JP2022551662A - Ｂｃｍａを標的とする、ヒトサルの交差反応性を有するヒト化モノクローナル抗体 - Google Patents
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Abstract
ヒトＢＣＭＡとサルＢＣＭＡの両方に結合できる、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を標的とする単離されたモノクローナル抗体が提供される。また、その抗体をコードする核酸、その抗体を製造する方法、及びその抗体を含む医薬組成物も提供される。【選択図】なし
Description
本発明は、ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）とサルＢＣＭＡ抗原に同時に特異的に結合するモノクローナル抗体及びそのフラグメントを含む、ＢＣＭＡに特異的に結合するモノクローナル抗体に関する。
本発明は、ＢＣＭＡに特異的に結合し、ＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬのＢＣＭＡ受容体への結合を阻害するモノクローナル抗体及びそのフラグメントに関する。
本発明はまた、ＢＣＭＡに特異的に結合し、優れたエンドサイトーシス効果を有するモノクローナル抗体及びそのフラグメントに関する。
Ｂ細胞は骨髄で成熟して形質細胞になり、外来のウイルスや細菌に対する抗体を分泌することができる。形質細胞が癌性になり骨髄腫細胞になると、より悪性の骨髄腫細胞を増殖させ続け、大量の無用な抗体を分泌する。骨髄腫は通常、脊椎、頭蓋骨、骨盤、胸腔などに発生し、腫瘍または溶骨性疾患として現れる。骨髄腫の状態は通常、重要性が不明なモノクローナルガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）から、低リスクのスモーキー多発性骨髄腫へ、さらに高リスクのスモーキー多発性骨髄腫（ＳＭＭ）へ徐々に進行し、最終的には多発性骨髄腫に進行する（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐｒｉｍｅｒｓ，２０１７，３，１７０４６．）。多発性骨髄腫（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ、ＭＭ）の主な特徴には、高カルシウム血症、腎機能障害、貧血、骨機能障害などがあり、重度の骨痛を伴い、骨折が繰り返される傾向がある（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１２，９（３），１３５－１４３．）。国際骨髄腫財団の統計によると、２０１７年８月まででも、世界中の患者数は約７５万に達し、毎年約１１．４万人が新たに発症し、約９万人がこの疾患で亡くなっていた。
腫瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバーであるＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、主に記憶細胞、形質芽細胞、及び形質細胞の表面に発現するが、他の細胞の表面にはほとんど発現しない。一方、ＢＣＭＡは細胞表面の膜貫通受容体であり、その遺伝子は１６番目の染色体のＴＮＦＲＳＦ１７部位に位置している。ＢＣＭＡ欠損マウスは、外観とＢ細胞の数が比較的正常であるが、形質細胞の生存能力が非常に低いことは文献で報告されている（Ｂｌｏｏｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１５，５（２），ｅ２８２－ｅ２８２．）。
ＢＣＭＡのリガンドは、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）と増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）を含む。その中で、ＢＡＦＦの受容体は、ＢＡＦＦ－ＲとＴＡＣＩをさらに含み、ＡＰＲＩＬの受容体は、ＴＡＣＩをさらに含む。ＢＣＭＡシグナル伝達経路の主な役割は、Ｂ細胞の生存と分化、及び制御性Ｔ細胞の活性化を促進することである。それに対して、ＴＡＣＩシグナル伝達経路は、Ｂ細胞の成熟を阻害する（Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００９，９（７）：４９１．）。これらの３つの受容体（ＢＡＦＦ－Ｒ、ＴＡＣＩ、およびＢＣＭＡ）の場合、Ｂ細胞の発達中、未成熟Ｂ細胞、移動中のＢ細胞及び初期Ｂ細胞の表面にはＢＡＦＦ－Ｒのみが発現し、ＧＣ Ｂ細胞の表面にはＢＡＦＦ－ＲとＢＣＭＡがいずれも発現し、記憶細胞の表面にもＢＡＦＦ－Ｒ、ＴＡＣＩおよびＢＣＭＡがいずれも発現する。形質芽細胞または形質細胞の表面にＴＡＣＩおよびＢＣＭＡがいずれも発現する。形質細胞が癌性になって多発性骨髄腫細胞になると、ＢＣＭＡはその表面に高度に発現し、ＴＡＣＩが発現し得るが、ＢＡＦＦ－Ｒは発現しない（Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００９，９（７）：４９１．）。これより分かるように、ほとんどのＢ細胞はＢＣＭＡを発現しない。さらに、他の臓器の細胞はＢＣＭＡをほとんど発現しないことが研究によって示されている。臨床的には、多発性骨髄腫患者の血清中のＢＣＭＡ、ＢＡＦＦ、ＡＰＲＩＬのレベルは高く、全生存期間と予後は悪化している。したがって、多発性骨髄腫の治療において、ＢＣＭＡはＣＤ１９などよりも優れた新しい標的であり、特異性が高く、標的の副作用が少ない。したがって、ＢＣＭＡ標的に対するブロッキング効果またはエンドサイトーシス効果を有する抗体薬の開発は、多発性骨髄腫の治療効果を改善するだけでなく、治療の副作用を大幅に低減し、莫大な経済的および社会的価値を生み出すことができる。
現在、ＡＤＣ（抗体薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ））薬に関しては、Ｇｌａｘｏ Ｇｒｏｕｐ社とＳｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社が共同開発したＢｅｌａｎｔａｍａｂ ｍａｆｏｄｏｔｉｎ（ＧＳＫ２８５７９１６と略称）には有意な効果があり、３５例の過剰前治療（ほとんどの患者は少なくとも５つの療法を受けたが治療が失敗した）Ｒ／Ｒ ＭＭ患者では、ＯＲＲは６０％に達し、ＰＦＳ（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ－Ｆｒｅｅ－Ｓｕｒｖｉｖａｌ（無増悪生存期間））の中央値は１２か月であった（ＮＣＴ０３８４８８４５）。ＣＡＲ－Ｔ細胞に関しては、ＮｅｏｇｅｎｅおよびＢｌｕｅｂｉｒｄ ＢｉｏのＣＡＲ－Ｔ細胞療法Ｉｄｅｃａｂｔａｇｅｎｅ ｖｉｃｌｅｕｃｅｌ（ｂｂ２１２１と略称）では、以前に少なくとも３つの療法を受けたが治療が失敗した３３例のＲ／Ｒ ＭＭ患者において、総寛解率は８５％に達し、ＰＦＳの中央値は１１．８か月であった（ＮＣＴ０２６５８９２９）。二重特異性抗体に関しては、アムジェンのＡＭＧ ４２０は最も急速に成長している治療法である。このタイプの抗体は、従来の抗体よりも小さく、２つの抗体ドメインフラグメントが連結してなり、良好な活性を示すが、その半減期が完全長抗体より短い（ＮＣＴ０２５１４２３９）。臨床結果に関しては、ＢＭＣＡ標的に対する薬物について、モノクローナル抗体、二重抗体、ＡＤＣ、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法のいずれであっても、注目すべき結果を収め、臨床結果は、ＢＭＣＡ標的による副作用が、他の標的による副作用より遥かに低いことを示している。
上記の背景に基づいて、本発明は、ＢＣＭＡを標的とする新規抗体を開発することを意図している。
本発明は、ＢＣＭＡを、マウスを免疫するための免疫原として使用し、ファージディスプレイ技術によって抗体ライブラリーを構築してスクリーニングし、ヒトとサルの両方のＢＣＭＡ抗原に結合するモノクローナル抗体を取得する。その後の抗体ヒト化により、マウスモノクローナル抗体をヒト化抗体に変換し、親和性、ブロッキング、エンドサイトーシスなどの機能実験により、ヒト化候補抗体が優れた機能を示し、細胞レベルでのエンドサイトーシス機能は、競合品であるＧＳＫ２８５７９１６よりも優れている。
本明細書に開示されているすべての特許および参考文献は、参照により明確かつ完全に本明細書に組み込まれる。
本発明は、ヒトＢＣＭＡとサルＢＣＭＡの両方に結合できる、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を標的とする単離されたモノクローナル抗体に係る。
具体的な一態様では、本発明の抗体は、配列番号１若しくは２に示される重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、及び／または配列番号３若しくは４に示される重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）、及び／または配列番号５若しくは６に示される重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）を含む重鎖可変領域を含む。
具体的な一態様では、本発明の抗体は、配列番号７若しくは８に示される軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、及び／または配列番号９若しくは１０に示される軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）、及び／または配列番号１１若しくは１２に示される軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む軽鎖可変領域を含む。
具体的な一態様では、本発明の抗体は、配列番号１若しくは２に示される重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、及び／または配列番号３若しくは４に示される重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）、及び／または配列番号５若しくは６に示される重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）を含む重鎖可変領域と、配列番号７若しくは８に示される軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、及び／または配列番号９若しくは１０に示される軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）、及び／または配列番号１１若しくは１２に示される軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む軽鎖可変領域とを含む。
具体的な一態様では、本発明の抗体は、上記抗体のバリアントを含み、本発明に記載の上記抗体と同等または類似の活性を有する。
具体的な一態様では、本発明の抗体は、配列番号１３もしくは１４示されるアミノ酸配列または前記配列のバリアントを含む軽鎖可変領域を含む。
具体的な一態様では、本発明の抗体は、配列番号１５もしくは１６示されるアミノ酸配列または前記配列のバリアントを含む重鎖可変領域を含む。
具体的な一態様では、本発明の抗体は、配列番号１３もしくは１４示されるアミノ酸配列または前記配列のバリアントを含む軽鎖可変領域と、配列番号１５もしくは１６示されるアミノ酸配列または前記配列のバリアントを含む重鎖可変領域とを含む。
具体的な一態様では、本発明の抗体の重鎖可変領域が、配列番号１に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号５に示されるＣＤＲ－Ｈ３を含む。
具体的な一態様では、本発明の抗体の重鎖可変領域が、配列番号２に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号６に示されるＣＤＲ－Ｈ３を含む。
具体的な一態様では、本発明の抗体の軽鎖可変領域が、配列番号７に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９に示されるＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１１に示されるＣＤＲ－Ｌ３を含む。
具体的な一態様では、本発明の抗体の軽鎖可変領域が、配列番号８に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１０に示されるＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１２に示されるＣＤＲ－Ｌ３を含む。
具体的な一態様では、本発明の抗体の軽鎖可変領域が、配列番号１３または１４に示される配列を有するか、または前記配列のいずれか１つと少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の類似性を有する配列を有する。
具体的な一態様では、本発明の抗体の重鎖可変領域が、配列番号１５または１６に示される配列を有するか、または前記配列のいずれか１つと少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の類似性を有する配列を有する。
具体的な一態様では、本発明の抗体は、配列番号１に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号５に示されるＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域と、配列番号７に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９に示されるＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１１に示されるＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域とを含む。
さらに、前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１３に示される配列を有するか、または前記配列のいずれか１つと少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の類似性を有する配列を有する。前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号１５に示される配列を有するか、または前記配列のいずれか１つと少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の類似性を有する配列を有する。
具体的な一態様では、本発明の抗体は、配列番号２に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号６に示されるＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域と、配列番号８に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１０に示されるＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１２に示されるＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域とを含む。
さらに、前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１４に示される配列を有するか、または前記配列のいずれか１つと少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の類似性を有する配列を有する。前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号１６に示される配列を有するか、または前記配列のいずれか１つと少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の類似性を有する配列を有する。
本発明はさらに、本発明に記載の上記抗体と同じエピトープを認識する、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を標的とするモノクローナル抗体に係る。
本発明はさらに、本発明に記載の上記抗体と競合してＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を標的とするモノクローナル抗体に係る。
本発明はさらに、本発明に記載の抗体をコードする核酸に係る。
本発明はさらに、本発明に記載の核酸を含む発現ベクターに係る。
本発明はさらに、本発明に記載の発現ベクターを含み、またはそのゲノムに本発明に記載の核酸が組み込まれた、宿主細胞に係る。
本発明はさらに、本発明に記載の宿主細胞を培養することによって本発明に記載のモノクローナル抗体を産生する、モノクローナル抗体を産生する方法に係る。
本発明はさらに、本発明に記載のモノクローナル抗体及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物に係る。
本発明はさらに、本発明に記載のモノクローナル抗体または本発明に記載の医薬組成物を含む、キットまたは製品に係る。
本発明はさらに、本発明に記載のモノクローナル抗体または本発明に記載の医薬組成物または本発明に記載のキット若しくは製品を、それを必要とする被験者に投与することを含む、ＢＣＭＡの発現に関連する疾患を治療するための方法に係る。
具体的な一態様では、上記疾患は、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病、Ｔ細胞急性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、小細胞または大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性疾患、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンストレームマクログロブリン血症、骨髄腫、ＭＧＵＳ、形質細胞腫、全身性アミロイド軽鎖アミロイドーシス及びＰＯＥＭＳ症候群から選択される。
具体的な一態様では、上記疾患は多発性骨髄腫である。
本発明はさらに、ＢＣＭＡの発現に関連する疾患を治療するための薬剤の調製における、本発明に記載のモノクローナル抗体の使用に係る。
具体的な一態様では、上記疾患は、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病、Ｔ細胞急性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、小細胞または大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性疾患、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンストレームマクログロブリン血症、骨髄腫、ＭＧＵＳ、形質細胞腫、全身性アミロイド軽鎖アミロイドーシス及びＰＯＥＭＳ症候群から選択される。
具体的な一態様では、上記疾患は多発性骨髄腫である。
具体的には、本発明は下記の態様に係る。
１、ヒトＢＣＭＡとサルＢＣＭＡの両方に結合できる、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を標的とする単離されたモノクローナル抗体。
２、前記抗体は、
（１）配列番号１若しくは２に示される重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、及び／または配列番号３若しくは４に示される重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）、及び／または配列番号５若しくは６に示される重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）を含む重鎖可変領域を含む抗体；
（２）配列番号７若しくは８に示される軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、及び／または配列番号９若しくは１０に示される軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）、及び／または配列番号１１若しくは１２に示される軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
（３）（１）に記載の抗体の重鎖可変領域及び（２）に記載の抗体の軽鎖可変領域を含む抗体；
（４）（１）～（３）のいずれか１項に記載の抗体のバリアントであり、（１）～（３）のいずれか１項に記載の抗体と同等または類似の活性を有する抗体
から選択されるいずれかである、項１に記載のモノクローナル抗体。
３、前記抗体は、
（１）配列番号１３もしくは１４示されるアミノ酸配列または前記配列のバリアントを含む軽鎖可変領域を含む抗体；
（２）配列番号１５もしくは１６示されるアミノ酸配列または前記配列のバリアントを含む重鎖可変領域を含む抗体；
（３）（１）に記載の抗体の重鎖可変領域及び（２）に記載の抗体の軽鎖可変領域を含む抗体
から選択されるいずれかであることを特徴とする、項１または２に記載の抗体。
４、前記抗体の重鎖可変領域が、配列番号１に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号５に示されるＣＤＲ－Ｈ３を含むことを特徴とする、項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
５、前記抗体の重鎖可変領域が、配列番号２に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号６に示されるＣＤＲ－Ｈ３を含むことを特徴とする、項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
６、前記抗体の軽鎖可変領域が、配列番号７に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９に示されるＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１１に示されるＣＤＲ－Ｌ３を含むことを特徴とする、項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
７、前記抗体の軽鎖可変領域が、配列番号８に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１０に示されるＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１２に示されるＣＤＲ－Ｌ３を含むことを特徴とする、項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
８、前記抗体の軽鎖可変領域が、配列番号１３または１４に示される配列を有するか、または前記配列のいずれか１つと少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の類似性を有する配列を有することを特徴とする、項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
９、前記抗体の重鎖可変領域が、配列番号１５または１６に示される配列を有するか、または前記配列のいずれか１つと少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の類似性を有する配列を有することを特徴とする、項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
１０、項１～９のいずれか１項に記載の抗体と同じエピトープを認識することを特徴とする、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を標的とするモノクローナル抗体。
１１、項１～９のいずれか１項に記載の抗体と競合してＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合することを特徴とする、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を標的とするモノクローナル抗体。
１２、項１～１１のいずれか１項に記載の抗体をコードする核酸。
１３、項１２に記載の核酸を含む発現ベクター。
１４、項１３に記載の発現ベクターを含み、またはそのゲノムに項１２に記載の核酸が組み込まれた、宿主細胞。
１５、項１４に記載の宿主細胞を培養することによって項１～１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を産生する、モノクローナル抗体を産生する方法。
１６、項１～１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
１７、項１～１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または項１６に記載の医薬組成物を含む、キットまたは製品。
１８、項１～１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または項１６に記載の医薬組成物または項１７に記載のキット若しくは製品を、それを必要とする被験者に投与することを含む、
ＢＣＭＡの発現に関連する疾患を治療するための方法。
１９、前記疾患が、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病、Ｔ細胞急性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、小細胞または大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性疾患、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンストレームマクログロブリン血症、骨髄腫、ＭＧＵＳ、形質細胞腫、全身性アミロイド軽鎖アミロイドーシス及びＰＯＥＭＳ症候群から選択される、項１８に記載の方法。
２０、前記疾患が多発性骨髄腫である、項１８または１９に記載の方法。
２１、ＢＣＭＡの発現に関連する疾患を治療するための薬剤の調製における、項１～１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体の使用。
２２、前記疾患が、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病、Ｔ細胞急性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、小細胞または大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性疾患、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンストレームマクログロブリン血症、骨髄腫、ＭＧＵＳ、形質細胞腫、全身性アミロイド軽鎖アミロイドーシス及びＰＯＥＭＳ症候群から選択される、項２１に記載の使用。
２３、前記疾患が多発性骨髄腫である、項２１または２２に記載の使用。
２、前記抗体は、
（１）配列番号１若しくは２に示される重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、及び／または配列番号３若しくは４に示される重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）、及び／または配列番号５若しくは６に示される重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）を含む重鎖可変領域を含む抗体；
（２）配列番号７若しくは８に示される軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、及び／または配列番号９若しくは１０に示される軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）、及び／または配列番号１１若しくは１２に示される軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
（３）（１）に記載の抗体の重鎖可変領域及び（２）に記載の抗体の軽鎖可変領域を含む抗体；
（４）（１）～（３）のいずれか１項に記載の抗体のバリアントであり、（１）～（３）のいずれか１項に記載の抗体と同等または類似の活性を有する抗体
から選択されるいずれかである、項１に記載のモノクローナル抗体。
３、前記抗体は、
（１）配列番号１３もしくは１４示されるアミノ酸配列または前記配列のバリアントを含む軽鎖可変領域を含む抗体；
（２）配列番号１５もしくは１６示されるアミノ酸配列または前記配列のバリアントを含む重鎖可変領域を含む抗体；
（３）（１）に記載の抗体の重鎖可変領域及び（２）に記載の抗体の軽鎖可変領域を含む抗体
から選択されるいずれかであることを特徴とする、項１または２に記載の抗体。
４、前記抗体の重鎖可変領域が、配列番号１に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号５に示されるＣＤＲ－Ｈ３を含むことを特徴とする、項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
５、前記抗体の重鎖可変領域が、配列番号２に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号６に示されるＣＤＲ－Ｈ３を含むことを特徴とする、項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
６、前記抗体の軽鎖可変領域が、配列番号７に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９に示されるＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１１に示されるＣＤＲ－Ｌ３を含むことを特徴とする、項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
７、前記抗体の軽鎖可変領域が、配列番号８に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１０に示されるＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１２に示されるＣＤＲ－Ｌ３を含むことを特徴とする、項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
８、前記抗体の軽鎖可変領域が、配列番号１３または１４に示される配列を有するか、または前記配列のいずれか１つと少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の類似性を有する配列を有することを特徴とする、項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
９、前記抗体の重鎖可変領域が、配列番号１５または１６に示される配列を有するか、または前記配列のいずれか１つと少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の類似性を有する配列を有することを特徴とする、項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
１０、項１～９のいずれか１項に記載の抗体と同じエピトープを認識することを特徴とする、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を標的とするモノクローナル抗体。
１１、項１～９のいずれか１項に記載の抗体と競合してＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合することを特徴とする、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を標的とするモノクローナル抗体。
１２、項１～１１のいずれか１項に記載の抗体をコードする核酸。
１３、項１２に記載の核酸を含む発現ベクター。
１４、項１３に記載の発現ベクターを含み、またはそのゲノムに項１２に記載の核酸が組み込まれた、宿主細胞。
１５、項１４に記載の宿主細胞を培養することによって項１～１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を産生する、モノクローナル抗体を産生する方法。
１６、項１～１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
１７、項１～１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または項１６に記載の医薬組成物を含む、キットまたは製品。
１８、項１～１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または項１６に記載の医薬組成物または項１７に記載のキット若しくは製品を、それを必要とする被験者に投与することを含む、
ＢＣＭＡの発現に関連する疾患を治療するための方法。
１９、前記疾患が、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病、Ｔ細胞急性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、小細胞または大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性疾患、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンストレームマクログロブリン血症、骨髄腫、ＭＧＵＳ、形質細胞腫、全身性アミロイド軽鎖アミロイドーシス及びＰＯＥＭＳ症候群から選択される、項１８に記載の方法。
２０、前記疾患が多発性骨髄腫である、項１８または１９に記載の方法。
２１、ＢＣＭＡの発現に関連する疾患を治療するための薬剤の調製における、項１～１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体の使用。
２２、前記疾患が、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病、Ｔ細胞急性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、小細胞または大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性疾患、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンストレームマクログロブリン血症、骨髄腫、ＭＧＵＳ、形質細胞腫、全身性アミロイド軽鎖アミロイドーシス及びＰＯＥＭＳ症候群から選択される、項２１に記載の使用。
２３、前記疾患が多発性骨髄腫である、項２１または２２に記載の使用。
本発明の効果
Ｂｅｌａｎｔａｍａｂ ｍａｆｏｄｏｔｉｎ抗体（ＧＳＫ２８５７９１６と略称）と比較して、本発明の抗体は、ヒトＢＣＭＡおよびサルＢＣＭＡの両方に結合することができ、親和性の点でＢｅｌａｎｔａｍａｂ ｍａｆｏｄｏｔｉｎ抗体に近いか、またはそれよりも優れている。本発明の抗体は、ＢＣＭＡがＢＣＭＡのリガンドＢＡＦＦまたはＡＰＲＩＬに結合することをブロッキングする効果では、ＧＳＫ２８５７９１６に近いか、またはそれよりも優れている。本発明の抗体はエンドサイトーシス効果では、ＧＳＫ２８５７９１６よりも優れたエンドサイトーシス効果を有する。熱安定性では、本発明の抗体は、ＧＳＫ２８５７９１６よりも優れた熱安定性を有する。免疫原性では、本発明の抗体は、より低い免疫原性を有するヒト化抗体である。
Ｂｅｌａｎｔａｍａｂ ｍａｆｏｄｏｔｉｎ抗体（ＧＳＫ２８５７９１６と略称）と比較して、本発明の抗体は、ヒトＢＣＭＡおよびサルＢＣＭＡの両方に結合することができ、親和性の点でＢｅｌａｎｔａｍａｂ ｍａｆｏｄｏｔｉｎ抗体に近いか、またはそれよりも優れている。本発明の抗体は、ＢＣＭＡがＢＣＭＡのリガンドＢＡＦＦまたはＡＰＲＩＬに結合することをブロッキングする効果では、ＧＳＫ２８５７９１６に近いか、またはそれよりも優れている。本発明の抗体はエンドサイトーシス効果では、ＧＳＫ２８５７９１６よりも優れたエンドサイトーシス効果を有する。熱安定性では、本発明の抗体は、ＧＳＫ２８５７９１６よりも優れた熱安定性を有する。免疫原性では、本発明の抗体は、より低い免疫原性を有するヒト化抗体である。
本発明の目的、技術案、および利点をより明確にするために、本発明を、具体的な実施形態と併せて、添付の図面を参照して、以下でさらに詳細に説明する。
本明細書に記載されている科学技術用語は、当業者が一般に理解している用語と同じ意味を有するが、矛盾する場合には、本明細書の定義に準ずる。
一般的に、本明細書で使用されている用語は、以下の意味を有する。
本明細書において、「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から分離された抗体をいう。特定の一部の実施形態では、抗体を９５％または９９％を超える純度に精製し、前記純度は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ等電集束（ＩＥＦ）、毛細管電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）によって確定される。
本明細書において、「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から分離された抗体をいう。特定の一部の実施形態では、抗体を９５％または９９％を超える純度に精製し、前記純度は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ等電集束（ＩＥＦ）、毛細管電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）によって確定される。
本明細書で使用される「ＢＣＭＡ」という用語は、ＣＤ２６９としても知られるＢ細胞成熟抗原であり、これは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー、すなわちＴＮＦＲＳＦ１７である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９２（１）：１２９－１３５，２０００）。ヒトＢＣＭＡは、形質細胞と多発性骨髄腫細胞でほぼ独占的に発現している（Ｎｏｖａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０３（２）：６８９－６９４，２００４；Ｎｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７３（１９）：５９０３－５９０９；Ｆｅｌｉｘ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，９（７）：１３４８－５８，２０１５などを参照）。ＢＣＭＡはＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）および増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）に結合できる（例えば、Ｍａｃｋａｙ ｅｔ ａｌ．，２００３、及びＫａｌｌｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ，２０４：４３－５４，２００５）。ＢＣＭＡは、多発性骨髄腫の免疫療法剤の適切な腫瘍抗原標的であり得る。
「抗原（Ａｇ）」は、動物における抗体産生またはＴ細胞応答を刺激することができる化合物、組成物、または物質を指し、動物に注射または吸収される組成物（例えば、がん特異的タンパク質を含む組成物）を含む。抗原は、（異種抗原（開示された抗原など）によって誘導される産物を含む）特異的体液または細胞性免疫の産物と反応する。特定の実施形態において、標的抗原は、ＢＣＭＡポリペプチドのエピトープである。
「エピトープ」または「抗原決定基」は、結合剤によって結合される抗原の領域を指す。エピトープは、連続したアミノ酸、またはタンパク質の三次フォールディングによって並列結合された連続しないアミノ酸によって形成することができる。連続したアミノ酸によって形成されたエピトープは、通常、変性溶媒にさらされたときに残るが、三次フォールディングによって形成されたエピトープは、通常、変性溶媒で処理されたときに消える。エピトープは通常、独特の空間的コンフォメーションで少なくとも３つ、より通常は少なくとも５個、約９個、または約８～１０個のアミノ酸を含む。
抗体は、その抗原結合フラグメント、例えば、ラクダＩｇ、Ｉｇ ＮＡＲ、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）’２フラグメント、Ｆ（ａｂ）’３フラグメント、Ｆｖ、単鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、二重－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニ抗体、二機能性抗体、三機能性抗体、四機能性抗体、ジスルフィド結合安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）および単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）、並びに抗原結合に関与する完全長抗体の一部を含む。この用語はまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ハイブリッド抗体（例えば、二重特異性抗体）、およびそれらの抗原結合フラグメントなどの遺伝子操作された形態を含む。Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４－１９９５，ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ；Ｋｕｂｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９７を参照されたい。
当業者によって理解されるように、また、本明細書の他の箇所で説明されるように、完全な抗体は、２本の重鎖および２本の軽鎖を含む。各重鎖は可変領域と第１、第２、および第３の定常領域で構成され、各軽鎖は可変領域と定常領域で構成される。哺乳類の重鎖は、α、δ、ε、γ、およびμに分類される。哺乳類の軽鎖はλまたはκに分類される。α、δ、ε、γ、およびμ重鎖を含む免疫グロブリンは、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ａ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭに分類される。完全な抗体は「Ｙ」字型を形成する。Ｙのステムは、２本の重鎖の第２と第３の定常領域（ＩｇＥとＩｇＭの場合は第４の定常領域）が結合して構成され、ヒンジにジスルフィド結合（鎖間）が形成される。重鎖γ、α、およびδは、３つのタンデム（一列に並んだ）Ｉｇドメインからなる定常領域、および柔軟性を高めるためのヒンジ領域を有する；重鎖μおよびεは、４つの免疫グロブリンドメイン領域からなる定常領域を有する。第２と第３の定常領域はそれぞれ「ＣＨ２ドメイン」と「ＣＨ３ドメイン」と呼ばれる。Ｙの各アームには、単一の軽鎖の可変領域および定常領域に結合している単一の重鎖の可変領域と第１の定常領域が含まれる。軽鎖および重鎖の可変領域が抗原結合に関与している。
軽鎖および重鎖可変領域には、３つの超可変領域（「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる）が点在する「フレームワーク」領域が含まれている。ＣＤＲは、従来の方法、例えば、Ｋａｂａｔらの配列（Ｗｕ，ＴＴ ＆ Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １３２（２）：２１１－５０，（１９７０）；Ｂｏｒｄｅｎ，Ｐ． ＆ Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．，ＰＮＡＳ，８４：２４４０－２４４３（１９８７）；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１を参照；それらが参照により本明細書に組み込まれる）、またはＣｈｏｔｈｉａらの構造（Ｃｈｏｉｔｈｉａ，Ｃ． ＆ Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１９６（４）：９０１－９１７（１９８７）；Ｃｈｏｉｔｈｉａ，Ｃ． ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７－８８３（１９８９））によって定義または特定できる。
異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種（ヒトなど）で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域（軽鎖と重鎖を組み合わせたフレームワーク領域）は、ＣＤＲの３次元空間での位置付けと比較に使用される。ＣＤＲは主に抗原のエピトープへの結合に関与する。各鎖のＣＤＲは通常、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれ、Ｎ末端から順番に番号が付けられ、通常、特定のＣＤＲが配置されている鎖によって識別される。したがって、抗体の重鎖の可変ドメインに位置するＣＤＲはＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３と呼ばれ、抗体の軽鎖の可変ドメインに位置するＣＤＲはＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３と呼ばれる。異なる特異性（すなわち、異なる抗原に対して異なる組み合わせ部位がある）を持つ抗体は、異なるＣＤＲを持っている。ＣＤＲは抗体と抗体で異なるが、ＣＤＲ内の限られた数のアミノ酸位置のみが抗原結合に直接関与している。ＣＤＲ内のこれらの位置は、特異性決定残基（ＳＤＲ）と呼ばれる。本明細書に含まれるヒト化ＢＣＭＡ ＣＡＲの構築に適した軽鎖ＣＤＲの例示的な例には、配列番号１～３に示されるＣＤＲ配列が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に含まれるヒト化ＢＣＭＡ ＣＡＲの構築に適した重鎖ＣＤＲの例示的な例には、配列番号４～６に示されるＣＤＲ配列が含まれるが、これらに限定されない。
「ＶＨ」または「ＶＨ」への言及は、抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、または本明細書に開示された他の抗体フラグメントの重鎖可変領域を含む、免疫グロブリン重鎖の可変領域を指す。「ＶＬ」または「ＶＬ」への言及は、抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、または本明細書に開示された他の抗体フラグメントの軽鎖可変領域を含む、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。
「モノクローナル抗体」は、Ｂリンパ球の単一クローンによって、または単一抗体の軽鎖および重鎖遺伝子がトランスフェクトされた細胞によって産生される抗体である。モノクローナル抗体は、当業者に知られている方法によって、例えば、骨髄腫細胞と免疫脾臓細胞の融合物からハイブリッド抗体形成細胞を調製することによって生成される。モノクローナル抗体は、ヒト化モノクローナル抗体を含む。
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。一実施形態では、二重鎖Ｆｖ種は、緊密な非共有結合性会合にある重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの二量体から構成される。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種では、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインが柔軟なペプチドリンカーを介して共有結合することによって、軽鎖と重鎖は二重鎖Ｆｖ種に類似した「二量体」構造で会合できる。この構成では、各可変ドメインの３つの超可変領域（ＨＶＲ）が相互作用して、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面の抗原結合部位を定義する。６つのＨＶＲは一緒に、抗体に対する抗原結合特異性を付与する。ただし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）でも、抗原を認識して結合する能力があるが、親和性は完全な結合部位より低い。
Ｆａｂフラグメントは、重鎖の可変ドメインおよび軽鎖の可変ドメインを含み、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体のヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む、いくつかの残基が重鎖のＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に付加されるという点でＦａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、本明細書ではＦａｂ’に関する名称であり、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持っている。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、元々、ヒンジシステインを間に挟んだＦａｂ’フラグメントのペアとして生成された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも知られている。
上記のように、本発明は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を標的とする単離されたモノクローナル抗体に関するものであり、前記抗体は、ヒトＢＣＭＡおよびサルＢＣＭＡの両方に結合することができる。具体的には、本発明において、フローサイトメーター操作法（ＦＡＣＳ法）を使用して、ヒトおよびサルのＢＣＭＡを発現する細胞に対する本発明の抗体の親和性効果を検証した。本発明で得られたモノクローナル抗体は、陽性対照抗体（ＧＳＫ２８５７９１６）よりもヒトＢＣＭＡ－ＨＥＫ２９３細胞に対してより優れた親和性効果を有する。本発明で得られたモノクローナル抗体は、陽性対照抗体（ＧＳＫ２８５７９１６）に近いか、またはそれよりも優れているサルＢＣＭＡ－ＣＨＯ細胞に対する親和性効果を有する。本発明により得られたモノクローナル抗体は、ヒトとサルのＢＣＭＡ抗原に高い親和性で同時に結合することができ、サルのＢＣＭＡ抗原に結合し、抗体が臨床試験に入る前にサル（カニクイザル）をモデルとして使用し、毒物学的評価および薬物動態学的評価を実施することに寄与する。同時に、本発明のモノクローナル抗体は親和性が高く、親和性の高い抗体は薬力学においてより有利である。例えば、抗体は標的抗原分子に結合した後、解離がより遅くなり、細胞内での抗体のエンドサイトーシス効果がよりよくなる。同等の細胞または動物薬効果を達成するために、必要な抗体の投与量も少なくなる可能性がある。
本明細書で使用される場合、「特異的結合」、「特異的認識」または「…に対して特異的」という用語は、標的と抗原結合タンパク質間結合など、測定可能かつ再現可能な相互作用を指す。例えば、標的（エピトープであり得る）に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、他の標的との結合よりも高い親和性、アフィニティ、容易性、および／またはより長い持続時間を有する抗原結合タンパク質である。いくつかの実施形態において、関連のない標的への抗原結合タンパク質の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって決定されるように、標的への抗原結合タンパク質の結合よりも約１０％少ない。いくつかの実施形態において、標的に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、解離定数（Ｋｄ）が１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下である。
具体的には、本発明の抗体は、配列番号１（ＧＨＩＦＴＮＦＨＦＨ）もしくは２（ＧＹＩＦＴＮＹＨＭＨ）に示される重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、および／または配列番号３（ＧＩＹＰＧＮＧＤＴＦ）もしくは４（ＧＩＹＰＧＮＧＤＩＦ）に示される重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）、および／または配列番号５（ＧＳＹＹＧＹＩＤＡＭＤＹ）もしくは６（ＧＳＹＹＧＹＩＤＡＭＤＹ）を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）を含む重鎖可変領域を含む。
具体的には、本発明の抗体は、配列番号７（ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ）若しくは８（ＲＡＳＱＤＩＳＮＤＬＮ）に示される軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、及び／または配列番号９（ＹＴＳＲＬＨＳ）若しくは１０（ＹＴＳＲＬＰＳ）に示される軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）、及び／または配列番号１１（ＱＱＧＮＴＬＰＷＴ）若しくは１２（ＱＱＧＨＴＬＰＷＴ）に示される軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む軽鎖可変領域を含み得る。
具体的には、本発明の抗体は、配列番号１若しくは２に示される重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、及び／または配列番号３若しくは４に示される重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）、及び／または配列番号５若しくは６に示される重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）を含む重鎖可変領域と、配列番号７若しくは８に示される軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、及び／または配列番号９若しくは１０に示される軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）、及び／または配列番号１１若しくは１２に示される軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む軽鎖可変領域とを含み得る。
具体的には、本発明の抗体は、
配列番号１３：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＶＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＮＴＬＰＷＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
または
配列番号１４：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＮＤＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＰＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＨＴＬＰＷＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
に示されるアミノ酸配列、または上記配列のバリアントを含む軽鎖可変領域を含み得る。
配列番号１３：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＶＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＮＴＬＰＷＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
または
配列番号１４：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＮＤＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＰＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＨＴＬＰＷＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
に示されるアミノ酸配列、または上記配列のバリアントを含む軽鎖可変領域を含み得る。
具体的には、本発明の抗体は、
配列番号１５：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＨＩＦＴＮＦＨＦＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＹＰＧＮＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧＲＡＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＧＳＹＹＧＹＩＤＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
または
配列番号１６：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＨＩＦＴＮＦＨＦＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＹＰＧＮＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧＲＡＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＧＳＹＹＧＹＩＤＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
に示されるアミノ酸配列、または上記配列のバリアントを含む重鎖可変領域を含み得る。
配列番号１５：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＨＩＦＴＮＦＨＦＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＹＰＧＮＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧＲＡＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＧＳＹＹＧＹＩＤＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
または
配列番号１６：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＨＩＦＴＮＦＨＦＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＹＰＧＮＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧＲＡＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＧＳＹＹＧＹＩＤＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
に示されるアミノ酸配列、または上記配列のバリアントを含む重鎖可変領域を含み得る。
具体的には、本発明の抗体は、配列番号１３もしくは１４示されるアミノ酸配列または前記配列のバリアントを含む軽鎖可変領域と、配列番号１５もしくは１６示されるアミノ酸配列または前記配列のバリアントを含む重鎖可変領域とを含む。
具体的には、本発明の１つの抗体の重鎖可変領域は、配列番号１に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号５に示されるＣＤＲ－Ｈ３を含む。本発明の別の抗体の重鎖可変領域は、配列番号２に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号６に示されるＣＤＲ－Ｈ３を含む。
具体的には、本発明の１つの抗体の軽鎖可変領域は、配列番号７に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９に示されるＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１１に示されるＣＤＲ－Ｌ３を含む。本発明の別の抗体の軽鎖可変領域は、配列番号８に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１０に示されるＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１２に示されるＣＤＲ－Ｌ３を含む。
具体的には、本発明の抗体の軽鎖可変領域が、配列番号１３または１４に示される配列を有するか、または前記配列のいずれか１つと少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の類似性を有する配列を有する。具体的には、本発明の抗体の重鎖可変領域が、配列番号１５または１６に示される配列を有するか、または前記配列のいずれか１つと少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の類似性を有する配列を有する。
具体的には、本発明の１つの抗体は、配列番号１に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号５に示されるＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域と、配列番号７に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９に示されるＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１１に示されるＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域とを含む。具体的には、前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１３に示される配列を有するか、または前記配列のいずれか１つと少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の類似性を有する配列を有する。前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号１５に示される配列を有するか、または前記配列のいずれか１つと少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の類似性を有する配列を有する。
具体的には、本発明の別の抗体は、配列番号２に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号６に示されるＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域と、配列番号８に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１０に示されるＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１２に示されるＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域とを含む。具体的には、前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１４に示される配列を有するか、または前記配列のいずれか１つと少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の類似性を有する配列を有する。前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号１６に示される配列を有するか、または前記配列のいずれか１つと少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の類似性を有する配列を有する。
本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、１、２、または３つのアミノ酸の置換、欠失、または付加など、少なくとも１つが修飾された重鎖可変領域または軽鎖可変領域を指し、ここで、重鎖または軽鎖バリアントを含む修飾された抗原結合タンパク質は実質的に、修飾前の抗原結合タンパク質の生物学的特性を保持している。一実施形態では、バリアントの重鎖可変領域または軽鎖可変領域の配列を含む抗原結合タンパク質は、修飾前の抗原結合タンパク質の生物学的特性の６０％、７０％、８０％、９０％、１００％を保持する。各重鎖可変領域または軽鎖可変領域は、単独で、または別の重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域と組み合わせて修飾することができることを理解されたい。本開示の抗原結合タンパク質は、本明細書に記載の重鎖可変領域のアミノ酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有する重鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。本開示の抗原結合タンパク質は、本明細書に記載の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有する軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。相同性パーセントは、重鎖可変領域全体および／または軽鎖可変領域全体にあり得るか、または相同性パーセントは、フレームワーク領域に限定され得、そしてＣＤＲに対応する配列は、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域において本明細書に開示されるＣＤＲと１００％の同一性を有する。本明細書で使用される場合、「ＣＤＲバリアント」という用語は、１、２または３つのアミノ酸の置換、欠失または付加など、少なくとも１つが修飾されたＣＤＲを指し、ここで、ＣＤＲバリアントを含む修飾された抗原結合タンパク質は実質的に、修飾前の抗原結合タンパク質の生物学的特性を保持している。一実施形態では、バリアントＣＤＲを含む抗原結合タンパク質は、修飾前の抗原結合タンパク質の生物学的特性の６０％、７０％、８０％、９０％、１００％を保持する。修飾可能な各ＣＤＲは、単独で、または別のＣＤＲと組み合わせて修飾できることを理解されたい。一実施形態では、修飾は、置換、特に保存的置換である。
上記のように、本発明の抗体は、陽性対照抗体（ＧＳＫ２８５７９１６）よりも優れたエンドサイトーシス効果を有する。エンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）は、細胞侵入またはトランスサイトーシスとしても知られており、原形質膜の変形を介して細胞外物質を細胞内に輸送するプロセスである。細胞に入る物質のサイズの違いと侵入のメカニズムに応じて、エンドサイトーシスを、食作用（Phagocytosis）、飲作用（ピノサイトーシス、Pinocy-tosis）、受容体を介したエンドサイトーシスの３つのタイプに分けることができる。本発明の抗体のエンドサイトーシスは、受容体媒介性エンドサイトーシスを指し、ＢＣＭＡを標的とするモノクローナル抗体をＢＣＭＡと組み合わせた後、ＢＣＭＡ－抗体複合体を媒介してエンドソームを形成してリソソームと融合した後、リソソームでは、ＢＣＭＡ－抗体複合体がリソソームによって分解され、ＢＣＭＡまたはＢＣＭＡ－抗体複合体の一部を細胞膜に戻すこともできる。本発明のモノクローナル抗体が小さな毒素分子にカップリングしてＡＤＣ薬物を形成した場合、それらはエンドサイトーシスを介して細胞に輸送され、放出された毒素分子は標的細胞（多発性骨髄腫細胞など）を殺すことができる。したがって、本発明のモノクローナル抗体がＡＤＣ薬物として開発される場合、より良好なエンドサイトーシス効果は、薬物を標的細胞に媒介することに寄与するために非常に重要である。
また、本発明の抗体はヒト化抗体であり、ヒトおよびサルのＢＣＭＡに対する本発明のヒト化前後の抗体の結合活性は基本的に同じであり、ＢＣＭＡとＢＡＦＦの結合をブロッキングするヒト化前後の抗体の効果は基本的に同じである。サルＢＣＭＡ－ＣＨＯ細胞に対する本発明のヒト化前後の抗体の結合効果は基本的に同じであり、いずれも陽性対照抗体（ＧＳＫ２８５７９１６）よりも優れており、しかもＨ９２９細胞に対するヒト化前後の抗体の結合効果が基本的に同じであり、どちらも陽性対照抗体（ＧＳＫ２８５７９１６）よりも優れている。さらに、ヒト骨髄腫細胞株Ｈ９２９細胞に対するヒト化前後の抗体のエンドサイトーシス効果は基本的に同じであり、どちらも陽性対照抗体（ＧＳＫ２８５７９１６）よりも優れている。
「ヒト化抗体」とは、非ヒトドナー免疫グロブリンに由来するＣＤＲを有し、この分子の残りの免疫グロブリン由来部分が１つ（または複数）のヒト免疫グロブリンタンパク質に由来する、操作された抗体の一類を指す。また、フレームワーク支持残基は、結合親和性を保持するように変更することができる（例えば、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８６：１００２９－１００３２（１９８９），Ｈｏｄｇｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：４２１（１９９１）を参照）。適切なヒト受容体抗体は、データベース、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓデータベース、およびＳｗｉｓｓタンパク質データベースなどの従来のデータベースから、ドナー抗体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列との相同性によって選択される抗体であり得る。ドナー抗体のフレームワーク領域に対する相同性（アミノ酸に基づく）を特徴とするヒト抗体は、ドナーＣＤＲの挿入のための重鎖定常領域および／または重鎖可変フレームワーク領域を提供するのに適している可能性がある。軽鎖の定常または可変フレームワーク領域を提供することができる適切な受容体抗体を同様の方法で選択することができる。ただし、受容体抗体の重鎖および軽鎖が同じ受容体抗体に由来する必要はない。
本発明のヒト化抗体の熱安定性は、陽性対照抗体（ＧＳＫ２８５７９１６）の熱安定性よりもわずかに優れており、抗体創薬の熱安定性条件を満たす。熱安定性が低いと、抗体発現の低下や抗体凝集などの抗体の創薬可能性の問題が発生する可能性がある。
また、本発明は、本発明に記載の抗体と同じエピトープを認識する、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を標的とするモノクローナル抗体に関する。本発明はまた、本発明に記載の上記抗体と競合してＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を標的とするモノクローナル抗体に関する。
具体的には、本発明はさらに、本発明に記載の抗体をコードする核酸に係る。本発明はさらに、本発明に記載の核酸を含む発現ベクターに係る。本発明はさらに、本発明に記載の発現ベクターを含み、またはそのゲノムに本発明に記載の核酸が組み込まれた、宿主細胞に係る。
当技術分野で知られているように、本明細書で交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドの鎖を指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらの類似体、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによって鎖に組み込まれることができる任意の基質であり得る。本明細書で使用される場合、「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、１つ以上の目的の遺伝子または配列を宿主細胞に送達することができ、好ましくは前記遺伝子または配列を宿主細胞で発現することができる構築物を指す。ベクターとして、ウイルスベクター、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性凝集剤に関連するＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソームにカプセル化されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクターおよび特定の真核生物細胞（例えば、プロデューサー細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明において、「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養物」という用語は交換可能に使用され、これらの細胞の子孫を含む、外因性核酸が導入された細胞を指す。宿主細胞は、継代数に関係なく、一次形質転換細胞およびそれに由来する子孫を含む「形質転換体」および「形質転換細胞」を含む。子孫は、核酸含有量の点で親細胞とは完全に同じではないかもしれないが、突然変異を含んでいる可能性がある。本明細書は、最初に形質転換された細胞でスクリーニングまたは選択された細胞と同じ機能または生物学的活性を有する変異子孫を含む。
本発明はまた、本発明に記載の宿主細胞を培養することによって本発明に記載のモノクローナル抗体を産生する、モノクローナル抗体を産生する方法に関する。
本発明はさらに、本発明に記載のモノクローナル抗体及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物に係る。本発明はさらに、本発明に記載のモノクローナル抗体または本発明に記載の医薬組成物を含む、キットまたは製品に係る。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される賦形剤」は、活性成分と組み合わされたときに、成分が生物学的に活性を維持し、対象の免疫系と反応しないことを可能にする任意の材料を含む。その例として、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルジョン（油／水エマルジョンなど）、およびさまざまなタイプの湿潤剤などの標準的な医薬担体を含むが、これらに限定されない。エアロゾルまたは非経口投与に好ましい希釈剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または生理食塩水（０．９％）である。公知の従来の方法により、このような担体を含む組成物を配合する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ Ｅｄ．ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２００５を参照）
本発明はさらに、ＢＣＭＡの発現に関連する疾患を治療するための方法であって、それを必要とする被験者に、本発明に記載のモノクローナル抗体または本発明に記載の医薬組成物または本発明に記載のキット若しくは製品を投与することを含む、方法に係る。具体的には、上記疾患は、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病、Ｔ細胞急性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、小細胞または大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性疾患、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンストレームマクログロブリン血症、骨髄腫、ＭＧＵＳ、形質細胞腫、全身性アミロイド軽鎖アミロイドーシス及びＰＯＥＭＳ症候群から選択される。具体的には、上記疾患は多発性骨髄腫である。
具体的には、形質細胞骨髄腫またはＫａｈｌｅｒ病（Ｏｔｔｏ Ｋａｈｌｅｒの後）としても知られる「多発性骨髄腫（ＭＭ）」という用語は、間質細胞と密接に接触する悪性プラズマＢ細胞が骨髄内に蓄積することを特徴とする難治性クローン性Ｂ細胞腫瘍である。ＭＭは進行性疾患であり、特に、例えば、前駆体プラズマＢ細胞への複数の遺伝的損傷によって、すなわち、主に転座、例えば、ｔ（１１；１４）、ｔ（４；１４）、ｔ（８；１４）によって引き起こされる染色体転座、またはｄｅｌ（１３）やｄｅｌ（１７）などの欠失が生じ、腫瘍細胞が大幅に増殖し、アポトーシスに耐性を持つようになる。Ｂリンパ球は骨髄から始まり、リンパ節に移動する。それらが発達するにつれて、Ｂリンパ球はその細胞表面に成熟して異なるタンパク質を示す。それらが活性化されて抗体を分泌するとき、それらを形質細胞と呼ぶ。それらが胚中心と呼ばれるリンパ節の一部から離れた後、多発性骨髄腫は、Ｂ細胞に発生する。免疫システムは、厳密な制御の下でＢ細胞の増殖と抗体の分泌を維持する。この制御は、染色体と塩基が損傷すると（通常は再配列によって）失われる。通常、プロモーター遺伝子は染色体に移動（または転座）し、そこで抗体遺伝子の過剰産生を刺激する。
上記のように、多発性骨髄腫患者においては、免疫グロブリン重鎖遺伝子（染色体１４、遺伝子座１４ｑ３２）とがん遺伝子（多くの場合１１ｑ１３、４ｐ１６．３、６ｐ２１、１６ｑ２３、および２０ｑ１１［１０］）の間の染色体転座が頻繁に観察される。この突然変異は、前記がん遺伝子の調節不全をもたらし、これは、骨髄腫の発症メカニズムにおける重要な開始イベントであると考えられている。その結果、形質細胞クローンの増殖とゲノム不安定性が生じ、さらなる突然変異と転座を引き起す。１４番目の染色体異常は、すべての骨髄腫症例の約５０％で観察された。１３番目の染色体（の一部）の欠失も約５０％の症例で観察された。
本明細書で使用される場合、「被験者」、「個体」または「対象」は、哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物には、家畜、競走動物、ペット、霊長類、馬、犬、猫、マウス、およびラットも含まれるが、これらに限定されない。本発明において、本発明に記載のモノクローナル抗体または本発明に記載の医薬組成物または本発明に記載のキット若しくは製品を、それを必要とする被験者に投与することは、有効量の医薬組成物または薬剤または製品などを投与することを指す。本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、例えば、研究者または臨床医によって追求されている組織、システム、動物またはヒトにおいて生物学的または薬理学的応答を誘発する薬物または薬剤の量を指す。さらに、「治療有効量」という用語は、該用量を受けていない対応する対象と比較した、疾患、障害または副作用の改善された治療、治癒、予防または緩和をもたらす量、あるいは疾患または状態の進行速度を低下させる量を意味する。この用語はまた、その範囲内に、正常な生理学的機能を増強するのに有効な量を含む。
本発明はさらに、ＢＣＭＡの発現に関連する疾患を治療するための薬剤の調製における、本発明に記載のモノクローナル抗体の使用に係る。具体的には、上記疾患は、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病、Ｔ細胞急性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、小細胞または大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性疾患、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンストレームマクログロブリン血症、骨髄腫、ＭＧＵＳ、形質細胞腫、全身性アミロイド軽鎖アミロイドーシス及びＰＯＥＭＳ症候群から選択される。具体的には、上記疾患は多発性骨髄腫である。本明細書で使用される場合、「がん」、「新生物」、および「腫瘍」という用語は、互換可能に使用され、単数形または複数形で使用され、悪性形質転換を受けた、または異常もしくは制御されない増殖または過剰増殖細胞の変化につながる細胞を指す。そのような変化または悪性形質転換は、通常、そのような細胞を宿主生体に対して病原性にするので、病原性になる、または病原性になる可能性があり、介入を必要とする、または介入から利益を得ることができる前がん性または前がん性細胞を含むことも意図されている。原発性がん細胞（すなわち、悪性形質転換部位の近くから得られた細胞）は、確立された技術、特に組織学的検査によって非がん細胞から区別することができる。本発明で使用されるように、がん細胞の定義は、原発性がん細胞だけでなく、がん細胞の祖先（ａｎｃｅｓｔｏｒ）に由来する任意の細胞も含む。これは、転移性がん細胞、ならびにインビトロ培養物およびがん細胞に由来する細胞株を含む。典型的には固形腫瘍として現れるがんの種類に言及する場合、「臨床的に検出可能な」腫瘍は、腫瘍塊に基づいて検出可能なものであり、例えば、ＣＡＴスキャン、ＭＲイメージング、Ｘ線、超音波、または触診操作によって、および／または患者から入手可能なサンプル中の１つ以上のがん特異的抗原の発現のために検出可能な腫瘍が挙げられる。言い換えれば、本発明の用語は、臨床医が前がん、腫瘍、インサイチュでの増殖、および進行した転移性増殖と呼ぶものを含む、細胞、新生物、がん、および任意の段階の腫瘍を含む。腫瘍は、血球腫瘍、すなわち液体腫瘍などの造血腫瘍であり得る。そのような腫瘍に基づく臨床状態の具体例として、慢性骨髄性白血病または急性骨髄性白血病などの白血病、多発性骨髄腫などの骨髄腫、リンパ腫などが挙げられる。
上記のように、Ｂｅｌａｎｔａｍａｂ ｍａｆｏｄｏｔｉｎ抗体（ＧＳＫ２８５７９１６と略称）と比較して、本発明の抗体は、ヒトＢＣＭＡおよびサルＢＣＭＡの両方に結合することができ、親和性の点でＢｅｌａｎｔａｍａｂ ｍａｆｏｄｏｔｉｎ抗体に近いか、またはそれよりも優れている。本発明の抗体は、ＢＣＭＡがＢＣＭＡのリガンドＢＡＦＦまたはＡＰＲＩＬに結合するのをブロッキングする効果では、ＧＳＫ２８５７９１６に近いか、またはそれよりも優れている。ＢＣＭＡのＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬへの結合をブロッキングすると、リガンド結合によって引き起こされる細胞内シグナル伝達経路（ＮＦκＢシグナル伝達経路など）の活性化を阻害し、それによって形質細胞の生存を阻害することができる。本発明の抗体はエンドサイトーシス効果では、ＧＳＫ２８５７９１６よりも優れたエンドサイトーシス効果を有する。エンドサイトーシス効果は、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を介した細胞殺傷の重要な機能であり、より優れたエンドサイトーシス効果を有する抗体に対応するＡＤＣ薬物は殺傷効果においてよリ多くの利点がある。熱安定性では、本発明の抗体は、ＧＳＫ２８５７９１６よりも優れた熱安定性を有する。熱安定性は抗体の創薬可能性の重要な指標であり、熱安定性が優れている抗体は、抗体の発現においてより多くの利点があり得、凝集体を生成する可能性が低下する。免疫原性では、本発明の抗体は、より低い免疫原性を有するヒト化抗体である。免疫原性は人体の免疫応答を刺激し、抗抗体が産生されて抗体薬の効果が低下する一方、強い免疫原性は薬の副作用のリスクを高める可能性がある。ヒト化抗体の場合、抗体のＣＤＲ領域以外の配列を変異させて、ヒト抗体配列に近づけ、それによって抗体の強い免疫原性のリスクを低減する。
実施例１
原材料の調製
本実施例では、ＢＣＭＡ抗原とそのリガンドをＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。同時に、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ（ＧＳＫ）の陽性抗体ＧＳＫ２８５７９１６を米国特許出願（ＵＳ２０１４０１０５９１５Ａ）に従って調製した。なお、調製された上記陽性抗体は毒素分子にカップリングしていないが、他の可能な機能には影響はない。
原材料の調製
本実施例では、ＢＣＭＡ抗原とそのリガンドをＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。同時に、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ（ＧＳＫ）の陽性抗体ＧＳＫ２８５７９１６を米国特許出願（ＵＳ２０１４０１０５９１５Ａ）に従って調製した。なお、調製された上記陽性抗体は毒素分子にカップリングしていないが、他の可能な機能には影響はない。
１．１ 抗原の用意
本願では、ｈｕｍａｎ－ＢＣＭＡ－Ｆｃ、ｈｕｍａｎ－ＢＣＭＡ－Ｈｉｓ、ｃｙｎｏ－ＢＣＭＡ－Ｆｃ、及びｃｙｎｏ－ＢＣＭＡ－Ｈｉｓの４つの抗原が使用され、いずれもＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入したものであり、カタログ番号はそれぞれＢＣ７－Ｈ５２５４、ＢＣＡ－Ｈ５２２ｙ、ＢＣＡ－Ｃ５２５３、ＢＣＡ－Ｃ５２Ｈ７である。さらに、その活性はＧＳＫ２８５７９１６と相互検証されており、米国特許出願ＵＳ２０１４０１０５９１５Ａに開示されているものと一致しており、結果を図２Ａに示す。
本願では、ｈｕｍａｎ－ＢＣＭＡ－Ｆｃ、ｈｕｍａｎ－ＢＣＭＡ－Ｈｉｓ、ｃｙｎｏ－ＢＣＭＡ－Ｆｃ、及びｃｙｎｏ－ＢＣＭＡ－Ｈｉｓの４つの抗原が使用され、いずれもＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入したものであり、カタログ番号はそれぞれＢＣ７－Ｈ５２５４、ＢＣＡ－Ｈ５２２ｙ、ＢＣＡ－Ｃ５２５３、ＢＣＡ－Ｃ５２Ｈ７である。さらに、その活性はＧＳＫ２８５７９１６と相互検証されており、米国特許出願ＵＳ２０１４０１０５９１５Ａに開示されているものと一致しており、結果を図２Ａに示す。
１．２ リガンドの用意
本願で使用されるリガンドは、ｈｕｍａｎ－ＢＡＦＦ－Ｆｃとｈｕｍａｎ－ＡＰＲＩＬ－Ｆｃの２種類が使用され、どちらも、ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入され、カタログ番号はそれぞれＢＡＦ－Ｈ４２６８、ＡＰＬ－Ｈ５２６７である。さらに、その活性は、ｈｕｍａｎ－ＢＣＭＡとの受容体リガンド結合について検証されており、米国特許出願ＵＳ２０１４０１０５９１５Ａに開示されているものと一致しており、結果を図２Ｂおよび２Ｃに示す。
本願で使用されるリガンドは、ｈｕｍａｎ－ＢＡＦＦ－Ｆｃとｈｕｍａｎ－ＡＰＲＩＬ－Ｆｃの２種類が使用され、どちらも、ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入され、カタログ番号はそれぞれＢＡＦ－Ｈ４２６８、ＡＰＬ－Ｈ５２６７である。さらに、その活性は、ｈｕｍａｎ－ＢＣＭＡとの受容体リガンド結合について検証されており、米国特許出願ＵＳ２０１４０１０５９１５Ａに開示されているものと一致しており、結果を図２Ｂおよび２Ｃに示す。
１．３ 陽性対照抗体の調製
本願では、陽性対照抗体ＧＳＫ２８５７９１６は、一過性トランスフェクションシステム（ＥｘｐｉＣＨＯ）を使用して発現させ、使用した主な材料は、Ｇｉｂｃｏ培地（カタログ番号Ａ２９１００－０１）、Ｇｉｂｃｏトランスフェクションキット（カタログ番号Ａ２９１２９）を含む。まず、ＧＳＫ２８５７９１６の軽鎖配列（配列番号１７の配列に示される）および重鎖配列（配列番号１８の配列に示される）を、米国特許出願ＵＳ２０１４０１０５９１５Ａに開示されている配列に従って合成し、完全なＧＳＫ２８５７９１６抗体軽鎖および重鎖遺伝子を含むプラスミドを分子クローニングによって構築した。ＧＳＫ２８５７９１６抗体の軽鎖を含むプラスミドと重鎖を含むプラスミドを２：１の質量比で混合し、２５ｍＬの発現系で、上記のプラスミド混合物（２５μｇ）を標準的な手順に従ってトランスフェクション試薬を混合して２５ｍＬのＥｘｐｉＣＨＯ細胞発現システムに滴下した。完全に混合した後、３７℃の細胞インキュベーター内で１８～２２時間発現させた。続いて、上記のトランスフェクション混合物に補充培地を添加し、３２℃の細胞インキュベーターに入れて培養を続けた。トランスフェクション後５日目に、２回目の補充フィードを追加し、細胞を３２℃の細胞インキュベーターにさらに１０～１２日間培養した。そして、発現した細胞懸濁液を高速遠心分離し、上澄みを取り、得られた上澄みを０．２２μｍフィルターメンブレンでろ過し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇアフィニティークロマトグラフィーカラムアフィニティー法で精製した。精製後、目的タンパク質を１００ｍＭグリシネート（ｐＨ３．０）で溶出し、濃縮、置換、分注し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ同定及び活性同定に合格した後、凍結保存のために倉庫に保存した。
本願では、陽性対照抗体ＧＳＫ２８５７９１６は、一過性トランスフェクションシステム（ＥｘｐｉＣＨＯ）を使用して発現させ、使用した主な材料は、Ｇｉｂｃｏ培地（カタログ番号Ａ２９１００－０１）、Ｇｉｂｃｏトランスフェクションキット（カタログ番号Ａ２９１２９）を含む。まず、ＧＳＫ２８５７９１６の軽鎖配列（配列番号１７の配列に示される）および重鎖配列（配列番号１８の配列に示される）を、米国特許出願ＵＳ２０１４０１０５９１５Ａに開示されている配列に従って合成し、完全なＧＳＫ２８５７９１６抗体軽鎖および重鎖遺伝子を含むプラスミドを分子クローニングによって構築した。ＧＳＫ２８５７９１６抗体の軽鎖を含むプラスミドと重鎖を含むプラスミドを２：１の質量比で混合し、２５ｍＬの発現系で、上記のプラスミド混合物（２５μｇ）を標準的な手順に従ってトランスフェクション試薬を混合して２５ｍＬのＥｘｐｉＣＨＯ細胞発現システムに滴下した。完全に混合した後、３７℃の細胞インキュベーター内で１８～２２時間発現させた。続いて、上記のトランスフェクション混合物に補充培地を添加し、３２℃の細胞インキュベーターに入れて培養を続けた。トランスフェクション後５日目に、２回目の補充フィードを追加し、細胞を３２℃の細胞インキュベーターにさらに１０～１２日間培養した。そして、発現した細胞懸濁液を高速遠心分離し、上澄みを取り、得られた上澄みを０．２２μｍフィルターメンブレンでろ過し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇアフィニティークロマトグラフィーカラムアフィニティー法で精製した。精製後、目的タンパク質を１００ｍＭグリシネート（ｐＨ３．０）で溶出し、濃縮、置換、分注し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ同定及び活性同定に合格した後、凍結保存のために倉庫に保存した。
実施例２
細胞株の調製
本実施例では、ＢＣＭＡを発現するヒト骨髄腫細胞株Ｈ９２９を購入し、ヒトＢＣＭＡを過剰発現する細胞株ＢＣＭＡ－ＨＥＫ２９３細胞およびサルＢＣＭＡを過剰発現する細胞株ＢＣＭＡ－ＣＨＯ細胞を構築した。
細胞株の調製
本実施例では、ＢＣＭＡを発現するヒト骨髄腫細胞株Ｈ９２９を購入し、ヒトＢＣＭＡを過剰発現する細胞株ＢＣＭＡ－ＨＥＫ２９３細胞およびサルＢＣＭＡを過剰発現する細胞株ＢＣＭＡ－ＣＨＯ細胞を構築した。
２．１ Ｈ９２９細胞株の用意
本願では、Ｈ９２９は北京協和セルバンクから購入され、カタログ番号は３１１１Ｃ０００１ＣＣＣ０００３６０であり、これは、ヒトＢＣＭＡを自然に高度に発現する骨髄腫細胞株である。
本願では、Ｈ９２９は北京協和セルバンクから購入され、カタログ番号は３１１１Ｃ０００１ＣＣＣ０００３６０であり、これは、ヒトＢＣＭＡを自然に高度に発現する骨髄腫細胞株である。
２．２ ＢＣＭＡ－ＣＨＯ細胞株の調製
２．２．１ 全長サルＢＣＭＡを発現するプラスミドの構築
カニクイザルのＢＣＭＡタンパク質を含むＤＮＡフラグメントを、遺伝子合成技術によって合成し、発現ベクターにクローニングした。形質転換法により大腸菌に導入し、大腸菌の単一クローンを採取して配列決定し、正しいプラスミドクローンを得た後、プラスミドを抽出し、再度配列決定して確認した。
２．２．１ 全長サルＢＣＭＡを発現するプラスミドの構築
カニクイザルのＢＣＭＡタンパク質を含むＤＮＡフラグメントを、遺伝子合成技術によって合成し、発現ベクターにクローニングした。形質転換法により大腸菌に導入し、大腸菌の単一クローンを採取して配列決定し、正しいプラスミドクローンを得た後、プラスミドを抽出し、再度配列決定して確認した。
２．２．２ エレクトロポレーション
ＣＨＯ－ｓ細胞は、ＧｉｂｃｏのＣＤ－ＣＨＯ無血清培地（カタログ番号１０７４３０２９）を使用して培養した。エレクトロポレーションの１日前に細胞を５×１０６／ｍＬで継代し、翌日、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのエレクトロポレーションキット（カタログ番号：ＭＰＫ１００９６）およびエレクトロポレーター（カタログ番号：ＭＰ９２２９４７）を使用して、構築されたプラスミドをＣＨＯ－ｓ細胞に導入した。エレクトロポレーション後の細胞をＣＤ－ＣＨＯ培地に移し、３７℃の細胞インキュベーターにおいて４８時間培養した。
ＣＨＯ－ｓ細胞は、ＧｉｂｃｏのＣＤ－ＣＨＯ無血清培地（カタログ番号１０７４３０２９）を使用して培養した。エレクトロポレーションの１日前に細胞を５×１０６／ｍＬで継代し、翌日、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのエレクトロポレーションキット（カタログ番号：ＭＰＫ１００９６）およびエレクトロポレーター（カタログ番号：ＭＰ９２２９４７）を使用して、構築されたプラスミドをＣＨＯ－ｓ細胞に導入した。エレクトロポレーション後の細胞をＣＤ－ＣＨＯ培地に移し、３７℃の細胞インキュベーターにおいて４８時間培養した。
２．２．３ エレクトロポレーション後の細胞プレーティング
エレクトロポレーションしたＣＨＯ－ｓ細胞を２０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートにプレーティングし、最終濃度３０μＭ ＭＳＸ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＧＳＳ－１０１５－Ｆ）およびＧＳサプリメント（Ｓｉｇｍａ、５８６７２Ｃ－１００ｍｌ）を添加し、３７℃の二酸化炭素インキュベーター内で培養し、１０日後に３０μＭ ＭＳＸおよび１×ＧＳサプリメントを含む培地を補充した。
エレクトロポレーションしたＣＨＯ－ｓ細胞を２０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートにプレーティングし、最終濃度３０μＭ ＭＳＸ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＧＳＳ－１０１５－Ｆ）およびＧＳサプリメント（Ｓｉｇｍａ、５８６７２Ｃ－１００ｍｌ）を添加し、３７℃の二酸化炭素インキュベーター内で培養し、１０日後に３０μＭ ＭＳＸおよび１×ＧＳサプリメントを含む培地を補充した。
２．２．４ クローン選択、細胞増殖およびＦＡＣＳ同定
９６ウェルプレートで増殖した単一細胞クローンを選び、２４ウェル培養プレートに移してさらに増殖させた後、サルＢＣＭＡが安定的にトランスフェクトされた細胞株をＦＡＣＳで同定した。
９６ウェルプレートで増殖した単一細胞クローンを選び、２４ウェル培養プレートに移してさらに増殖させた後、サルＢＣＭＡが安定的にトランスフェクトされた細胞株をＦＡＣＳで同定した。
２．３ ＢＣＭＡ－ＨＥＫ２９３細胞株の調製
２．３．１ 全長ヒトＢＣＭＡを発現するプラスミドの構築
ヒトＢＣＭＡタンパク質を含むＤＮＡフラグメントを、遺伝子合成技術によって合成し、発現ベクターにクローニングした。形質転換法により大腸菌に導入し、大腸菌の単一クローンを採取して配列決定し、正しいプラスミドクローンを得た後、プラスミドを抽出し、再度配列決定して確認した。
２．３．１ 全長ヒトＢＣＭＡを発現するプラスミドの構築
ヒトＢＣＭＡタンパク質を含むＤＮＡフラグメントを、遺伝子合成技術によって合成し、発現ベクターにクローニングした。形質転換法により大腸菌に導入し、大腸菌の単一クローンを採取して配列決定し、正しいプラスミドクローンを得た後、プラスミドを抽出し、再度配列決定して確認した。
２．３．２ エレクトロポレーション
ＨＥＫ２９３細胞は、ＧｉｂｃｏのＤＭＥＭ無血清培地（カタログ番号１２６３４０１０）を使用して培養した。エレクトロポレーションの１日前に細胞を２×１０５／ｍＬで継代し、翌日、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのエレクトロポレーションキット（カタログ番号：ＭＰＫ１００９６）およびエレクトロポレーター（カタログ番号：ＭＰ９２２９４７）を使用して、構築されたプラスミドをＨＥＫ２９３細胞に導入した。エレクトロポレーション後の細胞をＤＭＥＭ培地に移し、３７℃の細胞インキュベーターにおいて４８時間培養した。
ＨＥＫ２９３細胞は、ＧｉｂｃｏのＤＭＥＭ無血清培地（カタログ番号１２６３４０１０）を使用して培養した。エレクトロポレーションの１日前に細胞を２×１０５／ｍＬで継代し、翌日、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのエレクトロポレーションキット（カタログ番号：ＭＰＫ１００９６）およびエレクトロポレーター（カタログ番号：ＭＰ９２２９４７）を使用して、構築されたプラスミドをＨＥＫ２９３細胞に導入した。エレクトロポレーション後の細胞をＤＭＥＭ培地に移し、３７℃の細胞インキュベーターにおいて４８時間培養した。
２．３．３ エレクトロポレーション後の細胞プレーティング
エレクトロポレーションしたＨＥＫ２９３細胞を１０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートにプレーティングし、最終濃度２μｇ／ｍｌのｐｕｒｏｍｙｃｉｎを添加し、３７℃の二酸化炭素インキュベーター内で培養し、１４日後に２μｇ／ｍｌのｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含む培地を補充した。
エレクトロポレーションしたＨＥＫ２９３細胞を１０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートにプレーティングし、最終濃度２μｇ／ｍｌのｐｕｒｏｍｙｃｉｎを添加し、３７℃の二酸化炭素インキュベーター内で培養し、１４日後に２μｇ／ｍｌのｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含む培地を補充した。
２．３．４ クローン選択、細胞増殖およびＦＡＣＳ同定
９６ウェルプレートで増殖した単一細胞クローンを選び、２４ウェル培養プレートに移してさらに増殖させた後、ヒトＢＣＭＡ安定的にトランスフェクトされた細胞株をＦＡＣＳで同定した。
９６ウェルプレートで増殖した単一細胞クローンを選び、２４ウェル培養プレートに移してさらに増殖させた後、ヒトＢＣＭＡ安定的にトランスフェクトされた細胞株をＦＡＣＳで同定した。
実施例３
動物の免疫
本実施例では、動物の免疫化にはいくつかの計画が含まれ、同時に実行される。免疫化プロセス中に、力価検出のためにマウス血清を採取し、免疫化の効果を評価し、最後にライブラリーを構築するマウスの順番を血清力価に従って決定した。
動物の免疫
本実施例では、動物の免疫化にはいくつかの計画が含まれ、同時に実行される。免疫化プロセス中に、力価検出のためにマウス血清を採取し、免疫化の効果を評価し、最後にライブラリーを構築するマウスの順番を血清力価に従って決定した。
３．１ 動物の免疫
３．１．１． 免疫計画１
Ｂａｂｌ／ｃマウス（上海霊暢バイオテクノロジー株式会社、雌、６～８週間、ｎ＝２）を皮下注射および腹腔内注射により免疫し、材料は上記のヒトＢＣＭＡ－ＦｃおよびサルＢＣＭＡ－Ｆｃ抗原タンパク質（ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含み、交差免疫を使用した。最初の免疫化用量は１００μｇ／匹で、ＣＦＡ（フロイント完全アジュバント）を添加し、次に免疫化用量を５０μｇ／匹に減らし、ＩＦＡ（フロイント不完全アジュバント）を添加し、両方とも２週間ごとに交差免疫を１回した。対応するマウスには、Ｍｏｕｓｅ １およびＭｏｕｓｅ ２の番号が付けられた。
３．１．１． 免疫計画１
Ｂａｂｌ／ｃマウス（上海霊暢バイオテクノロジー株式会社、雌、６～８週間、ｎ＝２）を皮下注射および腹腔内注射により免疫し、材料は上記のヒトＢＣＭＡ－ＦｃおよびサルＢＣＭＡ－Ｆｃ抗原タンパク質（ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含み、交差免疫を使用した。最初の免疫化用量は１００μｇ／匹で、ＣＦＡ（フロイント完全アジュバント）を添加し、次に免疫化用量を５０μｇ／匹に減らし、ＩＦＡ（フロイント不完全アジュバント）を添加し、両方とも２週間ごとに交差免疫を１回した。対応するマウスには、Ｍｏｕｓｅ １およびＭｏｕｓｅ ２の番号が付けられた。
３．１．２ 免疫計画２
Ｂａｂｌ／ｃマウス（マウスは計画１と同じバッチ、ｎ＝２）を皮下注射および腹腔内注射によって免疫し、材料は上記のヒトＢＣＭＡ－Ｆｃ、サルＢＣＭＡ－Ｆｃ抗原タンパク質（ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ヒトＢＣＭＡを高度に発現するＨＥＫ２９３細胞、およびサルＢＣＭＡを高度に発現するＣＨＯ細胞を含み、交差免疫を使用した。タンパク質免疫の用量は２０μｇ／匹であり、細胞免疫の用量は１×１０７／匹であり、腹腔内注射し、１週間ごとに交差免疫を１回した。対応するマウスには、Ｍｏｕｓｅ ３とＭｏｕｓｅ ４の番号が付けられた。
Ｂａｂｌ／ｃマウス（マウスは計画１と同じバッチ、ｎ＝２）を皮下注射および腹腔内注射によって免疫し、材料は上記のヒトＢＣＭＡ－Ｆｃ、サルＢＣＭＡ－Ｆｃ抗原タンパク質（ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ヒトＢＣＭＡを高度に発現するＨＥＫ２９３細胞、およびサルＢＣＭＡを高度に発現するＣＨＯ細胞を含み、交差免疫を使用した。タンパク質免疫の用量は２０μｇ／匹であり、細胞免疫の用量は１×１０７／匹であり、腹腔内注射し、１週間ごとに交差免疫を１回した。対応するマウスには、Ｍｏｕｓｅ ３とＭｏｕｓｅ ４の番号が付けられた。
３．２ 血清力価のＥＬＩＳＡによる検出
３．２．１ 抗原のコーティングとブロッキング
ＥＬＩＳＡプレート上で、ヒトＢＣＭＡおよびサルＢＣＭＡを１日前にそれぞれコーティングし、コーティング濃度は２μｇ／ｍＬ、３０μＬ／ウェルであり、４℃で一晩した。免疫力価測定の日に、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、５％脱脂乳で室温、２時間ブロックし、次にプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。
３．２．１ 抗原のコーティングとブロッキング
ＥＬＩＳＡプレート上で、ヒトＢＣＭＡおよびサルＢＣＭＡを１日前にそれぞれコーティングし、コーティング濃度は２μｇ／ｍＬ、３０μＬ／ウェルであり、４℃で一晩した。免疫力価測定の日に、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、５％脱脂乳で室温、２時間ブロックし、次にプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。
３．２．２ 一次抗体および二次抗体
各血清サンプルを最初にストック（原液）に基づいて５００倍に希釈し、次に３倍の勾配で希釈し、一次抗体としてＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温、１時間インキュベートし、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後、二次抗体（Ｇｏａｔ－ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ－ＩｇＧ－Ｆａｂ－ＨＲＰ、Ｓｉｇｍａ、Ｍ４１１５）を添加し、室温、１時間インキュベートした。
各血清サンプルを最初にストック（原液）に基づいて５００倍に希釈し、次に３倍の勾配で希釈し、一次抗体としてＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温、１時間インキュベートし、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後、二次抗体（Ｇｏａｔ－ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ－ＩｇＧ－Ｆａｂ－ＨＲＰ、Ｓｉｇｍａ、Ｍ４１１５）を添加し、室温、１時間インキュベートした。
３．２．３ 発色、終止、プレートの読み取り
インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで６回洗浄し、ＴＭＢ（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ、ＴＭＢＳ－１０００－０１）を加えて発色させた。発色結果に応じて、２Ｍ ＨＣｌを加えて反応を終止させた。プレートは、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＳｐｅｃｔｒｅＭａｘ１９０）によってＯＤ４５０で読み取った。血清力価の結果は、免疫化されたマウスがヒトＢＣＭＡおよびサルＢＣＭＡに対して高い力価を示し、次の抗体ライブラリー構築のステップに使用できることを示している。結果を以下の表１－１および１－２に示す。
インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで６回洗浄し、ＴＭＢ（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ、ＴＭＢＳ－１０００－０１）を加えて発色させた。発色結果に応じて、２Ｍ ＨＣｌを加えて反応を終止させた。プレートは、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＳｐｅｃｔｒｅＭａｘ１９０）によってＯＤ４５０で読み取った。血清力価の結果は、免疫化されたマウスがヒトＢＣＭＡおよびサルＢＣＭＡに対して高い力価を示し、次の抗体ライブラリー構築のステップに使用できることを示している。結果を以下の表１－１および１－２に示す。
実施例４
本実施例では、実施例３で最高の力価を有するマウスを好ましく選択し、マウス脾臓中のＢ細胞の抗体遺伝子を、ファージディスプレイ技術を使用してファージディスプレイベクターにクローン化し、抗体ライブラリーを構築した。スクリーニング抗原としてヒトＢＣＭＡおよびサルＢＣＭＡを使用し、ライブラリー大規模選択、モノクローナル一次スクリーニングおよび配列決定などのプロセスを通じて、ヒトおよびサルＢＣＭＡ抗原に結合活性を有する１７の抗体分子を最終的に得た。
本実施例では、実施例３で最高の力価を有するマウスを好ましく選択し、マウス脾臓中のＢ細胞の抗体遺伝子を、ファージディスプレイ技術を使用してファージディスプレイベクターにクローン化し、抗体ライブラリーを構築した。スクリーニング抗原としてヒトＢＣＭＡおよびサルＢＣＭＡを使用し、ライブラリー大規模選択、モノクローナル一次スクリーニングおよび配列決定などのプロセスを通じて、ヒトおよびサルＢＣＭＡ抗原に結合活性を有する１７の抗体分子を最終的に得た。
４．１ ファージディスプレイ抗体遺伝子ライブラリーの構築
免疫化後、安楽死のための標準的な手順に従ってマウスを処理した。マウスの脾臓を採取し、粉砕し、濾過して脾臓細胞を収集し、１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１５５９６０２６）を加えて脾臓細胞を溶解し、フェノール・クロロホルム法によって全ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡを逆転写キット（ＴａＫａＲａ、６２１０Ａ）によってｃＤＮＡに逆転写した。次に、ｃＤＮＡをＰＣＲテンプレートとして使用し、マウス抗体配列の増幅に特定のプライマーを使用して、抗体の軽鎖遺伝子と重鎖遺伝子をそれぞれ増幅した。最後に、ＮｃｏＩ＋ＮｏｔＩ二重消化とＴ４リガーゼを介して、抗体遺伝子フラグメントをファージディスプレイベクターに挿入し、ライゲーション産物をＤＮＡ回収キット（Ｏｍｅｇａ、Ｄ６４９２－０２）で回収し、最後にエレクトロポレーター（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ）によってコンピテントな大腸菌ＳＳ３２０（Ｌｕｃｉｇｅｎ、ＭＣ１０６１Ｆ）に形質転換し、アンピシリンとテトラサイクリンを含む２－ＹＴ（Ｃ＋／Ｋ＋２－ＹＴ）固体プレートに広げて、正しく形質転換された抗体プラスミドのＳＳ３２０株を増幅し、最後にＦａｂフラグメント抗体配列を含むライブラリーを構築した。
免疫化後、安楽死のための標準的な手順に従ってマウスを処理した。マウスの脾臓を採取し、粉砕し、濾過して脾臓細胞を収集し、１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１５５９６０２６）を加えて脾臓細胞を溶解し、フェノール・クロロホルム法によって全ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡを逆転写キット（ＴａＫａＲａ、６２１０Ａ）によってｃＤＮＡに逆転写した。次に、ｃＤＮＡをＰＣＲテンプレートとして使用し、マウス抗体配列の増幅に特定のプライマーを使用して、抗体の軽鎖遺伝子と重鎖遺伝子をそれぞれ増幅した。最後に、ＮｃｏＩ＋ＮｏｔＩ二重消化とＴ４リガーゼを介して、抗体遺伝子フラグメントをファージディスプレイベクターに挿入し、ライゲーション産物をＤＮＡ回収キット（Ｏｍｅｇａ、Ｄ６４９２－０２）で回収し、最後にエレクトロポレーター（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ）によってコンピテントな大腸菌ＳＳ３２０（Ｌｕｃｉｇｅｎ、ＭＣ１０６１Ｆ）に形質転換し、アンピシリンとテトラサイクリンを含む２－ＹＴ（Ｃ＋／Ｋ＋２－ＹＴ）固体プレートに広げて、正しく形質転換された抗体プラスミドのＳＳ３２０株を増幅し、最後にＦａｂフラグメント抗体配列を含むライブラリーを構築した。
４．２ ファージディスプレイ抗体遺伝子ライブラリースクリーニング
４．２．１ 磁気ビーズ法によるファージディスプレイ抗体遺伝子ライブラリーのスクリーニング
磁気ビーズスクリーニングは、Ｂｉｏｔｉｎ標識抗原タンパク質とＡｖｉｄｉｎ結合磁気ビーズの結合に基づいて、抗原結合磁気ビーズとライブラリーのインキュベーション、洗浄、溶出のプロセスを通じて、２～４ラウンドの大規模選択後、最後に抗原に対する特異的モノクローナル抗体を濃縮するプロセスである。本実施例では、Ｂｉｏｔｉｎで標識されたヒトＢＣＭＡ抗原とサルＢＣＭＡ抗原の交差選択の原理を使用し、１回目と３回目はヒトＢＣＭＡ選択を使用し、２回目はサルＢＣＭＡ選択を使用し、合計３回の大規模選択をした。次に、濃縮された抗体配列の混合物を、ヒトおよびサルのＢＣＭＡの一次モノクローナルスクリーニングに供した。
４．２．１ 磁気ビーズ法によるファージディスプレイ抗体遺伝子ライブラリーのスクリーニング
磁気ビーズスクリーニングは、Ｂｉｏｔｉｎ標識抗原タンパク質とＡｖｉｄｉｎ結合磁気ビーズの結合に基づいて、抗原結合磁気ビーズとライブラリーのインキュベーション、洗浄、溶出のプロセスを通じて、２～４ラウンドの大規模選択後、最後に抗原に対する特異的モノクローナル抗体を濃縮するプロセスである。本実施例では、Ｂｉｏｔｉｎで標識されたヒトＢＣＭＡ抗原とサルＢＣＭＡ抗原の交差選択の原理を使用し、１回目と３回目はヒトＢＣＭＡ選択を使用し、２回目はサルＢＣＭＡ選択を使用し、合計３回の大規模選択をした。次に、濃縮された抗体配列の混合物を、ヒトおよびサルのＢＣＭＡの一次モノクローナルスクリーニングに供した。
具体的な実施方法は以下のとおりである。
まず、Ａｖｉｄｉｎ結合磁気ビーズをＢｉｏｔｉｎ標識ヒトＢＣＭＡタンパク質とインキュベートして、ヒトＢＣＭＡタンパク質を磁気ビーズに結合させた。ＢＣＭＡ抗原と結合した磁気ビーズおよび構築されたファージライブラリーを室温、２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで６～８回洗浄した後、非特異的に吸着したファージを除去し、Ｔｒｙｐｓｉｎ（Ｇｉｂｃｏ、２５２０００７２）を加えて軽く混合し、２０分間反応させて、特異的に結合した抗体ディスプレイファージを溶出した。続いて、対数期ＳＳ３２０菌体（Ｌｕｃｉｇｅｎ、ＭＣ１０６１ Ｆ）を、溶出したファージに感染させ、３０分間静置した後、２２０ｒｐｍで１時間インキュベートした後、ＶＳＣＭ１３ヘルパーファージを添加して３０分間静置した。続いて、２２０ｒｐｍで１時間培養し、遠心分離してＣ＋／Ｋ＋２－ＹＴ培地に置換し、最終的に得られたファージを次の大規模選択に使用した。
まず、Ａｖｉｄｉｎ結合磁気ビーズをＢｉｏｔｉｎ標識ヒトＢＣＭＡタンパク質とインキュベートして、ヒトＢＣＭＡタンパク質を磁気ビーズに結合させた。ＢＣＭＡ抗原と結合した磁気ビーズおよび構築されたファージライブラリーを室温、２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで６～８回洗浄した後、非特異的に吸着したファージを除去し、Ｔｒｙｐｓｉｎ（Ｇｉｂｃｏ、２５２０００７２）を加えて軽く混合し、２０分間反応させて、特異的に結合した抗体ディスプレイファージを溶出した。続いて、対数期ＳＳ３２０菌体（Ｌｕｃｉｇｅｎ、ＭＣ１０６１ Ｆ）を、溶出したファージに感染させ、３０分間静置した後、２２０ｒｐｍで１時間インキュベートした後、ＶＳＣＭ１３ヘルパーファージを添加して３０分間静置した。続いて、２２０ｒｐｍで１時間培養し、遠心分離してＣ＋／Ｋ＋２－ＹＴ培地に置換し、最終的に得られたファージを次の大規模選択に使用した。
４．４．２ 免疫試験管法によるファージディスプレイ抗体遺伝子ライブラリーのスクリーニング
免疫試験管スクリーニングの原理は、ＢＣＭＡタンパク質を高い吸着力を有する免疫試験管の表面にコーティングし、ファージディスプレイ抗体ライブラリーを免疫試験管に加え、免疫試験管の表面に吸着した抗原タンパク質とインキュベート、洗浄、溶出する大規模選択プロセスによって、２～４ラウンドの大規模選択後、最終的に抗原に対する特異的モノクローナル抗体を濃縮するプロセスである。免疫試験管法と磁気ビーズ法の目的は、抗原に対する特異的抗体を濃縮することであり、これらは２つの補完的な実験方法である。本実施例では、ヒトＢＣＭＡ抗原とサルＢＣＭＡ抗原の交差選択の原理を使用し、１ラウンド目と３ラウンド目はヒトＢＣＭＡによる選択を使用し、２ラウンド目はサルＢＣＭＡによる選択を使用し、合計３ラウンドの選択を行った。そして、濃縮された抗体配列の混合物を、ヒトおよびサルのＢＣＭＡの一次モノクローナルスクリーニングに使用した。具体的な実施方法は、スクリーニング用の磁気ビーズ法と同様である。
免疫試験管スクリーニングの原理は、ＢＣＭＡタンパク質を高い吸着力を有する免疫試験管の表面にコーティングし、ファージディスプレイ抗体ライブラリーを免疫試験管に加え、免疫試験管の表面に吸着した抗原タンパク質とインキュベート、洗浄、溶出する大規模選択プロセスによって、２～４ラウンドの大規模選択後、最終的に抗原に対する特異的モノクローナル抗体を濃縮するプロセスである。免疫試験管法と磁気ビーズ法の目的は、抗原に対する特異的抗体を濃縮することであり、これらは２つの補完的な実験方法である。本実施例では、ヒトＢＣＭＡ抗原とサルＢＣＭＡ抗原の交差選択の原理を使用し、１ラウンド目と３ラウンド目はヒトＢＣＭＡによる選択を使用し、２ラウンド目はサルＢＣＭＡによる選択を使用し、合計３ラウンドの選択を行った。そして、濃縮された抗体配列の混合物を、ヒトおよびサルのＢＣＭＡの一次モノクローナルスクリーニングに使用した。具体的な実施方法は、スクリーニング用の磁気ビーズ法と同様である。
４．５単一クローンの選択
３ラウンドのスクリーニングの後、第３ラウンドのプールからいくつかのモノクローナルクローンを選択して、ヒトＢＣＭＡおよびサルＢＣＭＡへの結合を含むＥＬＩＳＡ検出をした。最終的に、１３４４個のクローンからヒトとサルＢＣＭＡの両方に結合できる合計９３個の陽性クローンを選択した。配列決定分析と、ヒトおよびサルのＢＣＭＡによるアフィニティーシーケンス結果の分析の後、最後に、次の実験のために全長を構築するために、１７個のクローンの配列を選択した。
３ラウンドのスクリーニングの後、第３ラウンドのプールからいくつかのモノクローナルクローンを選択して、ヒトＢＣＭＡおよびサルＢＣＭＡへの結合を含むＥＬＩＳＡ検出をした。最終的に、１３４４個のクローンからヒトとサルＢＣＭＡの両方に結合できる合計９３個の陽性クローンを選択した。配列決定分析と、ヒトおよびサルのＢＣＭＡによるアフィニティーシーケンス結果の分析の後、最後に、次の実験のために全長を構築するために、１７個のクローンの配列を選択した。
実施例５
全長抗体の構築、発現および精製
この実施例では、実施例４で得られた１７のヒト－サル交差Ｆａｂ抗体をヒトＩｇＧ１タイプに構築し、ここで、軽鎖はいずれもＫａｐｐａであり、抗体タイプはヒト－マウスキメラ抗体である。
全長抗体の構築、発現および精製
この実施例では、実施例４で得られた１７のヒト－サル交差Ｆａｂ抗体をヒトＩｇＧ１タイプに構築し、ここで、軽鎖はいずれもＫａｐｐａであり、抗体タイプはヒト－マウスキメラ抗体である。
５．１ プラスミドの構築
スクリーニングで得られた配列の重鎖配列をヒトＩｇＧ１ Ｆｃセグメントと融合して構築し、軽鎖をヒトＫａｐｐａ定常領域と融合して構築した。重鎖と軽鎖のプラスミドをＥｘｐｉＣＨＯ細胞に形質転換し、発現を誘導して全長抗体を得た。
スクリーニングで得られた配列の重鎖配列をヒトＩｇＧ１ Ｆｃセグメントと融合して構築し、軽鎖をヒトＫａｐｐａ定常領域と融合して構築した。重鎖と軽鎖のプラスミドをＥｘｐｉＣＨＯ細胞に形質転換し、発現を誘導して全長抗体を得た。
５．２ 抗体の発現と精製
本願では、抗体はＥｘｐｉＣＨＯ一過性発現システムを採用し、培地は（Ｇｉｂｃｏ、Ａ２９１００－０１）、トランスフェクションキットは（Ｇｉｂｃｏ、Ａ２９１２９）である。具体的な方法は次のとおりである。トランスフェクションの１日前にＥｘｐｉＣＨＯ細胞を継代し、構築したプラスミド２５μｇとトランスフェクション試薬を２５ｍＬシステムで混合し、２５ｍＬ ＥｘｐｉＣＨＯ細胞に滴下し、十分に混合した後、３７℃細胞インキュベーターで１８～２２時間発現させた。続いて、上記のトランスフェクション混合物に補充培地を添加し、３２℃の細胞インキュベーターに入れて培養を続けた。トランスフェクション後５日目に、２回目の補充フィードを追加し、細胞を３２℃の細胞インキュベーターにさらに１０～１２日間培養した。そして、発現した細胞懸濁液を高速遠心分離し、上澄みを取り、得られた上澄みを０．２２μｍフィルターメンブレンでろ過し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇ アフィニティークロマトグラフィーカラムアフィニティー法で精製した。精製後、目的タンパク質を１００ｍＭグリシネート（ｐＨ３．０）で溶出し、濃縮、置換、分注し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ同定、ＳＥＣ純度測定、及び活性同定を経て、凍結保存のために倉庫に保存した。
本願では、抗体はＥｘｐｉＣＨＯ一過性発現システムを採用し、培地は（Ｇｉｂｃｏ、Ａ２９１００－０１）、トランスフェクションキットは（Ｇｉｂｃｏ、Ａ２９１２９）である。具体的な方法は次のとおりである。トランスフェクションの１日前にＥｘｐｉＣＨＯ細胞を継代し、構築したプラスミド２５μｇとトランスフェクション試薬を２５ｍＬシステムで混合し、２５ｍＬ ＥｘｐｉＣＨＯ細胞に滴下し、十分に混合した後、３７℃細胞インキュベーターで１８～２２時間発現させた。続いて、上記のトランスフェクション混合物に補充培地を添加し、３２℃の細胞インキュベーターに入れて培養を続けた。トランスフェクション後５日目に、２回目の補充フィードを追加し、細胞を３２℃の細胞インキュベーターにさらに１０～１２日間培養した。そして、発現した細胞懸濁液を高速遠心分離し、上澄みを取り、得られた上澄みを０．２２μｍフィルターメンブレンでろ過し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇ アフィニティークロマトグラフィーカラムアフィニティー法で精製した。精製後、目的タンパク質を１００ｍＭグリシネート（ｐＨ３．０）で溶出し、濃縮、置換、分注し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ同定、ＳＥＣ純度測定、及び活性同定を経て、凍結保存のために倉庫に保存した。
実施例６
候補抗体ＥＬＩＳＡレベルの親和性ブロッキング効果の検出
本実施例では、ＥＬＩＳＡの方法により、ヒトおよびサルＢＣＭＡに対する候補抗体の親和性効果を検証し、ＥＬＩＳＡの方法により、ＢＡＦＦまたはＡＰＲＩＬへのＢＣＭＡの結合のブロッキングに対する候補抗体の効果を検証した。
候補抗体ＥＬＩＳＡレベルの親和性ブロッキング効果の検出
本実施例では、ＥＬＩＳＡの方法により、ヒトおよびサルＢＣＭＡに対する候補抗体の親和性効果を検証し、ＥＬＩＳＡの方法により、ＢＡＦＦまたはＡＰＲＩＬへのＢＣＭＡの結合のブロッキングに対する候補抗体の効果を検証した。
６．１ ヒトおよびサルＢＣＭＡに対する候補抗体の親和性効果のＥＬＩＳＡによる検出
９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上で、ヒトＢＣＭＡとサルＢＣＭＡをそれぞれ２μｇ／ｍＬ、３０μＬ／ウェルでコーティングし、４度で一晩放置した。翌日、ウェルプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、５％脱脂乳で２時間ブロックした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後、段階希釈した候補抗体と陽性対照抗体（ＧＳＫ２８５７９１６）を添加し、１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳＴで３回洗浄した後、二次抗体（ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ－ＩｇＧ－Ｋａｐｐａ－ＨＲＰ、ａｂｃａｍ、ａｂ７９１１５）を添加し、１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで６回洗浄し、ＴＭＢ（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ、ＴＭＢＳ－１０００－０１）を加えて発色させた。発色結果によって、反応を終止するために２Ｍ ＨＣｌを添加し、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＳｐｅｃｔｒｅＭａｘ １９０）によってプレートをＯＤ４５０で読み取った。その結果を図４Ａと図４Ｂに示す。その結果は、候補抗体が、ヒトＢＣＭＡおよびサルＢＣＭＡに対するＧＳＫ２８５７９１６抗体に近いまたはそれ以上の親和性を有していることを示している。
９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上で、ヒトＢＣＭＡとサルＢＣＭＡをそれぞれ２μｇ／ｍＬ、３０μＬ／ウェルでコーティングし、４度で一晩放置した。翌日、ウェルプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、５％脱脂乳で２時間ブロックした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後、段階希釈した候補抗体と陽性対照抗体（ＧＳＫ２８５７９１６）を添加し、１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳＴで３回洗浄した後、二次抗体（ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ－ＩｇＧ－Ｋａｐｐａ－ＨＲＰ、ａｂｃａｍ、ａｂ７９１１５）を添加し、１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで６回洗浄し、ＴＭＢ（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ、ＴＭＢＳ－１０００－０１）を加えて発色させた。発色結果によって、反応を終止するために２Ｍ ＨＣｌを添加し、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＳｐｅｃｔｒｅＭａｘ １９０）によってプレートをＯＤ４５０で読み取った。その結果を図４Ａと図４Ｂに示す。その結果は、候補抗体が、ヒトＢＣＭＡおよびサルＢＣＭＡに対するＧＳＫ２８５７９１６抗体に近いまたはそれ以上の親和性を有していることを示している。
６．２ ＢＣＭＡとＢＡＦＦの結合をブロッキングするための候補抗体のＥＬＩＳＡによる検出
本実施例では、ブロッキングシステムは、事前開発のプロセスを含み、開発結果に従って、感度と安定性の両方を備えた実際のブロッキングシステムパラメータが決定された。
本実施例では、ブロッキングシステムは、事前開発のプロセスを含み、開発結果に従って、感度と安定性の両方を備えた実際のブロッキングシステムパラメータが決定された。
ＢＡＦＦブロッキングについて、ヒトＢＡＦＦタンパク質を１μｇ／ｍＬ、３０μＬ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩放置した。翌日、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、５％脱脂乳で２時間ブロックした。次に、候補抗体または陽性対照抗体（ＧＳＫ２８５７９１６）を段階希釈し、予めＢｉｏｔｉｎ標識ヒトＢＣＭＡ（０．６μｇ／ｍＬ）と０．５時間プレミックスし、ブロッキングが完了し、プレートの洗浄が終わった後、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに添加し、１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳＴで３回洗浄した後、二次抗体（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、３１００１）を添加し、１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで６回洗浄し、ＴＭＢ（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ、ＴＭＢＳ－１０００－０１）を添加して発色させた。発色結果に応じて、２Ｍ ＨＣｌを添加して反応を終止し、プレートをＯＤ４５０でマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＳｐｅｃｔｒｅＭａｘ １９０）によって読み取った。その結果を図５Ａに示す。その結果は、候補抗体が、ＧＳＫ２８５７９１６抗体に近いまたはさらに優れたヒトＢＣＭＡとＢＡＦＦ結合のブロッキング効果を有することを示している。
６．３ ＢＣＭＡとＡＰＲＩＬの結合をブロッキングするための候補抗体のＥＬＩＳＡによる検出
本実施例では、ブロッキングシステムは、事前開発のプロセスを含み、開発結果に従って、感度と安定性の両方を備えた実際のブロッキングシステムパラメータが決定された。
本実施例では、ブロッキングシステムは、事前開発のプロセスを含み、開発結果に従って、感度と安定性の両方を備えた実際のブロッキングシステムパラメータが決定された。
ＡＰＲＩＬブロッキングについて、ヒトＡＰＲＩＬタンパク質を２μｇ／ｍＬ、３０μＬ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩放置した。翌日、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、５％脱脂乳で１時間ブロックした。次に、候補抗体または陽性対照抗体（ＧＳＫ２８５７９１６）を段階希釈し、予めＢｉｏｔｉｎ標識ヒトＢＣＭＡ（０．６μｇ／ｍＬ）と０．５時間プレミックスし、ブロッキングが完了し、プレートの洗浄が終わった後、９６ウェルプレートに添加し、１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳＴで３回洗浄した後、二次抗体（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、３１００１）を添加し、１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで６回洗浄し、ＴＭＢ（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ、ＴＭＢＳ－１０００－０１）を添加して発色させた。発色結果に応じて、２Ｍ ＨＣｌを添加して反応を終止し、プレートをＯＤ４５０でマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＳｐｅｃｔｒｅＭａｘ １９０）によって読み取った。その結果を図５Ｂに示す。その結果は、候補抗体が、ＧＳＫ２８５７９１６抗体に近いまたはさらに優れたヒトＢＣＭＡとＡＰＲＩＬ結合のブロッキング効果を有することを示している。
実施例７
候補抗体のＦＡＣＳレベルのヒトおよびサルＢＣＭＡ発現細胞株との親和性効果の検出
本実施例では、ヒトおよびサルＢＣＭＡを発現する細胞に対する候補抗体の親和性効果をＦＡＣＳ法に基づいて検証した。
候補抗体のＦＡＣＳレベルのヒトおよびサルＢＣＭＡ発現細胞株との親和性効果の検出
本実施例では、ヒトおよびサルＢＣＭＡを発現する細胞に対する候補抗体の親和性効果をＦＡＣＳ法に基づいて検証した。
７．１ ヒトＢＣＭＡ－ＨＥＫ２９３細胞に対する候補抗体の親和性効果のＦＡＣＳによる検出
指数増殖期のヒトＢＣＭＡ－ＨＥＫ２９３細胞を収集し、３００ｇで遠心分離して上澄みを除去し、細胞を調製したＦＡＣＳバッファーに再懸濁してカウントし、細胞懸濁液の密度を２×１０６／ｍＬに調整した。続いて、ＢＣＭＡ－ＨＥＫ２９３細胞を９６ウェル丸底プレートにウェルあたり１００μＬで添加し、３００ｇで遠心分離して上澄みを除去した。候補抗体の段階希釈液と陽性対照抗体希釈液を対応するウェルに加え、マルチチャンネルピペットで細胞を均一にブローし、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベートした細胞混合液を３００ｇで遠心分離して上澄みを除去し、２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液を対応するウェルに加え、マルチチャンネルピペットを使用して細胞を再懸濁した。２回繰り返し、３００ｇで遠心分離して上澄みを除去した。ＰＥ標識されたａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ－ＩｇＧ－Ｆｃフローサイトメトリー用抗体（Ａｂｅａｍ、９８５９６）を添加し、細胞をマルチチャンネルピペットで均一にブローし、４℃で３０分間インキュベートし、３００ｇで遠心分離して上澄みを除去した。続いて、ＦＡＣＳ緩衝液を添加し、細胞を再懸濁した。２回繰り返した後、ＦＡＣＳ緩衝液をウェルに２００μＬ／ウェルで添加し、細胞を再懸濁した。最後に、フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ、ＣｙｔｏＦＬＥＸ ＡＯＯ－１－１１０２）によって検出された。本実施例では、結果を図３Ａに示す。その結果は、抗体ＳＹ１４－３ｒｄ－５－６－７のヒトＢＣＭＡ－ＨＥＫ２９３細胞に対する親和性が、陽性対照抗体（ＧＳＫ２８５７９１６）よりも優れていることを示している。
指数増殖期のヒトＢＣＭＡ－ＨＥＫ２９３細胞を収集し、３００ｇで遠心分離して上澄みを除去し、細胞を調製したＦＡＣＳバッファーに再懸濁してカウントし、細胞懸濁液の密度を２×１０６／ｍＬに調整した。続いて、ＢＣＭＡ－ＨＥＫ２９３細胞を９６ウェル丸底プレートにウェルあたり１００μＬで添加し、３００ｇで遠心分離して上澄みを除去した。候補抗体の段階希釈液と陽性対照抗体希釈液を対応するウェルに加え、マルチチャンネルピペットで細胞を均一にブローし、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベートした細胞混合液を３００ｇで遠心分離して上澄みを除去し、２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液を対応するウェルに加え、マルチチャンネルピペットを使用して細胞を再懸濁した。２回繰り返し、３００ｇで遠心分離して上澄みを除去した。ＰＥ標識されたａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ－ＩｇＧ－Ｆｃフローサイトメトリー用抗体（Ａｂｅａｍ、９８５９６）を添加し、細胞をマルチチャンネルピペットで均一にブローし、４℃で３０分間インキュベートし、３００ｇで遠心分離して上澄みを除去した。続いて、ＦＡＣＳ緩衝液を添加し、細胞を再懸濁した。２回繰り返した後、ＦＡＣＳ緩衝液をウェルに２００μＬ／ウェルで添加し、細胞を再懸濁した。最後に、フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ、ＣｙｔｏＦＬＥＸ ＡＯＯ－１－１１０２）によって検出された。本実施例では、結果を図３Ａに示す。その結果は、抗体ＳＹ１４－３ｒｄ－５－６－７のヒトＢＣＭＡ－ＨＥＫ２９３細胞に対する親和性が、陽性対照抗体（ＧＳＫ２８５７９１６）よりも優れていることを示している。
７．２ サルＢＣＭＡ－ＣＨＯ細胞に対する候補抗体の親和性のＦＡＣＳによる検出
本実施例では、操作プロセスは、細胞がサルＢＣＭＡ－ＣＨＯ細胞である以外、７．１とまったく同じである。その結果を図３Ｂに示す。その結果は、抗体ＳＹ１４－３ｒｄ－５－６－７のサルＢＣＭＡ－ＣＨＯ細胞に対する親和性が、陽性対照抗体（ＧＳＫ２８５７９１６）の親和性よりも優れていることを示している。また、ヒトとサルのシグナルの違いは、ＢＣＭＡ－ＨＥＫ２９３またはＢＣＭＡ－ＣＨＯでのＢＣＭＡの発現の違いが原因であると推測される。
本実施例では、操作プロセスは、細胞がサルＢＣＭＡ－ＣＨＯ細胞である以外、７．１とまったく同じである。その結果を図３Ｂに示す。その結果は、抗体ＳＹ１４－３ｒｄ－５－６－７のサルＢＣＭＡ－ＣＨＯ細胞に対する親和性が、陽性対照抗体（ＧＳＫ２８５７９１６）の親和性よりも優れていることを示している。また、ヒトとサルのシグナルの違いは、ＢＣＭＡ－ＨＥＫ２９３またはＢＣＭＡ－ＣＨＯでのＢＣＭＡの発現の違いが原因であると推測される。
実施例８
候補抗体のエンドサイトーシス効果の検出
本実施例では、ヒト骨髄腫細胞株Ｈ９２９細胞に対する抗体のエンドサイトーシス効果を検出する方法システムを開発し、それに応じて候補抗体のエンドサイトーシス効果をテストした。その基本原理は、細胞毒性によって抗体のエンドサイトーシス効果を検出することである。Ｆａｂ－ＺＡＰ（Ａｔｓｂｉｏ、ＩＴ－５１－１００）は、タンパク質合成を阻害して細胞死を引き起こし得るリボソーム阻害剤であるｓａｐｏｒｉｎ（サポニン）に結合したＦａｂフラグメントである。本実施例では、Ｆａｂ－ＺＡＰはヒト抗体Ｆｃに結合できるＦａｂフラグメントである。Ｆａｂ－ＺＡＰと抗ＢＣＭＡ抗体を共培養した後、抗体に毒素がロードされる。抗ＢＣＭＡ抗体がＨ９２９細胞によってエンドサイトーシスされると、毒素は抗体とともに細胞に入り、細胞を死滅させる。したがって、抗体のエンドサイトーシス効果は、ＭＴＳキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ３５８０）によって細胞の活性を検出することで検出できる。
候補抗体のエンドサイトーシス効果の検出
本実施例では、ヒト骨髄腫細胞株Ｈ９２９細胞に対する抗体のエンドサイトーシス効果を検出する方法システムを開発し、それに応じて候補抗体のエンドサイトーシス効果をテストした。その基本原理は、細胞毒性によって抗体のエンドサイトーシス効果を検出することである。Ｆａｂ－ＺＡＰ（Ａｔｓｂｉｏ、ＩＴ－５１－１００）は、タンパク質合成を阻害して細胞死を引き起こし得るリボソーム阻害剤であるｓａｐｏｒｉｎ（サポニン）に結合したＦａｂフラグメントである。本実施例では、Ｆａｂ－ＺＡＰはヒト抗体Ｆｃに結合できるＦａｂフラグメントである。Ｆａｂ－ＺＡＰと抗ＢＣＭＡ抗体を共培養した後、抗体に毒素がロードされる。抗ＢＣＭＡ抗体がＨ９２９細胞によってエンドサイトーシスされると、毒素は抗体とともに細胞に入り、細胞を死滅させる。したがって、抗体のエンドサイトーシス効果は、ＭＴＳキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ３５８０）によって細胞の活性を検出することで検出できる。
具体的な検出方法は次のとおりである。Ｈ９２９細胞を１週間前に蘇生し、蘇生後３日ごとに継代し、毎回２×１０５／ｍＬの細胞播種密度で、３週間以内に継代した。対数増殖期の細胞を吸引し、細胞をよく混合し、カウントして生存率を決定した。９６ウェル平底プレート一つを取り、細胞密度を４×１０５／ｍＬに調整し、各ウェルに５０μＬの細胞を加え、軽くピペッティングして混合し、細胞培養プレートを３７℃の細胞培養インキュベーターに入れて１６時間インキュベートした。次に、Ｆａｂ－ＺＡＰをまず１６４０＋１０％ ＦＢＳ＋１％ ＰＳ＋５０μＭ β－メルカプトエタノール完全培地で２７ｎＭ（２．１６μｇ／ｍｌ）希釈液に調製し、段階希釈された抗体に添加してインキュベートしたＦａｂ－ＺＡＰの最終濃度を１３．５ｎＭ（１．０８μｇ／ｍｌ）にした。設計されたプレートに従って、３００μＬのマルチチャンネルピペットを使用して希釈プレートから５０μＬの希釈溶液を取り出して細胞プレートに添加し、軽くピペッティングして均一に混合し、細胞インキュベーターに３日間培養した。その後、事前にＭＴＳを室温で溶かし、細胞プレートをインキュベーターから取り出し、１００μＬの１２チャンネルピペットガンで２０μＬのＭＴＳを取って各ウェルに加え、軽くピペッティングしてインキュベーター内で２時間インキュベートした。最後に、細胞プレートをマイクロプレートリーダーに入れ、４９２ｎｍの波長で読み取って保存した。
本実施例では、結果を図６Ａおよび６Ｂに示す。その結果は、候補抗体ＳＹ１４－３ｒｄ－５－６－７およびＳＹ１４－３ｒｄ－５－６－３２のエンドサイトーシス効果がどちらも陽性対照抗体（ＧＳＫ２８５７９１６）に優れていることを示している。
これまでのところ、候補抗体のすべての検出結果を図７にまとめている。
これまでのところ、候補抗体のすべての検出結果を図７にまとめている。
実施例９
抗体のヒト化操作
本実施例では、マウス抗体の重鎖および軽鎖Ｖ領域のフレームワークに対してアミノ酸点突然変異を実行して、それらをヒトＧｅｒｍｌｉｎｅに近づけた。それらの中で、操作された候補抗体は、ＳＹ１４－３ｒｄ－５－６－７（５－６－７または５－６－７－ＷＴとも呼ばれる）およびＳＹ１４－３ｒｄ－５－６－３２（５－６－３２または５－６－３２－ＷＴとも呼ばれる）を含み、操作された好ましい候補抗体は、それぞれ５－６－７－ｈｕ－２および５－６－３２－ｈｕ－２と呼ばれる。
抗体のヒト化操作
本実施例では、マウス抗体の重鎖および軽鎖Ｖ領域のフレームワークに対してアミノ酸点突然変異を実行して、それらをヒトＧｅｒｍｌｉｎｅに近づけた。それらの中で、操作された候補抗体は、ＳＹ１４－３ｒｄ－５－６－７（５－６－７または５－６－７－ＷＴとも呼ばれる）およびＳＹ１４－３ｒｄ－５－６－３２（５－６－３２または５－６－３２－ＷＴとも呼ばれる）を含み、操作された好ましい候補抗体は、それぞれ５－６－７－ｈｕ－２および５－６－３２－ｈｕ－２と呼ばれる。
実施例１０
ヒト化抗体の機能検証
１０．１ ヒト化前後のヒトおよびサルＢＣＭＡに対する２つの候補抗体の親和性のＥＬＩＳＡによる検出
具体的な操作方法は実施例６を参照されたい。結果を図８Ａ、図８Ｂ、図９Ａ、図９Ｂに示す。その結果は、ヒト化前後の抗体が、ヒトおよびサルＢＣＭＡ結合活性と基本的に同じであることを示している。
ヒト化抗体の機能検証
１０．１ ヒト化前後のヒトおよびサルＢＣＭＡに対する２つの候補抗体の親和性のＥＬＩＳＡによる検出
具体的な操作方法は実施例６を参照されたい。結果を図８Ａ、図８Ｂ、図９Ａ、図９Ｂに示す。その結果は、ヒト化前後の抗体が、ヒトおよびサルＢＣＭＡ結合活性と基本的に同じであることを示している。
１０．２ ヒト化前後のＢＣＭＡおよびＢＡＦＦのブロッキングにおける２つの候補抗体の効果のＥＬＩＳＡによる検出
具体的な操作については、実施例６を参照されたい。結果を図１０Ａおよび１１Ａに示す。その結果は、ＢＣＭＡおよびＢＡＦＦの結合をブロッキングするヒト化抗体の効果が陽性抗体の効果よりもわずかに悪いことを示している。
具体的な操作については、実施例６を参照されたい。結果を図１０Ａおよび１１Ａに示す。その結果は、ＢＣＭＡおよびＢＡＦＦの結合をブロッキングするヒト化抗体の効果が陽性抗体の効果よりもわずかに悪いことを示している。
１０．３ ヒト化前後のＢＣＭＡおよびＡＰＲＩＬのブロッキングにおける２つの候補抗体の効果のＥＬＩＳＡによる検出
具体的な操作については実施例６を参照されたい。結果を１０Ｂおよび１１Ｂに示す。その結果は、ＢＣＭＡおよびＡＰＲＩＬの結合をブロッキングするヒト化抗体の効果が陽性抗体の効果よりもわずかに悪いことを示している。
具体的な操作については実施例６を参照されたい。結果を１０Ｂおよび１１Ｂに示す。その結果は、ＢＣＭＡおよびＡＰＲＩＬの結合をブロッキングするヒト化抗体の効果が陽性抗体の効果よりもわずかに悪いことを示している。
１０．４ ヒトＢＣＭＡ－ＨＥＫ２９３細胞に対する候補抗体の親和性効果のＦＡＣＳによる検出
具体的な操作については実施例７を参照されたい。結果を図１２Ａに示す。その結果は、ヒト化前後の抗体とヒトＢＣＭＡ－ＨＥＫ２９３細胞の結合効果が基本的に同じであり、どちらも陽性対照抗体（ＧＳＫ２８５７９１６）よりも優れていることを示している。
具体的な操作については実施例７を参照されたい。結果を図１２Ａに示す。その結果は、ヒト化前後の抗体とヒトＢＣＭＡ－ＨＥＫ２９３細胞の結合効果が基本的に同じであり、どちらも陽性対照抗体（ＧＳＫ２８５７９１６）よりも優れていることを示している。
１０．５ サルＢＣＭＡ－ＣＨＯ細胞に対する候補抗体の親和性のＦＡＣＳによる検出
具体的な操作ついては実施例７を参照されたい。結果を図１２Ｂに示す。その結果は、ヒト化前後の抗体とサルＢＣＭＡ－ＣＨＯ細胞の結合効果が基本的に同じであり、どちらも陽性対照抗体（ＧＳＫ２８５７９１６）よりも優れていることを示している。
具体的な操作ついては実施例７を参照されたい。結果を図１２Ｂに示す。その結果は、ヒト化前後の抗体とサルＢＣＭＡ－ＣＨＯ細胞の結合効果が基本的に同じであり、どちらも陽性対照抗体（ＧＳＫ２８５７９１６）よりも優れていることを示している。
１０．６ ヒト骨髄腫細胞株Ｈ９２９細胞に対する候補抗体の親和性効果のＦＡＣＳによる検出
具体的な操作については実施例７を参照しされたい。結果を図１２Ｃに示す。その結果は、ヒト化前後の抗体とＨ９２９細胞の結合効果が基本的に同じであり、どちらも陽性対照抗体（ＧＳＫ２８５７９１６）よりも優れていることを示している。
具体的な操作については実施例７を参照しされたい。結果を図１２Ｃに示す。その結果は、ヒト化前後の抗体とＨ９２９細胞の結合効果が基本的に同じであり、どちらも陽性対照抗体（ＧＳＫ２８５７９１６）よりも優れていることを示している。
１０．７ ヒト化前後の抗体のエンドサイトーシス効果の検出
本実施例では、２つの候補抗体のヒト化前後のヒト骨髄腫細胞株Ｈ９２９細胞に対するエンドサイトーシス効果もテストされた。具体的な操作については、実施例８を参照されたい。結果を図１３Ａおよび１３Ｂに示す。その結果は、ヒト化抗体５－６－７－ｈｕＶ２のエンドサイトーシス効果がヒト化前（５－６－７－ＷＴ）と比較して部分的に改善され、ヒト化前後の他の抗体のヒト骨髄腫細胞株Ｈ９２９細胞に対するエンドサイトーシス効果が基本的に同じであり、すべて陽性対照抗体（ＧＳＫ２８５７９１６）よりも優れていることを示している。
本実施例では、２つの候補抗体のヒト化前後のヒト骨髄腫細胞株Ｈ９２９細胞に対するエンドサイトーシス効果もテストされた。具体的な操作については、実施例８を参照されたい。結果を図１３Ａおよび１３Ｂに示す。その結果は、ヒト化抗体５－６－７－ｈｕＶ２のエンドサイトーシス効果がヒト化前（５－６－７－ＷＴ）と比較して部分的に改善され、ヒト化前後の他の抗体のヒト骨髄腫細胞株Ｈ９２９細胞に対するエンドサイトーシス効果が基本的に同じであり、すべて陽性対照抗体（ＧＳＫ２８５７９１６）よりも優れていることを示している。
これまでのところ、ヒト化前後の２つの候補抗体のすべての検出結果を図１４にまとめている。
実施例１１
ヒト化前後の候補抗体のＤＳＦ検出
本実施例では、ヒト化前後の２つの候補抗体と陽性対照抗体（ＧＳＫ２８５７９１６）の熱安定性データをテストした。具体的なプロセスは次のとおりである。抗体溶液を調製し、０．２５ｍｇ／ｍＬ、１９μＬ／ウェルで、各テストサンプルに３つの並列ウェルを設定し、ＰＢＳとＩＰＩを参照として使用した。次に、１μＬのＳＹＰＲＯ оｒａｎｇｅ色素を１００倍の濃度で各ウェルに加え、ロードの準備をした。テストにはＡＢＩ７５００ ＦＡＳＴ ＲＴ－ＰＣＲ装置を使用し、テストタイプとして融解曲線を選択し、連続モードを使用し、スキャン温度範囲を２５～９５℃、加熱速度を１％、２５℃で５分間平衡した。加熱プロセス中にデータを収集し、レポーター基をＲＯＸ、クエンチャー基をＮｏｎｅ、反応用量を２０μＬにし、融解曲線の一次導関数の最初のピークと谷に対応する温度を、候補抗体の変性温度として確定した。結果を表１－３に示す。
ヒト化前後の候補抗体のＤＳＦ検出
本実施例では、ヒト化前後の２つの候補抗体と陽性対照抗体（ＧＳＫ２８５７９１６）の熱安定性データをテストした。具体的なプロセスは次のとおりである。抗体溶液を調製し、０．２５ｍｇ／ｍＬ、１９μＬ／ウェルで、各テストサンプルに３つの並列ウェルを設定し、ＰＢＳとＩＰＩを参照として使用した。次に、１μＬのＳＹＰＲＯ оｒａｎｇｅ色素を１００倍の濃度で各ウェルに加え、ロードの準備をした。テストにはＡＢＩ７５００ ＦＡＳＴ ＲＴ－ＰＣＲ装置を使用し、テストタイプとして融解曲線を選択し、連続モードを使用し、スキャン温度範囲を２５～９５℃、加熱速度を１％、２５℃で５分間平衡した。加熱プロセス中にデータを収集し、レポーター基をＲＯＸ、クエンチャー基をＮｏｎｅ、反応用量を２０μＬにし、融解曲線の一次導関数の最初のピークと谷に対応する温度を、候補抗体の変性温度として確定した。結果を表１－３に示す。
実施例１２
ヒト化前後の候補抗体の親和性検出
本実施例では、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６機器を使用して、ヒトＢＣＭＡおよびサルＢＣＭＡに対するヒト化前後の５－６－７および５－６－３２の候補抗体の親和性を検出した。
ヒト化前後の候補抗体の親和性検出
本実施例では、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６機器を使用して、ヒトＢＣＭＡおよびサルＢＣＭＡに対するヒト化前後の５－６－７および５－６－３２の候補抗体の親和性を検出した。
１２．１ 材料の準備
１ｇのＢＳＡを量り、５００μＬのＴｗｅｅｎ ２０を測定し、１０００ｍＬの１×ＰＢＳに加えてよく均一に混合した。フィルタリング後、分注して保存した。０．１ｍＬの０．１Ｍグリシン溶液（ｐＨ＝２．０）をピペットして０．９ｍＬの超純水に加え、均一に混合した。抗体をＫＢ緩衝液で１０μｇ／ｍＬに希釈し、抗原をＫＢ緩衝液で希釈して、２００、５０、１２．５、および０ｎＭの一連の濃度勾配をこの順で希釈した。
１ｇのＢＳＡを量り、５００μＬのＴｗｅｅｎ ２０を測定し、１０００ｍＬの１×ＰＢＳに加えてよく均一に混合した。フィルタリング後、分注して保存した。０．１ｍＬの０．１Ｍグリシン溶液（ｐＨ＝２．０）をピペットして０．９ｍＬの超純水に加え、均一に混合した。抗体をＫＢ緩衝液で１０μｇ／ｍＬに希釈し、抗原をＫＢ緩衝液で希釈して、２００、５０、１２．５、および０ｎＭの一連の濃度勾配をこの順で希釈した。
１２．２ 実験手順
センサー（ｓｅｎｓｏｒ）（Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ｆｂａ－ＣＨ１ ２ｎｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、ＦＡＢ２Ｇ）を少なくとも１０分間遮光予湿した後、サンプルプレート（ＧｒｅｉｎｉｅｒＢｉｏ、ＰＮ６５５２０９）をテストし、テストが正しく行われた後、予定のプログラムに従って続行した。ここで、２００μＬ／ウェルＫＢ緩衝液をサンプルプレート１の第１、１０、１２カラムに添加し、０．０１Ｍ ｐＨ２．０グリシン溶液を第１１カラムに添加し、調製したサンプル溶液を第２～８カラムに添加し（１つのサンプルに４つのウェルを追加、つまり１つのカラムに２つのサンプル）、第９カラムに、高濃度から低濃度までの順にヒトＢＣＭＡ－Ｆｃを添加し、すなわち、１番目と５番目のウェルに２００ｎＭの抗原溶液を添加し、２番目と６番目のウェルに５０ｎＭの抗原溶液を添加し、３番目と７番目のウェルに１２．５ｎＭの抗原溶液を添加し、４番目と８番目のウェルに０ｎＭの抗原溶液を添加した。サンプルプレート２の調製は、第９カラムの抗原がサルＢＣＭＡタンパク質に置き換えられたことを除いて、変更されなかった。データの結果を表１－４に示す。
センサー（ｓｅｎｓｏｒ）（Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ｆｂａ－ＣＨ１ ２ｎｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、ＦＡＢ２Ｇ）を少なくとも１０分間遮光予湿した後、サンプルプレート（ＧｒｅｉｎｉｅｒＢｉｏ、ＰＮ６５５２０９）をテストし、テストが正しく行われた後、予定のプログラムに従って続行した。ここで、２００μＬ／ウェルＫＢ緩衝液をサンプルプレート１の第１、１０、１２カラムに添加し、０．０１Ｍ ｐＨ２．０グリシン溶液を第１１カラムに添加し、調製したサンプル溶液を第２～８カラムに添加し（１つのサンプルに４つのウェルを追加、つまり１つのカラムに２つのサンプル）、第９カラムに、高濃度から低濃度までの順にヒトＢＣＭＡ－Ｆｃを添加し、すなわち、１番目と５番目のウェルに２００ｎＭの抗原溶液を添加し、２番目と６番目のウェルに５０ｎＭの抗原溶液を添加し、３番目と７番目のウェルに１２．５ｎＭの抗原溶液を添加し、４番目と８番目のウェルに０ｎＭの抗原溶液を添加した。サンプルプレート２の調製は、第９カラムの抗原がサルＢＣＭＡタンパク質に置き換えられたことを除いて、変更されなかった。データの結果を表１－４に示す。
実施例１３
上記の実施例に基づいて５－６－７－ｈｕ－２および５－６－３２－ｈｕ－２を選択し、分析および配列決定を行った。ＩＭＧＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）に基づいてヒト抗体配列の可変領域を定義し、本発明の抗体の軽鎖および重鎖可変領域の配列（配列番号１３～１６）を確定し、可変領域配列を分析し、ＣＤＲをＡｂＭによって定義する方法によって、抗体の重鎖および軽鎖の相補性決定領域配列（配列番号１～１２）を確定した。
上記の実施例に基づいて５－６－７－ｈｕ－２および５－６－３２－ｈｕ－２を選択し、分析および配列決定を行った。ＩＭＧＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）に基づいてヒト抗体配列の可変領域を定義し、本発明の抗体の軽鎖および重鎖可変領域の配列（配列番号１３～１６）を確定し、可変領域配列を分析し、ＣＤＲをＡｂＭによって定義する方法によって、抗体の重鎖および軽鎖の相補性決定領域配列（配列番号１～１２）を確定した。
本発明によって保護される配列は、具体的には以下の通りである。
配列番号１：
ＧＨＩＦＴＮＦＨＦＨ
配列番号２：
ＧＹＩＦＴＮＹＨＭＨ
配列番号３：
ＧＩＹＰＧＮＧＤＴＦ
配列番号４：
ＧＩＹＰＧＮＧＤＩＦ
配列番号５：
ＧＳＹＹＧＹＩＤＡＭＤＹ
配列番号６：
ＧＳＹＹＧＹＩＤＡＭＤＹ
配列番号７：
ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ
配列番号８：
ＲＡＳＱＤＩＳＮＤＬＮ
配列番号９：
ＹＴＳＲＬＨＳ
配列番号１０：
ＹＴＳＲＬＰＳ
配列番号１１：
ＱＱＧＮＴＬＰＷＴ
配列番号１２：
ＱＱＧＨＴＬＰＷＴ
配列番号１３：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＶＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＮＴＬＰＷＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号１４：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＮＤＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＰＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＨＴＬＰＷＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号１５：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＨＩＦＴＮＦＨＦＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＹＰＧＮＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧＲＡＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＧＳＹＹＧＹＩＤＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
配列番号１６：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＩＦＴＮＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＹＰＧＮＧＤＩＦＹＡＱＫＦＱＧＲＡＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＩＥＬＳＳＭＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＳＹＹＧＹＩＤＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
配列番号１７：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＮＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＲＫＬＰＷＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号１８：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＮＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＡＴＹＲＧＨＳＤＴＹＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＡＩＹＤＧＹＤＶＬＤＮＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１：
ＧＨＩＦＴＮＦＨＦＨ
配列番号２：
ＧＹＩＦＴＮＹＨＭＨ
配列番号３：
ＧＩＹＰＧＮＧＤＴＦ
配列番号４：
ＧＩＹＰＧＮＧＤＩＦ
配列番号５：
ＧＳＹＹＧＹＩＤＡＭＤＹ
配列番号６：
ＧＳＹＹＧＹＩＤＡＭＤＹ
配列番号７：
ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ
配列番号８：
ＲＡＳＱＤＩＳＮＤＬＮ
配列番号９：
ＹＴＳＲＬＨＳ
配列番号１０：
ＹＴＳＲＬＰＳ
配列番号１１：
ＱＱＧＮＴＬＰＷＴ
配列番号１２：
ＱＱＧＨＴＬＰＷＴ
配列番号１３：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＶＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＮＴＬＰＷＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号１４：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＮＤＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＰＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＨＴＬＰＷＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号１５：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＨＩＦＴＮＦＨＦＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＹＰＧＮＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧＲＡＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＧＳＹＹＧＹＩＤＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
配列番号１６：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＩＦＴＮＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＹＰＧＮＧＤＩＦＹＡＱＫＦＱＧＲＡＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＩＥＬＳＳＭＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＳＹＹＧＹＩＤＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
配列番号１７：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＮＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＲＫＬＰＷＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号１８：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＮＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＡＴＹＲＧＨＳＤＴＹＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＡＩＹＤＧＹＤＶＬＤＮＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
上記の具体的な実施例は、本発明の目的、技術案、および有益な効果をさらに詳しく説明した。以上は本発明の特定の実施例にすぎず、本発明を限定することを意図するものではないことを理解されたい。本発明の精神および原理内で行われたいかなる修正、同等の置換、改良などは、本発明の保護範囲内に含まれるべきである。
Claims (23)
- ヒトＢＣＭＡとサルＢＣＭＡの両方に結合できる、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を標的とする単離されたモノクローナル抗体。
- 前記抗体は、
（１）配列番号１若しくは２に示される重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、及び／または配列番号３若しくは４に示される重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）、及び／または配列番号５若しくは６に示される重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）を含む重鎖可変領域を含む抗体；
（２）配列番号７若しくは８に示される軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、及び／または配列番号９若しくは１０に示される軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）、及び／または配列番号１１若しくは１２に示される軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
（３）（１）に記載の抗体の重鎖可変領域及び（２）に記載の抗体の軽鎖可変領域を含む抗体；
（４）（１）～（３）のいずれか１項に記載の抗体のバリアントであり、（１）～（３）のいずれか１項に記載の抗体と同等または類似の活性を有する抗体
から選択されるいずれかである、請求項１に記載のモノクローナル抗体。 - 前記抗体は、
（１）配列番号１３もしくは１４示されるアミノ酸配列または前記配列のバリアントを含む軽鎖可変領域を含む抗体；
（２）配列番号１５もしくは１６示されるアミノ酸配列または前記配列のバリアントを含む重鎖可変領域を含む抗体；
（３）（１）に記載の抗体の重鎖可変領域及び（２）に記載の抗体の軽鎖可変領域を含む抗体
から選択されるいずれかであることを特徴とする、請求項１または２に記載の抗体。 - 前記抗体の重鎖可変領域が、配列番号１に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号５に示されるＣＤＲ－Ｈ３を含むことを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
- 前記抗体の重鎖可変領域が、配列番号２に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号６に示されるＣＤＲ－Ｈ３を含むことを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
- 前記抗体の軽鎖可変領域が、配列番号７に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９に示されるＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１１に示されるＣＤＲ－Ｌ３を含むことを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
- 前記抗体の軽鎖可変領域が、配列番号８に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１０に示されるＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１２に示されるＣＤＲ－Ｌ３を含むことを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
- 前記抗体の軽鎖可変領域が、配列番号１３または１４に示される配列を有するか、または前記配列のいずれか１つと少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の類似性を有する配列を有することを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
- 前記抗体の重鎖可変領域が、配列番号１５または１６に示される配列を有するか、または前記配列のいずれか１つと少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の類似性を有する配列を有することを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
- 請求項１～９のいずれか１項に記載の抗体と同じエピトープを認識することを特徴とする、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を標的とするモノクローナル抗体。
- 請求項１～９のいずれか１項に記載の抗体と競合してＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合することを特徴とする、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を標的とするモノクローナル抗体。
- 請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体をコードする核酸。
- 請求項１２に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項１３に記載の発現ベクターを含み、またはそのゲノムに請求項１２に記載の核酸が組み込まれた、宿主細胞。
- 請求項１４に記載の宿主細胞を培養することによって請求項１～１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を産生する、モノクローナル抗体を産生する方法。
- 請求項１～１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
- 請求項１～１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または請求項１６に記載の医薬組成物を含む、キットまたは製品。
- 請求項１～１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または請求項１６に記載の医薬組成物または請求項１７に記載のキット若しくは製品を、それを必要とする被験者に投与することを含む、
ＢＣＭＡの発現に関連する疾患を治療するための方法。 - 前記疾患が、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病、Ｔ細胞急性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、小細胞または大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性疾患、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンストレームマクログロブリン血症、骨髄腫、ＭＧＵＳ、形質細胞腫、全身性アミロイド軽鎖アミロイドーシス及びＰＯＥＭＳ症候群から選択される、請求項１８に記載の方法。
- 前記疾患が多発性骨髄腫である、請求項１８または１９に記載の方法。
- ＢＣＭＡの発現に関連する疾患を治療するための薬剤の調製における、請求項１～１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体の使用。
- 前記疾患が、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病、Ｔ細胞急性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、小細胞または大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性疾患、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンストレームマクログロブリン血症、骨髄腫、ＭＧＵＳ、形質細胞腫、全身性アミロイド軽鎖アミロイドーシス及びＰＯＥＭＳ症候群から選択される、請求項２１に記載の使用。
- 前記疾患が多発性骨髄腫である、請求項２１または２２に記載の使用。
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