的亲和效果都接近或优于阳性对照抗体(GSK2857916)。本发明所得到的单克隆抗体，能够同时高亲和地结合人和猴的BCMA抗原，和猴的BCMA抗原结合，便于抗体在进入临床研究前，以猴(食蟹猴)作为模型，很好地进行毒理评估和药代动力学评估。同时，本发明的单克隆抗体具有很高的亲和力，高亲和力的抗体在药效上更具优势，诸如抗体结合到靶标抗原分子上后解离下来更慢，使得抗体在细胞内吞效果等更好，而且达到同等细胞或动物药效作用情况下，所需的抗体剂量可能也更低。
在本文所用，术语“特异性结合”、“特异性识别”或“对......具有特异性”是指可测定的和可再现的相互作用，诸如靶标和抗原结合蛋白之间的结合。例如，特异性结合靶标(可以是表位)的抗原结合蛋白是与其他靶标的结合相比，与该靶标的结合具有更大的亲和力、亲合力、更容易和/或具有更长的持续时间的抗原结合蛋白。在一些实施方案中，如例如通过放射性免疫测定法(RIA)所测定，抗原结合蛋白与不相关靶标的结合程度比抗原结合蛋白与靶标的结合小约10％。在一些实施方案中，特异性结合靶标的抗原结合蛋白具有的解离常数(Kd)≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM。
具体来说，本发明的抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1(GHIFTNFHFH)或2(GYIFTNYHMH)所示的重链互补决定区1(CDR-H1)，和/或包含SEQ ID NO:3(GIYPGNGDTF)或4(GIYPGNGDIF)所示的重链互补决定区2(CDR-H2)，和/或包含SEQ ID NO:5(GSYYGYIDAMDY)或6(GSYYGYIDAMDY)所示的重链互补决定区3(CDR-H3)。
具体来说，本发明的抗体可以包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:7(RASQDISNYLN)或8(RASQDISNDLN)所示的轻链互补决定区1(CDR-L1)，和/或包含SEQ IDNO:9(YTSRLHS)或10(YTSRLPS)所示的轻链互补决定区2(CDR-L2)，和/或包含SEQ ID NO:11(QQGNTLPWT)或12(QQGHTLPWT)所示的轻链互补决定区3(CDR-L3)。
具体来说，本发明的抗体可以包含重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1或2所示的重链互补决定区1(CDR-H1)，和/或包含SEQ ID NO:3或4所示的重链互补决定区2(CDR-H2)，和/或包含SEQ ID NO:5或6所示的重链互补决定区3(CDR-H3)；所述轻链可变区包含SEQ ID NO:7或8所示的轻链互补决定区1(CDR-L1)，和/或包含SEQ ID NO:9或10所示的轻链互补决定区2(CDR-L2)，和/或包含SEQ ID NO:11或12所示的轻链互补决定区3(CDR-L3)。
具体来说，本发明的抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含
SEQ ID NO:13：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK
或
SEQ ID NO:14：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNDLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLPSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQGHTLPWTFGQGTKLEIK
所示的氨基酸序列、或上述序列的变体。
具体来说，本发明的抗体包含重链可变区，所述重链可变区具有
SEQ ID NO:15：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKISCKASGHIFTNFHFHWVRQAPGQGLEWIGGIYPGNGDTFYNQKFQGRATITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRGSYYGYIDAMDYWGQGTSVTVSS
或
SEQ ID NO:16：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKISCKASGHIFTNFHFHWVRQAPGQGLEWIGGIYPGNGDTFYNQKFQGRATITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRGSYYGYIDAMDYWGQGTSVTVSS
所示的氨基酸序列、或上述序列的变体。
具体来说，本发明的抗体包含轻链可变区和重链可变区，其中，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:13或14所示的氨基酸序列、或上述序列的变体，所述重链可变区具有SEQ IDNO:15或16所示的氨基酸序列、或上述序列的变体。
具体来说，本发明的一种抗体的重链可变区包含SEQ ID NO:1所示的CDR-H1，SEQID NO:3所示的CDR-H2和SEQ ID NO:5所示的CDR-H3。本发明的另一种抗体的重链可变区包含SEQ ID NO:2所示的CDR-H1，SEQ ID NO:4所示的CDR-H2和SEQ ID NO:6所示的CDR-H3。
具体来说，本发明的一种抗体的轻链可变区包含SEQ ID NO:7所示的CDR-L1，SEQID NO:9所示的CDR-L2和SEQ ID NO:11所示的CDR-L3。本发明的另一种抗体的轻链可变区包含SEQ ID NO:8所示的CDR-L1，SEQ ID NO:10所示的CDR-L2和SEQ ID NO:12所示的CDR-L3。
具体来说，本发明的抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:13或14所示的序列，或具有与上述任一序列至少80％，例如，85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相似性的序列。具体来说，本发明的抗体的重链可变区具有SEQ ID NO:15或16所示的序列，或具有与上述任一序列至少80％，例如，85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相似性的序列。
具体来说，本发明的一种抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中，重链可变区包含SEQ ID NO:1所示的CDR-H1，SEQ ID NO:3所示的CDR-H2和SEQ ID NO:5所示的CDR-H3；轻链可变区包含SEQ ID NO:7所示的CDR-L1，SEQ ID NO:9所示的CDR-L2和SEQ ID NO:11所示的CDR-L3。具体来说，所述抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:13所示的序列，或具有与上述任一序列至少80％，例如，85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相似性的序列；所述抗体的重链可变区具有SEQ ID NO:15所示的序列，或具有与上述任一序列至少80％，例如，85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相似性的序列。
具体来说，本发明的另一种抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中，重链可变区包含SEQ ID NO:2所示的CDR-H1，SEQ ID NO:4所示的CDR-H2和SEQ ID NO:6所示的CDR-H3；轻链可变区包含SEQ ID NO:8所示的CDR-L1，SEQ ID NO:10所示的CDR-L2和SEQ ID NO:12所示的CDR-L3。具体来说，所述抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:14所示的序列，或具有与上述任一序列至少80％，例如，85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相似性的序列；所述抗体的重链可变区具有SEQ ID NO:16所示的序列，或具有与上述任一序列至少80％，例如，85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相似性的序列。
如本文所用，术语“变体”是指已经修饰至少一个，例如1、2或3个氨基酸取代、缺失或添加的重链可变区或轻链可变区，其中包含重链或轻链变体的经修饰的抗原结合蛋白基本上保留修饰前抗原结合蛋白的生物学特征。在一个实施方案中，含有变体重链可变区或轻链可变区序列的抗原结合蛋白保留修饰前抗原结合蛋白的60％、70％、80％、90％、100％生物学特征。应当理解，可以单独或在与另一个重链可变区或轻链可变区组合修饰每个重链可变区或轻链可变区。本公开的抗原结合蛋白包含与本文描述的重链可变区氨基酸序列90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同源的重链可变区氨基酸序列。本公开的抗原结合蛋白包括与本文描述的轻链可变区氨基酸序列90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同源的轻链可变区氨基酸序列。同源性百分比可以在整个重链可变区和/或整个轻链可变区上，或者百分比同源性可以限于框架区，而对应于CDR的序列与重链可变区和/或轻链可变区内本文中公开的CDR具有100％同一性。如本文所用，术语“CDR变体”是指已经修饰至少一个，例如1、2或3个氨基酸取代、缺失或添加的CDR，其中包含CDR变体的经修饰的抗原结合蛋白基本上保留修饰前抗原结合蛋白的生物学特征。在一个实施方案中，含有变体CDR的抗原结合蛋白保留修饰前抗原结合蛋白的60％、70％、80％、90％、100％生物学特征。应当理解，可以修饰的每个CDR可以单独或与另一个CDR组合修饰。在一个实施方案中，修饰是取代，特别是保守取代。
如上所述，本发明的抗体具有优异的内吞效果，均优于阳性对照抗体(GSK2857916)。内吞作用(endocytosis)又称入胞作用或胞吞作用，是通过质膜的变形运动将细胞外物质转运入细胞内的过程。根据入胞物质的不同大小，以及入胞机制的不同可将内吞作用分为三种类型：吞噬作用、吞饮作用、受体介导的内吞作用。本发明所述抗体的内吞作用，指的是受体介导的内吞作用，通过靶向BCMA的单克隆抗体和BCMA结合后，介导BCMA-抗体复合物形成内吞小体后和溶酶体融合，在溶酶体内BCMA-抗体复合物被溶酶体介导降解，部分BCMA或BCMA-抗体复合物也可转运回细胞膜上。当本发明所述的单克隆抗体偶联毒素小分子形成ADC药物后，通过内吞转运至胞内，释放的毒素分子能够杀死靶细胞(如多发性骨髓瘤细胞)。因此，当本发明所述单克隆抗体开发为ADC药物，所述更好的内吞效果对于帮助介导药物进入靶细胞非常关键。
此外，本发明的抗体是经人源化改造的抗体，经本发明人源化改造前后的抗体与人和猴BCMA结合活性基本一致，且人源化改造前后的抗体阻断BCMA和BAFF结合的效果基本一致。本发明人源化改造前后抗体和猴BCMA-CHO细胞结合效果基本一致，且均优于阳性对照抗体(GSK2857916)，且人源化改造前后抗体和H929细胞结合效果基本一致，且均优于阳性对照抗体(GSK2857916)。且人源化前后抗体抗体在人骨髓瘤细胞系H929细胞上的内吞效果基本一致，且均优于阳性对照抗体(GSK2857916)。
“人源化抗体”是指一类工程化抗体，其具有源自非人供体免疫球蛋白的其CDR，该分子的剩余免疫球蛋白衍生部分源自一种(或多种)人免疫球蛋白。此外，框架支持残基可以改变以保留结合亲和力(参见例如Queen等,Proc.Natl Acad Sci USA,86:10029-10032(1989),Hodgson等,Bio/Technology,9:421(1991))。合适的人受体抗体可以是通过与供体抗体的核苷酸和氨基酸序列的同源性从常规数据库，例如数据库、Los Alamos数据库和Swiss蛋白质数据库选择的抗体。以与供体抗体的框架区的同源性(基于氨基酸)表征的人抗体可以适合于提供用于插入供体CDR的重链恒定区和/或重链可变框架区。可以以类似的方式选择能够提供轻链恒定或可变框架区的合适受体抗体。应当注意的是，受体抗体重链和轻链不需要来源于相同的受体抗体。
本发明经人源化改造后的抗体的热稳定性略优于阳性对照抗体(GSK2857916)，且达到抗体成药的热稳定性条件，热稳定性差可能导致抗体成药性问题，如抗体低表达和抗体聚集。
另外，本发明还涉及一种靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的单克隆抗体，该抗体与上述本发明所述的抗体识别相同的抗原决定部位。本发明还涉及一种靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的单克隆抗体，该抗体与上述本发明所述的抗体竞争性结合B细胞成熟抗原(BCMA)。
具体来说，本发明还涉及编码上述本发明的抗体的核酸。本发明还涉及一种表达载体，其包含上述本发明所述的核酸。本发明还涉及一种宿主细胞，其包含上述本发明所述的表达载体或基因组中整合有本发明所述的核酸。
如本领域已知，在本文中可交换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸链，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或它们的类似物、或者能够通过DNA或RNA聚合酶掺入链的任何底物。如本文所用，“载体(vector)”表示构建体，其能够将一种或多种所关注的基因或序列递送入宿主细胞并且优选在宿主细胞中表达所述基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子凝聚剂相关的DNA或RNA表达载体、包囊化于脂质体中的DNA或RNA表达载体以及某些真核细胞，例如生产细胞。在本发明中术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已经引入外源性核酸的细胞，包括这些细胞的子代。宿主细胞包括“转化子”和“转化的细胞”，其包括原代转化细胞以及由此来源的子代，而不考虑传代次数。子代在核酸含量上与亲代细胞可能不完全相同，但可能含有突变。本文包括与在初始转化的细胞中筛选或选择的细胞具有相同功能或生物学活性的突变子代。
本发明还涉及一种生产单克隆抗体的方法，所述方法包括培养本发明所述的宿主细胞从而生产上述本发明所述的单克隆抗体。
本发明还涉及一种药物组合物，其包含本发明所述的单克隆抗体和药学上可接受的载体。本发明还涉及一种药盒或制品，其包括本发明所述的单克隆抗体或本发明所述的药物组合物。如本文所用，“药学可接受的载体”或“药学可接受的赋形剂"包括任何这样的材料，当与活性成分组合时，其允许所述成分保持生物活性，并且不与对象的免疫系统反应。实例包括但不限于任何标准药学载体，例如磷酸缓冲盐溶液、水、乳剂(如油/水乳剂)以及各种类型的湿润剂。用于气溶胶或肠胃外施用的优选稀释剂为磷酸缓冲盐水(PBS)或生理盐水(0.9％)。通过公知的常规方法配制包含这类载体的组合物(参见，例如，Remington'sPharmaceutical Sciences,18th edition,A.Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990；和Remington,The Science and Practice of Pharmacy 21stEd.MackPublishing,2005)。
本发明还涉及一种治疗与BCMA的表达相关的疾病的方法，其包括：向有此需要的受试者给药本发明所述的单克隆抗体或本发明所述的药物组合物或本发明所述的药盒或制品。具体来说，上述疾病选自B细胞急性淋巴性白血病、T细胞急性淋巴性白血病、急性淋巴性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、伯基特淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病，小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴瘤、恶性淋巴增殖状况、MALT淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突细胞瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、骨髓瘤、MGUS、浆细胞瘤、系统性淀粉样蛋白轻链淀粉样变性和POEMS综合征。具体来说，上述疾病为多发性骨髓瘤。
具体来说，术语“多发性骨髓瘤(MM)”，也称为浆细胞骨髓瘤或Kahler氏病(OttoKahler之后)，是一种以与基质细胞密切接触的恶性浆B细胞在骨髓内的积累为特征的难治性克隆B细胞肿瘤。MM是一种渐进性疾病，特别是例如由对前体浆B细胞的多种遗传损伤引起的，即主要由易位，例如t(11；14)、t(4；14)、t(8；14)导致的染色体易位，或删除，例如del(13)和del(17)，使得肿瘤细胞大幅增殖并成为凋亡耐受。B淋巴细胞起始于骨髓中并移动到淋巴结。由于它们的发育，B淋巴细胞在其细胞表面上成熟并展示不同的蛋白。当它们被活化而分泌抗体时，将它们称作浆细胞。在它们离开称为生发中心的部分淋巴结后，多发性骨髓瘤在B细胞中发展。免疫系统在严格控制下保持B细胞的增殖和抗体的分泌。当染色体和基受损时(通常通过重排)，失去了这种控制。通常情况下，启动子基因移动(或易位)到染色体，它刺激抗体基因过量产生。
如上所述，在多发性骨髓瘤患者中经常观察到免疫球蛋白重链基因(在染色体14，基因座14q32上)和癌基因(经常11q13、4p16.3、6p21、16q23和20q11[10])之间的染色体易位。该突变导致所述癌基因的失调，这被认为是骨髓瘤发病机制中的一个重要的起始事件。该结果是浆细胞克隆的增殖和基因组不稳定性，导致进一步的突变和易位。在约50％的所有骨髓瘤病例中观察到了14号染色体异常。在约50％的病例中也观察到了13号染色体(一部分)的缺失。
在本文中，“受试者”、“个体”或“对象”是哺乳动物，更优选是人。哺乳动物还包括但不限于农场动物、竞赛动物、宠物、灵长类、马、犬、猫、小鼠和大鼠。在本发明中，向有此需要的受试者给药本发明所述的单克隆抗体或本发明所述的药物组合物或本发明所述的药盒或制品是指给予有效量的药物组合物或药剂或制品等，如本发明所用，术语“有效量”表示引发例如研究者或临床医师所追求的组织、系统、动物或人的生物学或药学响应的药物或药剂的量。此外，术语“治疗有效量”表示，与没有接受该量的相应受试者相比，引起疾病、病症或副作用的改进治疗、治愈、预防或减轻的量，或者使疾病或病况的进展速率降低的量。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量。
本发明还涉及本发明的单克隆抗体在制备用于治疗与BCMA的表达相关的疾病的药物中的用途。具体来说，上述疾病选自B细胞急性淋巴性白血病、T细胞急性淋巴性白血病、急性淋巴性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、伯基特淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病，小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴瘤、恶性淋巴增殖状况、MALT淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突细胞瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、骨髓瘤、MGUS、浆细胞瘤、系统性淀粉样蛋白轻链淀粉样变性和POEMS综合征。具体来说，上述疾病为多发性骨髓瘤。如本文所用，术语“癌症”、“新生物”和“肿瘤”可互换使用，并且为单一或复数形式，是指已经经过恶性转化或导致异常或不受调节的生长或过度增殖的细胞变化的细胞。此种变化或恶性转化通常会使此类细胞对宿主生物体有致病性，因此也意图包括变为或可以变成致病性且需要干预或可以受益于干预的初癌或癌前细胞。原发性癌细胞(即，从恶性转化部位附近取得的细胞)可以通过完善建立的技术，特别是组织学检查而与非癌细胞区分。如本发明所用，癌细胞的定义不仅包括原发性癌细胞，也包括衍生自癌细胞祖先(ancestor)的任何细胞。这包括转移的癌细胞、和体外培养物和衍生自癌细胞的细胞系。当提及通常表现为实体瘤的癌症类型时，“临床上可检测”的肿瘤为在肿瘤块的基础上可检测的那些；例如通过如CAT扫描、MR成像、X-射线、超声或触诊的操作，和/或由于从患者可获得的样品中一种或多种癌症特异性抗原的表达而可检测的肿瘤。换言之，本发明的术语包括细胞、新生物、癌症和任何阶段的肿瘤，包括临床医生称为初癌、肿瘤、原位生长、以及晚期转移性生长的。肿瘤可以为造血肿瘤，例如血细胞肿瘤等，即为液体肿瘤。基于此类肿瘤的临床病况的具体实例包括白血病如慢性髓细胞性白血病或急性髓细胞性白血病；骨髓瘤如多发性骨髓瘤；淋巴瘤等。
如上所述，相比于Belantamab mafodotin抗体(简称为GSK2857916)，本发明涉及的抗体既能结合人BCMA也能结合猴BCMA，在亲和水平方面，与之接近甚至更好。本发明涉及的抗体在阻断BCMA结合其配体BAFF或APRIL效果方面，与GSK2857916接近甚至更好，阻断BCMA和BAFF及APRIL结合，能够抑制受配体的结合导致的胞内信号通路活化(如NFκB信号通路)，从而抑制浆细胞的生存。本发明涉及的抗体在内吞效果方面，具有比GSK2857916更好的内吞效果，内吞效果是抗体药物偶联物(ADC)介导细胞杀伤的关键功能，具有更好的内吞效果的抗体对应ADC药物杀伤效果更优优势。本发明涉及的抗体在热稳定性方面，具有比GSK2857916更好的热稳定性，热稳定是抗体成药性的关键指标，具有更好的热稳定抗体，在抗体表达上可能更具优势，且产生聚体的可能性降低。本发明涉及的抗体，在免疫原性方面，为人源化后的抗体，具有更低的免疫原性风险，免疫原性会激起人体内的免疫反应，一方面产生抗抗体，降低抗体药的效果，另一方面强的免疫原性可能会带来药物更大的副作用风险。而人源化的抗体，将抗体CDR区以外的序列进行突变改造，使之更接近于人的抗体序列，从而降低抗体产生强免疫原性的风险。
实施例
实施例1
原材料的制备
在本实施例中，BCMA抗原及其配体均购自ACRO Biosystems，同时，根据美国专利申请(US20140105915A)制备了葛兰素史克(GSK)的阳性抗体GSK2857916，值得注意的是，制备的该阳性抗体并没有偶连毒素分子但并不影响其他可能的功能。
1.1抗原的准备
本申请中抗原共用到如下4种：human-BCMA-Fc、human-BCMA-His、cyno-BCMA-Fc和cyno-BCMA-His，均购买于ACRO Biosystems，货号分别为BC7-H5254、BCA-H522y、BCA-C5253、BCA-C52H7。另外，其活性已与GSK2857916进行相互验证，并与美国专利申请US20140105915A上披露的相符，结果显示在图2(A)中。
1.2配体的准备
本申请中使用的配体共用到如下2种，human-BAFF-Fc和human-APRIL-Fc，均购买于ACRO Biosystems，货号分别为BAF-H4268、APL-H5267。另外，其活性已与human-BCMA进行受配体结合验证，并与美国专利申请US20140105915A上披露的相符，结果显示在图2(B)和2(C)中。
1.3阳性对照抗体的制备
本申请中，阳性对照抗体GSK2857916采用瞬转系统(ExpiCHO)进行表达，其中，用到的主要材料包括：Gibco培养基(货号：A29100-01)，Gibco转染试剂盒(货号：A29129)。首先，根据美国专利申请US20140105915A披露的序列合成GSK2857916的轻链序列(如序列号SEQ ID NO:17的序列所示)和重链序列(如序列号SEQ ID NO.:18的序列所示)，通过分子克隆方法构建出包含完整GSK2857916抗体轻链和重链基因的质粒。将含有GSK2857916抗体轻链的质粒和重链的质粒按照2:1的质量比进行混合，在25mL表达体系内，按照标准流程将上述质粒混合物(25μg)与转染试剂进行混合并滴加入25mL的ExpiCHO细胞表达体系中。充分混匀后，于37℃细胞培养箱内表达18-22小时。随后，向上述转染混合物中添加补料培养基并置于32℃细胞培养箱内继续培养。转染后第5天，添加第二次补料，并将细胞置于32℃细胞培养箱内继续培养10-12天。接着，将表达好的细胞混悬液进行高速离心并取上清，所得上清经0.22μm滤膜过滤后，采用Protein A/G亲和层析柱亲和法进行纯化。纯化后，用100mM甘氨酸盐(pH3.0)洗脱目的蛋白，浓缩，置换，分装，经SDS-PAGE鉴定和活性鉴定合格后入库冻存。
实施例2
细胞株的制备
在本实施例中，购买了表达BCMA的人骨髓瘤细胞系H929细胞，构建了过表达人BCMA的细胞株BCMA-HEK293细胞和过表达猴BCMA的细胞株BCMA-CHO细胞。
2.1 H929细胞株的准备
本申请中，H929购于北京协和细胞库，货号为3111C0001CCC000360，为天然高表达人BCMA的骨髓瘤细胞株。
2.2 BCMA-CHO细胞株的制备
2.2.1表达猴BCMA全长的质粒的构建
通过基因合成技术合成含有食蟹猴的BCMA蛋白的DNA片段，并将其克隆至表达载体。通过化转的方法导入大肠杆菌，挑取大肠杆菌单克隆后测序得到正确的质粒克隆，进行质粒抽提并再次测序确认。
2.2.2电转
使用Gibco的CD-CHO无血清培养基(货号：10743029)培养CHO-s细胞。电转前一天，将细胞传代至5×106/mL，次日使用Invitrogen的电转试剂盒(货号：MPK10096)和电转仪(货号：MP922947)将构建好的质粒导入CHO-s细胞中。将电转后的细胞移至CD-CHO培养基中，放置于37℃细胞培养箱中培养48h。
2.2.3电转后细胞铺板
将电转后的CHO-s细胞按2000个细胞/孔铺到96孔板中，加入终浓度30μM MSX(Millipore，GSS-1015-F)和GS supplement(Sigma，58672C-100ml)，放置于37℃二氧化碳培养箱中培养，10天后补充加入含30μM MSX和1×GS supplement的培养基。
2.2.4克隆挑选、细胞扩培和FACS鉴定
挑取96孔板中长出的单细胞克隆，转移至24孔培养板中继续扩大培养，之后通过FACS鉴定猴BCMA稳转成功的细胞株。
2.3 BCMA-HEK293细胞株的制备
2.3.1表达人BCMA全长的质粒的构建
通过基因合成技术合成含有人的BCMA蛋白的DNA片段，并将其克隆至表达载体。通过化转的方法导入大肠杆菌，挑取大肠杆菌单克隆后测序得到正确的质粒克隆，进行质粒抽提并再次测序确认。
2.3.2电转
使用Gibco的DMEM无血清培养基(货号：12634010)培养HEK293细胞。电转前一天，将细胞传代至2×105/mL，次日使用Invitrogen的电转试剂盒(货号：MPK10096)和电转仪(货号：MP922947)将构建好的质粒导入HEK293细胞中。将电转后的细胞移至DMEM培养基中，放置于37℃细胞培养箱中培养48h。
2.3.3电转后细胞铺板
将电转后的HEK293细胞按1000个细胞/孔铺到96孔板中，加入终浓度2μg/mL的puromycin，放置于37℃二氧化碳培养箱中培养，14天后补充加入2μg/mL的puromycin的培养基。
2.3.4克隆挑选、细胞扩培和FACS鉴定
挑取96孔板中长出的单细胞克隆，转移至24孔培养板中继续扩大培养，之后通过FACS鉴定人BCMA稳转成功的细胞株。
实施例3
动物免疫
在本实施例中，动物免疫包括数种方案且同时进行，在免疫过程中，取小鼠血清进行效价检测并评估免疫的效果，最终根据血清效价决定建库的小鼠编号。
3.1动物免疫
3.1.1.免疫方案一
通过皮下注射和腹腔注射的方式免疫Babl/c小鼠(上海灵畅生物科技有限公司，雌性，6-8周，n＝2)，材料包括上述提到的人BCMA-Fc和猴BCMA-Fc抗原蛋白(ACROBiosystems)，采用交叉免疫的方式。首次免疫剂量为100μg/只，并辅以CFA(完全弗氏佐剂)，之后免疫剂量降至50μg/只，并辅以IFA(弗式不完全佐剂)，均为两周一交叉免疫。对应小鼠编号为Mouse 1和Mouse 2。
3.1.2免疫方案二
通过皮下注射和腹腔注射的方式免疫Babl/c小鼠(小鼠与方案一为同一批次，n＝2)，材料包括上述提到的人BCMA-Fc、猴BCMA-Fc抗原蛋白(ACRO Biosystems)、高表达人BCMA的HEK293细胞和高表达猴BCMA的CHO细胞，采用交叉免疫的方式。蛋白免疫剂量为20μg/只，细胞免疫剂量为1×107/只，腹腔注射，为一周一交叉免疫。对应小鼠编号为Mouse 3和Mouse 4。
3.2血清效价ELISA检测
3.2.1抗原包被和封闭
在ELISA板上，提前一天分别包被人BCMA和猴BCMA，包被浓度为2μg/mL，30μL/孔，4℃过夜。在免疫效价测定当日，用PBST洗板三次，并用5％的脱脂牛奶室温封闭两小时，再用PBST洗板三次。
3.2.2一抗和二抗
各个血清样本在原液的基础上先稀释500倍，再按3倍梯度进行稀释后，作为一抗加到ELISA板中，室温下孵育1h，PBST洗板三次后，加入二抗(Goat-anti-mouse-IgG-Fab-HRP，Sigma，M4115),室温下孵育1h。
3.2.3显色、终止和读板
孵育完成后，PBST洗板六次，加TMB(SurModics，TMBS-1000-01)显色，根据显色结果，加入2M HCl终止反应，通过酶标仪(Molecular Devices，SpecterMax 190)在OD450下读板。血清效价结果表明，免疫后的小鼠对人BCMA和猴BCMA的效价均很高，可用于下一步的抗体库构建，其结果显示在下表1-1和1-2中。
表1-1用人BCMA检测小鼠血清的效价
表1-2用猴BCMA检测小鼠血清的效价
实施例4
在本实施例中，优选了实施例3中效价最优的小鼠，采用噬菌体展示技术，将小鼠脾脏中B细胞的抗体基因克隆至噬菌体展示载体，构建成抗体文库。以人BCMA和猴BCMA为筛选抗原，通过文库海选、单克隆初筛和测序等过程，最终获得17个针对人和猴的BCMA抗原具有结合活性的抗体分子。
4.1噬菌体展示抗体基因文库构建
在免疫结束后，按安乐死标准流程处理小鼠。取小鼠脾脏，经研磨和过滤后，收集脾细胞，加入1mL的TRIzolTMReagent(Thermo Fisher，15596026)裂解脾细胞，通过酚氯仿法提取总RNA，通过反转录试剂盒(TaKaRa,6210A)将提取的RNA反转录成cDNA。之后，以cDNA为PCR模板，采用鼠源抗体序列扩增的特异性引物，分别扩增抗体的轻链和重链基因。最后，通过NcoI+NotI双酶切和T4连接酶连接，将抗体基因片段插入至噬菌体展示用载体上，连接产物通过DNA回收试剂盒(Omega,D6492-02)回收，最后通过电转仪(Bio-Rad，MicroPulser)转化至感受态大肠杆菌SS320中(Lucigen,MC1061 F)，并涂布于含有氨苄青霉素和四环素的2-YT(C+/K+2-YT)固体平板，扩增正确转化的抗体质粒的SS320菌，最终构建成含Fab段抗体序列的文库。
4.2噬菌体展示抗体基因文库筛选
4.2.1磁珠法筛选噬菌体展示抗体基因文库
磁珠法筛选是基于将Biotin标记的抗原蛋白和偶联有Avidin的磁珠结合，通过将结合抗原的磁珠和文库进行孵育、洗涤和洗脱的海选过程，经历2-4轮的海选，最终将针对抗原的特异性单克隆抗体富集下来的过程。本实施例中利用Biotin标记的人BCMA抗原和猴BCMA抗原交叉海选的原则，其中第一和第三轮采用人BCMA海选，第二轮采用猴BCMA海选，一共海选3轮，然后将富集的抗体序列混合物，进行人和猴BCMA的单克隆初筛。
具体实施方法如下：
首先用Biotin标记的人BCMA蛋白与Avidin偶联的磁珠孵育，使得人BCMA蛋白结合到磁珠上。将结合有BCMA抗原的磁珠和构建的噬菌体库室温下孵育2h。经PBST洗涤6-8次后，去除非特异性吸附的噬菌体，加入Trypsin(Gibco，25200072)轻轻混匀并反应20min，以洗脱特异性结合的抗体展示噬菌体。随后，用洗脱下来的噬菌体侵染对数期的SS320菌体(Lucigen,MC1061 F)并静置30min，然后在220rpm条件下培养1h，再通过加入VSCM13辅助噬菌体并静置30min，继续在220rpm条件下培养1h，离心并置换至C+/K+2-YT培养基中，最终得到的噬菌体继续用于下一轮的海选。
4.4.2免疫管法筛选噬菌体展示抗体基因文库
免疫管筛选的原理是将BCMA蛋白包被在具有高吸附力的免疫管表面，通过将噬菌体展示抗体文库加入免疫管中并和吸附于免疫管表面的抗原蛋白进行孵育、洗涤和洗脱的海选过程，经历2-4轮海选，最终将针对抗原的特异性单克隆抗体富集下来的过程。免疫管法和磁珠法的目的均为富集针对抗原的特异性抗体，为两个互补的实验方法。本实施例中以人BCMA抗原和猴BCMA抗原交叉海选的原则，其中第一和第三轮采用人BCMA海选，第二轮采用猴BCMA海选，一共海选3轮，然后将富集的抗体序列混合物，进行人和猴BCMA的单克隆初筛。具体实施方法与磁珠法筛选类同。
4.5单克隆的挑选
在三轮筛选后，从第三轮的Pool中挑选部分单克隆进行ELISA检测，包括与人BCMA和猴BCMA的结合。最终，在1344个克隆中共挑到93个能够与人和猴BCMA都结合的阳性克隆，经测序分析及与人和猴BCMA亲和力排序结果分析后，最终选取了17个克隆的序列构建全长以进行下一步的实验。
实施例5
全长抗体构建、表达与纯化
在本实施例中，将实施例4中获得的17个人猴交叉的Fab抗体构建为人IgG1型，其中轻链均为Kappa，抗体类型为人鼠嵌合抗体。
5.1质粒的构建
将筛选获得的序列的重链序列与人IgG1 Fc段融合构建，轻链与人的Kappa恒定区融合构建，将重链和轻链的质粒转化ExpiCHO细胞，诱导表达并得到全长抗体。
5.2抗体的表达纯化
本申请中，抗体采用的是ExpiCHO瞬转表达系统，培养基为(Gibco,A29100-01)，转染试剂盒为(Gibco，A29129)。具体方法如下：转染前一天将ExpiCHO细胞进行传代，在25mL体系内，将构建好的质粒25μg与转染试剂混合之后滴加入25mL ExpiCHO细胞中，充分混匀后，于37℃细胞培养箱内表达18-22h。随后，向上述转染混合物中添加补料培养基并置于32℃细胞培养箱内继续培养。转染后第5天，添加第二次补料，并将细胞置于32℃细胞培养箱内继续培养10-12天。接着，将表达好的细胞混悬液进行高速离心并取上清，所得上清经0.22μm滤膜过滤后，采用Protein A/G亲和层析柱亲和法进行纯化。纯化后，用100mM甘氨酸盐(pH3.0)洗脱目的蛋白，浓缩，置换，分装，经SDS-PAGE鉴定、SEC纯度检测、活性鉴定后入库冻存。
实施例6
候选抗体ELISA水平亲和阻断效果检测
在本实施例中，基于ELISA的方法验证了候选抗体对人和猴BCMA的亲和效果，基于ELISA的方法验证了候选抗体阻断BCMA和BAFF或APRIL结合的效果。
6.1基于ELISA检测候选抗体对人和猴BCMA的亲和效果
在96孔ELISA板上，分别包被人BCMA和猴BCMA，2μg/mL，30μL/孔，4度过夜。次日，将孔板用PBST洗3次后用5％脱脂牛奶封闭2h，用PBST洗板3次后，加入梯度稀释的候选抗体及阳性对照抗体(GSK2857916)并孵育1h。之后，用PBST清洗3次后加入二抗(anti-human-IgG-Kappa-HRP，abcam，ab79115)并孵育1h。孵育完成后，PBST洗板六次，加TMB(SurModics，TMBS-1000-01)显色。根据显色结果，加入2M HCl终止反应，通过酶标仪(MolecularDevices，SpecterMax 190)在OD450下读板，结果显示在图4(A)至图4(B)中，结果表明，候选抗体拥有接近甚至优于GSK2857916抗体的亲和人BCMA和猴BCMA的效果。
6.2基于ELISA检测候选抗体阻断BCMA和BAFF的结合
在本实施例中，阻断体系包含前期开发的过程，根据开发结果，确定实际使用的兼具灵敏度及稳定性的阻断体系参数。
对于BAFF的阻断，包板人BAFF蛋白，1μg/mL，30μL/孔，4℃过夜。次日，将孔板用PBST洗3次后用5％脱脂牛奶封闭2h。然后分别将候选抗体或阳性对照抗体(GSK2857916)梯度稀释，并与Biotin标记的人BCMA(0.6μg/mL)提前预混0.5h，在封闭完成并洗板结束后加至96孔ELISA板中，孵育1h。之后，用PBST清洗3次后加入二抗(NeutrAvidin-HRP，Therofisher，31001)并孵育1h。孵育完成后，PBST洗板六次，加TMB(SurModics，TMBS-1000-01)显色，根据显色结果，加入2M HCl终止反应，通过酶标仪(Molecular Devices，SpecterMax 190)在OD450下读板，结果显示在图5(A)中，结果表明，候选抗体拥有接近甚至优于GSK2857916抗体的阻断人BCMA和BAFF结合的效果。
6.3基于ELISA检测候选抗体阻断BCMA和APRIL的结合
在本实施例中，阻断体系包含前期开发的过程，根据开发结果，确定实际使用的兼具灵敏度及稳定性的阻断体系参数。
对于APRIL的阻断，包板人APRIL蛋白，2μg/mL，30μL/孔，4℃过夜。次日，将孔板用PBST洗3次后用5％脱脂牛奶封闭1h。然后分别将候选抗体或阳性对照抗体(GSK2857916)梯度稀释，并与Biotin标记的人BCMA(0.6μg/mL)提前预混半小时，在封闭完成并洗板结束后加至96孔平底板中，孵育1h。之后，用PBST清洗3次后加入二抗NeutrAvidin-HRP(Therofisher，31001)并孵育1h。孵育完成后，PBST洗板六次，加TMB(SurModics，TMBS-1000-01)显色，根据显色结果，加入2M HCl终止反应，通过酶标仪(Molecular Devices，SpecterMax 190)在OD450下读板，结果显示在图5(B)中，结果表明，候选抗体拥有接近甚至优于GSK2857916抗体的阻断人BCMA和APRIL的结合的效果。
实施例7
候选抗体FACS水平与人和猴BCMA表达细胞株亲和效果检测
在本实施例中，基于FACS方法验证候选抗体对表达人和猴BCMA细胞的亲和效果。
7.1基于FACS检测候选抗体对人BCMA-HEK293细胞的亲和效果
收集指数生长期的人BCMA-HEK293细胞，300g离心去上清，将细胞用配制好的FACS缓冲液重悬，计数并将细胞悬液密度调整为2×106/mL。随后，将BCMA-HEK293细胞以每孔100μL加入96孔圆底板中，300g离心去上清。向对应孔中加入梯度稀释的候选抗体和阳性对照抗体稀释液，用排枪将细胞吹匀并放置于4℃下孵育30min。将孵育后的细胞混合液300g离心去上清，向对应孔中加入200μL的FACS缓冲液并使用排枪重悬细胞；重复两次，300g离心去上清；加入PE标记的anti-human-IgG-Fc流式抗体(Abcam,98596)，用排枪将细胞吹匀并放置于4℃下孵育30min，300g离心去上清。随后，加入FACS缓冲液并重悬细胞，重复两次后向孔中加入FACS缓冲液，每孔200μL，重悬细胞。最后，通过流式细胞仪(Beckman，CytoFLEX AOO-1-1102)上机检测。本实施例中，结果显示在图3(A)中，结果表明，抗体SY14-3rd-5-6-7对于人BCMA-HEK293细胞的亲和效果优于阳性对照抗体(GSK2857916)。
7.2基于FACS检测候选抗体对猴BCMA-CHO细胞的亲和效果
本实施例中，操作流程与7.1完全一致，与之不同的是，细胞为猴BCMA-CHO细胞，其结果显示在图3(B)中，结果表明，抗体SY14-3rd-5-6-7对于猴BCMA-CHO细胞的亲和效果优于阳性对照抗体(GSK2857916)。另外，人、猴间的信号差异猜测可能是BCMA-HEK293或BCMA-CHO上BCMA表达量差异造成的。
实施例8
候选抗体内吞效应检测
在本实施例中，开发了检测抗体在人骨髓瘤细胞系H929细胞上内吞的方法体系并对候选抗体内吞效应进行了相应检测，基本原理为通过细胞毒性来检测抗体的内吞效应。Fab-ZAP(Atsbio,IT-51-100)是一种连接了saporin(皂素)的Fab片段，saporin是一种核糖体抑制剂，能够抑制蛋白质的合成而使细胞死亡。本实施例中，Fab-ZAP是一种能够和人源抗体Fc结合的Fab片段，Fab-ZAP和抗BCMA的抗体共孵育后使抗体带上毒素，当抗BCMA的抗体被H929细胞内吞后，毒素随着抗体进入到细胞内并使细胞死亡，因此，可以通过MTS试剂盒(Promega，G3580)检测细胞的活性来检测抗体的内吞效应。
具体检测方法如下：H929细胞提前一周复苏，复苏后每3天传代一次，每次细胞接种密度为2×105/mL，细胞传代不超过3周。吸取处于对数生长期的细胞,充分混匀细胞后，计数并测定其活率。取1个96孔平底板，将细胞密度调整为4×105/mL，每孔中加入50μL细胞，轻轻拍打混匀，将细胞培养板放入37℃细胞培养箱中孵育16小时。然后用1640+10％FBS+1％PS+50μMβ-巯基乙醇完全培养基将Fab-ZAP先配制成27nM(2.16μg/ml)的稀释液，加至梯度稀释的抗体内使得孵育的Fab-ZAP终浓度为13.5nM(1.08μg/ml)。按设计好的布板，用300μL排枪从稀释板中取50μL稀释液加入到细胞板中，轻轻拍打混匀，放入细胞培养箱培养3天。之后，提前将MTS置于室温融化，将细胞板从培养箱中取出，用100μL的12道移液枪取20μL的MTS加入到各孔中，轻轻拍打后置于培养箱孵育2h，最后，将细胞板放入酶标仪中，在492nm波长下，读数并保存。
本实施例中，结果显示在图6(A)和6(B)中，结果表明，候选抗体SY14-3rd-5-6-7和SY14-3rd-5-6-32的内吞效果均优于阳性对照抗体(GSK2857916)。
至此，候选抗体所有的检测结果汇总在图7中。
实施例9
抗体人源化改造
在本实施例中，对鼠源抗体重链和轻链V区的框架进行了氨基酸的点突变，使之更接近人的Germline。其中，改造的候选抗体包括SY14-3rd-5-6-7(又称5-6-7或5-6-7-WT)和SY14-3rd-5-6-32(又称5-6-32或5-6-32-WT)，其中改造后的优选候选抗体分别称为5-6-7-hu-2和5-6-32-hu-2。
实施例10
人源化抗体功能验证
10.1基于ELISA检测两个候选抗体在人源化改造前后对人和猴BCMA的亲和效果
具体操作方法参见实施例6，结果显示在图8(A)、图8(B)、图9(A)和图9(B)中，结果表明，人源化改造前后的抗体与人和猴BCMA结合活性基本一致。
10.2基于ELISA检测两个候选抗体在人源化改造前后阻断BCMA和BAFF的效果
具体操作参见实施例6，结果显示在图10(A)和11(A)中，结果表明，人源化改造后的抗体阻断BCMA和BAFF结合的效果稍差于阳性抗体。
10.3基于ELISA检测两个候选抗体在人源化改造前后阻断BCMA和APRIL的效果
具体操作参见实施例6，结果显示在10(B)和11(B)中，结果表明，人源化改造后的抗体阻断BCMA和APRIL结合的效果稍差于阳性抗体。
10.4基于FACS检测候选抗体对人BCMA-HEK293细胞的亲和效果
具体操作参见实施例7，结果显示在图12(A)中，结果表明，人源化改造前后抗体和人BCMA-HEK293细胞结合效果基本一致，且均优于阳性对照抗体(GSK2857916)。
10.5基于FACS检测候选抗体对猴BCMA-CHO细胞的亲和效果
具体操作参见实施例7，结果显示在图12(B)中，结果表明，人源化改造前后抗体和猴BCMA-CHO细胞结合效果基本一致，且均优于阳性对照抗体(GSK2857916)。
10.6基于FACS检测候选抗体对人骨髓瘤细胞系H929细胞的亲和效果
具体操作参见实施例7，结果显示在图12(C)中，结果表明，人源化改造前后抗体和H929细胞结合效果基本一致，且均优于阳性对照抗体(GSK2857916)。
10.7抗体在人源化改造前后内吞效应检测
在本实施例中，还检测了两个候选抗体人源化改造前后在人骨髓瘤细胞系H929细胞上的内吞效应。具体操作参见实施例8，结果显示在图13-A和13-B中，结果表明，人源化抗体5-6-7-huV2的内吞效果比人源化前(5-6-7-WT)有部分提升，其他人源化前后抗体抗体在人骨髓瘤细胞系H929细胞上的内吞效果基本一致，且均优于阳性对照抗体(GSK2857916)。
至此，两个候选抗体在人源化改造前后所有的检测结果汇总在图14中。
实施例11
人源化前后候选抗体DSF检测
在本实施例中，检测了两个候选抗体在人源化改造前后以及阳性对照抗体(GSK2857916)的热稳定性数据。具体流程如下：制备抗体溶液，0.25mg/mL，19μL/孔，每个供试品设置三个平行孔，并以PBS和IPI作为参比。然后在每个孔中加入1μL浓度为100×的SYPRO orange染料，准备上机。利用ABI 7500FAST RT-PCR仪器进行测试，试验类型选择熔解曲线，采用连续模式，扫描温度范围为25～95℃，升温速率为1％，25℃平衡5min，在升温过程中采集数据，报告基团选择ROX，淬灭基团选择None，反应体积20μL，以熔解曲线一阶导数的第一个峰谷对应的温度确定为候选抗体的变性温度，结果详见表1-3。
表1-3人源化抗体热稳定性检测结果
实施例12
人源化前后候选抗体亲和力检测
在本实施例中，采用Fortebio Octet RED96仪器，检测了5-6-7和5-6-32的人源化前后候选抗体，与人BCMA及猴BCMA的亲和力。
12.1材料准备
称取1g的BSA，量取500μL的Tween 20，加入到1000mL的1×PBS，混匀。过滤后分装保存。吸取0.1mL 0.1M pH＝2.0的甘氨酸溶液加入0.9mL的超纯水，混匀。抗体以KB buffer稀释成10μg/mL，抗原以KB buffer稀释成系列浓度梯度，依次为200、50、12.5、0nM。
12.2实验流程
避光预湿sensor(Anti-Human Fba-CH1 2nd Generation，FAB2G)至少10min后开始测试样品板(GreinierBio，PN655209)，测试无误后按预设程序进行。其中，样品板1的第1、10和12列加入200μL/孔的KB buffer，第11列加入0.01M pH2.0的甘氨酸溶液，第2-8列加入制备好的样品溶液(一个样品加4个孔，即一列加2个样品)，第九列按照浓度从高到低依次加入人BCMA-Fc，即第1，5个孔加入200nM的抗原溶液，第2，6个孔加入50nM的抗原溶液，第3，7个孔加入12.5nM的抗原溶液，第4、8个孔加入0nM的抗原溶液。样品板2的准备除第九列的抗原换成猴BCMA蛋白，其余保持不变。数据结果详见表1-4。
表1-4人源化抗体与人、猴BCMA亲和力检测结果
实施例13
基于上述实施例选定了5-6-7-hu-2和5-6-32-hu-2，对其进行分析和测序。基于IMGT数据库(http://www.imgt.org/)对人源抗体序列可变区进行定义，确定本发明抗体轻链和重链可变区的序列(SEQ ID NO:13-16)，针对可变区序列进行分析，采用AbM定义CDR的方式，确定了抗体重链和轻链的互补决定区序列(SEQ ID NO:1-12)。
本发明保护的序列具体如下：
SEQ ID NO:1
GHIFTNFHFH
SEQ ID NO:2
GYIFTNYHMH
SEQ ID NO:3
GIYPGNGDTF
SEQ ID NO:4
GIYPGNGDIF
SEQ ID NO:5
GSYYGYIDAMDY
SEQ ID NO:6
GSYYGYIDAMDY
SEQ ID NO:7
RASQDISNYLN
SEQ ID NO:8
RASQDISNDLN
SEQ ID NO:9
YTSRLHS
SEQ ID NO:10
YTSRLPS
SEQ ID NO:11
QQGNTLPWT
SEQ ID NO:12
QQGHTLPWT
SEQ ID NO:13
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO:14
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNDLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLPSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQGHTLPWTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO:15
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKISCKASGHIFTNFHFHWVRQAPGQGLEWIGGIYPGNGDTFYNQKFQGRATITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRGSYYGYIDAMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO:16
QVQLVQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYIFTNYHMHWVRQAPGQGLEWIGGIYPGNGDIFYAQKFQGRATITADKSTSTAYIELSSMRSEDTAVYYCARGSYYGYIDAMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO:17
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYRKLPWTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO:18
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGLEWMGATYRGHSDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGAIYDGYDVLDNWGQGTLVTVSS
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 苏州亲为药业有限公司
<120> 靶向BCMA的具有人猴交叉的人源化单克隆抗体
<130> TPD01188
<141> 2020-09-25
<150> 201910960313.4
<151> 2019-10-10
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Gly His Ile Phe Thr Asn Phe His Phe His
1 5 10
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Gly Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Phe
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<212> PRT
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Gly Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Ile Phe
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Gly Ser Tyr Tyr Gly Tyr Ile Asp Ala Met Asp Tyr
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<213> Artificial Sequence
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Gly Ser Tyr Tyr Gly Tyr Ile Asp Ala Met Asp Tyr
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 7
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
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<213> Artificial Sequence
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Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Asp Leu Asn
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 9
Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser
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<213> Artificial Sequence
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Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 12
Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Trp Thr
1 5
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<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Asp
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 15
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly His Ile Phe Thr Asn Phe
20 25 30
His Phe His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Gly Ser Tyr Tyr Gly Tyr Ile Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 16
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 16
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
His Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Ile Phe Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile Glu Leu Ser Ser Met Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Gly Tyr Ile Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 17
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 17
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 18
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 18
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Ile Tyr Asp Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
Claims (14)
1.一种分离的靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的单克隆抗体，其中，所述抗体既能结合人BCMA也能结合猴BCMA。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，所述抗体选自以下的任一种：
(1)抗体，其包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1或2所示的重链互补决定区1(CDR-H1)，和/或包含SEQ ID NO:3或4所示的重链互补决定区2(CDR-H2)，和/或包含SEQ ID NO:5或6所示的重链互补决定区3(CDR-H3)；
(2)抗体，其包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:7或8所示的轻链互补决定区1(CDR-L1)，和/或包含SEQ ID NO:9或10所示的轻链互补决定区2(CDR-L2)，和/或包含SEQ ID NO:11或12所示的轻链互补决定区3(CDR-L3)；
(3)抗体，包含(1)所述抗体的重链可变区及(2)所述抗体的轻链可变区。
3.如权利要求1或2所述的抗体，其特征在于，所述抗体选自以下的任一种：
(1)抗体，包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:13或14所示的氨基酸序列、或上述序列的变体；
(2)抗体，包含重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:15或16所示的氨基酸序列、或上述序列的变体；
(3)抗体，包含(1)所述抗体的重链可变区及(2)所述抗体的轻链可变区。
4.如权利要求1～3中任一项所述的抗体，其特征在于，
所述的抗体的重链可变区包含SEQ ID NO:1所示的CDR-H1，SEQ ID NO:3所示的CDR-H2和SEQ ID NO:5所示的CDR-H3，或者
所述的抗体的重链可变区包含SEQ ID NO:2所示的CDR-H1，SEQ ID NO:4所示的CDR-H2和SEQ ID NO:6所示的CDR-H3。
5.如权利要求1～3中任一项所述的抗体，其特征在于，
所述的抗体的轻链可变区包含SEQ ID NO:7所示的CDR-L1，SEQ ID NO:9所示的CDR-L2和SEQ ID NO:11所示的CDR-L3，或者
所述的抗体的轻链可变区包含SEQ ID NO:8所示的CDR-L1，SEQ ID NO:10所示的CDR-L2和SEQ ID NO:12所示的CDR-L3。
6.根据权利要求1～3中任一项所述的抗体，其特征在于，所述的抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:13或14所示的序列。
7.根据权利要求1～3中任一项所述的抗体，其特征在于，所述的抗体的重链可变区具有SEQ ID NO:15或16所示的序列。
8.编码权利要求1-6中任一项所述的抗体的核酸。
9.一种表达载体，其包含权利要求8所述的核酸。
10.一种宿主细胞，其包含权利要求9所述的表达载体或基因组中整合有权利要求9所述的核酸。
11.一种生产单克隆抗体的方法，所述方法包括培养根据权利要求10所述的宿主细胞从而生产根据权利要求1～7中任一项所述的单克隆抗体。
12.一种药物组合物，其包含根据权利要求1～7中任一项所述的单克隆抗体和药学上可接受的载体。
13.一种药盒或制品，其包括根据权利要求1～7中任一项所述的单克隆抗体或根据权利要求12所述的药物组合物。
14.根据权利要求1～7中任一项所述的单克隆抗体在制备用于治疗与BCMA的表达相关的疾病的药物中的用途，
优选所述疾病选自B细胞急性淋巴性白血病、T细胞急性淋巴性白血病、急性淋巴性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、伯基特淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病，小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴瘤、恶性淋巴增殖状况、MALT淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突细胞瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、骨髓瘤、MGUS、浆细胞瘤、系统性淀粉样蛋白轻链淀粉样变性和POEMS综合征，进一步优选所述疾病为多发性骨髓瘤。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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