CN116854819A - 抗cd25抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种抗CD25抗体或其抗原结合片段及其应用。该抗体或其抗原结合片段含有选自下列至少之一的CDR序列:重链可变区CDR1‑3序列:SEQ ID NO:1~3;轻链可变区CDR1‑3序列:SEQ ID NO:4~6。本发明的抗体具有增强的CD25结合特性,能有效阻断IL‑2与CD25结合,进而抑制IL‑2诱导的下游信号,抑制T细胞增殖、促进PBMC杀伤CD25阳性T细胞,可用于预防和/或治疗CD25介导的疾病。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体地,本发明涉及一种抗CD25抗体或其抗原结合片段及其应用。
背景技术
CD25,或称白细胞介素2受体α链,是一种I型跨膜蛋白,主要表达在Treg细胞和活化的T细胞表面,与细胞的存活、增殖和活化高度相关。T细胞表面的IL-2受体分两种,低亲和力的IL-2Rβ/IL-2Rγ和高亲和力受体IL-2Rα/IL-2Rβ/IL-2Rγ。静息的T细胞表面表达低亲和力受体IL-2Rβ/IL-2Rγ,活化后,IL-2Rα(CD25)上调表达,形成高亲和力受体IL-2Rα/IL-2Rβ/IL-2Rγ。Treg细胞表面高表达IL-2Rα(CD25),并且其表达丰度远高于其它免疫细胞,靶向CD25清除Treg细胞能够逆转肿瘤免疫抑制。Treg表面的IL-2受体高亲和力受体IL-2Rα/IL-2Rβ/IL-2Rγ为主,研究显示,Treg对IL-2的依赖性远高于T细胞,阻断IL-2信号能够抑制Treg存活、逆转Treg细胞的免疫抑制功能,恢复抗癌免疫。
目前,靶向CD25疗法在自身免疫性疾病和癌症等免疫相关疾病中均有应用。在自身免疫性疾病中,自身抗原特异性T细胞活化后攻击正常组织细胞,造成组织损伤。这些非正常活化的T细胞表面表达CD25。已知单抗Daclizumab是抑制IL-2与CD25结合的IgG1型抗人CD25抗体,抑制CD25介导IL-2的免疫激活功能,被开发用于减少效应T细胞的活化。目前,Daclizumab被批准用于治疗多发性硬化症。在肿瘤组织中,Treg细胞抑制了抗肿瘤免疫细胞免疫功能的发挥,造成肿瘤的发生发展,通过抗CD25抗体清除Treg细胞,能够延缓肿瘤的发生发展。已知WO2019/175216中公开了罗氏和Tusk Therapeutics联合开发的靶向CD25的抗体RG6292,目前正在进行I期临床试验,以考察其在实体瘤中的安全性和药效。
然而,开发CD25结合性更强的、能有效阻断IL-2与CD25结合或抑制IL-2诱导的下游信号的抗CD25抗体,仍然是本领域亟需的。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此,本发明的一个目的在于提供抗CD25抗体或其抗原结合片段及其缀合物。本发明的另一目的在于提供利用所述抗CD25抗体或其抗原结合片段及其缀合物制备的药物组合物,其可用于清除CD25阳性T细胞、阻断IL-2与CD25结合或者预防和/或治疗CD25介导的疾病。本发明的另一目的在于提供所述抗CD25抗体或其抗原结合片段及其缀合物等的应用。
本发明是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的:
发明人深入研究发现,Daclizumab作为IL-2信号抑制性抗体,其仅能部分抑制CD25与IL-2的结合,不具有完全的阻断功能,对IL-2信号的抑制功能弱。而抗体RG6292是非抑制性抗体,不能阻断CD25与IL-2结合,不影响IL-2信号传递。
因此,在本发明的第一方面,本发明提出了一种抗体或其抗原结合片段。根据本发明的实施例,所述抗CD25抗体或其抗原结合片段包含:重链可变区CDRs和轻链可变区CDRs,其中,
重链可变区CDRs具有如SEQ ID NO:1~3所示或其保守修饰形式的氨基酸序列;
轻链可变区CDRs具有如SEQ ID NO:4~6所示或其保守修饰形式的氨基酸序列。
根据本发明实施例的抗体或其抗原结合片段具有增强的CD25结合特性,能有效阻断IL-2与CD25结合,进而抑制IL-2诱导的下游信号,抑制T细胞增殖、促进PBMC杀伤CD25阳性T细胞。该抗体或其抗原结合片段还具有更弱的抗体内吞活性,适于单抗、双抗药物开发。进一步地,利用所述抗体或其抗原结合片段制备的药物具有良好的清除或杀伤CD25阳性T细胞、阻断IL-2与CD25结合或抑制IL-2诱导的下游信号的特性,可用于预防和/或治疗CD25介导的疾病。由此,本发明的抗CD25抗体或其抗原结合片段具有良好的临床应用价值和药物开发价值。
在本发明的第二方面,本发明提出了一种缀合物。根据本发明的实施例,所述缀合物包括:本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。如前所述,本发明实施例的抗体或其抗原结合片段能够结合CD25并有效阻断IL-2与CD25结合,进而抑制IL-2诱导的下游信号,抑制T细胞增殖、促进PBMC杀伤CD25阳性T细胞;以及更弱的抗体内吞活性,适于单抗、双抗药物开发。由此,包括所述抗CD25抗体或其抗原结合片段的缀合物可进一步用于清除或杀伤CD25阳性T细胞、阻断IL-2与CD25结合或抑制IL-2诱导的下游信号、或者预防和/或治疗CD25介导的疾病。由此,包括本发明第一方面的抗CD25抗体或其抗原结合片段的缀合物具有良好的临床应用价值和药物开发价值。
在本发明的第三方面,本发明提出了一种核酸。根据本发明的实施例,所述核酸编码本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。根据本发明实施例的核酸编码的抗体或其抗原结合片段能够结合CD25并有效阻断IL-2与CD25结合,进而抑制IL-2诱导的下游信号、抑制T细胞增殖、促进PBMC杀伤CD25阳性T细胞;以及更弱的抗体内吞活性,适于单抗、双抗药物开发。进一步地,所述核酸编码的蛋白具有清除或杀伤CD25阳性T细胞、阻断IL-2与CD25结合或抑制IL-2诱导的下游信号的特性,以及良好的预防和/或治疗CD25介导的疾病的效果。
在本发明的第四方面,本发明提出了一种载体或转化子。根据本发明的实施例,所述载体或转化子含有本发明第三方面所述的核酸。由此,利用构建得到的载体或转化子,可有效表达本发明第一方面的抗体或其抗原结合片段,以及获得本发明第二方面的缀合物。
在本发明的第五方面,本发明提出了一种细胞。根据本发明的实施例,所述细胞携带本发明第三方面所述的核酸或本发明第四方面所述的载体或转化子,或表达本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。根据本发明的实施例,所述细胞在合适条件下可高效表达本发明第一方面的抗体或其抗原结合片段,进一步地,获得能够结合CD25并有效阻断IL-2与CD25结合,进而抑制IL-2诱导的下游信号、抑制T细胞增殖、促进PBMC杀伤CD25阳性T细胞,以及更弱的抗体内吞活性的抗体或其抗原结合片段。
在本发明的第六方面,本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例,所述药物组合物包括:本发明第一方面的抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面的缀合物、本发明第三方面的核酸或在本发明的第四方面的载体或转化子。由此,获得的药物可进一步用于清除或杀伤CD25阳性T细胞、阻断IL-2与CD25结合或抑制IL-2诱导的下游信号、或者预防和/或治疗CD25介导的疾病。
在本发明的第七方面,本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例,所述试剂盒包含本发明第一方面的抗体或其抗原结合片段。由此,获得的试剂盒可用于CD25相关研究,比如用于检测和/或富集和/或分离纯化人或其他哺乳动物的CD25。
在本发明的第八方面,本发明提出了本发明第一方面的抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒用于检测和/或富集和/或分离纯化CD25。本领域技术人员能够理解的是,前面针对抗体或其抗原结合片段的特征和优点,同样适用于该用途,在此不再赘述。
在本发明的第九方面,本发明提出了一种检测、富集或分离纯化CD25的方法。根据本发明的实施例,所述方法包含:采用本发明第一方面的抗体或其抗原结合片段或本发明第七方面的试剂盒中的抗体或其抗原结合片段与生物样品进行接触,所述生物样品中含有CD25。利用发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段与CD25的强结合性能以及阻断CD25和IL-2结合的性能,将其与生物样品接触,进而通过与CD25的特异性结合,实现CD25的检测、富集或分离纯化。
在本发明的第十方面,本发明提出了本发明第一方面的抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面的缀合物、本发明第三方面的核酸、在本发明的第四方面的载体或转化子或本发明第六方面的药物组合物在制备药物中的用途,所述药物用于清除CD25阳性T细胞、阻断IL-2与CD25结合、或者预防和/或治疗CD25介导的疾病。利用本发明的抗体或其抗原结合片段及其对应的缀合物、核酸、载体或转化子或药物组合物可进一步制备成药物,该药物在临床上可用于预防或治疗疾病。
本领域技术人员能够理解的是,前面针对抗体或其抗原结合片段、缀合物、核酸分子、载体或转化子和药物组合物所描述的特征和优点,同样适用于该用途,在此不再赘述。
有益效果:
(1)本发明的抗体能够结合人及猴CD25、阻断CD25和IL-2的结合、抑制IL-2下游信号;本发明的抗体具有ADCC效应,能够促进CD25阳性T细胞清除。由此,本发明的抗体或其抗原结合片段,可进一步用于自身免疫性疾病、移植排斥和癌症等免疫相关疾病的预防和/或治疗。
(2)本发明的抗体具有更弱的内吞活性,更适用于单抗、双抗开发,具有良好的药物开发前景。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1为本发明实施例2的CD25鼠源抗体54A7与人CD25蛋白结合的ELISA结果图;
图2为本发明实施例3的CD25鼠源抗体54A7与人外周血T细胞结合的流式细胞术结果图;
图3为本发明实施例4的CD25嵌合抗体54A7-hIgG1与人及猴CD25蛋白结合的ELISA结果图;
图4为本发明实施例5的CD25嵌合抗体54A7-hIgG1与人外周血T细胞结合的流式细胞术结果图;
图5为本发明实施例6的CD25嵌合抗体54A7-hIgG1与CHO-K1-human CD25细胞结合的流式细胞术结果图;
图6为本发明实施例6的CD25嵌合抗体54A7-hIgG1与CHO-K1-cynomolgus CD25细胞结合的流式细胞术结果图;
图7为本发明实施例7的CD25嵌合抗体54A7-hIgG1阻断CD25结合IL-2-Biotin的ELISA结果图;
图8为本发明实施例8的CD25嵌合抗体54A7-hIgG1抑制IL-2下游信号pSTAT5的流式细胞术结果图;
图9为本发明实施例9的CD25嵌合抗体54A7-hIgG1抑制T细胞增殖的流式细胞术结果图;
图10为本发明实施例10的CD25嵌合抗体54A7-hIgG1促进PBMC杀伤CD25阳性T细胞的结果图;
图11为本发明实施例11的CD25嵌合抗体54A7-hIgG1内吞活性的流式细胞术结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例,所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的,旨在用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
此外,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中,“多个”的含义是至少两个,例如两个,三个等,除非另有明确具体的限定。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值,这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说,各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间,以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围,这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
术语及定义
为了更容易理解本发明,以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义,否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
本文中,术语“抗体”通常是指可识别一种或多种抗原表位的抗体,包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、仅重链抗体、三链抗体、单链Fv(scFv)、纳米抗体等,并且还包括抗体片段,只要它们表现出所需的生物学活性(Miller等(2003)Jour.ofImmunology170:48544861)。抗体可以是鼠的、人的、人源化的、嵌合的、或来源于其他物种。抗体可以是指全长重链、全长轻链、完整免疫球蛋白分子;或这些多肽中的任一种的免疫活性部分,即包含免疫特异性结合感兴趣的靶抗原的抗原结合位点的分子或其部分,此类靶标包括但不限于癌细胞或产生与自身免疫病相关的自身免疫抗体的细胞。
本文中,在可变区中某些区域氨基酸组成和排列顺序具有更高的变化程度,称为“高变区(Hyperva riable region,HVR)”,高变区为抗原和抗体结合的位置,因此也称为决定簇互补区(complementarity-determining region,CDR)。重链可变区和轻链可变区上均有三个CDR区。例如,通常包括:轻链可变区中23-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)附近,和重链可变区中31-35B(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)附近的氨基酸残基(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Heal thService,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991));和/或来自“高变环”(例如,轻链可变区中26-32(LI)、50-52(L2)和91-96(L3),和重链可变区中26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)附近的氨基酸残基(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。
本文中,术语“CD25”是指白细胞介素2受体α链,或白介素2受体亚基α,等同于“p55”、“IL2RA”、“IMD41”、“TCGFR”、“IDDM10”。白细胞介素2(IL2)受体α(IL2RA)和β(IL2RB)链以及共同的γ链(IL2RG)构成高亲和力IL2受体。同源二聚体α链(IL2RA)产生低亲和力受体,而同源二聚体β(IL2RB)链产生中等亲和力受体。
本文中,术语“抗CD25抗体”是指能够结合CD25的抗体。这种抗体在本文中也称为“结合CD25的抗体”。
本文中,术语“抗原结合片段”等同于“抗体片段”或“抗原结合性抗体片段”,可以包括完整抗体的一部分,一般是抗原结合区或可变区。包括不限于:Fv、scFv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、scFv-Fc片段或者双抗体(Bispecific antibodies,BsAbs)、线性抗体或者通过化学修饰或通过掺入脂质体中应能够增加半衰期的任何片段,所述化学修饰例如添加聚(亚烷基)二醇,如聚乙二醇(“聚乙二醇化,PEG化”)(被称为Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab’)2-PEG或Fab’-PEG的聚乙二醇化片段)(“PEG”为聚乙二醇)。
本文中,术语“嵌合抗体”是指利用重组DNA技术,将来自一个物种(如小鼠)的单克隆抗体的恒定区氨基酸序列替换为来自另一个物种(如人)的抗体的恒定区而获得的重组抗体。
本文中,术语“人源化抗体”是指利用重组DNA技术,将来自一个物种(如小鼠)的单克隆抗体的恒定区和可变区的非CDR(Fv骨架区(FR))氨基酸序列全部替换为来自另一个物种(如人)的抗体的恒定区和可变区的非CDR氨基酸序列而获得的重组抗体。也即,一个抗体的恒定区被人源化时称为嵌合抗体,而恒定区和可变区的非CDR氨基酸序列全部人源化后称为人源化抗体。人源化的方法可以参照常规的抗体工程技术进行,在此不再赘述。
对于核苷酸而言,术语“同源性”用来描述或比较两个或更多个核苷酸序列的核苷酸相似程度。可以通过将[第一序列中与相应位置的核苷酸相同的核苷酸的数目相除]来计算第一序列和第二序列之间的“序列同源性”的百分比。第二个序列中的核苷酸]减去[第一个序列中核苷酸的总数],然后乘以[100%],其中第二个核苷酸序列中每个核苷酸的缺失,插入,取代或添加-相对于第一核苷酸序列-被认为是单个核苷酸(位置)上的差异。或者,可以使用标准设置,使用用于序列比对的已知计算机算法,例如NCBI Blast v2.0,计算两个或多个核苷酸序列之间的序列同一性程度。用于确定序列同一性程度的一些其他技术,计算机算法和设置例如在WO 04/037999,EP 0 967 284,EP 1 085 089,WO 00/55318,WO 00/78972,WO 98/49185和GB 2357768-A。
对于多肽而言,术语“(实质)同源性”用来描述或比较两个或更多个多肽或其指定序列在最佳比对及比较(其中适当插入或缺失核苷酸)时的氨基酸相似程度。两条序列之间的同源性%在最佳比对序列时随这些序列所共享的相同位置数而变化(即同源性%=相同位置数/总位置数×100),其中最佳比对系考虑到为达成两条序列的最佳比对而需要引入的空位数及每一空位的长度来确定。两条序列之间的序列比较及同一性百分数测定可使用数学算法来完成,如下文非限制性实施例中所述。
本文中,术语“保守修饰形式的氨基酸序列”指这样的氨基酸修饰,所述修饰不显著影响或改变包含该氨基酸序列的抗体的结合特性,该修饰包括氨基酸置换、增加和缺失。修饰可通过例如定点诱变和PCR介导的诱变等标准技术引入本发明的抗体中。保守氨基酸置换系其中的氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的置换。在本领域中已经确定具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸),具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸),具有不带电的极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸),具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸),具有β-支化侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、和具有芳香侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
在本文中,术语“缀合物”,结合上下文理解,是指使用任何共价或非共价生物缀合策略与偶联部分比如载体物质、药物、毒素、细胞因子、蛋白标签、修饰物、治疗剂和化疗剂等缀合的抗体或其抗原结合片段。
在本文中,术语“载体”通常是指能够插入在合适的宿主中自我复制的核酸分子,其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体,以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常,通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞,所述载体可以产生期望的表达产物。
在本文中,术语“药物组合物”通常是指单位剂量形式,并且可以通过制药领域中熟知的方法的任何一种进行制备。所有的方法包括使活性成分与构成一种或多种附属成分的载体相结合的步骤。通常,通过均匀并充分地使活性化合物与液体载体、细碎固体载体或这两者相结合,制备组合物。
在本文中,术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的,即具有合理的效益/风险比的物质。
在本文中,术语“药学上可接受的辅料”均可包括任何溶剂、固体赋形剂、稀释剂或其他液体赋形剂等等,适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本发明的化合物不相容的范围,例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用,它们的用途也是本发明所考虑的范围。
在本文中,术语“给药”指将预定量的物质通过某种适合的方式引入病人。本发明的抗体或抗原结合片段、重组蛋白、多特异性抗体、偶联物或药物组合物可以通过任何常见的途径被给药,只要它可以到达预期的组织。给药的各种方式是可以预期的,包括腹膜、静脉注射、肌肉注射、皮下注射等等,但是本发明不限于这些已举例的给药方式。优选地,本发明的组合物采用静脉注射或皮下注射方式被给药。
在本文中,术语“治疗”是指用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的,和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病,包括:(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生;(b)抑制疾病,例如阻滞疾病发展;或(c)缓解疾病,例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药,包括但不限于将含本文所述化合物的药物给予有需要的个体。
如本文所用,术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
本发明提出了一种抗CD25抗体或其抗原结合片段及其缀合物、对应核酸分子、载体或转化子、细胞、药物组合物、试剂盒及其应用,下面将分别对其进行详细描述。
抗CD25抗体或其抗原结合片段
本发明提供一种抗CD25抗体或其抗原结合片段。所述抗CD25抗体或其抗原结合片段包括:重链可变区CDRs和轻链可变区CDRs,其中,
重链可变区CDRs具有如SEQ ID NO:1~3所示或其保守修饰形式的氨基酸序列;
轻链可变区CDRs具有如SEQ ID NO:4~6所示或其保守修饰形式的氨基酸序列。
本发明的抗体或其抗原结合片段具有增强的CD25结合特性,能有效阻断IL-2与CD25结合,进而抑制IL-2诱导的下游信号,抑制T细胞增殖、促进PBMC杀伤CD25阳性T细胞。该抗体或其抗原结合片段还具有更弱的抗体内吞活性,适于单抗、双抗药物开发。进一步地,利用所述抗体或其抗原结合片段制备的药物具有良好的清除或杀伤CD25阳性T细胞、阻断IL-2与CD25结合或抑制IL-2诱导的下游信号的特性,可用于预防和/或治疗CD25介导的疾病。由此,本发明的抗CD25抗体或其抗原结合片段具有良好的临床应用价值和药物开发价值。
需要说明的是,本发明的抗体或其抗原结合片段CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替代,并且使可用本文中说明的功能测定方法对经改变的抗体的保留功能进行测试。优选的是,保守修饰在数目上不超过1个或2个。
根据本发明的实施例,所述抗体或其抗原结合片段包含:如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区CDR1,如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的重链可变区CDR2,如SEQID NO:3所示的氨基酸序列的重链可变区CDR3,如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的轻链可变区CDR1,如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的轻链可变区CDR2,如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
需要说明的是,所述抗原结合片段将由其来源抗体的重链可变区或轻链可变区的部分序列构成或者包含轻、重链可变区的部分序列,所述部分序列足以保留与其来源抗体相同的结合特异性和充分的亲和力。
根据本发明的实施例,所述抗体或其抗原结合片段包含重链框架区和/或轻链框架区。
根据本发明的实施例,所述重链框架区和/或轻链框架区的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体、牛源抗体、马源抗体、乳牛源抗体、猪源抗体、绵羊源抗体、山羊源抗体、狗源抗体、猫源抗体、兔源抗体、骆驼源抗体、驴源抗体、鹿源抗体、貂源抗体、鸡源抗体、鸭源抗体、鹅源抗体、火鸡源抗体、斗鸡源抗体或其突变体中的至少之一。
根据本发明的实施例,重链框架区和/或轻链框架区的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体和灵长目源抗体中的至少之一。
需要说明的是,为了进一步提高抗体的生物可接受性,还可以对抗体进行人源化,即,所述抗体为嵌合抗体或人源化抗体。
如前所述,本发明的抗体或其抗原结合片段的重链或轻链可变区中的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替代,并且使可用本文中说明的功能测定方法对经改变的抗体的保留功能进行测试。
根据本发明的实施例,所述抗体或其抗原结合片段包含:如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的重链可变区;和/或,如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的轻链可变区。
需要说明的是,在不实质性影响抗体或其抗原结合片段CD25结合活性(保留至少95%的活性)的前提下,本领域技术人员可以对本发明的抗体或其抗原结合片段的重链或轻链可变区氨基酸序列替换、添加和/或缺失一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸,以获得所述抗体或其抗原结合片段之序列的变体。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。如在重链或轻链可变区将具有类似性质的氨基酸进行替换。本发明上述变体的序列可以与参比序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性(或同源性)。本发明所述的序列一致性可以使用序列分析软件测量。例如使用缺省参数的计算机程序BLAST,尤其是BLASTP或TBLASTN。
根据本发明的实施例,所述重链可变区包含与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少90%序列同源性的氨基酸序列;和/或,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少90%序列同源性的氨基酸序列。
根据本发明的实施例,所述抗体或其抗原结合片段进一步包含恒定区;其中,所述恒定区包括重链恒定区和轻链恒定区中的至少之一。
根据本发明的实施例,所述重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体、牛源抗体、马源抗体、乳牛源抗体、猪源抗体、绵羊源抗体、山羊源抗体、狗源抗体、猫源抗体、兔源抗体、骆驼源抗体、驴源抗体、鹿源抗体、貂源抗体、鸡源抗体、鸭源抗体、鹅源抗体、火鸡源抗体、斗鸡源抗体或其突变体中的至少之一。
需要说明的是,本文述及的免疫球蛋白可为任何类型(例如,IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如,IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子,包括具有改变的Fc部分的工程化亚类,其提供降低的或增强的效应细胞活性。免疫球蛋白可来源于任何物种。
根据本发明的实施例,所述重链恒定区包括选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的重链恒定区;和/或,所述轻链恒定区包括选自κ型或λ型轻链恒定区。
在一些具体的实施中,所述重链恒定区包括选自人IgG、IgA、IgM、IgE或IgD,例如人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4、人IgA、人IgM、人IgE或人IgD的重链恒定区。
在一些具体的实施方案中,所述重链恒定区包括选自鼠IgG、IgA、IgM、IgE或IgD,例如鼠IgG1、鼠IgG2a、鼠IgG2b、鼠IgG2c、鼠IgG3、鼠IgA、鼠IgM、鼠IgE或鼠IgD的重链恒定区。
根据本发明的实施例,所述轻链恒定区和重链恒定区均来自于鼠源抗体或其突变体,或者人源抗体或其突变体。
需要说明的是,本发明述及的氨基酸序列均按照N端至C端的方式示出。
根据本发明的实施例,所述重链恒定区的N端与所述重链可变区的C端相连;和/或所述轻链恒定区的N端与所述轻链可变区的N端相连。
如前所述,在不实质性影响抗体或其抗原结合片段CD25结合活性(保留至少95%的活性)的前提下,本领域技术人员可以对本发明的抗体或其抗原结合片段的重链或轻链恒定区的氨基酸序列替换、添加和/或缺失一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸,以获得所述抗体或其抗原结合片段之序列的变体。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。如在重链或轻链恒定区将具有类似性质的氨基酸进行替换。本发明上述变体的序列可以与参比序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性(或同源性)。
根据本发明的实施例,所述重链恒定区具有如SEQ ID NO:21或23所示的氨基酸序列或与其具有至少80%同一性的氨基酸序列;和/或所述轻链恒定区具有如SEQ ID NO:22或24所示的氨基酸序列或与其具有至少80%同一性的氨基酸序列。
根据本发明的实施例,所述重链恒定区和轻链恒定区具有如SEQ ID NO:21和SEQID NO:22所示的氨基酸序列;和/或所述重链恒定区和轻链恒定区具有如SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例,所述抗体或抗原结合片段包含:如SEQ ID NO:10或12所示的氨基酸序列或与其具有至少90%同源性的氨基酸序列的重链;和/或如SEQ ID NO:11或13所示的氨基酸序列或与其具有至少90%同源性的氨基酸序列的轻链。
根据本发明的实施例,所述抗体或抗原结合片段包括:如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或与其具有至少80%同源性的氨基酸序列的重链,和如SEQ ID NO:11任一项所示的氨基酸序列或与其具有至少80%同源性的氨基酸序列的轻链;或者如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或与其具有至少80%同源性的氨基酸序列的重链,和如SEQ ID NO:13任一项所示的氨基酸序列或与其具有至少80%同源性的氨基酸序列的轻链。
如前所述,本发明的抗体可以是全长的(例如,IgG1或IgG4抗体)或仅包含抗原结合部分(例如,Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2或Fv、scFv片段),或可以被修饰影响功能。本发明包括具有修饰的糖基化模式的抗CD25抗体。在一些实施方式中,进行修饰以除去不期望的糖基化位点可以是有用的,或在寡糖链上不存在岩藻糖部分以例如增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能的抗体。在另一些实施方式中,可进行半乳糖基化修饰以改变补体依赖性细胞毒性(CDC)。
根据本发明的实施例,所述抗体为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、Fv、scFv、Fab、Fab’、Fab’-SH或F(ab’)2;所述抗体的抗原结合片段包括:选自F(ab’)2片段、Fab’片段、Fab片段、F(ab)2片段、Fv片段、scFv片段、scFv-Fc融合蛋白、scFv-Fv融合蛋白和最小识别单位中的至少之一。
缀合物
本发提供一种缀合物。所述缀合物包括:上述的抗体或其抗原结合片段;缀合部分,所述的抗体或其抗原结合片段与缀合部分相连。如前所述,包括上述抗CD25抗体或其抗原结合片段的缀合物可进一步用于清除或杀伤CD25阳性T细胞、阻断IL-2与CD25结合或抑制IL-2诱导的下游信号、或者预防和/或治疗CD25介导的疾病。由此,包括本发明第一方面的抗CD25抗体或其抗原结合片段的缀合物具有良好的临床应用价值和药物开发价值。
根据本发明的实施例,所述偶联部分包括选自为载体、药物、毒素、细胞因子、蛋白标签、修饰物、治疗剂和化疗剂中的至少之一。
核酸
本发提供一种核酸。所述核酸编码上述的抗体或其抗原结合片段。如前所述,所述核酸编码的抗体或其抗原结合片段具有清除或杀伤CD25阳性T细胞、阻断IL-2与CD25结合或抑制IL-2诱导的下游信号的特性,以及良好的预防和/或治疗CD25介导的疾病的效果。
需要说明的是,对于本文中所提及的核酸分子,本领域技术人员应当理解,实际包括互补双链的任意一条,或者两条。为了方便,在本文中,虽然多数情况下只给出了一条链,但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外,本发明中的分子序列包括DNA形式或RNA形式,公开其中一种,意味着另一种也被公开。
根据本发明的实施例,所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:25、26所示。
根据本发明的实施例,所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:27、28所示。
载体或转化子
本发明提供一种载体或转化子。所述载体或转化子含有上述的核酸。所述载体或转化子可包括可选的控制序列,所述控制序列与所述核酸分子可操作地连接。其中,所述控制序列为可指导所述核酸分子在宿主中表达的一个或多个控制序列。由此构建得到的载体或转化子,可有效表达本发明第一方面的抗体或其抗原结合片段,以及获得本发明第二方面的缀合物。
在将上述核酸分子连接到所述载体或转化子上,比如表达载体上时,可以将所述核酸分子与表达载体上的控制元件直接或者间接相连,只要这些控制元件能够控制所述核酸分子的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于载体本身,也可以是外源性的,即并非来自于载体本身。所述核酸分子与控制元件进行可操作地连接即可。
根据本发明的实施例,所述载体可以指克隆载体,也可以指表达载体,可以通过将所述核酸与商购的载体(如质粒或病毒载体)可操作地连接而获得。本发明中的载体不受特别限制,常用的质粒均可使用,如pSeTag2、PEE14、pMH3等。
在本文中,术语“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上,使得载体内的控制元件,例如转录控制序列和翻译控制序列等等,能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。常用的载体例如可以为病毒载体、质粒、噬菌体等等。根据本发明的一些具体实施例的表达载体导入合适的受体细胞后,可在调控系统的介导下,有效实现前面所述的核酸分子的表达,进而实现所述核酸分子编码的蛋白质的体外大量获得。
根据本发明的实施例,所述载体为真核载体或原核载体。
根据本发明的实施例,所述载体包括选自质粒载体、腺病毒载体、慢病毒载体和腺相关病毒载体中的至少之一。
细胞
本发明提供一种细胞。所述细胞携带有上述的核酸、上述的载体或转化子,或表达上述的抗体或其抗原结合片段。由此,获得的细胞在在合适条件下可高效表达本发明第一方面的抗体或其抗原结合片段,进一步地,获得能够结合CD25并有效阻断IL-2与CD25结合,进而抑制IL-2诱导的下游信号、抑制T细胞增殖、促进PBMC杀伤CD25阳性T细胞,以及更弱的抗体内吞活性的抗体或其抗原结合片段。
根据本发明的实施例,所述细胞为原核细胞、真核细胞或噬菌体。
根据本发明的实施例,所述原核细胞为大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌或奇异变形菌。
根据本发明的实施例,所述真核细胞为真菌、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。
根据本发明的实施例,所述真菌为巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母或木霉。
根据本发明的实施例,所述昆虫细胞为草地粘虫细胞;根据本发明的实施例,所述植物细胞是烟草植物细胞;根据本发明的实施例,所述哺乳动物细胞为BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞或人胚肾293细胞;且不包括动物生殖细胞、受精卵或胚胎干细胞。
根据本发明的实施例,所述细胞是哺乳动物细胞。
根据本发明的实施例,所述细胞是BHK细胞、CHO细胞、COS细胞或NSO细胞。
需要说明的是,本申请说明书中所述的“适合条件”,是指适合本申请所述抗体或其抗原结合片段表达的条件。本领域技术人员容易理解的是,适合抗体或其抗原结合片段表达的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“适合条件”不受特别限制,本领域技术人员可根据实验室的具体环境,优化最适的所述重组抗体表达的条件。
药物组合物
本发明提供一种药物组合物。所述药物组合物包含:上述的抗体或其抗原结合片段、上述的缀合物、上述的核酸、或者上述的载体或转化子。由此,获得的药物可进一步用于清除或杀伤CD25阳性T细胞、阻断IL-2与CD25结合或抑制IL-2诱导的下游信号、或者预防和/或治疗CD25介导的疾病,效果显著。
根据本发明的实施例,进一步包括药学上可接受的辅料。
根据本发明的实施例,所述辅料包括:药学上可接受的一种或多种赋形剂、稀释剂、稳定剂或载体。
根据本发明的实施例,所述药物组合物为注射剂。
需要说明的是,所述药物组合物包括在时间和/或空间上分开的组合,只要其能够共同作用以实现本发明的目的。例如,所述组合物中所含的成分可以以整体施用于受试者,或者分开施用于受试者。当所述组合物中所含的成分分开地施用于受试者时,各个成分可以同时或依次施用于受试者。
本发明的药物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的辅料。这类辅料包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配,本发明的药物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物宜在无菌条件下制造。
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于:所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等;患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如,由治疗状况的迫切要求,可每天给予若干次分开的剂量,或将剂量按比例地减少。
本发明所述的药学上可接受的辅料包括(但不限于):水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配,这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
试剂盒
本发明提供一种试剂盒。所述试剂盒包含上述的抗体或其抗原结合片段。如前所述,本发明实施例的抗体或其抗原结合片段能够有效地与CD25特异性结合,利用该特性开发得到的CD25相关试剂盒,可用于CD25相关研究,比如用于检测和/或富集和/或分离纯化人或其他哺乳动物的CD25。
所述试剂盒可以有效检测、富集或分离纯化生物样品中的CD25,进一步用于科学研究,如定性或定量检测生物样本中的CD25蛋白分子。更具体地,可以用于免疫印迹、免疫沉淀等涉及到利用CD25和抗体特异性结合性能来检测的试剂盒等。这些试剂盒可包含下列中的任意一种或多种:拮抗剂、CD25抗体或者药物参照材料;蛋白纯化柱;免疫球蛋白亲和纯化缓冲剂;细胞的测定稀释剂。CD25抗体可被用于不同类型的诊断测试,例如可以在体外或者体内检测各种各样的疾病或者药物、毒素或者其他蛋白等的存在。例如可以通过对受试者的血清或者血液进行检测,用来测试CD25相关疾病。
制备试剂盒中的用途
本发明提供上述的抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒用于检测和/或富集和/或分离纯化CD25。
根据本发明的实施例,所述试剂盒通过ELISA法、流式细胞术、免疫印迹法或免疫沉淀法检测CD25。
根据本发明的实施例,所述试剂盒通过亲和层析法富集和/或分离纯化CD25。
如前所述,本发明实施例的抗体或其抗原结合片段能够与CD25特异性结合,因此,所述抗体或其抗原结合片段可用于检测CD25。进一步地,可用于制备CD25相关试剂盒并用于科学研究,比如定性或定量检测生物样本中的CD25蛋白分子。更具体地,可以用于免疫印迹、免疫沉淀等涉及到利用CD25和抗体或其结合片段特异性结合性能来检测的试剂盒等。这些试剂盒可包含下列中的任意一种或多种:拮抗剂、CD25抗体或者药物参照材料;蛋白纯化柱;免疫球蛋白亲和纯化缓冲剂;细胞的测定稀释剂。CD25抗体或抗原片段可被用于不同类型的诊断测试,例如可以在体外或者体内检测各种各样的疾病或者药物、毒素或者其他蛋白等的存在。例如可以通过对受试者的血清或者血液进行检测,用来测试CD25相关疾病。
方法
本发明提供一种检测、富集或分离纯化CD25的方法。所述方法包含:采用上述的抗体或其抗原结合片段或上述的试剂盒中的抗体或其抗原结合片段与生物样品进行接触,所述生物样品中含有CD25。如前所述,本发明实施例的抗体或其抗原结合片段能够与CD25特异性结合,利用该特性开发的CD25研究方法,比如检测和/或富集和/或分离纯化人或其他哺乳动物CD25的方法,可进一步用于CD25相关研究,比如用于检测和/或富集和/或分离纯化人或其他哺乳动物的CD25等。
制备药物中的用途
本发明提供上述的抗体或其抗原结合片段、上述的缀合物、上述的核酸、上述的载体或转化子或上述的药物组合物在制备药物中的用途,所述药物用于清除CD25阳性T细胞、阻断IL-2与CD25结合或者预防和/或治疗CD25介导的疾病。
根据本发明的实施例,所述CD25介导的疾病为炎性病或免疫相关疾病;
根据本发明的实施例,所述免疫相关疾病包括移植排斥、自身免疫病、感染性疾病、癌症或肿瘤。
根据本发明的实施例,移植排斥为同种异体移植物或异种移植物排斥。
根据本发明的实施例,所述炎性病或免疫相关疾病选自类风湿关节炎、强直性脊柱炎、牛皮癣性关节炎、1型糖尿病、胰岛素依赖性2型糖尿病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、重症肌无力、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、皮肤多肌炎、干燥综合征、动脉炎(包括巨细胞性动脉炎)、再生障碍性贫血、哮喘、硬皮病、葡萄膜炎、牛皮癣、掌跖脓疱病、腐蚀性扁平苔藓、大疱性天疱疮、大疱性表皮松解症、接触性皮炎和特应性皮炎中的至少一种。
根据本发明的实施例,所述癌症为肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤、肾癌、胃癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌和头颈癌中的至少一种。
在一些具体实施方案中,所述肿瘤包括但不限于癌、淋巴瘤、白血病、胚细胞瘤和肉瘤。这类癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌、骨髓瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞癌(HCC)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性髓性白血病(AML)、多种骨髓瘤、胃肠(道)癌、肾癌、卵巢癌、肝脏癌、淋巴母细胞白血病、淋巴细胞白血病、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、软骨肉瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性胶质母细胞瘤、宫颈癌、脑癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌和头颈癌。
在一些具体实施方案中,所述癌症或肿瘤可以是实体瘤,包括但不限于肉瘤(包括由组织(例如松质骨、软骨、脂肪、肌肉、血管、造血细胞或纤维结缔组织)中的间充质来源的转化细胞产生的癌症)、癌(包括由上皮细胞产生的肿瘤)、间皮瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤等。涉及实体瘤的癌症包括但不限于,脑癌、肺癌、胃癌、十二指肠癌、食道癌、乳腺癌、结肠和直肠癌、肾癌、膀胱癌、肾脏癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、口腔癌、肉瘤、眼癌、甲状腺癌、尿道癌、阴道癌、颈癌、淋巴瘤等。
在一些具体实施方案中,所述癌症涉及表达CD25的肿瘤,包括但不限于淋巴瘤,例如霍奇金淋巴瘤和淋巴细胞性白血病,例如慢性淋巴细胞白血病(CLL)。
疾病治疗方法
本发明提供了一种预防和/或治疗CD25介导的疾病的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:向受试者施用药学上可接受量的上述的抗体或其抗原结合片段、上述的缀合物、上述的核酸、上述的载体或转化子或上述的药物组合物。
需要说明的是,术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文可互换使用,是指被评估用于治疗和/或被治疗的哺乳动物。在一个实施方案中,哺乳动物为人。术语“受试者”、“个体”和“患者”包括但不限于患有癌症的个体、患有自身免疫性疾病的个体、患有病原体感染的个体等。受试者可以是人,但也包括其他哺乳动物,特别是可用作人疾病的实验室模型的哺乳动物,例如小鼠、大鼠等。
本发明所述的抗体或其抗原结合片段、缀合物、核酸、载体或转化子或药物组合物的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于:所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等;患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如,由治疗状况的迫切要求,可每天给予若干次分开的剂量,或将剂量按比例地减少。
在一些具体实施方案中,上述受试者的移植排斥表现为同种异体移植物或异种移植物排斥,出现在正在进行或已经进行过器官或组织移植的患者体内,所述移植如心脏,肺,组合的心脏肺,气管,肾脏,肝脏,胰腺,食管,肠,皮肤,肢体,脐带,干细胞,胰岛细胞移植等。
在一些具体实施方案中,上述受试者的病症选自炎性病、免疫病或自身免疫病,如类风湿关节炎,强直性脊柱炎、牛皮癣性关节炎、1型糖尿病、胰岛素依赖性2型糖尿病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、重症肌无力、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、皮肤多肌炎、干燥综合征、动脉炎(包括巨细胞性动脉炎)、再生障碍性贫血、哮喘、硬皮病和葡萄膜炎;炎性或过度增殖性皮肤病,例如,牛皮癣,包括斑块牛皮癣,掌跖脓疱病(pustulosispalmoplantaris)(PPP),腐蚀性扁平苔藓,大疱性天疱疮(pemphigus bullosa),大疱性表皮松解症,接触性皮炎和特应性皮炎。
在一些具体实施方案中,上述受试者的病症为增殖性病症(例如癌症或肿瘤)或患有增殖性病症(例如癌症或肿瘤)。所述肿瘤包括但不限于癌、淋巴瘤、白血病、胚细胞瘤和肉瘤。这类癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌、骨髓瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞癌(HCC)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性髓性白血病(AML)、多种骨髓瘤、胃肠(道)癌、肾癌、卵巢癌、肝脏癌、淋巴母细胞白血病、淋巴细胞白血病、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、软骨肉瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性胶质母细胞瘤、宫颈癌、脑癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌和头颈癌。
在一些具体实施方案中,所述癌症或肿瘤可以是实体瘤,包括但不限于肉瘤(包括由组织(例如松质骨、软骨、脂肪、肌肉、血管、造血细胞或纤维结缔组织)中的间充质来源的转化细胞产生的癌症)、癌(包括由上皮细胞产生的肿瘤)、间皮瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤等。涉及实体瘤的癌症包括但不限于,脑癌、肺癌、胃癌、十二指肠癌、食道癌、乳腺癌、结肠和直肠癌、肾癌、膀胱癌、肾脏癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、口腔癌、肉瘤、眼癌、甲状腺癌、尿道癌、阴道癌、颈癌、淋巴瘤等。
在一些具体实施方案中,所述癌症涉及表达CD25的肿瘤,包括但不限于淋巴瘤,例如霍奇金淋巴瘤和淋巴细胞性白血病,例如慢性淋巴细胞白血病(CLL)。
本发明所涉及的序列说明详见表1。
表1氨基酸/核苷酸序列说明表
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以下将通过实施例对本发明进行详细描述。实施例或测试例中,未注明具体条件的实验方法的,均按照常规条件进行。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1本发明抗CD25抗体的制备
杂交瘤技术被用于筛选获得目标蛋白CD25鼠源单克隆抗体,基因重组技术被用于获得目标蛋白的CD25嵌合抗体、人源抗体、灵长目源抗体、牛源抗体、马源抗体、乳牛源抗体、猪源抗体、绵羊源抗体、山羊源抗体、狗源抗体、猫源抗体、兔源抗体、骆驼源抗体、驴源抗体、鹿源抗体、貂源抗体、鸡源抗体、鸭源抗体、鹅源抗体、火鸡源抗体、斗鸡源抗体或其突变体。示例性地,本实施例CD25鼠源单克隆抗体(CD25鼠源抗体54A7)的筛选及制备方法、CD25嵌合抗体(CD25嵌合抗体54A7-hI gG1)的制备方法如下。
1、CD25鼠源抗体54A7筛选及本发明抗CD25抗体制备
CD25鼠源抗体筛选方法:通过生成针对人CD25的鼠源单克隆抗体,然后用纯化的重组CD25胞外区His标签融合蛋白(CD25-His)(购自Acro)作为抗原,免疫Balb/c小鼠(9周龄,购自上海莱斯克,体重20g左右)。免疫小鼠使用纯化抗原和完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂进行3次免疫,通过尾静脉放血后检测免疫应答。通过ELISA、流式细胞术筛选血清,获取有抗人CD25免疫球蛋白的小鼠。并对有最高的抗CD25免疫球蛋白的小鼠取出脾细胞与鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞(ATCC编号CRL-1581)进行融合。融合后的杂交瘤细胞进行抗体筛选,得到CD25鼠源抗体,即CD25鼠源抗体54A7。
CD25鼠源54A7抗体基因重组技术制备方法:将候选杂交瘤细胞总数量培养到106,800rpm离心10分钟收集细胞,并以Trizol试剂盒(Invitrogen)提取总RNA;以总RNA为模板,逆转录合成cDNA文库(Invitrogen),又以cDNA为模板PCR扩增杂交瘤细胞的所对应的可变区核酸序列。PCR扩增反应中所使用的引物序列与抗体可变区第一框架区或信号肽区和恒定区互补(Larrick,J.W.,et al.,(1990)Scand.J.Immunol.,32,121-128和Coloma,J.J.etal.,(1991)BioTechniques,11,152-156)。在50μl反应体系中,分别加入cDNA 2μl,10×PCR缓冲液5μl,上游及下游引物2μl(5μmol),dNTP 2μl,Taq酶1μl(Takara,Ex Taq),H2O 38μl;95℃预变性5min,进入温度循环,进行PCR扩增。反应条件为:94℃变性30S,58℃退火45S,72℃延伸50S,共32个循环,然后72℃延长7min。将扩增产物测序后,得到鼠源54A7抗体的重链和轻链可变区序列(重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示,以及轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示),得到CD25鼠源抗体54A7的重链和轻链序列(重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示,以及轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示)。
参照CD25鼠源抗体54A7轻链可变区序列和重链可变区氨基酸序列,设计并制备本发明的CD25嵌合抗体54A7-hIgG1,其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示,轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。具体制备方法可以参照常规的抗体工程技术进行,在此不再赘述。
2、抗体的生产,具体实验操作如下:(1)利用ExpiCHO Expression Medium培养基(购自Thermo Fisher)培养ExpiCHO细胞(购自Thermo Fisher),调整细胞浓度为6×106/mL,以获得ExpiCHO细胞溶液。(2)将含有编码抗体重链和抗体轻链的核酸序列的pcDNA3.4载体(委托南京金斯瑞合成)按照1:1的比例加入2mL OptiSFM培养基(购自Thermo Fisher)中,获得溶液A。(3)将160μLExpiFectamineCHO转染试剂(购自Thermo Fisher)加入2mLOptiSFM培养基(购自Thermo Fisher)中,获得溶液B。(4)然后将溶液A和溶液B混合,获得转染混合物,并在5分钟内将转染混合物全部加入50mL ExpiCHO细胞溶液中。(5)在37℃、5%CO2条件下培养1天后,加入8mL Feed、300μL Enhancer(购自Thermo Fisher),并转入32℃、5% CO2条件下培养9天后收获培养上清,其中第5天添加8mL Feed。(6)利用Protein A纯化柱(购自纳微)从培养上清中亲和纯化,获得目的抗体。
实施例2本发明的CD25鼠源抗体ELISA结合实验
ELISA实验被用于检测CD25抗体的结合特性。在本实施例中,CD25胞外区His标签融合蛋白包被到96孔板中,抗体加入后信号的强弱用于判断抗体和CD25蛋白的结合特性。
用PBS缓冲液将人CD25-His蛋白(购自Acro)稀释为2μg/ml,以100μl/孔的体积加于96孔板中,于4℃放置过夜。将96孔板中PBS缓冲液吸掉,用PBST(pH7.2 PBS含0.1%Tween 20)缓冲液洗板6次后,加入200μl/孔PBS/10% BSA,37℃孵育2h进行封闭。移去封闭液,用PBST洗板6次后,加入100μl/孔用PBST/0.05% BSA梯度稀释的待测本发明实施例1得到的CD25鼠源54A7抗体(重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示,以及轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示),37℃孵育1h。移去反应体系,用PBST洗板6次后,以100μl/孔用PBST/0.05% BSA稀释HRP(辣根过氧化物酶)标记的抗鼠IgG抗体二抗(购自Jacksonlab),37℃孵育1h。用PBST洗板6次后,加入80μl/孔TMB(四甲基联苯胺),于室温孵育3min,加入80μl/孔4M硫酸终止反应。用酶标仪在450mm处读取吸光值。
结果如图1所示。实验结果表明:本发明的CD25鼠源抗体54A7能够结合CD25蛋白。
实施例3本发明的CD25鼠源抗体流式细胞术结合实验
流式细胞术实验被用于检测鼠源CD25抗体的结合特性。在本实施例中,向人外周血T细胞中加入CD25抗体,抗体加入后信号的强弱用于判断抗体和CD25的结合特性。
用PBS将人外周血T细胞稀释为2×106/ml(购自赛笠生物),以100μl/管的体积加于1.5ml EP管中,向其中加入10μl/管山羊血清,于4℃封闭30min。加入不同浓度梯度的本发明实施例1得到的CD25鼠源抗体54A7(重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示,以及轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示)、mIgG1(购自义翘神州),于4℃孵育30min。向EP管中加入1ml PBS,在4℃、3500rpm条件下离心5min,弃尽上清,再用PBS洗一遍。离心后弃尽上清,用100μl/管PBS重悬细胞,向其中加入1μl/管Alexa-647标记的山羊抗小鼠IgG抗体二抗(购自Biolegend),4℃避光孵育30min。用PBS洗两遍,离心后弃尽上清。用200μl/管PBS重悬细胞,用流式细胞仪进行检测。结果如图2所示。
实验结果进一步显示:本发明的CD25鼠源抗体54A7能够结合T细胞。
实施例4本发明的CD25嵌合抗体ELISA结合实验
ELISA实验被用于检测CD25抗体的结合特性。在本实施例中,人、猴CD25胞外区His标签融合蛋白包被到96孔板中,抗体加入后信号的强弱用于判断抗体和CD25蛋白的结合特性。
用PBS缓冲液将人、猴CD25-His蛋白(购自Acro,人源CD25的氨基酸序列如SEQ IDNO:9所示,食蟹猴Cynomolgus CD25的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示)稀释为2μg/ml,以100μl/孔的体积加于96孔板中,于4℃放置过夜。将96孔板中PBS缓冲液吸掉,用PBST(pH7.2PBS含0.1% Tween 20)缓冲液洗板6次后,加入200μl/孔PBS/10% BSA,37℃孵育2h进行封闭。移去封闭液,用PBST洗板6次后,加入100μl/孔用PBST/0.05% BSA梯度稀释的、待测本发明实施例1得到的CD25嵌合抗体54A7-hIgG1(重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示,以及轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示)、对照CD25抗体AB917-hIgG1(重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示,以及轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示)、hIgG1(购自百英生物),37℃孵育1h。移去反应体系,用PBST洗板6次后,以100μl/孔用PBST/0.05% BSA稀释HRP(辣根过氧化物酶)标记的抗人IgG抗体二抗(购自Southern Biotech),37℃孵育1h。用PBST洗板6次后,加入80μl/孔TMB(四甲基联苯胺),于室温孵育3min,加入80μl/孔4M硫酸终止反应。用酶标仪在450mm处读取吸光值。结果如图3所示。
实验结果表明:表明本发明的CD25嵌合抗体54A7-hIgG1能够结合人及猴CD25蛋白。
实施例5本发明的CD25嵌合抗体流式细胞术CD25结合实验
流式细胞术实验被用于检测CD25抗体的结合特性。在本实施例中,向人外周血T细胞中加入CD25抗体,抗体加入后信号的强弱用于判断抗体和CD25的结合特性。
用PBS将人外周血T细胞稀释为2×106/ml(购自赛笠生物),以100μl/管的体积加于1.5ml EP管中,向其中加入10μl/管山羊血清,于4℃封闭30min。加入梯度稀释的、本发明实施例1得到的CD25嵌合抗体54A7-hIgG1(重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示,以及轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示)、对照CD25抗体AB917-hIgG1(重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示,以及轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示,制备方法参见WO2019/175216,与罗氏处于I期临床试验的CD25抗体RG6292性能最接近)、hIgG1(购自百英生物),于4℃孵育30min。向EP管中加入1ml PBS,在4℃、3500rpm条件下离心5min,弃尽上清,再用PBS洗一遍。离心后弃尽上清,用100μl/管PBS重悬细胞,向其中加入1μl/管Alexa-647标记的抗人IgG抗体二抗(购自Jacksonlab),4℃避光孵育30min。用PBS洗两遍,离心后弃尽上清。用200μl/管PBS重悬细胞,用流式细胞仪进行检测。结果如图4所示。
实验结果进一步显示:本发明的CD25嵌合抗体54A7-hIgG1够结合T细胞,结合强度高于对照CD25抗体AB917-hIgG1。
实施例6本发明的CD25嵌合抗体流式细胞术人、猴CD25结合实验
流式细胞术实验被用于检测CD25抗体的结合特性。在本实施例中,进一步地,向CHO-K1-human CD25、CHO-K1-cynomolgus CD25细胞中加入抗体,抗体加入后信号的强弱用于判断嵌合抗体和人、猴CD25的结合特性。
HEK293T细胞按照5×105细胞/孔铺六孔板,用不含双抗的DMEM培养基培养过夜。转染前弃去培养基,加入1ml新鲜的不含双抗的DMEM培养基。将pLVX-EF1a-human CD25-IRES-puro(pLVX-EF1a-IRE S-puro载体的酶切位点EcoRI与BamHI之间插入人CD25蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示)的编码序列(核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示)或者pLVX-EF1a-cynomolgus CD25-IRES-puro(pLVX-EF1a-IRES-puro载体的酶切位点EcoRI与BamHI之间插入有猴CD25蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示)的编码序列(核苷酸序列如SEQID NO:20所示)、pMD2G、psPAX2载体(共3μg)按照2:1:1的比例加入200μl无血清DMEM培养基中,加入12μg聚醚酰亚胺(PEI,购自Polysciences)。混匀后静置16min,然后将全部液体加入铺有HEK293T细胞的六孔板中。培养6h后,弃去培养基,加入新鲜的完全DMEM培养基培养。转染48h后,收细胞培养上清,过0.45μm滤器(购自Millipore),即为病毒上清。将病毒上清全部加入含有1×104CHO-K1细胞的6孔板中,加入终浓度4μg/ml的聚凝胺(购自Sigma),培养12h。随后弃尽上清,加入新鲜的完全DMEM培养基。所得细胞即为CHO-K1-human CD25、CHO-K1-cynomo lgus CD25细胞。
用PBS将CHO-K1-human CD25、CHO-K1-cynomolgus CD25细胞稀释为2×106/ml,以100μl/管的体积加于1.5ml EP管中,向其中加入10μl/管山羊血清,于4℃封闭30min。加入梯度稀释的、本发明实施例1得到的CD25嵌合抗体54A7-hIgG1(重链的氨基酸序列如SEQ IDNO:12所示,以及轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示)、对照CD25抗体AB917-hIgG1(重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示,以及轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示)、对照Daclizumab(重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示,以及轻链的氨基酸序列SEQ ID NO:18所示)或hIgG1(购自百英生物),于4℃孵育30min。向EP管中加入1ml PBS,在4℃、3500rpm条件下离心5min,弃尽上清,再用PBS洗一遍。离心后弃尽上清,用100μl/管PBS重悬细胞,向其中加入1μl/管Alexa-647标记的抗人Fc抗体二抗(购自Jacksonl ab),4℃避光孵育30min。用PBS洗两遍,离心后弃尽上清。用200μl/管PBS重悬细胞,用流式细胞仪进行检测。结果如图5、图6所示。
实验结果进一步显示:本发明的CD25嵌合抗体54A7-hIgG1能够结合人及猴CD25,与人CD25结合的亲和力强于对照CD25抗体AB917-hIgG1、强于对照Daclizumab。
实施例7本发明的CD25嵌合抗体阻断能力考察
ELISA实验被用于检测嵌合CD25抗体的阻断特性。在本实施例中,人CD25胞外区His标签融合蛋白包被到96孔板中,抗体与IL-2-Biotin加入后信号的强弱用于判断抗体对CD25结合IL-2的影响。
用PBS缓冲液将人CD25-His蛋白(购自Acro)稀释为2μg/ml,以100μl/孔的体积加于96孔板中,于4℃放置过夜。将96孔板中PBS缓冲液吸掉,用PBST(pH7.2 PBS含0.1%Tween 20)缓冲液洗板6次后,加入200μl/孔PBS/10% BSA,37℃孵育2h进行封闭。移去封闭液,用PBST洗板6次后,加入50μl/孔用PBST/0.05% BSA稀释至合适浓度的IL-2-Biotin(购自Acro)和50μl/孔用PBST/0.05% BSA梯度稀释的、本发明实施例1得到的待测CD25嵌合抗体54A7-hIgG1(重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示,以及轻链的氨基酸序列如SEQ IDNO:13所示)、对照CD25抗体AB917-hIgG1(重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示,以及轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示)、Daclizumab(重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示,以及轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示)、hIgG1(购自百英生物),37℃孵育1h。移去反应体系,用PBST洗板6次后,以100μl/孔用PBST/0.05% BSA稀释HRP(辣根过氧化物酶)标记的抗Streptavidin二抗(购自Southern Biotech),37℃孵育1h。用PBST洗板6次后,加入80μl/孔TMB(四甲基联苯胺),于室温孵育3min,加入80μl/孔4M硫酸终止反应。用酶标仪在450mm处读取吸光值。结果如图7所示。
实验结果表明:本发明的CD25嵌合抗体54A7-hIgG1能够阻断CD25与IL-2结合,强于对照CD25抗体AB917-hIgG1、强于对照Daclizumab。
实施例8本发明的CD25嵌合抗体抑制IL-2下游信号性能考察
流式细胞术实验被用于检测嵌合CD25抗体的抑制IL-2下游信号的特性。在本实施例中,向人外周血T细胞中加入IL-2和CD25抗体,抗体加入后pSTAT5信号的强弱用于判断嵌合抗体对IL-2下游信号的影响。
用完全RPMI 1640培养基将人外周血T细胞稀释为2×106/ml(购自赛笠生物),以100μl/管的体积加于96孔板中,向其中加入10U/ml IL-2和梯度稀释的、本发明实施例1得到的待测CD25嵌合抗体54A7-hI gG1(重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示,以及轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示)、对照CD25抗体AB917-hIgG1(重链的氨基酸序列如SEQID NO:14所示,以及轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示)、Daclizumab(重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示,以及轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示)、hIgG1(购自百英生物),37℃孵育1h。标记pSTAT5荧光抗体(购自Biolegend),然后用200μl/管PBS重悬细胞,用流式细胞仪进行检测。结果如图8所示。
实验结果显示:本发明的CD25嵌合抗体54A7-hIgG1能够抑制STAT5磷酸化,即能够抑制IL-2诱导的下游信号,强于对照Daclizumab,而CD25抗体AB917-hIgG1抗体无此功能。
实施例9本发明的CD25嵌合抗体抑制T细胞增殖性能考察
流式细胞术实验被用于检测CD25抗体的抑制T细胞增殖的特性。在本实施例中,将人外周血T细胞标记CFSE,加入CD3和CD28抗体,培养72h,CFSE信号的强弱用于判断CD25抗体对T细胞增殖的影响。
利用5μM CFSE标记T细胞,标记完成后,用完全RPMI 1640培养基将人外周血T细胞稀释为2×105/ml(购自赛笠生物),以100μl/管的体积加于96孔板中,向其中加入2μg/mlCD3和CD28抗体,以及本发明实施例1得到的待测CD25嵌合抗体54A7-hIgG1(重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示,以及轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示)、对照CD25抗体AB917-hIgG1(重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示,以及轻链的氨基酸序列如SEQ IDNO:15所示)、hIgG1(购自百英生物),使得抗体终浓度为100μg/ml,37℃孵育72h。然后用流式细胞仪进行检测,结果如图9所示。
实验结果显示:本发明的CD25嵌合抗体54A7-hIgG1能够抑制T细胞增殖,而对照的AB917抗体不影响T细胞增殖。
实施例10本发明的CD25嵌合抗体促进PBMC杀伤CD25阳性T细胞性能考察
流式细胞术实验被用于检测CD25抗体的促进PBMC杀伤CD25阳性T细胞的特性。
利用5μM CTV标记T细胞,标记完成后,用完全RPMI 1640培养基将人外周血T细胞稀释为1×105/ml(购自赛笠生物),以100μl/管的体积加于96孔板中作为靶细胞;利用完全RPMI 1640细胞将PBMC稀释为2.5×106/ml(购自赛笠生物),以80μl/管的体积加于96孔板中作为效应细胞;以20μl/管的体积加入稀释至合适浓度的、本发明实施例1得到的待测CD25嵌合抗体54A7-hIgG1(重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示,以及轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示)或hIgG1(购自百英生物),37℃孵育4h。加入7-AAD,用流式细胞仪进行检测。结果如图10所示。
实验结果显示:本发明的CD25嵌合抗体54A7-hIgG1能够促进PBMC杀伤CD25阳性的T细胞,具有ADCC作用。
实施例11CD25嵌合抗体内吞活性检测
流式细胞术实验被用于检测嵌合CD25抗体的内吞特性。
用完全DMEM培养基将CHO-K1-human CD25细胞稀释为1×105/ml,以100μl/孔的体积加于96孔板中;将本发明实施例1得到的待测CD25嵌合抗体54A7-hIgG1(重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示,以及轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示)、对照CD25抗体AB917-hIgG1(重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示,以及轻链的氨基酸序列如SEQ IDNO:15所示)或hIgG1(购自百英生物)与pHrodo标记的抗人IgG二抗(购自Jacksonlab)1:1混合,加入细胞中,使得CD25抗体终浓度为20μg/ml,37℃孵育24h。用流式细胞仪进行检测。结果如图11所示。
实验结果显示:本发明的CD25嵌合抗体54A7-hIgG1内吞活性更弱,更适用于单抗、双抗开发。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (14)
1.一种抗CD25抗体或其抗原结合片段,其特征在于,包含:重链可变区CDRs和轻链可变区CDRs,其中,
重链可变区CDRs具有如SEQ ID NO:1~3所示或其保守修饰形式的氨基酸序列;
轻链可变区CDRs具有如SEQ ID NO:4~6所示或其保守修饰形式的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或其抗原结合片段包含:
如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区CDR1,
如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的重链可变区CDR2,
如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的重链可变区CDR3,
如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的轻链可变区CDR1,
如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的轻链可变区CDR2,
如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或其抗原结合片段包含重链框架区和/或轻链框架区;
任选地,所述重链框架区和/或轻链框架区的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体、牛源抗体、马源抗体、乳牛源抗体、猪源抗体、绵羊源抗体、山羊源抗体、狗源抗体、猫源抗体、兔源抗体、骆驼源抗体、驴源抗体、鹿源抗体、貂源抗体、鸡源抗体、鸭源抗体、鹅源抗体、火鸡源抗体、斗鸡源抗体或其突变体中的至少之一;优选为鼠源抗体、人源抗体和灵长目源抗体中的至少之一;
任选地,所述抗体或其抗原结合片段包含:
如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的重链可变区;和/或,
如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的轻链可变区;
任选地,所述重链可变区包含与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少90%序列同源性的氨基酸序列;和/或,
所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少90%序列同源性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1或2任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或其抗原结合片段进一步包含恒定区;
其中,所述恒定区包括重链恒定区和轻链恒定区中的至少之一;
任选地,所述重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体、牛源抗体、马源抗体、乳牛源抗体、猪源抗体、绵羊源抗体、山羊源抗体、狗源抗体、猫源抗体、兔源抗体、骆驼源抗体、驴源抗体、鹿源抗体、貂源抗体、鸡源抗体、鸭源抗体、鹅源抗体、火鸡源抗体、斗鸡源抗体或其突变体中的至少之一;
任选地,所述重链恒定区包括选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的重链恒定区;和/或,
所述轻链恒定区包括选自κ型或λ型轻链恒定区;
任选地,所述轻链恒定区和重链恒定区均来自于鼠源抗体或其突变体,或者人源抗体或其突变体;
任选地,所述重链恒定区的N端与所述重链可变区的C端相连;和/或
所述轻链恒定区的N端与所述轻链可变区的N端相连;
任选地,所述重链恒定区具有如SEQ ID NO:21或23所示的氨基酸序列或与其具有至少80%同一性的氨基酸序列;和/或
所述轻链恒定区具有如SEQ ID NO:22或24所示的氨基酸序列或与其具有至少80%同一性的氨基酸序列;
任选地,所述重链恒定区和轻链恒定区分别具有如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列;和/或
所述重链恒定区和轻链恒定区分别具有如SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列;
任选地,所述抗体或抗原结合片段包含:
如SEQ ID NO:10或12所示的氨基酸序列或与其具有至少90%同源性的氨基酸序列的重链;和/或
如SEQ ID NO:11或13所示的氨基酸序列或与其具有至少90%同源性的氨基酸序列的轻链;
任选地,所述抗体或抗原结合片段包括:
如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或与其具有至少80%同源性的氨基酸序列的重链,和如SEQ ID NO:11任一项所示的氨基酸序列或与其具有至少80%同源性的氨基酸序列的轻链;或者
如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或与其具有至少80%同源性的氨基酸序列的重链,和如SEQ ID NO:13任一项所示的氨基酸序列或与其具有至少80%同源性的氨基酸序列的轻链。
5.根据权利要求1或2任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、Fv、scFv、Fab、Fab’、Fab’-SH或F(ab’)2;
所述抗体的抗原结合片段包括:选自F(ab’)2片段、Fab’片段、Fab片段、F(ab)2片段、Fv片段、scFv片段、scFv-Fc融合蛋白、scFv-Fv融合蛋白和最小识别单位中的至少之一。
6.一种缀合物,其特征在于,包括:
权利要求1~5任一项所述的抗体或其抗原结合片段;
缀合部分,所述的抗体或其抗原结合片段与缀合部分相连;
任选地,所述偶联部分包括选自为载体、药物、毒素、细胞因子、蛋白标签、修饰物、治疗剂和化疗剂中的至少之一。
7.一种核酸,其特征在于,编码权利要求1~5任一项所述的抗体或其抗原结合片段;
任选地,所述核酸的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:25、26所示;
任选地,所述核酸的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:27、28所示。
8.一种载体或转化子,其特征在于,含有权利要求7所述的核酸;
任选地,所述载体为真核载体或原核载体;
任选地,所述载体包括选自质粒载体、腺病毒载体、慢病毒载体和腺相关病毒载体中的至少之一。
9.一种细胞,其特征在于,携带有权利要求7所述的核酸、权利要求8所述的载体或转化子,或表达权利要求1~5任一项所述的抗体或其抗原结合片段;
任选地,所述细胞为原核细胞、真核细胞或噬菌体;
任选地,所述原核细胞为大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌或奇异变形菌;
任选地,所述真核细胞为真菌、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞;
任选地,所述真菌为巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母或木霉;
任选地,所述昆虫细胞为草地粘虫细胞;任选地,所述植物细胞是烟草植物细胞;任选地,所述哺乳动物细胞为BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞或人胚肾293细胞;
优选地,所述细胞是哺乳动物细胞;
优选地,所述细胞是BHK细胞、CHO细胞、COS细胞或NSO细胞。
10.一种药物组合物,其特征在于,包含:权利要求1~5任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求6所述的缀合物、权利要求7所述的核酸、或者权利要求8所述的载体或转化子;
任选地,进一步包括药学上可接受的辅料;
任选地,所述辅料包括:药学上可接受的一种或多种赋形剂、稀释剂、稳定剂或载体;
任选地,所述药物组合物为注射剂。
11.一种试剂盒,其特征在于,包含权利要求1~5任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
12.权利要求1~5任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途,
所述试剂盒用于检测和/或富集和/或分离纯化CD25;
任选地,所述试剂盒通过ELISA法、流式细胞术、免疫印迹法或免疫沉淀法检测CD25;
任选地,所述试剂盒通过亲和层析法富集和/或分离纯化CD25。
13.一种检测、富集或分离纯化CD25的方法,其特征在于,包含:
采用权利要求1~5任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求11所述的试剂盒中的抗体或其抗原结合片段与生物样品进行接触,所述生物样品中含有CD25。
14.权利要求1~5任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求6所述的缀合物、权利要求7所述的核酸、权利要求8所述的载体或转化子或权利要求10所述的药物组合物在制备药物中的用途,所述药物用于清除CD25阳性T细胞、阻断IL-2与CD25结合或者预防和/或治疗CD25介导的疾病;
任选地,所述CD25介导的疾病为炎性病或免疫相关疾病;
任选地,所述免疫相关疾病包括移植排斥、自身免疫病、感染性疾病、癌症或肿瘤;
任选地,所述移植排斥为同种异体移植物或异种移植物排斥;
任选地,所述炎性病或免疫相关疾病选自类风湿关节炎、强直性脊柱炎、牛皮癣性关节炎、1型糖尿病、胰岛素依赖性2型糖尿病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、重症肌无力、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、皮肤多肌炎、干燥综合征、动脉炎、再生障碍性贫血、哮喘、硬皮病、葡萄膜炎、牛皮癣、掌跖脓疱病、腐蚀性扁平苔藓、大疱性天疱疮、大疱性表皮松解症、接触性皮炎和特应性皮炎中的至少一种;
任选地,所述癌症为肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤、肾癌、胃癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌和头颈癌中的至少一种。
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