KR101541478B1 - 항-vegf 항체 및 이를 포함하는 암 또는 신생혈관형성관련 질환의 예방, 진단 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

항-vegf 항체 및 이를 포함하는 암 또는 신생혈관형성관련 질환의 예방, 진단 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 혈관내피세포 성장인자(VEGF)에 대해 강한 결합 친화도를 가지며 생체내 종양 성장을 억제할 수 있는 신규 항-VEGF 항체 및 이를 포함하는 암 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 항체는 인간 및 마우스 혈관내피세포 성장인자에 우수한 결합 능력을 나타내고, 제대정맥 내피세포(HUVEC)의 증식 및 투과능을 억제하며 종양 성장을 억제할 수 있어 암 치료용 항체로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항-VEGF 항체 및 이를 포함하는 암 또는 신생혈관형성관련 질환의 예방, 진단 또는 치료용 약학 조성물{ANTI-VEGF ANTIBODIES AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING SAME FOR PREVENTING, DIAGNOSING OR TREATING CANCER OR ANGIOGENESIS-RELATED DISEASE}
본 발명은 혈관내피세포 성장인자(VEGF)에 대해 강한 결합 친화도를 가져 생체내 종양 성장을 억제하고, 신생혈관형성관련 질환을 치료할 수 있는 VEGF에 결합하는 신규 항체 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
혈관형성은 각종 질병의 발병과 관련되는 것으로 잘 알려져 있으며, 이들 질환에는 고형 종양을 포함하여 눈에서의 혈관신생과 관련된 증식성 망막증 또는 노화 관련 황반 변성(AMD) 등이 있다.
신생혈관형성에 대한 연구를 통해 aFGF, bFGF, TGF-α, TGF-β, HGF, TNF-β, 앤지오제닌, IL-8 등과 같은 많은 유도인자가 확인되었다. 신생혈관 억제제로는 트롬보스폰딘(thrombospondin), 16kDa의 프로락틴의 N-말단 단편(Clapp 등, Endocrinology, 133:1292-1299 (1993)), 앤지오스타틴(angiostatin) 및 엔도스타틴(endostatin) 등이 있다.
신생혈관형성이 일어나거나 또는 억제되는 것은 신생혈관 유도인자와 억제제간의 균형에 의존한다 (folkman, J, 등 J. Biol. Chem. 267, 10931-10934(1992)).
신생혈관생성 유도인자 중 혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)는 혈관, 림프관의 발생과 항상성 유지에 관여하며 신경세포에도 중요한 효과를 가진다. VEGF는 저산소상태 및 TGF, 인터루킨, PDGF와 같은 세포성장인자들의 자극에 의해 혈관내피세포, 조혈세포, 기질세포에서 주로 생성된다. VEGF는 VEGF 수용체에 결합하고, 각각의 VEGF 아형(isoform)은 특정수용체에 결합하여, 수용체의 동형 또는 이형접합체를 형성을 유도한 뒤, 각각의 신호전달체계를 활성화시킨다(Karsan A., Int J Mol Med., 5(5):447-56 (2000)). VEGF 수용체의 신호전달특이성은 보조수용체인 뉴리필린(neuriphilin), 헤파린 설페이트(heparin sulfate), 인테그린(integrin), 카데린(cadherin) 등에 의해 보다 미세하게 조절된다 (Zachary IC 등, Mol Biol Cell. 22(15):2766-76 (2011)). 이러한 VEGF는 종양 및 눈에서의 질병과 관련된 신혈관생성의 중요한 매개자인 것으로 알려졌다. 또한 VEGF mRNA는 조사된 대다수 사람의 종양에 의해 과발현된다(Berkman 등, J Clin Invest., 91: 153-159 (1993)). 암의 경우 자신의 성장을 위해 영양분의 공급과 노폐물을 배출하는 통로로 새로운 모세혈관을 필요로 하며, 이를 위해 암세포와 암의 기질세포는 VEGF를 계속적으로 분비하고, 분비된 VEGF는 조직을 통해 확산되어, 혈관내피세포의 이동을 촉진한다(Ferrara.N. 등, Nat Rev Cancer, 2:795-803, (2002)). 암세포에 의해 유도된 신생혈관은 주위세포의 도움을 받지 않기 때문에 정상적으로 형성된 모세혈관에 비해 불완전한 것이 특징이다. VEGF는 수용체인 VEGFR1, 2, 3에 결합하지만, VEGFR2를 통해 내피세포의 증식, 이동, 투과성을 유도하는 신호를 전달한다(Zeng H. 등, J Biol chem., 276:26969-26976 (2001)). 그러므로 VEGF를 타겟하는 약물을 이용하여 신생혈관형성을 제어함으로써, 암세포의 증식 및 신생혈관형성 관련 질환을 치료할 수 있다. 이 중, VEGF에 결합하는 항체를 약물로 이용할 수 있는데, VEGF에 대한 결합력을 높이고, 면역원성을 줄이기 위해 항체의 인간화 과정을 거쳐 약물로 개발할 수 있다. 인간화 항체에 대해서는 문헌 [Bending, Methods: Comp. Meth. Enzy., 8: 83-93 (1995)]에 기재되어 있다. 항-VEGF 중화 항체는 누드 마우스에 있어서 각종 사람의 종양 세포주의 성장을 억제하고 (Kim 등, Nature., 362:841-844 (1993); Warren 등, J. Clin. Invest., 95:1789-1797 (1995); Borgstroem 등, Cancer Res. 56:4032-4039 (1996); 및 Melnyk 등, Cancer Res., 56:921-924 (1996)), 또한 허혈성 망막 질병의 모델에 있어서 안구내 혈관형성을 억제한다(Adamis 등, Arch. Ophtalmol., 114:66-71 (1996)). 유효농도의 항-VEGF 항체를 안구 내로 국소투여하여 VEGF의 활성을 감소시킬 수 있으며, 이러한 허혈성 망막 질병은 당뇨병성 망막병증이나 노화관련 황반변성 등이 포함될 수 있다.
현재 개발된 항-VEGF 중화항체로는 2004년 2월 대장암을 적응증으로 FDA에서 승인받은 베바시주맙(bevacizumab, AvastinTM, Genentech/Roche)이 있다. 베바시주맙의 경우, 전이성 결장직장암, 진행성 난소암등을 포함하여 총 6종류의 진행성 종양의 치료에 사용할 수 있도록 적응증이 확대되었다. 또한, VEGF에 결합하도록 고안된 애플리버셉트(Aflibercept, 바이엘 헬스케어)는 황반변성을 적응증으로 2011년 FDA에서 제품허가신청을 받았다. 하지만, 2011년 FDA에서는 아바스틴이 유방암 환자에서 위약 대비 유의하게 전체 생존율을 증가시키지 못했다며 유방암과 관련된 적응증 철회하였고, 이어 아바스틴이 유방암환자에서 심부전 발생위험을 증가시킨다는 연구결과가 보고되었다. 이는 기존 개발된 항 VEGF 중화항체의 개선이 필요하며, 또한 전임상에서 정확한 유효성을 판단할 필요가 있다는 점을 시사한다. 아바스틴의 경우, 마우스 VEGF에는 결합하지 않으므로, 마우스를 이용한 전임상 모델에서는 유효성을 정확히 판단하기 힘들다. 그러므로 본 발명에서는 마우스 및 인간에 모두 결합하는 항체를 개발함으로써, 전임상 모델에서의 연구결과의 신뢰성을 획득하고, VEGF에 대한 결합력을 증가시켜 항종양 효과를 향상시킴을 목적으로 하였다.
본 발명자들은 바이오패닝 및 친화도 개선 과정을 통해 종래 알려지지 않은 새로운 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는, VEGF에 특이적으로 결합하여 종양 및 각종 안구 내 신혈관 질환을 치료할 수 있는 항체를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
[비특허문헌 1] Clapp 등, Endocrinology., 133:1292-1299 (1993)
[비특허문헌 2] Berkman 등, J Clin Invest., 91: 153-159 (1993)
[비특허문헌 3] Kim 등, Nature., 362:841-844 (1993)
[비특허문헌 4] Warren 등, J. Clin. Invest., 95:1789-1797 (1995)
[비특허문헌 5] Borgstroem 등, Cancer Res., 56:4032-4039 (1996)
[비특허문헌 6] Melnyk 등, Cancer Res., 56:921-924 (1996)
[비특허문헌 7] Adamis 등, Arch. Ophtalmol., 114:66-71 (1996)
[비특허문헌 8] Bending, Methods: Comp. Meth. Enzy., 8: 83-93 (1995)
[비특허문헌 9] Karsan A. Int J Mol Med., 5(5):447-56 (2000)
[비특허문헌 10] folkman, J, 등 J.Biol. Chem., 267, 10931-10934 (1992)
[비특허문헌 11] Zachary IC 등, Mol Biol Cell., 22(15):2766-76 (2011)
[비특허문헌 12] Ferrara.N.등, Nat Rev Cancer, 2:795-803, (2002)
[비특허문헌 13] Zeng H. 등, J Biol chem., 276:26969-26976(2001)
따라서, 본 발명의 목적은 혈관내피세포 성장인자에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은
1) CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역에서, 상기 CDR2가 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되고, 상기 CDR3이 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역; 및
2) CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역에서, 상기 CDR3이 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는, 혈관내피세포 성장인자에 결합하는 항체를 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 항체를 포함하는 VEGF 과발현에 의해 야기되는 암 또는 신생혈관형성관련 질환의 예방, 진단 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 항체는 인간 또는 마우스 혈관내피세포 성장인자에 우수한 결합 능력을 나타내고, 제대정맥 내피세포(HUVEC)의 증식 및 투과능을 억제하며 종양 성장을 억제할 수 있어 암 또는 신생혈관형성관련 질환의 예방, 진단 또는 치료용 항체로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 HF2-11 클론의 VEGF에 대한 결합 및 해리 센소그램을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 항체가 VEGF와 VEGFR1과의 결합을 억제하지 않으면서 VEGFR2와의 결합을 억제하는 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 항체가 인간 및 마우스 VEGF-A에 대한 특이적 결합을 나타내는 그래프이다.
도 4는 HF2-11 클론의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 HF2-4 항체의 중쇄(a) 및 경쇄(b)의 질량분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 HF2-8 클론의 크기배제 크로마토그래피(SEC) 결과를 나타낸 것이다.
도 7 및 8은 각각 본 발명의 항체 및 아바스틴의 인간 VGEF 및 마우스 VEGF에 대한 결합도를 ELISA로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 항체 및 아바스틴의 혈관내피세포(HUVEC)의 증식 억제시험 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 항체(a) 및 아바스틴(b)의 HUVEC 투과성 억제시험 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 항체의 HUVEC 유동성 억제시험 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 항체의 HT29 이식 동물모델에서의 종양 성장 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 항체의 맥락막 신생혈관형성시험의 신생혈관형성억제 효과를 나타낸 것이다.
본 발명은 1) 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2, 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는, VEGF에 결합하는 항체(이하, 항-VEGF 항체)를 제공한다.
본 발명에 따른 항체의 경쇄 가변영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3(이하, 각각 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3으로 지칭함); 및 중쇄 가변영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3(이하, 각각 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3으로 지칭함)의 아미노산 서열 리스트를 하기 표 1에 나타내었다.
Figure 112015006447809-pat00020
Figure 112015006447809-pat00021

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삭제
본 발명에 따른 VEGF에 결합하는 항체는, 1) 서열번호 4 내지 14로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는, 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 15 내지 34로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 35 내지 50으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는, 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항-VEGF 항체는 1) 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 35의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항-VEGF 항체는 1) 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 16의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 36의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항-VEGF 항체는 1) 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 17의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 37의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항-VEGF 항체는 1) 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 18의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 38의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항-VEGF 항체는 1) 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 19의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 39의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항-VEGF 항체는 1) 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 20의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 40의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항-VEGF 항체는 1) 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 21의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 38의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항-VEGF 항체는 1) 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 22의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 38의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항-VEGF 항체는 1) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 41의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항-VEGF 항체는 1) 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 24의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 38의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항-VEGF 항체는 1) 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 25의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 38의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항-VEGF 항체는 1) 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 26의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 42의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항-VEGF 항체는 1) 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 27의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 38의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항-VEGF 항체는 1) 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 28의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 43의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항-VEGF 항체는 1) 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 29의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 44의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항-VEGF 항체는 1) 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 30의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 45의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항-VEGF 항체는 1) 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 31의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 42의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항-VEGF 항체는 1) 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 20의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 39의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항-VEGF 항체는 1) 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 32의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 46의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항-VEGF 항체는 1) 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 33의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 45의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항-VEGF 항체는 1) 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 34의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 47의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항-VEGF 항체는 1) 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2)서열번호 25의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 48의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항-VEGF 항체는 1) 서열번호 12의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 31의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 38의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항-VEGF 항체는 1) 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 31의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 46의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항-VEGF 항체는 1) 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 17의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 42의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항-VEGF 항체는 1) 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 34의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 49의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항-VEGF 항체는 1) 서열번호 14의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 17의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 50의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 항체는 경쇄 불변영역 및 중쇄 불변영역을 포함할 수 있으며, 상기 경쇄 불변영역 및 중쇄 불변영역은 공지된 인간 항체의 경쇄 불변영역 및 중쇄 불변영역일 수 있다 (U Rutishauser 등 PNAS, 61(4): 1414-1421 (1968); 및 Takahashi N. 등, Cell, 29:671-679 (1982)).
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 본 발명의 항-VEGF 항체는, i) 서열번호 54 내지 65로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는, 경쇄 가변영역; 및 서열번호 78 내지 104로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는, 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 인간 또는 인간화 항체일 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 면역글로불린 중 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM인 것을 포함할 수 있으며, VEGF에 결합하는 항체 또는 이들을 혼합하는 형태 또는 이들의 변이체일 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dAb 또는 scFv 형태이거나, 또는 상기 항체의 CDR을 VEGF와의 결합에 주요 부위로 하는 스캐폴드 접합체(scaffold conjugate) 형태일 수 있다.
또한, 본 발명은 경쇄 가변영역의 아미노산 서열인, 서열번호 54 내지 65로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는, 서열번호 66 내지 77로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열을 제공한다.
본 발명은 중쇄 가변영역의 아미노산 서열인, 서열번호 78 내지 104로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는, 서열번호 105 내지 131로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열을 제공한다.
본 발명에 따른 항체의 경쇄 및 중쇄 가변영역의 아미노산 및 염기서열 리스트를 하기 표 2에 나타내었다.
클론명 경쇄 가변영역의
아미노산서열		 경쇄 가변영역의 염기서열 중쇄 가변영역의
아미노산서열		 중쇄 가변영역의 염기서열
F SEQ:54 SEQ:66 SEQ:78 SEQ:105
HF2-1 SEQ:55 SEQ:67 SEQ:79 SEQ:106
HF2-2 SEQ:55 SEQ:67 SEQ:80 SEQ:107
HF2-3 SEQ:56 SEQ:68 SEQ:81 SEQ:108
HF2-4 SEQ:55 SEQ:67 SEQ:82 SEQ:109
HF2-5 SEQ:55 SEQ:67 SEQ:83 SEQ:110
HF2-6 SEQ:57 SEQ:69 SEQ:84 SEQ:111
HF2-7 SEQ:57 SEQ:69 SEQ:85 SEQ:112
HF2-8 SEQ:58 SEQ:70 SEQ:86 SEQ:113
HF2-9 SEQ:57 SEQ:69 SEQ:87 SEQ:114
HF2-10 SEQ:57 SEQ:69 SEQ:88 SEQ:115
HF2-11 SEQ:59 SEQ:71 SEQ:89 SEQ:116
HF2-12 SEQ:57 SEQ:69 SEQ:90 SEQ:117
HF2-13 SEQ:60 SEQ:72 SEQ:91 SEQ:118
HF2-14 SEQ:55 SEQ:67 SEQ:92 SEQ:119
HF2-15 SEQ:61 SEQ:73 SEQ:93 SEQ:120
HF2-16 SEQ:62 SEQ:74 SEQ:94 SEQ:121
HF2-17 SEQ:62 SEQ:74 SEQ:95 SEQ:122
HF2-18 SEQ:62 SEQ:74 SEQ:96 SEQ:123
HF2-19 SEQ:55 SEQ:67 SEQ:97 SEQ:124
HF2-20 SEQ:55 SEQ:67 SEQ:98 SEQ:125
HF2-21 SEQ:57 SEQ:69 SEQ:99 SEQ:126
HF2-22 SEQ:63 SEQ:75 SEQ:100 SEQ:127
HF2-23 SEQ:60 SEQ:72 SEQ:101 SEQ:128
HF2-24 SEQ:61 SEQ:73 SEQ:102 SEQ:129
HF2-25 SEQ:64 SEQ:76 SEQ:103 SEQ:130
HF2-26 SEQ:65 SEQ:77 SEQ:104 SEQ:131
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 VEGF에 결합하는 항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 DNA를 제공한다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2를 코딩하는 DNA는 서열번호 51의 염기서열로 표시되고, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 코딩하는 DNA는 서열번호 52의 염기서열로 표시될 수 있다.
따라서, 본 발명의 항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 DNA는, LCDR2를 코딩하는 서열번호 51의 염기서열; 및 LCDR3을 코딩하는 서열번호 52의 염기서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 66 내지 77로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열로 표시될 수 있다.
본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 VEGF에 결합하는 항체의 중쇄 가변영역을 코딩하는 DNA를 제공한다.
상기 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 코딩하는 DNA는 서열번호 53의 염기서열로 표시될 수 있다.
따라서, 상기 항-VEGF 항체의 중쇄 가변영역을 코딩하는 DNA는 서열번호 53의 HCDR3을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 105 내지 131로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열로 표시될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 DNA를 포함하는, VEGF에 결합하는 항체의 경쇄 가변영역을 발현시키는 발현벡터를 제공한다.
바람직하게는, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2를 코딩하는 서열번호 51의 염기서열 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 코딩하는 서열번호 52의 염기서열을 포함하는, VEGF에 결합하는 항체의 경쇄 가변영역, 보다 바람직하게는 서열번호 66 내지 77로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열로 표시되는 VEGF에 결합하는 항체의 경쇄 가변영역을 발현시키는 발현벡터를 제공한다.
본 발명은 상기 항-VEGF 항체의 중쇄 가변영역을 코딩하는 DNA를 포함하는, VEGF에 결합하는 항체의 중쇄 가변영역을 발현시키는 발현벡터를 제공한다.
바람직하게는, 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 코딩하는 서열번호 53의 염기서열을 포함하는, VEGF에 결합하는 항체의 중쇄 가변영역, 보다 바람직하게는 서열번호 105 내지 131로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열로 표시되는 VEGF에 결합하는 항체의 중쇄 가변영역을 발현시키는 발현벡터를 제공한다.
본 발명에 따른 발현벡터는 CHO 세포, HEK 세포 또는 NS0 세포와 같은 동물 세포주로 형질전환될 수 있으며, 상기 동물 세포주는 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 VEGF에 결합하는 항체를 포함하는, VEGF 과발현에 의해 야기되는 암 또는 신생혈관형성 관련 안구 질환의 예방, 진단 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 VEGF 과발현에 의해 야기되는 암 또는 신생혈관형성 관련 안구 질환은 예를 들어 대장암, 췌장암, 신장암, 폐암, 유방암, 난소암, 황반변성, 망막정맥 폐쇄증, 당뇨병성 망막증 및 허혈성 망막증으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
항-VEGF 항체는 임상에서 플루오로피리미딘계 약물, 파클리탁셀, 플라티늄계 약물, 인터페론알파-2a, 카보플라틴 등과 같은 약물과 함께 사용될 수 있다(FDA US BL125085 Avastin label).
본 발명의 약학 조성물 역시 상기 항체 이외에, 플루오로피리미딘계 약물, 파클리탁셀, 플라티늄계 약물, 인터페론알파-2a, 카보플라틴, 독소루비신(doxorubicin), 시스플라틴(cisplatin), 젬시타빈(gemcitabine), 5-플루오로우라실, 류코보린, 이리노테칸, 옥살라플라틴, 카페시타빈, 및 도세탁셀로 이루어진 군에서 선택되는 약물을 병용하여 사용할 수 있으며, 상기 약물은 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 항암 활성을 나타내는 어떠한 화학 치료제라도 본 발명의 약학 조성물과 함께 사용될 수 있다. 상기 화학 치료제는, 알킬화제, 대사길항물질, 풀산 동족체, 피리미딘 동족체, 퓨린 동족체 및 관련 억제제, 빈카 알칼로이드, 에피포도 필로톡신, 항생제, L-아스파라기나제, 토포아이소머라제 억제제, 인터페론, 백금 배위 착물, 안트라센디온 치환된 우레아, 메틸 하드라진 유도체, 부신 피질 억제제, 아드레노코르티코스테로이드, 프로게스틴, 에스트로겐, 안티에스트로겐, 안드로겐, 안티안드로겐, 및 고나도트로핀-방출 호르몬 동족체로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 VEGF에 결합하는 항체를 포함하는, VEGF 과발현에 의해 야기되는 암 또는 신생혈관형성 관련 안구 질환의 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 항체는, VEGF와 VEGF 수용체인 Flt-1(VEGFR-1)과의 결합에는 영향을 주지 않고, VEGF와 VEGF 수용체인 KDR(VEGFR-2)의 결합을 선택적으로 억제한다(도 2). 또한, 인간 VEGF-B, 인간 VEGF-C, 인간 VEGF-D 및 인간 태반 성장인자(PIGF)에 대해서는 전혀 결합하지 않는 반면, 인간 VEGF-A 및 마우스 VEGF-A에 대해서는 높은 결합특이성을 나타낸다(도 3).
본 발명의 항체의 인간 혈관 내피세포 성장인자에 대한 결합 친화도(binding affinity)를 효소 면역 측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 통해 확인한 결과, 인간 VEGF에 대해 농도 의존적인 결합력을 나타내었으며(도 7), 기존의 항-VEGF 항체인 아바스틴이 마우스 VEGF에 대해 결합력을 나타내지 않는 것과는 달리 마우스 VEGF에 대해서도 우수한 결합력을 나타내어 마우스를 이용한 전임상 연구에도 적합함을 알 수 있다(도 8).
또한, 본 발명의 항체는 VEGF에 의해 촉진되는 인간 제대정맥 내피세포(HUVEC)의 증식, HUVEC 투과능 및 HUVEC 유동성을 아바스틴 보다 동등이상 수준으로 억제하였으며(도 9 내지 11), 인간 대장암 세포주를 이식한 마우스에서 종양 성장을 아바스틴에 비해 월등히 우수한 수준으로 억제시켰다(도 12). 또한 맥락막 신생혈관형성 모델에서도 대조군 대비 유의하게 혈관형성을 억제하였다(도 13). 따라서, 본 발명의 인간(화) 항체는 암 또는 신생혈관형성 관련 질환의 치료용으로 유용하게 사용될 수 있으며, 이에 본 발명은 상기 항체를 포함하는 암 및 신생혈관질환 치료용 조성물을 제공한다.
정의
본 발명에서 "VEGF"는 165-아미노산 인간 혈관내피세포 성장인자 및 관련 121-, 189- 및 206-아미노산 혈관내피세포 성장인자 뿐만 아니라 천연의 이런 성장 인자의 대립형질 형태 및 변화된 형태를 함께 의미한다(문헌 [Leung 등, Science 246:1306 (1989) 및 Houck 등, Mol. Endocrin. 5:1806 (1991)] 참고).
본 발명에서 "항-VEGF 항체"는 VEGF 수용체에 VEGF가 결합하는 것을 방해함으로써, VEGF에 의해 활성화된 세포를 무능력하게 하거나, 또는 VEGF 수용체에 VEGF를 결합시킨 후 혈관 내피 세포 활성화를 방해함으로써 작용되는 항체를 의미한다.
본 발명에서 "항체"는 특정 항원에 대한 결합 특이성을 나타내는 당단백질을 의미한다. 비인간 (예를 들어, 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소의 서열을 포함하는 키메릭 항체이다. 대부분, 인간화 항체는 인간 면역글로불린의 초가변 영역 잔기를 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼, 닭 또는 비인간 영장류의 초가변 영역 잔기로 교체하여 제조된다. 몇몇 경우, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역(FR) 잔기가 상응하는 비인간 잔기로 교체된다.
본 발명에서 "단쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재하는, 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 바람직한 구조를 형성하도록 하는 VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 더 포함한다
본 발명에서 "Fab 항체 단편"은 항체를 단백질분해효소인 파파인으로 소화시켜 얻는 단편으로, 항체의 VH 및 VL 도메인, 및 CH1 및 CL 도메인이 S-S 결합으로 연결되어 있으며, 항원에 결합하는(antigen binding) 기능이 있다.
본 발명에서 "F(ab')2 항체 단편"은 항체의 Fc (CH2 및 CH3) 단편을 제외한 부분을 의미하며, 항체의 Hinge 영역 아래를 절단하여 만들 수 있다.
본 발명에서 "Fab'"는 F(ab')2 의 항체 단편의 hinge region을 절단한 형태이며, 2개의 -SH기를 가지는 것이 특징이다.
본 발명에서 "Fv"는 항체의 가변영역이고, "dAb"는 단일 도메인 항체 단편을 의미한다.
본 발명에서 "VEGF 수용체"는 VEGF에 대한 세포 수용체, 통상, 혈관내피세포에서 발견되는 세포-표면 수용체 및 hVEGF를 결합시키는 능력을 보유하는 그의 변이체를 의미한다. VEGF 수용체의 한 예로는 fms형 티로신 키나제 (flt)인 티로신 키나제류에 있는 트랜스멤브레인 수용체가 있다(문헌 [DeVries 등, Science 255:989 (1992); Shibuya 등, Oncogene 5; 519 (1990)]). flt 수용체는 세포외 도메인, 트랜스멤브레인 도메인, 및 티로신 키나제 활성을 갖는 세포내 도메인을 포함한다. 세포 외 도메인은 VEGF의 결합과 관련이 있는 반면, 세포내 도메인은 신호 변환과 관련이 있다. VEGF 수용체의 또다른 예로는 flk-1 수용체 (KDR이라고도 함)가 있다(문헌 [Matthews 등, Proc. Nat. Acad. Sci. 88:9026 (1991); Terman 등, Oncogene 6:1677 (1991)).
[실시예]
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. VEGF 면역 및 cDNA 라이브러리 제작
VEGF에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하기 위하여, 동물 면역 항체 라이브러리를 구축하였다. 상기 라이브러리는 동물에 항원을 면역한 면역세포로부터 mRNA를 얻은 후 항체 유전자의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 통해 항체 유전자를 증폭시키고 파아지 디스플레이를 위한 벡터 내로 클로닝하는 방식으로 수행되었다.
구체적으로, 화이트 레그혼종의 닭 3마리에 인간 VEGF와 마우스 VEGF(R&D systems, 미국)를 완전 프로인트 보강제(complete Freund's adjuvant) 및 불완전 프로인트 보강제(Sigma, 미국)와 혼합하여 3주 간격으로 5회 피하 주사하였다. 면역한 동물의 혈청을 얻은 후, PBSB(3% 태아혈청알부민(bovine serum albumin)을 포함하는 인산완충용액)를 이용하여 1:100, 1:500, 1:2500 및 1:12500의 농도로 희석하여 보관한 후, 인간 VEGF와 마우스 VEGF와의 결합여부를 효소면역측정법으로 확인하였다. ELISA 플레이트에 인간 VEGF(VEGF-165, R&D systems, 미국)와 마우스 VEGF(VEGF-164, R&D systems, 미국) 0.2ug/ml을 각각 4℃에서 각각 밤새 코팅한 후, 상기에서 희석한 혈청을 넣고 2시간 동안 반응시켰다. PBST(0.1% tween-20을 포함하는 PBS)로 3회 세척한 후, 항-닭 면역글로블린-HRP(horse radish peroxidase)(1:3000)를 넣고 1시간 동안 반응시켰다. PBST로 3회 세척한 후 울트라 TMB(Thermo, 미국)을 넣고 7분 동안 발색시킨 후 650 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 측정하였다. 면역 전 혈청은 VEGF와 결합하지 않았으며, 인간 VEGF와 마우스 VEGF 모두에 강하게 결합하는 혈청을 생산하는 동물을 선별하였다.
마지막 주사 후 5일 후에 선별된 닭의 골수, 지라 및 파브리시우스낭 조직을 채취하였다. 조직을 10ml TRI 시약(Molecular research center, 미국)과 혼합하여 호모게나이저로 분쇄한 후 20ml TRI 시약을 추가한 후 원심분리하여 상층액을 얻었다. 여기에 1-브로모-3-클로로프로판(1-bromo-3-chloropropane, BCP) 3ml을 넣고 원심 분리하여 상층액을 얻었다. 이소프로판올 15ml로 전체 RNA를 침전시켜 얻었다. 랜덤 헥사머(random hexamer)를 프라이머로 이용하여 수퍼스크립트 전사 시스템(Invitrogen, 미국)을 이용하여 역전사 반응(65℃에서 5분; 4℃에서 5분; 50℃에서 50분; 85℃에서 5분; 및 4℃)을 수행하였다. 역전사 반응의 결과물인 cDNA를 포함하는 반응액 5μl를 1% 아가로스 젤에 로딩하여 전기영동 후 다양한 길이의 cDNA 밴드를 확인하였다.
실시예 2. 항체 라이브러리 제작
(2-1) 면역 항체 유전자 증폭
닭 항체의 중쇄와 경쇄의 가변영역인 VH와 VL 도메인을 증폭하기 위하여 다음과 같이 PCR 반응을 수행하였다.
PCR 반응은 실시예 1에서 제조한 cDNA를 주형으로 하여, 중쇄 가변영역, 경쇄 가변영역 및 이를 연결한 scFV(single chain Fv) 영역에 맞게 고안된 하기 표 2의 프라이머 조합을 이용하였다. VH 및 VL 각각의 cDNA 라이브러리 0.5μl, 30 pmole 순방향 프라이머, 30 pmole 역방향 프라이머, 10x PCR 버퍼, 200 uM dNTPs 및 0.5 ul Taq DNA 폴리머라제를 혼합하여 최종 50 ul를 맞추어 준 후, 94℃에서 5분 반응시킨 후, 94℃에서 15초, 56℃에서 30초 및 72℃에서 90초간 반응시키는 과정을 30사이클 반복하였다.
Figure 112015006447809-pat00024
PCR 증폭된 항체 DNA를 1% 아가로스 젤에 전기 영동하여 각각의 증폭된 DNA를 크기에 따라 분리하고, 겔 추출 키트(Gel extraction kit, Qiagen, 미국)를 이용하여 정제하였다.
scFv DNA를 얻기 위해, 정제된 VH 50ng, VL 50ng DNA를 주형으로 하여 30 pmole 순방향 프라이머, 30 pmole 역방향 프라이머, 10x PCR 버퍼, 200 uM dNTPs 및 0.5 ul Taq DNA 폴리머라제를 혼합하여 최종 50 ul를 맞추어 준 후, 94℃에서 5분 반응시키고, 94℃에서 30초, 56℃에서 30초 및 72℃에서 2분간 반응시키는 과정을 20사이클 반복하여 PCR을 수행하였다. 상기 PCR을 통해 증폭된 DNA를 1% 아가로스 젤에 전기 영동하여 각각의 증폭된 DNA를 크기에 따라 분리하고, 겔 추출 키트(Gel extraction kit, Qiagen, 미국)를 이용하여 정제하였다.
(2-2) 항체 DNA 의 제한효소 절단
상기에서 제조된 scFv와 파지미드 벡터인 pComb3X(the Scripps Research Institute, CA, 미국)를 제한효소 SfiI (Roche, 미국)로 절단하였다.
scFv를 코딩하는 PCR 절편 10ug, 360 units SfiI (Roche, 미국), 20ul 10x 버퍼를 넣고 최종 볼륨이 200ul가 되게 하여 50℃에서 밤샘 반응시켰다.
또한, pComb3X 벡터 20ug, 120 units SfiI 및 20ul 10x buffer를 넣고 최종 볼륨이 200ul가 되게 하여 50℃에서 밤샘 반응시켰다. 상기 제한효소로 절단한 각각의 절편을 아가로스 젤에 전기영동한 후 겔 추출 키트(Qiagen, 미국)를 이용하여 정제하였다.
(2-3) 항체 DNA 의 라이게이션 및 라이브러리의 제조
scFv 절편을 pComb3X 벡터에 삽입하기 위하여, 상기 (2-2)에서 제한효소 SfiI를 이용하여 절단한 scFv를 코딩하는 PCR 절편 700ng 및 pComb3X 1.4ug을 혼합하고, T4 DNA 라이게이즈(Invitrogen, 미국)를 첨가하여 16℃에서 밤새 반응시켰다. 상기 라이게이션 혼합물을 에탄올 침강법으로 정제하고, 대장균 ER2738(New England Biolab, 미국)에 전기 천공법(electroporation)으로 형질전환시켜 46ug/ml 카베니실린 및 70ug/ml 카나마이신 하에서 배양하여 1.5x109 complexity를 가진 라이브러리를 제작하여 이용하였다.
실시예 3. 항- VEGF scFV 를 포함하는 파지 클론의 선별
상기 실시예 2에서 수득한 scFv의 형태로 랜덤화된 중쇄와 경쇄를 갖는 라이브러리로부터 인간 VEGF와 마우스 VEGF에 모두 결합하는 항체를 고체에 지지된 VEGF를 이용하여 선별하였다.
(3-1) VEGF 에 결합하는 항체 선별
먼저, 마그네틱 비드에 인간 VEGF(R&D systems, 미국) 및 마우스 VEGF(R&D systems, 미국) 10μg을 각각 컨쥬게이션시켰다.
상기 실시예 2에서 수득한 scFv 형태의 항체를 파아지의 코트 단백질 PIII와 융합하여 디스플레이할 수 있게 만들어진 항체 라이브러리 DNA를 대장균 ER2738(New England Biolab)에 전기천공법으로 형질전환시키고, 37℃에서 배양 후 VCSM13 헬퍼 파지(Stratagene, 미국)를 넣은 후 46ug/ml 카베니실린과 70ug/ml 카나마이신을 넣고 SB 배지(30g/L 트립톤, 20g/L 효모 추출물 및 10g/L MOPS, pH 7.0)에서 밤새 배양하였다.
상기에서 수득한 대장균과 파아지를 포함하는 배양액을 원심분리하여 침전된 대장균을 제거하였다. 상등액만을 회수한 후, 40mg/ml 폴리에틸렌글리콜 8000과 30mg/ml NaCl을 첨가하고 원심 분리하여 PEG에 의해 침전된 파아지를 모아 PBS로 재현탁하였다.
마그네틱 비드에 컨쥬게이션된 인간 VEGF 또는 마우스 VEGF와 파아지를 상온에서 2시간 동안 반응시킴으로써 VEGF에 친화력을 가진 파아지를 결합시킨 후, 이를 0.5% Tween 20을 포함하는 PBS로 세척하고, 0.1M 글리신(pH 2.2)용액으로 용출하고 2M 트리스 용액으로 중화시켰다. 용출된 파아지는 다음 라운드 패닝(panning)을 위해 대장균 ER2738에 감염시켜 밤새 배양하여 증식시켰다. 이러한 과정을 4차례 반복하며 패닝(panning)을 진행하였다.
패닝 횟수가 증가할수록 세척 횟수가 증가하여 결합력이 높은 파아지를 축적하였다. 인간 VEGF와 마우스 VEGF에 모두 결합하는 바인더를 찾기 위해 인간 VEGF 단독, 또는 인간 VEGF와 마우스 VEGF를 번갈아 항원으로 사용하였다.
각각의 4차 패닝 결과물의 플레이트로부터 선별된 개별 클론을 96 딥웰(deep well) 플레이트에서 100ug/ml 카베니실린, 70ug/ml 카나마이신 및 VCSM13 헬퍼 파아지(1:1000)를 넣고 37℃에서 밤새 배양하여 항체가 발현된 파아지의 증식을 유도하였다.
상기에서 수득한 배양액을 원심분리를 이용해 파아지를 포함한 배지 상등액을 얻어 VEGF가 코팅되어 있는 ELISA 플레이트에 넣고 37℃에서 2시간 동안 배양하였으며, HRP가 컨쥬게이션되어 있는 항-M13 항체를 이차항체로 이용하여 VEGF에 결합하는 항체를 ELISA로 확인하였다.
(3-2) 선별된 항체의 시퀀싱
상기 3-1에서 선별한 인간 VEGF 및 마우스 VEGF에 모두 양성 시그날을 나타내는 클론을 가지고 있는 ER2738을 SB 배지로 밤새 배양한 후 원심분리하여 대장균을 얻는다. DNA 미니 프렙 키트(진올, 한국)를 이용하여 플라스미드 DNA를 얻어 염기서열을 분석하였다. 염기서열 결정을 위해 하기 표 4에 나타낸 바와 같은 시퀀싱 프라이머 서열번호 138(정방향) 및 139(역방향)의 프라이머를 이용하여 분석하였으며, 선별된 클론은 "클론 F"로 명명하였다. 클론 F 항체의 구체적인 서열 정보는 상기 표 1에서 나타낸 바와 같다.
정방향(서열번호 138) ACA CTT TAT GCT TCC GGC TC
역방향(서열번호 139) CAA AAT CAC CGG AAC CAG AG
실시예 4. 인간화 및 친화도 개선
동물 면역 항체라이브러리로부터 얻은 항체 클론 F의 프레임워크를 인간 항체 프레임워크로 변환하고 일부 항원 결합에 중요한 잔기는 고정하였다 (Nishibori et al., Molecular Immunology, 43 (2006)).
친화도 개선을 위해 중쇄 및 경쇄영역의 CDR의 서열을 랜덤화시켜 새로운 파아지 라이브러리를 제작하였다. 상기 실시예 2와 같은 방법으로 수득한 파아지 라이브러리를 마그네틱 비드에 고정시킨 인간 VEGF 10μg과 상온에서 2시간 반응시킨 후 0.5% Tween 20을 포함하는 PBS로 5회 세척하였다. 세척 후 결합되어 있는 파아지를 0.1M 글리신(pH 2.2) 용액으로 용출하고 2M 트리스 용액으로 중화시켰다. 2차 패닝 시에는 Tween 20을 포함하는 PBS로 10회 세척하고 3차 패닝 시에는 Tween 20을 포함하는 PBS로 20회 세척하여 선택 압력을 증가시켰다.
상기 과정을 거친 클론 F의 변이 클론들을 "HF2-1 내지 HF2-26"으로 명명하였고, 결합 친화도를 ELISA와 BIAcore를 통해 확인하였다. 그 결과, 상기 과정을 거쳐 수득된 항체는 모클론 F에 비해 10배 이상의 친화도로 인간 VEGF 및 마우스 VEGF와 결합하는 것을 확인하였고 이 중 일부 클론은 100배 이상의 친화도를 가진다.
실시예 5. 항체의 생산
상기에서 수득한 항체의 친화도 측정 및 활성 분석을 위하여, scFv 또는 면역글로불린(IgG) 단백질을 생산하였다.
scFv 단백질의 경우, 선별된 클론의 DNA를 포함하는 pComb3x 플라스미드로 HB2151 대장균을 형질전환시킨 후 발현되는 scFv를 정제하였다.
구체적으로, O.D.값이 1일 때 1mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 넣고 37℃에서 밤새 배양한 후, 원심분리를 통해 상기 대장균와 배양액을 분리하였다. scFv 정제를 위해 scFv 단백질을 카복시 말단에 태그되어 있은 His tag과 결합하는 니켈 NTA 컬럼 (GE, 미국)에 결합시키고, 250-300mM 이미다졸 용액으로 용출 (elution)한 후 PBS 버퍼에 밤새 투석하였다.
한편, IgG의 경우, scFv를 포함하는 pComb3x로부터 중쇄 및 경쇄의 가변영역과 불변영역의 절편을 하기 표 5의 프라이머 조합을 이용해서 실시예 2와 같은 조건의 PCR을 통해 수득하였다.
각 가변영역과 불변영역(CH 및 Ck)을 하기 표 5의 HC 및 LC 프라이머 조합을 이용하여 PCR로 각각 중쇄와 경쇄를 얻어냈고, pcDNATM3.3-TOPO®TA 클로닝 키트 및 pOptiTMVEC-TOPO®TA 클로닝 키트(Invitrogen, 미국)를 이용하여 포유류 세포 발현 플라스미드로 옮겼다. 각 벡터(pcDNATM3.3-TOPO® 벡터와 pOptiTM VEC-TOPO® 벡터) 1ul와 절편을 200 mM NaCl 및 10 mM MgCl2이 포함된 완충액에 총 6ul가 되게 첨가하여 상온에서 5분 동안 반응시켰다. DH 5a 대장균 competent cell에 열충격을 가하여 형질전환하여 콜로니를 얻은 후 대량 배양하여 플라스미드를 얻었다.
상기에서 제조된 플라스미드를 이용하여 HEK293F 세포(Invitrogen, 미국)에 형질감염시킨 후, 7일 동안 배양하여 수득한 항체를 단백질 A 컬럼 (GE, 미국)을 사용하여 정제하였다. 배양액을 컬럼에 로딩하여 배양액 중에 있는 항체(IgG)를 단백질 A와 결합시키고 20mM 구연산 나트륨 버퍼 (pH3.0)로 용출하였다. SDS-PAGE를 통해 경쇄와 중쇄의 SDS-PAGE를 통해 경쇄와 중쇄의 이론적 계산치와 일치하는 분자량과 높은 순도를 확인하였다.
Figure 112015006447809-pat00023
삭제
실시예 6. 결합력 측정
ELISA 플레이트에 0.2μg/ml의 인간 VEGF 및 마우스 VEGF(R&D systems, 미국)를 각각 코팅하고, 상기 실시예 5에서 수득한 scFv 형태로 HB2151로부터 발현하여 정제된 단백질 또는 IgG 형태로 293F 세포에서 발현하여 정제한 단백질을 순차적으로 희석된 농도로 인큐베이션하였다. 그 결과, 실시예 3-3에서 얻은 F 클론 및 이로부터 친화도 개선을 통해 얻어진 변이체들이 인간 VEGF와 마우스 VEGF에 농도 의존적으로 잘 결합함을 알 수 있었다.
한편, 친화도를 측정하기 위해 인간 VEGF 및 마우스 VEGF 각각을 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, GE)을 이용하여 제조자의 지시에 따라 커플링하였다. 결합 및 해리 속도 측정을 위해 IgG 단백질을 5nM, 2.5nM, 1.25nM, 0.625nM, 0.313nM 및 0.156nM로 2배 연속 희석하여 주입하였다.
결합속도 및 해리속도는 결합 및 해리 센소그램(sensogram)으로 표시되고, 단순 일대일 랭뮈어 결합 모델(BIAcore X100 평가 소프트웨어, 버전2.0)을 사용하여 계산하였다. 평형해리 상수(KD)는 해리 속도 상수(Kd)를 결합 속도 상수(Ka)로 나눈 값으로서, 실제 값을 계산한 결과 nM 이하로 높은 수준의 KD 값을 확인하였다. 항체 HF2-1 내지 HF2-11, HF2-13 및 HF2-14의 인간 VEGF(hVEGF)에 대한 측정값을 하기 표 6에 나타냈으며 대표적으로 HF2-11의 센소그램을 도 1에 나타내었다.
클론명 결합 분자 Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M)
HF2-1 hVEGF 2.5X106 <1X10-6 <1X10-12
HF2-2 hVEGF 1.1X106 <1X10-6 <1X10-12
HF2-3 hVEGF 1.3X106 <1X10-6 <1X10-12
HF2-4 hVEGF 1.6X106 3.1X10-6 1.9X10-12
HF2-5 hVEGF 1.3X106 2.6X10-5 1.9X10-11
HF2-6 hVEGF 1.6X106 <1X10-6 <1X10-12
HF2-7 hVEGF 1.6X106 2.7X10-5 1.6X10-11
HF2-8 hVEGF 1.5X106 5.7X10-5 3.6X10-11
HF2-9 hVEGF 1.7X106 3.2X10-5 1.8X10-11
HF2-10 hVEGF 1.6X106 <1X10-6 <1X10-12
HF2-11 hVEGF 1.4X106 6.8X10-6 4.7X10-12
HF2-13 hVEGF 1.4X106 1X10-5 9.0X10-12
HF2-14 hVEGF 1.3X106 <1X10-6 <1X10-12
실시예 7. 리간드-수용체 결합 억제 확인
본 발명의 항체 중 HF2-1, HF2-5, HF2-9 및 HF2-11의 VEGF 및 VEGF 수용체 KDR(이하, VEGFR-2) 또는 VEGF 수용체 Flt-1(이하, VEGFR-1)의 결합 억제효과를 확인하기 위하여 다음과 같이 실험하였다.
0.5μg/ml 인간 VEGF를 96웰 ELISA 플레이트에 코팅한 후 3% BSA 및 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS 용액으로 블로킹하였다. 6nM 농도의 Flt-1 ECD IgG-Fc 융합단백질(27-687, R&D systems, 미국), 9nM 농도의 KDR ECD IgG-Fc 융합단백질 (R&D systems, 미국)을 각각 0.01, 0.1, 0.3, 1, 3, 10 및 100 nM로 연속 희석된 각각의 항체(HF2-1, HF2-5, HF2-9 및 HF2-11)와 함께 각 웰에 넣고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 항체에 의한 결합 억제 반응 이후에도 결합되어 있는 Flt-1 ECD IgG-Fc 융합단백질과 KDR ECD IgG-Fc 융합단백질을 항-인간 IgG-Fc 항체-HRP 컨쥬게이트(Jackson Immunoresearch, 미국)와 결합시키고 ABTS를 기질로 발색시킨 다음 405nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항체는 VEGF와 KDR(VEGFR-2)의 결합을 농도 의존적으로 억제시켰으나, VEGF와 Flt-1(VEGFR-1)의 결합은 억제하지 않았다. 즉, 본 발명의 선별된 항체는 VEGF와 VEGF 수용체의 결합을 선택적으로 억제하는 것을 확인하였다.
실시예 8. 결합 특이성 확인
본 발명의 항체 중 HF2-1, HF2-5, HF2-9 및 HF2-11의 인간 및 마우스 VEGF-A(hVEGF-A 및 mVEGF-A), 인간 VEGF-B(hVEGF-B), 인간 VEGF-C(hVEGF-C), 인간 VEGF-D(hVEGF-D), 인간 태반 성장 인자(PlGF)에 대한 결합 특이성을 측정하기 위해 다음과 같이 실험하였다.
상기 각 단백질(hVEGF-A, mVEGF-A, hVEGF-B, hVEGF-C, hVEGF-D 및 PlGF)(R&D systems) 0.2μg/ml을 ELISA 플레이트에 코팅하였다. 3% BSA 및 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS로 37℃에서 30분간 블로킹한 후, 증가하는 농도의 항체 클론 단백질을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어, 3% BSA 및 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS로 3회 세척한 후 항-인간 IgG-Fab-HRP 컨쥬게이트(Jackson Immunoresearch, 미국)를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 3% BSA 및 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS로 3회 세척 후, TMB를 기질로 발색시킨 다음 650nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 대조군으로는 아바스틴(Avastin)(Roche, 스위스)을 이용하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이 본 발명의 항체 클론들은 인간 VEGF-A, 마우스 VEGF-A에는 잘 결합하지만, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 및 PlGF와는 전혀 결합하지 않았으며, 이를 통해 VEGF에 대해 높은 특이성을 가짐을 알 수 있었다.
실시예 9. 물리화학적 특성분석
본 발명에 따른 항체의 물리 화학적 특성을 분석하였다.
NuPAGE 4-12% Bis-Tris 겔(Invitrogen사)을 이용하여, 검체를 DTT로 처리하여 이황화 결합을 제거한 환원조건, 및 DTT로 처리하지 않은 비환원 조건에서 각각 SDS-폴리아크릴아미드젤 전기영동(SDS-PAGE) 분석을 수행하여 전체 항체의 경쇄와 중쇄의 존재를 확인하였다. 대표적으로, HF2-11에 대한 분자량 측정 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 비환원 조건(NR, 5μg)에서 분석한 검체는 116 kDa 사이즈 마커와 205 kDa의 사이즈 마커 위치 사이에 1개의 주요 밴드가 관찰되어 전체 항체 크기에 해당되는 밴드의 존재가 확인되었다. 환원 조건(R, 2μg)에서 분석한 검체는 55 kDa 사이즈 마커와 20.1 kDa 사이즈 마커 부근에서 각각 1개의 주요 밴드가 관찰되어 항체의 중쇄와 경쇄에 해당되는 밴드의 존재가 확인되었다. 이와 같이 SDS-폴리아크릴아미드젤 전기영동 분석에서 전체 항체 및 중쇄와 경쇄에 해당되는 밴드가 확인되었으며, 그 외의 주요 불순물 밴드는 관찰되지 않았다.
또한, 액체크로마토그래피/질량분석법(LC/MS)을 이용하여 HF2-4의 분자량을 측정하여 이론적인 아미노산 서열에서 예측되는 값과 일치하는지를 확인하였다. 대표적으로, HF2-4에 대한 중쇄 및 경쇄의 질량분석 결과를 도 5의 (a) 및 (b)에 나타내었다.
검체를 부분적으로 환원한 후 중쇄와 경쇄의 질량을 각각 분석한 결과, 중쇄는 약 50.6 kDa, 경쇄는 약 23.3 kDa 크기의 주요 피크를 보여 예상 분자량과 일치하는 것으로 확인되었으며, 주요 피크 외에 당쇄 부가(glycosylation) 등 번역 후 수정(post-translational modification)에 따른 이형체로 추정되는 작은 피크들이 추가로 관찰되었다.
한편, 본 발명의 항체 HF2-8의 응집상태(불순물의 한 종류로 soluble aggregate를 지칭함)를 TSKgel G3000SWxl 칼럼(Tosoh사)을 이용한 크기배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography, SEC)로 분석하여 그 결과를 도 6에 나타내었다. 100 mM 인산완충액(pH6.6)을 이동상으로 하여 등용매용리 방법으로 분리하고 흡광도 280 nm에서 모니터링하였을 때에 단량체의 피크면적이 전체 피크면적의 98% 이상을 차지하였으며, 응집체 피크의 비율은 2% 미만으로 높은 순도를 나타내었다.
실시예 10. 인간 또는 마우스 VEGF에 대한 항체의 결합 분석
본 발명의 항체(HF2-1 내지 HF2-11)의 인간 혈관내피세포 성장인자(VEGF)에 대한 결합력을 ELISA법을 이용하여 확인하였다.
150μL의 완충용액에 희석한 인간 VEGF 1.5 ng를 96웰 면역 플레이트(Nunc, 미국)에 넣고, 4℃에서 보관하여 밤새 흡착시킨 후, 0.1% Tween 20이 포함된 완충용액으로 3회 세척하였다. 다시 1% 우혈청 알부민(Sigma, 미국)이 포함된 완충용액으로 상온에서 1시간 반응시킨 후, 3회 세척하고, 순차적 농도(1, 10, 30, 100, 1000 및 3000 ng/ml)로 희석한 각각의 항체를 웰 당 150μL씩 처리하였다. 항원에 항체가 결합할 수 있도록 상온에서 1시간 반응시킨 후, 완충용액으로 3회 세척하였다.
항-인간 면역글로불린 Fc-HRP 항체(AbSerotec, USA)를 1:20000으로 희석하여 웰 당 150 μL씩 처리한 후, 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 완충 용액으로 3회 세척한 후, TMB(Sigma, 미국)를 150 μL씩 넣고 10분간 발색시켰다. 1N 황산용액으로 반응을 종결시키고, 분광 광도계(Molecular Device, 미국)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 도 7에 나타내었다. 이때, 대조군으로는 아바스틴 항체를 이용하여 동일한 방식으로 흡광도를 측정하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 클론 F(a)를 인간화한 HF 클론(b)의 결합력이 친화도 개선과정을 거치면서 증가함을 확인할 수 있다. 이 대부분의 HF 클론이 아바스틴보다 VEGF에 대한 결합력이 높음을 확인할 수 있다.
한편, 상기와 동일한 방식으로 마우스 VEGF에 대한 항체의 결합력을 ELISA를 통해 확인하였다. 그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항체는 아바스틴과 달리 인간 VEGF 뿐만 아니라 마우스 VEGF에도 결합하며, 이는 본 발명의 항체가 마우스를 이용한 전임상 연구에 적합함을 보여준다.
실시예 11. 본 발명의 항체의 VEGF에 의한 HUVEC 증식 억제 활성 확인
본 발명의 항체의 VEGF에 의한 인간 제대정맥 내피세포의 증식 억제 활성을 확인하였다.
인간 제대정맥 내피세포(HUVEC, Clonetics, 미국)를 원심 분리하여 펠렛을 얻은 후, 성장인자와 우혈청이 배제된 EBM-2 기본배지(clonetics, 미국)를 이용하여 현탁하였다. 96웰 세포 배양 플레이트에 웰당 동일한 수의 세포 현탁액을 넣고, 정온 습식 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양이 끝나면 배지를 버리고, 순차적 농도(30, 60, 100, 150, 200, 300, 1000, 및 3000 ng/mL)로 희석한 항체와 30~90ng/mL의 일정 농도로 희석한 인간 VEGF를 혼합한 용액을 처리하였다. 항체와 항원을 처리한 세포를 정온 습식 배양기에서 4일간 배양시킨 후, 웰당 10uL의 라자주린 용액(invitrogen, 미국)을 처리하고 3~4시간 후, 530nm/590nm에서 형광을 측정하였다. 이때, 대조군으로는 아바스틴을 이용하였으며, VEGF만 처리한 웰의 형광값을 기준으로 항체에 의한 세포 증식 억제 효과를 수치화하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 본 발명의 HF2-5 항체는 VEGF에 의해 촉진된 인간 제대정맥 내피세포 증식을 아바스틴과 유사한 정도로 억제시켰다. 또한 H clone의 인간화(a) 및 친화도 개선(b, c, d)을 통해, 항체의 활성이 증가함을 확인할 수 있다.
실시예 12. 본 발명의 항체의 VEGF에 의한 HUVEC 투과능 억제 활성 확인
VEGF에 의한 인간 제대정맥 내피세포(Clonetics, 미국)의 투과능(permeability)에 대한 본 발명의 항체의 억제 활성을 확인하였다.
시험 하루 전, 0.4 uM 미세다공의 막으로 구성된 트랜스웰에 콜라겐 용액(Sigma, 미국)을 처리하여 세포의 부착을 촉진하였다. 트립신을 이용하여 세포를 회수한 후, 5 x 104cells/mL의 농도로 현탁하였다. 트랜스웰의 콜라겐 용액을 버리고, 완충용액으로 1회 세척 후, 웰당 100μL의 세포 현탁액을 분주하고, 바닥 챔버에는 우혈청과 성장인자가 포함된 EGM-2 배지 (clonetics, USA) 600μL를 분주하였다. 내피세포 단일층이 형성되면 농도별로 희석한 항체(HF2-5, HF2-9 및 HF2-11, 및 아바스틴(대조군) 각각 1x 및 10x)와 30~90ng/mL의 농도로 희석한 인간 VEGF를 혼합한 용액을 트랜스웰에 100μL, 바닥 챔버에 600μL씩 처리한 후, 배양기에서 밤새 반응시켰다. 반응이 끝나면 트랜스웰의 시료를 버리고 덱스트란-FITC 용액을 100μL 처리하여 1시간이 지난 후 트랜스웰을 투과한 덱스트란을 490nm/520nm에서 형광 측정하였다. 이때 대조군으로는 VEGF와 항체를 포함하지 않는 EBM 배지를 사용하였다.
도 10에 나타난 바와 같이, VEGF에 의해 증가한 내피세포의 투과능이 본 발명의 항체에 의해 농도 의존적으로 억제되었으며(a), 이는 양성 대조군인 아바스틴(b)과 유사하였다.
실시예 13. 본 발명의 항체의 VEGF에 의한 HUVEC 유동성 억제 활성 확인
VEGF에 의한 인간 제대정맥 내피세포(Clonetics, 미국)의 유동성에 대한 본 발명의 항체 중 HF2-4 및HF2-8의 억제 활성을 확인하였다.
내피세포의 유동성을 정량적으로 확인하기 위해, 3 uM 미소다공의 막으로 구성된 트랜스웰을 이용하여 보이던 챔버 시험을 진행하였다. VEGF의 반응성을 높이기 위하여 시험 전, 플라스크에 배양 중인 세포는 0.1% BSA가 포함된 EBM-2기본 배지로 4시간 이상 고갈시켰다. 위쪽 챔버에 웰당 50,000개의 세포가 들어가도록 세포 현탁액 100 uL을 넣고, 바닥 챔버에는 기본 배지로 희석한 3 ng/mL의 VEGF, 및 9, 90 ng/mL 농도의 항체(HF2-4 및 HF2-8)가 혼합된 용액 600 uL을 첨가하였다.
24시간 배양 후, VEGF의 농도 구배에 따라 세포가 트랜스웰의 반대편으로 이동하게 되면, 트립신을 이용하여 트랜스웰 반대쪽 막에 부착된 세포를 탈착하였다. 탈착된 세포는 원심분리하여 회수한 뒤, 라이시스 버퍼(Invitrogen, 미국)로 분해하였다. 이후 분해된 세포에 포함된 DNA를 DNA staining dye(invitrogen, 미국)로 염색한 후, 480/520 nm로 형광을 측정하여 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 내피세포의 유동성은 인간 VEGF에 의해 촉진되며, 이러한 유동성의 증가는 항체 HF2-4 및 HF2-에 의해 농도 의존적으로 억제되었다.
실시예 14: 본 발명의 항체의 종양 성장 억제 활성 확인
인간의 암세포를 이식하여 종양이 형성된 누드마우스에 본 발명의 항체를 투여하여 종양 억제 활성을 평가하였다.
구체적으로, 10% FBS 및 1% 페니실린 스트렙토마이신이 포함된 McCoy's 5A 배지에서 배양한 HT-29세포(인간 대장암 세포주 HTB-38, ATCC) 2~5백만개를 BALB/c 누드 마우스(오리엔트바이오)의 피하 내로 주입하였다. 상기 마우스들에서 종양 부피의 평균이 약 200~300 mm3 정도로 충분히 자란 상태에서, 분리된 군에 따라 항체 HF2-1, HF2-5, HF2-9 및 HF2-11을 각각 투여하였다. 항체 투여는 3 또는 10mg/kg의 용량으로, 주 2회 복강내 주사하였으며, 시점별(7, 14, 21, 28 및 35일)로 종양의 부피(mm3)를 측정하였다. 음성 대조군으로는 완충 용액(PBS)을 이용하였으며, 양성 대조군으로는 아바스틴을 투여하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타난 바와 같이, 항체를 투여한 마우스에서는 대조군들에 비해 종양 성장이 억제되었으며, 특히 항체 투여군의 종양 성장 억제 효과가 아바스틴 투여군에 비해 월등히 우수함을 알 수 있었다.
실시예 15: 본 발명의 항체의 망막 신생혈관 형성 억제활성 확인
본 발명에 따른 항체의 망막 신생혈관형성 억제 활성을 확인하기 위하여 다음과 같이 실험하였다. 먼저, 맥락막의 신생혈관형성을 유도하기 위해, 시험 0일에 포토코아귤레이터 (viridis laser, Quantel, France)를 이용하여 150 mW 및 530 nm의 레이저를 마우스의 오른쪽 안구에 0.1초 동안 투사하였다. 투사 후 병변은 0.1 uM가 되게 하였다. 시험 0일과 7일째에 항체(HF2-4 및 HF2-11)를 각각 1ug 및 5ug의 양으로 오른쪽 안구에 안구 내 투여하고, 안저의 신생혈관형성 정도를 평가하기 위해 시험 7일 및 14일째에 혈관조영검사를 실시하였다. 이때, 음성 대조군(vehicle)으로는 PBS를 사용하였고, 양성 대조군(Ref. drug)으로는 아플리버셉트(aflibercept, 바이엘 헬스케어)를 사용하였다.
그 결과 도 13에 나타난 것처럼, 본 발명의 항체 투여군에서 음성 대조군 대비 우수한 맥락막의 신생혈관 억제 효과를 나타내었으며, 시판중인 대조약물과 비교하여 동등이상의 효과를 보였다.
<110> DONG-A SOCIO HOLDINGS CO., Ltd. IBIO, INC. <120> ANTI-VEGF ANTIBODIES AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING SAME FOR PREVENTING, DIAGNOSING OR TREATING CANCER OR ANGIOGENESIS-RELATED DISEASE <130> FPD/201207-0066 <160> 151 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of CDR2 in light chain variable region (LCDR2) <400> 1 Trp Asp Asp Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of CDR3 in light chain variable region (LCDR3) <400> 2 Gly Ala Trp Glu Tyr Ser Ser Asp Val Gly Ile 1 5 10 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of CDR3 in heavy chain variable region (HCDR3) <400> 3 Asp Phe Ser Thr Ser Tyr Gly Ala Asp Ser Ile Asp Ala 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of LCDR1 of Clone F <400> 4 Ser Gly Gly Ser Asn Ser Ala Tyr Gly Tyr Gly 1 5 10 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of HCDR2 of Clone HF2-4, HF2-17 <400> 39 Gly Ile Ser Ser Asp Gly Ser Trp Arg Arg His Ser Ala Ala Val Glu 1 5 10 15 Gly <210> 40 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of HCDR2 of Clone HF2-5 <400> 40 Gly Ile Ser Ser Asp Gly Ser Trp Ala Arg His Ser Ala Ala Val Glu 1 5 10 15 Gly <210> 41 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of HCDR2 of Clone HF2-8 <400> 41 Gly Ile Ser Ser Asp Gly Ser Trp Leu Lys Leu Ser Ala Ala Val Glu 1 5 10 15 Gly <210> 42 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of HCDR2 of Clone HF2-11, HF2-16, HF2-24 <400> 42 Gly Ile Ser Ser Asp Gly Ser Trp Val Lys Val Ala Ala Ala Val Glu 1 5 10 15 Gly <210> 43 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of HCDR2 of Clone HF2-13 <400> 43 Gly Ile Ser Ser Asp Gly Ser Trp Gln Arg Val Asn Ala Ala Val Glu 1 5 10 15 Gly <210> 44 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<210> 49 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of HCDR2 of Clone HF2-25 <400> 49 Gly Ile Ser Ser Asp Gly Ser Trp Phe Arg Met Asn Ala Ala Val Glu 1 5 10 15 Gly <210> 50 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of HCDR2 of Clone HF2-26 <400> 50 Gly Ile Ser Ser Asp Gly Ser Trp Ile Arg Val Gln Ala Ala Val Glu 1 5 10 15 Gly <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of light chain variable region (LCDR2) <400> 51 tgggacgaca agcggccctc c 21 <210> 52 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of light chain variable region (LCDR3) <400> 52 ggagcctggg agtactccgg cggcgtgggc atc 33 <210> 53 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of light chain variable region (HCDR3) <400> 53 gacttctcca ccggctacgg agccgactcc atcgacgcc 39 <210> 54 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of light chain variable region of Clone F <400> 54 Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val Lys 1 5 10 15 Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ser Asn Ser Ala Tyr Gly Tyr Gly Trp Tyr 20 25 30 Gln Gln Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu Ile Tyr Trp Asp 35 40 45 Asp Lys Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Ala Ser 50 55 60 Gly Ser Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Arg Ala Glu Asp Glu 65 70 75 80 Ala Val Tyr Phe Cys Gly Ala Trp Glu Tyr Ser Ser Asp Val Gly Ile 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 55 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of light chain variable region of Clone HF2-1, HF2-2, HF2-4, HF2-5, HF2-14, HF2-19, HF2-20 <400> 55 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ser Asp Ser Ala Tyr Gly 20 25 30 Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 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HF2-9, HF2-10, HF2-12, HF2-21 <400> 57 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ser Met Glu Pro Leu Gly 20 25 30 Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Glu Tyr Ser Gly Gly 85 90 95 Val Gly Ile Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 58 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of light chain variable region of Clone HF2-8 <400> 58 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Ser Leu Gly 20 25 30 Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Glu Tyr Ser Gly Gly 85 90 95 Val Gly Ile Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 59 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of light chain variable region of Clone HF2-11 <400> 59 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ser Ser Glu Pro Leu Gly 20 25 30 Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Glu Tyr Ser Gly Gly 85 90 95 Val Gly Ile Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 60 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of light chain variable region of Clone HF2-13, HF2-23 <400> 60 Asp Ile Gln Met Thr 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Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ser Thr Ala Gly Val Gly 20 25 30 Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Glu Tyr Ser Gly Gly 85 90 95 Val Gly Ile Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 64 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of light chain variable region of Clone HF2-25 <400> 64 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ser Asn Phe Pro Met Gly 20 25 30 Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp 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120 cctgtcactc tgatctatga catcccttca cgattctccg gttccgcatc cggctccaca 180 gccacattaa ccatcactgg ggtccgagcc gaggacgagg ctgtctattt ctgtggtgcc 240 tgggaataca gcagcgatgt tggtatattt ggggccggga caaccctgac cgtccta 297 <210> 67 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of light chain variable region of Clone HF2-1, HF2-2, HF2-4, HF2-5, HF2-14, HF2-19, HF2-20 <400> 67 gacatccaga tgacccagtc cccctcctcg ctgagcgcct ccgtgggcga ccgggtgacc 60 atcacctgct ccggcggctc cgactccgcc tacggctacg gctggtatca gcagaagcct 120 ggcaaggcgc ctaagacgct gatctactgg gacgacaagc ggccctccgg cgtgccttcc 180 cggttctccg gatccagatc cggcaccgac ttcaccctga ccatctcctc cctgcaacct 240 gaggacttcg ccacctacta ctgcggagcc tgggagtact ccggcggcgt gggcatcttc 300 ggccagggta ccaaggtgga gatcaag 327 <210> 68 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of light chain variable region of Clone HF2-3 <400> 68 gacatccaga tgacccagtc cccctcctcg ctgagcgcct ccgtgggcga ccgggtgacc 60 atcacctgct ccggcggctc cgactccgcc tacggctacg gctggtatca gcagaagcct 120 ggcaaggcgc ctaagacgct gatctactgg gacgacaagc ggccctccgg cgcgccttcc 180 cggttctccg gatccagatc cggcaccgac ttcaccctga ccatctcctc cctgcaacct 240 gaggacttcg ccacctacta ctgcggagcc tgggagtact ccggcggcgt gggcatcttc 300 ggccagggta ccaaggtgga gatcaag 327 <210> 69 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of light chain variable region of Clone HF2-6, HF2-7, HF2-9, HF2-10, HF2-12, HF2-21 <400> 69 gacatccaga tgacccagtc cccctcctcg ctgagcgcct ccgtgggcga ccgggtgacc 60 atcacctgct ccggcggctc catggagcct ttgggctacg gctggtatca gcagaagcct 120 ggcaaggcgc ctaagacgct gatctactgg gacgacaagc ggccctccgg cgtgccttcc 180 cggttctccg gatccagatc cggcaccgac ttcaccctga ccatctcctc cctgcaacct 240 gaggacttcg ccacctacta ctgcggagcc tgggagtact ccggcggcgt gggcatcttc 300 ggccagggta ccaaggtgga gatcaag 327 <210> 70 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of light chain variable region of Clone HF2-8 <400> 70 gacatccaga tgacccagtc cccctcctcg ctgagcgcct ccgtgggcga ccgggtgacc 60 atcacctgct ccggcggctc cacttatagt cttggctacg gctggtatca gcagaagcct 120 ggcaaggcgc ctaagacgct gatctactgg gacgacaagc ggccctccgg cgtgccttcc 180 cggttctccg gatccagatc cggcaccgac ttcaccctga ccatctcctc cctgcaacct 240 gaggacttcg ccacctacta ctgcggagcc tgggagtact ccggcggcgt gggcatcttc 300 ggccagggta ccaaggtgga gatcaag 327 <210> 71 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of light chain variable region of Clone HF2-11 <400> 71 gacatccaga tgacccagtc cccctcctcg ctgagcgcct ccgtgggcga ccgggtgacc 60 atcacctgct ccggcggctc cagtgagcct ctgggctacg gctggtatca gcagaagcct 120 ggcaaggcgc ctaagacgct gatctactgg gacgacaagc ggccctccgg cgtgccttcc 180 cggttctccg gatccagatc cggcaccgac ttcaccctga ccatctcctc cctgcaacct 240 gaggacttcg ccacctacta ctgcggagcc tgggagtact ccggcggcgt gggcatcttc 300 ggccagggta ccaaggtgga gatcaag 327 <210> 72 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of light chain variable region of Clone HF2-13, HF2-23 <400> 72 gacatccaga tgacccagtc cccctcctcg ctgagcgcct ccgtgggcga ccgggtgacc 60 atcacctgct ccggcggctc cgatctgttg ttgggctacg gctggtatca gcagaagcct 120 ggcaaggcgc ctaagacgct gatctactgg gacgacaagc ggccctccgg cgtgccttcc 180 cggttctccg gatccagatc cggcaccgac ttcaccctga ccatctcctc cctgcaacct 240 gaggacttcg ccacctacta ctgcggagcc tgggagtact ccggcggcgt gggcatcttc 300 ggccagggta ccaaggtgga gatcaag 327 <210> 73 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of light chain variable region of Clone HF2-15, HF2-24 <400> 73 gacatccaga tgacccagtc cccctcctcg ctgagcgcct ccgtgggcga ccgggtgacc 60 atcacctgct ccggcggctc ccaggagtct cttggctacg gctggtatca gcagaagcct 120 ggcaaggcgc ctaagacgct gatctactgg gacgacaagc ggccctccgg cgtgccttcc 180 cggttctccg gatccagatc cggcaccgac ttcaccctga ccatctcctc cctgcaacct 240 gaggacttcg ccacctacta ctgcggagcc tgggagtact ccggcggcgt gggcatcttc 300 ggccagggta ccaaggtgga gatcaag 327 <210> 74 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of light chain variable region of Clone HF2-16, HF2-17, HF2-18 <400> 74 gacatccaga tgacccagtc cccctcctcg ctgagcgcct ccgtgggcga ccgggtgacc 60 atcacctgct ccggcggctc cattgagcct ttgggctacg gctggtatca gcagaagcct 120 ggcaaggcgc ctaagacgct gatctactgg gacgacaagc ggccctccgg cgtgccttcc 180 cggttctccg gatccagatc cggcaccgac ttcaccctga ccatctcctc cctgcaacct 240 gaggacttcg ccacctacta ctgcggagcc tgggagtact ccggcggcgt gggcatcttc 300 ggccagggta ccaaggtgga gatcaag 327 <210> 75 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of light chain variable region of Clone HF2-22 <400> 75 gacatccaga tgacccagtc cccctcctcg ctgagcgcct ccgtgggcga ccgggtgacc 60 atcacctgct ccggcggctc cacggcgggt gttggctacg gctggtatca gcagaagcct 120 ggcaaggcgc ctaagacgct gatctactgg gacgacaagc ggccctccgg cgtgccttcc 180 cggttctccg gatccagatc cggcaccgac ttcaccctga ccatctcctc cctgcaacct 240 gaggacttcg ccacctacta ctgcggagcc tgggagtact ccggcggcgt gggcatcttc 300 ggccagggta ccaaggtgga gatcaag 327 <210> 76 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of light chain variable region of Clone HF2-25 <400> 76 gacatccaga tgacccagtc cccctcctcg ctgagcgcct ccgtgggcga ccgggtgacc 60 atcacctgct ccggcggctc caattttcct atgggctacg gctggtatca gcagaagcct 120 ggcaaggcgc ctaagacgct gatctactgg gacgacaagc ggccctccgg cgtgccttcc 180 cggttctccg gatccagatc cggcaccgac ttcaccctga ccatctcctc cctgcaacct 240 gaggacttcg ccacctacta ctgcggagcc tgggagtact ccggcggcgt gggcatcttc 300 ggccagggta ccaaggtgga gatcaag 327 <210> 77 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of light chain variable region of Clone HF2-26 <400> 77 gacatccaga tgacccagtc cccctcctcg ctgagcgcct ccgtgggcga ccgggtgacc 60 atcacctgca ctgcgcctgc tgactccgcc tacggctacg gctggtatca gcagaagcct 120 ggcaaggcgc ctaagacgct gatctactgg gacgacaagc ggccctccgg cgtgccttcc 180 cggttctccg gatccagatc cggcaccgac ttcaccctga ccatctcctc cctgcaacct 240 gaggacttcg ccacctacta ctgcggagcc tgggagtact ccggcggcgt gggcatcttc 300 ggccagggta ccaaggtgga gatcaag 327 <210> 78 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of heavy chain variable region of Clone F <400> 78 Ala Val Thr Leu His Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His 20 25 30 Gly Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val 35 40 45 Ala Gly Ile Ser Ser Asp Gly Ser Trp Thr Gly Tyr Gly Ala Ala Val 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Phe Ser Thr Ser Tyr Gly Ala Asp Ser Ile Asp Ala Trp 100 105 110 Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser 115 120 <210> 79 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of heavy chain variable region of Clone HF2-1 <400> 79 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu 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60 tcctgcgccg cctccaattt tgtgtttagg tcccacggca tgcagtgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gcctcgagta cgtggccggc atctcctccg acggctcctg gaccggctac 180 ggagccgccg tggagggccg gttcaccatc tcccgcgacg actccaagaa caccgcctac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagacttc 300 tccaccggct acggagccga ctccatcgac gcctggggcc agggcacact agtgaccgtg 360 tcctcc 366 <210> 107 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of heavy chain variable region of Clone HF2-2 <400> 107 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggaag cttgcggctg 60 tcctgcgccg cctcccgttt taatatgcgg tcccacggca tgcagtgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gcctcgagta cgtggccggc atctcctccg acggctcctg ggagagggtt 180 ggggccgccg tggagggccg gttcaccatc tcccgcgacg actccaagaa caccgcctac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagacttc 300 tccaccggct acggagccga ctccatcgac gcctggggcc agggcacact agtgaccgtg 360 tcctcc 366 <210> 108 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of heavy chain variable region of Clone HF2-3 <400> 108 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggaag cttgcggctg 60 tcctgcgccg cctcccattt taatatgcgg tcccacggca tgcagtgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gcctcgagta cgtggccggc atctcctccg acggctcctg gtttcgggtt 180 gctgccgccg tggagggccg gttcaccatc tcccgcgacg actccaagaa caccgcctac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagacttc 300 tccaccggct acggagccga ctccatcgac gcctggggcc agggcacact agtgaccgtg 360 tcctcc 366 <210> 109 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of heavy chain variable region of Clone HF2-4 <400> 109 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggaag cttgcggctg 60 tcctgcgccg cctccgggtg gagtatgcgt tcccacggca tgcagtgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gcctcgagta cgtggccggc atctcctccg acggctcctg gaggaggcat 180 agtgccgccg tggagggccg gttcaccatc tcccgcgacg actccaagaa caccgcctac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagacttc 300 tccaccggct acggagccga ctccatcgac gcctggggcc agggcacact agtgaccgtg 360 tcctcc 366 <210> 110 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of heavy chain variable region of Clone HF2-5 <400> 110 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggaag cttgcggctg 60 tcctgcgccg cctccggttt tatgattcgt tcccacggca tgcagtgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gcctcgagta cgtggccggc atctcctccg acggctcctg ggcgcggcat 180 tcggccgccg tggagggccg gttcaccatc tcccgcgacg actccaagaa caccgcctac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagacttc 300 tccaccggct acggagccga ctccatcgac gcctggggcc agggcacact agtgaccgtg 360 tcctcc 366 <210> 111 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of heavy chain variable region of Clone HF2-6 <400> 111 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggaag cttgcggctg 60 tcctgcgccg cctcccggtt tcttctgcgt tcccacggca tgcagtgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gcctcgagta cgtggccggc atctcctccg acggctcctg gtttcgggtt 180 gctgccgccg tggagggccg gttcaccatc tcccgcgacg actccaagaa caccgcctac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagacttc 300 tccaccggct acggagccga ctccatcgac gcctggggcc agggcacact agtgaccgtg 360 tcctcc 366 <210> 112 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of heavy chain variable region of Clone HF2-7 <400> 112 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggaag cttgcggctg 60 tcctgcgccg cctcccagtt ttggattagg tcccacggca tgcagtgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gcctcgagta cgtggccggc atctcctccg acggctcctg gtttcgggtt 180 gctgccgccg tggagggccg gttcaccatc tcccgcgacg actccaagaa caccgcctac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagacttc 300 tccaccggct acggagccga ctccatcgac gcctggggcc agggcacact agtgaccgtg 360 tcctcc 366 <210> 113 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of heavy chain variable region of Clone HF2-8 <400> 113 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggaag cttgcggctg 60 tcctgcgccg cctccgggtt tcatattagg tcccacggca tgcagtgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gcctcgagta cgtggccggc atctcctccg acggctcctg gcttaagctg 180 agtgccgccg tggagggccg gttcaccatc tcccgcgacg actccaagaa caccgcctac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagacttc 300 tccaccggct acggagccga ctccatcgac gcctggggcc agggcacact agtgaccgtg 360 tcctcc 366 <210> 114 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of heavy chain variable region of Clone HF2- 9 <400> 114 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggaag cttgcggctg 60 tcctgcgccg cctccatgtt taggattcgg tcccacggca tgcagtgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gcctcgagta cgtggccggc atctcctccg acggctcctg gtttcgggtt 180 gctgccgccg tggagggccg gttcaccatc tcccgcgacg actccaagaa caccgcctac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagacttc 300 tccaccggct acggagccga ctccatcgac gcctggggcc agggcacact agtgaccgtg 360 tcctcc 366 <210> 115 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of heavy chain variable region of Clone HF2-10 <400> 115 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggaag cttgcggctg 60 tcctgcgccg cctcctttca gtattttcgt tcccacggca tgcagtgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gcctcgagta cgtggccggc atctcctccg acggctcctg gtttcgggtt 180 gctgccgccg tggagggccg gttcaccatc tcccgcgacg actccaagaa caccgcctac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagacttc 300 tccaccggct acggagccga ctccatcgac gcctggggcc agggcacact agtgaccgtg 360 tcctcc 366 <210> 116 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of heavy chain variable region of Clone HF2-11 <400> 116 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggaag cttgcggctg 60 tcctgcgccg cctccggttt tcttattagg tcccacggca tgcagtgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gcctcgagta cgtggccggc atctcctccg acggctcctg ggtgaaggtg 180 gcggccgccg tggagggccg gttcaccatc tcccgcgacg actccaagaa caccgcctac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagacttc 300 tccaccggct acggagccga ctccatcgac gcctggggcc agggcacact agtgaccgtg 360 tcctcc 366 <210> 117 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of heavy chain variable region of Clone HF2-12 <400> 117 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggaag cttgcggctg 60 tcctgcgccg cctcctatag tgaggttcgt tcccacggca tgcagtgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gcctcgagta cgtggccggc atctcctccg acggctcctg gtttcgggtt 180 gctgccgccg tggagggccg gttcaccatc tcccgcgacg actccaagaa caccgcctac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagacttc 300 tccaccggct acggagccga ctccatcgac gcctggggcc agggcacact agtgaccgtg 360 tcctcc 366 <210> 118 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of heavy chain variable region of Clone HF2-13 <400> 118 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggaag cttgcggctg 60 tcctgcgccg cctccggttt tcttgtgcgt tcccacggca tgcagtgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gcctcgagta cgtggccggc atctcctccg acggctcctg gcagcgtgtg 180 aatgccgccg tggagggccg gttcaccatc tcccgcgacg actccaagaa caccgcctac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagacttc 300 tccaccggct acggagccga ctccatcgac gcctggggcc agggcacact agtgaccgtg 360 tcctcc 366 <210> 119 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of heavy chain variable region of Clone HF2-14 <400> 119 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggaag cttgcggctg 60 tcctgcgccg cctcccatag ttcgattagg tcccacggca tgcagtgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gcctcgagta cgtggccggc atctcctccg acggctcctg gcttaggcag 180 gatgccgccg tggagggccg gttcaccatc tcccgcgacg actccaagaa caccgcctac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagacttc 300 tccaccggct acggagccga ctccatcgac gcctggggcc agggcacact agtgaccgtg 360 tcctcc 366 <210> 120 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of heavy chain variable region of Clone HF2-15 <400> 120 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggaag cttgcggctg 60 tcctgcgccg cctccggttt tgtggttagg tcccacggca tgcagtgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gcctcgagta cgtggccggc atctcctccg acggctcctg gaaggctacg 180 gcggccgccg tggagggccg gttcaccatc tcccgcgacg actccaagaa caccgcctac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagacttc 300 tccaccggct acggagccga ctccatcgac gcctggggcc agggcacact agtgaccgtg 360 tcctcc 366 <210> 121 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of heavy chain variable region of Clone HF2-16 <400> 121 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggaag cttgcggctg 60 tcctgcgccg cctccggttt tcgtattagg tcccacggca tgcagtgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gcctcgagta cgtggccggc atctcctccg acggctcctg ggtgaaggtg 180 gcggccgccg tggagggccg gttcaccatc tcccgcgacg actccaagaa caccgcctac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagacttc 300 tccaccggct acggagccga ctccatcgac gcctggggcc agggcacact agtgaccgtg 360 tcctcc 366 <210> 122 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of heavy chain variable region of Clone HF2-17 <400> 122 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggaag cttgcggctg 60 tcctgcgccg cctccggttt tatgattcgt tcccacggca tgcagtgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gcctcgagta cgtggccggc atctcctccg acggctcctg gaggaggcat 180 agtgccgccg tggagggccg gttcaccatc tcccgcgacg actccaagaa caccgcctac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagacttc 300 tccaccggct acggagccga ctccatcgac gcctggggcc agggcacact agtgaccgtg 360 tcctcc 366 <210> 123 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of heavy chain variable region of Clone HF2-18 <400> 123 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggaag cttgcggctg 60 tcctgcgccg cctcctattg ggcgtttagg tcccacggca tgcagtgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gcctcgagta cgtggccggc atctcctccg acggctcctg gttttctagt 180 gcggccgccg tggagggccg gttcaccatc tcccgcgacg actccaagaa caccgcctac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagacttc 300 tccaccggct acggagccga ctccatcgac gcctggggcc agggcacact agtgaccgtg 360 tcctcc 366 <210> 124 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of heavy chain variable region of Clone HF2-19 <400> 124 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggaag cttgcggctg 60 tcctgcgccg cctccgggtt tagtacgcgg tcccacggca tgcagtgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gcctcgagta cgtggccggc atctcctccg acggctcctg gaaggctacg 180 gcggccgccg tggagggccg gttcaccatc tcccgcgacg actccaagaa caccgcctac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagacttc 300 tccaccggct acggagccga ctccatcgac gcctggggcc agggcacact agtgaccgtg 360 tcctcc 366 <210> 125 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of heavy chain variable region of Clone HF2-20 <400> 125 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggaag cttgcggctg 60 tcctgcgccg cctcctatat ggagtatagg tcccacggca tgcagtgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gcctcgagta cgtggccggc atctcctccg acggctcctg gtcgcgggtg 180 gatgccgccg tggagggccg gttcaccatc tcccgcgacg actccaagaa caccgcctac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagacttc 300 tccaccggct acggagccga ctccatcgac gcctggggcc agggcacact agtgaccgtg 360 tcctcc 366 <210> 126 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of heavy chain variable region of Clone HF2-21 <400> 126 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggaag cttgcggctg 60 tcctgcgccg cctcctttca gtattttcgt tcccacggca tgcagtgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gcctcgagta cgtggccggc atctcctccg acggctcctg gtatcgggtg 180 caggccgccg tggagggccg gttcaccatc tcccgcgacg actccaagaa caccgcctac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagacttc 300 tccaccggct acggagccga ctccatcgac gcctggggcc agggcacact agtgaccgtg 360 tcctcc 366 <210> 127 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of heavy chain variable region of Clone HF2-22 <400> 127 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggaag cttgcggctg 60 tcctgcgccg cctccggttt tcgtattagg tcccacggca tgcagtgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gcctcgagta cgtggccggc atctcctccg acggctcctg gtttcgggtt 180 gctgccgccg tggagggccg gttcaccatc tcccgcgacg actccaagaa caccgcctac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagacttc 300 tccaccggct acggagccga ctccatcgac gcctggggcc agggcacact agtgaccgtg 360 tcctcc 366 <210> 128 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of heavy chain variable region of Clone HF2-23 <400> 128 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggaag cttgcggctg 60 tcctgcgccg cctccggttt tcgtattagg tcccacggca tgcagtgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gcctcgagta cgtggccggc atctcctccg acggctcctg gttttctagt 180 gcggccgccg tggagggccg gttcaccatc tcccgcgacg actccaagaa caccgcctac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagacttc 300 tccaccggct acggagccga ctccatcgac gcctggggcc agggcacact agtgaccgtg 360 tcctcc 366 <210> 129 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of heavy chain variable region of Clone HF2-24 <400> 129 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggaag cttgcggctg 60 tcctgcgccg cctcccgttt taatatgcgg tcccacggca tgcagtgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gcctcgagta cgtggccggc atctcctccg acggctcctg ggtgaaggtg 180 gcggccgccg tggagggccg gttcaccatc tcccgcgacg actccaagaa caccgcctac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagacttc 300 tccaccggct acggagccga ctccatcgac gcctggggcc agggcacact agtgaccgtg 360 tcctcc 366 <210> 130 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of heavy chain variable region of Clone HF2-25 <400> 130 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggaag cttgcggctg 60 tcctgcgccg cctcctatat ggagtatagg tcccacggca tgcagtgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gcctcgagta cgtggccggc atctcctccg acggctcctg gtttcgtatg 180 aatgccgccg tggagggccg gttcaccatc tcccgcgacg actccaagaa caccgcctac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagacttc 300 tccaccggct acggagccga ctccatcgac gcctggggcc agggcacact agtgaccgtg 360 tcctcc 366 <210> 131 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of heavy chain variable region of Clone HF2-26 <400> 131 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggaag cttgcggctg 60 tcctgcgccg cctcccgttt taatatgcgg tcccacggca tgcagtgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gcctcgagta cgtggccggc atctcctccg acggctcctg gattcgggtg 180 caggccgccg tggagggccg gttcaccatc tcccgcgacg actccaagaa caccgcctac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagacttc 300 tccaccggct acggagccga ctccatcgac gcctggggcc agggcacact agtgaccgtg 360 tcctcc 366 <210> 132 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer for amplifying VH domain <400> 132 ggtcagtcct ctagatcttc cggcggtggt ggcagctccg gtggtggcgg ttccgccgtg 60 acgttggacg ag 72 <210> 133 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer for amplifying VH domain <400> 133 ctggccggcc tggccactag tggaggagac gatgacttcg gtcc 44 <210> 134 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer for amplifying VL domain <400> 134 gtggcccagg cggccctgac tcagccgtcc tcggtgtc 38 <210> 135 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer for amplifying VL domain <400> 135 ggaagatcta gaggactgac ctaggacggt cagg 34 <210> 136 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer for amplifying ScFV <400> 136 gaggaggagg aggaggaggt ggcccaggcg gccctgactc ag 42 <210> 137 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer for amplifying ScFV <400> 137 gaggaggagg aggaggagga gctggccggc ctggccacta gtggagg 47 <210> 138 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for sequencing of plasmid DNA (Clone F) <400> 138 acactttatg cttccggctc 20 <210> 139 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for sequencing of plasmid DNA (Clone F) <400> 139 caaaatcacc ggaaccagag 20 <210> 140 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer for amplifying VH domain obtained from pComb3x <400> 140 gctagccgcc accatgggc 19 <210> 141 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer for amplifying VH domain obtained from pComb3x <400> 141 aggggccctt ggtggaggcc tggccggcct ggccact 37 <210> 142 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer for amplifying CH domain obtained from pComb3x <400> 142 gcctccacca agggcccctc 20 <210> 143 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer for amplifying CH domain obtained from pComb3x <400> 143 cgggatccct tgccggccgt 20 <210> 144 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer for amplifying HC obtained from pComb3x <400> 144 gctagccgcc accatgggc 19 <210> 145 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer for amplifying HC obtained from pComb3x <400> 145 cgggatccct tgccggccgt 20 <210> 146 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer for amplifying VL obtained from pComb3x <400> 146 aagcttgccg ccaccatg 18 <210> 147 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer for amplifying VL obtained from pComb3x <400> 147 agggggcggc cacggtccgg gaagatctag aggactg 37 <210> 148 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer for amplifying Ck domain obtained from pComb3x <400> 148 cggaccgtgg ccgccccctc 20 <210> 149 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer for amplifying Ck domain obtained from pComb3x <400> 149 gctctagact agcactcgc 19 <210> 150 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer for amplifying LC obtained from pComb3x <400> 150 aagcttgccg ccaccatg 18 <210> 151 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer for amplifying LC obtained from pComb3x <400> 151 gctctagact agcactcgc 19

Claims (46)

1) 상보성 결정영역(CDR)1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역에서, 상기 CDR2가 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되고, 상기 CDR3이 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역; 및
2) CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역에서, 상기 CDR3이 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역
을 포함하는, 혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)에 결합하는 항체로서,
상기 항체가 하기로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체:
(i) 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 35의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
(ⅱ) 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 36의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
(ⅲ) 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 17의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 37의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
(ⅳ) 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 18의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 38의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
(v) 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 19의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 39의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
(ⅵ) 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 20의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 40의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
(ⅶ) 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 21의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 38의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
(ⅷ) 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 22의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 38의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
(ⅸ) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 41의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
(ⅹ) 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 24의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 38의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
(xi) 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 25의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 38의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
(xii) 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 26의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 42의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
(xⅲ) 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 27의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 38의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
(xⅳ) 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 28의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 43의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
(xⅴ) 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 29의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 44의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
(xⅵ) 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 30의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 45의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
(xⅶ) 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 31의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 42의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
(xⅷ) 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 20의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 39의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
(xⅸ) 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 32의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 46의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
(xx) 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 33의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 45의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
(xxi) 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 34의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 47의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
(xxⅱ) 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 25의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 48의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
(xxⅲ) 서열번호 12의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 31의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 38의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
(xxⅳ) 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 31의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 46의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
(xxⅴ) 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 17의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 42의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
(xxⅵ) 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 34의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 49의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체; 및
(xxⅶ) 서열번호 14의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 17의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 50의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체.
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제 1 항에 있어서,
상기 항체가 인간 또는 인간화 항체인 것을 특징으로 하는, VEGF에 결합하는 항체.
제 1 항에 있어서,
상기 항체가 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM, 또는 이의 조합 또는 변이체인 것을 특징으로 하는, VEGF에 결합하는 항체.
제 32 항에 있어서,
상기 항체가 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dAb, scFV, 또는 상기 항체의 CDR을 VEGF와의 결합에 주요 부위로 하는 스캐폴드 접합체(scaffold conjugate) 형태인 것을 특징으로 하는, VEGF에 결합하는 항체.
서열번호 66 내지 77로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열로 표시되는, 제 1 항에 따른 VEGF에 결합하는 항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 DNA.
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서열번호 105 내지 131로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열로 표시되는, 제 1 항에 따른 VEGF에 결합하는 항체의 중쇄 가변영역을 코딩하는 DNA.
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제 34 항의 DNA를 포함하는, VEGF에 결합하는 항체의 경쇄 가변 영역을 발현시키는 발현벡터.
제 36 항의 DNA를 포함하는, VEGF에 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역을 발현시키는 발현벡터.
제 38 항의 발현벡터 및 제 39 항의 발현벡터로 형질 전환된 동물 세포주.
제 40 항에 있어서,
상기 동물 세포주가 CHO 세포, HEK 세포 또는 NSO 세포인 것을 특징으로 하는 동물 세포주.
제 1 항에 따른 항체를 포함하는, VEGF 과발현에 의해 야기되는 암, 또는 황반변성, 망막정맥 폐쇄증, 당뇨병성 망막증 및 허혈성 망막증으로 이루어진 군에서 선택되는 신생혈관형성 관련 안구 질환의 예방, 진단 또는 치료용 약학 조성물.
제 42 항에 있어서,
상기 VEGF 과발현에 의해 야기되는 암이 대장암, 췌장암, 신장암, 폐암, 유방암 및 난소암으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
제 42 항에 있어서,
상기 약학 조성물이 알킬화제, 대사길항물질, 풀산 동족체, 피리미딘 동족체, 퓨린 동족체 및 관련 억제제, 빈카 알칼로이드, 에피포도 필로톡신, 항생제, L- 아스파라기나제, 토포아이소머라제 억제제, 인터페론, 백금 배위 착물, 안트라센디온 치환된 우레아, 메틸 히드라진 유도체, 부신 피질 억제제, 아드레노코르티코스테로이드, 프로게스틴, 에스트로겐, 안티에스트로겐, 안드로겐, 안티안드로겐 및 고나도트로핀-방출 호르몬 동족체로 이루어진 군에서 선택되는 화학 치료제와 병용하여 사용되는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
제 42 항에 있어서,
상기 약학 조성물이 플루오로피리미딘계 약물, 파클리탁셀, 플라티늄계 약물, 인터페론알파-2a, 카보플라틴, 독소루비신(doxorubicin), 시스플라틴(cisplatin), 젬시타빈(gemcitabine), 5-플루오로우라실, 류코보린, 이리노테칸, 옥살라플라틴, 카페시타빈, 도세탁셀 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 약물과 병용하여 사용되는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
제 1 항에 따른 항체를 포함하는, VEGF 과발현에 의해 야기되는 암, 또는 황반변성, 망막정맥 폐쇄증, 당뇨병성 망막증 및 허혈성 망막증으로 이루어진 군에서 선택되는 신생혈관형성 관련 안구 질환의 진단용 키트.
KR1020130062413A 2013-05-31 2013-05-31 항-vegf 항체 및 이를 포함하는 암 또는 신생혈관형성관련 질환의 예방, 진단 또는 치료용 약학 조성물 KR101541478B1 (ko)

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