KR102377008B1

KR102377008B1 - Mct 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 관련 안과 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR102377008B1
Application number: KR1020200081199A
Authority: KR
Inventors: 석승혁; 송주하; 이기황
Original assignee: 서울대학교산학협력단; 아주대학교산학협력단
Priority date: 2019-07-01
Filing date: 2020-07-01
Publication date: 2022-03-21
Also published as: KR20210003061A; US20210002637A1; US11407999B2

Abstract

본 발명은 MCT 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 관련 안과 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 기존 치료법과는 달리 침윤된 대식세포가 분비하는 VEGF 만을 특이적으로 억제함으로써, 맥락막 모세혈관과 시세포의 항상성 유지에 필요한 VEGF의 정상적인 기능에 영향을 미치지 않고 효과적으로 혈관신생 관련 안과 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

MCT 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 관련 안과 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating angiogenesis relating ocular diseases comprising inhibitors of MCT expression or activity}

본 발명은 MCT 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 관련 안과 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

당뇨 망막병증, 노인성 황반 변성증, 조숙아 망막증, 신생혈관성 녹내장과 같은 질환은 혈관신생이 주요 원인이 되는 안과 질환들로서, 해마다 전세계적으로 수백만 명의 실명의 원인이 되고 있다. 혈관내피성장인자(VEGF)는 신생혈관 형성 유도 물질 중 가장 중요한 역할을 하고, 안구 내에서 허혈(ischemia)이 발생하면 망막내피세포, 망막색소상피세포, 망막주위세포(retinal pericytes) 내의 VEGF 양이 증가하여 혈관신생을 유도한다고 알려져 있다.

따라서, 기존의 혈관신생 관련 안과 질환의 치료는 안구 내에 병적으로 증가한 혈관내피성장인자에 대한 항체(anti-VEGF)를 안구 내로 직접 주사하여 과도하게 생성된 혈관을 퇴화시키는 방법이 주를 이루었다. 현재까지 다양한 anti-VEGF 약물이 개발되어 시판되고 있으나, 기존의 anti-VEGF 약물은 망막 및 망막색소상피 등에서 정상 혈관 유지 및 생리 작용에 필요로 하는 VEGF까지 과도하게 억제하는 문제점이 있고, 전신적인 흡수에 의한 부작용 및 눈의 국소적 합병증(예를 들면 혈압의 급격한 증가, 뇌졸중, 심근경색, 사망, 안내염, 견인 망막박리, 포도막염, 열공망막 박리 등)을 발생시키는 것이 보고된다. 따라서 정상적인 면역혈관축(immunovascular axis)을 방해하지 않는 새로운 혈관신생 관련 안과질환에 대한 치료제의 개발이 필요하다.

대한민국 공개특허 제10-2014-0141818호

본 발명의 목적은 MCT(Monocarboxylate transporter) 유전자의 발현 또는 MCT 단백질의 활성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는, 혈관신생 관련 안과 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 MCT 유전자의 발현 또는 MCT 단백질의 활성을 억제하는 억제제의 약학적 유효량을 혈관신생 관련 안과질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 혈관신생 관련 안과질환의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 MCT 유전자의 발현 또는 MCT 단백질의 활성을 억제하는 억제제(예를 들면, SR13800)가 VEGF 발현 및/또는 혈관신생을 효과적으로 억제하는 것을 확인하여, MCT 유전자의 발현 또는 MCT 단백질의 혈관신생 관련 안과 질환(예를 들면, 당뇨 망막병증)의 예방, 치료, 및/또는 개선 용도를 제안한다.

일 예는 MCT(Monocarboxylate transporter) 유전자의 발현 또는 MCT 단백질의 활성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는, 혈관신생 관련 안과 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 다른 예는, MCT(Monocarboxylate transporter) 유전자의 발현 또는 MCT 단백질의 활성을 억제하는 억제제(또는 상기 억제제를 포함하는 조성물)을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생 관련 안과 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다. 일 예에서, 상기 혈관신생 관련 안과 질환의 예방 또는 치료방법은 MCT 유전자의 발현 또는 MCT 단백질의 활성을 억제하는 억제제를 투여하는 단계 이전에, 상기 혈관신생 관련 안과 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인(선별)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 MCT 유전자는 MCT1, MCT2, MCT3, 및 MCT4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 MCT 유전자는 MCT1(SLC16A1), MCT2(SLC16A7), MCT3(SLC16A8), 및 MCT4(SLC16A3)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 MCT 단백질은 MCT1, MCT2, MCT3, 및 MCT4로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.

일 예에 따르면, MCT는 MCT1(Monocarboxylate transporter 1: e.g., 인간 MCT1(유전자: GenBank Accession Nos. NM_001166496.1, NM_003051.3 등; 단백질: GenBank Accession Nos. NP_001159968.1, NP_003042.3 등), 마우스 MCT1(유전자: GenBank Accession Nos. NM_009196.4 등; 단백질: GenBank Accession Nos. NP_033222.1 등)), MCT2(Monocarboxylate transporter 2: e.g., 인간 MCT2(유전자: GenBank Accession Nos. NM_001270622.2, NM_001270623.2, NM_004731.5 등; 단백질: GenBank Accession Nos. NP_001257551.1, NP_001257552.1, NP_004722.2 등), 마우스 MCT2(유전자: GenBank Accession Nos. NM_011391.2, NM_001358496.1, NM_001358915.1 등; 단백질: GenBank Accession Nos. NP_035521.1, NP_001345425.1, NP_001345844.1 등)), MCT3(Monocarboxylate transporter 3: e.g., 인간 MCT3(유전자: GenBank Accession Nos. NM_013356.2 등; 단백질: GenBank Accession Nos. NP_037488.2 등), 마우스 MCT3(유전자: GenBank Accession Nos. NM_020516.2 등; 단백질: GenBank Accession Nos. NP_065262.1 등)), 및 MCT4(Monocarboxylate transporter 4: e.g., 인간 MCT4(유전자: GenBank Accession Nos. NM_001042422.2, NM_001042423.2, NM_001206950.1, NM_001206951.1, NM_001206952.1 등; 단백질: GenBank Accession Nos. NP_001035887.1, NP_001035888.1, NP_001193879.1, NP_001193880.1, NP_001193881.1 등), 마우스 MCT4(유전자: GenBank Accession Nos. NM_001038653.1, NM_001038654.1, NM_030696.3 등; 단백질: GenBank Accession Nos. NP_001033742.1, NP_001033743.1, NP_109621.1 등))으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.

MCT 패밀리는 14 아형으로 구성되고, MCT의 아형 중 MCT1, 2, 3, 및 4가 락테이트(lactate), 피루브산(pyruvate) 및 케톤체(ketone bodies)와 같이 대사적으로 중요한 모노카복실레이트의 양성자-연결 수송체(proton-linked transport)를 촉진한다. 조직 및 종에 따라 상이하나, MCT1 또는 MCT2는 주로케톤체 또는 글루코스 신합성을 위한 락트산을 흡수하고, MCT3는 주로 망막색소상피에서 발현되며, MCT4는 주로 당분해 세포(glycolytic cells)에서 발현된다고 알려져 있다.

일 예에 따르면, 상기 조성물(또는 MCT 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 억제하는 억제제, 이하 MCT 억제제)은 MCT 중에서 MCT1 유전자의 발현 또는 MCT1 단백질의 활성을 선택적으로 억제하여 조성물 사용시 개체의 발달이나 생리작용 저해 등의 부작용을 최소화시킬 수 있다.

일 예에 따르면, 혈관신생 관련 안과 질환(예를 들면, 맥락막 혈관신생, 노인성 황반 변성증 또는 당뇨 망막병증)에서 락트산(lactic acid, lactate)의 발현이 증가될 수 있고, 락트산은 대식세포에서 VEGF 발현을 증가시킬 수 있으며, 일 예에 따른 조성물은 락트산에 의해 증가된 VEGF 유전자 발현, VEGF 단백질 발현, 및/또는 분비를 감소시킬 수 있어 우수한 혈관신생 관련 안과질환 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다. 일 예에서, 상기 질환에서 증가된 락트산은 망막색소상피 세포, 및/또는 내피세포에서 VEGF 발현을 증가시키지 않으나 대식세포 특이적으로 VEGF 발현을 증가시킬 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 조성물(또는 MCT 억제제)은 대식세포(macrophage)의 락트산(lactic acid) 흡수 및/또는 분비를 저해하는 것일 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 조성물(또는 MCT 억제제)은 대식세포에서의 VEGF(vascular endothelial growth factor) 분비를 억제하는 것일 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 조성물(또는 MCT 억제제)은 침윤된 대식세포에서 비정상적으로 증가하는 VEGF 의 분비를 특이적으로 억제하고, 정상 혈관 유지 및 생리 작용에 필요한 VEGF의 분비에는 영향을 미치지 않아 부작용 없이 혈관신생 관련 안과질환의 예방 또는 치료 용도로 사용될 수 있다.

일 예에 따른 조성물(또는 MCT 억제제)은 안구 내의 망막색소상피(RPE) 층 및 맥락막(choroid) 조직에 침윤한 대식세포에서 VEGF 분비(또는 발현)를 억제하여 맥락막 혈관신생, 및/또는 노인성 황반변성증의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것일 수 있다.

일 예에 따른 조성물(또는 MCT 억제제)은 안구 내의 망막 조직에서 VEGF 분비(또는 발현)를 억제하여 당뇨 망막병증의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것일 수 있고, 구체적으로 망막 조직에 침윤한 대식세포에서 VEGF 분비(또는 발현)을 억제하여 당뇨 망막병증의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것일 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 억제제는 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항체, 앱타머, 추출물 및 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 화합물은 SR13800(Cas No. 227321-12-2), AZD-3965(Cas No. 1448671-31-5), AR-C15588(Cas No. 496791-37-8), AR-C117977(Cas No. 216685-07-3), 7ACC1(DEAC, 또는 Coumarin D 1421) (Cas No. 50995-74-9), 7ACC2(DC7876) (Cas No. 1472624-85-3), α-CHC(α-cyano-4-hydroxycinnamate, α-Cyano-4-hydroxycinnamic Acid) (Cas No. 28166-41-8), pCMB(p-chloromercuribenzoic acid) (Cas No. 59-85-8), 플로레틴(phloretin) (Cas No. 60-82-2), 케르세틴(quercetin) (Cas No. 117-39-5), DIDS(4,4'-diisothiocyanostilbene-2,20-disulfonate) (Cas No. 207233-90-7), UK-5099(Cas No. 56396-35-1), 니플루믹산(niflumic acid) (Cas No. 4394-00-7), NPPB(5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)-benzoate) (Cas No. 107254-86-4), GW604714X, GW450863X. 루테올린(luteolin) (Cas No. 491-70-3), 및 로니다민(lonidamine) (Cas No. 50264-69-2)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 것일 수 있다.

일 예에 따르면, 역가(potency)와 특이성(specificity)이 낮은 화합물은 다양한 종류의 MCT 유형(subtype)에 작용하므로 정상적인 발달이나 생리작용에 부작용이 발생할 수 있다.

일 예에 따르면, AZD-3965, 및 SR13800으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물은 선택적으로 MCT1의 활성을 저해하여, 정상적인 발달이나 생리작용에 부작용 없이 효과적으로 혈관신생 관련 안과질환을 치료할 수 있다.

상기 AZD-3965는 하기 화학식 1의 일반식을 갖는 것일 수 있고, 상기 SR13800은 하기 화학식 2의 일반식을 갖는 것일 수 있다.

[화학식 1]

[화학식 2]

일 예에 따르면, 혈관신생 관련 안과 질환(예를 들면, 맥락막 혈관신생, 노인성 황반 변성증, 및/또는 당뇨 망막병증)에서 락트산(lactic acid, lactate)의 발현이 증가될 수 있고, 일 예에 따른 조성물은 락트산에 의해 증가된 VEGF 유전자 발현, VEGF 단백질 발현, 및/또는 분비를 감소시킬 수 있어 우수한 혈관신생 관련 안과질환 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.

일 예에 따르면, AZD-3965, 및 SR13800으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물이 α-CHC 보다 혈관신생 관련 안과 질환의 예방 또는 치료 효과가 더 우수한 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면, AZD-3965, 및 SR13800으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물이 α-CHC 보다 당뇨 망막병증의 예방 또는 치료 효과가 더 우수한 것일 수 있다.

본 명세서에서, "당뇨 망막병증(DR)"이란 당뇨병에 의해 말초 순환 장애가 발생하여, 이 때 망막의 미세순환에 장애가 생겨 시력 감소가 발생하는 합병증을 의미하며 증식성 DR (PDR), 비-증식성 DR (NPDR), 및 고고도 DR 을 포함할 수 있다.

일 예에 따르면, AZD-3965, 및 SR13800으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물은 α-CHC 보다 낮은 농도로 투여됨에도 α-CHC 보다 하기 (1) 내지 (3)으로 이루어지는 군 중에서 선택된 하나 이상의 우수한 효과를 가질 수 있다:

(1) 망막 조직에서 높은 혈당에 의해 증가된 VEGF 발현 억제;

(2) 망막 조직에서 높은 혈당에 의해 발생된 혈관신생 억제; 및

(3) 선택적으로 MCT1의 활성을 저해하여, 정상적인 발달이나 생리작용에 부작용이 적음.

일 예에 따르면, AZD-3965, 및 SR13800으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물은 시세포 항상성 유지에 필요한 VEGF의 정상적인 기능에 영향을 미치지 않는 것일 수 있고 예를 들면 당뇨 망막병증에서 발생한 망막조직의 VEGF 발현 및/또는 혈관신생은 효과적으로 억제하나 망막색소상피(RPE)층 및 맥락막 조직의 VEGF 발현에는 영향을 미치지 않는 것일 수 있다.

일 예에 따르면, AZD-3965, 및 SR13800으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물은 α-CHC 보다 안구 내에서 망막색소상피(RPE) 층 및 맥락막 조직에 침윤한 대식세포에서 VEGF 분비 억제 효과가 더 우수한 것일 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 것일 수 있다.

본 명세서에서, "약학적으로 허용 가능한 염"이란 양이온과 음이온이 정전기적 인력에 의해 결합하고 있는 물질인 염 중에서도 약제학적으로 사용될 수 있는 형태의 염을 의미하는데, 통상적으로 금속염, 유기 염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염 등이 될 수 있다. 예를 들어, 금속염으로는 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염, 바륨염 등), 알루미늄염 등이 될 수 있고; 유기 염기와의 염으로는 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 시클로헥실아민, 디시클로헥실아민, N,N-디벤질에틸렌디아민 등과의 염이 될 수 있으며; 무기산과의 염으로는 염산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산 등과의 염이 될 수 있고; 유기산과의 염으로는 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레인산, 시트르산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등과의 염이 될 수 있으며; 염기성 아미노산과의 염으로는 아르기닌, 라이신, 오르니틴 등과의 염이 될 수 있고; 산성 아미노산과의 염으로는 아스파르트산, 글루탐산 등과의 염이 될 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 혈관신생 관련 안과 질환은 노인성 황반 변성증(Age-Related Macular Degeneration; AMD), 당뇨 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 맥락막 혈관신생, 신생혈관 녹내장, 각막 신생혈관, 중심성 망막 정맥 폐색, 분지 망막 정맥 폐색, 증식 유리체 망막병증, 색소성 망막증, 허혈성 시신경 장애, 미숙아 망막증, 유행성 각결막염, 신생혈관성 홍채질환, 후수정체 섬유증식증, 아토피성 각막염, 상각막윤부 각막염, 위상편 건선 각막염, 및 플릭텐성 각결막염으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

일 예에 따르면, AZD-3965, 및 SR13800으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물은 α-CHC 보다 상기 혈관신생 관련 안과 질환 중에서도 특이적으로 당뇨 망막병증의 예방 또는 치료에 효과적일 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 조성물은 투여를 위해서 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 1종 이상 더 포함하여 제제화할 수 있다. 예를 들면, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 용매, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제를 부가적으로 첨가할 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 조성물(또는 MCT 억제제)은 경우에 따라서 약학적으로 허용되는 첨가제와 함께, 투여에 적합한 제형으로 제제화될 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 조성물은 점안제, 안연고, 주사제, 안구 삽입제, 과립제, 정제, 환제, 캡슐제, 겔제, 시럽, 현탁제, 유제, 점적제, 및 액제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 제형일 수 있다. 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.

경구 투여에 적합한 제형의 예는 정제, 캡슐제, 과립제, 세립제 및 산제 등을 포함하고; 비경구 투여에 적합한 제형은 주사제, 점안제, 안연고, 첩부제, 겔제 및 안구 삽입제를 포함한다. 이들 제형은 해당 분야에서 범용되어 있는 일반적인 기술을 이용하여 조제할 수 있다. 또한, 이들 제제 외에, 본 발명의 조성물은 안내 이식물용 제제 나 미소구 등의 DDS(Drug delivery System; 약물 전달계)로 제조된 제제로 제제화할 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 조성물은 임의의 공지된 전달 시스템 및/또는 투여경로에 의해 투여될 수 있다.

상기 조성물 또는 유효성분(MCT 억제제)의 유효량이 투여되는 대상은 인간, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 염소, 토끼, 마우스, 래트 등을 포함하는 포유동물 또는 이로부터 분리된 세포, 조직, 또는 이의 배양물 등일 수 있다.

본 명세서에서, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 대상 개체에게 상기 조성물 또는 유효성분(MCT 억제제)을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 경로에 의할 수 있으며, 예컨대, 경구 투여, 또는 정맥 투여, 근육 투여, 피하 투여, 복막내 투여, 병변 부위 국소 투여와 같은 비경구 투여일 수 있다. 일 예에서, 상기 조성물(또는 MCT 억제제)의 투여 경로는 유리체 내 투여, 결막낭 내 투여, 결막하 투여, 및 테논낭 하 투여로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 '약학적으로 유효한 양'은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 조성물(또는 MCT 억제제)은 개별 치료제로 투여하거나 다른 혈관신생 억제제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 조성물의 약학적 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 배설 속도, 질병 종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라 증감될 수 있으며, 예를 들면 유효성분으로서 MCT 억제제 화합물(예를 들면, α-CHC, AZD-3965, 및/또는 SR13800)을 0.0001㎍/kg 내지 1000mg/kg, 0.01㎍/kg 내지 500mg/kg, 0.1㎍/kg 내지 100mg/kg, 1㎍/kg 내지 90mg/kg, 10㎍/kg 내지 80mg/kg, 100㎍/kg 내지 70mg/kg, 1mg/kg 내지 60mg/kg, 또는 10mg/kg 내지 50mg/kg이 되도록 일 예에 따른 조성물을 투여할 수 있다. 일 예에서, 구체적으로 α-CHC는 1mM 내지 3mM 농도로 1㎕ 내지 1㎖의 양으로 일 예에 따른 조성물(MCT 억제제)을 안구 내에 투여할 수 있고, SR13800은 1μM 내지 5μM의 농도로 1㎕ 내지 1㎖의 양으로 일 예에 따른 조성물(MCT 억제제)을 안구 내에 투여할 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 조성물(MCT 억제제)은 0.001중량% 내지 10중량% 로 MCT 억제제 화합물(예를 들면, α-CHC, AZD-3965, 및/또는 SR13800)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 조성물은 0.001중량%, 0.01중량%, 0.1중량%, 0.5중량%, 1.0중량%, 1.5중량%, 2.0중량%, 5.0중량%, 또는 10중량%의 MCT 억제제 화합물(예를 들면, α-CHC, AZD-3965, 및/또는 SR13800)을 포함할 수 있다.

일 예는 MCT(Monocarboxylate transporter) 유전자의 발현 또는 MCT 단백질의 활성을 억제하는 억제제를 포함하는 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생 관련 안과 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다. 상기 예방 또는 치료방법과 관련된 상기 억제제의 투여방법, 투여 경로, 및/또는 투여 대상에 대한 것은 전솔한 바와 같다.

일 예에 따르면, 상기 혈관신생 관련 안과 질환의 예방 또는 치료방법은 MCT 유전자의 발현 또는 MCT 단백질의 활성을 억제하는 억제제를 투여하는 단계 이전에, 상기 혈관신생 관련 안과 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인(선별)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 환자를 확인하는 단계는 환자의 망막 조직에서 특이적으로 혈관신생이 발생하거나 망막색소상피(RPE) 층 및 맥락막 조직에서 특이적으로 혈관신생이 발생한 환자를 확인하는 것일 수 있다.

일 예에서 상기 환자를 확인하는 단계는 상기 환자로부터 채취된 생물학적 시료에서 분리된 대식세포에서 VEGF 발현이 증가되었는지 확인하여 수행할 수 있고, 추가적으로 상기 생물학적 시료에서 분리된 망막색소상피 세포, 및/또는 내피세포에서는 VEGF 발현이 증가되지 않았는지 확인하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 구체적으로 VEGF 발현이 락트산에 의하여 증가되었는지 확인하여 수행할 수 있다. 일 예에서, 상기 생물학적 시료는 RPE-맥락막 조직 및/또는 망막조직으로부터 분리한 세포일 수 있다.

상기 치료방법이 적용되는 대상 개체는 혈관신생 관련 안과 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 가축 등을 포함하는 포유 동물을 의미하나 이에 한정되지 않는다. MCT(Monocarboxylate transporter) 유전자의 발현 또는 MCT 단백질의 활성을 억제하는 억제제를 포함하는 약학적 조성물을 대상 개체에 투여함으로써, 개체를 효율적으로 치료할 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 혈관신생 관련 안과 질환의 예방 또는 치료방법은 MCT(Monocarboxylate transporter) 유전자의 발현 또는 MCT 단백질의 활성을 억제하는 억제제의 약학적 유효량을 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 혈관신생 관련 안과 질환의 예방 또는 치료방법을 제공할 수 있다. 약학적 유효량에 대해서는 전술한 바와 같고, 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치에 의해 결정될 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용할 수 있다.

또 다른 예는 세포에서 VEGF 발현, 및/또는 분비를 억제하기 위한 시험관내(인비트로) 방법을 제공한다. 상기 세포는 락트산이 처리된 세포일 수 있다.

일 예에서, 상기 시험관내 방법은 상기 락트산의 처리에 의해 증가된 VEGF 발현, 및/또는 분비를 억제하기 위한 것일 수 있다.

일 예에 따른 시험관내 방법이 적용되는 세포는 대식세포일 수 있고, 망막색소상피 세포(Retinal Pigment Epithelium cells), 및/또는 내피세포는 제외될 수 있다.

일 예에서, 상기 시험관내 방법은 락트산이 처리된 세포에서 VEGF 발현, 및/또는 분비를 억제하기 위한 것일 수 있고, 그 억제 정도는 락트산이 처리되지 않은 세포와 동일 및/또는 유사(또는 통계적으로 유의미하지 않음)한 정도로 VEGF 발현 및/또는 분비되도록 하는 것일 수 있다.

일 예에 따른 MCT 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 혈관신생 관련 안과 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은, 기존 치료법과는 달리 침윤된 대식세포가 분비하는 VEGF 만을 특이적으로 억제함으로써, 맥락막 모세혈관과 시세포의 항상성 유지에 필요한 VEGF의 정상적인 기능에 영향을 미치지 않고 효과적으로 혈관신생 관련 안과 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

도 1은 레이저를 조사하지 않은 대조군 및 레이저 조사 후의 망막조직을 H&E 염색한 결과를 나타낸다. 도 1에서 좌측 패널은 레이저를 조사하지 않은 대조군의 망막 조직을 나타내고, 우측 패널은 레이저 조사 후 1일차의 망막 조직을 나타낸다.
도 2는 CNV 마우스의 RPE-맥락막 조직에서의 락트산의 농도를 측정하는 과정을 나타낸 개략도이다.
도 3은 대조군(naive) 및 CNV 마우스로부터 분리한 RPE-맥락막 조직에서의 락트산의 농도(mM)를 나타낸다.
도 4a 내지 4c는 망막색소상피 세포(ARPE-19, 도 4a), 내피 세포(HUVEC, 도 4b) 및 침윤된 대식세포(THP-1, 도 4c)에서 락트산의 처리에 따른 VEGF 발현 양상을 나타낸다.
도 5는 α-CHC의 존재 또는 부재 하에서 락트산을 THP-1 세포에 처리시 VEGF 발현을 나타낸다.
도 4a 내지 4c, 및 도 5에서 좌측 그래프는 상대적인 VEGFA mRNA 발현을 나타내고, 우측 그래프는 VEGF 단백질 발현양을 나타내며 control은 락트산을 처리하지 않은 대조군을 의미한다.
도 6a 및 6b는 CHC의 존재 또는 부재 하에서 락트산으로 자극시킨 대식세포가 HUVEC에서 혈관신생을 촉진하는지 여부를 나타내는 튜브 형성 분석 결과를 나타낸다. 구체적으로 도 6a는 내피 세포의 튜브 형성을 Calcein AM으로 시각화한 이미지를 나타내고, 도 6b는 Image J 소프트웨어를 이용하여 총 분지 수를 계산한 결과를 나타낸다.
도 7a 내지 7d는 CNV 병변으로의 대식세포 침윤 및 VEGF발현을 살펴보기 위하여 유세포 분석을 수행한 결과를 나타낸다. 구체적으로, 도 7a는 CNV 마우스의 RPE-맥락막 조직으로부터 분리한 세포를 이용하여 대식세포 마커에 대해 유세포 분석을 수행한 결과를 나타내고, 도 7b는 레이저 조사 후 시간에 따른 CNV 마우스 안구에 침윤한 대식세포의 백분율(%)을 나타내며, 도 7c는 레이저 조사 후 3일차의 CNV 마우스의 대식세포에서 VEGF에 대한 대표적인 히스토그램을 나타내고, 도 7d는 대조군(naive) 및 CNV 마우스의 대식세포에서 VEGF의 형광강도를 정량(MFI; mean fluorescence intensity)한 결과를 나타낸다.
도 8a 및 8b는 CNV 마우스에 MCT 억제제를 유리체강 내 주사한 후 VEGF에 대해 유세포 분석을 수행한 결과를 나타낸다. 구체적으로 도 8a는 히스토그램을 나타내고, 도 8b는 VEGF 의 농도를 염색 대조군(staining control) 대비 상대적인 평균 형광강도로 나타낸다.
도 8c 및 8d는 MCT 억제제(α-CHC) 또는 PBS를 CNV 마우스에 주사한 후 3일차에 F4/80 또는 VEGF에 대해 면역조직염색을 수행한 결과를 나타낸다. 구체적으로, 도 8c는 MCT 억제제 주사군 또는 비히클 군에서 F4/80 또는 VEGF에 대해 면역조직염색을 수행하여 얻은 이미지이고, 도 8d는 Image J 소프트웨어를 사용하여 각각 F4/80(좌측 그래프) 및 VEGF(우측 그래프) 염색 부분을 정량하여 나타낸 것이다.
도 8e는 비히클 군 및 MCT 억제제(α-CHC) 주사군의 RPE/맥락막(choroid) 및 망막(retina) 영역에서 VEGF 단백질 발현양(pg/tissue g)을 측정한 결과를 나타낸다.
도 8f 및 8g는 비히클 군 및 MCT 억제제 주사군에서 맥락막 혈관신생(CNV)을 정량한 결과를 나타낸다. 구체적으로, 도 8f는 비히클 군(상단 이미지) 및 MCT 억제제 주사군(하단 이미지)에서 IB4(isolectin B4)에 대해 면역조직염색을 수행하여 얻은 공초점(confocal) 이미지이고, 도 8g는 IB4 양성 신호를 정량한 그래프를 나타낸다. 도 8f에서 적색의 점선은 IB4로 염색된 영역을 표시한다.
도 9a는 MCT 억제제(SR13800)의 존재 또는 부재 하에서 락트산을 THP-1 세포에 처리시 VEGF 단백질 발현양을 나타내고, 도 9b는 MCT 억제제(AR-C155858)의 존재 또는 부재하에서 락트산을 THP-1세포에 처리시 VEGF 단백질 발현양을 나타낸다.
도 10a는 대조군으로서 야생형 마우스 (wild type) 및 당뇨 마우스 (db/db mouse)의 안구 내 망막과 RPE-맥락막 조직에서 락트산을 측정하는 과정을 나타낸 개략도를 나타내고, 도 10b는 야생형 마우스(WT) 및 당뇨 마우스(db/db/)의 망막과 RPE-맥락막 조직에서 측정한 락트산 농도(mM)를 나타낸다.
도 11a는 STZ로 당뇨를 유발하고, 당뇨 망막병증(DR)을 유도한 마우스를 제조하는 과정을 나타낸 개략도이고, 도 11b는 야생형 마우스(WT)과 STZ로 당뇨 및 당뇨 망막병증을 유발한 마우스(STZ) 혈액에서의 혈당을 측정한 결과 (mg/dL)를 나타낸다.
도 12는 PBS(비히클 군)과 α-CHC(α-CHC 투여군)의 안구 내 주사에 의한 망막과 RPE-맥락막 조직의 VEGF 단백질 분비양 (ng/tissue g)을 측정한 그래프를 나타낸다. 도 12에서 STZ는 당뇨 망막병증이 유발된 마우스를 의미하고, WT은 야생형 마우스로서 정상군을 의미하며 ns는 통계적으로 유의미하지 않은 것을 의미한다.
도 13은 PBS(비히클 군)과 SR13800(SR13800 투여군)의 안구내 주사에 의한 망막과 RPE-맥락막 조직의 VEGF 단백질 발현양을 측정한 그래프를 나타낸다. 도 12에서 STZ는 당뇨 망막병증이 유발된 마우스를 의미하고, WT은 야생형 마우스로서 정상군을 의미하며, SR은 SR13800 투여를 의미한다.
도 14는 비히클 군, α-CHC 투여군, 및 SR13800 투여군의 안구 내 주사에 의한 STZ 마우스의 망막 혈관 출혈 및 신생 혈관 형성 변화를 촬영한 그림이다.
상기 도면에서 ^*는 P<0.05, ^**는 P<0.01, ^***는 P<0.001, ^****는 P<0.0001 을 의미한다.

이하, 참고예 및 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 참고예 및 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 참고예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다.

참고예 1. 세포 및 시약

인간 APRE-19 세포는 ATCC(Manassas, VA, USA)에서 얻었고 10% 소태아 혈청(FBS)(Gibco, Carlsbad, CA), 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco) 및 2mM L-글루타민(Gibco)으로 보충된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)/F12 배지(1:1, USA)에서 37℃ 5% CO₂ 조건의 ?㎱권? 배양기에서 배양하였다. ARPE-19 단층 배양(monolayer culture)을 위해 24-웰 조직 배양 플레이트(웰 당 1.53105 세포; Corning, Corning, NY, USA)에 ARPE-19세포를 접종하고 혈청을 감소(1% FBS)시킨 DMEM/F12 배지에서 유지시켰다. 40Ωcm²이상의 TER(Transepithelial resistance)을 갖는 융합 단층 배양물(Confluent monolayer culture)을 실험에 사용하였다.

HUVEC(Human umbilical vein endothelial cell; Lonza Ltd., Basel, Switzerland)을 EGM-2(endothelial growth medium-2; Lonza)에서 배양하였다. 인간 급성 단구성 백혈병 THP-1 세포주를 10% FBS(Gibco)를 함유하는 RPMI 배지에서 유지시켰다. 37℃ 5% CO₂ 조건으로 2일 동안 15ng/㎖ PMA(Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA)와 THP-1 세포를 배양하여, THP-1 세포를 대식세포(macrophage)로 분화시켰다.

24-웰 플레이트에서 유지된 융합 ARPE-19 단층 세포를 지정된 기간 동안 3mM의 MCT 억제제(monocarboxylate transporter inhibitor)인 α-CHC(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid; Sigma-Aldrich)의 존재 또는 부재 하에서 10mM의 L(+)-락트산(L(+)-lactic acid)(Sigma-Aldrich Corp.)과 함께 인큐베이션하였다. HUVEC을 24-웰 플레이트에 1Υ10⁵/웰의 밀도로 접종하였고, 세포가 60% 내지 70%의 융합(confluence)에 도달했을 때, 3mM a-CHC의 존재 또는 부재 하에서 10mM의 L(+)-락트산에 세포를 노출시켰다. THP-1 세포를 3x10⁵/웰의 밀도로 24-웰 플레이트에 접종하고, PMA 처리로 대식세포로 분화시킨 후 3mM a-CHC의 존재 또는 부재 하에서 20mM L(+)-락트산과 함께 배양하였다.

또한, THP-1 세포를 3x10⁵/웰의 밀도로 24-웰 플레이트에 접종하고, PMA 처리로 대식세포로 분화시킨 후 여기에 0.5 내지 2μM 농도의 SR13800 (Tocris Bioscience, Bristol, UK) 및 300 내지 500nM 농도의 AR-C155858를 각각 처리하여, L(+)-락트산 20mM과 함께 배양하였다.

참고예 2. 맥락막 혈관신생(choroidal neovascularization; CNV)을 유도한 마우스 제작

7 내지 8주령의 암컷 야생형 C57BL/6J 마우스(Samtako Co., Gyeonggi, Korea)를 실험에 사용하였다. 연구 프로토콜은 서울대학교 동물 보호 및 사용위원회(승인 번호 SNU-160114-1)의 승인을 받았고, 모든 동물 실험에서 안과 및 시력 연구에서의 동물 이용(Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research)을 위한 ARVO(Association for Research in Vision and Ophthalmology) 지침을 준수하였다.

7 내지 8 주령의 암컷 C57BL/6J 마우스를 케타민 100mg/kg 및 크실라진 10mg/kg의 합제로 복강 내 주사하여 마취시키고, 1% 트로피카마이드(Alcon Laboratories Inc., Fort Worth, TX, USA)를 점안하여 마우스의 동공을 확장시켰다. 831-nm 106 다이오드 레이저 광응고(laser photocoagulation) 방법으로 (75㎛ spot size, 0.1초 지속 시간, 120mW) 시신경 원판(optic disc)에서 2 디스크 직경의 3, 6, 9, 12시 방향으로 레이저를 조사하였다. 레이저 광 응고에 의한 버블링(bubbling) 또는 팝 센싱(pop sensing)을 브루크 막의 성공적인 파열로 간주하였다.

대식세포에서 락트산 섭취를 차단하여 항 혈관 형성 효과를 평가하기 위해, 대식세포가 레이저 조사 부위(화상 부위)에 침윤하기 시작할 때인 레이저 조사 후 1일차에 PBS에 용해된 3mM의 a-CHC 2㎕ 또는 PBS(vehicle) 2㎕를 유리체강 내(intravitreally) 주사하고 이를 추후 실험에 사용하였다.

참고예 3. 당뇨 망막병증(Diabetic Retinopathy)를 유도한 마우스의 제작

당뇨 망막병증 모델을 제조하기 위해 7 내지 8 주령의 수컷 야생형 C57BL/6J 마우스를 실험에 사용하였다. 연구 프로토콜은 서울대학교 동물 보호 및 사용위원회 (승인 번호 SNU-190313-1-1)의 승인을 받았다.

7 내지 8 주령의 수컷 C57BL6/J 마우스의 복강에 STZ (streptozotocin, Sigma)를 투여한 후, 이틀 후에 혈당을 측정하여 고혈당으로 유도되었는지 확인하였다. 혈당이 400mg/dL 이상으로 유도된 마우스를 선별하여 추후 실험에 사용하였다. STZ를 투여하고, 약 10주 후부터 당뇨 망막병증이 나타나기 시작하였다.

당뇨 망막병증이 유도된 마우스에 STZ 투여 후 약 140일 차에 PBS에 용해된 3mM의 a-CHC 2㎕, PBS에 용해된 2μM의 SR13800 2㎕, 또는 PBS(vehicle) 2㎕를 유리체강 내(intravitreally) 주사하고 이를 추후 실험에 사용하였다.

참고예 4. 대사산물 추출 및 락트산(lactic acid) 농도 측정

RPE-맥락막(choroid) 및/또는 망막 조직을 마우스로부터 분리하고, 이전에 기술된 방법(Zhu D et al., Curr Eye Res. 2012;37:1025-1029.)으로 대사산물을 추출하였다. 구체적으로, 새로 분리한 조직을 1M PCA(perchloric acid) 용액 100㎕에서 균질화시키고, 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션한 후 15,871g로 15분간 원심분리하였다. 상등액을 분리하고, 상등액에 2M KOH(1㎕ PCA 당 0.25㎕)를 첨가하여 PCA를 중화시켰다. 15,871 g로 15분간 원심분리한 후, 분리한 상등액을 락트산 측정에 사용하였다. 락트산 농도는 Lactate Colorimetric/Fluorometric Assay Kit(BioVision, Milpitas, CA, USA)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 측정했다.

참고예 5. 효소 면역 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

세포를 24 시간 동안 락트산으로 처리하였다. 배지를 수집하고 5분 동안 587g에서 원심분리하여 미립자를 제거하고 ELISA 수행 전까지 -80℃에서 저장하였다.

망막(retina) 및 RPE-맥락막 조직을 대조군(naive; CNV를 유도하지 않은 정상군) CNV 마우스(레이저 조사 후 3일차), 또는 당뇨 망막병증 마우스(STZ 투여 후 20주차)로부터 분리하고, 분리한 조직을 1% 프로테아제 억제 칵테일 및 1% 포스파타제 억제 칵테일(GenDEPOT, Katy, TX, USA)을 포함하는 차가운(ice-cold) RIPA 용해 버퍼(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)에서 균질화시켰다. 15,871g에서 15분간 원심분리한 후, 분리한 상등액을 ELISA 분석에 사용하였다. VEGF의 분비는 제조사의 지침에 따라 ELISA Duoset 시스템(R & D Systems, Minneapolis, MN, USA)을 사용하여 측정하였다.

참고예 6. RNA 분리 및 실시간 RT-PCR(real-time PCR)

트라이졸(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 세포에서 총 RNA(total RNA)를 추출했다. 나노드랍 분광 광도계(NanoDrop Technology, Wilmington, DE, USA)를 사용하여 RAN 농도/품질을 평가하였다. 동량의 RNA를 역전사 키트(Enzynomics, Daejeon, Korea)를 사용하여 cDNA로 역전사시켰고, SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 정량적 실시간 PCR(ABI PRISM 7900, Applied Biosystems)을 수행하여 유전자 발현을 측정하였다. 95℃에서 12 분 후에, 95℃에서 10초 및 60℃에서 30초로 이루어진 사이클을 50회 수행하였다.

각 샘플의 상대적인 mRNA 발현은 β-actin과 RPL37A에 의해 표준화되었고 Student 's unpaired t-test를 사용하여 통계를 분석하였다. 증폭에 사용된 프라이머의 염기서열은 하기 표 1에 기재하였다.

프라이머		염기서열(5'->3')	서열번호
β-actin	Forward	5'-ATTGCCGACAGGATGCAGAA-3'	서열번호 1
β-actin	Reverse	5'-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3'	서열번호 2
RPL37A	Forward	5'-ATTGAAATCAGCCAGCACGC-3'	서열번호 3
RPL37A	Reverse	5'-AGGAACCACAGTGCCAGATCC-3'	서열번호 4
VEGFA	Forward	5'-ATTGAAATCAGCCAGCACGC-3'	서열번호 5
VEGFA	Reverse	5'-AGGAACCACAGTGCCAGATCC-3'	서열번호 6

참고예 7. 면역조직화학(Immunohistochemistry)

48 시간 동안 15ng/㎖ PMA를 처리하여 대식세포로 분화된 THP-1 세포를 18 시간 동안 락트산으로 처리하고 4% 파라포름알데히드에서 15분간 고정시켰다. 0.3% Triton X-100을 함유하는 PBS 중 5% FBS에서 1시간 동안 세포를 블로킹한 후, 48℃에서 하기의 1 차 항체와 함께 밤새 배양하였다: FITC-접합 CD68(KP1; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA) 및 APC-접합 항마우스-VEGF(C-1, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) 세포를 헹구고 PBS로 3회 세척 하였다. 핵을 염색하기 위해, 세포를 핵 염색약 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole) 3㎕로 15분 동안 처리하였다. Olympus FV1000 Confocal Scanning Scope(Olympus, Tokyo, Japan)를 사용하여 염색된 세포를 관찰하였다. ImageJ 소프트웨어 (http://imagej.nih.gov/ij/; provided in the public domain by the National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 VEGF 강도를 측정하였다.

상기 참고예 2의 방법으로 마우스에 레이저를 조사하고, 3일차에 마우스로부터 안구를 적출하고 4% 파라 포름알데히드에서 1시간 동안 고정시켰다. 망막 제거 후, RPE-맥락막 조직을 랫트 항-마우스 F4/80(Bio-Rad, Richmond, CA, USA) 및 APC 접합 항 마우스 VEGF (C-1; Santa Cruz Biotechnology, Inc.)와 함께 48℃에서 밤새 배양하였다. 플랫 마운트를 실온에서 오비탈 쉐이커를 사용하여 10분간 PBS로 10회 세척한 후 Alexa-Fluor 488로 표지된 염소 항-랫트 IgG(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)와 1 시간 동안 인큐베이션하였다. Olympus FV1000 공초점 스캐닝 스코프 (Confocal Scanning Scope) 하에서 염색된 조직을 검사하였다. 침윤된 대식세포 및 분비된 VEGF의 영역을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정하였다.

참고예 3의 방법으로 제조한, STZ로 당뇨가 유발된 마우스의 안구를 적출하고 4% 파라 포름알데히드에서 1시간 동안 고정시켰다. 전안방을 제거한 후, 망막 조직을 FITC-접합 isolectin B4 (Sigma)와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 실온에서 오비탈 쉐이커를 사용하여 10분간 PBS로 10회 세척한 후, Olympus FV1000 공초점 스캐닝 스코프 (Confocal Scanning Scope) 하에서 염색된 조직을 검사하였다.

참고예 8. 조직학

안구 내 조직학적인 형태를 확인하기 위해, 조직염색을 수행하였다. 구체적으로, 레이저 조사 후 고정된 안구(globe)를 파라핀에 포매시키고, 표준 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 수행하였다. 염색된 부분을 광학 현미경(Labophot; Nikon, Tokyo, Japan)을 사용하여 디지털화하였다.

참고예 9. 맥락막 혈관신생(CNV) 정량화

CNV의 평가를 위해, 레이저 조사 후 1일차에 PBS 또는 α-CHC를 안구 내 주사하고, 6일 후(레이저 조사 후 7일차)에 CNV 마우스의 안구에서 분리한 RPE-맥락막 조직을 Alexa-Fluor 594-접합 IB4(isolectin B4) (Molecular Probes)로 면역조직염색하여 CNV를 시각화하였다. Olympus FV1000 공 초점 스캐닝 스코프로 획득한 이미지를 IMARIS 이미징 소프트웨어(Bitplane, Zurich, Switzerland)에서 처리하여 IB4-양성 CNV 양을 정량하였다.

참고예 10. 튜브 형성 분석(Tube Formation Assay)

4℃에서 성장 인자가 감소된 Matrigel(Corning)을 밤새 해동하였다. 미리 냉각된 24-웰 플레이트의 각 웰을 100㎕ Matrigel로 코팅하고 40분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. HUVEC(3x10⁴ 세포)을 100㎕의 EGM-2 배지에 현탁시키고 400㎕의 대식세포 조건화 배지에 분주하고, 37℃ 5% CO₂ 조건으로 12시간 동안 배양하였다. 대식세포 조건화 배지는 24시간 동안 20mM의 락트산을 대식세포(또는, α-CHC 로 1시간 동안 전처리한 대식세포)에 처리하여 자극하고, 배지를 갈아준 후 상등액을 수집한 것을 의미한다.

내피 세포 튜브 형성을 Calcein AM(Corning)으로 시각화 한 다음 Leica CTR6000 형광 현미경(Wetzlar, Germany)을 사용하여 영상화하였다. 모세관-유사 구조의 수는 저전력 필드(low-power field)(x10)의 수동 계수(manual counting)로 정량하였다. 각 웰에 대해 5개의 독립적인 필드가 평가되었고, 필드 당 평균 분지 수(배율, x10)를 측정하였다.

참고예 11. 유세포 분석(Flow Cytometry)

15ng/㎖의 PMA로 48시간 동안 처리하여 대식세포로 분화한 THP-1 세포를 18시간 동안 락트산으로 처리하였다. 고정시키고 투과성을 증가시킨 세포를 APC 접합 항마우스 VEGF(C-1; Santa Cruz Biotechnology, Inc.)로 염색하였다. LSR-II cytometer(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 표지된 세포를 분석하였고, FlowJo 소프트웨어(버전 7.6.2, Ashland, OR, USA)를 사용하여 데이터를 분석하였다.

레이저 조사 후 1, 3, 7, 14, 21 일차에 레이저를 조사한 안구를 적출하였다. 전안방(anterior segment) 및 유리체(vitreous humor)를 제거한 후 망막과 RPE-맥락막을 포함하는 후안방(posterior segment)을 50unit/㎖의 DNase I(Sigma-Aldrich Corp.) 존재하에 1mg/㎖의 I 형 콜라게나제(Sigma-Aldrich Corp.)를 처리하여 1시간 동안 효소적으로 해리시키고 단일세포로 분해시켰다. 685g에서 5분 동안 원심분리하여 PBS에서 단일세포 현탁액을 세척한 후, 세포 펠렛을 1% BSA 및 0.1% 아지드화 나트륨(sodium azide)을 함유하는 FACS 버퍼 200㎕으로 현탁시켰다. 표면 염색을 위해, 하기의 항체를 사용하였다. : Q655-접합 항 마우스 CD45(clone: 30-F11; eBioscience, San Diego, CA, USA), PE-접합 항 마우스 F4/80(clone: BM8; eBioscience), APC eFluor 780-접합 항 마우스 CD11b(clone: M1/70, eBioscience), V450-접합 항 마우스 Gr-1(clone: RB6-8C5; eBioscience), FITC-접합 항 랫트 CD206(clone: MR5D3, AbD Serotec, Raleigh, NC, USA)

세포 내의 사이토카인을 검출하기 위해, 세포를 1% 파라포름알데하이드로 15분 동안 고정시키고 BD Perm/Wash 버퍼(BD Pharmingen, San Diego, CA, USA)로 15분 동안 인큐베이션하여 투과성을 증가시킨 후 APC-접합 항마우스 VEGF(C-1, Santa Cruz Biotechnology, Inc.)의 항체와 인큐베이션하여 플랫 마운트 면역조직 염색을 실시하였다.

LSR-II cytometer(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 표지된 세포를 분석하였고, FlowJo 소프트웨어(버전 7.6.2, Ashland, OR, USA)를 사용하여 데이터를 분석하였다.

참고예 12. 통계 분석

모든 결과를 평균 ± 표준오차(SEM)로 표현하였다. 그룹 간의 통계적 유의성은 Student 's unpaired t-test(two-tailed)로 평가하였다. P <0.05는 통계적으로 유의하다고 여겨졌다.

실시예 1. 맥락막 혈관신생(CNV) 마우스에서의 락트산 농도

상기 참고예 2 및 8의 방법과 같이, 레이저 조사를 통해 마우스에서 CNV를 유도하고, 레이저를 조사하지 않은 대조군 및 레이저 조사 후의 망막조직을 H&E 염색하여 이를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 좌측 패널은 레이저를 조사하지 않은 대조군의 망막 조직을 나타내고, 우측 패널은 레이저 조사 후 1일차의 망막 조직을 나타낸다. 레이저를 조사하지 않은 대조군과 비교하였을 때 레이저 조사 후 1일차에 RPE 층과 부르크 막에 균열이 확인되었다. 이로부터 참고예 2의 방법으로 성공적으로 마우스에 CNV를 유도한 것을 알 수 있었다. 레이저를 마우스의 망막상피세포와 부르크막에 조사하여 인위적으로 맥락막의 혈관신생을 유도한 CNV 마우스 모델은 맥락막 혈관신생 및/또는 노인성 황반 변성증을 대변하는 동물 모델로서 사용되어 왔다.

도 2는 CNV 마우스의 RPE-맥락막 조직에서의 락트산의 농도를 측정하는 과정을 나타낸 개략도이다. 상기 참고예 3의 방법과 같이, CNV 마우스로부터 RPE-맥락막 조직을 분리하고 대사산물을 추출한 후 락트산의 농도를 측정하였다. 도 3은 대조군(naive)및 CNV 마우스로부터 분리한 RPE-맥락막 조직에서의 락트산의 농도(mM)를 나타낸다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 레이저 조사에 의해 CNV를 유도 후 3일차(3d)에 측정한 락트산 수준은 레이저를 조사하지 않은 대조군에 비해 유의하게 증가하였다.

실시예 2. 인비트로에서 VEGF 분비에 대한 락트산 및 MCT 억제제의 영향

본 실시예에서 세포유형에 따라 락트산이 VEGF 분비에 어떤 영향을 미치는지 살펴보고자 했다.　망막색소상피 세포, 내피 세포 및 침윤된 대식세포에서 VEGF 발현에 대한 락트산의 영향 살펴보기 위해 ARPE-19, HUVEC 및 PMA-분화된 THP-1 대식세포를 사용하여 인비트로 세포 실험을 수행하였다. 참고예 1에서와 같이 각 세포를 락트산으로 처리하였다.

ARPE-19, HUVEC 및 THP-1에서 VEGFA mRNA 및 VEGF 단백질 발현양을 각각 실시간 RT-PCR(참고예 5) 및 ELISA(참고예 4)로 측정하여, 그 결과를 도 4a 내지 도 4c에 나타내었다.　도 4a 및 4b에 나타난 바와 같이, 락트산의 처리 후에 ARPE-19 및 HUVEC에서의 VEGF에 대한 유전자 전사체 및 단백질 발현은 락트산 처리하지 않은 대조군(control)과 비교하였을 때 유의미하게 변하지 않았다.

그러나, 도 4c에 나타난 바와 같이 PMA로 분화된 THP-1 대식세포에서 락트산은 VEGFA mRNA 및 단백질 발현을 현저히 증가시켰으며 락트산 처리 후 3 배 이상으로 VEGF 발현을 증가시켰다.

도 5는 MCT 억제제(α-CHC)의 존재 또는 부재 하에서 락트산을 THP-1 세포에 처리시 VEGFA mRNA 및 VEGF 단백질 발현을 나타낸다. 락트산으로 자극 후 24시간 동안 THP-1 대식세포에서 약 5배 정도 VEGF 분비가 증가되었고, MCT 억제제(α-CHC) 및 락트산 처리시 락트산만을 처리한 그룹에 비하여 VEGF 분비가 감소하였으며 이러한 결과는 MCT 억제제 농도 의존적이었다. HCl에 의해 pH 4.5로 산성화된 배지에 노출된 THP-1 대식세포는 VEGF 발현에 유의미한 변화를 보이지 않았고, 이는 락트산에 의한 VEGF의 발현 증가가 배양 배지의 산성화 때문이 아니라는 것을 의미한다.

도 9a는 MCT 억제제(SR13800)의 존재 또는 부재 하에서 락트산을 THP-1 세포에 처리시 VEGF 단백질 발현양을 나타내고, 도 9b는 MCT 억제제(AR-C155858)의 존재 또는 부재하에서 락트산을 THP-1세포에 처리시 VEGF 단백질 발현양을 나타낸다. 락트산으로 자극 후 24시간 동안 THP-1 대식세포에서 VEGF 분비가 현저히 증가되었고, MCT 억제제(SR13800) 및 락트산 처리시 락트산만을 처리한 그룹에 비하여 VEGF 분비가 감소하였으며 이러한 결과는 MCT 억제제 농도 의존적이었으나, AR-C155858 처리에 의할 경우 락트산에 의해 증가된 VEGF 발현은 유의미한 변화를 나타내지 않았다.

실시예 3. 신생 혈관 형성에 대한 락트산의 효과

락트산으로 자극한 대식세포가 신행 혈관 형성을 촉진하는지 여부를 확인하기 위해, 상기 참고예 10의 방법과 같이 HUVEC에서 튜브 형성 분석을 수행하였다. 도 6a 및 6b는 MCT 억제제(α-CHC)의 존재 또는 부재 하에서 락트산으로 자극시킨 대식세포가 HUVEC에서 신생 혈관 형성을 촉진하는지 여부를 나타내는 튜브 형성 분석 결과를 나타낸다. 구체적으로 도 6a는 내피 세포의 튜브 형성을 Calcein AM으로 시각화한 이미지를 나타내고, 도 6b는 Image J 소프트웨어를 이용하여 총 분지 수를 계산한 결과를 나타낸다.

도 6a에 나타난 바와 같이, 락트산으로 자극한 대식세포의 상등액을 첨가시 내피세포(HUVEC)에서 튜브 형성이 현저하게 증가되었으나, MCT 억제제(a-CHC) 전처리된 대식세포를 락트산으로 처리한 후 수집한 상등액을 첨가시 내피세포(HUVEC)에서 증가된 튜브 형성은 감소하였다. 도 6b에 나타난 바와 같이 락트산으로 자극한 대식세포의 상등액을 첨가시 형성된 분지(branch) 수가 대조군(락트산 비처리군) 대비 약 5배 정도 증가하였고, MCT 억제제(a-CHC) 전처리된 대식세포를 락트산으로 처리한 후 수집한 상등액 추가시 락트산만을 처리한 그룹에 비하여 분지 수가 현저히 감소하였다.

이로부터 락트산이 내피세포에서 혈관형성을 유도하고, MCT 억제제가 락트산이 유도하는 혈관형성을 억제하는 것을 알 수 있다.

실시예 4. CNV 마우스에서의 대식세포의 침윤 및 VEGF 발현

인 비보에서 락트산의 영향을 조사하기 위해, 상기 참고예 11의 방법과 같이 유세포 분석을 수행하여 CNV 병변으로의 대식세포 침윤 및 VEGF 발현을 측정하였다.

도 7a 내지 7d는 CNV 병변으로의 대식세포 침윤 및 VEGF 발현을 살펴보기 위하여 유세포 분석을 수행한 결과를 나타낸다. 구체적으로, 도 7a는 CNV 마우스의 RPE-맥락막 조직으로부터 분리한 세포를 이용하여 대식세포 마커에 대해 유세포 분석을 수행한 결과를 나타내고, 도 7b는 레이저 조사 후 시간에 따른 CNV 마우스 안구에 침윤한 대식세포의 백분율(%)을 나타내며, 도 7c는 레이저 조사 후 3일차의 CNV 마우스의 대식세포에서 VEGF에 대한 대표적인 히스토그램을 나타내고, 도 7d는 대조군(naive) 및 CNV 마우스의 대식세포에서 VEGF의 형광강도를 정량(MFI; mean fluorescence intensity)한 결과를 나타낸다.

도 7a 및 7b에 나타난 바와 같이 레이저 조사 후 1일차부터 유의적으로 대식세포(CD45+CD11b+Gr1-F4/80+) 비율이 증가하여, 3일차에 최고치를 보였으며, 레이저를 조사하지 않은 대조군 대비 대식세포 비율이 약 10배 이상 증가하였다. 도 7c및 7d에 나타난 바와 같이, 레이저 처리 후 3 일차에 CNV 마우스의 대식세포 당 세포 내 VEGF 함유량은 레이저를 조사하지 않은 대조군(naive)에 비해 현저히 증가하였다.

실시예 5. CNV 마우스에서 신생 혈관 형성에 대한 MCT 억제제의 효과

상기 참고예 2의 방법과 같이 제조한 CNV 마우스에 레이저 조사 후 1일차에 PBS(이하, 비히클 군) 또는 PBS에 용해시킨 a-CHC(이하, MCT 억제제 주사군)를 유리체강 내 주사하여 동물모델에서 신생 혈관 형성에 대한 MCT 억제제의 효과를 평가하였다.

비히클 군 및 MCT 억제제 주사군에 대해 참고예 10의 방법과 같이 유세포 분석을 수행하여, VEGF 발현에 대한 MCT 억제제의 효과를 측정하였다. 도 8a 및 8b는 CNV 마우스에 MCT 억제제를 유리체강 내 주사한 후 VEGF에 대해 유세포 분석을 수행한 결과를 나타낸다. 구체적으로 도 8a는 히스토그램을 나타내고, 도 8b는 VEGF 의 농도를 염색 대조군 대비 상대적인 평균 형광강도로 나타낸다. 도 8a 및 8b에 나타난 바와 같이, CNV 마우스에 MCT 억제제인 a-CHC를 주사시 비히클 군에 비하여 VEGF 발현이 현저히 감소하였고 이는 CNV를 유도하지 않은 대조군(naive)과 비슷한 정도였다.

상기 참고예 7의 방법과 같이 레이저 조사 후 3일차의 CNV 마우스에서 면역조직화학 실험을 수행하여 MCT 억제제가 침윤한 대식세포에서 VEGF 분비에 대해 어떤 영향을 미치는지 살펴보았다. 도 8c 및 8d는 MCT 억제제 또는 PBS를 CNV 마우스에 주사한 후 3일차에 F4/80 또는 VEGF에 대해 면역조직염색을 수행한 결과를 나타낸다. 구체적으로, 도 8c는 MCT 억제제 주사군 또는 비히클 군에서 F4/80 또는 VEGF에 대해 면역조직염색을 수행하여 얻은 이미지이고, 도 8d 는 Image J 소프트웨어를 사용하여 각각 F4/80(좌측 그래프) 및 VEGF(우측 그래프) 염색 부분을 정량하여 나타낸 것이다. 도 8c 및 8d에 나타난 바와 같이, 비히클 군(523,378 ± 165,071㎛²)에 비해 MCT 억제제 주사군(383,738 ± 196,716㎛²)에서 F4/80 염색된 대식세포 영역에서 VEGF 양성 영역이 유의미하게 감소하였다. 그러나 침윤된 대식세포의 면적은 비히클 군과 MCT 억제제 주사군에서 유의미한 차이가 나타나지 않았다. 이로부터 CNV 유도에 의해 대식세포의 침윤이 발생하고, MCT 억제제는 침윤한 대식세포에서의 VEGF 분비를 효과적으로 억제하는 것을 알 수 있다.

상기 참고예 5의 방법으로 ELISA를 수행하여 비히클 군 및 MCT 억제제 주사군의 RPE/맥락막(좌측 그래프) 및 망막 영역(우측 그래프)에서 VEGF 단백질 발현양을 측정하여 이를 도 8e에 나타내었다. RPE/맥락막 조직에서 CNV 유도에 의하여 VEGF 단백질이 증가(2120.5 ± 286.4pg/tissue g)하였고, MCT 억제제 주사군에서는 CNV 유도에 의해 증가한 VEGF 단백질의 양이 유의미하게 감소하였다.

상기 참고예 9의 방법으로 레이저 조사후 7일차에 비히클 군 및 MCT 억제제 주사군으로부터 분리한 RPE-맥락막 조직에서 IB4에 대해 면역조직염색을 수행하여 CNV를 정량한 결과를 도 8f 및 8g에 나타내었다. 도 8f는 비히클 군(상단 이미지) 및 MCT 억제제 주사군(하단 이미지)에서 IB4(isolectin B4)에 대해 면역조직염색을 수행하여 얻은 공초점(confocal) 이미지이고, 도 8g는 IB4 양성 신호를 정량한 그래프를 나타낸다. 도 8f에서 적색의 점선은 IB4로 염색된 영역을 표시한다. 도 8f 및 8g에 나타난 바와 같이 IB4-양성 내피세포는 비히클 군(141,472.9 ± 49,186㎛³) 대비 MCT 억제제 주사군(74,160.6 ± 12,339.5㎛³)에서 현저히 감소하였다.

도 8f에 나타난 바와 같이, 상기 참고예 2의 방법으로 성공적으로 마우스에 CNV를 유도한 것을 알 수 있으며 MCT 억제제를 유리체강 내 주사시, 맥락막 혈관 신생이 억제되었다.

종합적으로 상기의 결과로부터 CNV 동물모델에서 MCT 억제제가 대식세포에서 락트산의 수송을 차단함으로써, VEGF 분비를 현저히 감소시키고, 침윤한 대식세포에 의한 비정상적인 혈관신생을 효과적으로 억제하는 것을 알 수 있었다.

실시예 6. 당뇨 망막병증을 유도한 마우스에서 MCT 억제제의 효과

실시예 6-1. 당뇨 망막병증을 유도한 마우스에서 락트산의 농도

1년령의 당뇨가 유발된 비만 마우스 (이하, db/db 마우스, 충분히 당뇨 망막병증이 유도된 상태)의 안구(망막 및 RPE-맥락막 조직)에서 상기 참고예 4의 방법을 이용하여 락트산 농도를 평가하였다. 도 10a는 db/db 마우스의 망막과 RPE-맥락막 조직에서의 락트산의 농도를 측정하는 과정을 나타낸 개략도이다. 도 10b는 대조군(wild-type) 및 db/db 마우스로부터 분리한 망막, RPE-맥락막 조직에서의 락트산 농도(mM)를 나타낸다. 도 10b에 나타난 바와 같이, 당뇨 유발에 의해 망막 조직의 락트산 수준이 대조군에 비해 유의하게 증가하였으나 RPE-맥락막 조직에서는 락트산 수준의 유의미한 변화는 관찰되지 않았다.

실시예 6-2. 당뇨 망막병증을 유도한 마우스에서 혈당 측정

상기 참고예 3의 방법과 같이 STZ로 당뇨를 유도한 마우스를 제작하고 혈당 증가를 평가하였다. 도 11a는 STZ로 당뇨를 유발하고, 당뇨 망막병증(DR)을 유도한 마우스를 제조하는 과정을 나타낸 개략도이다. 도 11b는 야생형 마우스(WT)와 STZ로 당뇨 및 당뇨 망막병증을 유발한 마우스(STZ) 혈액에서의 혈당을 측정한 결과 (mg/dL)를 나타낸다. 도 11a에서 나타난 바와 같이, STZ의 복강 주사에 의해 유의적으로 혈당이 현저하게 증가하였다.

실시예 6-3. 당뇨 망막병증을 유도한 마우스에서 VEGF 발현 측정

본 실시예에서는 참고예 3 및 4의 방법과 같이, 당뇨 및 당뇨 망막병증을 유도한 마우스의 안구에 PBS(이하, 비히클 군) 또는 PBS에 용해시킨 α-CHC와 SR13800을 각각 유리체강 내 주사하여 당뇨 망막병증 동물모델에서 신생 혈관 형성에 대한 α-CHC와 SR13800의 효과를 평가하였다. 도 12는 비히클 군과 α-CHC 투여군에서 망막과 RPE-맥락막 조직의 VEGF 단백질 분비양(발현양) (ng/tissue g)을 측정한 그래프를 나타낸다. 도 13은 비히클 군과 SR13800 투여군의 안구내 주사에 의한 망막과 RPE-맥락막 조직의 VEGF 단백질 발현양을 측정한 그래프를 나타낸다.

도 12 및 도 13에 나타난 바와 같이, RPE-맥락막 조직에서는 STZ 투여에 의해(당뇨병성 망막병증 유도에 의해) VEGF 발현이 유의하게 증가하지 않았으나, 망막 조직에서는 STZ 투여에 의해 VEGF 발현이 유의하게 증가하였으며, 특히 SR13800 투여군에서 당뇨 망막병증 유발에 의해 망막 조직에서 증가된 VEGF 발현이 유의적으로 현저히 감소하였으며 SR13800 투여는 RPE-맥락막 조직에서의 VEGF 발현에는 유의미한 영향을 미치지 않았다.

실시예 6-4. 당뇨 망막병증을 유도한 마우스의 망막에서 신생혈관 형성 확인

상기 참고예 3의 방법으로 STZ로 당뇨 및 당뇨망막병증을 유도한 마우스의 안구에 PBS(이하, 비히클 군) 또는 PBS에 용해시킨 α-CHC와 SR13800을 각각 유리체강 내 주사하고, 상기 참고예 7의 방법과 같이 신생 혈관 형성에 대한 MCT 억제제의 효과를 조직 염색 방법으로 평가하였다. 도 14는 비히클 군, α-CHC 투여군, 및 SR13800 투여군의 안구 내 주사(유리체강 내 주사)에 의한 STZ 마우스의 망막 혈관 출혈 및 신생 혈관 형성 변화를 촬영한 그림으로서 IB4(isolectin B4)를 사용하여 혈관을 염색하였다. 도 14에서 나타난 바와 같이, α-CHC와 SR13800은 안구 내 주사에 의하여 당뇨 망막병증 모델에서 증가된 출혈 및 신생 혈관 형성을 감소시킨 것을 확인할 수 있었고, 특히 SR13800의 경우 현저히 출혈 및 신생 혈관 형성을 감소시켰다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating angiogenesis relating ocular diseases comprising inhibitors of MCT expression or activity <130> DPP20201645KR <150> KR 10-2019-0078999 <151> 2019-07-01 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin_Forward <400> 1 attgccgaca ggatgcagaa 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin_Reverse <400> 2 gctgatccac atctgctgga a 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPL37A_Forward <400> 3 attgaaatca gccagcacgc 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPL37A_Reverse <400> 4 aggaaccaca gtgccagatc c 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFA_Forward <400> 5 attgaaatca gccagcacgc 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFA_Reverse <400> 6 aggaaccaca gtgccagatc c 21

Claims

MCT(Monocarboxylate transporter) 유전자의 발현 또는 MCT 단백질의 활성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는, 혈관신생 관련 안과 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 억제제는 SR13800(Cas No. 227321-12-2), 또는 α-CHC(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid)(Cas No. 28166-41-8)이고,
상기 혈관신생 관련 안과 질환은 노인성 황반 변성증, 당뇨 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 맥락막 혈관신생, 신생혈관 녹내장, 각막 신생혈관, 중심성 망막 정맥 폐색, 분지 망막 정맥 폐색, 증식 유리체 망막병증, 색소성 망막증, 허혈성 시신경 장애, 미숙아 망막증, 유행성 각결막염, 신생혈관성 홍채질환, 후수정체 섬유증식증, 아토피성 각막염, 상각막윤부 각막염, 위상편 건선 각막염, 및 플릭텐성 각결막염으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인,
약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 MCT 유전자는 MCT1, MCT2, MCT3, 및 MCT4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 MCT 단백질은 MCT1, MCT2, MCT3, 및 MCT4로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 대식세포에서의 VEGF(vascular endothelial growth factor) 분비를 억제하는 것인, 약학적 조성물.
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 조성물은 점안제, 안연고, 주사제, 안구 삽입제, 과립제, 정제, 환제, 캡슐제, 겔제, 시럽, 현탁제, 유제, 점적제, 및 액제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 제형인 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물의 투여 경로는 유리체 내 투여, 결막낭 내 투여, 결막하 투여, 및 테논낭 하 투여로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 약학적 조성물.