CN114502781A - 个人化癌症免疫治疗 - Google Patents

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CN114502781A CN202080065110.XA CN202080065110A CN114502781A CN 114502781 A CN114502781 A CN 114502781A CN 202080065110 A CN202080065110 A CN 202080065110A CN 114502781 A CN114502781 A CN 114502781A
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Abstract

本发明关于一种获得特异性结合于肿瘤样本及针对肿瘤样本之抗体或其抗原结合片段之方法，所述方法包含：向个体投与自体树突状细胞；自所述个体获取免疫细胞及肿瘤样本；建构所述免疫细胞之抗体库；及筛选所述抗体库以获得特异性结合于所述肿瘤样本及针对所述肿瘤样本之所述抗体或其片段。本发明亦关于一种用于改造免疫细胞、特异性结合于肿瘤样本及针对肿瘤样本之抗体或其抗原结合片段之方法及其用途。

Description

个人化癌症免疫治疗
技术领域
本发明关于一种癌症免疫治疗之领域。特定言之，本发明关于获得用于个人化癌症免疫治疗之抗体之方法。
背景技术
精准医学及免疫治疗目前为癌症研究之最热领域中之两者。免疫治疗旨在刺激(或恢复)患者自身的免疫系统以对抗癌症。已经批准用于患者使用之一种类型之个人化免疫治疗为嵌合抗原受体(CAR)-T细胞疗法，一种新颖之免疫肿瘤学治疗模式。
需要可实现针对癌症之更有效个人化癌症免疫治疗之技术。
发明内容
本发明提供一种获得患有肿瘤之个体中特异性结合于所述肿瘤且针对所述肿瘤之抗体或其抗原结合片段之方法，其包含：
自所述个体获取肿瘤样本；
向所述个体投与树突状细胞以引发抗肿瘤免疫反应；
采集所述个体之免疫细胞；
建构所述免疫细胞之抗体库；及
筛选所述抗体库以获得特异性结合于所述肿瘤及针对所述肿瘤之所述抗体或其片段。
在一个实施例中，个体经历手术切除或同时化学治疗及放射治疗。
在一个实施例中，个体在投与树突状细胞之前经历手术切除或同时化学治疗及放射治疗。
在一个实施例中，肿瘤样本在投与树突状细胞之前获得。
在一个实施例中，树突状细胞为自体的或异体的；优选为自体的。在本发明之另一实施例中，在个体经历放射治疗、化学治疗或手术之前或之后自个体采集自体树突状细胞。在另一其他实施例中，自体树突状细胞来源于在个体接受放射治疗、化学治疗或手术之前或之后自个体采集之单核球。
在本发明之一个实施例中，向个体投与树突状细胞超过一次。在一个实施例中，以一定时间间隔投与树突状细胞超过两次。在一个实施例中，投与树突状细胞两次。在另一实施例中，时间间隔为一周一次。在一个实施例中，一周投与树突状细胞两次。
在一个实施例中，所述方法包含：
自个体获取肿瘤样本；
一周向所述个体投与树突状细胞两次以在所述个体经历手术切除或同时化学治疗及放射治疗之后引发抗肿瘤免疫反应；
采集所述个体之免疫细胞；
建构所述免疫细胞之抗体库；及
筛选所述抗体库以获得特异性结合于所述肿瘤样本且针对所述肿瘤样本之所述抗体或其片段。
在本发明之一个实施例中，以104个细胞/公斤体重至108个细胞/公斤体重之剂量向个体投与树突状细胞。在另一实施例中，以104个细胞/公斤体重至106个细胞/公斤体重之剂量向个体投与树突状细胞。
在一个实施例中，本文所描述之免疫细胞来源于周边血液单核细胞(PBMC)。
在本发明之一个实施例中，本文所描述之免疫细胞为作为组合抗体基因库建构之主要部分之B细胞。
在本发明之一个实施例中，抗体库由噬菌体呈现建构。
在本发明之一个实施例中，所述方法还包含根据肿瘤样本建立原发肿瘤细胞系且用所述原发肿瘤细胞系筛选抗体库。
在本发明之一个实施例中，由基于细胞之筛选来筛选抗体库。
在本发明之一个实施例中，抗体或其片段为单株抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体或scFv抗体或其片段。
在本发明之一个实施例中，抗体为抗碳酸酐酶IX(CAIX)抗体。
在本发明之一个实施例中，肿瘤为鳞状细胞癌、肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、包括胃肠癌之胃癌(gastric/stomach cancer)、胰脏癌、神经胶母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、尿道癌、肝肿瘤(hepatoma)、乳癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney/renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、肛门癌、阴茎癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、脑癌、头颈癌或其相关转移癌。
本发明亦提供一种用于改造特异性结合于肿瘤样本及针对肿瘤样本之免疫细胞之方法，其包含：
根据上文所提及之方法获得特异性结合于肿瘤样本且针对肿瘤样本之抗体或其抗原结合片段；
提供免疫细胞；及
将所述抗体或其抗原结合片段在所述免疫细胞之表面上表现。
在本发明之一个实施例中，免疫细胞为嵌合抗体免疫细胞。
本发明亦提供一种特异性结合于肿瘤样本且针对所述肿瘤样本之抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区之互补决定区(CDR)及轻链可变区之互补决定区，其中所述重链可变区之互补决定区包含CDRH1、CDRH2及CDRH3区，且所述轻链可变区之互补决定区包含CDRL1、CDRL2及CDRL3区，且其中：
所述CDRH1区包含SEQ ID NO:1(SYAMQ)之氨基酸序列；所述CDRH2区包含选自由SEQ ID NO:2(GMSDDGSWTDYGAAVKG)及SEQ ID NO:3(GVSDDGSWTGYGAAVQG)组成之群之氨基酸序列；所述CDRH3区包含选自由SEQ ID NO:4(GAGTGYCDNRSFGCASTIDA)及SEQ ID NO:5(GAGTGYCNNRGFGCASTIDA)组成之群之氨基酸序列；且
所述CDRL1区包含SEQ ID NO:6(SGSSGSYG)之氨基酸序列；所述CDRL2区包含选自由SEQ ID NO:7(HNDKRPS)及SEQ ID NO:8(YNDKRPS)组成之群之氨基酸序列；所述CDRL3区包含SEQ ID NO:9(GSADRSGAGI)之氨基酸序列。
在本发明之一个实施例中，抗体或其抗原结合片段为哺乳动物抗体。
在本发明之一个实施例中，
CDRH1区包含SEQ ID NO:1之氨基酸序列；CDRH2区包含SEQ ID NO:2之氨基酸序列；CDRH3区包含SEQ ID NO:4之氨基酸序列；且
CDRL1区包含SEQ ID NO:6之氨基酸序列；CDRL2区包含SEQ ID NO:7之氨基酸序列；CDRL3区包含SEQ ID NO:9之氨基酸序列。
在本发明之一个实施例中，
CDRH1区包含SEQ ID NO:1之氨基酸序列；CDRH2区包含SEQ ID NO:3之氨基酸序列；CDRH3区包含SEQ ID NO:5之氨基酸序列；且
CDRL1区包含SEQ ID NO:6之氨基酸序列；CDRL2区包含SEQ ID NO:8之氨基酸序列；CDRL3区包含SEQ ID NO:9之氨基酸序列。
在本发明之一个实施例中，抗体或其抗原结合片段包含：包含SEQ ID NO:10(AVTLDESGGGLHTPGGGLSLVCRASGFTFSSYAMQWVRQAPGKGLEWVAGMSDDGSWTDYGAAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKGAGTGYCDNRSFGCASTIDAWGHGTEVIVSS)之氨基酸序列之重链可变区；及包含SEQ ID NO:11(ALTQPSSVSANLGETVEITCSGSSGSYGWYQQKSPGSAPVTVIYHNDKRPSDIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYYCGSADRSGAGIFGAGTTLTVL)之氨基酸序列之轻链可变区。
在本发明之一个实施例中，抗体或其抗原结合片段包含：包含SEQ ID NO:12(AVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCRASGFTMTSYAMQWVRQAPGKGLEWVAGVSDDGSWTGYGAAVQGRATISRDNGQSTVRLLLNNLRAEDTATYYCVKGAGTGYCNNRGFGCASTIDAWGHGTEVIVSS)之氨基酸序列之重链可变区；及包含SEQ ID NO:13(ALTQPSSVSANLGETVEITCSGSSGSYGWYQQKSPGSAPVTVIYYNDKRPSDIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYYCGSADRSGAGIFGAGTTLTVL)之氨基酸序列之轻链可变区。
在本发明之一个实施例中，抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成之群之氨基酸序列：SEQ ID NO:14(ALTQPSSVSANLGETVEITCSGSSGSYGWYQQKSPGSAPVTVIYHNDKRPSDIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYYCGSADRSGAGIFGAGTTLTVLGQSSRSSGGGGSSGGGGSAVTLDESGGGLHTPGGGLSLVCRASGFTFSSYAMQWVRQAPGKGLEWVAGMSDDGSWTDYGAAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKGAGTGYCDNRSFGCASTIDAWGHGTEVIVSS)及SEQ ID NO:15(ALTQPSSVSANLGETVEITCSGSSGSYGWYQQKSPGSAPVTVIYYNDKRPSDIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYYCGSADRSGAGIFGAGTTLTVLGQSSRSSAVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCRASGFTMTSYAMQWVRQAPGKGLEWVAGVSDDGSWTGYGAAVQGRATISRDNGQSTVRLLLNNLRAEDTATYYCVKGAGTGYCNNRGFGCASTIDAWGHGTEVIVSS)。
在本发明之一个实施例中，抗体或其抗原结合片段在免疫细胞表面上表现。
本发明提供一种医药组合物，其包含治疗有效量之上文所提及之抗体或其抗原结合片段及视情况选用之医药学上可接受之载剂或赋形剂。
本发明提供上文所提及之医药组合物的用途，其用于制造用以治疗有需要之个体之肿瘤的药物。
在本发明之一个实施例中，经静脉内、腹膜内、动脉内、鞘内、膀胱内或瘤内投与所述药物。
本发明提供一种用于治疗有需要之个体之肿瘤的方法，其包含投与上文所提及之医药组合物。
在本发明之一个实施例中，其中经静脉内、腹膜内、动脉内、鞘内、膀胱内或瘤内进行投与。
图式简单说明
图1示出K562-CAIX之基于细胞之ELISA的结果。
图2A至2C示出细胞表面染色之结果。2A：未染色的对照抗体(抗CAIX)；scFv L6。2B：长1B、3A、2F、3C抗体。2C：短1C、1F、1G、2B抗体。
图3示出获得特异性结合于肿瘤样本且针对肿瘤样本之抗体或其抗原结合片段之方法的示意图。
图4示出KYL之细胞的基于细胞之ELISA之结果。
具体实施方式
为促进对本发明技术之理解，下文定义多个术语及词组。其他定义在整个实施方式中阐述。
另外，如本文所使用，除非上下文另外明确规定，否则术语“或”为包括性的“或”运算符，且等效于术语“及/或”。除非上下文另外明确规定，否则术语“基于”不为排他性的且允许基于未描述之额外因素。另外，在整个说明书中，“一(a/an)”及“所述”之含义包括复数个参考物。“在……中”之含义包括“在……中”及“在……上”。
如本文所使用，术语“特异性结合”意谓抗体在很大程度上不会与其他表位交叉反应。
如本文所使用，术语“表位”是指抗体结合之抗原上之位点。
如本文所用，术语“抗体”是指属于多株、单株、嵌合及人源化抗体类别之单链、双链及多链蛋白质及多肽；其亦包括此等抗体之合成及基因改造变异体。“抗体片段”包括Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段，以及具有针对一或多个所需目标表位之特异性之抗体的任何部分。
如本文所使用，术语“单株抗体”是指获自实质上均质抗体群体之抗体。换言之，单株抗体由产生自单一细胞系(例如融合瘤细胞、经针对均匀抗体进行编码之DNA分子转染之真核宿主细胞，或经针对均匀抗体进行编码之DNA分子转染之原核宿主细胞)之生长之均质抗体组成。此等抗体是针对单一表位，且因此具有高度特异性。
如本文所使用，术语“人源化抗体”是指一种重组蛋白，其中将来自一个物种(例如鼠或鸡)之抗体CDR自所述物种抗体之重链可变区及轻链可变区转移至人类重链可变域及轻链可变域(构架区)中。所述抗体分子之恒定域是源于所述人类抗体之恒定域。在一些情况下，人源化抗体之构架区之特定性残基(尤其接触或接近CDR序列之彼等特定残基)可经修饰，例如可经来源鼠、啮齿动物、类人猴或其他抗体之对应残基置换。人源化抗体可由多种方法实现，包括(a)仅将非人类CDR移植至人类构架及恒定区上，而保留或不保留关键构架残基，或(b)藉由置换表面残基移植整个非人类可变域，但其用类似人类之部分“遮盖”。适用于实践本发明之此类方法包括揭示于Padlan,Mol.Immunol.,31(3):169-217(1994)中之方法。
如本文所使用，术语“嵌合抗体”是指含有抗体重链及抗体轻链两者之可变域之重组蛋白，其包括来源于一个物种之抗体(优选为啮齿动物抗体或鸡抗体，更优选为鼠抗体)之互补决定区(CDR)，然而抗体分子之恒定域是源于人类抗体之彼等恒定域。
如本文所使用，术语“互补决定区”(CDR)是指重链及轻链多肽之可变区内所发现之非连续抗原组合位点。CDR已由Kabat等人，J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；Kabat等人，U.S.Dept.of Health and Human Services，“Sequences of proteins ofimmunological interest”(1991)；由Chothia等人，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；及MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996)描述，其中当彼此比较时，定义包括氨基酸残基之重迭或子集。
如应用于多肽，术语“实质类似性”或“实质上类似”意谓当诸如藉由程序GAP或BESTFIT使用默认空位权重进行最佳比对时，两个肽序列具有至少95％之序列一致性，甚至更优选至少98％或99％之序列一致性。优选地，不相同之残基位置因保守氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”为氨基酸残基经具有类似化学特性(例如电荷或疏水性)之侧链(R基团)之另一氨基酸残基取代的氨基酸取代。一般而言，保守氨基酸取代实质上不会改变蛋白质之功能特性。在两个或更多个氨基酸序列彼此因保守取代而不同之情况下，可上调序列一致性百分比或相似度以针对保守取代性质加以校正。进行此调节之方式为熟习此项技术者所熟知。含有具类似化学特性之侧链之氨基酸基团之实例包括(1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、白氨酸及异白氨酸；(2)脂族羟基侧链：丝氨酸及苏氨酸；(3)含酰氨侧链：天冬酰氨及麸酰氨酸；(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸；(5)碱性侧链：离氨酸、精氨酸及组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸及麸氨酸；及(7)含硫侧链为半胱氨酸及甲硫氨酸。优选保守氨基酸取代群组为：缬氨酸-白氨酸-异白氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、离氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、麸氨酸-天冬氨酸及天冬酰氨-麸酰氨酸。或者，保守置换为Gonnet等人(1992)Science 256:1443-1445中揭示之PAM250对数似然矩阵中具有正值之任何变化，其以引用之方式并入本文中。“适度保守”置换为在PAM250对数似然矩阵中具有非负值之任何变化。
如本文所使用，术语“样本”涵盖自个体、个体或患者获得之多种样本类型且可用于诊断或监测分析中。所述定义涵盖生物来源之血液及其他液态样本；固态组织样本，诸如生检检体或组织培养物或源自其之细胞，及其后代。
如本文所使用，术语“治疗(treatment/treating)”及其类似术语涵盖哺乳动物(尤其人类)之疾病之任何治疗，且包括：(a)预防可能易患所述疾病但尚未诊断出患有所述疾病之个体出现疾病；(b)抑制所述疾病，亦即阻滞其发展；及(c)缓解所述疾病，亦即促使所述疾病消退。
如本文中可互换地使用，术语“个体”、“个体”、“宿主”及“患者”是指哺乳动物，其包括但不限于鼠(大鼠、小鼠)、非人类灵长类动物、人类、犬科动物、猫科动物、有蹄动物(例如马科动物、牛科动物、绵羊、猪科动物、山羊)等。
如本文所使用，术语“治疗有效量”或“有效量”是指当为了治疗疾病向哺乳动物或其他个体投与时足以实现对所述疾病之所述治疗之抗体的量。
本发明提供一种获得在患有肿瘤之个体中特异性结合于肿瘤且针对肿瘤之抗体或其抗原结合片段之方法，其包含：
自所述个体获取肿瘤样本；
向所述个体投与树突状细胞以引发抗肿瘤免疫反应；
采集所述个体之免疫细胞；
建构所述免疫细胞之抗体库；及
筛选所述抗体库以获得特异性结合于所述肿瘤及针对所述肿瘤之所述抗体或其片段。
在一个实施例中，获取肿瘤样本以建立特异性原发肿瘤细胞系。在一个实施例中，本文所描述之免疫细胞来源于周边血液单核细胞(PBMC)。
咸信(但不意欲受任何理论限制)树突状细胞为哺乳动物免疫系统之抗原呈现细胞，将细胞表面上之抗原呈现至免疫系统之T细胞。在采集免疫细胞之前投与自体树突状细胞提高筛选之特异性及有效性，促进获得特异性结合于肿瘤样本且针对肿瘤样本之强大抗体。自体树突状细胞可来源于个体之单核球或经由增殖提供。优选地，树突状细胞来源于个体之PBMC；更优选地，直接来源于周边血液。
在优选实施例中，个体为哺乳动物。例示性哺乳动物包括人类、猪、绵羊、山羊、马、小鼠、犬、猫、母牛等。
临床上，肿瘤患者通常经历放射治疗、化学治疗或手术。为了收集有效树突状细胞，树突状细胞优选在个体经历放射治疗、化学治疗或手术之前自个体收集。放射治疗、化学治疗或手术与收集之间的持续时间可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天，优选7天。
树突状细胞之投与可进行超过一次；优选地，以一定时间间隔向个体投与树突状细胞两次。投与之间的间隔可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天，优选7天。
在另一态样中，以足以展示抗原呈现之量向个体投与树突状细胞。优选地，以104个细胞/公斤体重至106个细胞/公斤体重之剂量向个体投与树突状细胞。
在个体接受放射治疗、化学治疗或手术之情况下，优选在个体经历放射治疗、化学治疗或手术之后向个体投与树突状细胞。
所采集之免疫细胞可来自淋巴或血液，优选来自周边血液。优选地，免疫细胞在投与树突状细胞1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天，优选7天之后采集。
根据本发明之免疫细胞之实例包括但不限于淋巴球、嗜中性白血球、单核球及巨噬细胞。优选地，免疫细胞为淋巴球。淋巴球之实例包括但不限于T细胞、B细胞及NK细胞。优选地，免疫细胞为B细胞。
可改变建构免疫细胞之抗体库之方式。建构之实例包括但不限于噬菌体呈现、活体外显示、酵母呈现、哺乳动物呈现及细菌呈现；优选地，抗体库藉由噬菌体呈现建构。
肿瘤样本可直接由个体提供或经处理。优选地，所述方法进一步包含自肿瘤样本建立原发肿瘤细胞系且用所述原发肿瘤细胞系筛选抗体库。此外，优选由基于细胞之筛选来筛选抗体库。
抗体或其片段可为单株抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体或scFv抗体或其片段，优选scFv抗体。
在本发明之一个实施例中，根据本发明筛选抗碳酸酐酶IX(CAIX)抗体。
可用抗体或其医药组合物治疗之肿瘤包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤及白血病或淋巴恶性肿瘤。此类癌症之更多特定实例包括鳞状细胞癌(上皮鳞状细胞癌)；包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌及肺鳞状细胞癌之肺癌；腹膜癌；肝细胞癌；包括胃肠癌之胃癌(gastric/stomach cancer)；胰脏癌；神经胶母细胞瘤；子宫颈癌；卵巢癌；肝癌(liver cancer)；膀胱癌；尿道癌；肝肿瘤(hepatoma)；乳癌；结肠癌；直肠癌；结肠直肠癌；子宫内膜癌或子宫癌；唾液腺癌；肾癌(kidney/renal cancer)；前列腺癌；外阴癌；甲状腺癌；肝癌(hepatic carcinoma)；肛门癌；阴茎癌；黑色素瘤；多发性骨髓瘤及B细胞淋巴瘤、脑癌以及头颈癌，及相关转移癌。
本发明亦提供一种用于改造特异性结合于肿瘤样本及针对肿瘤样本之免疫细胞之方法，其包含：
根据上文所提及之方法获得特异性结合于肿瘤样本且针对肿瘤样本之抗体或其抗原结合片段；
提供免疫细胞；及
将所述抗体或其抗原结合片段在所述免疫细胞上表现。
优选地，免疫细胞为嵌合抗体免疫细胞。在本发明之一个实施例中，嵌合抗体包含抗原识别域、铰链区、跨膜域及胞内T细胞信号传导域。抗体或其抗原结合片段作为抗原识别域。
本发明亦提供一种特异性结合于肿瘤样本且针对所述肿瘤样本之抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区之互补决定区(CDR)及轻链可变区之互补决定区，其中所述重链可变区之互补决定区包含CDRH1、CDRH2及CDRH3区，且所述轻链可变区之互补决定区包含CDRL1、CDRL2及CDRL3区，且其中：
所述CDRH1区包含SEQ ID NO:1(SYAMQ)之氨基酸序列；所述CDRH2区包含选自由SEQ ID NO:2(GMSDDGSWTDYGAAVKG)及SEQ ID NO:3(GVSDDGSWTGYGAAVQG)组成之群之氨基酸序列；所述CDRH3区包含选自由SEQ ID NO:4(GAGTGYCDNRSFGCASTIDA)及SEQ ID NO:5(GAGTGYCNNRGFGCASTIDA)组成之群之氨基酸序列；且
所述CDRL1区包含SEQ ID NO:6(SGSSGSYG)之氨基酸序列；所述CDRL2区包含选自由SEQ ID NO:7(HNDKRPS)及SEQ ID NO:8(YNDKRPS)组成之群之氨基酸序列；所述CDRL3区包含SEQ ID NO:9(GSADRSGAGI)之氨基酸序列。
特定言之，抗体或其抗原结合片段为抗CAIX L3A，其中：
CDRH1区包含SEQ ID NO:1之氨基酸序列；CDRH2区包含SEQ ID NO:2之氨基酸序列；CDRH3区包含SEQ ID NO:4之氨基酸序列；且
CDRL1区包含SEQ ID NO:6之氨基酸序列；CDRL2区包含SEQ ID NO:7之氨基酸序列；CDRL3区包含SEQ ID NO:9之氨基酸序列。
特定言之，抗体或其抗原结合片段为抗CAIX S1C，其中：
CDRH1区包含SEQ ID NO:1之氨基酸序列；CDRH2区包含SEQ ID NO:3之氨基酸序列；CDRH3区包含SEQ ID NO:5之氨基酸序列；且
CDRL1区包含SEQ ID NO:6之氨基酸序列；CDRL2区包含SEQ ID NO:8之氨基酸序列；CDRL3区包含SEQ ID NO:9之氨基酸序列。
优选地，抗CAIX L3A包含：包含SEQ ID NO:10(AVTLDESGGGLHTPGGGLSLVCRASGFTFSSYAMQWVRQAPGKGLEWVAGMSDDGSWTDYGAAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKGAGTGYCDNRSFGCASTIDAWGHGTEVIVSS)之氨基酸序列之重链可变区；及包含SEQ ID NO:11(ALTQPSSVSANLGETVEITCSGSSGSYGWYQQKSPGSAPVTVIYHNDKRPSDIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYYCGSADRSGAGIFGAGTTLTVL)之氨基酸序列之轻链可变区。
优选地，抗CAIX S1C包含：包含SEQ ID NO:12(AVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCRASGFTMTSYAMQWVRQAPGKGLEWVAGVSDDGSWTGYGAAVQGRATISRDNGQSTVRLLLNNLRAEDTATYYCVKGAGTGYCNNRGFGCASTIDAWGHGTEVIVSS)之氨基酸序列之重链可变区；及包含SEQ ID NO:13(ALTQPSSVSANLGETVEITCSGSSGSYGWYQQKSPGSAPVTVIYYNDKRPSDIPSRFSGSKS GSTGTLTITGVQAEDEAVYYCGSADRSGAGIFGAGTTLTVL)之氨基酸序列之轻链可变区。
更优选地，抗CAIX L3A包含SEQ ID NO:14(ALTQPSSVSANLGETVEITCSGSSGSYGWYQQKSPGSAPVTVIYHNDKRPSDIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYYCGSADRSGAGIFGAGTTLTVLGQSSRSSGGGGSSGGGGSAVTLDESGGGLHTPGGGLSLVCRASGFTFSSYAMQWVRQAPGKGLEWVAGMSDDGSWTDYGAAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKGAGTGYCDNRSFGCASTIDAWGHGTEVIVSS)之氨基酸序列。
更优选地，抗CAIX S1C包含SEQ ID NO:15(ALTQPSSVSANLGETVEITCSGSSGSYGWYQQKSPGSAPVTVIYYNDKRPSDIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYYCGSADRSGAGIFGAGTTLTVLGQSSRSSAVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCRASGFTMTSYAMQWVRQAPGKGLEWVAGVSDDGSWTGYGAAVQGRATISRDNGQSTVRLLLNNLRAEDTATYYCVKGAGTGYCNNRGFGCASTIDAWGHGTEVIVSS)之氨基酸序列。
在本发明之一个优选实施例中，抗体或其抗原结合片段与治疗剂结合。在本发明之一个优选实施例中，抗体或其抗原结合片段表现在细胞表面上。更优选地，细胞为免疫细胞，又更优选地，NK-细胞。
本发明提供一种医药组合物，其包含治疗有效量之上文所提及之抗体或其抗原结合片段及视情况选用之医药学上可接受之载剂或赋形剂。本发明之医药组合物是用适合之载剂、赋形剂及可提供经改良之转移、传递、耐受性及其类似物之其他药剂调配。多种适当调配物可见于所有药剂师已知之处方集中：Remington's Pharmaceutical Sciences,MackPublishing Company,Easton,Pa。此等调配物包括例如粉剂、糊剂、软膏、凝胶、蜡、油、脂质、含有囊泡之脂质(阳离子或阴离子)、DNA结合物、无水吸收糊剂、水包油及油包水乳剂、乳液卡波蜡(各种分子量之聚乙二醇)、半固体凝胶及含有卡波蜡之半固体混合物。
向患者投与之抗体剂量可视患者之年龄及体型、目标疾病、病状、投与途径及其类似因素而变化。优选剂量通常根据体重或体表面积计算。当本发明之抗体用于治疗成人患者之肿瘤时，经静脉内投与本发明之抗体是有利的。视病状之严重程度而定，可调整治疗之频率及持续时间。投与抗体之有效剂量及时程可凭经验确定；例如，患者进展可由周期性评估监测，且相应地调整剂量。此外，可利用此项技术中熟知之方法来进行物种间之剂量的调整。
各种传递系统为已知的且可用于投与本发明之医药组合物，例如脂质体胶囊化、微粒、微胶囊、能够表现突变病毒之重组细胞、受体介导之胞吞作用(参见例如Wu等人，1987，J.Biol.Chem.262:4429-4432)。引入方法包括但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、动脉内、鞘内、膀胱内或瘤内、硬膜外及口服途径。所述组合物可藉由任何便利途径投与，例如藉由输注或推注注射、藉由经上皮或黏膜皮肤衬里(例如口腔黏膜、直肠黏膜及肠黏膜等)吸收且可与其他生物学活性剂一起投与。投与可为全身性投与或局部投与。优选地，药物是经静脉内、腹膜内、动脉内、鞘内、膀胱内或瘤内投与。
本发明提供上文所提及之医药组合物的用途，其用于制造用以治疗有需要之个体之肿瘤的药物。
本发明提供一种用于治疗有需要之个体之肿瘤的方法，其包含投与上文所提及之医药组合物。
在本发明之一个实施例中，其中经静脉内、腹膜内、动脉内、鞘内、膀胱内或瘤内进行投与。
提供以下实例以辅助熟习此项技术者实践本发明。
实例
实例1：抗CAIX Ab之表现、纯化结合分析
获取K562细胞用于阴性选择；同时，获取CAIX过度表现K562细胞用于阳性选择。根据经CAIX Ag免疫之鸡建立抗体噬菌体库。
基于先前报导(Andris-Widhopf J、Rader C、Steinberger P等人Methods forthe generation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display.JImmunol Methods 2000；242:159-81)建立抗体库。简言之，将最终免疫之后自鸡采集之脾脏立即置放于Trizol(Gibco BRL.,USA)中以供均质化。使用SuperScript RT套组(Invitrogen,USA)将10μg RNA逆转录成第一股cDNA。使用鸡特异性引子扩增之后，对重链及轻链可变(VH及VL)区之PCR产物进行第二轮PCR以形成具有短或长连接符之全长scFv片段，其进一步用SfiI消化且选殖至pComb3X载体中。藉由电穿孔(来自BioRad之MicroPulser)将重组噬菌体DNA转换为大肠杆菌ER2738菌株。重组噬菌体之产生藉由添加野生型VCS-M13协助者噬菌体起始，随后用4％聚乙二醇8000及3％NaCl(w/v)使其沈淀，且最终再悬浮于含有1％牛血清白蛋白(BSA)之1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。随后，在4℃下用含1％BSA之PBS阻断scFv抗体库中重组噬菌体(50μl)之1012至1013空斑形成单元(pfu)持续1小时，且随后与106个K562细胞(100μl)一起在室温下培育30分钟两次(阴性选择)。收集未结合噬菌体上清液之后，将上清液与CAIX过度表现K562细胞一起在4℃下培育1小时(阳性选择)。随后用PBS洗涤细胞5～8次。结合之噬菌体用0.2M甘氨酸-HCl(pH 2.2)溶离，用1MTris-HCl缓冲液中和，且随后用于感染大肠杆菌ER2738菌株。如上文所描述沈淀且回收经扩增之噬菌体用于下一轮选择。
建构具有短连接符及长连接符之库，如表1中所示。示出各筛选之后的溶离效价(表1)。三轮筛选之后，CAIX结合噬菌体变异体大量富集。此等结果表明非特异性结合噬菌体在筛选过程中移除且具有特异性结合亲和力之纯系富集。序列经证实属于鸡免疫球蛋白生殖系基因。
表1
Figure BDA0003549882900000161
为检查其结合反应性，将50μl候选噬菌体与K562或CAIX过度表现K562细胞一起在室温下在150rpm震荡下在ELISA板孔中培育2小时。在用PBS洗涤3次之后，与HRP-结合抗M13抗体(1:5,000)一起在室温下培育2小时来侦测结合之scFv。在用PBS洗涤6次之后，将四甲基联苯氨(TMB)受质溶液(Sigma,USA)添加至各孔中用于显色。用2N H2SO4停止反应且在450nm至540nm下使用ELISA板读取器(BioTek Synergy HT)量测光密度。基于细胞之ELISA之结果展示于图1中。相比于K562细胞，候选scFv对CAIX过度表现K562细胞具有较高结合活性。
使用抗HA抗体侦测候选噬菌体纯系之结合活性。对1×105个K562或K562-CAIX细胞及20μl候选噬菌体纯系进行流式细胞术分析技术。细胞表面染色之结果展示于图2A至2C中。除抗CAIX L1B scFv以外，所有scFv均可特异性结合于CAIX过度表现细胞。
在所述抗体中，获得抗CAIX L3A(长3A)及S1C(短1C)。
实例2：活体内分析中之抗甲状腺癌细胞Ab
用于获得特异性结合于肿瘤样本及针对肿瘤样本之抗体或其抗原结合片段之方法之示意图展示于图3中。
自患有甲状腺癌之患者采集树突状细胞。在患者经受手术切除术或同时化学治疗及放射治疗之后，患者接受自体DC细胞之1×104～1×106个细胞/公斤体重之腋淋巴结(ALN)注射两次(在第1周及第2周)。手术切除样本用于建立肿瘤细胞系，且在第3周采集之周边血液用于建立Ab噬菌体库。
甲状腺癌细胞(KYL之细胞)自患者建立且在具有5％CO2之潮湿空气中于37℃下在补充有1.5％PLUSTMHuman Plate Lysate(CPMPASS,CPS-PLS5-BAG)及2％青霉素-链霉素(Life technologies，15140)之RPMI1640培养基(HyUNK，SH30027)中培养。
基于细胞之筛选方案如实例1中所提及。
根据实例1进行噬菌体效价，且结果展示于表2中。
表2：
筛选1 扩增1 筛选2 扩增2 筛选3
长链连接符 1.3*10^2 4*10^11 1.5*10^5 7.0*10^11 3.7*10^5
短链连接符 1.2*10^2 2*10^10 1.1*10^5 1.0*10^12 1.22*10^6
噬菌体扩增及基于细胞之ELISA之方案与实例1中之彼等方案相同。结果展示于图4中。纯系D及F对甲状腺癌细胞具有高结合活性。
虽然已结合上文所阐述之特定实施例来描述本发明，但其许多替代方案及其修改及变化对于一般技术者而言将显而易知。所有此类替代方案、修改及变化被视为落入本发明之范畴内。

Claims (27)

1.一种获得特异性结合于患有肿瘤个体中之所述肿瘤及针对所述肿瘤之抗体或其抗原结合片段之方法，其包含：
自所述个体获取肿瘤样本；
向所述个体投与树突状细胞以引发抗肿瘤免疫反应；
采集所述个体之免疫细胞；
建构所述免疫细胞之抗体库；及
筛选所述抗体库以获得特异性结合于所述肿瘤及针对所述肿瘤之所述抗体或其片段。
2.如权利要求1所述之方法，其中所述个体经历手术切除或同时化学治疗及放射治疗。
3.如权利要求1所述之方法，其中所述个体在投与所述树突状细胞之前经历手术切除或同时化学治疗及放射线治疗。
4.如权利要求1所述之方法，其中所述肿瘤样本是在投与所述树突状细胞之前获得。
5.如权利要求1所述之方法，其中所述树突状细胞为自体的。
6.如权利要求5所述之方法，其中所述自体树突状细胞是在所述个体经历放射治疗、化学治疗或手术之前或之后采集自所述个体。
7.如权利要求1所述之方法，其中向所述个体投与所述树突状细胞超过一次。
8.如权利要求1所述之方法，其中以一定时间间隔投与所述树突状细胞超过两次。
9.如权利要求1所述之方法，其中投与所述树突状细胞两次。
10.如权利要求8所述之方法，其中所述时间间隔为一周一次。
11.如权利要求1所述之方法，其中一周投与所述树突状细胞两次。
12.如权利要求1所述之方法，其包含以下各者：
自所述个体获取肿瘤样本；
在所述个体经历手术切除或同时化学治疗及放射治疗之后，一周向所述个体投与树突状细胞两次以引发抗肿瘤免疫反应；
采集所述个体之免疫细胞；
建构所述免疫细胞之抗体库；及
筛选所述抗体库以获得特异性结合于所述肿瘤样本及针对所述肿瘤样本之所述抗体或其片段。
13.如权利要求1所述之方法，其中以104个细胞/公斤体重至108个细胞/公斤体重之剂量向所述个体投与所述树突状细胞。
14.如权利要求1所述之方法，其中所述免疫细胞为B细胞。
15.如权利要求1所述之方法，其进一步包含根据所述肿瘤样本建立原发肿瘤细胞系且用所述原发肿瘤细胞系筛选所述抗体库。
16.如权利要求1所述之方法，其中所述抗体或其片段为单株抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体或scFv抗体或其片段。
17.如权利要求1所述之方法，其中所述肿瘤为鳞状细胞癌、肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、包括胃肠癌之胃癌(gastric/stomach cancer)、胰脏癌、神经胶母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、尿道癌、肝肿瘤(hepatoma)、乳癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney/renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、肛门癌、阴茎癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、脑癌、头颈癌或其相关转移癌。
18.一种用于改造特异性结合于肿瘤样本及针对肿瘤样本之免疫细胞之方法，其包含：
根据如权利要求1至17中所述任一项之方法获得特异性结合于肿瘤样本及针对肿瘤样本之抗体或其抗原结合片段；
提供免疫细胞；及
将所述抗体或其抗原结合片段在所述免疫细胞上表现。
19.一种特异性结合于肿瘤样本及针对肿瘤样本之抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区之互补决定区(CDR)及轻链可变区之互补决定区，其中所述重链可变区之所述互补决定区包含CDRH1、CDRH2及CDRH3区，且所述轻链可变区之所述互补决定区包含CDRL1、CDRL2及CDRL3区，且其中：所述CDRH1区包含SEQ ID NO:1(SYAMQ)之氨基酸序列；所述CDRH2区包含选自由SEQ ID NO:2(GMSDDGSWTDYGAAVKG)及SEQ ID NO:3(GVSDDGSWTGYGAAVQG)组成之群之氨基酸序列；所述CDRH3区包含选自由SEQ ID NO:4(GAGTGYCDNRSFGCASTIDA)及SEQ ID NO:5(GAGTGYCNNRGFGCASTIDA)组成之群之氨基酸序列；且
所述CDRL1区包含SEQ ID NO:6(SGSSGSYG)之氨基酸序列；所述CDRL2区包含选自由SEQID NO:7(HNDKRPS)及SEQ ID NO:8(YNDKRPS)组成之群之氨基酸序列；所述CDRL3区包含SEQID NO:9(GSADRSGAGI)之氨基酸序列。
20.如权利要求19所述之抗体或其抗原结合片段，其中
所述CDRH1区包含SEQ ID NO:1之氨基酸序列；所述CDRH2区包含SEQ ID NO:2之氨基酸序列；所述CDRH3区包含SEQ ID NO:4之氨基酸序列；且
所述CDRL1区包含SEQ ID NO:6之氨基酸序列；所述CDRL2区包含SEQ ID NO:7之氨基酸序列；所述CDRL3区包含SEQ ID NO:9之氨基酸序列；或
所述CDRH1区包含SEQ ID NO:1之氨基酸序列；所述CDRH2区包含SEQ ID NO:3之氨基酸序列；所述CDRH3区包含SEQ ID NO:5之氨基酸序列；且所述CDRL1区包含SEQ ID NO:6之氨基酸序列；所述CDRL2区包含SEQ ID NO:8之氨基酸序列；所述CDRL3区包含SEQ ID NO:9之氨基酸序列。
21.如权利要求19所述之抗体或其抗原结合片段，其包含
包含SEQ ID NO:10(AVTLDESGGGLHTPGGGLSLVCRASGFTFSSYAMQWVRQAPGKGLEWVAGMSDDGSWTDYGAAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKGAGTGYCDNRSFGCASTIDAWGHGTEVIVSS)之氨基酸序列之重链可变区；及包含SEQ ID NO:11(ALTQPSSVSANLGETVEITCSGSSGSYGWYQQKSPGSAPVTVIYHNDKRPSDIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYYCGSADRSGAGIFGAGTTLTVL)之氨基酸序列之轻链可变区；或
包含SEQ ID NO:12(AVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCRASGFTMTSYAMQWVRQAPGKGLEWVAGVSDDGSWTGYGAAVQGRATISRDNGQSTVRLLLNNLRAEDTATYYCVKGAGTGYCNNRGFGCASTIDAWGHGTEVIVSS)之氨基酸序列之重链可变区；及包含SEQ ID NO:13(ALTQPSSVSANLGETVEITCSGSSGSYGWYQQKSPGSAPVTVIYYNDKRPSDIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYYCGSADRSGAGIFGAGTTLTVL)之氨基酸序列之轻链可变区。
22.如权利要求19所述之抗体或其抗原结合片段，其包含选自由以下组成之群之氨基酸序列：SEQ ID NO:14(ALTQPSSVSANLGETVEITCSGSSGSYGWYQQKSPGSAPVTVIYHNDKRPSDIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYYCGSADRSGAGIFGAGTTLTVLGQSSRSSGGGGSSGGGGSAVTLDESGGGLHTPGGGLSLVCRASGFTFSSYAMQWVRQAPGKGLEWVAGMSDDGSWTDYGAAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKGAGTGYCDNRSFGCASTIDAWGHGTEVIVSS)及SEQ ID NO:15(ALTQPSSVSANLGETVEITCSGSSGSYGWYQQKSPGSAPVTVIYYNDKRPSDIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYYCGSADRSGAGIFGAGTTLTVLGQSSRSSAVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCRASGFTMTSYAMQWVRQAPGKGLEWVAGVSDDGSWTGYGAAVQGRATISRDNGQSTVRLLLNNLRAEDTATYYCVKGAGTGYCNNRGFGCASTIDAWGHGTEVIVSS)。
23.如权利要求19所述之抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段为单株抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体或scFv抗体或其片段。
24.如权利要求19所述之抗体或其抗原结合片段，其表现在免疫细胞表面上。
25.一种医药组合物之用途，其是用在制造用于治疗有需要个体之肿瘤的药物；其中所述医药组合物包含治疗有效量之如权利要求19至24中任一项之抗体或其抗原结合片段及视情况选用之医药学上可接受之载剂或赋形剂。
26.如权利要求25所述之用途，其中所述药物是经静脉内、腹膜内、动脉内、鞘内、膀胱内或瘤内投与。
27.如权利要求25所述之用途，其中所述肿瘤为鳞状细胞癌、肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、包括胃肠癌之胃癌(gastric/stomach cancer)、胰脏癌、神经胶母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、尿道癌、肝肿瘤(hepatoma)、乳癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney/renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、肛门癌、阴茎癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、脑癌、头颈癌或其相关转移癌。
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