JP6328231B2 - 抗vegf抗体およびそれを含む癌または血管新生関連疾患を予防、診断、または治療するための医薬組成物 - Google Patents
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Description
本発明の別の目的は、上記抗体を含む医薬組成物を提供することがである。
1)相補性決定領域(CDR)1、CDR2、およびCDR3を含む軽鎖可変領域、ここで、CDR2は配列番号1のアミノ酸配列で示され、CDR3は配列番号2のアミノ酸配列で示される;および
2) CDR1、CDR2、およびCDR3を含む重鎖可変領域、ここで、CDR3は配列番号3のアミノ酸配列で示される。
本発明は、以下のものを含むVEGFと結合する抗体(以後、「抗VEGF抗体」という)を提供する:1)CDR1、CDR2、およびCDR3を含む軽鎖可変領域、ここで、CDR2は配列番号1のアミノ酸配列で示され、CDR3は配列番号2のアミノ酸配列で示される;および2) CDR1、CDR2、およびCDR3を含む重鎖可変領域、ここで、CDR3は配列番号3のアミノ酸配列で示される。
本発明の抗体は、免疫グロブリンIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、またはIgMを含むことがあり、VEGF、またはその組み合わせまたは変異体と結合する抗体でありうる。
本発明の抗体の軽および重鎖の可変領域のアミノ酸配列と対応する塩基配列のリストを下記表2に示す。
配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2をコードするDNAは、配列番号51の塩基配列で示すことができ、配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3をコードするDNAは配列番号52の塩基配列で示すことができる。
好ましくは、VEGFと結合する抗体の重鎖可変領域を発現する、配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3をコードする塩基配列を含む発現ベクターを提供する。
本発明において、「VEGF」は、165アミノ酸のヒト血管内皮成長因子および関連121- 189-、および206アミノ酸の血管内皮成長因子、ならびに対立形質形または修飾形の天然ヒト血管内皮成長因子を表す([Leung et al.、Science.、246:1306(1989);およびHouck et al.、Mol. Endocrin.、5:1806(1991)]参照)。
VEGFと特異的に結合する抗体を選択するために、抗体ライブラリーを免疫動物から構築した。該ライブラリーを、抗原で免疫した動物の免疫細胞からmRNAを得、抗体遺伝子用のプライマーの組み合わせを用いるPCRにより抗体遺伝子を増幅し、ファージディスプレイ用のベクター中に該遺伝子をクローニングすることにより構築した。
(2-1)免疫抗体遺伝子の増幅
ニワトリ抗体の重よび軽鎖の可変領域(VHおよびVLドメイン)を増幅するためPCR反応を以下のごとく行った。
PCR反応を、鋳型として実施例1で調製したcDNA、ならびにVHおよびVL、およびVHおよびVLを結合する一本鎖Fv(scFv)用に設計した表3のプライマー混合物を用いて行った。各0.5μLのVHおよびVLのcDNAライブラリー、30pモルのフォワードプライマー、30pモルのリバースプライマー、10xPCR緩衝液、200μM dNTPs、および0.5μLのTaq DNAポリメラーゼを混合し、終量を50μLとした。混合物を94℃で5分間反応させ、次いで94℃で15秒間、56℃で30秒間、および72℃で90秒間を30サイクル反復して反応させた。
scFv DNAを得るため、各50ngの精製VHおよびVL DNAを鋳型として用い、これを30pmoleのフォワードプライマーおよび30pmoleのリバースプライマー(表3)、10x PCR緩衝液、200μM dNTPs、および0.5μLのTaq DNAポリメラーゼと混合し終量を50μLとした。該混合物を94℃で5分間、次いで94℃で30秒間、56℃で30秒間、および72℃で2分間を20サイクルのPCR反応にかけた。PCR増幅した抗体DNAを1%アガロースゲルを用いる電気泳動にかけて各該増幅DNAを大きさに従って分離し、次いでゲル抽出キット(Qiagen、USA)を用いて精製した。
上記で作製したscFvおよびファージミッドベクター、pComb3X(the Scripps Research Institute、CA、USA)を制限酵素SfiI(Roche、USA)で開裂した。
10μgのscFvをコードするPCR断片、360単位のSfiI(Roche、USA)、および20μgの10x緩衝液を混合して終量200μLとし、50℃で一夜反応した。
さらに、20μgのpComb3Xベクター、120単位のSfiI、および20μLの10x緩衝液を混合して終量200μLとし、50℃で一夜反応した。制限酵素開裂により得た断片を電気泳動にかけ、次いでゲル抽出キット(Qiagen、USA)を用いて精製した。
scFv断片をpComb3Xベクターに挿入するために、700ngの(2-2)でSfiIを用いて開裂したscFvをコードするPCR断片および1.4μgのpComb3Xを混合した。T4 DNAリガーゼ(Invitrogen、USA)を添加後、該混合物を16℃で一夜反応させた。結合混合物をエタノール沈殿で精製した。次に、E.coli ER2738(New England Biolab、USA)をエレクトロポーレーションにより該混合物で形質転換し、46μg/mLカルベニシリンおよび70μg/mLカナマイシンの存在下で培養して1.5x109の複雑さのライブラリーを作製した。
実施例2で得られたscFv形のランダム化した重鎖と軽鎖を含むライブラリーから、ヒトおよびマウスVEGFの両方と結合する抗体を固体固定化VEGFを用いて選んだ。
最初に、各10ugのヒトVEGF(R&D systems、USA)およびマウスVEGF(R&D systems、USA)を磁気ビーズと結合した。
実施例3-1で選んだヒトおよびマウスVEGF両方に陽性シグナルを示すクローンを含むER2738をSB培養液中で一夜培養し、次いで遠心分離してE.coliを得た。DNA mini-prepキット(GeneAll、Korea)を用いてプラスミドDNAを得、その塩基配列を分析した。表4に示すシーケンシングプライマー(配列番号138および139)を用いて塩基配列を決定した。選んだクローンを「クローンF」と名付けた。クローンF抗体の詳細な塩基配列情報を表1に示す。
動物を免疫した抗体ライブラリーから得られた抗体クローンFのフレームワークをヒト抗体のフレームワークに変換したが、抗原結合に重要ないくつかの残基は変更しなかった(Nishibori et al.、Molecular Immunology、43(2006))。
得られた上記抗体の親和性測定と活性分析のためにscFvまたは免疫グロブリン(IgG)タンパク質を作製した。
scFvタンパク質を作製するためE.coli HB2151を選んだクローンのDNAを含むpComb3Xプラスミドで形質転換し、次いで発現したscFvを精製した。
ELISAプレートをそれぞれ0.2μg/mlのヒトVEGFおよびマウスVEGF(R&D systems、USA)でコートし、HB2151が発現するscFvまたは293F細胞が発現するIgGの形の実施例5で得られた精製タンパク質を連続希釈濃度でインキュベーションした。結果として、実施例3-2で得られたクローンFおよび親和性改善により得られたその変異体は、濃度依存性にヒトおよびマウスVEGFと良好な結合を示した。
VEGFとVEGFレセプターKDR(以後、VEGFR2)またはVEGFレセプターFlt-1(以後、VEGFR1)との結合に対する本発明の選んだ抗体(HF2-1、HF2-5、HF2-9、およびHF2-11)の阻害効果を確認するため、以下のごとく実験を行った。
本発明の選んだ抗体 HF2-1、HF2-5、HF2-9、およびHF2-11とヒトVEGF-A(hVEGF-A)、マウスVEGF-A(mVEGF-A)、ヒトVEGF-B(hVEGF-B)、ヒトVEGF-C(hVEGF-C)、ヒトVEGF-D(hVEGF-D)、およびヒト胎盤成長因子(PlGF)との結合特異性を測定するための実験を以下のごとく行った。
本発明の抗体の物理化学特性を分析した。
NuPAGE 4〜12%ビス-トリスゲル(Invitrogen Co.)を用いるジスルフィド結合を除去するためにDTT存在下の還元条件下およびDTT処理なしの非還元条件下のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)分析で全抗体の軽および重鎖の存在を確認した。HF2-11の分子量測定結果を典型例として図4に示す。
本発明の抗体(HF2-1〜HF2-26)のヒト血管内皮成長因子(VEGF)に対する結合特性をELISA法を用いて確認した。
本発明の抗体のVEGF誘導HUVEC増殖の抑制活性を確認した。
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC、Clonetics、USA)を遠心分離してペレットを得、次いで増殖因子とウシ血清を除いたEBM-2基礎培地(Clonetics、USA)に浮遊させた。細胞浮遊液を同数の細胞/ウェルで96ウェル細胞培養プレートに分注し、一定温度の加湿インキュベーター中で24時間インキュベーションした。インキュベーションを完結した後、培地を捨て、ウェルを連続濃度(30ng/mL、60ng/mL、100ng/mL、150ng/mL、200ng/mL、300ng/mL、1000ng/mL、および3000ng/mL)に希釈した各抗体と30〜90ng/mLの一定濃度に希釈したヒトVEGFの混合溶液で処理した。該抗原および抗体で処理した該細胞を一定温度の加湿インキュベーター中で4日間培養し、次いで10μL/ウェルのレサズリン溶液(Invitrogen、USA)で処理した。3〜4時間後、蛍光を530nm/590nmで測定した。Avastin(登録商標)をコントロールとして用い、抗体の細胞増殖に対する抑制効果を、VEGFのみで処理したウェルの蛍光値に対して定量した。抗体 HF-1、HF-4、HF-5、およびHF-8で処理したHUVEC増殖率の結果を図9(b)に示し、抗体HF-1〜HF-5、HF-9、およびHF-11で処理した時の細胞生存率の結果を図9(c)および(d)に示す。
本発明の抗体のHUVEC(Clonetics、USA)のVEGF誘導透過性に対する抑制活性を評価した。
試験1日前に、0.4μm微細孔膜を有するTranswellを細胞の付着を促進するためコラーゲン溶液(Sigma、USA)で処理した。細胞をトリプシンを用いて回収し、5x104細胞/mLの濃度で浮遊させた。Transwell中のコラーゲン溶液を捨て、Transwellを緩衝溶液で1回洗浄した。100ulの細胞浮遊液を各ウェルに分注した。600μLの容量のEGM-2培地(Clonetics、USA)をボトムチャンバーに加えた。単層の内皮細胞を形成した後、希釈抗体(HF2-5、HF2-9、HF2-11、またはAvastin(登録商標)(コントロール)、各1xまたは10x)および30〜90ng/mLに希釈したヒトVEGFを含む混合溶液を各100μLおよび600μLの容量でTranswellおよびボトムチャンバーに加え、インキュベーター中で一夜反応させた。反応が完結した後、Transwell中の溶液を除去し、Transwellを100μLのデキストラン-FITC溶液で処理した。1時間後、蛍光を490nm/520nmで測定し、Transwellを横切って通過したデキストランを検出した。VEGFを含まないEBM培地をコントロールとして用いた。
HUVEC(Clonetics、USA)のVEGF誘導遊走特性に対する本発明の抗体HF2-4およびHF2-8の抑制活性を評価した。
腫瘍増殖に対する該抗体の抑制活性を評価するため、本発明の抗体を、ヒト癌細胞を移植して腫瘍を形成したヌードマウスに注射した。
網膜血管新生に対する本発明抗体の抑制活性を確認するため、以下のごとく実験を行った。
Claims (18)
- 血管内皮成長因子(VEGF)と結合する抗体であって、
(i)1)配列番号5のアミノ酸配列で示されるCDR1;配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2;および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域;および2)配列番号16のアミノ酸配列で示されるCDR1;配列番号36のアミノ酸配列で示されるCDR2;および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体、
(ii)1)配列番号5のアミノ酸配列で示されるCDR1;配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2;および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域;および2)配列番号17のアミノ酸配列で示されるCDR1;配列番号37のアミノ酸配列で示されるCDR2;および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体、
(iii)1)配列番号5のアミノ酸配列で示されるCDR1;配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2;および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域;および2)配列番号18のアミノ酸配列で示されるCDR1;配列番号38のアミノ酸配列で示されるCDR2;および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体、
(iv)1)配列番号5のアミノ酸配列で示されるCDR1;配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2;および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域;および2)配列番号19のアミノ酸配列で示されるCDR1;配列番号39のアミノ酸配列で示されるCDR2;および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体、
(v)1)配列番号5のアミノ酸配列で示されるCDR1;配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2;および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域;および2)配列番号20のアミノ酸配列で示されるCDR1;配列番号40のアミノ酸配列で示されるCDR2;および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体、
(vi)1)配列番号6のアミノ酸配列で示されるCDR1;配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2;および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域;および2)配列番号21のアミノ酸配列で示されるCDR1;配列番号38のアミノ酸配列で示されるCDR2;および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体、
(vii)1)配列番号6のアミノ酸配列で示されるCDR1;配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2;および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域;および2)配列番号22のアミノ酸配列で示されるCDR1;配列番号38のアミノ酸配列で示されるCDR2;および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体、
(viii)1)配列番号7のアミノ酸配列で示されるCDR1;配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2;および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域;および2)配列番号23のアミノ酸配列で示されるCDR1;配列番号41のアミノ酸配列で示されるCDR2;および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体、
(ix)1)配列番号6のアミノ酸配列で示されるCDR1;配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2;および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域;および2)配列番号24のアミノ酸配列で示されるCDR1;配列番号38のアミノ酸配列で示されるCDR2;および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体、
(x)1)配列番号6のアミノ酸配列で示されるCDR1;配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2;および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域;および2)配列番号25のアミノ酸配列で示されるCDR1;配列番号38のアミノ酸配列で示されるCDR2;および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体、および
(xi)1)配列番号8のアミノ酸配列で示されるCDR1;配列番号1のアミノ酸配列で示されるCDR2;および配列番号2のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む軽鎖可変領域;および2)配列番号26のアミノ酸配列で示されるCDR1;配列番号42のアミノ酸配列で示されるCDR2;および配列番号3のアミノ酸配列で示されるCDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体
からなる群から選ばれる、抗体。 - 血管内皮成長因子(VEGF)と結合する抗体であって、
(i)1)配列番号55のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域;および2)配列番号79のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含む抗体、
(ii)1)配列番号55のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域;および2)配列番号80のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含む抗体、
(iii)1)配列番号56のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域;および2)配列番号81のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含む抗体、
(iv)1)配列番号55のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域;および2)配列番号82のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含む抗体、
(v)1)配列番号55のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域;および2)配列番号83のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含む抗体、
(vi)1)配列番号57のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域;および2)配列番号84のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含む抗体、
(vii)1)配列番号57のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域;および2)配列番号85のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含む抗体、
(viii)1)配列番号58のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域;および2)配列番号86のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含む抗体、
(ix)1)配列番号57のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域;および2)配列番号87のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含む抗体、
(x)1)配列番号57のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域;および2)配列番号88のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含む抗体、および
(xi)1)配列番号59のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域;および2)配列番号89のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域を含む抗体
からなる群から選ばれる、抗体。 - ヒトまたはヒト化抗体である請求項1または2記載のVEGF結合抗体。
- IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM、またはその組み合わせまたは変異体である請求項1または2記載のVEGF結合抗体。
- Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、dAb、scFv、またはVEGFと結合するための主要部分として該抗体のCDRを含む足場コンジュゲートの形の請求項4記載のVEGF結合抗体。
- 請求項1または2記載のVEGF結合抗体の軽鎖可変領域をコードするDNA。
- 配列番号67〜71からなる群から選ばれる塩基配列で示される請求項6記載のVEGF結合抗体の軽鎖可変領域をコードするDNA。
- 請求項1または2記載のVEGF結合抗体の重鎖可変領域をコードするDNA。
- 配列番号106〜116からなる群から選ばれる塩基配列で示される請求項8記載のVEGF結合抗体の重鎖可変領域をコードするDNA。
- VEGFと結合する抗体の軽鎖可変領域を発現する請求項6または7記載のDNAを含む発現ベクター。
- VEGFと結合する抗体の重鎖可変領域を発現する請求項8または9記載のDNAを含む発現ベクター。
- 請求項10および11の発現ベクターで形質転換された動物細胞株。
- CHO細胞、HEK細胞、またはNS0細胞である請求項12記載の動物細胞株。
- 請求項1または2記載の抗体を含む、癌またはVEGFの過剰発現によって生じる血管新生関連疾患を予防、診断、または治療するための医薬組成物。
- 該癌またはVEGFの過剰発現によって生じる血管新生関連疾患が、大腸癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、および脳癌からなる群から選ばれる癌;および黄斑変性、糖尿病性網膜症、および虚血性網膜症からなる群から選ばれる眼科疾患からなる群から選ばれる請求項14記載の医薬組成物。
- アルカリ化剤、代謝拮抗剤、葉酸ホモログ、ピリミジンホモログ、プリンホモログ、および関連阻害剤、ビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、抗生物質、L-アスパラギナーゼ、トポイソメラーゼ阻害剤、インターフェロン、プラチナ配位錯体、アントラセンジオン置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、副腎皮質ステロイド、プロゲスチン、エストロゲン、抗エストロゲン、アンドロゲン、抗アンドロゲン、およびゴナドトリピン放出ホルモンホモログからなる群から選ばれる化学療法剤と組み合わせて用いる請求項14記載の医薬組成物。
- フルオロピリミジンベースの薬剤、パクリタキセル、プラチナベースの薬剤、インターフェロンα-2a、カルボプラチン、ドキソルビシン、シスプラチン、ゲムシタビン、5-フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、オキサラプラチン、カペシタビン、ドセタキセル、およびそれらの混合物からなる群から選ばれる薬剤と組み合わせて用いる請求項14記載の医薬組成物。
- 請求項1または2記載のVEGFと結合する抗体を含む、癌またはVEGFの過剰発現によって生じる血管新生関連疾患の診断キット。
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