CN114174335B - 一种人源化vegfr2抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于肿瘤免疫治疗领域,涉及一种重组人源化的抗VEGFR2抗体药物。本发明公开编码所述抗体的核酸序列(包括重/轻链可变区)、含有所述核酸序列的载体、药物组合物和试剂盒。本发明公开的抗体能与肿瘤细胞特异性结合,并同时阻断VEGF‑A,VEGF‑C和VEGF‑D的作用,因而具有更佳的抑制血管生成作用。所述抗体还能激活NK细胞发生抗体依赖性细胞毒性(ADCC)反应,抑制肿瘤的生长和转移,可用于临床治疗黑色素瘤。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤免疫治疗领域,涉及一种重组人源化的抗VEGFR2抗体及其应用。
背景技术
肿瘤血管为肿瘤的发生发展输送充足的营养物质,并提供肿瘤细胞的逃逸通道。靶向血管新生的药物可阻断肿瘤的营养供给,从而达到“饿杀”肿瘤的效果。然而,肿瘤血管的新生受肿瘤微环境中多种生长因子、受体及下游信号通路的综合调控。其中,血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)通过与其受体(vascularendothelial growth factor receptor,VEGFR)结合,在生理性和病理性血管形成过程中发挥重要作用[1]。
VEGFR2(也称为FLK-1,或KDR),是VEGFR家族的主要成员,属于III型受体酪氨酸激酶,主要分布在血管及淋巴管内皮细胞膜表面。VEGFR2的胞外区含7个免疫球蛋白样结构域(即D1-D7),包括配体VEGF结合结构域(D2-D3)和二聚化结构域(D4-D7),其胞内区含酪氨酸激酶结构域[2-4]。VEGF(包括VEGF-A、C、D、E等)在正常人血浆中的浓度约为137±7.7pg/mL[5],胰腺癌、卵巢癌等患者血清中VEGF浓度显著上调,为200-400pg/mL,而肿瘤组织或者肿瘤囊肿积液中,VEGF的浓度则高达0.5-20ng/mL[5-7]。当肿瘤微环境中高浓度的VEGF二聚体结合VEGFR2后,诱导VEGFR2受体形成同源二聚体(主要),亦可与VEGFR1或者VEGFR3形成异源二聚体(次要),引起VEGFR2胞内区酪氨酸残基自磷酸化,活化下游磷脂酶C(PLC)等信号通路,促进肿瘤血管内皮细胞增殖和存活、介导肿瘤细胞迁移、改变血管通透性,最终引起肿瘤血管增生[2]。
VEGFR2抗体类药物可阻断VEGFR2与VEGF结合,抑制血管生成,降低血管通透性,在短时间内使肿瘤微环境重新获得平衡,从而获得良好的抑癌效果。礼来(Eli Lilly)公司研发的第一个抗VEGFR2肿瘤治疗药物雷莫芦单抗(CYRAMZA)[8],已在化疗/放疗失败后的胃癌/胃食管连接处癌[9]、化疗失败后的非小细胞肺癌[10]、化疗/放疗联合Avastin(VEGF抗体)失败后的结直肠癌[11]和转移性乳腺癌[12]等多种肿瘤中显示出良好的治疗效果,特别是在胃癌的二线治疗中显示出比VEGF单抗药物Avastin更佳的疗效。此外,由于VEGF在正常生理代谢中的重要作用,尽管Avastin在多种疾病中耐受良好,临床研究中发现Avastin具有胃穿孔等严重副作用[13],而靶向VEGFR-2可保留VEGF结合VEGFR1同源二聚体的功能,保留了人正常组织新生血管的部分功能,因此,预期靶向VEGFR-2导致的胃肠道穿孔等系统性毒副作用更低,具有更好的安全性优势,而临床更需要兼顾安全和疗效的药物。
目前为止,雷莫芦单抗是唯一一款获FDA批准上市用于晚期胃癌、结肠癌及非小细胞肺癌的二线治疗的VEGFR2单克隆抗体药物,而且其尚未在国内批准上市,因此,国内急需研发更安全有效的针对VEGFR2靶点的创新型单克隆抗体药物以填补这一空白。本发明公开的抗体能与肿瘤细胞特异性结合,并同时阻断VEGF-A,VEGF-C和VEGF-D的作用,因而具有更佳的抑制血管生成作用。所述抗体还能激活NK细胞发生抗体依赖性细胞毒性(ADCC)反应,抑制肿瘤的生长和转移,可用于临床治疗黑色素瘤。
发明内容
在一个方面,本发明提供了一种分离的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段,其包含具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的重链CDR1域、具有SEQ ID NO:14/50所示的氨基酸序列的重链CDR2域和具有SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的重链CDR3域的重链可变区,和具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的轻链CDR1域、具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的轻链CDR2域和具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的轻链CDR3域的轻链可变区。
在一个实施方式中,所述抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包含具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8具有至少90%、92%、95%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9具有至少90%、92%、95%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方式中,所述抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段是人源化抗体或嵌合抗体。
在一个实施方式中,所述抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包含具有如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:22具有至少85%、90%、95%或99%序列同一性的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23具有至少85%、90%、95%或99%序列同一性的轻链可变区。
在一个实施方式中,所述抗体进一步包含轻链恒定区和重链恒定区,优选地所述轻链恒定区为氨基酸序列为SEQ ID NO:25的kappa轻链恒定区的氨基酸序列或与SEQ IDNO:25具有至少90%、92%、95%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列,和/或所述重链恒定区为与氨基酸序列为SEQ ID NO:24的IgG1重链恒定区的氨基酸序列或与SEQ ID NO:24具有至少90%、92%、95%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方式中,所述抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段为IgG抗体,优选为IgG1抗体。
在一个实施方式中,所述抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体。
在一个实施方式中,所述抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段与重组VEGFR2的结合亲和力KD为1-100pM,优选5-50pM,更优选10.6pM。
在一个实施方式中,所述抗原结合片段为Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、Fd片段、Fd′片段、单链抗体分子或单域抗体;其中单链抗体分子优选为scFv、di-scFv、tri-scFv、双体抗体或scFab。
在一个实施方式中,所述抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段,其结合表位是VEGFR2的Y137/K142、R164/Y165、D257、S311/G312。
在另一方面,本发明提供一种抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段,其与本发明的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段结合抗原上的相同的表位。
在另一方面,本发明提供一种VEGFR2分子表位,其是VEGFR2的Y137/K142、R164/Y165、D257、S311/G312。
在另一方面,本发明提供一种抗体-药物缀合物,其包含如权利要求1-9任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段和另外的治疗剂,优选地所述抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段和另外的治疗剂通过接头连接。
在另一方面,本发明提供一种核酸,其编码根据本发明的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方式中,所述核酸包含如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列和/或如SEQID NO:5所示的核苷酸序列,或者包含如SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列和/或如SEQ IDNO:31所示的核苷酸序列。
在另一方面,本发明提供一种表达载体,其包含根据本发明的核酸。
在另一方面,本发明提供一种宿主细胞,其包含根据本发明的核酸或表达载体。
在另一方面,本发明提供一种用于产生本发明的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段的方法,包括在适合于抗体表达的条件下培养所述的宿主细胞,和从培养基中回收表达的抗体。
在另一方面,本发明提供一种药物组合物,包含根据本发明的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段或根据本发明的抗体-药物缀合物或根据本发明的核酸或表达载体,及药学上可接受的载体。
在另一方面,本发明涉及抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段或抗体-药物缀合物或药物组合物,其用于治疗黑色素瘤。
在另一方面,本发明提供一种用于治疗黑色素瘤的方法,包括向需要的受试者施用治疗有效量的根据本发明的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段或根据本发明的抗体-药物缀合物或根据本发明的药物组合物,从而治疗所述黑色素瘤。
在另一方面,本发明涉及根据本发明的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段或根据本发明的抗体-药物缀合物或根据本发明的药物组合物在制备用于治疗黑色素瘤的药物中的用途。
在另一方面,本发明提供一种药物组合,其包含根据本发明的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段或根据本发明的抗体-药物缀合物或根据本发明的药物组合物及一种或多种另外的治疗剂。
在另一方面,本发明提供一种试剂盒,其包含根据本发明的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段或根据本发明的抗体-药物缀合物或根据本发明的药物组合物,优选地,所述试剂盒进一步包含给药的装置。
附图说明
本发明结合附图进行说明,附图中:
图1显示了通过ELISA检测的抗VEGFR2嵌合抗体与重组蛋白VEGFR2-His的结合。
图2显示了通过FACS检测的抗VEGFR2嵌合抗体在293FT-VEGFR2细胞株上的结合。
图3显示了通过ELISA检测的抗VEGFR2嵌合抗体阻断重组人VEGFR2-His与人VEGF165重组蛋白的结合。
图4显示了抗VEGFR2嵌合抗体阻断VEGF165对HUVEC细胞的增殖作用。
图5显示了通过ELSIA检测VEGFR2-HK19与重组人VEGFR2-His的结合。
图6显示了通过FACS检测的VEGFR2-HK19在293FT-VEGFR2细胞株上的结合。
图7显示了通过ELISA检测的VEGFR2-HK19的种属交叉结合。
图8显示了通过ELISA检测的VEGFR2-HK19阻断VEGF165与VEGFR2的结合。
图9显示了通过FACS检测的VEGFR2-HK19阻断VEGF165与293FT-VEGFR2的结合。
图10显示了通过ELISA检测的VEGFR2-HK19阻断VEGFR2-Fc重组蛋白与VEGF-C的结合。
图11显示了通过ELISA检测的VEGFR2-HK19阻断VEGFR2-Fc重组蛋白与VEGF-D的结合。
图12显示了VEGFR2-HK19阻断VEGF165对HUVEC细胞的增殖作用。
图13显示了VEGFR2-HK19阻断VEGF-C对HUVEC细胞的增殖作用。
图14显示了VEGFR2-HK19阻断VEGF-C+VEGF-D对HUVEC细胞的增殖作用。
图15显示了VEGFR2-HK19阻断VEGF-A+VEGF-C+VEGF-D对HUVEC细胞的增殖作用。
图16显示了通过CD16A重组报告基因检测的VEGFR2-HK19的ADCC作用。
图17显示了VEGFR2-HK19同源建模与VEGFR2的晶体结构对接。
图18显示了VEGFR2-HK19和VEGF-A与VEGFR2结合的表位。
图19显示了VEGFR2-HK19对B16-F1黑色素瘤移植KDR人源化小鼠体重的影响。
图20显示了VEGFR2-HK19对B16-F1黑色素瘤移植KDR人源化小鼠肿瘤体积的影响。
图21显示了CD-1小鼠单次给予VEGFR2-HK19抗体的药物浓度-时间曲线。
具体实施方式
本发明的各个方面涉及分离的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段、包含该抗体或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物、编码该抗体或其抗原结合片段的核酸和表达载体、包含该核酸或表达载体的宿主细胞、产生该抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段的方法、包含该抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段的药物组合物以及使用该抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段治疗黑色素瘤的方法。
定义
除非另有说明,本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属的技术领域的普通技术人员通常理解的含义。为了本发明的目的,定义以下术语,以同本技术领域通常理解的含义保持一致。
当用于本文和所附权利要求书中时,单数形式“一”、“一种”、“另一”和“所述”包括复数指代对象,除非上下文明确地另有指示。
术语“抗体”意指免疫球蛋白分子,是指表现所需生物学活性的抗体的任何形式。包括但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体和多特异性抗体(例如双特异性抗体),甚至包括抗体片段。典型地,全长抗体结构优选包含4条多肽链,通常通过二硫键相互连接的2条重(H)链和2条轻(L)链。每条重链包含重链可变区和重链恒定区。每条轻链包含轻链可变区和轻链恒定区。在此典型全长抗体结构外,其结构还包括其他衍生形式。
所述重链可变区和轻链可变区可进一步细分为更保守的区域(称为框架区(FR))和穿插其中的高变区(称为互补决定区(CDR))。
术语“互补决定区”(CDR,例如CDR1、CDR2和CDR3)是指抗体可变区的这样一些氨基酸残基,其存在对于抗原结合来说是必需的。每个可变区通常具有3个被鉴别为CDR1、CDR2和CDR3的CDR区域。每个互补决定区可包含来自如Kabat所定义的“互补决定区”的氨基酸残基(Kabat等,Sequences of Proteins of Immulological Interest,5th Ed.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.1991))和/或来自“高变环”的那些残基(Chothia和Lesk;J Mol Biol 196:901-917(1987))。
术语“构架”或“FR”残基是如本文中所定义的CDR残基之外的那些可变区残基。
每个重链可变区和轻链可变区通常包含3个CDR和最多达4个FR,所述CDR和FR从氨基末端至羧基末端以例如以下顺序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
给定抗体的互补性决定区(CDR)和框架区(FR)可以使用Kabat体系标识(Kabat等:Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,美国卫生和公众服务部,PHS,NIH,NIH出版编号91-3242,1991)。
术语“恒定区”是指抗体的轻链和重链上的这样一些氨基酸序列,不直接参与抗体与抗原的结合,但展现出多种效应子功能,例如抗体依赖性细胞毒性。
根据其恒定区的氨基酸序列的抗原性差异,抗体的重链可以被分为α、δ、ε、γ和μ五类,当其与轻链组成完整的抗体,可被分为五类:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,这些类中的若干还可进一步分为亚类(同种型),例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。基于其恒定结构域的氨基酸序列,抗体的轻链可归入κ和λ。
“抗体的抗原结合片段”包含完整抗体分子的一部分,其保留母体抗体的至少某些结合特异性,通常包括至少部分母体抗体的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。抗原结合片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、Fd片段、Fd′片段、单链抗体分子(例如scFv,di-scFv或tri-scFv、双体抗体或scFab)、单域抗体。
术语“抗体片段”是指保留母体抗体的至少某些生物学特性的非完整抗体分子,其实例除上述“抗原结合片段”所述及的那些之外,还包括但不限于Fc片段。
术语“抗体-药物缀合物”或“ADC”是指与一种或多种化学药物化学连接的结合蛋白如抗体或其抗原结合片段,其可以任选地是治疗剂或细胞毒性剂(如一种或多种细胞因子或化疗药物)。在优选的实施方案中,ADC包括抗体、细胞毒性或治疗药物,以及能够使药物与抗体连接或缀合的接头。ADC通常具有与抗体缀合的1至8个中任一值的药物,包括2、4、6或8的载药物质。可以包含在ADC中的药物的非限制性实例是有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、免疫调节剂、用于基因治疗载体、烷化剂、抗血管生成剂、抗代谢药、含硼药剂、化疗保护剂、激素、抗激素剂、皮质类固醇、光活性治疗剂、寡核苷酸、放射性核素剂、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和放射致敏剂。
术语“嵌合抗体”是指重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种,而其余部分来源于不同来源或物种的抗体。“嵌合抗体”亦可以为如上定义的功能性的片段。“人源化抗体”是“嵌合抗体”的子集。
术语“人源化抗体”或“人源化抗原结合片段”在本文中被定义为这样的抗体或抗体片段:(i)来源于非人来源(例如,携带异源免疫系统的转基因小鼠)且基于人种系序列;或(ii)可变区是非人来源而恒定区是人来源的嵌合抗体;或者(iii)CDR移植的,其中可变区的CDR来自非人来源,而可变区的一个或多个构架区为人来源的,并且恒定区(如果有的话)是人来源的。“人源化”的目的是消除非人来源抗体在人体内的免疫原性,而同时最大可能地保留亲和力。选择与非人来源抗体构架序列最相似的人构架序列为模板进行人源化改造是有利的。在某些情况下,可能需要用非人构架中相应的残基替换人类构架序列中的一个或多个氨基酸,以避免亲和性的丧失。
“单克隆抗体”是指获自基本上同质的抗体群体的抗体,即,所述包含单一抗体的群体除了可能以极少量存在的可能突变(例如天然突变)之外是相同的。因此,所述术语“单克隆”表明所述抗体的性质,即不是不相关抗体的混合物。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反,单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体均针对抗原上的单独一个决定簇。除了其特异性之外,单克隆抗体制剂的优点在于它们通常不会被其他抗体污染。所述术语“单克隆”不应被理解为需要通过任何特定的方法产生所述抗体。
抗体“特异性结合”目的抗原例如肿瘤相关的多肽抗原靶(本文中,VEGFR2),即以足够的亲和力结合所述抗原以使得所述抗体可用作治疗性试剂,靶向表达所述抗原的细胞或组织,并且与其他蛋白质无显著交叉反应或者与除了上文提到的抗原靶的同源体和变体(例如突变形式、剪接变体,或蛋白水解作用截短的形式)以外的蛋白质无显著交叉反应。
术语“结合亲和力”是指分子的单个结合位点与其结合伴侣之间非共价相互作用总和的强度。除非另有说明,用于本文时“结合亲和力”是指固有的结合亲和力,其反映结合对(例如抗体和抗原)的成员之间1∶1的相互作用。如本文所用,术语“KD”是指抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。如本文所用,术语“kon”是指抗体与抗原结合的速率常数。如本文所用,术语“koff”是指抗体与抗体/抗原复合物解离的速率常数。“KD”、“结合速率常数kon”和“解离速率常数koff”通常用于描述分子(例如抗体)与其结合伴侣(例如抗原)之间的亲和力,即,配体结合特定蛋白的紧密程度。结合亲和力受非共价分子间相互作用的影响,例如氢键,静电相互作用,两个分子之间的疏水和范德华力。另外,配体与其靶分子之间的结合亲和力可能受到其他分子的存在的影响。亲和力可通过本领域中已知的常规方法来分析,包括本文描述的ELISA。
术语“表位”包括能够特异性结合至抗体或T细胞受体的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或糖侧链,或其组合)组成,并且通常具有特定三维结构特征以及特定的电荷特征。
术语“分离的”抗体是已经被鉴别并且从表达它的细胞的组分中分离的抗体。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体,所述抗体的天然环境中的至少一种组分是不存在的。然而,通常情况下,分离的抗体是通过至少一个纯化步骤进行制备。
两条多肽或核酸序列之间的“序列同一性”表示所述序列之间相同的残基的数目占残基总数的百分比,且基于比较的分子中较小者的大小来计算。在计算同一性百分数时,将正在比较的序列以产生序列之间最大匹配的方式比对,通过特定算法解决比对中的空位(如果存在的话)。确定两个序列之间同一性的优选计算机程序方法包括,但不限于,GCG程序包,包括GAP、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.215:403-410)。上述程序可以公开地从国际生物技术信息中心(NCBI)和其他来源得到。熟知的SmithWaterman算法也可用于确定同一性。
术语“Fc受体”或“FcR”指与抗体Fc区结合的受体。优选天然序列的人FcR,且优选与IgG抗体结合的受体(γ受体),其包括FcγRI,FcγRII和FcγRIII亚型,以及这些受体的变体。其它FcR均被包含在术语“FcR”中。该术语也包括新生儿受体(FcRn)其负责将母体的IgG转运至胎儿(Guyer等,免疫学杂志117:587(1976)和Kim等,免疫学杂志24:249(1994))。
术语“新生儿Fc受体”、简称“FcRn”,其结合IgG抗体Fc区。新生儿Fc受体(FcRn)在体内IgG类抗体的代谢命运中起重要作用。FcRn行使功能以从溶酶体降解途径营救IgG,从而降低其在血清中的清除率并加长半衰期。因此,IgG体外FcRn结合性质/特征指示它在血液循环中的体内药代动力学性质。
术语“效应子功能”指可归因于抗体的Fc区的那些生物学活性,其随抗体同种型而不同。抗体效应子功能的实例包括:C1q结合和依赖补体的细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、依赖抗体的细胞毒性(ADCC)、依赖抗体的吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取、细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调和B细胞激活。
术语“效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应子功能的白细胞。在一个方面,所述效应细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞。效应细胞可以从天然来源,例如,血液中分离。效应细胞通常是与效应子阶段相关联的淋巴细胞,并发挥作用,以产生细胞因子(辅助T细胞)、杀死被病原体感染的细胞(细胞毒性T细胞)或分泌抗体(分化的B细胞)。
″免疫细胞″包括具有造血的起源并在免疫应答中起作用的细胞。免疫细胞包括:淋巴细胞,例如B细胞和T细胞;天然杀伤细胞;髓样细胞,例如单核细胞、巨噬细胞、嗜曙红细胞、肥大细胞、嗜碱细胞和粒细胞。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指一种细胞毒性形式,其中结合到在某些细胞毒性细胞(例如NK细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fcγ受体上的分泌Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合至承载抗原的靶细胞,随后使用例如细胞毒素杀死所述靶细胞。为了评估目的抗体的ADCC活性,可进行体外ADCC测定法,例如记载于美国专利No.5,500,362或5,821,337或美国专利No.6,737,056(Presta)中的体外ADCC测定法。用于这类测定法的有用效应细胞包括PBMC和NK细胞。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体的存在下靶细胞的裂解。典型的补体途径的活化是通过将补体系统的第一组分(C1q)与结合至其相应抗原的(适当亚类的)抗体结合来起始。为了评估补体活化,可进行CDC测定法,例如记载于Gazzano-Santoro等,J.Immunol Methods 202:163(1996)中的CDC测定法。例如在美国专利No.6,194,551 B1和WO1999/51642中描述了具有改变的Fc区氨基酸序列的多肽变体(具有变体Fc区的多肽)和具有增强或降低的C1q结合的多肽变体。
本发明的抗体的氨基酸序列和核苷酸序列
本发明首先采用重组人VEGFR2蛋白来免疫小鼠,然后通过噬菌体展示文库筛选获得与重组人VEGFR2蛋白特异性结合的高结合力scFv抗体克隆VEGFR2-MK19。之后采用PCR方法将编码VEGFR2-MK19 scFv抗体的重链和轻链可变区的核苷酸序列分别插入带人IgG1恒定区或人kappa恒定区核苷酸序列的pSTEP2载体中,进行培养表达。采用蛋白A纯化柱进行纯化获得高纯度人鼠嵌合抗体。ELISA测试表明,该抗VEGFR2嵌合抗体能够很好地阻断VEGFR2与其配体的结合及对HUVEC细胞的增殖作用。
然后,采用经典的人源化方式CDR移植方法,选择与鼠轻链或重链可变区最接近的人抗体轻链或重链可变区为模板,将鼠抗体轻链/重链的各3个CDR分别插入到上述人源模板的相应位置,获得人源化的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)序列。由于鼠源框架区的关键位点对于支撑CDR的活性至关重要,因此将关键点回复突变为鼠抗体的序列。分别将轻链/重链信号肽序列、回复突变的人源化抗体轻链/重链的可变区序列、人IgG1重链恒定区/人kappa轻链恒定区序列依次拼接,获得人源化抗体PD1-H944的氨基酸序列和核苷酸序列。
本发明的核酸
本发明还涉及编码本发明的抗体或其部分的核酸分子。这些核酸分子的序列包括但不限于SEQ ID NO:3-7、26-33和36-39。
本发明的核酸分子不限于本文公开的序列,还包括其变体。本发明中变体可以参照它们在杂交中的物理特性来描述。本领域技术人员会认识到利用核酸杂交技术,核酸可用于鉴别其互补物以及其等同物或同系物。还会认识到杂交可以以低于100%互补性发生。然而,考虑到条件的适当选择,杂交技术可用于基于DNA序列与特定探针的结构相关性来区分所述DNA序列。对于这类条件的指导参见Sambrook等,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,2nd Ed.;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989和Ausubel,F.M.,Brent,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Sedman,J.G.,Smith,J.A.,&Struhl,K.eds.(1995).Current Protocols in Molecular Biology.New York:JohnWiley and Sons。
重组载体和表达
本发明还提供了包含本发明的一个或多个核苷酸序列的重组构建体。通过将编码本发明的抗体的核酸分子插入载体例如质粒、噬粒、噬菌体或病毒载体中构建本发明的重组构建体。
本发明的抗体可通过在宿主细胞中重组表达编码轻链和重链或其部分的核苷酸序列来制备。为了以重组方法表达抗体,可用携带编码轻链和/或重链或其部分的核苷酸序列的一个或多个重组表达载体转染宿主细胞,以使得所述轻链和重链在所述宿主细胞中表达。标准重组DNA方法学被用于制备和/或获得编码重链和轻链的核酸、将这些核酸纳入重组表达载体中并且将所述载体引入至宿主细胞中,例如Sambrook,Fritsch and Maniatis(eds.),Molecular Cloning;A Laboratory Manual,Second Edition,Cold SpringHarbor,N.Y.,(1989)、Ausubel,F.M.等(eds.)Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing Associates,(1989)和Boss等的美国专利No.4,816,397中记载的那些。
合适的宿主细胞为原核细胞和真核细胞。原核宿主细胞的实例为细菌,真核宿主细胞的实例为酵母、昆虫或哺乳动物细胞。应理解,包括选择调节序列的表达载体的设计受到多种因素的影响,例如宿主细胞的选择、所需的蛋白质的表达水平以及表达是组成型的还是可诱导型的。
细菌表达
通过将编码所需抗体的结构DNA序列连同合适的翻译起始和终止信号以及有功能的启动子插入可操作阅读框中,来构建可用于细菌的可用表达载体。所述载体会包含一个或多个表型选择标记以及复制起点以确保维持所述载体,以及根据需要在宿主内提供扩增。用于转化的合适的原核宿主包括大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)以及假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)中的多个物种。
细菌载体可以是例如基于噬菌体、质粒或噬粒的。这些载体可含有选择标记和细菌复制起点,其来源于通常含有公知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)的元件的可商购的质粒。转化合适的宿主菌株并使所述宿主菌株生长至适当细胞密度之后,通过适当的方法(例如,温度变化或化学诱导)将所选择的启动子去阻遏/诱导,并且将细胞培养额外的时间。通常通过离心收获细胞,通过物理或化学方法使细胞破裂,并且保留所得的粗提取物用于进一步纯化。
在细菌系统中,根据所表达的蛋白的目的用途,可有利地选择多种表达载体。例如,当要生产大量这样的蛋白用于生产抗体或用于筛选肽文库时,例如,可能需要指导易于纯化的融合蛋白产物的高水平表达的载体。
哺乳动物表达和纯化
用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平蛋白表达的病毒元件,例如源于巨细胞病毒(CMV)的启动子和/或增强子(例如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)的启动子和/或增强子(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒的启动子和/或增强子(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。对病毒调节元件及其序列的进一步描述参见例如,Stinski的U.S.5,168,062、Bell等的U.S.4,510,245和Schaffner等的U.S.4,968,615。重组表达载体还可以包括复制起点和选择标记(参见例如,Axel等的U.S.4,399,216、U.S.4,634,665和U.S.5,179,017)。合适的选择标记包括赋予已经引入所述载体的宿主细胞对药物例如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性的基因。例如,二氢叶酸还原酶(DHFR)基因赋予对甲氨蝶呤的抗性,而neo基因赋予对G418的抗性。
将所述表达载体至宿主细胞中的转染可以利用标准技术例如电穿孔、磷酸钙沉淀和DEAE-葡聚糖转染来进行。
用于表达本文提供的抗体的合适的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)[包括dhfr-CHO细胞,记载于Urlaub和Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220中,使用DHFR选择标记,例如记载于R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621中]、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。
本发明的抗体可通过公知方法从重组细胞培养物回收和纯化,所述公知方法包括但不限于,硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、蛋白A亲和层析、蛋白G亲和层析、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法、羟磷灰石色谱法以及凝集素色谱法。高效液相色谱法(“HPLC”)也可用于纯化。参见例如,Colligan,CurrentProtocols in Immunology或Current Protocols in Protein Science,John Wiley &Sons,NY,N.Y.,(1997-2001),例如第1、4、6、8、9、10章,各自以引用的方式全文纳入本文。
本发明的抗体的特性和功能
对本发明的人源化VEGFR2-HK19抗体进行特性分析和功能分析。分析结果表明,本发明的抗体具备以下优势:(1)能够与VEGFR2抗原高亲和力特异性结合,具有低解离速率,从而提供良好的抗肿瘤药效;(2)与雷莫芦单抗相比,对于VEGFR2具有更高的结合亲和力;(实施例4)(3)VEGFR2-HK19阻断VEGF165蛋白结合VEGFR2的能力与雷莫芦单抗相近;(实施例4.2.1)(4)VEGFR2-HK19阻断VEGFR2-Fc重组蛋白与VEGF-C或VEGF-D结合的能力比雷莫芦单抗强;(实施例4.2.3)(5)VEGFR2-HK19阻断VEGF165、VEGF-C、VEGF-C+VEGF-D或VEGF-A+VEGF-C+VEGF-D对HUVEC细胞增殖作用的EC50均小于雷莫芦单抗;(实施例4.3.1和4.3.2)(6)VEGFR2-HK19具有比雷莫芦单抗更强的ADCC作用;(实施例4.4)和(7)在人源化KDR小鼠B16-F1黑色素癌皮下移植瘤模型中对B16-F1黑色素癌皮下移植瘤有明显的抑制作用。(实施例5)
用途
本发明的抗体可用于治疗黑色素瘤。本发明的抗体还可用于制备治疗所述病症的药物。
药物组合物
可将本发明的抗体与至少一种其他试剂(例如稳定化合物)制备成药物组合物,其包括本发明的抗体和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。任选地,所述药物组合物可包含另外的治疗剂。
试剂盒
本发明还涉及药物包装和包含一个或多个容器的试剂盒,所述容器含有上文提到的本发明的药物组合物。其上附有管理药物或生物制品的生产、使用或销售的政府机构规定形式提示,其反映该药物被上述机构批准用于人类给药。
制备和储存
本发明的药物组合物可以以本领域中已知的方式制备,例如通过常规的混合、溶解、造粒、锭剂制备、研磨、乳化、包裹、包埋或冻干方法。
在已经制备包含配制于可接受的载体中的本发明化合物的药物组合物之后,可以将它们放置在适当的容器中并贴上标签用于治疗所标明的病症。这类标签会包括给药的量、频率和方法。
药物组合
上述包含本发明的抗体的药物组合物还与一种或多种其他治疗剂,例如抗肿瘤剂组合,其中所得组合不会引起不可接受的不利影响。
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂公司购买。
实施例
实施例1:筛选特异阻断VEGFR2与VEGF结合的鼠源抗体
1.1小鼠免疫
采用重组人VEGFR2蛋白(北京义翘神州科技有限公司,UniProtKB-P35968/NP_002244.1)免疫Balb/c小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)。该重组人VEGFR2蛋白的胞外区Met1-Glu764氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
具体方法:将重组人VEGFR2蛋白与弗氏完全佐剂混合,使用混合物进行三次皮下注射免疫,每次免疫的蛋白剂量为50μg,免疫间隔依次为2周,3周。从第三次免疫起,免疫后七天经眼眶内眦静脉丛采血。采用ELISA方法,包被重组人VEGFR2蛋白以检测小鼠抗VEGFR2的血清效价。第三次免疫血清8000倍稀释后滴度达标(ELISA OD>1.0)后,间隔84天,使用25μg重组人VEGFR2蛋白进行静脉注射加强,4天之后处死小鼠,取小鼠的脾脏组织冻存于液氮中。
1.2噬菌体抗体展示文库构建
小鼠脾组织用TriPureHisolationReagent试剂(Roche,Cat.No.11 667 165 001)提取RNA,利用反转录试剂将RNA反转录获得cDNA文库,利用重叠延伸拼接PCR法[14-15],采用参考文献中2对引物扩增鼠抗体的轻链可变区,用另1对引物扩增重链可变区序列,将编码鼠抗体轻链和重链可变区序列的核苷酸序列拼接成编码抗体scFv的核苷酸序列,轻重链可变区通过接头接头(SEQ ID NO:2)连接,产生的DNA片段经限制性内切酶Sfi I酶切后连接到噬菌体载体pComb3x(北京义翘神州科技有限公司)中,电转X-Blue感受态获得小鼠的噬菌体展示scFv抗体库。
1.3 VEGFR2单克隆抗体筛选
参考噬菌体抗体淘选方法及流程[16],将重组人VEGFR2的第2到第3结构域蛋白VEGFR2-结构域2&3(北京义翘神州科技有限公司,10012-H08H3,NP_002244.1,Asp120-Lys327))包被在ELISA板上,加入抗体噬菌体孵育,洗去未结合的噬菌体,回收结合的噬菌体,如此重复,经多轮筛选富集获得抗VEGFR2阳性抗体噬菌体文库。从富集的文库中挑取单克隆噬菌体进行表达,用ELISA方法检测与重组人VEGFR2蛋白的结合,从多株单克隆中筛选获得与重组人VEGFR2特异性结合的scFv抗体,单克隆通过测序获得抗体的核苷酸序列,其中编码单克隆scFv抗体VEGFR2-MK19的核苷酸序列为SEQ ID NO:3)。
1.4 VEGFR2单克隆嵌合抗体的生产
基于1.3中筛选得到的与重组人VEGFR2特异性结合的scFv抗体生产VEGFR2单克隆嵌合抗体。以VEGFR2-MK19scFv为例,详述生产过程。通过PCR扩增VEGFR2-MK19 scFv抗体的重链核苷酸序列,通过in-fusion方法插入到带重链信号肽(SEQ ID NO:28)和人IgG1恒定区(SEQ ID NO:6)的经过ScaI/NheI(Fermentas)双酶切的pSTEP2载体中,获得人鼠嵌合重链(SEQ ID NO:36)表达载体。同理,PCR扩增VEGFR2-MK19 scFv抗体的轻链核苷酸序列,通过in-fusion方法插入到带轻链信号肽(SEQ ID NO:29)和人kappa恒定区(SEQ ID NO:7)的经过ScaI/BsiWI(Fermentas)酶切的pSTEP2载体中获得人鼠嵌合轻链(SEQ ID NO:37)表达载体。
扩增重链可变区引物:
F1 | GCTACCAGGGTGCTGAGTGAAGTGAAGCTGGTGGAG |
R1 | TGGGCCCTTGGTGCTAGCTGCAGAGACAGTGACCAG |
扩增轻链可变区引物:
F2 | GCCACAGGAGTGCATAGTGACATCAAAATGACTCAG |
R2 | TGGTGCAGCCACCGTACGTTTGATTTCCAGCTTGGT |
293E细胞用SCD4-4-TC2培养基(北京义翘神州科技有限公司)传代至200mL/瓶,起始接种密度在0.3~0.4*106个细胞/mL,放入温度为37℃转速为175rpm的CO2摇床中培养,待细胞密度达到1.5~3*106个细胞/mL后,按1∶1混合轻重链质粒DNA,分别向培养瓶中加入100μg混合后的质粒DNA和800μL的TF2转染试剂,放入温度为37℃转速为175rpm的摇床中继续培养至第7天收料。培养液4000rpm离心25min,收集上清,加入1/5上清液体积的stock缓冲液。用PBS将蛋白A层析柱平衡5-10倍柱体积,将过滤后的培养上清加入层析柱,再次平衡5-10倍柱体积后,用醋酸钠缓冲液洗脱样品。样品洗脱后用Tris中和至中性,获得高纯度嵌合抗体备用。
实施例2:VEGFR2嵌合抗体功能检测
2.1 ELISA方法检测嵌合抗体与重组蛋白VEGFR2-His结合
将浓度为0.1μg/mL的重组人VEGFR2-His蛋白包被于96孔板上,每孔100μL,4℃包被过夜。次日洗板,室温封闭1h后,分别加入100μL 2μg/mL的抗VEGFR2嵌合抗体孵育1h,洗板去除未结合抗体,加入检测二抗山羊抗人IgG Fc/HRP孵育后重复洗板,加入底物显色液进行显色,终止显示后,酶标仪读取OD450。以重组人VEGFR2抗体为横坐标,OD450读数为纵坐标,利用GraphPad Prism 6.0软件分析并绘制柱形图。结果见图1,其前述的衍生于VEGFR2-MK19 scFv的嵌合抗体mhK19和另一嵌合抗体mhX09与重组蛋白VEGFR2-His有较好的结合。
2.2 FACS检测嵌合抗体在VEGFR2过表达细胞系上的结合
以对数生长期的VEGFR2稳定表达细胞株293FT-VEGFR2-13-13(以下简称为293FT-VEGFR2)为实验材料,通过流式细胞仪FACS检测嵌合抗体在293FT-VEGFR2上的结合,同时设定293FT细胞株为阴性对照细胞进行检测。293FT-VEGFR2细胞和293FT细胞分别分装为5×105个细胞/管,体积50μL,加入浓度稀释为0.1μg/μL的抗VEGFR2嵌合抗体10μL,4℃混合孵育之后PBS清洗,离心去除未结合抗体,加入山羊抗人IgG Fc-FITC二抗4℃孵育,重复清洗并离心去上清,除去未结合的二抗,最后加入200μL PBS重悬细胞,400目滤网过滤至流式管中,随后用流式细胞仪检测。结果见图2,嵌合抗体mhK19、以及嵌合抗体mhT06、mhW03、mhX09和mhX12在293FT-VEGFR2细胞上有较好的特异性结合。
2.3嵌合抗体阻断VEGF165结合VEGFR2-His
将浓度为0.5μg/mL的重组VEGF165蛋白(北京义翘神州科技有限公司,11066-HNAB,VEGF165是VEGF-A最经典的剪切体)包被于96孔板上,每孔100μL,4℃包被过夜。次日洗板,室温封闭1h后,加入100μL 1μg/mL的重组VEGFR2-His蛋白,再加入浓度分别为2μg/mL和0.4μg/mL的VEGFR2嵌合抗体共同孵育1h,其中设定仅加入VEGFR2-His蛋白未加入抗体的孔为阳性孔,洗板去除未结合抗体,加入C-His-R023/HRP检测抗体孵育后重复洗板,加入底物显色液进行显色,终止后用酶标仪读取OD450,根据OD450读值计算不同浓度抗体阻断重组人VEGFR2-His蛋白与人VEGF165蛋白结合的竞争抑制率%,抗体竞争抑制率%=(阳性孔OD450-加入相应浓度VEGFR2抗体OD450)/阳性孔OD450×100%。结果见图3,mhK19、mhT06、mhU11、mhW03、mhX09和mhX12等嵌合抗体均能阻断重组人VEGFR2-His蛋白与人VEGF165蛋白的结合,mhK19在浓度为2μg/mL条件下抑制率能达到96%。
2.4嵌合抗体阻断VEGF165对HUVEC细胞的增殖作用
人脐静脉内皮细胞HUVEC按4×103个细胞/孔接种到96孔细胞培养板,在含有10%FBS及5%L-Gln的M199培养基(Gibco,11043023)中培养4h,然后按50μL/孔加入相应浓度的抗体,随后以10μL/孔加入终浓度为10ng/mL的VEGF165,设置检测空白孔B(无细胞)、阴性对照组M(接种细胞,不加样品,加VEGF165)和M’(接种细胞,不加样品及VEGF165)。将96孔板置于37℃、5%CO2细胞培养箱内培养3天后,按10μL/孔加入WST-8显色液(南京旋光科技有限公司,GLT008),将96孔板置CO2培养箱,显色稳定后用酶标仪测定450nm、630nm的吸光度。结果以OD450减去OD630得到样品检测值,各孔检测值减去空白孔B扣除背景后计算中和率,中和率%=(阴性对照M组OD值-样品OD值)/(阴性对照M组OD值-M’组OD值)×100%。结果见图4,嵌合抗体mhK19、mhW03和mhX09均具有较强的阻断VEGF165对HUVEC细胞增殖的作用。
实施例3:鼠抗体人源化改造及生产
根据实施例2中嵌合抗体功能检测结果,选取鼠抗体VEGFR2-MK19进行人源化改造及生产。
3.1鼠抗体轻链及重链CDR的确定
将实施例1.3中测定的VEGFR2-MK19scFv抗体核苷酸序列,推导得到VEGFR2-MK19scFv抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列,见SEQ ID NO:8/9。参考Kabat[17]以及IMGT编号方式,确定抗体VEGFR2-MK19scFv轻链及重链各3个CDR的氨基酸序列,见表1中SEQID NO:10-15,除HCDR2中第60位P突变为A外,上述的轻链及重链各3个CDR在后续人源化步骤中被移植且保留在最终获得的人源化抗体VEGFR2-HK19scFv中,见实施例3.2和3.3。
表1:VEGFR2-MK19轻链及重链CDR序列
名称 | 序列 |
LCDR1 | RASENIYSNLA(SEQIDNO:10) |
LCDR2 | SATDLAD(SEQ ID NO:11) |
LCDR3 | QQYWSIPT(SEQ ID NO:12) |
HCDR1 | GFTFSSYSMS(SEQ ID NO:13) |
HCDR2 | SISSGGSYIYYPDSVKG(SEQ ID NO:14) |
HCDR3 | SRVDEGFAY(SEQ ID NO:15) |
3.2鼠抗体CDR移植
鼠抗体人源化采用经典的CDR移植方法[18-19],选择分别与鼠轻链和重链可变区相似性均在50%以上,且重链可变区和轻链可变区的框架区分别与待改造抗体重链可变区和轻链可变区的框架区的氨基酸序列相似性在50%以上的抗体做为预人源化模板,从预人源化模板中选择与待改造抗体的可变区空间结构相似性最高的人源抗体做为人源化模板,将鼠抗体轻链或重链的3个CDR序列置换人源化模板中相应的CDR氨基酸序列,将HCDR2中第60位P突变为A。。用于VEGFR2-MK19的轻链可变区移植的人源模板为IGKV1-NL1*01,该模板与VEGFR2-MK19轻链的同源性为70.5%,重链可变区的人源模板为IGHV3-21*01,该模板与VEGFR2-MK19重链的同源性为81.6%。
3.3回复突变人源化可变区序列的框架区
由于鼠源框架区的关键点对于维持CDR空间结构的稳定性具有至关重要的作用,因此将关键点回复突变为鼠抗体的相应氨基酸,直至获得空间结构稳定的抗体共进行了以下突变:按照Kabat编号,将轻链的第43位回复突变为S,第45位回复突变为Q,第70位回复突变为H;重链的第42位回复突变为D,第44位回复突变为R,第49位回复突变为A。经CDR人源化移植和框架区回复突变获得人源化抗体VEGFR2-HK19,其重链和轻链氨基酸序列分别如SEQID NO:16/17所示;其含有信号肽的重链和轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO:18/19所示,分别包含依次连接的重链/轻链信号肽氨基酸序列(SEQ ID NO:20/21);其人源化抗体重链/轻链的可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:22/23);其人源化抗体的恒定区为人IgG1重链恒定区/人kappa轻链恒定区序列(SEQ ID NO:24/25)。改造后的抗体与嵌合抗体相比,其亲和力相近,并达到完全的人源化,人源化后的CDR序列,详见表2。
表2:VEGFR2-HK19轻链及重链CDR序列
名称 | 序列 |
LCDR1 | RASENIYSNLA(SEQIDNO:10) |
LCDR2 | SATDLAD(SEQ ID NO:11) |
LCDR3 | QQYWSIPT(SEQ ID NO:12) |
HCDR1 | GFTFSSYSMS(SEQ ID NO:13) |
HCDR2 | SISSGGSYIYYADSVKG(SEQ ID NO:50) |
HCDR3 | SRVDEGFAY(SEQ ID NO:15) |
3.4人源化抗体的生产
PCR扩增编码含有信号肽的VEGFR2-HK19抗体轻链核苷酸序列(SEQ ID NO:27),其中包含依次连接的轻链信号肽的核苷酸序列(SEQ ID NO:29)、人源化抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:31)和人kappa轻链恒定区的核苷酸序列(SEQ ID NO:33),通过in-fusion方法插入自主研发的经KpnI和XbaI双酶切后的pGS载体,通过测序验证获得正确的质粒。同样的,PCR扩增编码VEGFR2-HK19抗体重链核苷酸序列(SEQ ID NO:26),其中包含依次连接的重链信号肽的核苷酸序列(SEQ ID NO:28)、人源化抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:30)和人IgG1重链恒定区的核苷酸序列(SEQ ID NO:32),通过in-fusion方法插入已经构建正确的包含轻链的pGS载体(经NheI和NotI双酶切)中,通过测序验证获得正确的VEGFR2-HK19轻重链表达载体。该表达载体是包含GS筛选基因和抗体轻、重链的表达元件的真核细胞表达载体。将该表达载体转染至CHO-K1-GS缺陷的细胞中,经MSX筛选获得VEGFR2-HK19高表达细胞株。采用ELISA检测选取高表达的克隆,并结合细胞生长的状态和抗体药物的关键质量属性分析结果筛选获得高表达细胞稳定株。采用无血清加料悬浮培养的方式培养生产VEGFR2-HK19的CHO细胞株,纯化获得高质量VEGFR2-HK19抗体。
实施例4:人源化抗体特性分析
4.1人源化抗体与VEGFR2抗原结合的亲和力分析
4.1.1人源化抗体VEGFR2-HK19与重组人VEGFR2-His蛋白的结合
将不同浓度(0.5ng/mL、1.4ng/mL、4.1ng/mL、12.3ng/mL、37ng/mL、111.1ng/mL、333.3ng/mL、1000ng/mL、3000ng/mL和9000ng/mL)的重组人VEGFR2-His蛋白包被于96孔板上,每孔100μL,4℃包被过夜。次日洗板,室温封闭1h后,分别加入100μL 2μg/mL的VEGFR2-HK19、雷莫芦单抗(Eli Lilly,C839381C)和阴性对照抗体(H7N9-R1)孵育1h,之后洗板去除未结合抗体,加入二抗山羊抗人IgG Fc/HRP孵育后重复洗板,加入底物显色液进行显色,终止后酶标仪读取OD450。以重组人VEGFR2-His蛋白浓度为横坐标,OD450读数为纵坐标,利用GraphPad Prism 6.0软件拟合S型曲线并分析抗体与重组人VEGFR2-His蛋白结合的EC50。结果见图5,人源化分子VEGFR2-HK19与重组人VEGFR2-His的特异性结合EC50为191.5ng/mL,R2=0.999;雷莫芦单抗结合的EC50为162.1ng/mL,R2=0.997;VEGFR2-HK19结合重组人VEGFR2-His蛋白的能力与雷莫芦单抗相近。
4.1.2人源化抗体VEGFR2-HK19与重组293FT-VEGFR2细胞的结合
用流式细胞仪FACS检测人源化抗体VEGFR2-HK19及雷莫芦单抗(Eli Lilly,C839381C)在VEGFR2表达细胞上的结合,H7N9-R1为阴性对照抗体。293FT-VEGFR2细胞分别分装为3×105个细胞/管,体积为50μL,加入不同浓度(2nM、6nM、17nM、51nM、154nM、463nM和1389nM)的VEGFR2-HK19、雷莫芦单抗和H7N9-R1抗体各10μL,4℃混合孵育之后PBS洗液清洗,离心去除未结合抗体,加入山羊抗人IgG Fc-FITC二抗4℃孵育,重复清洗并离心去上清,除去未结合的二抗,最后加入200μL PBS重悬细胞,400目滤网过滤至流式管中,在流式细胞仪上进行检测。图6显示,VEGFR2-HK19抗体在293FT-VEGFR2细胞上的结合与雷莫芦单抗相近。
4.1.3人源化抗体VEGFR2-HK19与重组人VEGFR2-生物素蛋白的亲和力
利用Octet生物分子相互作用分析系统(型号:Octet RED,厂家:Fortebio)测定多个浓度梯度(0.42nM、0.90nM、1.74nM、3.47nM、6.94nM)的VEGFR2-HK19,和雷莫芦单抗(EliLilly,C839381C)与生物素化VEGFR2-生物素的亲和力。如表3,VEGFR2-HK19与重组人VEGFR2-生物素蛋白结合的KD值为1.06*10-11M,结合速率常数kon值为8.26E+05M-1s-1,解离速率常数kdis值为8.75E-06s-1;雷莫芦单抗与VEGFR2蛋白结合亲和力KD值为4.58*10-11M,结合速率常数kon值为3.86E+05M-1s-1,解离速率常数kdis值为1.77E-05s-1。VEGFR2-HK19亲和力约为雷莫芦单抗亲和力的4.32倍,并且VEGFR2-HK19具有更慢的解离速率,因此VEGFR2-HK19比雷莫芦单抗具有更强的结合VEGFR2-生物素蛋白的能力。
表3.OCTET检测VEGFR2-HK19与VEGFR2-生物素结合
4.1.4人源化抗体VEGFR2-HK19种属交叉结合
将重组人VEGFR2-His蛋白、重组小鼠mKDR-His蛋白和重组大鼠ratVEGFR2-His蛋白分别按0.04μg/mL、10μg/mL、10μg/mL的浓度包被于96孔板上,每孔100μL,4℃包被过夜。次日洗板,室温封闭1h,分别加入100μL浓度为2μg/mL的VEGFR2-HK19、雷莫芦单抗分子(北京义翘神州科技有限公司)、阴性对照抗体(H7N9-R1)孵育1h,洗板去除未结合抗体,加入检测二抗山羊抗人IgG Fc/HRP孵育后重复洗板,加入底物显色液进行显色,终止后酶标仪读取OD450。以蛋白浓度为横坐标,OD450读数为纵坐标,利用GraphPad Prism 6.0软件做柱状图。结果如图7显示,VEGFR2-HK19和雷莫芦单抗分子与重组人VEGFR2-His蛋白有特异性结合,与重组小鼠mKDR-His蛋白和重组大鼠ratVEGFR2-His蛋白无交叉结合。
4.2配体封闭
4.2.1人源化抗体VEGFR2-HK19阻断VEGFR2-His重组蛋白与VEGF165结合
将浓度为0.5μg/mL的重组VEGF165蛋白包被于96孔板上,每孔100μL,4℃包被过夜。次日洗板,室温封闭1h后,加入100μL浓度为1μg/mL的重组VEGFR2-His蛋白,蛋白孔中同时加入100μL不同浓度(1.37ng/mL、4.12ng/mL、12.35ng/mL、37.04ng/mL、111.11ng/mL、333.33ng/mL、1000ng/mL、3000ng/mL和9000ng/mL)的VEGFR2-HK19、雷莫芦单抗((EliLilly,C839381C))和阴性对照抗体H7N9-R1,并且定仅加入VEGFR2-His蛋白未加入抗体的孔为阳性孔,样品室温孵育1h,洗板去除未结合抗体,加入C-His-R023/HRP检测抗体孵育后重复洗板,加入底物显色液进行显色,终止后酶标仪读取OD450,根据OD450读值计算不同浓度抗体阻断重组人VEGFR2蛋白与人VEGF165蛋白结合的竞争抑制率%,抗体竞争抑制率%=(阳性孔OD450-加入相应浓度VEGFR2抗体OD450)/阳性孔OD450×100%。以抗体浓度为横坐标,抑制率为纵坐标,利用GraphPad Prism 6.0软件拟合S型曲线并分析抗体阻断VEGFR2-His蛋白与VEGF165结合的EC50。结果如图8显示,VEGFR2-HK19阻断VEGFR2重组蛋白与VEGF165结合的EC50为283.4ng/mL,R2=0.994,雷莫芦单抗阻断VEGFR2重组蛋白与VEGF165结合的EC50为275.2ng/mL,R2=0.988,VEGFR2-HK19阻断VEGF165蛋白结合VEGFR2的能力与雷莫芦单抗相近。
4.2.2人源化抗体VEGFR2-HK19阻断293FT-VEGFR2细胞系与VEGF165结合
用流式细胞仪FACS检测人源化抗体VEGFR2-HK19及雷莫芦单抗(Eli Lilly,C839381C)对VEGFR2过表达细胞与重组蛋白VEGF165结合的影响,H7N9-R1为阴性对照抗体。293FT-VEGFR2细胞分别分装为3×105个细胞/管,体积为50μL,加入不同浓度(2777.8nM、925.9nM、308.6nM、102.9nM、34.3nM、11.4nM和3.8nM)的VEGFR2-HK19、雷莫芦单抗和H7N9-R1抗体各10μL,于4℃孵育20min之后加入2.5μg体内生物素标记的VEGF165蛋白(北京义翘神州科技有限公司,11066-H27H-B)混合孵育,设定未加入抗体仅有VEGF165蛋白的细胞孔为阳性对照孔,PBS洗液清洗,离心去除未结合抗体,加入Strepavidin Alexa fluor488二抗4℃孵育,重复清洗并离心去上清,除去未结合的二抗,最后加入200μL PBS重悬细胞,400目滤网过滤至流式管中,在流式细胞仪上检测。根据VEGF165蛋白与VEGFR2过表达细胞结合的平均荧光强度(MFI)分析抗体阻断二者结合的抑制率(%),抑制率(%)=(MFI阳性-MFI样品)/MFI阳性*100%,MFI阳性为无抗体仅加入VEGF165蛋白与VEGFR2细胞结合的MFI值,MFI样品为加入抗体后VEGF165蛋白与VEGFR2细胞结合的MFI值。结果如图9所示,VEGFR2-HK19抗体能够阻断VEGF165蛋白与VEGFR2过表达细胞的结合。
4.2.3人源化抗体VEGFR2-HK19阻断VEGFR2-Fc重组蛋白与VEGF-C或VEGF-D结合
将浓度为5μg/mL的重组VEGFR2-Fc(北京义翘神州科技有限公司,10012-H02H)蛋白包被于96孔板上,每孔100μL,4℃包被过夜。次日洗板,室温封闭1h后,分别加入100μL浓度为0.5μg/mL的重组VEGF-C(北京义翘神州科技有限公司)蛋白,或2μg/mL的重组VEGF-D(北京义翘神州科技有限公司)蛋白,蛋白孔中同时加入100μL不同浓度(4.12ng/mL、12.35ng/mL、37.04ng/mL、111.11ng/mL、333.33ng/mL、1000ng/mL、3000ng/mL和9000ng/mL)的VEGFR2-HK19、雷莫芦单抗(Eli Lilly,C839381C)和阴性对照抗体H7N9-R1,其中设定仅加入VEGF-C-His蛋白或VEGF-D-His未加入抗体的孔为阳性孔,样品室温孵育1h,洗板去除未结合抗体,加入C-His-R023/HRP检测抗体孵育后重复洗板,加入底物显色液进行显色,终止后酶标仪读取OD450,根据OD450读值计算不同浓度抗体阻断重组人VEGFR2蛋白与人VEGF-C或VEGF-D蛋白结合的竞争抑制率%,抗体竞争抑制率%=(阳性孔OD450-加入相应浓度VEGFR2抗体OD450)/阳性孔OD450×100%。以抗体浓度为横坐标,抑制率为纵坐标,利用GraphPad Prism 6.0软件分别拟合S型曲线并分析抗体阻断VEGFR2-Fc蛋白与VEGF-C或VEGF-D结合的EC50。
结果见图10和图11,VEGFR2-HK19阻断VEGFR2-Fc重组蛋白与VEGF-C结合的EC50为57.3ng/mL,R2=0.999,雷莫芦单抗阻断VEGFR2重组蛋白与VEGF-C结合的EC50为70.9ng/mL,R2=0.999;VEGFR2-HK19阻断VEGFR2重组蛋白与VEGF-D结合的EC50为76.7ng/mL,R2=0.998,雷莫芦单抗阻断VEGFR2重组蛋白与VEGF-D结合的EC50为85.9ng/mL,R2=0.998;综上,VEGFR2-HK19阻断VEGFR2-Fc重组蛋白与VEGF-C或VEGF-D结合的能力比雷莫芦单抗强。
4.3人源化抗体VEGFR2-HK19的生长抑制作用
4.3.1人源化抗体VEGFR2-HK19阻断VEGF165或VEGF-C对HUVEC细胞的增殖作用
HUVEC细胞按4×103个细胞/孔接种到96孔细胞培养板,在含有10%FBS及5%L-Gln的M199培养基(Gibco,11043023)中培养4h,然后按50μL/孔加入相应浓度的抗体,随后以10μL/孔加入终浓度为10ng/mL的VEGF165或者终浓度为1000ng/mL的VEGF-C,设置检测空白孔B(无细胞)、阴性对照组M(接种细胞,不加样品,加VEGF165或VEGF-C)和M’(接种细胞,不加样品及VEGF165或VEGF-C)。将96孔板置于37℃、5%CO2细胞培养箱内培养3天后,按10μL/孔加入WST-8显色液(南京旋光科技有限公司,GLT008),将96孔板置CO2培养箱,显色稳定后用酶标仪测定450nm、630nm的吸光度。结果以OD450减去OD630得到样品检测值,各孔检测值减去空白孔B以扣除背景后计算中和率,中和率%=(阴性对照M组OD值-样品OD值)/(阴性对照M组OD值-M’组OD值)×100%,采用统计软件GraphPad Prism的自动分析功能计算标准曲线,横坐标为样品浓度,纵坐标为中和率,用四参数回归方程拟合得到“S”型曲线,计算样品半数有效浓度(EC50)。结果如图12、13和表4,虽然VEGFR2-HK19与雷莫芦单抗(EliLilly,C839381C)阻断VEGF165或VEGF-C对HUVEC细胞增殖作用的最大中和率相当,但是VEGFR2-HK19的EC50浓度均小于雷莫芦单抗,提示VEGFR2-HK19的生长抑制活性更好。
表4.VEGFR2-HK19中和VEGF165或VEGF-C对HUVEC细胞增殖作用的EC50及最大中和率
4.3.2人源化抗体VEGFR2-HK19阻断不同亚型VEGF组合物对HUVEC细胞的增殖作用
HUVEC细胞按4×103个细胞/孔接种96孔细胞培养板,在含有10%FBS及5%L-Gln的M199培养基(Gibco,11043023)中培养4h,然后按50μL/孔加入相应浓度的抗体,随后以10μL/孔加入VEGF-C(1000ng/mL)与VEGF-D(8181ng/mL)的混合物,或者VEGF165(25ng/mL)与VEGF-C(1000ng/mL)及VEGF-D(5455ng/mL)的混合物。设置检测空白孔B(无细胞)、阴性对照组M(接种细胞,不加样品,加VEGF)和M’(接种细胞,不加样品及VEGF)。将96孔板置于37℃、5%CO2细胞培养箱内培养3天后,按10μL/孔加入WST-8显色液(南京旋光科技有限公司,GLT008),将96孔板置CO2培养箱,显色稳定后用酶标仪测定450nm、630nm的吸光度。结果以OD450减去OD630得到样品检测值,各孔检测值减去空白孔B扣除背景后计算中和率,中和率%=(阴性对照M组OD值-样品OD值)/(阴性对照M组OD值-M’组OD值)×100%,采用统计软件GraphPad Prism的自动分析功能计算标准曲线,横坐标为样品浓度,纵坐标为中和率,用四参数回归方程拟合得到“S”型曲线,计算样品半数有效浓度(EC50)。结果如图14、15和表5,尽管VEGFR2-HK19与雷莫芦单抗(Eli Lilly,C839381C)阻断VEGF-C+VEGF-D对HUVEC细胞增殖作用的最大中和率相当,且VEGFR2-HK19阻断VEGF-A+VEGF-C+VEGF-D对HUVEC细胞增殖作用的最大中和率略小于雷莫芦单抗,但是VEGFR2-HK19的EC50浓度均小于雷莫芦单抗,提示VEGFR2-HK19的生长抑制活性更好。
表5.VEGFR2-HK19中和不同亚型的VEGF组合物对HUVEC细胞增殖作用的EC50及最大中和率
4.4人源化抗体VEGFR2-HK19的ADCC作用
本实施例中采用重组CD16A报告基因系统方法测定VEGFR2-HK19介导的ADCC效应,效应细胞为Jurkat-NFAT-Luc2p-CD16A,而靶细胞为293FT-VEGFR2,当两种细胞共培养的同时加入VEGFR2-HK19后,VEGFR2-HK19的Fab段与靶细胞上过表达的VEGFR2结合,其Fc段可与过表达FcγIII型受体(CD16A)的效应细胞结合,从而激活效应细胞Jurkat-NFAT-Luc2p-CD16A并促进NFAT-RE介导的生物发光。具体而言,将靶细胞293FT-VEGFR2按2×104个细胞/孔接种于96孔板,在含有10%FBS的DMEM培养基中培养过夜,去掉上清,用含0.5g/L PF68(北京义翘神州科技有限公司)的无酚红RPMI 1640培养基清洗两遍,然后按40μL/孔加入相应浓度的抗体,随后以40μL/孔加入1×105个效应细胞Jurkat-NFAT-Luc2p-CD16A,每组设3个复孔,同时设靶细胞、效应细胞和阴性对照组(加靶细胞及效应细胞,不加样品)。置于37℃、5%CO2条件下培养4h后,按20μL/孔加入Passive Lysis 5X Buffer(Promega,E1941),震荡混匀后每孔取20μL上清液转移至96孔白底板,通过LB960-微孔板式发光检测仪检测荧光信号。利用GraphPad Prism软件分析并绘制量效曲线,横坐标为样品的浓度,纵坐标为化学发光强度(RLU),计算EC50及诱导倍数(样品RLU/阴性对照组RLU)。
如图16和表6所示,雷莫芦单抗(Eli Lilly,C839381C)介导ADCC作用的能力较弱,而VEGFR2-HK19具有较强的ADCC作用。
表6.VEGFR2-HK19介导ADCC作用的EC50及最大诱导倍数
4.5人源化抗体VEGFR2-HK19的表位
4.5.1人源化抗体VEGFR2-HK19与结构域蛋白结合
实施例4.2中证实VEGFR2-HK19能够阻断配体VEGF165与VEGFR2的结合,证明VEGFR2-HK19的表位与配体相近,而文献报道VEGF165结合在VEGFR2胞外区的第2和第3结构域[2]。为了表征VEGFR2-HK19抗体的表位,本实施例中用ELISA法检测VEGFR2的结构域蛋白(VEGFR2-结构域2&3)和胞外区重组蛋白VEGFR2-His与VEGFR2-HK19的结合,结果详见表6,VEGFR2-HK19与VEGFR2-结构域2&3和VEGFR2-His无显著性差异,表明VEGFR2-HK19结合在VEGFR2的第2到第3结构域,且与配体VEGF165在VEGFR2的结合可能存在表位重叠。
4.5.2分子模拟预测人源化抗体VEGFR2-HK19表位
为了深入了解VEGFR2-HK19与VEGFR2蛋白界面相互作用,本实施例中利用分子模拟及对接法,用DS 4.0(Accelrys Software Inc.)中的Antidody model程序对VEGFR2-HK19进行同源建模,从PDB数据库中提取VEGFR2蛋白三维结构(PDB ID:3V2A),经过ProteinPreparation程序初始化。VEGFR2-HK19模型和VEGFR2结构通过ZDOCK程序进行对接,根据对接结果,对打分函数前十位的对接进行RDOCK优化,最优的模型(图17)经ProteinInterface Analysis程序进一步分析。对接模型界面显示,VEGFR2-HK19与VEGFR2蛋白关键结合肽序列分别为结构域2的137YITENK142以及结构域3的255GIDFNWEY262、310SSGLMTKK317。
4.5.3 VEGFR2突变蛋白验证人源化抗体VEGFR2-HK19结合关键位点
为了进一步确认VEGFR2-HK19结合的关键位点,根据上述4.5.2实施例中预测的VEGFR2-HK19与VEGFR2蛋白的关键结合肽序列,设计并生产一系列VEGFR2蛋白突变体,ELISA测定突变体与VEGFR2-HK19、上市抗体雷莫芦单抗(Eli Lilly,C839381C)和配体VEGF-A的结合能力。结果显示VEGFR2-HK19与VEGFR2蛋白突变体结合有不同程度的降低(表7),VEGFR2-HK19主要结合在Y137A/K142A、D257A、S311A/G312A、L313A和T315A等关键位点,该结果与4.5.2实施例中对接模型分析结果基本吻合,验证了模型的准确性。VEGF与雷莫芦单抗抗体的关键位点文献报道的晶体结构基本吻合[20-21]。Y137A/K142A、R164S/Y165A、D257A、S311A/G312A等为同时影响VEGFR2-HK19和配体VEGF-A结合VEGFR2的关键点,证明VEGFR2-HK19抗体与VEGF-A存在表位交叠(图18),由于抗体的亲和力大于配体,VEGFR2-HK19可通过直接阻断VEGF-A与VEGFR2的结合来发挥作用。此外,VEGFR2-HK19与上市药物雷莫芦单抗存在表位差异例如R222A为雷莫芦单抗的关键位点,但对VEGFR2-HK19结合并无影响,因此二者表位的不同可能对于解释ADCC功能的差异有重要的指导意义。
实施例5:人源化抗体VEGFR2-HK19对KDR人源化小鼠B16-F1黑色素瘤皮下移植瘤模型的抗肿瘤作用研究
KDR人源化小鼠(中国食品药品检定研究院)右侧胁肋部皮下接种大小为约2×2×2(mm3)的B16-F1瘤块,共接种39只(雌性20只,雄性19只)。当肿瘤体积约100mm3左右时分组给药,根据个体肿瘤体积挑选小鼠入组,采用excel软件将动物按瘤体积随机分为4组,每组6只(雌雄各3只),第1组为空白对照组,第2组为实验组(VEGFR2-HK19),其中第3、4组为与本申请无关的其他抗VEGFR2抗体,因此不呈现相关数据。分组当天开始腹腔注射(I.P.)给药,实验组剂量为15mg/kg,空白对照组(Vehicle)注射等体积的溶剂,每周给药2次,连续给5次,具体给药方案见下表8。通过计算肿瘤生长抑制率TGI(%)评价药物的抗肿瘤作用:TGI(%)<60%为无效;TGI(%)≥60%,且经统计学处理实验组瘤体积显著低于溶剂对照组(P<0.05)为有效,即对肿瘤生长具有显著抑制作用。
TGI(%)=[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100,其中:
Ti:实验组在给药第i天的肿瘤体积均值,
T0:实验组在给药第0天的肿瘤体积均值,
Vi:溶剂对照组在给药第i天的肿瘤体积均值,
V0:溶剂对照组在给药第0天的肿瘤体积均值。
表8.试验分组及给药方案
a:给药容积依实验动物体重按1mL/kg计算。
除对照组因肿瘤体积过大出现部分动物死亡外,实验组动物在给药期间的活动和进食等状态良好,体重均有一定程度的上升,且实验组和对照组给药后动物体重无显著性差异(P>0.05)。所有动物体重变化情况见图19及表9。
表9.VEGFR2-HK19对B16-F1黑色素瘤皮下移植瘤模型中KDR人源化小鼠体重的影响
a:均数±标准误;
b:实验组体重与溶剂对照组体重在给药17天后统计学比较,t检验;
c:组1实验终点为2只小鼠。
末次给药4天后,受试动物均被安乐死,测量并计算肿瘤体积,结果见表10和图20。试验结束时,溶剂对照组平均肿瘤体积为6245±921mm3,实验组(VEGFR2-HK19)平均肿瘤体积为1708±420mm3,TGI为73.59%,与溶剂对照组的肿瘤体积相比有显著差异(P=0.0021)。表明供试抗体VEGFR2-HK19结合KDR表位在B16-F1黑色素癌皮下移植瘤模型上是有效的,在15mg/kg剂量水平下对B16-F1黑色素癌皮下移植瘤有明显的抑制作用。
表10.VEGFR2-HK19对KDR人源化小鼠B16-F1黑色素瘤皮下移植瘤模型中肿瘤体积的影响
a:实验组肿瘤体积与溶剂对照组肿瘤体积统计学比较,t检验。
实施例6:人源化抗体VEGFR2-HK19在小鼠体内的药代动力学和免疫原性研究
抗体VEGFR2-HK19的小鼠药代动力学在CD1小鼠体内考察:以5mg/kg剂量分别经尾静脉和皮下注射给予CD-1小鼠,每组6只,雌雄各半,于药前、药后0.5h(i.v.组)、2h、4h、6h、24h、48h、72h、96h、168h、336h、504h、672h采血。采用间接ELISA法检测血清中VEGFR2-HK19抗体的浓度,并通过Phoenix-WinNonlin 6.4软件中非房室模型(NCA)计算药代动力学参数,用桥联ELISA法对全部动物在注射给药后168、336、504、672h时的血样进行抗药抗体检测。
(1)药代动力学结果
通过ELISA法检测CD-1小鼠血清中VEGFR2-HK19抗体浓度,血药浓度时间曲线如图21所示,药代动力学参数如表11所示。5mg/kg剂量的VEGFR2-HK19抗体静脉及皮下给予CD-1小鼠,动物雌雄间未见明显差异,静脉和皮下给药的Cmax分别为77.77和32.00μg/mL,AUClast分别为11702.39和11033.42h*μg/mL,皮下给药的绝对生物利用度为94.28%。两种给药方式下t1/2、Vz、Cl等参数基本一致。
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序列表
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/>
参考文献:
1.Ferrara N.The role of vascular endothelial growth factor inpathological angiogenesis[J].Breast Cancer Res Treat,1995,36(2):127-137.
2.Holmes K,Roberts O L,Thomas A M,et al.Vascular endothelial growthfactor receptor-2:Structure,function,intracellular signalling and therapeuticinhibition[J].Cellular Signalling,2007,19(10):2003-2012.
3.Thieltges K M,Avramovic D,Piscitelli C L,et al.Characterization ofa drug-targetable allosteric site regulating vascular endothelial growthfactor signaling[J].Angiogenesis,2018.
4.Yang Y,Xie P,Schlessinger O J.Direct Contacts between ExtracellularMembrane-Proximal Domains Are Required for VEGF Receptor Activation and CellSignaling[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America,2010,107(5):1906-1911.
5.Talar-Wojnarowska R,,Gasiorowska A,Olakowski M,et al.Vascularendothelial growth factor(VEGF)genotype and serum concentration in patientswith pancreatic adenocarcinoma and chronic pancreatitis[J].Journal ofPhysiology & Pharmacology An Official Journal of the Polish PhysiologicalSociety,2010,61(6):711.
6.Harlozinska A,Sedlaczek P,Kulpa J,et al.Vascular endothelial growthfactor(VEGF)concentration in sera and tumor effusions from patients withovarian carcinoma.[J].Anticancer research,2004,24(2C):1149-57.
7.Takahashi S,Li X G,Chiba A.Concentration of Vascular EndothelialGrowth Factor in the Serum and Tumor Tissue of Brain Tumor Patientsl[J].Cancer Research,1996,56(9):2185-2190.
8.Wadhwa R,Taketa T,Sudo K,et al.Ramucirumab:a novel antiangiogenicagent[J].Future Oncology,2013,9(6):789-795.
9.Wilke H,Muro K,Van C E,et al.Ramucirumab plus paclitaxel versusplacebo plus paclitaxel in patients with previously treated advanced gastricor gastro-oesophageal junction adenocarcinoma(RAINBOW):a double-blind,randomised phase 3 trial.[J].Lancet Oncology,2014,15(11):1224-1235.
10.Garon E B,Ciuleanu T E,Arrieta O,et al.Ramucirumab plus docetaxelversus placebo plus docetaxel for second-line treatment of stage IV non-small-cell lung cancer after disease progression on platinum-based therapy(REVEL):a multicentre,double-blind,randomised phase 3 trial[J].The Lancet,2014,384(9944):665-673.
11.Garciacarbonero R,Obermannova R,Bodoky G,et al.O-020Quality-of-life results from RAISE:randomized,double-blind phase III study of FOLFIRIplus ramucirumab or placebo in patients with metastatic colorectal carcinomaafter first-line therapy with bevacizumab,oxaliplatin,and a fluoropyrimidine[J].Annals of Oncology,2015,26(suppl 4):iv 115-iv115.
12.Mackey J R,Ramosvazquez M,Lipatov O,et al.Primary results of ROSE/TRIO-12,a randomized placebo-controlled phase III trial evaluating theaddition of ramucirumab to first-line docetaxel chemotherapy in metastaticbreast cancer.[J].Journal of Clinical Oncology Official Journal of theAmerican Society of Clinical Oncology,2015,33(2):141.
13.Saif M W,Elfiky A,Salem R R.Gastrointestinal Perforation Due toBevacizumab in Colorectal Cancer[J].Annals of Surgical Oncology,2007,14(6):1860-1869.
14.Jones S T,Bendig M M.Rapid PCR-Cloning of Full-Length MouseImmunoglobulin Variable Regions[J].Bio/Technology,1991,9(1):88-89.
15.Orlandi R,Gussow D H,Jones P T,et al.Cloning immunoglobulinvariable domains for expression by the polymerase chain reaction.[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1989,86(10):3833-3837.
16.Antibody Phage Display:Methods and Protocols,Philippa M.O’Brienand Robert Aitken(Eds),Humana Press,ISBN:9780896037113)
17.Kabat E A,1914-.Sequences of proteins of immunological interest[J].1991.
18.Jones P T,Dear P H,Foote J,et al.Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse[J].Nature,1986,321(6069):522-525.
19.Verhoeyen M,Riechmann L.Engineering of antibodies[J].Bioessays,1988,8(2-3):74-78.
20.Brozzo M S,Bjelic S,Kisko K,et al.Thermodynamic and structuraldescription of allosterically regulated VEGFR-2 dimerization[J].Blood,2012,119(7):1781-1788.
21.Franklin M,Navarro E,Wang Y,et al.The Structural Basis for theFunction of Two Anti-VEGF Receptor 2 Antibodies[J].Structure,2011,19(8):1097-1107.
Claims (28)
1. 一种分离的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段,其包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示的重链CDR1域、氨基酸序列如SEQ IDNO:14或SEQ ID NO:50所示的重链CDR2域和氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的重链CDR3域,和所述轻链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的轻链CDR1域、氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的轻链CDR2域和氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的轻链CDR3域。
2. 如权利要求1所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段,包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8具有至少90%、92%、95%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9具有至少90%、92%、95%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
3.如权利要求1所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段,其中所述抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段是人源化抗体。
4.如权利要求1所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段,其中所述抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段是嵌合抗体。
5. 如权利要求3所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段,其中所述抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:22具有至少85%、90%、95%或99%序列同一性的氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23具有至少85%、90%、95%或99%序列同一性的轻链可变区。
6.如权利要求1-5任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体进一步包含轻链恒定区和重链恒定区。
7. 如权利要求6所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段,其中所述轻链恒定区为氨基酸序列为SEQ ID NO:25的kappa轻链恒定区的氨基酸序列或与SEQ ID NO:25具有至少90%、92%、95%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列,和/或所述重链恒定区为与氨基酸序列为SEQID NO:24的IgG1重链恒定区的氨基酸序列或与SEQ ID NO:24具有至少90%、92%、95%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
8.如权利要求1-5中任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段,其为IgG抗体。
9.如权利要求8所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段,其为IgG1抗体。
10.如权利要求1-5中任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段,其为单克隆抗体。
11. 如权利要求1-5中任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段,其与重组VEGFR2的结合亲和力KD为1-100 pM。
12. 如权利要求11所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段,其与重组VEGFR2的结合亲和力KD为5-50 pM。
13. 如权利要求11所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段,其与重组VEGFR2的结合亲和力KD为10.6 pM。
14.如权利要求1-5任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段,其中所述抗原结合片段为Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2或单链抗体分子。
15.如权利要求14所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段,其中所述单链抗体分子为scFv、di-scFv、tri-scFv、双体抗体或scFab。
16.一种抗体-药物缀合物,其包含如权利要求1-15任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段和另外的治疗剂。
17.如权利要求16所述的抗体-药物缀合物,其中所述抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段和另外的治疗剂通过接头连接。
18.一种核酸,其编码根据权利要求1-15任一项的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段。
19. 如权利要求18所述的核酸,其包含如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列和/或如SEQID NO:5所示的核苷酸序列,或者其包含如SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列和/或如SEQ IDNO:31所示的核苷酸序列。
20.一种表达载体,其包含如权利要求18或19所述的核酸。
21.一种宿主细胞,其包含如权利要求18或19所述的核酸或如权利要求20所述的表达载体。
22.一种用于产生如权利要求1-15任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段的方法,包括在适合于抗体表达的条件下培养如权利要求21所述的宿主细胞,和从培养基中回收表达的抗体。
23.一种药物组合物,包含如权利要求1-15任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段或如权利要求16或17所述的抗体-药物缀合物,及药学上可接受的载体。
24.如权利要求1-15任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段或如权利要求16或17所述的抗体-药物缀合物或如权利要求23所述的药物组合物,其用于治疗黑色素瘤。
25.如权利要求1-15任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段或如权利要求16或17所述的抗体-药物缀合物或如权利要求23所述的药物组合物在制备用于治疗黑色素瘤的药物中的用途。
26.一种药物组合产品,其包含如权利要求1-15任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段或如权利要求16或17所述的抗体-药物缀合物或如权利要求23所述的药物组合物,及一种或多种另外的治疗剂。
27.一种试剂盒,其包含如权利要求1-15任一项所述的抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段或如权利要求16或17所述的抗体-药物缀合物或如权利要求23所述的药物组合物。
28.如权利要求27所述的试剂盒,其进一步包含给药的装置。
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---|---|---|---|---|
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EP4323408A1 (en) * | 2021-04-14 | 2024-02-21 | Suzhou Transcenta Therapeutics Co., Ltd. | Novel anti-hvegfr2 antibodies |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013067098A1 (en) * | 2011-11-02 | 2013-05-10 | Apexigen, Inc. | Anti-kdr antibodies and methods of use |
CN105646710A (zh) * | 2014-11-17 | 2016-06-08 | 四川科伦药物研究院有限公司 | 一种全人源化抗vegfr-2单克隆抗体及其制备方法 |
CN106188296A (zh) * | 2016-07-19 | 2016-12-07 | 中山康方生物医药有限公司 | 一类抗血管内皮生长因子受体vegfr2的单克隆抗体及其编码基因和应用 |
CN106892980A (zh) * | 2017-01-25 | 2017-06-27 | 长春金赛药业有限责任公司 | 抗vegfr2单克隆抗体及其应用 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20110076279A1 (en) * | 2006-10-20 | 2011-03-31 | Schering Corporation | Fully human anti-vegf antibodies and methods of using |
-
2020
- 2020-07-17 WO PCT/CN2020/102559 patent/WO2021013064A1/zh active Application Filing
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013067098A1 (en) * | 2011-11-02 | 2013-05-10 | Apexigen, Inc. | Anti-kdr antibodies and methods of use |
CN105646710A (zh) * | 2014-11-17 | 2016-06-08 | 四川科伦药物研究院有限公司 | 一种全人源化抗vegfr-2单克隆抗体及其制备方法 |
CN106188296A (zh) * | 2016-07-19 | 2016-12-07 | 中山康方生物医药有限公司 | 一类抗血管内皮生长因子受体vegfr2的单克隆抗体及其编码基因和应用 |
CN106892980A (zh) * | 2017-01-25 | 2017-06-27 | 长春金赛药业有限责任公司 | 抗vegfr2单克隆抗体及其应用 |
Also Published As
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