WO2014193191A1 - 항-vegf 항체 및 이를 포함하는 암 또는 신생혈관형성관련 질환의 예방, 진단 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

항-vegf 항체 및 이를 포함하는 암 또는 신생혈관형성관련 질환의 예방, 진단 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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이성희
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김유진
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송동섭
정은이
이진석
승우진
손영선
황규상
한병열
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    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Definitions

  • Anti-VEGF antibodies and cancer or neovascularization-related diseases include cancer or neovascularization-related diseases, and cancer or neovascularization-related diseases.
  • compositions for the prevention, diagnosis or treatment are provided.
  • the present invention relates to novel antibodies that bind to VEGF capable of treating cancer or neovascularization-related diseases in vivo with strong binding affinity for vascular endothelial growth factor (VEGF) and pharmaceutical compositions comprising the same.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • BACKGROUND Angiogenesis is well known to be associated with the development of a variety of diseases, including proliferative retinopathy or age-related macular degeneration (AMD) associated with angiogenesis in the eye, including solid tumors.
  • Angiogenesis inhibitors include thrombospondin, N-terminal fragments of prolactin of 16 kDa (Clapp et al., Endocrinology, 133: 1292-1299 (1993)), angiostatin and endostat in There is this.
  • angiogenesis depends on the balance between angiogenesis inducers and inhibitors (folkman, J, et al. J. Biol. Che., 267, 10931-10934 (1992)).
  • vascular endothelial growth factor is an angiogenesis inducer involved in the development and homeostasis of blood vessels and lymphatic vessels, and has an important effect on neurons.
  • VEGF is produced mainly in vascular endothelial cells, hematopoietic cells and stromal cells by hypoxia and stimulation of cell growth factors such as TGF, interleukin and PDGF.
  • VEGF binds to VEGF receptors, and each VEGF isoform binds to a specific receptor, induces the formation of a homozygous or heterozygous receptor, and activates each signaling system (Karsan A., Int J. Mo I. Med., 5 (5): 447-56 (2000)).
  • VEGF receptor Signaling specificity of the VEGF receptor is more finely regulated by the co-receptors neuriphilin, heparin sulfate, integrin, caderin, etc. (Zachary IC et al., Mol. Biol) Cell., 22 (15): 2766-76 (2011)). These VEGFs are known to be important mediators of angiogenesis associated with diseases in tumors and eyes. VEGF mRNA is also overexpressed by the majority of human tumors examined (Berkman et al., J. Clin. Invest., 91: 153-159 (1993)). In the case of cancer, new capillaries are needed as a pathway for supplying nutrients and waste products for growth.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • VEGF binds to the receptors VEGFR1, 2 and 3, but transmits signals that induce endothelial cell proliferation, migration and permeability through VEGFR2 (ZengH. Et al., J. Biol. Chem., 276: 26969-26976 (2001) )).
  • angiogenesis-related diseases can be treated.
  • the antibody that binds to VEGF can be used as a drug, it can be developed as a drug through the humanization process of the antibody in order to increase the binding capacity to VEGF, and reduce immunogenicity.
  • Anti-VEGF neutralizing antibodies inhibit the growth of various human tumor cell lines in nude mice (Kim et al., Nature., 362: 841-844 (1993); Warren Dung, J. Clin.
  • An effective concentration of anti-VEGF antibody can be administered intraocularly to reduce the activity of VEGF. It may include sexual retinopathy or age-related macular degeneration.
  • anti-VEGF neutralizing antibodies include ⁇ »1 ⁇ , / 1000
  • Bevacizumab (Avast in TM, Genentech / Roche) is FDA approved. Bevacizumab, including metastatic colorectal cancer and advanced ovarian cancer
  • Aflibercept vial Healthcare
  • Avastin was significantly more effective than placebo in breast cancer patients. They did not increase their survival rate, but retreated breast cancer-related redness, followed by a report that Avastin increases the risk of heart failure in breast cancer patients. This suggests that the improvement of anti-VEGF neutralizing antibodies developed in the past is necessary, and that the accurate efficacy of preclinical studies needs to be determined.
  • the present invention aims to improve the antitumor effect by developing the antibody binding to both mouse and human, to obtain the reliability of the results of the preclinical model, and to increase the binding capacity to VEGF.
  • the present inventors have developed an antibody capable of specifically binding to VEGF to treat tumors and various intraocular neovascular diseases through a biopanning and affinity improvement process, having a novel complementarity determining region (CDR), which is not known in the art.
  • CDR complementarity determining region
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition comprising the antibody.
  • the present invention to achieve the above object,
  • CDR complementarity determining region
  • the CDR3 binds to a vascular endothelial growth factor (VEGF) comprising a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 Provide an antibody.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention, diagnosis or treatment of cancer or neovascularization-related diseases caused by VEGF overexpression comprising the antibody.
  • Antibodies of the present invention exhibit excellent binding capacity to human or mouse vascular endothelial growth factor, inhibit the proliferation and permeability of umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and inhibit tumor growth, thereby inhibiting cancer—or Sansen ⁇
  • Figure 1 shows the binding and dissociation sensogram of the HF2-11 clone to VEGF.
  • Figure 2 is a graph showing the results of the antibody of the present invention inhibits the binding of VEGFR2 without inhibiting the binding of VEGF and VEGFR1.
  • FIG. 3 is a graph showing specific binding of human and mouse VEGF-A to antibodies of the invention.
  • Figure 5 shows the mass spectrometry results of the heavy chain (a) and light chain (b) of the HF2-4 antibody.
  • Figure 6 shows the size exclusion chromatography (SEC) results of the HF2-8 clone.
  • FIG. 7 and 8 show the results of ELISA measurement of the binding of the antibody and Avastin of the present invention to human VGEF and mouse VEGF, respectively.
  • FIG. 9 shows the results of inhibition of proliferation of vascular endothelial cells (HUVEC) of the antibody and Avastin of the present invention.
  • Figure 10 shows the results of HUVEC permeability inhibition test of the antibody (a) and Avastin (b) of the present invention.
  • Figure 11 shows the results of HUVEC fluidity inhibition test of the antibody of the present invention.
  • Figure 12 shows the tumor growth inhibitory effect of HT29 transplanted animal model of the antibody of the present invention.
  • Figure 13 shows the effect of the present invention on the choroidal choroidal neovascularization of the antibody.
  • the present invention provides a light chain variable region comprising: 1) a light chain variable region comprising CDRl, CDR2 and CDR3, wherein the CDR2 is represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the CDR3 is represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 ; And 2) a heavy chain variable region comprising CDRl, CDR2, and CDR3, wherein the CDR3 comprises a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, which binds to VEGF (hereinafter, anti-VEGF antibody) do.
  • VEGF hereinafter, anti-VEGF antibody
  • CDRl, CDR2 and CDR3C of the light chain variable region of the antibody according to the present invention hereinafter referred to as LCDR1, LCDR2, and LCDR3;
  • amino acid sequence lists of CDRl, CDR2, and CDR3 (hereinafter, referred to as HCDRl, HCDR2, and HCDR3, respectively) of the heavy chain variable region are shown in Table 1 below.
  • Antibodies that bind to VEGF according to the present invention 1) SEQ ID NOs: 4 to 14 -
  • CDR1 represented by an amino acid sequence selected from the group consisting of; CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID 1; And the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • Light chain variable region comprising CDR3; And 2) CDR1 represented by an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 15-34; CDR2 represented by an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 35 to 50; And it may be an antibody comprising a heavy chain variable region comprising CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention, 1) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Light chain variable region;
  • CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15
  • CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID 35
  • it may be an antibody comprising a heavy chain variable region comprising CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention, 1) comprises a CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Light chain variable region;
  • CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16
  • CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID 36
  • it may be an antibody comprising a heavy chain variable region comprising CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention, 1) comprises a CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Light chain variable region;
  • CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17
  • CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID 37
  • it may be an antibody comprising a heavy chain variable region comprising CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18; Amino acid of SEQ ID NO: 38
  • CDR2 represented by sequence
  • it may be an antibody comprising a heavy chain variable region comprising CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention, 1) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Light chain variable region; And 2) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID 39; And it may be an antibody comprising a heavy chain variable region comprising CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • Anti-VIII VEGF antibody according to an embodiment of the present invention, 1) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Light chain variable region; And 2) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID 40; And it may be an antibody comprising a heavy chain variable region comprising CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention, 1) comprises a CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Light chain variable region; And 2) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21; CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID 38; And it may be an antibody comprising a heavy chain variable region comprising CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention, 1) comprises a CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Light chain variable region; And 2) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22; CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID 38; And it may be an antibody comprising a heavy chain variable region comprising CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the anti—VEGF antibody comprises 1) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Light chain variable region; . And 2) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23; CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID 41; And it may be an antibody comprising a heavy chain variable region comprising CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention, 1) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 A light chain variable region comprising; And 2) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24; CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID 38; And it may be an antibody comprising a heavy chain variable region comprising CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the anti-VEGF antibody according to one embodiment of the present invention, 1) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 A light chain variable region comprising; ⁇ And 2) CDR1 as amino amino acid sequence of SEQ ID 25; CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID 38; And it may be an antibody comprising a heavy chain variable region comprising CDR3 15 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • An anti-VEGF antibody according to one embodiment of the present invention, 1) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 A light chain variable region comprising; And 2) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26; Amino acid of SEQ ID NO: 42
  • CDR2 represented by the 20 sequence; And it may be an antibody comprising a heavy chain variable region comprising CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention, 1) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Light chain variable region;
  • CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27
  • CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID 38
  • it may be an antibody comprising a heavy chain variable region comprising CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention, 1) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 _
  • a light chain variable region comprising CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; And 2) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID 43; And it may be an antibody comprising a heavy chain variable region comprising CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention, 1) comprises a CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Light chain variable region; And 2) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID 29; CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID 44; And it may be an antibody comprising a heavy chain variable region comprising CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention, 1) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Light chain variable region; And 2) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID 30; CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID 45; And it may be an antibody comprising a heavy chain variable region comprising CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention, 1) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Light chain variable region; And 2) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID 31; CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID 42; And it may be an antibody comprising a heavy chain variable region comprising CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention, 1) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Light chain variable region; And 2) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID 39; And it may be an antibody comprising a heavy chain variable region comprising CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention, 1) SEQ ID NO: A light chain variable region comprising a CDR1 represented by an amino acid sequence, a CDR2 represented by an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and a CDR3 represented by an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; And 2) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID 32; CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID 46; And it may be an antibody comprising a heavy chain variable region comprising CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention, 1) comprises a CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Light chain variable region; And 2) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33; CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID 45; And it may be an antibody comprising a heavy chain variable region comprising CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention, 1) comprises a CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Light chain variable region; And 2) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34; CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47; And it may be an antibody comprising a heavy chain variable region comprising CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention, 1) comprises a CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Light chain variable region; And 2) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID 48; And it may be an antibody comprising a heavy chain variable region comprising CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention, 1) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Light chain variable region; And 2) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID 31; CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID 38; And it may be an antibody comprising a heavy chain variable region comprising CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention, 1) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Light chain variable region; And 2) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID 31; CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID 46; And it may be an antibody comprising a heavy chain variable region comprising CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention, 1) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Light chain variable region; And 2) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17; CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID 42; And it may be an antibody comprising a heavy chain variable region comprising CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention, 1) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Light chain variable region; And 2) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34; CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID 49; And it may be an antibody comprising a heavy chain variable region comprising CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention, 1) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Light chain variable region; And 2) CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17; CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID 50; And it may be an antibody comprising a heavy chain variable region comprising CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • Antibody binding to VEGF according to the present invention, 1) a light chain variable region represented by an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 54 to 65; And 2) a heavy chain variable region represented by an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 78 to 104 (see Table 2).
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention comprises 1) a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID 54; And 2) a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 78.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention comprises 1) a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID 55; And 2) a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 79.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention comprises 1) a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID 55; And 2) a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 80.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention comprises 1) a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56; And 2) a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 81.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention comprises 1) a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID 55; And 2) a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention comprises 1) a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID 55; And 2) a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 83.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention comprises 1) a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 57; And 2) a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 84.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention comprises 1) a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 57; And 2) a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 85.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention comprises 1) a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID 58; And 2) a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 86.
  • An anti-VEGF antibody according to one embodiment of the present invention comprises 1) SEQ ID NO: 57 Light chain variable region represented by amino acid sequence; And 2) a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 87.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention comprises 1) a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 57; And 2) a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 88.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention comprises 1) a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 59; And 2) a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 89.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention comprises 1) a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 57; And 2) a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention comprises 1) a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60; And 2) a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 91.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention comprises 1) a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID 55; And 2) a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 92.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention comprises 1) a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61; And 2) a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 93.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention comprises: 1) a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62; And 2) a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 94.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention comprises: 1) a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62; And 2) a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 95.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention comprises: 1) a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62; And 2) a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 96.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention comprises 1) a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID 55; And 2) a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 97.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention comprises 1) a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID 55; And 2) a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 98.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention comprises 1) a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 57; And 2) a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 99.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention comprises 1) a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 63; And 2) it may be an antibody comprising a chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention comprises 1) a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60; And 2) a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention comprises 1) a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61; And 2) a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 102.
  • Anti-VEGF antibody according to an embodiment of the present invention comprises 1) a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 64; And 2) a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 103.
  • Anti-VEGF antibody comprises 1) a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID 65; And 2) a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 104.
  • the antibody of the present invention may include a light chain constant region and a heavy chain constant region, and the light chain constant region and heavy chain constant region may be light chain constant region and heavy chain constant region of a known human antibody (URUTishauser et al. PNAS, 61 (4). ): 1414-1421 (1968); and
  • the antibody according to the invention may be a human or humanized antibody.
  • the antibody according to the present invention may include one of IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgD, IgE, or IgM among immunoglobulins, and may be an antibody that binds to VEGF, or a combination thereof or a variant thereof. .
  • the antibody according to the invention may be in the form of Fab, Fab ', F (ab' h, Fv, dAb or scFv) or in the form of a scaffold conjugate whose CDR is the main site for binding to VEGF.
  • the present invention is the amino acid sequence of the light chain variable region, SEQ ID NO: 54 to
  • nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 66 to 77, encoding an amino acid sequence selected from the group consisting of 65.
  • the present invention provides a base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 105 to 131, which encodes an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 78 to 104, the amino acid sequence of the heavy chain variable region.
  • a list of amino acids and corresponding nucleotide sequences of the variable regions of the light and heavy chains of the antibody according to the present invention is shown in Table 2 below.
  • the present invention provides a CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; And it provides a DNA encoding the light chain variable region of the antibody that binds to VEGF comprising CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the DNA encoding the CDR3 represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 51 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 may be represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 52.
  • the DNA encoding the light chain variable region of the antibody of the present invention may comprise a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 51 encoding LCDR2; And a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 52 encoding LCDR3.
  • the present invention provides a DNA encoding a heavy chain variable region of an antibody that binds to VEGF comprising CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the DNA encoding the CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 may be represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 53.
  • the DNA encoding the heavy chain variable region of the anti-VEGF antibody may include a nucleotide sequence encoding HCDR3 of SEQ ID NO: 53.
  • the present invention provides an expression vector for expressing a light chain variable region of an antibody that binds to VEGF, including DNA encoding the light chain variable region of the antibody.
  • the VEGF comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 51 encoding CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 52 encoding the CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 to VEGF.
  • An expression vector expressing a light chain variable region of an antibody to be bound is provided.
  • the present invention also provides an expression vector expressing a heavy chain variable region of an antibody that binds to VEGF, including DNA encoding the heavy chain variable region of the anti-VEGF antibody.
  • an expression vector that expresses a heavy chain variable region of an antibody that binds to VEGF, including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 53 encoding CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the expression vector according to the present invention may be transformed with an animal cell line such as CH0 cell HEK cell or NS0 cell, and the animal cell line is not limited thereto.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing, diagnosing, or treating a cancer or angiogenesis related disease caused by VEGF overexpression, including the antibody that binds the VEGF.
  • angiogenesis refers to the formation of new capillaries by germination from existing capillaries.
  • angiogenesis related disease refers to all diseases related to angiogenesis caused by VEGF overexpression.
  • Such neovascularization-related diseases may include various cancers and eye diseases, but are not limited thereto.
  • Cancer or neovascularization-related diseases caused by VEGF overexpression in the present invention is a cancer selected from the group consisting of colon cancer, pancreatic cancer, kidney cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer and brain cancer;
  • macular degeneration disease, diabetic retinopathy and ischemic retinopathy may include eye diseases selected from the group consisting of.
  • Anti-VEGF antibodies can be used in the clinic with drugs such as fluoropyrimidine-based drugs, paclitaxal, platinum-based drugs, interferonalpha-2a, carboplatin and the like (FDA US BL 125085 Avast in label).
  • the pharmaceutical composition of the present invention is also a poloropyrimidine-based drug, paclitaxel, platinum-based drug, interferonalpha _2a, carboplatin, doxorubicin, cisplatin, gemcitabine, gemcitabine,
  • the drug selected from the group consisting of 5-fluorouracil, leucovorin, irinotecan, oxalaplatin, capecitabine, and docetaxel may be used in combination, but the drug is not limited thereto.
  • any chemotherapeutic agent that exhibits anticancer activity may be used with the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the chemotherapeutic agent is an alkylating agent, an antimetabolite, a fulic acid analog, a pyrimidine analog, a purine analog and related inhibitors, vinca alkaloids, epipodophyllotoxins, antibiotics, L-asparaginase, topoisomerase inhibitors, interferon, platinum coordination Complexes, anthracene-substituted urea, methyl hydrazine derivatives, adrenal cortex inhibitors, adrenocorticosteroids, progestins, estrogens, Antiestrogens, androgens, antiandrogens, and gonadotropin-releasing hormone homologs.
  • the present invention also provides a kit for diagnosing cancer or neovascularization-related diseases caused by VEGF overexpression, comprising the antibody binding to VEGF.
  • VEGF angiogenesis-related diseases
  • the antibody according to the present invention does not affect the binding of VEGF to Flt-1 (VEGFR-1), which is a VEGF receptor, and selectively inhibits binding of VEGF and KDR VEGFR-2, which is a VEGF receptor (FIG. 2).
  • Flt-1 Flt-1
  • KDR VEGFR-2 which is a VEGF receptor (FIG. 2).
  • human VEGF- human VEGF- (: human VEGF-D and human placental growth factor (PIGF)
  • PIGF human placental growth factor
  • the antibody of the present invention inhibited proliferation, HUVEC permeability, and HUVEC fluidity of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) promoted by VEGF to an equivalent level or higher than Avastin (FIGS. 9 to 11), and inhibited human colon cancer cell lines. Tumor growth was inhibited to significantly better levels than Avastin in transplanted mice (FIG. 12). In addition, the choroidal neovascularization model significantly inhibited angiogenesis compared to the control group (FIG. 13).
  • the human (hwa) antibody of the present invention can be usefully used for the treatment of cancer or neovascularization-related diseases, and the present invention provides a composition for the prophylactic treatment of cancer or neovascularization-related diseases comprising the antibody. to provide. Justice . , ru7M ⁇ I 0 4858
  • VEGF refers to both the 165-amino acid human vascular endothelial growth factor and the associated 121-, 189- and 206—amino acid vascular endothelial growth factor, as well as allelic and altered forms of the natural growth factors. (See Leung et al., Science., 246: 1306 (1989); and Houck et al., Mol. Endocrin., 5: 1806 (1991)).
  • Anti-VEGF antibody in the present invention acts by interfering with the binding of VEGF to the VEGF receptor, incapacitating cells activated by VEGF, or by binding VEGF to the VEGF receptor and then inhibiting vascular endothelial cell activation. Means an antibody.
  • antibody refers to a glycoprotein exhibiting binding specificity for a particular antigen.
  • a “humanized” form of a non-human (eg rodent) antibody is a chimeric antibody comprising a minimal sequence derived from a non-human immunoglobulin.
  • humanized antibodies are prepared by replacing the hypervariable region residues of human immunoglobulins with the hypervariable region residues of mice, rats, rabbits, chickens or non-human primates with the desired specificity, affinity and ability.
  • the framework region (FR) residues of human immunoglobulins are replaced with non-human residues.
  • a "single chain FV” or “scFv” antibody fragment comprises the V H and V L domains of an antibody present in a single polypeptide chain.
  • the FV polypeptide further comprises a polypeptide linker between V H and the domain that allows the scFv to form the desired structure for antigen binding.
  • the "Fab antibody fragment” is a fragment obtained by digesting an antibody with papain, a protease, and the V H and V L domains of the antibody, and ( 3 ⁇ 4 and CL domains are connected by SS binding, which bind to the antigen. (antigen binding) function.
  • F (ab ') 2 antibody fragment means a portion excluding the Fc (C3 ⁇ 4 and C3 ⁇ 4) fragment of the antibody, it can be made by cutting under the hinge region of the antibody.
  • Fab ' is a form in which the hinge region of the antibody fragment of F (ab') 2 is cut and has two -SH groups.
  • FV is the variable region of the antibody
  • dAb is a single domain i ⁇ , IUU 400
  • VEGF receptor as used herein means a variant that retains the ability to bind cellular receptors for VEGF, usually the cell-surface receptors found in vascular endothelial cells and hVEGF.
  • An example of a VEGF receptor is the transmembrane receptor in tyrosine kinases, a fms type tyrosine kinase fit.
  • the fit receptor includes an extracellular domain, a transmembrane domain, and an intracellular domain with tyrosine kinase activity. Extracellular domains are involved in binding of VEGF, while intracellular domains are involved in signal transduction.
  • VEGF receptor is the flk-1 receptor (hereinafter also referred to as "KDR") (Matthews et al., Oc.
  • an animal immune antibody library was constructed.
  • the library obtains mRNA from immune cells immunized with an animal and then uses a combination of primers of antibody genes.
  • three white-legged chickens contained human VEGF and a mouse.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • PBSB a complete solution of phosphate containing bovine serum albumin
  • VEGF-165 human VEGF
  • VEGF-164 mouse VEGF
  • PBST PBS containing 0.1% tween-20
  • anti-chicken immunoglobulin -HRPChorse radish peroxidase (l: 3000) was added and reacted for 1 hour.
  • Reverse transcription (5 min at 65 ° C; 5 min at 4 ° C; 5 min at 50 ° C; 85 ° C) using a superscript transcription system (Invitrogen, USA) using a random hexamer as a primer 5 min at C; and 4 ° C.) 5 ⁇ , of the reaction solution containing cDNA resulting from reverse transcription reaction was loaded onto 1% agarose gel to identify cDNA bands of various lengths after electrophoresis. 1, antibody library construction
  • PCR reaction was carried out using the cDNA prepared in Example 1 as a template, designed to fit the heavy chain variable region, light chain variable region and scFV (single chain Fv) region ⁇ 2 ⁇ 1 ⁇ / 004S58
  • the primer combinations in Table 2 were used.
  • V L each cDNA library 0.5 ⁇ 1, 30 pmole forward primer, 30 pmole reverse primer, 10x PCR buffer, 200 uM dNTPs and 0.5ul TaqDNA polymerase was mixed to adjust the final 50 ul, 5 at 94 ° C After the reaction was performed, the reaction was repeated for 30 cycles for 15 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 56 ° C, and 90 seconds at 72 ° C.
  • DNA was isolated according to size and purified using a gel extraction kit (Gel extraction kit, Qiagen, USA).
  • the purified V H 50 ng and V L 50 ng DNA were used as templates, and the 30 pmole forward primer and 30 pmole reverse primer, 10 ⁇ PCR buffer, 200 uM dNTPs and 0.5 ul Taq DNA polymerase as described in Table 3 were mixed. and then aligning the semi-final 50 ul, and banung 5 minutes at 94 ° C, 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 56 ° C and
  • PCR was performed by repeating 20 cycles of reaction for 2 minutes at 72 ° C.
  • the DNA amplified by the PCR was electrophoresed on 13 ⁇ 4 agarose gel to each amplified ,
  • DNA was isolated according to size and purified using a gel extraction kit (Qiagen, USA).
  • PCR fragments encoding scFv, 10 ug, 360 units Sfil (Roche, USA), 20 ul 10x buffer were added and the final volume was 200 ul and reacted overnight at 50 ° C.
  • pComb3X vector 20 ug, 120 units Sfil and 20 ul 10x buffer was added and the final volume was 200 ul to react at 50 ° C overnight.
  • Each section cut with the restriction enzyme was electrophoresed on agarose gel and then purified using a gel extraction kit (Qiagen, USA).
  • Example 3 Screening of Phage Clones Containing Anti-VEGF scFV Antibodies that bind to both human VEGF and mouse VEGF from a library having heavy and light chains randomized in the form of scFv obtained in Example 2 above are supported on a solid Were selected using VEGF. ⁇ ⁇ ⁇ im. I
  • Antibody library DNA made by fusing the scFv-type antibody obtained in Example 2 with the phage coat protein PIII was transformed by E. coli ER2738 (New England Biolab) by electroporation and cultured at 37 ° C. After adding VCSM13 helper phage (Stratagene, USA), add 46 ug / ml carbenicillin and 70 ug / ml kanamycin and add SB medium (30 g / L tryptone, 20 g / L yeast extract and 10 g / L MOPS, incubated overnight at pH 7.0).
  • SB medium (30 g / L tryptone, 20 g / L yeast extract and 10 g / L MOPS
  • the culture solution containing E. coli and phage obtained above was centrifuged to remove the E. coli cells that were chipped . After recovering only the supernatant, 40 mg / i polyethylene glycol 8000 and 30 mg / ml NaCl were added and centrifuged to remove PEG. The phages precipitated by were collected and resuspended in PBS.
  • the phages having affinity were bound to VEGF, washed with PBS containing 0.5% Tween 20, and washed with 0.1M glycine (pH). 2.2) eluted with solution and neutralized with 2M tris solution. Eluted phages were infected with Escherichia coli ER2738 for next round panning and incubated overnight. This process was repeated four times and panning was performed.
  • Human VEGF alone or human VEGF and mouse VEGF were alternately used as antigen to find a binder that binds both human VEGF and mouse VEGF.
  • New phage libraries were constructed by randomizing the sequences of the CDRs of the heavy and light chain regions for affinity improvement.
  • the phage library obtained in the same manner as in Example 2 was reacted with human VEGF lOiig immobilized on magnetic beads for 2 hours in phase silver, and then washed 5 times with PBS containing 0.5% Tween 20. After washing, the bound phages are eluted with 0.1M glycine (pH 2.2) solution and 2M rV JL ⁇ Ult. IV l 3 ⁇ 4 0 d 0
  • scFv protein expressed after the transformation of HB2151 Escherichia coli with a pComb3X plasmid containing the DNA of the selected clone was purified.
  • variable region and constant region were obtained by PCR using the HC and IX primer combinations of Table 5 below, respectively, and the pcDNATM3.3-T0P0 ® TA cloning kit and the p0ptiTMVEC-TOP0 ® TA cloning kit, respectively. (Invitrogen, USA) was used to transfer to mammalian cell expression plasmids. 1 ul of each vector (pcDNATM3.3-T0P0 ® vector and pOp TM VEC-T0P0 ® vector) was decanted into 200 mM NaCl and 10 mM MgCl 2 . iiiv UU 4005
  • the antibody obtained by culturing for 7 days was purified using Protein A column (GE USA).
  • the culture was loaded on a column to bind the antibody (IgG) in the culture with Protein A and eluted with 20 mM sodium citrate buffer (pH 3.0).
  • SDS-PAGE of the light and heavy chains confirmed the molecular weight and high purity consistent with the theoretical calculations of the light and heavy chains.
  • each of human VEGF and mouse VEGF was coupled using a carboxymethylated dextran biosensor chip (CM5, GE) according to the manufacturer's instructions.
  • IgG proteins were injected at 2 fold serial dilutions to 5 nM, 2.5 nM, 1.25 nM, 0.625 nM, 0.313 nM and 0.156 nM for binding and dissociation rate measurements.
  • Binding and dissociation rates were expressed as binding and dissociation sensograms and were calculated using a simple one-to-one tandem coupling model (BIAcore X100 evaluation software, version 2.0).
  • the equilibrium dissociation constant (KD) is obtained by dividing the dissociation rate constant (Kd) by the binding rate constant (Ka).
  • Measurements of human VEGF (hVEGF) of antibodies HF2-1 to HF2-11, HF2-13 and HF2-14 are shown in Table 6 below and representatively a sensogram of HF2-11 is shown in FIG.
  • VEGFR2 VEGF Receptor KDR
  • HF2-1, HF2-5, HF2-9 and HF2-11 VEGF Receptor Flt-1
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • IgG-Fc fusion proteins 27-687, R & D systems, USA
  • 9 nM KDR ECD IgG-Fc fusion proteins were respectively 0.01 nM, 0.1 nM, 0.3 nM, 1 nM, 3 nM,
  • Each antibody was serially diluted with 10 nM and 100 nM (HF2-1, HF2-5, HF2-9 and HF2 ′ 11) and incubated at 37 ° C. for 1 hour.
  • Flt-1 ECD IgG-Fc fusion protein and KDR ECD IgG-Fc fusion protein which are bound even after binding inhibition by antibody, are combined with an anti-human IgG-Fc antibody-HRP conjugate (Jackson Isearch unoresearch, USA).
  • ABTS was developed as a substrate and then absorbed at 405 nm. Measured.
  • the antibody of the present invention inhibited the binding of VEGF and KDR (VEGFR2) in a concentration-dependent manner, but did not inhibit the binding of VEGF and Flt-1 (VEGFRl). That is, the selected antibodies of the present invention was confirmed to selectively inhibit the binding of VEGF and VEGF receptor.
  • Example 8 the antibody of the present invention inhibited the binding of VEGF and KDR (VEGFR2) in a concentration-dependent manner, but did not inhibit the binding of VEGF and Flt-1 (VEGFRl). That is, the selected antibodies of the present invention was confirmed to selectively inhibit the binding of VEGF and VEGF receptor.
  • hVEGF-A Human VEGF-A
  • mVEGF-A Mouse VEGF-A
  • hVEGF-B human VEGF-C
  • hVEGF-D human VEGF-D
  • P1GF human placental growth factor
  • hVEGF-A, mVEGF-A, hVEGF-B, hVEGF-C, hVEGF-D and P1GF were coated on an ELISA plate.
  • 3% BSA and 0.05% Tween 20 were coated. After blocking for 30 minutes at 37 ° C with PBS containing, increasing concentration of the antibody clone protein was incubated for 2 hours at 37 ° C. Subsequently, the cells were washed three times with PBS containing 3% BSA and 0.05% Tween 20, and then incubated for 1 hour at room temperature by adding an anti-human IgG—Fab-HRP conjugate (Jackson I unoresearch, USA). 3) After washing three times with PBS containing BSA and 0.05% Tween 20, TMB was developed with a substrate and the absorbance was measured at 650 nm. At this time, Avastin (Roche, Switzerland) was used as a control.
  • the antibody clones of the present invention bind well to hVEGF-A and mVEGF-A, but did not bind to VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D and P1GF at all. It was found to have specificity.
  • Example 9 Physicochemical Characterization The physicochemical properties of the antibodies according to the invention were analyzed.
  • the mass and heavy chains were analyzed, respectively.
  • the heavy and heavy chains showed major peaks of about 50.6 kDa and light chains of about 23.3 kDa. Small peaks presumed to be heterozygous by post-trans 1 at ional modi fi cat ion, such as glycosylation, were observed.
  • the state of the antibody HF2-8 of the present invention (referred to as soluble aggregate as a kind of impurity) was analyzed by size exclusion chromatography (SE) using a TSKgel G3000SWxl column (Tosoh). 6 is shown.
  • Example 10 Binding Analysis of Antibodies to Human or Mouse VEGF
  • the binding ability of the antibodies (HF2-1 to HF2-26) of the present invention to human vascular endothelial growth factor (VEGF) was confirmed by ELISA method.
  • the antibodies HF2-1, HF2-5, HF2-8 and HF2-9 of the present invention unlike Avastin, binds not only to human VEGF but also to mouse VEGF. It is shown to be suitable for preclinical studies using.
  • Example 11 Confirmation of HUVEC Proliferation Inhibitory Activity by VEGF of Antibody of the Present Invention The proliferation inhibitory activity of human umbilical vein endothelial cells by VEGF of the antibody of the present invention was confirmed.
  • Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC, Clonetics, USA) were centrifuged to obtain pellets, and then suspended using EBM-2 base medium (clonetics, USA) without growth factor and bovine serum. The same number of cell suspensions per well were placed in 96-well cell culture plates and incubated for 24 hours in a constant temperature wet incubator.
  • the cells treated with the antibody and the antigen were incubated for 4 days in a fixed wet incubator, treated with 10 uL of razazurin solution (invitrogen, USA) per well, and after 3-4 hours, fluorescence was measured at 530 nm / 590 nm. .
  • Avastin was used as a control, and the effect of inhibiting cell proliferation by the antibody was quantified based on the fluorescence value of VEGF-treated wells.
  • FIG. 9 (b) The results of HUVEC proliferation rate when treated with HF-1, HF-4, HF-5 and HF-8 antibodies are shown in FIG. 9 (b), and when HF-1 to HF-5, HF-9 and HF-11 antibodies Cell viability results of are shown in (c) and (d) of FIG.
  • the HF2-5 antibody of the present invention inhibited human umbilical vein endothelial cell proliferation promoted by VEGF to a similar level as Avastin (FIGS. 9 (b) and (d)).
  • VEGF human umbilical vein endothelial cell proliferation promoted by VEGF
  • FIG. 9 (b) and (d) Avastin
  • affinity improvement (b, c, d) of the H clone it can be seen that the activity of the antibody increases.
  • HF2-4 and HF2-8 in the antibodies of the present invention on the fluidity of human umbilical vein endothelial cells (Clonetics, USA) by VEGF was confirmed.
  • a chamber test was performed using a transwell composed of a 3 uM microporous membrane.
  • cells in the flasks were depleted with EBM-2 basal medium containing 0.1% BSA for at least 4 hours before testing.
  • Example 14 Confirmation of Tumor Growth Inhibitory Activity of the Antibody of the Present Invention Tumor inhibitory activity was evaluated by administering the antibody of the present invention to nude mice in which tumors were formed by transplanting human cancer cells.
  • mice 2-5xl0 HT-29 cells (human colon cancer cell line HTB-38, ATCC) cultured in McCoy's 5A medium containing 10% FBS and 1% penicillin streptomycin were placed in BALB / c nude mice ( 6 ). Oral bio). In the mice with sufficient average tumor volume of about 200-300 mm 3 , antibodies HF2-1, HF2-5, HF2-9 and HF2-1 were administered, respectively, according to the isolated groups. Intraperitoneal injections were performed twice weekly at doses of 3 mg / kg or 10 mg / kg, and tumor volume (mm 3 ) was measured at time points (7 days, 14 days, 21 days, 28 days and 35 days). . Complete layer solution (PBS) was used as a negative control, and Avastin was administered as a positive control. The results are shown in FIG.
  • PBS Complete layer solution
  • mice administered with the antibody was inhibited tumor growth compared to the control group, in particular, the tumor growth inhibitory effect of the antibody administration group was found to be superior to the Avastin administration group.
  • Example 15 Confirmation of Retinal Neovascularization Inhibitory Activity of the Antibody of the Present Invention
  • the following experiment was performed.
  • the antibody-administered group of the present invention showed superior choroidal neovascularization inhibitory effect compared to the negative control group, and had an equivalent effect or more compared to a commercially available control drug.

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Abstract

본 발명은 혈관내피세포 성장인자(VEGF)에 대해 강한 결합 친화도를 가지며 생체내 종양 성장을 억제할 수 있는 신규 항-VEGF 항체 및 이를 포함하는 암 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 항체는 인간 및 마우스 혈관내피세포 성장인자에 우수한 결합 능력을 나타내고, 제대정맥 내피세포(HUVEC)의 증식 및 투과능을 억제하며 종양 성장을 억제할 수 있어 암 치료용 항체로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항 -VEGF항체 및 이를포함하는 암또는신생혈관형성관련 질환의
예방, 진단또는치료용 약학조성물
발명의 분야 본 발명은 혈관내피세포 성장인자 (VEGF)에 대해 강한 결합 친화도를 가져 생체내 암 또는 신생혈관형성 관련 질환을 치료할 수 있는 VEGF에 결합하는 신규 항체 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 배경기술 혈관형성은 각종 질병의 발병과 관련되는 것으로 잘 알려져 있으며， 이들 질환에는 고형 종양을 포함하여 눈에서의 혈관신생과 관련된 증식성 망막증 또는 노화 관련 황반 변성 (AMD) 등이 있다.
신생혈관형성에 대한 연구를 통해 aFGF, bFGF, TGF- α， TGF-β， HGF,
TNF-β , 앤지오제닌， IL-8 등과 같은 많은 유도인자가 확인되었다. 신생혈관 억제제로는 트롬보스폰딘 (thrombospondin), 16 kDa의 프로락틴의 N-말단 단편 (Clapp 등， Endocrinology, 133:1292-1299 (1993))， 앤지오스타틴 (angiostatin) 및 엔도스타틴 (endostat in) 등이 있다.
신생혈관형성이 일어나거나 또는 억제되는 것은 신생혈관 유도인자와 억제제간의 균형에 의존한다 (folkman, J, 등 J. Biol. Che . , 267, 10931-10934(1992)).
신생혈관생성 유도인자 중 혈관내피세포 성장인자 (vascular endothelial growth factor, VEGF)는 혈관, 림프관의 발생과 항상성 유지에 관여하며 신경세포에도 중요한 효과를 가진다. VEGF는 저산소상태 및 TGF, 인터루킨， PDGF와 같은 세포성장인자들의 자극에 의해 혈관내피세포， 조혈세포， 기질세포에서 주로 생성된다. VEGF는 VEGF 수용체에 결합하고， 각각의 VEGF 아형 (isoform)은 특정수용체에 결합하여， 수용체의 동형 또는 이형접합체를 형성을 유도한 뒤，각각의 신호전달체계를 활성화시킨다 (KarsanA., Int J. Mo I. Med., 5(5) :447-56(2000)). VEGF 수용체의 신호전달특이성은 보조수용체인 뉴리필린 (neuriphilin), 헤파린 설페이트 (heparin sulfate), 인테그린 (integrin), 카데린 (cadher in) 등에 의해 보다 미세하게 조절된다 (Zachary IC등, Mol . Biol. Cell.， 22(15) :2766-76 (2011)). 이러한 VEGF는 종양 및 눈에서의 질병과 관련된 신혈관생성의 중요한 매개자인 것으로 알려졌다. 또한 VEGF mRNA는 조사된 대다수 사람의 종양에 의해 과발현된다 (Berkman등, J. Clin. Invest. , 91: 153-159 (1993)). 암의 경우 자신의 성장을 위해 영양분의 공급과 노폐물을 배출하는 통로로 새로운 모세혈관을 필요로 하며， 이를 위해 암세포와 암의 기질세포는 VEGF를 계속적으로 분비하고， 분비된 VEGF는 조직을 통해 확산되어, 혈관내피세포의 이동을 촉진한다 (Ferrara.N. 등， Nat. Rev. Cancer, 2 :795-803, (2002)). 암세포에 의해 유도된 신생혈관은 주위세포의 도움을 받지 않기 때문에 정상적으로 형성된 모세혈관에 비해 불완전한 것이 특징이다. VEGF는 수용체인 VEGFR1, 2， 3에 결합하지만， VEGFR2를 통해 내피세포의 증식， 이동,투과성을 유도하는 신호를 전달한다 (ZengH.등， J. Biol. chem. , 276:26969-26976 (2001)). 그러므로 VEGF를 타겟하는 약물을 이용하여 신생혈관형성을 제어함으로써， 암세포의 증식 및 신생혈관형성 관련 질환을 치료할 수 있다. 이 중， VEGF에 결합하는 항체를 약물로 이용할 수 있는데， VEGF에 대한 결합력을 높이고, 면역원성을 줄이기 위해 항체의 인간화 과정을 거쳐 약물로 개발할 수 있다. 인간화 항체에 대해서는 문헌 [Bending, Methods: Comp. Meth. Enzy. , 8： 83-93 (1995)]에 기재되어 있다. 항 -VEGF 중화 항체는 누드 마우스에 있어서 각종 사람의 종양 세포주의 성장을 억제하고 (Kim 등， Nature. , 362:841-844 (1993)； Warren 둥, J. Clin. Invest. , 95:1789-1797 (1995)； Borgstroem등， Cancer Res. , 56:4032-4039 (1996)； 및 Melnyk등， Cancer Res. , 56:921-924 (1996)), 또한 허혈성 망막 질병의 모델에 있어서 안구내 혈관형성을 억제한다 (Adamis 등， Ardi. Ophtalmol. , 114： 66-71 (1996)) 유효농도의 항 -VEGF 항체를 안구 내로 국소투여하여 VEGF의 활성을 감소시킬 수 있으며， 이러한 허혈성 망막 질병은 당뇨병성 망막병증이나 노화관련 황반변성 등이 포함될 수 있다.
현재 개발된 항 -VEGF 중화항체로는 2004년 2월 대장암을 적웅증으로 ΓΙ»1 υ , / 1000
FDA에서 승인받은 베바시주맙 (bevacizumab, Avast in™, Genentech/Roche)이 있다. 베바시주맙의 경우， 전이성 결장직장암， 진행성 난소암 등을 포함하여 총
6종류의 진행성 종양의 치료에 사용할 수 있도록 적웅증이 확대되었다. 또한， VEGF에 결합하도록 고안된 애플리버셉트 (Aflibercept, 바이앨 헬스케어)는 황반변성을 적응증으로 2011년 FDA에서 제품허가신청을 받았다.하지만， 2011년 FDA에서는 아바스틴이 유방암 환자에서 위약 대비 유의하게 전체 생존율을 증가시키지 못했다며 유방암과 관련된 적웅증 철회하였고， 이어 아바스틴이 유방암환자에서 심부전 발생위험을 증가시킨다는 연구결과가 보고되었다. 이는 기존 개발된 항 VEGF 중화항체의 개선이 필요하며， 또한 전임상에석 정확한 유효성을 판단할 필요가 있다는 점을 시사한다. 아바스틴의 경우, 마우스 VEGF에는 결합하지 않으므로， 마우스를 이용한 전임상 모델에서는 유효성을 정확히 판단하기 힘들다. 그러므로 본 발명에서는 마우스 및 인간에 모두 결합하는 항체를 개발함으로써， 전임상 모델에서의 연구결과의 신뢰성을 획득하고， VEGF에 대한 결합력을 증가시켜 항종양 효과를 향상시킴을 목적으로 하였다.
본 발명자들은 바이오패닝 및 친화도 개선 과정을 통해 종래 알려지지 않은 새로운 상보성 결정 영역 (CDR)을 갖는， VEGF에 특이적으로 결합하여 종양 및 각종 안구 내 신생혈관 질환을 치료할 수 있는 항체를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다. 발명의 요약 따라서， 본 발명의 목적은 혈관내피세포 성장인자에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것이다. 상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은，
1)상보성 결정영역 (CDR) 1， CDR2및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역에서， 상기 CDR2가 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되고, 상기 CDR3이 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 ; 및
2) CDR1, CDR2 및 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역에서， 상기 CDR3 이 서열번호 3 의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는， 혈관내피세포 성장인자 (vascular endothelial growth factor, VEGF)에 결합하는 항체를 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은， 상기 항체를 포함하는 VEGF 과발현에 의해 야기되는 암 또는 신생혈관형성관련 질환의 예방， 진단 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 항체는 인간 또는 마우스 혈관내피세포 성장인자에 우수한 결합 능력을 나타내고， 제대정맥 내피세포 (HUVEC)의 증식 및 투과능을 억제하며 종양 성장을 억 -제할 -수있어 암—또는 산센^
진단 또는 치료용 항체로 유용하게 사용될 수 있다. 도면의 간단한설명 본 발명의 상기 및 다른 목적과 특징들은 첨부된 도면과 함께 하기 본 발명의 설명으로부터 명확해질 것이다: 도 1은 HF2-11 클론의 VEGF에 대한 결합 및 해리 센소그램을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 항체가 VEGF와 VEGFR1과의 결합을 억제하지 않으면서 VEGFR2와의 결합을 억제하는 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 항체의 인간 및 마우스 VEGF-A에 대한 특이적 결합을 나타내는 그래프이다.
도 4는 HF2-11 클론의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 HF2-4 항체의 중쇄 (a) 및 경쇄 (b)의 질량분석 결과를 나타낸 것이다. 도 6은 HF2-8 클론의 크기배제 크로마토그래피 (SEC) 결과를 나타낸 것이다.
도 7 및 8는 각각 본 발명의 항체 및 아바스틴의 인간 VGEF 및 마우스 VEGF에 대한 결합도를 ELISA로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9은 본 발명의 항체 및 아바스틴의 혈관내피세포 (HUVEC)의 증식 억제시험 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 항체 (a) 및 아바스틴 (b)의 HUVEC 투과성 억제시험 결과를 나타낸 것이다.
도 11는 본 발명의 항체의 HUVEC 유동성 억제시험 결과를 나타낸 것이다.
도 12은 본 발명의 항체의 HT29 이식 동물모델에서의 종양 성장 억제 효과를 나타낸 것이다.
도ᅵ 13은 본- .발명의―항체의ᅳ맥락막ᅳ신—생혈관형성억제 -효ᅳ과를 나타낸 것이다. 발명의 상세한설명 본 발명은 1) CDRl, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역에서， 상기 CDR2가 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되고， 상기 CDR3이 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역; 및 2) CDRl, CDR2및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역에서， 상기 CDR3이 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는， VEGF에 결합하는 항체 (이하， 항 -VEGF 항체)를 제공한다. 본 발명에 따른 항체의 경쇄 가변영역의 CDRl, CDR2 및 CDR3C이하， 각각 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3으로 지칭함); 및 중쇄 가변영역의 CDRl, CDR2 및 CDR3(이하， 각각 HCDRl, HCDR2, 및 HCDR3으로 지칭함)의 아미노산 서열 리스트를 하기 표 1에 나타내었다.
[표 1] 경쇄 및 중쇄 가변영역의 CDRl, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000009_0001
본 발명의 따른 VEGF에 결합하는 항체는， 1) 서열번호 4 내지 14로 -
이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는
CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역 ; 및 2)서열번호 15내지 34로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 35 내지 50으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는， 1) 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역;
및 2) 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 35의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는， 1) 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역;
및 2) 서열번호 16의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 36의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는， 1) 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역;
및 2) 서열번호 17의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 37의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는 1) 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3올 포함하는 경쇄 가변영역;
및 2) 서열번호 18의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 38의 아미노산
Figure imgf000011_0001
서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는, 1) 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 19의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 39의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항ᅳ VEGF 항체는， 1) 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 20의 아미노산서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 40의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는， 1) 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 21의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 38의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는， 1) 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 22의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 38의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항— VEGF 항체는, 1) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; . 및 2) 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 41의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는， 1) 서열번호 6의 5 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 24의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 38의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
10 본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는， 1) 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; ^ 및 2) 서열번호 25의 아미노ᅳ산 서열로ᅳ표시돠는 CDR1; 서열번호 38의―아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3를 15 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
• 본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는， 1) 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 26의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 42의 아미노산
20 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는, 1) 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역;
25 및 2) 서열번호 27의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 38의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는， 1) 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 _
및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 28의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 43의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는， 1) 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 29의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 44의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는， 1) 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 30의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 45의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는， 1) 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 31의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 42의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는, 1) 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 20의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 39의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는， 1) 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 32의 아미노산서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 46의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는， 1) 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 33의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 45의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는， 1) 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 34의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 47의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는， 1) 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 25의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 48의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는， 1) 서열번호 12의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 31의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 38의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는， 1) 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 31의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 46의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는， 1) 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 17의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 42의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는， 1) 서열반호 13의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 34의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 49의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는， 1) 서열번호 14의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 17의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 50의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
.
본 발명의 따른 VEGF에 결합하는 항체는， 1) 서열번호 54 내지 65로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 78 내지 104로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다 (표 2 참고). 본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는 1) 서열번호 54의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 78의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는 1) 서열번호 55의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 79의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는 1) 서열번호 55의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 80의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는 1) 서열번호 56의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 81의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는 1) 서열번호 55의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 82의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는 1) 서열번호 55의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 83의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는 1) 서열번호 57의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 84의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는 1) 서열번호 57의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 85의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는 1) 서열번호 58의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 86의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는 1) 서열번호 57의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 87의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는 1) 서열번호 57의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 88의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는 1) 서열번호 59의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 89의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는 1) 서열번호 57의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 90의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는 1) 서열번호 60의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 91의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는 1) 서열번호 55의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 92의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는 1) 서열번호 61의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 93의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는 1) 서열번호 62의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 94의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는 1) 서열번호 62의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 95의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는 1) 서열번호 62의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 96의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는 1) 서열번호 55의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 97의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는 1) 서열번호 55의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 98의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는 1) 서열번호 57의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 99의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는 1) 서열번호 63의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 100의 아미노산 서열로 표시되는 증쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는 1) 서열번호 60의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 101의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는 1) 서열번호 61의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 102의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는 1) 서열번호 64의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 103의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 항 -VEGF 항체는 1) 서열번호 65의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 104의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체일 수 있다. 본 발명의 항체는 경쇄 불변영역 및 중쇄 불변영역을 포함할 수 있으며， 상기 경쇄 불변영역 및 중쇄 블변영역은 공지된 인간 항체의 경쇄 불변영역 및 중쇄 불변영역일 수 있다 (URutishauser등 PNAS, 61(4)： 1414- 1421 (1968)； 및
Takahashi N. 등, Cell, 29 :671-679 (1982)). 본 발명에 따른 항체는 인간 또는 인간화 항체일 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 면역글로불린 중 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgD, IgE또는 IgM인 것을 포함할 수 있으며， VEGF에 결합하는 항체 또는 이들을 흔합하는 형태 또는 이들의 변이체일 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 Fab, Fab' ， F(ab' h, Fv, dAb 또는 scFv 형태이거나， 또는 상기 항체의 CDR을 VEGF와의 결합에 주요 부위로 하는 스캐폴드 접합체 (scaffold conjugate) 형태일 수 있다. 또한， 본 발명은 경쇄 가변영역의 아미노산 서열인， 서열번호 54 내지
65로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는， 서열번호 66 내지 77로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열을 제공한다.
본 발명은 중쇄 가변영역의 아미노산 서열인, 서열번호 78 내지 104로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는，서열번호 105내지 131로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열을 제공한다. 본 발명에 따른 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변영역의 아미노산 및 그에 해당하는 염기서열 리스트를 하기 표 2에 나타내었다.
[표 2]
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또한， 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 VEGF에 결합하는 항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 DNA를 제공한다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2를 코딩하는 DNA는 ,
서열번호 51의 염기서열로 표시되고， 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 코딩하는 DNA는 서열번호 52의 염기서열로 표시될 수 있다.
따라서， 본 발명의 항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 DNA는, LCDR2를 코딩하는 서열번호 51의 염기서열; 및 LCDR3을 코딩하는 서열번호 52의 염기서열을 포함할 수 있다. 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 포함하는 VEGF에 결합하는 항체의 중쇄 가변영역을 코딩하는 DNA를 제공한다.
상기 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시돠는 CDR3을 코딩하는 DNA는 서열번호 53의 염기서열로 표시될 수 있다.
따라서， 상기 항 -VEGF 항체의 중쇄 가변영역을 코딩하는 DNA는 서열번호 53의 HCDR3을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다. 본 발명은 상기 항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 DNA를 포함하는， VEGF에 결합하는 항체의 경쇄 가변영역을 발현시키는 발현백터를 제공한다. 바람직하게는， 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2를 코딩하는 서열번호 51의 염기서열， 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 코딩하는 서열번호 52의 염기서열올 포함하는， VEGF에 결합하는 항체의 경쇄 가변영역을 발현시키는 발현백터를 제공한다. 또한， 본 발명은 상기 항 -VEGF 항체의 중쇄 가변영역을 코딩하는 DNA를 포함하는， VEGF에 결합하는 항체의 중쇄 가변영역을 발현시키는 발현백터를 제공한다.
바람직하게는， 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3을 코딩하는 서열번호 53의 염기서열을 포함하는， VEGF에 결합하는 항체의 중쇄 가변영역을 발현시키는 발현백터를 제공한다.
본 발명에 따른 발현백터는 CH0 세포 HEK 세포 또는 NS0 세포와 같은 동물 세포주로 형질전환될 수 있으며， 상기 동물 세포주는 이에 한정되는 것은 아니다. 또한， 본 발명은 상기 VEGF에 결합하는 항체를 포함하는, VEGF 과발현에 의해 야기되는 암 또는 신생혈관형성 관련 질환의 예방， 진단 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
신생혈관형성은 기존의 모세혈관으로부터 새로운 모세혈관이 발아되어 형성되는 것을 말하는 것으로， 본 발명에서 "신생혈관형성 관련 질환" 은 VEGF 과발현에 의해 야기되는 신생혈관형성과 관련된 모든 질환을 의미한다. 이러한 신생혈관형성 관련 질환으로는 각종 암 및 안구 질환 등을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 VEGF 과발현에 의해 야기되는 암 또는 신생혈관형성 관련 질환은 대장암， 췌장암， 신장암, 폐암， 유방암， 난소암 및 뇌암으로 이루어진 군에서 선택되는 암; 및 황반변성 질환， 당뇨병성 망막증 및 허혈성 망막증으로 이루어진 군에서 선택되는 안구질환 등을 포함할 수 있다. 항 -VEGF 항체는 임상에서 플루오로피리미딘계 약물， 파클리탁샐， 플라티늄계 약물， 인터페론알파 -2a, 카보플라틴 등과 같은 약물과 함께 사용될 수 있다 (FDA US BL 125085 Avast in label).
본 발명의 약학 조성물 역시 상기 항체 이외에, 폴루오로피리미딘계 약물, 파클리탁셀, 플라티늄계 약물， 인터페론알파 _2a, 카보플라틴, 독소루비신 (doxorubicin), 시스플라틴 (cisplatin), 젬시타빈 (gemcitabine)，
5-플루오로우라실, 류코보린, 이리노테칸， 옥살라플라틴, 카페시타빈， 및 도세탁셀로 이루어진 군에서 선택되는 약물을 병용하여 사용할 수 있으며， 상기 약물은 이에 한정되는 것은 아니다.
또한， 항암 활성을 나타내는 어떠한 화학 치료제라도 본 발명의 약학 조성물과 함께 사용될 수 있다. 상기 화학 치료제는， 알킬화제， 대사길항물질， 풀산 동족체， 피리미딘 동족체, 퓨린 동족체 및 관련 억제제， 빈카 알칼로이드， 에피포도필로톡신， 항생제, L-아스파라기나제, 토포아이소머라제 억제제， 인터페론， 백금 배위 착물， 안트라센디온 치환된 우레아， 메틸 하드라진 유도체， 부신 피질 억제제， 아드레노코르티코스테로이드， 프로게스틴, 에스트로겐， 안티에스트로겐， 안드로겐, 안티안드로겐， 및 고나도트로핀 -방출 호르몬 동족체로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 또한， 본 발명은 상기 VEGF에 결합하는 항체를 포함하는， VEGF 과발현에 의해 야기되는 암 또는 신생혈관형성 관련 질환의 진단용 키트를 제공한다. 상기 신생혈관형성 관련 질환의 예는 앞서 언급한 바와 동일하다. 본 발명에 따른 항체는, VEGF와 VEGF 수용체인 Flt-l(VEGFR-l)과의 결합에는 영향을 주지 않고， VEGF와 VEGF 수용체인 KDR VEGFR-2)의 결합을 선택적으로 억제한다 (도 2). 또한， 인간 VEGF-B, 인간 VEGF- (：， 인간 VEGF-D 및 인간 태반 성장인자 (PIGF)에 대해서는 전혀 결합하지 않는 반면, 인간 VEGF-A 및 마우스 VEGF-A에 대해서는 높은 결합특이성을 나타낸다 (도 3).
본 발명의 항체의 인간 혈관 내피세포 성장인자에 대한 결합 친화도 (binding affinity)를 효소 면역 즉정법 (Enzyme— 1 inked immunosorbent assay, ELISA)을 통해 확인한 결과， 인간 VEGF에 대해 농도 의존적인 결합력을 나타내었으며 (도 7)， 기존의 항 -VEGF 항체인 아바스틴이 마우스 VEGF에 대해 결합력을 나타내지 않는 것과는 달리 마우스 VEGF에 대해서도 우수한 결합력을 나타내어 마우스를 이용한 전임상 연구에도 적합함을 알 수 있다 (도 8).
또한, 본 발명의 항체는 VEGF에 의해 촉진되는 인간 제대정맥 내피세포 (HUVEC)의 증식， HUVEC 투과능 및 HUVEC 유동성을 아바스틴보다 동등이상 수준으로 억제하였으며 (도 9 내지 11)， 인간 대장암 세포주를 이식한 마우스에서 종양 성장을 아바스틴에 비해 월등히 우수한 수준으로 억제시켰다 (도 12). 또한 맥락막 신생혈관형성 모델에서도 대조군 대비 유의하게 혈관형성을 억제하였다 (도 13). 따라서， 본 발명의 인간 (화) 항체는 암 또는 신생혈관형성 관련 질환의 치료용으로 유용하게 사용될 수 있으며， 이에 본 발명은 상기 항체를 포함하는 암 또는 신생혈관형성 관련 질환의 예방 치료용 조성물을 제공한다. 정의 . , ru7M ϋΆ I 0 4858
본 발명에서 "VEGF" 는 165-아미노산 인간 혈관내피세포 성장인자 및 관련 121-， 189- 및 206—아미노산 혈관내피세포 성장인자 뿐만 아니라， 천연의 상기 성장 인자의 대립형질 형태 및 변화된 형태를 함께 의미한다 (문헌 [Leung 등， Science. , 246： 1306 (1989)； 및 Houck등， Mol . Endocrin. , 5： 1806 (1991)] 참고).
본 발명에서 "항 -VEGF 항체" 는 VEGF 수용체에 VEGF가 결합하는 것을 방해함으로써， VEGF에 의해 활성화된 세포를 무능력하게 하거나， 또는 VEGF 수용체에 VEGF를 결합시킨 후 혈관 내피 세포 활성화를 방해함으로써 작용되는 항체를 의미한다.
본 발명에서 "항체" 는 특정 항원에 대한 결합 특이성을 나타내는 당단백질을 의미한다. 비인간 (예를 들어， 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소의 서열을 포함하는 키메릭 항체이다.
대부분， 인간화 항체는 인간 면역글로불린의 초가변 영역 잔기를 목적하는 특이성， 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트， 토끼， 닭 또는 비인간 영장류의 초가변 영역 잔기로 교체하여 제조된다. 몇몇 경우， 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기가 상웅하는 비인간 잔기로 교체된다.
본 발명에서 "단쇄 FV"또는 "scFv"항체 단편은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재하는， 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 일반적으로， FV 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 바람직한 구조를 형성하도록 하는 VH 및 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 더 포함한다
본 발명에서 "Fab 항체 단편" 은 항체를 단백질분해효소인 파파인으로 소화시켜 얻는 단편으로， 항체의 VH 및 VL 도메인， 및 (¾ 및 CL 도메인이 S-S 결합으로 연결되어 있으며， 항원에 결합하는 (antigen binding) 기능이 있다.
본 발명에서 "F(ab' )2 항체 단편" 은 항체의 Fc (C¾ 및 C¾) 단편을 제외한 부분을 의미하며， 항체의 Hinge 영역아래를 절단하여 만들 수 있다.
본 발명에서 "Fab' " 는 F(ab' )2 의 항체 단편의 hinge region을 절단한 형태이며， 2개의 -SH기를 가지는 것이 특징이다.
본 발명에서 "FV" 는 항체의 가변영역이고, "dAb" 는 단일 도메인 i 丄 , I U U 400
항체 단편을 의미한다.
본 발명에서 "VEGF 수용체" 는 VEGF에 대한 세포 수용체, 통상, 혈관내피세포에서 발견되는 세포 -표면 수용체 및 hVEGF를 결합시키는 능력을 보유하는 그의 변이체를 의미한다. VEGF 수용체의 한 예로는 fms형 티로신 키나제 (fit)인 티로신 키나제류에 있는 트랜스멤브레인 수용체가 있다 (문헌
[DeVries등， Science.， 255： 989 (1992)； Shibuya등, Oncogene. , 5； 519 (1990)]).
fit수용체는 세포외 도메인, 트랜스멤브레인 도메인, 및 티로신 키나제 활성을 갖는 세포내 도메인을 포함한다. 세포 외 도메인은 VEGF의 결합과 관련이 있는 반면， 세포내 도메인은 신호 변환과 관련이 있다. VEGF수용체의 또다른 예로는 flk-1수용체 (이하, "KDR" 이라고도 지칭함)가 있다 (문헌 [Matthews등， oc.
Nat. Acad. Sci. , 88： 9026 (1991)； Terman 등, Oncogene. , 6： 1677 (1991)). 이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀 더 상세하게 설명하고자 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐， 본 발명의 범위가 이들만으로 제한되는 것은 아니다. 실시예 1. VEGF 면역 및 cDNA라이브러리 제작
VEGF 에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하기 위하여， 동물 면역 항체 라이브러리를 구축하였다. 상기 라이브러리는 동물에 항원을 면역한 면역세포로부터 mRNA 를 얻은 후 항체 유전자의 프라이머 조합을 이용하여
PCR 을 통해 항체 유전자를 증폭시키고 파아지 디스플레이를 위한 백터 내로 클로닝하는 방식으로 수행되었다.
구체적으로， 화이트 레그흔종의 닭 3 마리에 인간 VEGF 와 마우스
VEGF (R&D systems, 미국)를 완전 프로인트 보강제 (complete Freund's adjuvant) 및 불완전 프로인트 보강제 (Sigma, 미국)와 흔합하여 3 주 간격으로 5 회 피하 주사하였다. 면역한 동물의 혈청을 얻은 후, PBSB( 태아혈청알부민 (bovine serum albumin)을 포함하는 인산완층용액)를 이용하여 1:100， 1:500， 1:2500및
1:12500 의 농도로 희석하여 보관한 후， 인간 VEGF 와 마우스 VEGF 와의 .
결합여부를 효소면역측정법으로 확인하였다. ELISA 플레이트에 인간 VEGF(VEGF-165, R&D systems,미국)와 마우스 VEGF(VEGF-164, R&D systems,미국) 0.2 ug/ml 을 4°C에서 각각 밤새 코팅한 후, 상기에서 희석한 혈청을 넣고 2시간 동안 반웅시켰다 . PBST(0.1% tween-20을 포함하는 PBS)로 3회 세척한 후 항ᅳ닭 면역글로블린 -HRPChorse radish peroxidase)(l:3000)를 넣고 1시간 동안 반응시켰다. PBST로 3회 세척한 후 울트라 TMB Thermo,미국)을 넣고 7분 동안 발색시킨 후 650 nm 에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더 (microplate reader)로 측정하였다. 면역 전 혈청은 VEGF 와 결합하지 않았으며， 인간 VEGF 와 마우스 VEGF 모두에 강하게 결합하는 혈청을 생산하는 동물을 선별하였다.
마지막 주사 후 5 일 후에 선별된 닭의 골수， 지라 및 파브리시우스낭 조직을 채취하였다. 조직을 10 ml TRI시약 (Molecular research center, 미국)과 흔합하여 호모게나이저로 분쇄한 후 20 ml TRI 시약을 추가한 후 원심분리하여 상층액을 얻었다. 여기에 1-브로모 -3-클로로프로판 (l-bromo-3-chloropropane, BCP) 3 ml을 넣고 원심 분리하여 상층액을 얻었다. 이소프로판올 15 ml로 전체 RNA를 침전시켜 얻었다. 랜덤 핵사머 (random hexamer)를 프라이머로 이용하여 수퍼스크립트 전사 시스템 (Invitrogen, 미국)을 이용하여 역전사 반옹 (65°C에서 5분; 4°C에서 5분; 5( C에서 50분; 85°C에서 5분; 및 4°C)을 수행하였다. 역전사 반웅의 결과물인 cDNA 를 포함하는 반응액 5 μΐ 를 1% 아가로스 젤에 로딩하여 전기영동 후 다양한 길이의 cDNA 밴드를 확인하였다. 실시예 1, 항체 라이브러리 제작
(2-1) 면역 항체 유전자 증폭 닭 항체의 중쇄와 경쇄의 가변영역인 VH 와 VL도메인을 증폭하기 위하여 다음과 같이 PCR 반웅을 수행하였다.
PCR반응은 실시예 1에서 제조한 cDNA를 주형으로 하여，중쇄 가변영역, 경쇄 가변영역 및 이를 연결한 scFV(single chain Fv)영역에 맞게 고안된 하기 ^^2ϋ1ί / 004S58 표 2의 프라이머 조합을 이용하였다. 및 VL각각의 cDNA라이브러리 0.5 μ 1, 30 pmole순방향 프라이머， 30 pmole역방향 프라이머， 10x PCR버퍼, 200 uM dNTPs 및 0.5ul TaqDNA폴리머라제를 흔합하여 최종 50 ul를 맞추어 준 후， 94°C에서 5 분 반웅시킨 후， 94°C에서 15 초, 56°C에서 30 초 및 72°C에서 90 초간 반응시키는 과정을 30사이클 반복하였다.
[표 3]
PCR 반응에 사용된 프라이머
Figure imgf000027_0001
PCR 증폭된 항체 DNA 를 1¾) 아가로스 젤에 전기 영동하여 각각의 증폭된
DNA 를 크기에 따라 분리하고 겔 추출 키트 (Gel extraction kit, Qiagen, 미국)를 이용하여 정제하였다.
scFvDNA를 얻기 위해， 정제된 VH50ng및 VL50ngDNA를 주형으로 하여 , 표 3에 기재된 30 pmole순방향 프라이머 및 30 pmole역방향 프라이머, 10x PCR 버퍼， 200 uM dNTPs 및 0.5 ul Taq DNA 폴리머라제를 흔합하여 최종 50 ul 를 맞추어 준 후, 94°C에서 5 분 반웅시키고， 94°C에서 30 초， 56°C에서 30 초 및
72°C에서 2 분간 반웅시키는 과정을 20 사이클 반복하여 PCR 을 수행하였다.
상기 PCR을 통해 증폭된 DNA를 1¾아가로스 젤에 전기 영동하여 각각의 증폭된 ,
DNA 를 크기에 따라 분리하고， 겔 추출 키트 (Qiagen, 미국)를 이용하여 정제하였다.
(2-2) 항체 DNA의 제한효소 절단 상기에서 제조된 scFV와 파지미드 백터인 PComb3X(the Scripps Research Institute, CA, 미국)를 제한효소 Sfil (Roche, 미국)로 절단하였다.
scFv를 코딩하는 PCR 절편 10 ug, 360 units Sfil (Roche, 미국)， 20 ul 10x 버퍼를 넣고 최종 볼륨이 200 ul가 되게 하여 50°C에서 밤샘 반웅시켰다. 또한， pComb3X 백터 20 ug, 120 units Sfil 및 20 ul 10x buffer를 넣고 최종 볼륨이 200 ul 가 되게 하여 50°C에서 밤샘 반응시켰다. 상기 제한효소로 절단한 각각의 절편을 아가로스 젤에 전기영동한 후 겔 추출 키트 (Qiagen, 미국)를 이용하여 정제하였다. (2-3) 항체 DNA의 라이게이션 및 라이브러리의 제조 scFv 절편을 pComb3X 백터에 삽입하기 위하여， 상기 (2-2)에서 제한효소 Sfil를 이용하여 절단한 scFv를 코딩하는 PCR절편 700ng및 PComb3X 1.4 ug을 흔합하고， T4 DNA 라이게이즈 (Invitrogen, 미국)를 첨가하여 16°C에서 밤새 반웅시켰다. 상기 라이게이션 흔합물을 에탄올 침강법으로 정제하고， 대장균 ER2738(New England Biolab, 미국)에 전기 천공법 (elect roporat ion)으로 형질전환시켜 46 ug/ml 카베니실린 및 70 ug/ml 카나마이신 하에서 배양하여 1.5 X 109 complexity를 가진 라이브러리를 제작하여 이용하였다. 실시예 3. 항 -VEGF scFV를포함하는 파지 클론의 선별 상기 실시예 2에서 수득한 scFv의 형태로 랜덤화된 중쇄와 경쇄를 갖는 라이브러리로부터 인간 VEGF 와 마우스 VEGF 에 모두 결합하는 항체를 고체에 지지된 VEGF를 이용하여 선별하였다. ϊ υ ΐκ im. I
(3-1) VEGF에 결합하는 항체 선별 먼저 ,마그네틱 비드에 인간 VEGF( R&D systems,미국)및 마우스 VEGF(R&D systems, 미국) 10μβ을 각각 컨쥬게이션시켰다.
상기 실시예 2 에서 수득한 scFv 형태의 항체를 파아지의 코트 단백질 PIII 와 융합하여 디스플레이할 수 있게 만들어진 항체 라이브러리 DNA 를 대장균 ER2738(New England Biolab)에 전기천공법으로 형질전환시키고， 37°C에서 배양 후 VCSM13 헬퍼 파지 (Stratagene, 미국)를 넣은 후 46 ug/ml 카베니실린과 70 ug/ml 카나마이신을 넣고 SB배지 (30 g/L트립톤， 20 g/L효모 추출물 및 10 g/L MOPS, pH 7.0)에서 밤새 배양하였다.
상기에서 수득한 대장균과 파아지를 포함하는 배양액을 원심분리하여 ᅳ칩전된ᅵ대장균을ᅳ제거하였다.상등액만을 회수한 후， 40mg/i 폴리에틸렌글리콜 8000과 30 mg/ml NaCl을 첨가하고 원심 분리하여 PEG에 의해 침전된 파아지를 모아 PBS로 재현탁하였다.
마그네틱 비드에 컨쥬게이션된 인간 VEGF 또는 마우스 VEGF 와 파아지를 상온에서 2 시간 동안 반응시킴으로써 VEGF 에 친화력을 가진 파아지를 결합시킨 후， 이를 0.5%Tween 20을 포함하는 PBS로 세척하고， 0.1M글리신 (pH 2.2)용액으로 용출하고 2M트리스 용액으로 중화시켰다. 용출된 파아지는 다음 라운드 패닝 (panning)을 위해 대장균 ER2738 에 감염시켜 밤새 배양하여 증식시켰다. 이러한 과정을 4차례 반복하며 패닝 (panning)을 진행하였다.
패닝 흿수가 증가할수록 세척 횟수가 증가하여 결합력이 높은 파아지를 축적하였다. 인간 VEGF 와 마우스 VEGF 에 모두 결합하는 바인더를 찾기 위해 인간 VEGF 단독， 또는 인간 VEGF 와 마우스 VEGF 를 번갈아 항원으로 사용하였다.
각각의 4 차 패닝 결과물의 플레이트로부터 선별된 개별 클론을 96 딥웰 (deep well) 플레이트에서 100 ug/ml 카베니실린， 70 ug/ml 카나마이신 및 VCSM13 헬퍼 파아지 (1:1000)를 넣고 37°C에서 밤새 배양하여 항체가 발현된 파아지의 증식을 유도하였다. 상기에서 수득한 배양액을 원심분리를 이용해 파아지를 포함한 배지 상등액을 얻어 VEGF 가 코팅되어 있는 ELISA 플레이트에 넣고 37°C에서 2 시간 동안 배양하였으며， HRP 가 컨쥬게이션되어 있는 항 -M13 항체를 이차항체로 이용하여 VEGF에 결합하는 항체를 ELISA로 확인하였다 .
(3-2) 선별된 항체의 시뭔싱 상기 3-1 에서 선별한 인간 VEGF 및 마우스 VEGF 에 모두 양성 시그날을 나타내는 클론을 가지고 있는 ER2738 을 SB 배지로 밤새 배양한 후 원심분리하여 대장균을 얻었다. DNA 미니 프랩 키트 (진을， 한국)를 이용하여 플라스미드 DNA를 얻어 염기서열을 분석하였다. 염기서열 결정을 위해 하기 표 4 에 나타낸 바와 같은 시뭔싱 프라이머 (서열번호 138 및 139)의 프라이머를 이용하여ᅵ분석하였으며 Γᅳ선별된 클론은 ' '클론 '로명명하였다.ᅳ클론 F 항체의 구체적인 서열 정보는 상기 표 1에서 나타낸 바와 같다.
[표 4]
Figure imgf000030_0001
실시예 4. 인간화및 친화도 개선 동물 면역 항체라이브러리로부터 얻은 항체 클론 F의 프레임워크를 인간 항체 프레임워크로 변환하고 일부 항원 결합에 중요한 잔기는 고정하였다
(Nishibori et al . , Molecular Immunology, 43 (2006)) .
친화도 개선을 위해 중쇄 및 경쇄영역의 CDR의 서열을 랜덤화시켜 새로운 파아지 라이브러리를 제작하였다. 상기 실시예 2와 같은 방법으로 수득한 파아지 라이브러리를 마그네틱 비드에 고정시킨 인간 VEGF lOiig과 상은에서 2시간 반응시킨 후 0.5% Tween 20을 포함하는 PBS로 5회 세척하였다. 세척 후 결합되어 있는 파아지를 0.1M 글리신 (pH 2.2) 용액으로 용출하고 2M rV JL ^Ult. I V l ¾ 0 d 0
트리스 용액으로 중화시켰다.2차 패닝 시에는 Tween20을 포함하는 PBS로 10회 세척하고 3차 패닝 시에는 Tween 20을 포함하는 PBS로 20회 세척하여 선택 압력을 증가시켰다.
상기 과정을 거친 클론 F의 변이 클론들을 "HF2-1 내지 HF2-26" 으로 명명하였고， 결합 친화도를 ELISA와 BIAcore를 통해 확인하였다. 그 결과， 상기 과정을 거쳐 수득된 항체는 모클론 F에 비해 10배 이상의 친화도로 인간 VEGF 및 마우스 VEGF와 결합하는 것을 확인하였고 이 중 일부 클론은 100배 이상의 친화도를 가진다. 실시예 5. 항체의 생산 상기에서 수득한 항체의 친화도 측정 및 활성 분석을 위하여， scFv또는 면역글로불린 (IgG) 단백질을 생산하였다.
scFv 단백질의 경우, 선별된 클론의 DNA를 포함하는 pComb3X 플라스미드로 HB2151 대장균을 형질전환시킨 후 발현되는 scFv를 정제하였다.
구체적으로， O.D.값이 1일 때 1 mM 이소프로필 β-D-l-티오갈락토피라노사이드 (IPTG)를 넣고 37°C에서 밤새 배양한 후， 원심분리를 통해 상기 대장균와 배양액을 분리하였다. scFv 정제를 위해 scFv 단백질을 카복시 말단에 태그되어 있은 His tag과 결합하는 니켈 NTA컬럼 (GE, 미국)에 결합시키고, 250-300 mM 이미다졸 용액으로 용출 (elution)한 후 PBS 버퍼에 밤새 투석하였다.
한편， IgG의 경우， scFv를 포함하는 pComb3x로부터 중쇄 및 경쇄의 가변영역과 불변영역의 절편을 하기 표 5의 프라이머 조합을 이용해서 실시예
2와 같은 조건의 PCR을 통해 수득하였다.
각 가변영역과 불변영역 ( 및 Ck)을 하기 표 5의 HC 및 IX 프라이머 조합을 이용하여 PCR로 각각 중쇄와 경쇄를 얻어냈고， pcDNATM3.3-T0P0®TA 클로닝 키트 및 p0ptiTMVEC-TOP0®TA 클로닝 키트 (Invitrogen, 미국)를 이용하여 포유류 세포 발현 플라스미드로 옮겼다. 각 백터 (pcDNATM3.3-T0P0® 백터와 pOp TM VEC-T0P0® 백터) 1 ul와 절편을 200 mM NaCl 및 10 mM MgCl2이 iiiv U U 4005
포함된 완층액에 총 6 ul가 되게 첨가하여 상온에서 5분 동안 반웅시켰다. DH 5a 대장균 competent cell에 열충격을 가하여 형질전환하여 콜로니를 얻은 후 대량 배양하여 플라스미드를 얻었다.
상기에서 제조된 플라스미드를 이용하여 HEK293F 세포 (Invitrogen, 미국)에 형질감염시킨 후, 7일 동안 배양하여 수득한 항체를 단백질 A컬럼 (GE 미국)을 사용하여 정제하였다. 배양액을 컬럼에 로딩하여 배양액 중에 있는 항체 (IgG)를 단백질 A와 결합시키고 20 mM 구연산 나트륨 버퍼 (pH 3.0)로 용출하였다. SDS-PAGE를 통해 경쇄와 중쇄의 SDS-PAGE를 통해 경쇄와 중쇄의 이론적 계산치와 일치하는 분자량과 높은 순도를 확인하였다.
[표 5]
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000033_0001
실시예 6. 결합력 측정
EL ISA플레이트에 0.2 yg/ml의 인간 VEGF 및 마우스 VEGF(R&D systems, 미국)를 각각 코팅하고， 상기 실시예 5에서 수득한 scFv 형태로 HB2151로부터 발현하여 정제된 단백질， 또는 igG 형태로 293F 세포에서 발현하여 정제한 단백질을 순차적으로 희석된 농도로 인큐베이션하였다. 그 결과， 실시예 3-2에서 얻은 클론 F 및 이로부터 친화도 개선을 통해 얻어진 변이체들이 인간 VEGF와 마우스 VEGF에 농도 의존적으로 잘 결합함을 알 수 있었다.
한편， 친화도를 측정하기 위해 인간 VEGF 및 마우스 VEGF 각각을 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, GE)을 이용하여 제조자의 지시에 따라 커플링하였다. 결합 및 해리 속도 측정을 위해 IgG단백질을 5nM, 2.5nM, 1.25 nM, 0.625 nM, 0.313 nM 및 0.156 nM로 2배 연속 희석하여 주입하였다. 결합속도 및 해리속도는 결합 및 해리 센소그램 (sensogram)으로 표시되고 단순 일대일 탱뮈어 결합 모델 (BIAcore X100 평가 소프트웨어， 버전 2.0)을 사용하여 계산하였다. 평형해리 상수 (KD)는 해리 속도 상수 (Kd)를 결합 속도 상수 (Ka)로 나눈 값으로서， 실제 값을 계산한 결과 nM 이하로 높은 수준의 KD값을 확인하였다. 항체 HF2-1 내지 HF2-11, HF2-13 및 HF2-14의 인간 VEGF(hVEGF)에 대한 측정값을 하기 표 6에 나타냈으며 대표적으로 HF2-11의 센소그램을 도 1에 나타내었다.
[표 6]
Figure imgf000033_0002
Λ Λ
PC R 2014. I 004853
Figure imgf000034_0001
실시예 7. 리간드-수용체 결합 억제 확인 본 발명의 항체 중 HF2-1, HF2-5, HF2-9및 HF2-11의 VEGF및 VEGF수용체 KDR (이하， VEGFR2) 또는 VEGF 수용체 Flt-1(이하， VEGFR1)의 결합 억제효과를 확인하기 위하여 다음과 같이 실험하였다.
0.5 ug/ml 인간 VEGF를 96웰 ELISA 플레이트에 코팅한 후 3% BSA 및
0.05% Tween 20을 포함하는 PBS용액으로 불로킹하였다. 6 iiM농도의 FU-1 ECD
IgG-Fc 융합단백질 (27-687， R&D systems, 미국)， 9 nM 농도의 KDR ECD IgG-Fc 융합단백질 (R&D systems, 미국)을 각각 0.01 nM, 0.1 nM, 0.3 nM, 1 nM, 3 nM,
10 nM및 100 nM로 연속 희석된 각각의 항체 (HF2-1, HF2-5, HF2-9 및 HF2ᅳ 11)와 함께 각 웰에 넣고 37°C에서 1시간 동안 배양하였다. 항체에 의한 결합 억제 반웅 이후에도 결합되어 있는 Flt-1 ECD IgG-Fc 융합단백질과 KDR ECD IgG-Fc 융합단백질을 항 -인간 IgG-Fc 항체 -HRP 컨쥬게이트 (Jackson I麵 unoresearch, 미국)와 결합시키고 ABTS를 기질로 발색시킨 다음 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과， 도 2에 나타낸 바와 같이， 본 발명의 항체는 VEGF와 KDR(VEGFR2)의 결합을 농도 의존적으로 억제시켰으나， VEGF와 Flt-l(VEGFRl)의 결합은 억제하지 않았다. 즉， 본 발명의 선별된 항체는 VEGF와 VEGF 수용체의 결합을 선택적으로 억제하는 것을 확인하였다. 실시예 8. 결합특이성 확인 본 발명의 항체 중 HF2-1, HF2-5, HF2-9 및 HF2-11의 인간 VEGF-A(hVEGF-A) , 마우스 VEGF-A(mVEGF-A)， 인간 VEGF-B(hVEGF-B)， 인간 VEGF-C(hVEGF-C) , 인간 VEGF-D(hVEGF-D) 및 인간 태반 성장 인자 (P1GF)에 대한 결합 특이성을 측정하기 위해 다음과 같이 실험하였다.
상기 각 단백질 (hVEGF— A, mVEGF-A, hVEGF-B, hVEGF-C, hVEGF-D 및 P1GF)(R&D systems) 0.2 g/ml을 ELISA플레이트에 코팅하였다.3% BSA및 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS로 37°C에서 30분간 블로킹한 후， 증가하는 농도의 항체 클론 단백질을 37°C에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어， 3% BSA 및 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS로 3회 세척한 후 항 -인간 IgG—Fab-HRP 컨쥬게이트 (Jackson I議 unoresearch, 미국)를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 3 ) BSA 및 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS로 3회 세척 후, TMB를 기질로 발색시킨 다음 650 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 대조군으로는 아바스틴 (Roche, 스위스)을 이용하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이 본 발명의 항체 클론들은 hVEGF-A 및 mVEGF-A에는 잘 결합하지만， VEGF—B, VEGF-C, VEGF-D및 P1GF와는 전혀 결합하지 않았으며 , 이를 통해 VEGF에 대해 높은 특이성을 가짐을 알 수 있었다. 실시예 9. 물리화학적 특성분석 본 발명에 따른 항체의 물리 화학적 특성을 분석하였다.
NuPAGE 4-12% Bis-Tris 겔 (Invitrogen사)을 이용하여, 검체를 DTT로 처리하여 이황화 결합을 제거한 환원조건， 및 DT처리하지 않은 비환원 조건에서 각각 SDS-폴리아크릴아미드젤 전기영동 (SDS-PAGE) 분석을 수행하여 전체 항체의 경쇄와 중쇄의 존재를 확인하였다. 대표적으로, HF2-11에 대한 분자량 측정 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이， 비환원 조건 (NR, 5 ug)에서 분석한 검체는
116 kDa 사이즈 마커와 205 kDa의 사이즈 마커 위치 사이에 1개의 주요 밴드가 관찰되어 전체 항체 크기에 해당되는 밴드의 존재가 확인되었다. 환원 조건 (R, 2 yg)에서 분석한 검체는 55 kDa사이즈 마커와 20.1 kDa사이즈 마커 부근에서 각각 1개의 주요 밴드가 관찰되어 항체의 증쇄와 경쇄에 해당되는 밴드의 존재가 확인되었다. 이와 같이 SDS-PAGE에서 전체 항체 및 중쇄와 경쇄에 해당되는 밴드가 확인되었으며， 그 외의 주요 불순물 밴드는 관찰되지 않았다. 또한, 액체크로마토그래피 /질량분석법 (LC/MS)을 이용하여 HF2-4의 분자량을 측정하여 이론적인 아미노산 서열에서 예측되는 값과 일치하는지를 확인하였다. 대표적으로， HF2-4에 대한 중쇄 및 경쇄의 질량분석 결과를 도 5의 (a) 및 (b)에 나타내었다.
검체를 부분적으로 환원한 후 중쇄와 경쇄의 질량을 각각 분석한 결과， 중쇄는 약 50.6 kDa, 경쇄는 약 23.3 kDa 크기의 주요 피크를 보여 예상 분자량과 일치하는 것으로 확인되었으며， 주요 피크 외에 당쇄 부가 (glycosylation) 등 번역 후 수정 (post—trans 1 at ional modi f i cat ion)에 따른 이형체로 추정되는 작은 피크들이 추가로 관찰되었다. 한편, 본 발명의 항체 HF2— 8의 웅집상태 (불순물의 한 종류로 soluble aggregate를 지칭함)를 TSKgel G3000SWxl 칼럼 (Tosoh사)올 이용한 크기배제 크로마토그래피 (size exclusion chromatography, SEC)로 분석하여 그 결과를 도 6에 나타내었다. 100 mM 인산완충액 (pH6.6)을 이동상으로 하여 둥용매용리 방법으로 분리하고 흡광도 280 nm에서 모니터링하였을 때에 단량체의 피크면적이 전체 피크면적의 98% 이상을 차지하였으며， 웅집체 피크의 비율은 2% 미만으로 높은 순도를 나타내었다. „
KUl 2014. I 004858
실시예 10. 인간또는마우스 VEGF에 대한항체의 결합분석 본 발명의 항체 (HF2-1 내지 HF2-26)의 인간 혈관내피세포 성장인자 (VEGF)에 대한 결합력을 ELISA법을 이용하여 확인하였다.
150 의 완충용액에 회석한 인간 VEGF 1.5 ng를 96웰 면역 플레이트 (Nunc, 미국)에 넣고， 41：에서 보관하여 밤새 흡착시킨 후， 0.1% TVeen 20이 포함된 완층용액으로 3회 세척하였다. 다시 1% 우혈청 알부민 (Sigma, 미국)이 포함된 완충용액으로 상온에서 1시간 반웅시킨 후, 3회 세척하고, 순차적 농도 (1 ng/ml, 10 ng/ml, 30 ng/ml , 100 ng/ml , 1000 ng/ml 및 3000 ng/ml)로 회석한 각각의 항체를 웰 당 150 yL씩 처리하였다. 항원에 항체가 결합할 수 있도록 상온에서 1시간 반웅시킨 후， 완층용액으로 3회 세척하였다. 항 -인간 면역글로불린 Fc-HRP 항체 (AbSerotec, USA)를 1:20000으로 희석하여 웰 당 150 yL씩 처리한 후, 상온에서 1시간 반웅시켰다. 반웅이 끝난 후, 완층 용액으로 3회 세척한 후， TMB(Sigma, 미국)를 150 씩 넣고 10분간 발색시켰다. 1N황산용액으로 반웅을 종결시키고,분광 광도계 (Molecular Device, 미국)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 도 7에 나타내었다. 이때, 대조군으로는 아바스틴 항체를 이용하여 동일한 방식으로 흡광도를 측정하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이 , 클론 F(a)를 인간화한 HF 클론 (b)의 결합력이 친화도 개선과정을 거치면서 증가함을 확인할 수 있다. 이 대부분의 HF 클론들 (HF2-1 내지 HF2-26)이 아바스틴보다 VEGF에 대한 결합력이 높음을 확인할 수 있다. 한편， 상기와 동일한 방식으로 마우스 VEGF에 대한 항체의 결합력을
ELISA를 통해 확인하였다. 그 결과， 도 8에 나타낸 바와 같이， 본 발명의 항체 HF2-1, HF2-5, HF2-8및 HF2— 9는 아바스틴과 달리 인간 VEGF뿐만 아니라 마우스 VEGF에도 결합하며， 이는 본 발명의 항체가 마우스를 이용한 전임상 연구에 적합함을 보여준다. 실시예 11. 본 발명의 항체의 VEGF에 의한 HUVEC 증식 억제 활성 확인 본 발명의 항체의 VEGF에 의한 인간 제대정맥 내피세포의 증식 억제 활성을 확인하였다.
인간 제대정맥 내피세포 (HUVEC, Clonetics, 미국)를 원심 분리하여 펠렛을 얻은 후， 성장인자와 우혈청이 배제된 EBM-2 기본배지 (clonetics, 미국)를 이용하여 현탁하였다. 96웰 세포 배양 플레이트에 웰당 동일한 수의 세포 현탁액을 넣고， 정온 습식 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양이 끝나면 배지를 버리고，순차적 농도 (30 ng/ml, 60 ng/ml, 100 ng/ml, 150 ng/ml , 200 ng/ml 300 ng/ml, 1000 ng/ml , 및 3000 ng/mL)로 희석한 항체와 30~90ng/mL의 일정 농도로 회석한 인간 VEGF를 흔합한 용액을 처리하였다. 항체와 항원을 처리한 세포를 정은 습식 배양기에서 4일 간 배양시킨 후， 웰당 10 uL의 라자주린 용액 (invitrogen, 미국)을 처리하고 3~4시간 후， 530 nm/590 nm에서 형광을 측정하였다. 이때， 대조군으로는 아바스틴을 이용하였으며， VEGF만 처리한 웰의 형광값을 기준으로 항체에 의한 세포 증식 억제 효과를 수치화하였다. HF-1, HF-4, HF-5 및 HF-8 항체 처리시 HUVEC 증식율 결과를 도 9의 (b)에 나타내었으며, HF-1 내지 HF-5, HF-9 및 HF— 11 항체 처리시의 세포 생존율 결과를 도 9의 (c) 및 (d)에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이， 본 발명의 HF2-5 항체는 VEGF에 의해 촉진된 인간 제대정맥 내피세포 증식을 아바스틴과 유사한 정도로 억제시켰다 (도 9의 (b) 및 (d)). 또한 H클론의 인간화 (a) 및 친화도 개선 (b, c, d)을 통해， 항체의 활성이 증가함을 확인할 수 있다. 실시예 12. 본 발명의 항체의 VEGF에 의한 HUVEC투과능 억제 활성 확인
VEGF에 의한 인간 제대정맥 내피세포 (Clonetics, 미국)의 투과능
(permeability)에 대한 본 발명의 항체의 억제 활성을 확인하였다.
시험 하루 전， 0.4 uM 미세다공의 막으로 구성된 트랜스웰에 콜라겐 용액 (Sigma, 미국)을 처리하여 세포의 부착을 촉진하였다. 트립신을 이용하여 세포를 회수한 후， 5 X 104 cens/mL의 농도로 현탁하였다. 트랜스웰의 콜라겐 용액을 버리고， 완충용액으로 1회 세척 후， 웰당 100 uL의 세포 현탁액을 분주하고， 바닥 챔버에는 우혈청과 성장인자가 포함된 EGM-2 배지 (clonetics, USA) 600 iiL를 분주하였다. 내피세포 단일층이 형성되면 농도별로 희석한 항체 (HF2-5, HF2-9 및 HF2-11, 및 아바스틴 (대조군) 각각 lx및 10x)와 30내지 90 ng/mL의 농도로 희석한 인간 VEGF를 흔합한 용액을 트랜스웰에 100 UL, 바닥 챔버에 600 uL씩 처리한 후， 배양기에서 밤새 반응시켰다. 반웅이 끝나면 트랜스웰의 시료를 버리고 덱스트란 -FTTC 용액을 100 yL 처리하여 1시간이 지난 후 트랜스웰을 투과한 덱스트란을 490 nm/520 nm에서 형광 측정하였다. 이때 대조군으로는 VEGF와 항체를 포함하지 않는 EBM 배지를 사용하였다.
도 10에 나타난 바와 같이， VEGF에 의해 증가한 내피세포의 투과능이 본 발명의 항체에 의해 농도 의존적으로 억제되었으며 (a), 이는 양성 대조군인 아바스틴 (b)과 유사하였다. 실시예 13. 본 발명의 항체의 VEGF에 의한 HUVEC유동성 억제 활성 확인
VEGF에 의한 인간 제대정맥 내피세포 (Clonetics, 미국)의 유동성에 대한 본 발명의 항체 중 HF2-4 및 HF2-8의 억제 활성을 확인하였다.
내피세포의 유동성을 정량적으로 확인하기 위해， 3 uM미소다공의 막으로 구성된 트랜스웰을 이용하여 보이던 챔버 시험을 진행하였다. VEGF의 반웅성을 높이기 위하여 시험 전，플라스크에 배양 중인 세포는 0.1%BSA가 포함된 EBM-2 기본 배지로 4시간 이상 고갈시켰다. 위쪽 챔버에 웰당 50,000개의 세포가 들어가도록 세포 현탁액 100 uL을 넣고， 바닥 챔버에는 기본 배지로 회석한 3 ng/mL의 VEGF, 및 9ng/mL, 90 ng/mL농도의 항체 (HF2-4및 HF2-8)가 흔합된 용액
600 uL을 첨가하였다.
24시간 배양 후， VEGF의 농도 구배에 따라 세포가 트랜스웰의 반대편으로 이동하게 되면， 트립신을 이용하여 트랜스웰 반대쪽 막에 부착된 세포를 탈착하였다. 탈착된 세포는 원심분리하여 회수한 뒤， 라이시스 버퍼 (Invitrogen, 미국)로 분해하였다. 이후 분해된 세포에 포함된 DNA를 DNA 염색 다이 (invitrogen,미국)로 염색한 후， 480nm/520nm로 형광을 측정하여 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에서 나타낸 바와 같이， 내피세포의 유동성은 인간 VEGF에 의해 촉진되며， 이러한 유동성의 증가는 항체 HF2-4및 HF2-에 의해 농도 의존적으로 억제됨을 알 수 있다. 실시예 14: 본 발명의 항체의 종양성장 억제 활성 확인 인간의 암세포를 이식하여 종양이 형성된 누드마우스에 본 발명의 항체를 투여하여 종양 억제 활성을 평가하였다.
구체적으로， 10% FBS 및 1% 페니실린 스트렙토마이신이 포함된 McCoy' s 5A 배지에서 배양한 HT-29세포 (인간 대장암 세포주 HTB-38, ATCC) 2~5xl06개를 BALB/c 누드 마우스 (오리엔트바이오)의 피하 내로 주입하였다. 상기 마우스들에서 종양 부피의 평균이 약 200~300 mm3정도로 충분히 자란 상태에서， 분리된 군에 따라 항체 HF2— 1， HF2-5, HF2-9및 HF2ᅳ 11을 각각 투여하였다.항체 투여는 3 mg/kg 또는 10 mg/kg의 용량으로， 주 2회 복강내 주사하였으며， 시점별 (7일， 14일， 21일， 28일 및 35일)로 종양의 부피 (mm3)를 측정하였다. 음성 대조군으로는 완층 용액 (PBS)을 이용하였으며， 양성 대조군으로는 아바스틴을 투여하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타난 바와 같이， 항체를 투여한 마우스에서는 대조군들에 비해 종양 성장이 억제되었으며, 특히 항체 투여군의 종양 성장 억제 효과가 아바스틴 투여군에 비해 월등히 우수함을 알 수 있었다. 실시예 15: 본 발명의 항체의 망막신생혈관 형성 억제활성 확인 본 발명에 따른 항체의 망막 신생혈관형성 억제 활성을 확인하기 위하여 다음과 같이 실험하였다.
먼저, 망막의 신생혈관형성을 유도하기 위해， 시험 0일에 포토코아글레이터 (viridis laser, Quant el , France)를 이용하여 150 및 530 nm의 레이저를 마우스의 오른쪽 안구에 0.1초 동안 투사하였다. 투사 후 병변은 0.1 uM가 되게 하였다. 시험 0일과 7일째에 항체 (HF2-4 및 HF2-11)를 각각 1 ug 및 5 ug의 양으로 오른쪽 안구에 안구 내 투여하고， 안저의 신생혈관형성 정도를 평가하기 위해 시험 7일 및 14일째에 형광 안저 혈관조영검사 (fluorescein angiography)를 실시하였다. 이때, 음성 대조군 (vehicle)으로는 PBS를 사용하였고, 양성 대조군 (Ref. drug)으로는 아플리버셉트 (aflibercept, 바이엘 헬스케어)를 사용하였다. 형광 안저 혈관조영 검사 점수는 던넷 다중 비교 시험 (dunnett's multiple comparison test)으로 분석하였으며， 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타난 것처럼, 본 발명의 항체 투여군에서 음성 대조군 대비 우수한 맥락막의 신생혈관 형성 억제 효과를 나타내었으며， 시판중인 대조약물과 비교하여 동등이상의 효과를 보였다. 본 발명을 상기의 구체적인 실시예와 관련하여 기술하였지만, 첨부된 특허청구범위에 의해 정의된 본 발명의 범위 내에서 당 분야의 숙련자는 본 발명을 다양하게 변형 및 변화시킬 수 있다.

Claims

Figure imgf000042_0001
특허청구의 범위
1)상보성 결정영역 (CDR , CDR2및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역에서， 상기 CDR2 가 서열번호 1 의 아미노산 서열로 표시되고, 상기 CDR3 이 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역 ; 및
2) CDR1, CDR2 및 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역에서， 상기 CDR3 이 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역
을 포함하는， 혈관내피세포 성장인자 (vascular endothelial growth factor VEGF)에 결합하는 항체 .
2. 제 1 항에 있어서，
상기 항체가
1) 서열번호 4 내지 14 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 CDR1;
서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및
서열번호 2 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 을 포함하는 경쇄 가변영역; 및
2) 서열번호 15 내지 34 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 CDR1;
서열번호 35 내지 50 으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및
서열번호 3 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는， VEGF에 결합하는 항체 .
3. 제 1 항에 있어서，
상기 항체가，
1) 서열번호 54 내지 65 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역; 및
2) 서열번호 78 내지 104 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는， VEGF에 결합하는 항체 . WO 2014/193191 PCT7™i4/OO485800485g
4. 제 2 항에 있어서，
1) 서열번호 4 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 15 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 35 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는， VEGF에 결합하는 항체 .
5. 제 2 항에 있어서,
1) 서열번호 5 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 16 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 36 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는， VEGF에 결합하는 항체.
6. 제 2 항에 있어서,
1) 서열번호 5 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 17 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 37 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는， VEGF에 결합하는 항체 .
7. 제 2 항에 있어서，
1) 서열번호 5 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 18 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 38 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는， VEGF에 결합하는 항체 .
8. 제 2 항에 있어서 ,
1) 서열번호 5 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 19 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 39 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는， VEGF에 결합하는 항체 .
9. 제 2 항에 있어서，
1) 서열번호 5 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 20 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 40 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는， VEGF에 결합하는 항체 .
10. 제 2 항에 있어서
1) 서열번호 6 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 21 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 38 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는， VEGF에 결합하는 항체 .
11. 제 2 항에 있어서，
1) 서열번호 6 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 22 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 38 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는， VEGF에 결합하는 항체 .
12. 제 2 항에 있어서，
1) 서열번호 7 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 23 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 41 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는， VEGF에 결합하는 항체 .
13. 제 2 항에 있어서，
1) 서열번호 6 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 24 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 38 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는, VEGF에 결합하는 항체 .
14. 제 2 항에 있어서，
1) 서열번호 6 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 25 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 38 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는， VEGF에 결합하는 항체 .
15. 제 2 항에 있어서, 1) 서열번호 8 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 26 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 42 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는， VEGF에 결합하는 항체 .
16. 제 2 항에 있어서 '
1) 서열번호 6 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 27 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 38 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는， VEGF에 결합하는 항체 .
17. 제 2 항에 있어서，
1) 서열번호 9 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 28 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 43 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는， VEGF에 결합하는 항체 .
18. 제 2 항에 있어서，
1) 서열번호 5 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 29 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 44 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는, VEGF에 결합하는 항체 . 제 2 항에 있어서，
1) 서열번호 10 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 30 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 45 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는， VEGF에 결합하는 항체 . 제 2 항에 있어서, .
1) 서열번호 11 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 31 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 42 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는， VEGF에 결합하는 항체 . 제 2 항에 있어서，
1) 서열번호 11 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 20 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 39 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는， VEGF에 결합하는 항체 . 제 2 항에 있어서，
1) 서열번호 11 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 32 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 46 의 아미노산 서열로 WO 2014/193191 PCT/KR2 14/004858J 4g5g
표시되는 CDR2; 및 서열번호 3 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는， VEGF에 결합하는 항체 .
23. 제 2 항에 있어서，
1) 서열번호 5 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 33 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 45 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는， VEGF에 결합하는 항체 .
24. 제 2 항에 있어서，
1) 서열번호 5 ^ 아미노살 서¾론 표신 늘 CDRl^ 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 34 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 47 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 를 포함하는 증쇄 가변영역을 포함하는 , VEGF에 결합하는 항체 .
25. 제 2 항에 있어서，
1) 서열번호 6 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 25 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 48 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 를 포함하는 증쇄 가변영역을 포함하는, VEGF에 결합하는 항체 .
26. 제 2 항에 있어서，
1) 서열번호 12 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 31 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 38 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는， VEGF에 결합하는 항체 . 제 2 항에 있어서，
1) 서열번호 9 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 31 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 46 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는, VEGF에 결합하는 항체 . 제 2 항에 있어서，
1) 서열번호 10 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 17 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 42 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는， VEGF에 결합하는 항체 . 제 2 항에 있어서，
1) 서열번호 13 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 34 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 49 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는， VEGF에 결합하는 항체 . 제 2 항에 있어서 1) 서열번호 14 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 1 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 2 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 2) 서열번호 17 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1; 서열번호 50 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 3 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는， VEGF에 결합하는 항체 .
31. 제 1 항에 있어서，
상기 항체가 인간 또는 인간화 항체인 것을 특징으로 하는， VEGF 에 결합하는 항체 .
32. 제 1 항에 있어서，
상기 항체가 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgD, IgE, IgM, 또는 이의 조합 또는 변이체인 것을 특징으로 하는， VEGF에 결합하는 항체 .
33. 제 32 항에 있어서，
상기 항체가 Fab, Fab' ， F(ab' )2, Fv, dAb, scFV, 또는 상기 항체의 CDR 을 VEGF 와의 결합에 주요 부위로 하는 스캐폴드 접합체 (scaffold conjugate) 형태인 것을 특징으로 하는, VEGF에 결합하는 항체 .
34. 서열번호 1 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2; 및 서열번호 2 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 을 포함하는 VEGF 에 결합하는 항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 DNA.
35. 제 34 항에 있어서，
상기 DNA 가 서열번호 1 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 를 코딩하는 서열번호 51 의 염기서열; 및 서열번호 2 의 아미노산 서열로 표시되는
CDR3 를 코딩하는 서열번호 52 의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA. WO 2014/193191 PCT/KR2014/004858 ΑΆ ^,
36. 서열번호 3 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 을 포함하는 VEGF 에
결합하는 항체의 중쇄 가변영역을 코딩하는 DNA.
37. 제 36항에 있어서，
상기 DNA 가서열번호 3 의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 을 코딩하는 서열번호 53의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA.
38. 제 34 항의 DNA를 포함하는， VEGF에 결합하는 항체의 경쇄 가변 영역을
발현시키는 발현백터.
39. 제 36 항의 DNA를 포함하는, VEGF에 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역을
발현시키는 발현백터.
40. 제 38 항의 발현백터 및 제 39 항의 발현백터로 형질 전환된 동물
세포주.
41. 제 40 항에 있어서，
상기 동물 세포주가 CH0 세포， HEK 세포 또는 NS0 세포인 것을 특징으로 하는 동물 세포주.
42. 제 1 항에 따른 항체를 포함하는， VEGF 과발현에 의해 야기되는 암 또는
신생혈관형성 관련 질환의 예방， 진단 또는 치료용 약학 조성물.
43. 제 42 항에 있어서，
상기 VEGF 과발현에 의해 야기되는 암 또는 신생혈관형성 관련 질환이 대장암， 췌장암, 신장암， 폐암， 유방암， 난소암 및 뇌암으로 이루어진 군에서 선택되는 암; 및 황반변성 질환， 당뇨병성 망막증 및 허혈성 망막증으로 이루어진 군에서 선택되는 안구 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물. WO 2014/193191 PCT/KR2014/004858n 0 c o
r\ju an ώυι¾. I υ U 4 o o o
44. 제 42 항에 있어서，
상기 약학 조성물이 알킬화제， 대사길항물질, 풀산 동족체, 피리미딘 동족체， 퓨린 동족체 및 관련 억제제, 빈카 알칼로이드, 에피포도필로톡신，항생제， L-아스파라기나제，토포아이소머라제 억제제， 인터페론， 백금 배위 착물, 안트라센디온 치환된 우레아, 메틸 히드라진 유도체， 부신 피질 억제제， 아드레노코르티코스테로이드， 프로게스틴, 에스트로겐， 안티에스트로겐， 안드로겐， 안티안드로겐 및 고나도트로핀 -방출 호르몬 동족체로 이루어진 군에 선택되는 화학 치료제와 병용하여 사용되는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
45. 제 42 항에 있어서,
상기 약학 조성물이 플루오로피리미딘계 약물， 파클리탁셀， 플라티늄계 약물, 인터페론알파 -2a, 카보플라틴, 독소루비신 (doxorubicin), 시스플라틴 (cisplatin), 젬시타빈 (gemcitabine) , 5ᅳ플루오로우라실， 류코보린， 이리노테칸， 옥살라플라틴， 카페시타빈， 도세탁셀 및 이의 흔합물로 이루어진 군에서 선택되는 약물과 병용하여 사용되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
46. 제 1 항에 따른 VEGF 에 결합하는 항체를 포함하는, VEGF 과발현에 의해
야기되는 암 또는 신생혈관형성 관련 질환의 진단용 키트.
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RU2015156461A RU2644245C2 (ru) 2013-05-31 2014-05-30 Анти-vegf-антитело и содержащая его фармацевтическая композиция для предупреждения, диагностики или лечения рака или связанного с ангиогенезом заболевания
EP14803672.6A EP3006465A4 (en) 2013-05-31 2014-05-30 Anti-vegf antibody, and pharmaceutical composition for preventing, diagnosing or treating cancer or angiogenesis-related diseases, containing same
JP2016516455A JP6328231B2 (ja) 2013-05-31 2014-05-30 抗ｖｅｇｆ抗体およびそれを含む癌または血管新生関連疾患を予防、診断、または治療するための医薬組成物
NZ71517714A NZ715177A (en) 2013-05-31 2014-05-30 Anti-vegf antibody, and pharmaceutical composition for preventing, diagnosing or treating cancer or angiogenesis-related diseases, containing same

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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017119435A1 (ja) * 2016-01-06 2017-07-13 株式会社オーダーメードメディカルリサーチ 高親和性抗ｖｅｇｆ抗体
US11008387B2 (en) 2016-01-06 2021-05-18 Order-Made Medical Research Inc. Antibody inhibiting binding of VEGF to NRP1
US11820816B2 (en) 2017-12-29 2023-11-21 Hoffman-La Roche Inc. Anti-VEGF antibodies and methods of use

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110003328B (zh) * 2018-01-05 2022-04-19 百奥泰生物制药股份有限公司 一种长效低毒的重组抗vegf人源化单克隆抗体及其生产方法
JP2022514362A (ja) * 2018-12-21 2022-02-10 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 抗ｖｅｇｆ抗体のｖｅｇｆ－ｒ１への結合阻害を改善する方法
KR102377008B1 (ko) 2019-07-01 2022-03-21 서울대학교산학협력단 Mct 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 관련 안과 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
EP4031696A4 (en) * 2019-09-20 2023-02-22 Navi Bio-Therapeutics, Inc. PERSONALIZED CANCER IMMUNOTHERAPY
WO2021072265A1 (en) 2019-10-10 2021-04-15 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder
US20220390456A1 (en) * 2019-10-17 2022-12-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Small extracellular vesicle-associated vegf as a predictor for therapeutic responses
KR20220029524A (ko) * 2020-08-31 2022-03-08 (주)메디톡스 항-ｖｅｇｆ 육량체 항체, 및 이를 포함하는 조성물

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US25085A (en) 1859-08-16 Improvement in steam-generators
WO2000064946A2 (en) * 1999-04-28 2000-11-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for cancer treatment by selectively inhibiting vegf
KR20080003453A (ko) * 1997-04-07 2008-01-07 제넨테크, 인크. 항-ｖｅｇｆ 항체
US8394943B2 (en) * 2007-11-09 2013-03-12 Affitech Research As Anti-VEGF antibody compositions and methods
KR20130031136A (ko) * 2011-09-20 2013-03-28 가톨릭대학교 산학협력단 항-ｖｅｇｆ 항체를 포함하는 자가면역질환 예방 및 치료용 조성물

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ621449A (en) * 2003-05-30 2015-07-31 Genentech Inc Treatment with anti-vegf antibodies
US20050106667A1 (en) 2003-08-01 2005-05-19 Genentech, Inc Binding polypeptides with restricted diversity sequences
TWI580694B (zh) * 2007-11-30 2017-05-01 建南德克公司 抗-ｖｅｇｆ抗體
CA3020290A1 (en) * 2008-06-25 2009-12-30 Esbatech, An Alcon Biomedical Research Unit Llc Stable and soluble antibodies inhibiting vegf
US20100183620A1 (en) * 2008-11-26 2010-07-22 Kaumudi Bhawe Compositions and methods for regulating collagen and smooth muscle actin expression by serpine2
EP2579895A4 (en) * 2010-06-14 2013-12-18 Vaccinex Inc ANTI-VEGF ANTIBODIES AND USES THEREOF
US20120225081A1 (en) * 2010-09-03 2012-09-06 Boehringer Ingelheim International Gmbh Vegf-binding molecules
CN102286101B (zh) 2011-08-08 2013-05-08 常州亚当生物技术有限公司 抗VEGF单克隆抗体Fab片段Vasculizumab及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US25085A (en) 1859-08-16 Improvement in steam-generators
KR20080003453A (ko) * 1997-04-07 2008-01-07 제넨테크, 인크. 항-ｖｅｇｆ 항체
WO2000064946A2 (en) * 1999-04-28 2000-11-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for cancer treatment by selectively inhibiting vegf
US8394943B2 (en) * 2007-11-09 2013-03-12 Affitech Research As Anti-VEGF antibody compositions and methods
KR20130031136A (ko) * 2011-09-20 2013-03-28 가톨릭대학교 산학협력단 항-ｖｅｇｆ 항체를 포함하는 자가면역질환 예방 및 치료용 조성물

Non-Patent Citations (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ADAMIS ET AL., ARCH OPHTALMOL., vol. 114, 1996, pages 66 - 71
BENDING, METHODS: COMP. METH. ENZY., vol. 8, 1995, pages 83 - 93
BERKMAN ET AL., J CLIN INVEST., vol. 91, 1993, pages 153 - 159
BORGSTROEM ET AL., CANCER RES., vol. 56, 1996, pages 4032 - 4039
BREKKEN ET AL.: "Selective inhibition of vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor 2 (KDR/Flk-1) activity by a monoclonal anti-VEGF antibody blocks tumor growth in mice", CANCER RESEARCH, vol. 60, no. 18, 15 September 2000 (2000-09-15), pages 5117 - 5124, XP002340113 *
CLAPP ET AL., ENDOCRINOLOGY, vol. 133, 1993, pages 1292 - 1299
DEVRIES ET AL., SCIENCE, vol. 255, 1992, pages 989
FERRARA.N ET AL., NAT REV. CANCER, vol. 2, 2002, pages 795 - 803
FOLKMAN, J ET AL., J BIOL CHEM., vol. 267, 1992, pages 10931 - 10934
H. ZENG ET AL., J BIOL CHEM, vol. 276, 2001, pages 26969 - 26976
HOUCK ET AL., MOL. ENDOCRIN., vol. 5, 1991, pages 1806
KARSAN A., INT J MOL MED., vol. 5, no. 5, 2000, pages 447 - 56
KIM ET AL., NATURE, vol. 362, 1993, pages 841 - 844
LEUNG ET AL., SCIENCE, vol. 246, 1989, pages 1306
MATTHEWS ET AL., PROC. NAT. ACAD. SCI., vol. 88, 1991, pages 9026
MELNYK ET AL., CANCER RES, vol. 56, 1996, pages 921 - 924
NISHIBORI ET AL., MOLECULAR IMMUNOLOGY, 2006, pages 43
See also references of EP3006465A4
SHIBUYA ET AL., ONCOGENE, vol. 5, 1990, pages 519
TAKAHASHI N. ET AL., CELL, vol. 29, 1982, pages 671 - 679
TERMAN ET AL., ONCOGENE, vol. 6, 1991, pages 1677
U RUTISHAUSER ET AL., PNAS, vol. 61, no. 4, 1968, pages 1414 - 1421
WARREN ET AL., J CLIN INVEST., vol. 95, 1995, pages 1789 - 1797
ZACHARY IC ET AL., MOL. BIOL. CELL.,, vol. 22, no. 15, 2011, pages 2766 - 76

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017119435A1 (ja) * 2016-01-06 2017-07-13 株式会社オーダーメードメディカルリサーチ 高親和性抗ｖｅｇｆ抗体
CN108699141A (zh) * 2016-01-06 2018-10-23 定制药品研究株式会社 高亲和性抗vegf抗体
JPWO2017119435A1 (ja) * 2016-01-06 2018-10-25 株式会社オーダーメードメディカルリサーチ 高親和性抗ｖｅｇｆ抗体
KR20180132038A (ko) * 2016-01-06 2018-12-11 오더-메이드 메디컬 리서치 인코포레이티드 고친화성 항vegf 항체
US11007259B2 (en) 2016-01-06 2021-05-18 Order-Made Medical Research Inc. High-affinity anti-VEGF antibody
US11008387B2 (en) 2016-01-06 2021-05-18 Order-Made Medical Research Inc. Antibody inhibiting binding of VEGF to NRP1
KR102293755B1 (ko) 2016-01-06 2021-08-24 오더-메이드 메디컬 리서치 인코포레이티드 고친화성 항vegf 항체
JP2021169475A (ja) * 2016-01-06 2021-10-28 株式会社オーダーメードメディカルリサーチ 高親和性抗ｖｅｇｆ抗体
CN108699141B (zh) * 2016-01-06 2022-06-17 定制药品研究株式会社 高亲和性抗vegf抗体
JP7273110B2 (ja) 2016-01-06 2023-05-12 株式会社オーダーメードメディカルリサーチ 高親和性抗ｖｅｇｆ抗体
US11872271B2 (en) 2016-01-06 2024-01-16 Order-Made Medical Research Inc. High-affinity anti-VEGF antibody KLHa505
US11820816B2 (en) 2017-12-29 2023-11-21 Hoffman-La Roche Inc. Anti-VEGF antibodies and methods of use

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