CN112513097B

CN112513097B - 四价对称双特异性抗体

Info

Publication number: CN112513097B
Application number: CN201980050120.3A
Authority: CN
Inventors: 张敬; 方丽娟; 严永祥; 曾亮; 周鹏飞
Original assignee: Wuhan Yzy Biopharma Co ltd
Current assignee: Wuhan youzhiyou biopharmaceutical Co.,Ltd.
Priority date: 2019-07-11
Filing date: 2019-07-11
Publication date: 2021-10-29
Anticipated expiration: 2039-07-11
Also published as: MX2022000456A; WO2021003739A1; EP3998286A1; CN114539419B; US20230080842A1; CN113968910B; BR112022000416A2; CN112513097A; ZA202201796B; CN113968910A; EP3998286A4; KR20220044748A; JP2022546002A; AU2019456113A1; CA3146381A1; CN114539419A

Abstract

本发明涉及一种双特异性抗体，其结构为F(ab)₂‑(Fv)₂‑Fc的4价对称双特异性抗体，包含2条相同的融合重链和2条相同的融合轻链。

Description

四价对称双特异性抗体

技术领域

本发明涉及抗体领域。具体地，涉及双特异性抗体，包含其的药物组合物及其用途。

背景技术

双特异性抗体(Bispecific antibody，BsAb)为具有两种不同结合特异性的抗体或抗体类分子。双特异性抗体广泛应用于生物医学，尤其是针对肿瘤的免疫治疗中。

双特异性抗体可通过例如化学工程、细胞工程以及基因工程的方法制备。基因工程的优势在于能够容易地改造抗体，使得能够设计和生产许多不同形式的双特异性抗体片段，包括双特异性IgG(BsIgG)、附加IgG(appended IgG)、双特异性抗体片段(BsAbfragments)、双特异性融合蛋白(Bispecific fusion protein)和双特异性抗体偶联物(BsAb conjugates)五大类(参见Christoph Spiess，Qianting Zhai，Paul J.Carter，Alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecificantibodies.Molecular Immunology 67(2015)95-106)。

第一类：双特异性IgG，具有与天然单抗相似的结构和分子量，但具有两个不同的Fab，(1)早期的Triomab技术通过将大鼠和小鼠的杂交瘤再融合形成“杂交-杂交瘤”，从而产生小鼠大鼠嵌合双特异性抗体，根据大、小鼠Fc对亲和填料的选择性在纯化时获得目的产物，该技术存在表达量低，纯化收率低的缺点。(2)后期通过抗体工程技术如亮氨酸拉链(Lucine zipper)、“杵入臼”(Knobs-into-holes)或静电转向(electrostatic steering)改造Fc，使两个不同的重链形成异二聚体，再利用共同轻链(common light chain)、“杵入臼”或静电转向技术使轻-重链正确配对，或者设计不同的轻链亚型κ链和λ链，利用分别对κ链和λ链特异性的亲和填料进行纯化获得正确的目的产物。这类双特异性抗体具有接近天然抗体的药代动力学，但存在杂质难以鉴定和去除的缺点。

第二类：附加IgG，以天然单抗IgG为骨架，在抗体重链或轻链的N端或C端融合抗原结合结构域，如可变区片段(Fv)、单链可变区片段(ScFv)、抗原结合片段(Fab)或多肽等，该类双特异性抗体分子量大于150kDa，主要为对称结构，药代动力学类似天然抗体，甚至半衰期更长，纯化上具有一定便利，但存在表达量不高、分子不够稳定等缺点。

第三类：双特异性抗体片段，保留抗体可变区片段，缺失部分甚至全部的抗体恒定区，重链可变区片段(VH)和轻链可变区片段(VL)一般通过接头(linker)蛋白连接形成ScFv，或者自发配对形成Fv。该类双特异性抗体分子量不超过150kDa，半衰期短，存在表达量很难达到单抗水平，分子不够稳定，纯化收率低等缺点。

第四类：双特异性融合蛋白，保留抗体可变区片段，同时融合了其他蛋白或药物分子，如T细胞受体恒定区、人血清白蛋白或毒素蛋白等。该类双特异性抗体分子量在75～160kDa之间，存在纯化工艺上的挑战，分子稳定性也有一定风险。

第五类：双特异性抗体偶联物，将两个不同的单抗或ScFv通过化学方法偶联在一起。该类抗体工艺复杂，最终收率低，目前国际上基本没有使用。

上述各类双特异性抗体均存在一些缺点，导致产品在临床使用上具有潜在的风险。为解除这些风险，本申请发明了一种新型双特异性抗体。

发明内容

本申请提供了一种新型双特异性抗体的构建及制备方法，具体结构见图1。本申请中的所有抗体都具有人IgG恒定区，属于附加IgG或双特异性抗体片段。

本申请对新型双特异性抗体的亲和力，稳定性，生物学活性和药效进行了检测，并与3种已有技术的双特异性抗体进行了对比，结果表明新型双特异性抗体具有更好的稳定性、生物学活性和药效，且表达和制备更为方便。

技术解决方案

本发明双特异性抗体具有2条相同的融合重链和2条相同的融合轻链，其中2条融合重链形成配对，融合轻链和融合重链形成配对。

在某些方面，所述抗体的融合重链之间通过一个或多个二硫键结合。

在某些方面，所述抗体的融合轻链和所述融合重链之间通过一个或多个二硫键结合。

在某些方面，所述抗体的融合重链具有抗体a重链可变区(VHa)、第一恒定区(CH1)、抗体b轻链可变区(VLb)和Fc片段。其中VLb在CH1和Fc之间，通过接头或肽键连接。所述抗体的融合轻链具有抗体a轻链可变区(VLa)、轻链恒定区(CL)和抗体b重链可变区(VHb)。其中VHb在CL的C端，通过接头或肽键连接。

在某些方面，所述抗体的融合重链具有抗体a重链可变区(VHa)、第一恒定区(CH1)、抗体b重链可变区(VHb)和Fc片段。其中VHb在CH1和Fc之间，通过接头或肽键连接。所述抗体的融合轻链具有抗体a轻链可变区(VLa)、轻链恒定区(CL)和抗体b轻链可变区(VLb)。其中VLb在CL的C端，通过接头或肽键连接。

在某些方面，VHa-VLa配对针对抗原A具有特异性，该抗原A包括但不限于肿瘤细胞表面抗原，免疫细胞表面抗原，病毒，细菌，内毒素，细胞因子，例如CD3，SLAMF7，CD38，BCMA，CD16a，CEA，PD-L1，PD-1，CTLA-4，TIGIT，LAG-3，VEGF，B7-H3，TGF-β，IL-10等。

在某些方面，VHb-VLb配对针对抗原B具有特异性，该抗原B包括但不限于肿瘤细胞表面抗原，免疫细胞表面抗原，病毒，细菌，内毒素，细胞因子，例如CD3，SLAMF7，CD38，BCMA，CD16a，CEA，PD-L1，PD-1，CTLA-4，TIGIT，LAG-3，VEGF，B7-H3，TGF-β，IL-10等。

具体地，在一个方面，本发明提供了双特异性抗体，包含2条相同的融合重链和2条相同的融合轻链，其中2条融合重链形成配对，融合轻链和融合重链形成配对，其中所述融合重链包含抗体a重链可变区VHa、第一恒定区CH1、抗体b可变区1和Fc片段，抗体b可变区1通过接头2或肽键连接CH1和通过接头3或肽键连接Fc，所述双特异性抗体的融合轻链包含抗体a轻链可变区VLa、轻链恒定区CL和抗体b可变区2，其中抗体b可变区2通过接头1或肽键连接CL的C端，其中，

(1)当抗体b可变区1为抗体b的重链可变区VHb时，抗体b可变区2为抗体b的轻链可变区VLb；

或

(2)当抗体b可变区1为抗体b的轻链可变区VLb时，抗体b可变区2为抗体b的重链可变区VHb，

其中VHa-VLa配对靶向抗原A，VHb-VLb配对靶向抗原B。

在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体的结构为F(ab)₂-(Fv)₂-Fc，其中F(ab)₂包括2个VHa，2个CH1，2个VLa和2个CL，(Fv)₂包括2个VH/VLb和2个VL/VHb，其中所述VH/VLb和所述VL/VHb的位置可以互换，所述Fc片段包括铰链区、第二恒定区CH2和第三恒定区CH3。

在一个实施方案中，所述双特异性抗体从N端到C端对称具有式I所示的结构：

式中，

“～”为二硫键或共价键；

“-”为肽键；

L1、L2、L3各自独立地为肽键或接头或铰链；

VHa为抗体a的重链可变区；

VLa为抗体a的轻链可变区；

CH1为第一恒定区；

Fc为包含铰链区的Fc片段；

CL为轻链恒定区；

Vb1为抗体b可变区1；

Vb2为抗体b可变区2。

在一个实施方案中，所述双特异性抗体从N端到C端对称具有式II或式III所示的结构：

式中，

“～”为二硫键或共价键；

“-”为肽键；

L1、L2、L3各自独立地为肽键或接头；

VHa为抗体a的重链可变区；

VLa为抗体a的轻链可变区；

CL为轻链恒定区；

H为铰链区；

CH1、CH2、CH3分别为第一恒定区、第二恒定区和第三恒定区；

VHb为抗体b的重链可变区；

VLb为抗体b的轻链可变区。

在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含：

(1)融合重链，所述融合重链从N端到C端依次包含抗体a重链可变区VHa、第一恒定区CH1、接头2(或肽键)、抗体b重链可变区VHb、接头3(或肽键)和Fc片段；和

(2)融合轻链，所述融合轻链从N端到C端依次包含抗体a轻链可变区VLa、轻链恒定区CL、接头1(或肽键)和抗体b轻链可变区VLb。

在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含：

(1)融合重链，所述融合重链从N端到C端依次包含抗体a重链可变区VHa、第一恒定区CH1、接头2(或肽键)、抗体b轻链可变区VLb、接头3(或肽键)和Fc片段；和

(2)融合轻链，所述融合轻链从N端到C端依次包含抗体a轻链可变区VLa、轻链恒定区CL、接头1(或肽键)和抗体b重链可变区VHb。

在一个实施方案中，所述VHa-VLa配对形成一个或多个链间二硫键，VHb-VLb配对形成一个或多个链间二硫键。

在一个实施方案中，抗体b可变区1为抗体b的轻链可变区VLb，抗体b可变区2为抗体b的重链可变区VHb。

在一个实施方案中，所述接头1-3可以相同或不同，所述接头1-3各自独立地选自SEQ ID NO：69-90组成的组，优选选自SEQ ID NO：71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，82，83，85，86，87，88，89或90。

在一个实施方案中，铰链区的序列选自SEQ ID NO：91-103组成的组。

在一个实施方案中，CL的序列选自SEQ ID NO：104-110组成的组。

在一个实施方案中，CH1的序列选自SEQ ID NO：111-114组成的组。

在一个实施方案中，CH2的序列选自SEQ ID NO：115-119组成的组。

在一个实施方案中，CH3的序列选自SEQ ID NO：120-128组成的组。

在一个实施方案中，抗原A和抗原B可以相同或不同，优选地，抗原A或抗原B不同或表示相同抗原的不同表位。

在一个实施方案中，所述抗原A和抗原B各自独立地选自下组：免疫细胞表面抗原、肿瘤抗原、病毒、细菌、内毒素、细胞因子、或其组合。

在一个实施方案中，所述抗原A和/或抗原B选自PD-L1，PD-1，VEGFA，IL-10，IL-10R，BCMA，VEGF，TGF-β，CTLA-4，LAG-3，TIGIT，CEA，CD38，SLAMF7，B7-H3，Her2，EpCAM，CD19，CD20，CD30，CD33，CD47，CD52，CD133，EGFR，GD2，GD3，GM2，RANKL，CD3和/或CD1 6a。

在一个实施方案中，所述抗原A和/或抗原B选自SEQ ID NO：129-145。

在一个实施方案中，所述抗原A和/或抗原B为PD-1；优选地，所述抗原A和抗原B两者中一个为PD-1，另一个选自下组：PD-L1，PD-1，VEGFA，IL-10，IL-10R，BCMA，VEGF，TGF-β，CTLA-4，LAG-3，TIGIT，CEA，CD38，SLAMF7，B7-H3，HER2，CD3或CD16a。

在一个实施方案中，所述抗原A和抗原B选自以下各项组成的组：

PD-L1和VEGF，

PD-1和VEGF，

PD-L1和TGF-β，

PD-1和TGF-β，

PD-1和CTLA-4，

PD-1和LAG-3，

PD-1和TIGIT，

PD-1和IL-10，

SLAMF7和CD16a，和

Her2和Her2。

在一个实施方案中，所述VHa、VLa、VHb和/或VLb来源于选自下组的抗体：动物源抗体(如鼠源抗体)、嵌合抗体、人源化抗体；优选地，所述的人源化抗体包括全人源化抗体和部分人源化抗体。

在一个实施方案中，所述VHa和/或VHb包含下述任一项的序列：

a)具有如SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、146、148中任一所示的氨基酸序列；

b)与a)所述的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列；

c)与a)所述的氨基酸序列具有一个或多个(优选一个或几个，更优选1、2或3个)氨基酸差异的氨基酸序列；和/或

所述VLa和/或VLb包含下述任一项的序列：

d)具有如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、147、149中任一所示的氨基酸序列；

e)与d)所述的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列；

f)与d)所述的氨基酸序列具有一个或多个(优选一个或几个，更优选1、2或3个)氨基酸差异的氨基酸序列。

在一个实施方案中，所述双特异性抗体选自下组：Y100-A1、Y100-A2、Y100-A3、Y100-A4、Y100-A5、Y100-A6、Y100-A7、Y100-A8、Y100-A9、Y100-A10、Y100-A11、Y100-ACl、Y100-AC2、Y100-AC3、Y101-A1、Y101-A2、Y101-A3、Y101-A4、Y101-A5、Y103-A1、Y103-A2、Y103-A3、Y104-A1、Y104-A2、Y104-A3、Y105-Al、Y105-A2、Y105-A3、Y106-A1、Y106-A2、Y106-A3、Y106-A4、Y106-A5、Y110-A1、Y110-A2、Y110-A3、Y110-A4、Y116-A1、Y116-A2、Y116-A3、Y100-B1、Y100-B2、Y100-B3、Y100-B4、Y100-B5、Y100-B6、Y100-B7、Y100-B8、Y100-B9、Y100-B10、Y100-B11、Y100-B12、Y100-B13、Y100-BC1、Y100-BC2、Y100-BC3、Y101-B1、Y101-B2、Y101-B3、Y101-B4、Y101-B5、Y101-B6、Y103-B1、Y103-B2、Y103-B3、Y104-B1、Y104-B2、Y104-B3、Y105-B1、Y105-B2、Y105-B3、Y106-B1、Y106-B2、Y106-B3、Y106-B4、Y106-B5、Y110-B1、Y110-B2、Y110-B3、Y110-B4、Y110-B5、Y116-B1、Y116-B2、Y116-B3、Y140-A1、Y140-A2、Y140-A3、Y140-A4、Y140-B1、Y140-B2、Y140-B3、Y140-B4、或其组合。

在一个实施方案中，所述双特异性抗体选自表27和表34中任一所示的双特异性抗体。

在一个实施方案中，所述双特异性抗体选自下组：Y100-B6、Y100-B7、Y100-BR、Y100-B9、Y100-B10、Y100-B11、Y100-B12、Y100-BC1、Y100-BC2、Y100-BC3、Y101-B1、Y101-B2、Y101-B3、Y101-B4、Y101-B5、Y101-B6、Y103-B1、Y103-B2、Y103-B3、Y104-B1、Y104-B2、Y104-B3、Y105-B1、Y105-B2、Y105-B3、Y106-B1、Y106-B2、Y106-B3、Y106-B4、Y106-B5、Y110-B1、Y110-B2、Y110-B3、Y110-B4、Y110-B5、Y116-B1、Y116-B2、Y116-B3、Y140-B1、Y140-B2、Y140-B3、Y140-B4、或其组合。

在一个实施方案中，所述双特异性抗体选自下组：Y100-B7、Y100-B9、Y101-B2、Y101-B4、Y103-B2、Y104-B2、Y105-B2、Y106-B2、Y106-B4、Y110-B2、Y110-B4、Y116-B2、或其组合。

在一个实施方案中，所述双特异性抗体选自以下各项组成的组：

(1)融合轻链包含SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：42；融合重链包含SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(2)融合轻链包含SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：42；融合重链包含SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(3)融合轻链包含SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：42；融合重链包含SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(4)融合轻链包含SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：46；融合重链包含SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(5)融合轻链包含SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：46；融合重链包含SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(6)融合轻链包含SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：58；融合重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(7)融合轻链包含SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：58；融合重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(8)融合轻链包含SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：58；融合重链包含SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(9)融合轻链包含SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：58；融合重链包含SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(10)融合轻链包含SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：54；融合重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：53，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(11)融合轻链包含SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：58；融合重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：57，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120；

(12)融合轻链包含SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：68；融合重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：67，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(13)融合轻链包含SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：58；融合重链包含SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：57，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(14)融合轻链包含SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：60；融合重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：59，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(15)融合轻链包含SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：60；融合重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：59，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(16)融合轻链包含SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：60；融合重链包含SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：59，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(17)融合轻链包含SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：60；融合重链包含SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：59，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(18)融合轻链包含SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：60；融合重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：59，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120；

(19)融合轻链包含SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：34；融合重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：33，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(20)融合轻链包含SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：34；融合重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：33，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(21)融合轻链包含SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：34；融合重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：33，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120；

(22)融合轻链包含SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：28；融合重链包含SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：27，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(23)融合轻链包含SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：28；融合重链包含SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：27，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(24)融合轻链包含SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：28；融合重链包含SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：27，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120；

(25)融合轻链包含SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：30；融合重链包含SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：29，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(26)融合轻链包含SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：30；融合重链包含SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：29，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(27)融合轻链包含SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：30；融合重链包含SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：29，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120；

(28)融合轻链包含SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：58；融合重链包含SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：57，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(29)融合轻链包含SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：58；融合重链包含SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：57，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(30)融合轻链包含SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：60；融合重链包含SEQ ID NO∶37，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：59，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(31)融合轻链包含SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：60；融合重链包含SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：59，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(32)融合轻链包含SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：60；融合重链包含SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：59，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120；

(33)融合轻链包含SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：64；融合重链包含SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：63，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(34)融合轻链包含SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：64；融合重链包含SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：63，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(35)融合轻链包含SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：64；融合重链包含SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：63，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(36)融合轻链包含SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：64；融合重链包含SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：63，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120；

(37)融合轻链包含SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：48；融合重链包含SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：47，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(38)融合轻链包含SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：48；融合重链包含SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：47，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(39)融合轻链包含SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：48；融合重链包含SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：47，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120；

(40)融合轻链包含SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：41；融合重链包含SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：42，SEQ IDNO：82，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(41)融合轻链包含SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：41；融合重链包含SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：42，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(42)融合轻链包含SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：41；融合重链包含SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：42，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(43)融合轻链包含SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：45；融合重链包含SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：46，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(44)融合轻链包含SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：45；融合重链包含SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：46，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(45)融合轻链包含SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：57；融合重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：58，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(46)融合轻链包含SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：57；融合重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：58，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(47)融合轻链包含SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：57；融合重链包含SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：58，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(48)融合轻链包含SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：57；融合重链包含SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：58，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(49)融合轻链包含SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：53；融合重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：54，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(50)融合轻链包含SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：84和SEQ ID NO：57；融合重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：58，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(51)融合轻链包含SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：57；融合重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：58，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(52)融合轻链包含SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：57；融合重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：58，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120；

(53)融合轻链包含SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：67；融合重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：68，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(54)融合轻链包含SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：57；融合重链包含SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：58，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(55)融合轻链包含SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：57；融合重链包含SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：58，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120；

(56)融合轻链包含SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：59；融合重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：60，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(57)融合轻链包含SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：59；融合重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：60，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(58)融合轻链包含SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：59；融合重链包含SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：60，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(59)融合轻链包含SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：59；融合重链包含SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：60，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(60)融合轻链包含SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：84和SEQ ID NO：59；融合重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：60，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(61)融合轻链包含SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：59；融合重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：60，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(62)融合轻链包含SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：33；融合重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：34，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(63)融合轻链包含SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：33；融合重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：34，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(64)融合轻链包含SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：33；融合重链包含SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：34，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120；

(65)融合轻链包含SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：27；融合重链包含SEQ ID NO∶37，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：28，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(66)融合轻链包含SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：27；融合重链包含SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：28，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(67)融合轻链包含SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：27；融合重链包含SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：28，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120；

(68)融合轻链包含SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：29；融合重链包含SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：30，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(69)融合轻链包含SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：29；融合重链包含SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：30，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(70)融合轻链包含SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：29；融合重链包含SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：30，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120；

(71)融合轻链包含SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：57；融合重链包含SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：58，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(72)融合轻链包含SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：57；融合重链包含SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：58，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(73)融合轻链包含SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：59；融合重链包含SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：60，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(74)融合轻链包含SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：59；融合重链包含SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：60，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(75)融合轻链包含SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：59；融合重链包含SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：60，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120；

(76)融合轻链包含SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：63；融合重链包含SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：64，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(77)融合轻链包含SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：63；融合重链包含SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：64，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120；

(78)融合轻链包含SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：63；融合重链包含SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：64，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(79)融合轻链包含SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：63；融合重链包含SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：64，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(80)融合轻链包含SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：63；融合重链包含SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：64，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120；

(80)融合轻链包含SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：47；融合重链包含SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：48，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(81)融合轻链包含SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：47；融合重链包含SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：48，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(82)融合轻链包含SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：47；融合重链包含SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：48，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120；

(83)融合轻链包含SEQ ID NO：147，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：149；融合重链包含SEQ ID NO：146，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：148，SEQ IDNO：82，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(84)融合轻链包含SEQ ID NO：149，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：147；融合重链包含SEQ ID NO：148，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：146，SEQ IDNO：82，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(85)融合轻链包含SEQ ID NO：147，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：149；融合重链包含SEQ ID NO：146，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：148，SEQ IDNO：82，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120；

(86)融合轻链包含SEQ ID NO：149，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：147；融合重链包含SEQ ID NO：148，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：146，SEQ IDNO：82，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120；

(87)融合轻链包含SEQ ID NO：147，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：148；融合重链包含SEQ ID NO：146，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：149，SEQ IDNO：87，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO∶117和SEQ ID NO：120；

(88)融合轻链包含SEQ ID NO：149，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：146；融合重链包含SEQ ID NO：148，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：147，SEQ IDNO：82，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：120；

(89)融合轻链包含SEQ ID NO：147，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：148；融合重链包含SEQ ID NO：146，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：149，SEQ IDNO：82，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120；或

(90)融合轻链包含SEQ ID NO：149，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：146；融合重链包含SEQ ID NO：148，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：147，SEQ IDNO：82，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120。

在一个实施方案中，所述双特异性抗体具有同时结合抗原A和抗原B的活性。

在一个实施方案中，所述双特异性抗体为双旁原位抗体。

在另一方面，本发明提供了缀合物或融合蛋白，其包含本发明的双特异性抗体。

在具体的实施方案中，所述缀合物或融合蛋白包含与所述抗体缀合或融合的物质A，所述物质A选自治疗剂、药物前体、蛋白(例如酶)、病毒、脂质、生物反应调节剂(如免疫调节剂)、PEG、激素、寡核苷酸、诊断剂、细胞毒性剂，其可为药物或毒素，超声增强剂，非放射性标记物，可检测标记物，如化学发光物标记化合物(如鲁米诺、异鲁米诺、热性吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓盐和草酸酯)，或荧光发光金属(如152Eu，或镧系标记)。

在一个实施方案中，所述缀合物或融合蛋白为单体、二聚体或多聚体。

在又一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明所述的双特异性抗体或本发明所述的缀合物或融合蛋白。

在一个实施方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。

在一个实施方案中，所述药物组合物的剂型包括胃肠给药剂型或胃肠外给药剂型；较佳地，所述药物组合物的剂型为注射剂，包括静脉注射、静脉滴注、皮下注射、局部注射、肌肉注射、瘤内注射、腹腔内注射、颅内注射、或腔内注射。

在又一个方面，本发明提供了编码本发明的双特异性抗体的多核苷酸。

在一个实施方案中，所述多核苷酸具有编码所述双特异性抗体融合轻链的第一多核苷酸和编码融合重链的第二多核苷酸，优选地，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的比例为1∶1。

在又一个方面，本发明提供了含有本发明所述的多核苷酸的载体；优选地，所述载体包括：质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、或其组合。

在又一个方面，本发明提供了细胞，其包含本发明所述的多核苷酸。

在一个实施方案中，所述细胞含有本发明所述的载体或基因组中整合有本发明所述的多核苷酸。

在一个实施方案中，所述细胞选自下组：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、或其组合；优选地为哺乳动物细胞，如CHO-S细胞或293E细胞。

在又一个方面，本发明提供了所述双特异性抗体或本发明所述的缀合物或融合蛋白在治疗肿瘤(癌症)或在制备用于治疗肿瘤(癌症)的药物中的用途。

在一个实施方案中，所述疾病为癌症或肿瘤，优选地，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合。

在又一个方面，本发明提供了所述双特异性抗体或本发明所述的缀合物或融合蛋白在制备检测肿瘤(癌症)的试剂或试剂盒的用途。

在又一个方面，本发明提供了一种制备本发明所述双特异性抗体的方法，包括步骤：

(i)在合适的条件下，培养本发明所述的细胞，获得含有本发明所述的双特异性抗体的混合物；和

(ii)对步骤(i)中得到的混合物进行纯化和/或分离，从而获得本发明所述的双特异性抗体。

在一个实施方案中，所述纯化包括：亲和层析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析、或其组合。

在又一个方面，本发明提供了一种治疗疾病的方法，包括步骤：向需要的对象施用治疗有效量的本发明所述的双特异性抗体、或本发明所述的缀合物或融合蛋白、或本发明所述的药物组合物、或其组合。

在一个实施方案中，所述对象为人或非人哺乳动物。

附图说明

图1为双特异性抗体结构1的抗体结构示意图(A)和抗体各组分的蛋白质一级结构示意图(B)，其中抗体b可变区1表示为VL/Hb，抗体b可变区2表示为VH/Lb。

图2为双特异性抗体结构2的抗体结构示意图(A)和抗体各组分的蛋白质一级结构示意图(B)。

图3为双特异性抗体结构3的抗体结构示意图(A)和抗体各组分的蛋白质一级结构示意图(B)。

图4为双特异性抗体结构4的抗体结构示意图(A)和抗体各组分的蛋白质一级结构示意图(B)。

图5为双特异性抗体结构1的抗体。(A)显示Y100-A系列和Y100-B系列抗体在CHO细胞中瞬时转染表达水平。(B)显示Y101/Y103/Y104/Y105-A系列和Y101/Y103/Y104/Y105-B系列抗体在CHO细胞中瞬时转染表达水平。(C)显示Y106/Y110/Y116-A系列和Y106/Y110/Y116-B系列抗体在CHO细胞中瞬时转染表达水平。图5D显示Y100/Y101/Y103/Y104/Y105/Y106/Y110/Y116-B系列抗体表达量超过5mg/L的抗体，经过proteinA亲和层析后的HPLC-SEC检测纯度。。

图6为双特异性抗体结构2的Y200/Y201/Y203/Y204/Y205/Y206/Y210/Y216-A系列和B系列抗体在CHO细胞中瞬时转染表达水平，以及经过proteinA亲和层析后的HPLC-SEC检测纯度。

图7为双特异性抗体结构3的Y300/Y304/Y316-A系列、B系列、C系列和D系列抗体在CHO细胞中瞬时转染表达水平，以及经过proteinA亲和层析后的HPLC-SEC检测纯度。

图8为双特异性抗体结构4的Y400/Y404/Y416-A系列和B系列抗体在CHO细胞中瞬时转染表达水平，以及经过proteinA亲和层析后的HPLC-SEC检测纯度。

图9为相同靶点及抗体可变区序列的双特异性抗体结构1-4抗体之间的表达水平及纯度对比。(A)为具有S70抗体可变区序列(序列号：41和42)和G631抗体可变区序列(序列号：57和58)的双特异性抗体结构1-4抗体的表达水平及纯度。(B)具有S70抗体可变区序列(序列号：41和42)和3G12抗体可变区序列(序列号：59和60)的双特异性抗体结构1和2抗体的表达水平及纯度。(C)具有12A4抗体可变区序列(序列号：45和46)和3G12抗体可变区序列(序列号：59和60)的双特异性抗体结构1和2抗体的表达水平及纯度。(D)具有S70抗体可变区序列(序列号：41和42)和LAG35抗体可变区序列(序列号：33和34)的双特异性抗体结构1和2抗体的表达水平及纯度。(E)具有5C4抗体可变区序列(序列号：37和38)和Yervoy抗体可变区序列(序列号：27和28)的双特异性抗体结构1，3和4抗体的表达水平及纯度。(F)具有5C4抗体可变区序列(序列号：37和38)和10A7抗体可变区序列(序列号：29和30)的双特异性抗体结构1和2抗体的表达水平及纯度。(G)具有5C4抗体可变区序列(序列号：37和38)和G631抗体可变区序列(序列号：57和58)的双特异性抗体结构1和2抗体的表达水平及纯度。(H)具有5C4抗体可变区序列(序列号：37和38)和B-N10抗体可变区序列(序列号：63和64)的双特异性抗体结构1和2抗体的表达水平及纯度。(I)具有Elotuzumab抗体可变区序列(序列号：49和50)和NM3E2抗体可变区序列(序列号：47和48)的双特异性抗体结构1-4抗体的表达水平及纯度。

图10为不同的双特异性抗体结构的40℃加速热稳定性检测。(A)Y100-B6，Y100-B7，Y200-A1，Y200-B1，Y200-B3，Y300-A1和Y400-B1在0天，7天和14天40度处理的HPLC-SEC纯度检测：(B)Y101-B1，Y101-B2，Y201-A1，Y201-B1，Y101-B3，Y101-B4，Y201-A2和Y201-B2在0天，7天和14天40度处理的HPLC-SEC纯度检测；(C)Y103-B1，Y103-B2，Y203-A1，Y203-B1，Y104-B1，Y104-B2，Y304-A1和Y404-B1在0天，7天和14天40度处理的HPLC-SEC纯度检测；(D)Y105-B1，Y105-B2，Y205-A2，Y205-B2，Y106-B1，Y106-B2，Y206-A2，Y206-B1和Y206-B2在0天，7天和14天40度处理的HPLC-SEC纯度检测；(E)Y110-B1，Y110-B2，Y210-A1，Y210-B1，Y116-B1，Y116-B2，Y216-A1，Y216-B1，Y316-A1，Y416-B1在0天，7天和14天40度处理的HPLC-SEC纯度检测。

图11为不同的双特异性抗体结构的耐酸性检测，所用酸性溶液的pH值为3.5。图11A为Y100-B6，Y100-B7，Y200-A1，Y200-B1，Y200-B3，Y300-A1和Y400-B1在0分钟，30分钟和60分钟低pH处理后的HPLC-SEC纯度检测：图11B为Y101-B1，Y101-B2，Y201-A1，Y201-B1，Y101-B3，Y101-B4，Y201-A2和Y201-B2在0分钟，30分钟和60分钟低pH处理后的HPLC-SEC纯度检测；图11C为Y103-B1，Y103-B2，Y203-A1，Y203-B1，Y104-B1，Y104-B2，Y304-A1和Y404-B1在0分钟，30分钟和60分钟低pH处理后的HPLC-SEC纯度检测；图11D为Y105-B1，Y105-B2，Y205-A2，Y205-B2，Y106-B1，Y106-B2，Y206-A2，Y206-B1和Y206-B2在0分钟，30分钟和60分钟低pH处理后的HPLC-SEC纯度检测；图11E为Y110-B1，Y110-B2，Y210-A1，Y210-B1，Y116-B1，Y116-B2，Y216-A1，Y216-B1，Y316-A1，Y416-B1在0分钟，30分钟和60分钟低pH处理后的HPLC-SEC纯度检测。

图12为双特异性抗体结构1的Y100-B7体内药效实验结果，所用肿瘤细胞株为小鼠结肠癌MC38，所用小鼠品系为雌性C57BL/6小鼠。

图13为双特异性抗体结构1的Y101-B2体内药效实验结果，所用肿瘤细胞株为小鼠结肠癌MC38，所用小鼠品系为雌性C57BL/6小鼠。

定义

应注意非明确数量的实体限定应指一或多个(种)该实体；例如，“双特异性抗体”应理解为表示一或多个(种)双特异性抗体。同样地，非明确数量限定的、术语“一个或多个”和“至少一个”本文中可互换使用。

本文使用的术语“多肽”用于包括单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并且也指通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指两个或多个氨基酸的任一条或多条链，而不是指特定长度的该产物。因此、肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白”、“氨基酸链”、或任何指两个或多个氨基酸组成的一条或多条链的其他术语都包括在“多肽”的定义中，且术语“多肽”可代替这些术语的任何一个或与它们互换使用。术语“多肽”也用于指多肽的表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护基/阻断基衍生化、蛋白水解裂解或通过非自然产生的氨基酸的修饰。多肽可衍生自天然的生物源或通过重组技术生产，但不一定由指定核酸序列翻译而成。其可以任何方式产生，包括通过化学合成方式。

本文使用的术语“重组”，在涉及多肽或多核苷酸时指自然状态下不存在的多肽或多核苷酸的形式，其中一个非限制性的例子，可以通过将通常不会一起出现的多核苷酸或多肽组合在一起来实现。

“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽链分子之间或两个核酸分子之间的序列相似程度。同源性可通过比较每个序列中的位置来测定，可通过比对来进行比较。当在被比较的序列中的位置上有相同的碱基或氨基酸时，在该位置上的分子为同源的。多个序列之间的同源度为这些序列共有的配对或同源位点数量的函数。“无关的”或“非同源的”序列与本申请的序列之一之间具有少于40％的同源性，但优选小于25％的同源性。

多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)与另一序列具有一定的百分比(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)的“序列同一性”是指，在比对时，在这两个序列比较时该百分比的碱基(或氨基酸)是相同的。此种比对和百分比同源性或序列同一性，可使用本领域中已知的软件程序测定，例如，通过Ausubel等人编的(2007)Current Protocols in Molecular Biology描述的那些软件。优选地，使用默认参数用于比对。BLAST是一种比对程序，使用默认参数。具体地，程序为BLASTN和BLASTP，使用如下默认参数：Genetic code＝standard；filter＝none；strand＝both；cutoff＝60；expect＝10；Matrix＝BLOSUM62；Descriptions＝50sequences；sort by＝HIGH SCORE；Databases＝non-redundant，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的详细信息，可于以下互联网地址获得：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi，2008年5月21日最后一次访问。生物学等效的多核苷酸是具有上面提到的特定百分比的同源性，并编码具有相同或相似的生物活性多肽的多核苷酸。

术语“编码”在其应用于多核苷酸时指被认为“编码”某一多肽的多核苷酸，以其天然的状态或由本领域技术人员熟知的方法操作时，它可以被转录和/或翻译以产生该多肽的mRNA和/或其片段。反义链是此种核酸的互补物，该编码序列可以由其推导出。

本文使用的，“抗体”或者“抗原结合多肽”指特定识别并结合抗原的多肽或多肽复合体。抗体可为整个抗体也可为任何抗原结合片段或者其单链。因此术语“抗体”包括含有特定分子的任何蛋白或肽，该特定分子含有至少一部分的免疫球蛋白分子，该免疫球蛋白分子具有结合至抗原的生物活性。此种情况的实例包括但不限于，重链或轻链或其配体结合部分的互补决定区(CDR)，重链或轻链可变区，重链或轻链恒定区，框架(FR)区或其任何部分，或结合蛋白的至少一部分。

本文使用的术语“抗体片段”或“抗原结合片段”为抗体的一部分，该抗体例如F(ab′)₂、F(ab)₂、Fab′、Fab、Fv、Fd、Fv、dAb、Fab/c、互补决定区(CDR)片段、二硫键连接的Fvs(sdFv)、单链抗体(例如，scFv)、双价抗体或结构域抗体等。不管结构如何，与相同的抗原结合的抗体片段被认为是完整抗体。术语“抗体片段”包括适配体、适配体对映体(spiegelmers)和双体(diabodies)。术语“抗体片段”也包括任何合成的或基因改造的蛋白，它们与抗体一样可结合至特定的抗原以形成复合体。

“单链可变片段”或“scFv”指免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区域的融合蛋白。在某些方面，这些区域用10至约25个氨基酸的短接头肽连接。该接头可富含甘氨酸以具有柔性，也含有丝氨酸或苏氨酸以具有可溶性，且能将VH的N-末端连接至VL的C末端，反过来也一样。该蛋白质保留了原始的免疫球蛋白的特性，只是去除了恒定区并引入了接头。ScFv分子为本领域已知的，且描述于美国专利5,892,019中。

术语抗体包括多种宽泛类别的多肽，这些多肽可被生化识别。本领域技术人员应理解重链分为gamma、mu、alpha、delta、及epsilon(γ，μ，α，δ，ε)并具有一些亚类(例如，γ1-4)。该链的性质决定了抗体的“类”，如IgG，IgM，IgA，IgG，或者IgE。免疫球蛋白亚类(同型)例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5等被很好表征并在功能上具有特异性。本领域技术人员参考本申请可容易识别这些类和同型的每一种修饰形式，因此，这些形式在本申请范围内。所有免疫球蛋白类明确地在本申请的范围内，下列讨论通常将针对免疫球蛋白分子的IgG类。关于IgG，标准免疫球蛋白分子包含两个相同的轻链多肽(它们的分子量约为23,000道尔顿)和两个相同的重链多肽(它们的分子量为53,000-70,000)。这四条链通常经二硫键以“Y”型连接在一起，其中轻链在“Y”结构的口部开始支撑重链，并延伸穿过可变区。

本申请的抗体、抗原结合多肽、它们的变体或衍生物包括但不限于，多克隆抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化的抗体、灵长类化的(primatized)抗体、或嵌合抗体、单链抗体、抗原表位结合片段，例如，Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、Fvs、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)、包含VL结构域或VH结构域的片段、由Fab表达库产生的片段、和抗独特型(idiotypic)(抗-Id)抗体。本申请的免疫球蛋白分子或抗体分子可为任何类型的(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、免疫球蛋白分子的任何类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。

轻链分为kappa或lambda(κ，λ)。每类重链均可结合kappa或lambda轻链。通常，轻链和重链共价地结合在一起，且当这些免疫球蛋白由杂交瘤、B细胞或基因改造的宿主细胞产生时，两条重链的“尾部”部分通过共价二硫键或非共价连接结合在一起。在该重链中，氨基酸序列从Y型结构的叉端的N末端向每条链的底部C末端延伸。

轻链和重链两者都分成结构区和功能同源区。术语“恒定”和“可变的”为功能上的使用。在此，应认识到轻链可变结构域(VL)和重链可变结构域(VH)同时决定了抗原识别和特异性。相反地，轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域(CH1，CH2或CH3)提供了重要的生物学性质，例如分泌、经胎盘的流动性、Fc受体结合，补体结合等。通常恒定区结构域的数量随着远离抗体的抗原结合位点或氨基端的末端位置而增加。N末端部分为可变区，而在C末端部分为恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基末端。

如上所述，该可变区域使得抗体能选择性识别并特异性结合抗原上的抗原表位。即，抗体的VL结构域和VH结构域，或互补决定区(CDR)的亚类组合形成定义三维抗原结合位点的可变区域。这种四价抗体结构形成了抗原结合位点，该抗原结合位点存在于Y构型的每个臂的末端。更具体地，该抗原结合位点被每个VH和VL链(即，CDR-H1，CDR-H2，CDR-H3，CDR-L1，CDR-L2和CDR-L3)上的三个CDR定义。在一些实例中，例如，某些衍生自骆驼种或基于骆驼免疫球蛋白改造的免疫球蛋白，完整的免疫球蛋白分子可仅由重链组成，而没有轻链。参见，例如，Hamers-Casterman等，Nature363：446-448(1993)。

自然产生的抗体中，存在于每个抗原结合域中的六个“互补决定区”或“CDR”是短的，非连续的氨基酸序列，它们具有特定的定位以形成抗原结合结构域。该抗原结合结构域的其余氨基酸，称为“框架”区，具有更少的分子内可变性。该框架区主要采用β-折叠片构型，且CDR形成环，该环连接该β-折叠片结构，有时形成该β-折叠片结构的一部分。因此，框架区用于形成支架，该支架使CDR通过链内的、非共价作用在正确方向上定位。由该定位的CDR形成的抗原结合域定义了互补于免疫活性抗原表位的表面。该互补表面促进了抗体与其同源表位的非共价结合。本领域技术人员可针对任何给定的重链或轻链可变区容易地识别CDR和框架区的氨基酸，因为它们已经被明确定义(参见，“Sequences of Proteins ofImmunological Interest，”Kabat，E.，等，美国卫生和公共服务部(U.S.DepartmentofHealth and Human Services，)，(1983)；Chothia和Lesk，J.MoI.Biol.，196：901-917(1987)，其在此通过引用以全文形式结合至本文)。

在本技术领域内使用和/或可接受的情况下，一个术语有两个或两个以上定义时，本文使用的术语的定义用于包括所有的含义，除非明确说明与此相反。一个具体的例子为，使用术语“互补决定区”(“CDR”)来描述在重链和轻链多肽的可变区中都存在的非连续的抗原结合位点。这种具体区域由Kabat等描述于美国卫生和公共服务部，“Sequences ofProteins of Immunological Interest”(1983)和由Chothia等描述与J.MoI.Biol.196：901-917(1987)中，其通过全文引用结合至本文。根据Kabat和Chothia的定义，CDR包括相互比较时重叠的氨基酸残基，或氨基酸亚结构。然而，每种关于抗体或其变体的CDR的定义的应用都将在本文定义和使用的术语的范围内。包含如以上引用的每一篇参考文献定义的CDR的合适的氨基酸残基列于下表中作为比较。包含特定CDR的精确残基数将随该CDR的序列和大小变化。如果给定该抗体的可变区氨基酸序列，则本领域技术人员通常可确定哪些残基包含特定CDR。

[表1]抗体可变区的定义

	Kabat	Chothia
			CDR-H1	31-35	26-32
CDR-H2	50-65	52-58
			CDR-H3	95-102	95-102
CDR-L1	24-34	26-32
			CDR-L2	50-56	50-52
CDR-L3	89-97	91-96

Kabat等也定义了用于可变结构域序列的编号系统，该系统适用于任一种抗体。本领域技术人员可毫无疑义地将该“Kabat编号”系统用于任何可变结构域序列，而不依赖于该序列自身之外的任何实验数据。本文使用的“Kabat编号”是指Kabat等描述的编号系统，其内容记载于美国卫生和公共服务部，“Sequence of Proteins of ImmunologicalInterest”(1983)。

除了上表，Kabat编号系统描述的CDR区如下：CDR-H1在大约31号氨基酸处开始(即，第一半胱氨酸残基后约9个残基)，包括约5-7个氨基酸，并在下一个色氨酸残基处终止。CDR-H2在CDR-H1的末端后第15个残基处开始，包括约16-19个氨基酸，并在下一个精氨酸或赖氨酸残基处终止。CDR-H3在CDR-H2的末端后约第33个氨基酸残基处开始；包括3-25个氨基酸；并在序列W-G-X-G处终止，其中X为任意氨基酸。CDR-L1在约残基24处开始(即，在半胱氨酸残基之后)；包括大约10-17个残基；并终止于下一个色氨酸残基。CDR-L2在CDR-L1的末端后约16个残基后开始，并包括约7个残基。CDR-L3在CDR-L2的末端后约第33个残基处开始(即，在半胱氨酸残基之后)；包括约7-11个残基，并在序列F或W-G-X-G处终止，其中X为任意氨基酸。

本文描述的抗体可来自任何动物源，包括鸟和哺乳动物。优选地，抗体为人、鼠、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、驼马、马或鸡的抗体。在另一个实施例中，可变区可来自于软骨鱼(condricthoid)(例如，来自鲨鱼)。

本文使用的术语“重链恒定区”包括来自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链恒定区的多肽至少包含以下一种：CH1结构域，铰链(例如，上部铰链区、中间铰链区，和/或下部铰链区)结构域，CH2结构域，CH3结构域，或其变体或片段。例如，本申请中使用的抗原结合多肽可包含具有CH1结构域的多肽链；具有CH1结构域、至少一部分的铰链结构域和CH2结构域的多肽；具有CH1结构域和CH3结构域的多肽链；具有CH1结构域、至少一部分铰链结构域和CH3结构域的多肽链，或者具有CH1结构域，至少一部分铰链结构，CH2结构域，和CH3结构域的多肽链。在另一个实施方案中，本申请的多肽包括具有CH3结构域的多肽链。另外，在本申请中使用的抗体可能缺少至少一部分CH2结构域(例如，所有的或一部分的CH2结构域)。如上文所述，但本技术领域的普通技术人员应理解，重链恒定区可能会被修改，使得它们在氨基酸序列上与天然存在的免疫球蛋白分子不同。

本文所公开的抗体的重链恒定区可以来自于不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链恒定区可以包含来自IgG1分子的CH1结构域和来自IgG3的分子的铰链区。在另一例子中，重链恒定区可以包含铰链区，该铰链区部分来自IgG1分子，且部分地来自IgG3分子。在另一例子中，重链部分可包含嵌合铰链，该嵌合铰链一部分来自IgG1分子，并且一部分来自IgG4分子。

本文使用的术语“轻链恒定区”包括来自抗体轻链的氨基酸序列。优选地，所述轻链恒定区包括恒定kappa结构域和恒定lambda结构域中的至少一个。

“轻链-重链对”是指轻链和重链的集合，它们可通过轻链的CL结构域和CHl结构域之间的二硫键形成二聚体。

如前面所指出的，各种免疫球蛋白类的恒定区的亚基结构和三维结构是已知的。本文使用的，术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，而术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一(多数为氨基末端)恒定区。CH1结构域邻近VH结构域并且是免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端。

本文使用的术语“CH2结构域”包括一部分的重链分子，该部分范围，例如，从抗体的约残基244到残基360，使用常规的编号方案(残基244至360，Kabat编号系统；和残基231-340，EU编号系统；见Kabat等，美国卫生和公共服务部，“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”(1983)。CH2结构域是独特的，因为它与另一个结构域配对不紧密。相反，两个N-连接的支链的糖链插入至完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间。有文献记载，CH3结构域从CH2结构域延伸至IgG分子的C-末端，并包含约108个残基。

本文使用的术语“铰链区”包括重链分子的将CH1结构域连接至CH2结构域的那一部分。该铰链区包含约25个残基并且是柔性的，从而使两个N-末端抗原结合区独立地移动。铰链区可分为三个不同的结构域：上部、中部、和下部铰链结构域(Roux等人，J.Immunol161：4083(1998))。

本文使用的术语“二硫键”包括两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸含有巯基，该巯基可以与第二个巯基形成二硫键或桥连。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区由二硫键连接并且两个重链由两个二硫键连接，在对应于使用Kabat编号系统的239和242处(位置226或229，EU编号系统)连接。

本文使用的术语“嵌合的抗体”将用于指以下任何抗体：其中其免疫反应区或位点得自或来自第一物种且其恒定区(该恒定区可以是完整的，部分的或根据本申请修改过的)得自第二物种。在某些实施方案中靶结合区或位点将来自非人类来源(例如小鼠或灵长类)且恒定区来自人。

本文使用的“百分比人源化”通过以下方式计算：测定人源化的结构域和种系结构域之间的框架氨基酸差值的数量(即，非CDR差)，用氨基酸总数减去该数量，然后除以氨基酸总数，再乘以100。

所谓“特异性结合”或“对...有特异性”，通常意味着抗体通过它的抗原结合结构域结合抗原表位，并且该结合使得抗原结合结构域和抗原表位之间必须有一些互补性。根据这个定义，抗体被认为是“特异性结合”至抗原表位，当它结合到该抗原表位时，经抗原结合结构域的结合比结合至随机的、不相关的抗原表位更容易。本文中使用术语“特异性”以确定某一抗体结合至特定抗原表位的亲和力。例如，抗体“A”可能被视为对于一给定的抗原表位比抗体“B”具有更高的特异性，或抗体“A”可被说成是结合至抗原表位“C”比其对于相关抗原表位“D”具有更高的特异性。

本文使用的术语“治疗”(“treat”或“treatment”)是指治疗性治疗和预防或防治措施，其中对于受试者进行防止或减慢(减轻)不良的生理变化或疾病，如癌症的发展。有益的或所需的临床结果包括但不限于，减轻症状，降低疾病的程度、稳定(例如使其不恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病发展，改善或缓和疾病状态，并缓解(无论是部分或全部)，无论可否被检测到。“治疗”也可指与不接受治疗时的预计生存期相比能延长生存期。那些需要治疗的状况包括那些已经具有病症或症状以及那些容易具有病症或症状或那些将对病症或症状进行预防的情况。

本申请的实施方案提供了多种双特异性抗体，这些抗体包含两种不同或相同的抗原结合多肽单元。结合抗原的抗体结构域为Fab，或ScFv，或重链可变区(VH)-轻链可变区(VL)之间非共价配对(Fv)。特别地，这些双特异性抗体都具有抗体重链恒定区的Fc片段，Fc包含：(1)铰链，(2)重链第二恒定区(CH2)，和重链第三恒定区(CH3)。

任何上述的抗体或多肽还可包括额外的多肽，例如，如本文所述的编码的多肽，抗体N端的信号肽，该信号肽用于指导分泌，或如本文所述的其他异源多肽。

本技术领域的普通技术人员还应当理解，本文所述的抗体可被修改，以使得它们的氨基酸序列与天然存在的结合多肽不同，它们得自这些天然存在的结合多肽。例如，来自于指定的蛋白的多肽或氨基酸序列可与起始序列类似，例如，与起始序列具有一定百分比的同一性，例如，其可与起始序列有60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性。

此外，也可进行核苷酸或氨基酸替换，缺失，或插入以在“非必需”氨基酸区域进行保守替换或改变。例如，来自指定的蛋白质的多肽或氨基酸序列可与启动顺序相同，除了一个或多个独立的氨基酸的替换，插入，或缺失，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个或更多独立的氨基酸替换，插入，或缺失。在某些实施方案中，来自指定的蛋白质的多肽或氨基酸序列相对于起始序列有1至5个、1至10个、1至15个或1至20个独立的氨基酸的替换，插入，或缺失。

在其它实施方案中，本申请的抗原结合多肽可包含保守的氨基酸替换。

“保守氨基酸替换”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替换。具有类似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义，其包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸，谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)，B-支链的侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽的非必需氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替换。在另一实施方案中，一串氨基酸可被结构上类似的氨基酸串替换，后者在顺序上和/或侧链家族的组成上不同。

在下表中提供了的保守性氨基酸替换的非限制性实例，其中相似性得分为0或更高表示在这两个氨基酸之间有保守替换。

[表2]保守型氨基酸替换的非限制性列表

在一些实施方案中，所述抗体可以结合治疗剂、药物前体、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物反应调节剂、药剂或PEG。

该抗体可以连接至或融合至治疗剂上，该治疗剂可包括可检测标记物，如放射性标记物、免疫调节剂、激素、酶、寡核苷酸、光活性治疗剂或诊断剂、细胞毒性剂，其可为药物或毒素，超声增强剂，非放射性标记物，它们的组合和其他这类本领域已知的成分。

通过将其偶联化学发光化合物，该抗体被可检测地标记。然后，通过检测化学反应过程中产生的发光来确定化学发光物标记的抗原结合多肽的存在。特别有用的化学发光物标记化合物的例子有鲁米诺、异鲁米诺、热性(theromatic)吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓盐和草酸酯。

该抗体也可被可检测地标记，使用荧光发光金属如152Eu，或其他的镧系标记。这些金属可使用以下金属螫合基团连接到抗体上，如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。将多种基团连接至抗体的技术是公知的，参见，例如，Arnon等，“MonoclonalAntibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”，in MonoclonalAntibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(编.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.(1985)；Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery”，in Controlled Drug Delivery(第二版)，Robinson等(编)，Marcel Dekker，Inc.，pp.623-53(1987)；Thorpe，“AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”，in MonoclonalAntibodies’84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等(编)，pp.475-506(1985)；“Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use OfRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，in Monoclonal Antibodies For CancerDetection And Therapy，Baldwin等(编)，Academic Press pp.303-16(1985)，以及Thorpe等，“The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”，Immunol.Rev.(52：119-58(1982))。

抗体制备方法

抗体的制备方法在本技术领域是公知的，在此进行描述。在一些实施方案中，本申请的抗原结合多肽的可变区和恒定区是完全人类的。完全人抗体可使用现有技术中描述的技术制备，并如本文所述。例如，抗特定抗原的完全人抗体可以通过将该抗原施用至转基因动物来制备，该转基因动物已被修改以产生此种响应抗原刺激的抗体，但其内源性基因座已被禁用。可以用来制造这种抗体的示例性的技术描述于美国专利：6,150,584、6,458,592、6,420,140，其全部内容通过引用并入本文。

本申请的抗原结合多肽的结合特异性可通过体外实验测得，例如免疫沉淀，放射免疫分析法(RIA)或酶联免疫吸附法(ELISA)。

或者，描述的制备单链单元的技术(美国专利4,694,778号；Bird，Science 242：423-442(1988)；Huston等的Proc.Natl.Acad.Sci.USA 55：5879-5883(1988)；和Ward等的Nature 334：544-554(1989))可用于产生本申请的单链单元。经氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段形成单链单元，获得单链融合肽。在大肠杆菌(E.coli)中合成功能性Fv片段的技术也可以使用(Skerra等的Science 242：1038-1041(1988))。

可以用于产生单链Fvs(scFvs)和抗体的技术实例包括描述在美国专利第4,946,778号和5,258,498号；Huston等的Methods in Enzymology 203：46-88(1991)；Shu等的Proc.Natl.Sci.USA 90：1995-1999(1993)；和Skerra等的Science 240：1038-1040(1988)。对于某些应用，包括在人体内使用抗体和体外检测分析，可优选使用嵌合的、人源化的或人抗体。嵌合抗体为抗体的不同部分来自不同动物种类的分子，例如含有来自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。嵌合抗体的制造方法是本领域已知的。见，例如，Morrison，Science 229：1202(1985)；Oi等的BioTechniques 4：214(1986)；Gillies等的J.Immunol.Methods 125：191-202(1989)；美国专利第5,807,715；4,816,567和4,816397号，其全部内容通过引用的方式并入本文。

人源化的抗体为来自于非人类物种的抗体分子，并且该抗体分子结合所需的抗原，该抗体分子具有一个或多个来自非人类物种的互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区。通常，在人框架区中的框架残基将被来自CDR供体抗体的对应残基替换所改变，优选提高抗原结合能力。这些框架替换通过本领域已知的方法识别，例如，通过建立CDR和框架残基的相互作用模型，以鉴定对于抗原结合和序列比较重要的框架残基，以找出在特定位置的异常的框架残基。(见，例如，Queen等的美国专利第5,585,089号；Riechmann等的Nature 332：323(1988)，其全部内容通过引用并入本文)。可使用多种本领域已知的技术对抗体进行人源化，这些技术包括，例如，CDR-移植(EP 239，400；PCT公开号WO 91/09967；美国专利第5,225,539；5,530,101和5,585,089号)，饰面(veneering)或表面置换(resurfacing)(EP 592，106；EP 519，596；Padlan，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等的，Protein Engineering7(6)：805-814(1994)；Roguska等的Proc.Natl.Sci.USA 91：969-973(1994))，和链改组(shuffling)(美国专利号US 5,565,332，其全部内容通过引用结合至本文)。

使用常规的重组DNA技术，本申请的抗原结合多肽的一个或多个CDR，可插入框架区内，例如，插入至人框架区以使非人类抗体人源化。该框架区可以是天然存在的或共有的框架区，且优选为人的框架区(见，例如，Chothia等的J.Mol.Biol.278：457-479(1998)，人的框架区的列表)。优选地，该框架区和CDR的组合所产生的多核苷酸编码多肽，该多肽特异性地结合至所需多肽的至少一个抗原表位，例如，LIGHT。优选地，可在框架区内进行一个或多个氨基酸替换，并且，优选地，该氨基酸替换提高该抗体对抗原结合能力。此外，这种方法可用于获得一个或多个可变区半胱氨酸残基(该半胱氨酸残基参与链内二硫键形成)的氨基酸替换或缺失，这样产生缺乏一个或多个链内二硫键的抗体分子。其他对于该多核苷酸进行的改变都包含在本申请的范围内，并在现有技术范围内。

此外，可使用用于通过对来自小鼠抗体分子的基因剪接生产“嵌合抗体”的技术(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA：851-855(1984)；Neuberger等的Nature 372：604-608(1984)；Takeda等的Nature 314：452-454(1985))，将具有合适的抗原特异性，与具有合适生物活性的人抗体分子基因一起。如本文使用的，嵌合抗体为其中不同部分来自不同动物种类的分子，例如含有来自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。

然而，另一种用于产生重组抗体的高效方法公开于Newman，Biotechnology 10：1455-1460(1992)。具体地，该技术导致产生含有猴可变结构域和人恒定序列的灵长类化的抗体。该文件通过引用全文结合至本文中。此外，这种技术也被描述在共同转让的美国专利号5,658,570、5,693,780和5,756,096，其中每一篇通过引用并入本文。

或者，产生抗体的细胞系可使用本领域技术人员熟知的技术选择和培养。这样的技术描述在多种实验室手册和主要出版物中。在这方面，本文中适合使用的技术例如如下所述描述于Current Protocols in Immunology，Coligan等编，Green PublishingAssociates and Wiley-Interscience，John Wiley和Sons，New York(1991)，其通过引用以全文并入本文中，包括补充参考。

此外，本领域技术人员公知的标准技术可用于在编码本申请抗体的核苷酸序列中引入突变，包括，但不限于，定点诱变和PCR介导的突变，这产生氨基酸替换。优选地，所述变体(包括衍生物)，相对于参考可变重链区，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、轻链可变区、CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3，编码少于50个氨基酸替换、少于40个氨基酸替换、少于30个氨基酸替换、少于25个氨基酸替换、少于20个氨基酸替换、少于15个氨基酸替换、少于10个氨基酸替换、少于5个氨基酸替换、少于4个氨基酸替换、少于3个氨基酸替换、或少于2个氨基酸替换。或者，可沿着全部或部分的编码序列随机引入突变，例如通过饱和诱变，可对所得到的突变体针对生物活性筛选，以确定保留有活性的突变。

抗体结构信息

单特异性抗体为：对称抗体，包含两条相同的轻链和两条相同的重链，轻链和重链之间通过二硫键连接并靶向相应的抗原，重链和重链之间通过二硫键连接，整个抗体为“Y”型结构。轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(Lc)，重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区，其中重链恒定区包含CH1和Fc，其中Fc包含铰链、CH2和CH3。

双特异性抗体结构1为：F(ab)₂-(Fv)₂-Fc，4价对称双特异性抗体，包含2条相同的融合重链和2条相同的融合轻链，其中2条融合重链形成配对，融合轻链和融合重链形成配对，每个配对会形成一个或多个链间二硫键。所述抗体的融合重链包含抗体a重链可变区(VHa)、第一恒定区(CH1)、抗体b可变区1和Fc片段。抗体b可变区1在CH1和Fc之间，通过接头连接。所述抗体的融合轻链包含抗体a轻链可变区(VLa)、轻链恒定区(CL)和抗体b可变区2。其中抗体b可变区2在CL的C端，通过接头连接；其中，(1)抗体b可变区1为重链可变区(VHb)，抗体b可变区2为轻链可变区(VLb)，称为双特异性抗体结构1的A系列；或(2)抗体b可变区1为轻链可变区(VLb)，抗体b可变区2为重链可变区(VHb)，称为双特异性抗体结构1的B系列。其中VHa-VLa配对靶向抗原A，VHb-VLb配对靶向抗原B。

图1A为双特异性抗体结构1的结构示意图，图1B为抗体各组分的蛋白质一级结构示意图。

双特异性抗体结构2为：IgG(H)-ScFv，4价对称双特异性抗体，包含2条相同的融合重链和2条相同的轻链，其中2条融合重链形成配对，轻链-融合重链形成配对，每个配对会形成一个或多个链间二硫键；融合重链包含重链可变区(VHa)、重链第一恒定区(CH1)、Fc和ScFv，其中ScFv位于Fc的C端并通过接头连接，轻-重链配对靶向抗原A，ScFv靶向抗原B。

图2A为双特异性抗体结构2的结构示意图，图2B为抗体各组分的蛋白质一级结构示意图。

双特异性抗体结构3为：Tandem-ScFv-Fc，4价对称双特异性抗体，包含两条相同的融合肽。融合肽包含靶向抗原A的ScFv(ScFv-a)，靶向抗原B的(ScFv-b)和Fc，其中ScFv-b位于ScFv-a和Fc之间并通过接头或铰链连接。

图3A为双特异性抗体结构3的结构示意图，图3B为抗体各组分的蛋白质一级结构示意图。

双特异性抗体结构4为：DVD-IgG，4价对称双特异性抗体，包含2条相同的融合轻链和2条相同的融合重链，其中2条融合重链形成配对，2条融合轻链与融合重链形成配对，每个配对会形成一个或多个链间二硫键；融合轻链包含抗体b可变区I和通过接头连接的抗体a轻链，其中抗体a轻链在C端；融合重链包含抗体b可变区2和通过接头连接的抗体a重链，其中抗体a重链在C端。其中，(1)抗体b可变区1为轻链可变区(VLb)，抗体b可变区2为重链可变区(VHb)，或(2)抗体b可变区1为重链可变区(VHb)，抗体b可变区2为轻链可变区(VLb)。VHa-VLa配对靶向抗原A，VHb-VLb配对靶向抗原B。

图4A为双特异性抗体结构4的结构示意图，图4B为抗体各组分的蛋白质一级结构示意图。

上述4种双特异性抗体结构都是具有Fc片段的对称结构，且都为4价，其中2价针对抗原A，另外2价针对抗原B。

抗体制备及抗体活性检测

实施例1.双特异性抗体制备

1.质粒构建方法

所用的载体为pcDNA3.1(购自invitrogen)或pCHO1.0(购自Gibco)。

1.1聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段DNA

*模板DNA由武汉金开瑞合成。DNA序列根据序列号1-145的氨基酸序列进行逆向翻译获得。

所得PCR产物即为目的片段DNA。

1.2限制性内切酶酶切载体质粒

载体质粒DNA*	10μg
		buffer	10μl
限制性内切酶(例如NotI，NruI或BamHI-HF等)	5μl
		H<sub>2</sub>O	加至100μl
总体积	100μl

最适温度酶切4小时。

所得酶切产物即为酶切的载体DNA。

*载体分两种：重链表达载体和轻链表达载体。其中重链表达载体具有信号肽及人IgG1(GenBank登记号MG920253.1)重链恒定区DNA序列，包括CH1、铰链、CH2和CH3，酶切位点在信号肽的3’和CH1的5’端之间；其中轻链表达载体具有信号肽及人kappa或lambda轻链恒定区DNA序列，酶切位点在信号肽的3’和轻链恒定区的5’端之间。

1.3PCR产物或酶切产物进行纯化

使用Tiangen的DNA纯化试剂。具体操作步骤见Tiangen的试剂盒内附说明书。所得的纯化产物即为纯化的目的片段DNA，和纯化的酶切载体DNA。

(1)目的片段重组

5XCE II Buffer	4μl
		重组酶(Exnase II，Vazyme，货号C112-01)	2μl
酶切载体	50～200ng
		片段1	20～200ng
片段2	20～200ng
		H<sub>2</sub>O	Up to 20μl

重组条件：37℃ 30分钟。所得的重组产物置于冰上，准备进行转化。

重链片段重组于酶切的重链表达载体DNA，轻链片段重组于酶切的轻链表达载体DNA。

1.4热激转化

按照常规方法取10μl重组产物通过热激转化到100μl Trans10感受态细胞中。挑单菌落，送样至武汉金开瑞测序。重链片段重组于酶切的表达载体DNA所获得的质粒称为重链表达质粒，轻链片段重组于酶切的表达载体DNA所获得的质粒称为轻链表达质粒，融合肽片段重组于酶切的表达载体DNA所获得的质粒称为融合肽表达质粒，融合重链片段重组于酶切的表达载体DNA所获得的质粒称为融合重链表达质粒，融合链片段重组于酶切的表达载体DNA所获得的质粒称为融合链表达质粒。

具体涉及质粒构建如下：

1)图1中的双特异性抗体结构1，涉及两种质粒的构建。两种质粒分别为：融合轻链表达质粒(pFL)、和融合重链表达质粒(pFH)。

2)图2中的双特异性抗体结构2，涉及两种质粒的构建。两种质粒分别为：轻链表达质粒(pL)、和融合重链2表达质粒(pFH2)。

3)图3中的双特异性抗体结构3，涉及一种质粒的构建。该质粒为：融合肽表达质粒(pFP)。

4)图4中的双特异性抗体结构4，涉及两种质粒的构建。两种质粒分别为：融合轻链2表达质粒(pFL2)、和融合重链3表达质粒(pFH3)。

1.5双特异性抗体表达方法：

包括CHO-S和293E两种瞬时转染表达体系，具体如下：

(1)CHO-S瞬时转染步骤(以100ml转染总体积为例)

a)细胞转染前一天传代，例如，CD-CHO培养基(购自Thermo Fisher公司)可用于细胞传代，调整悬浮细胞密度至1×10⁶细胞/ml，体积90ml，保证细胞处于对数生长期，第二天转染时细胞密度能达到2×10⁶细胞/ml；

b)37℃，125rpm，5％CO₂过夜摇床培养；

c)转染当天，预热FectoPRO转染试剂(购自Polyplus transfection公司)到室温并轻轻混匀；取10ml无血清培养基，如opti PRO-SFM(购自Thermo Fisher公司)，稀释50μg质粒DNA，轻柔混匀，并将其加入到100μl转染试剂中，混合均匀，室温孵育10分钟形成转染复合物；转染时为两或三种质粒DNA共转染。

d)将转染复合物均匀加入到准备好的90ml处于对数生长期的细胞中，加入后立即摇匀，并放置在摇床培养37℃，125rpm，5％CO₂；

e)转染后2～4小时，加入75μl转染增强剂Fecto

Booster(购自Polyplustransfection公司)；

f)转染后18-24小时，降温至32℃培养；

g)转染后第3，5，7天进行补料，补料体积为细胞总体积的3.5％；

h)细胞活力低于70％收获，表达时间9-13天。

(2)293E瞬时转染步骤(以20ml转染总体积为例)

a)细胞转染前一天传代，例如，FreeStyle^TM 293(购自Thermo Fisher公司)可用于细胞传代，调整悬浮细胞密度至0.6-0.8×10⁶细胞/ml，体积20ml，保证细胞处于对数生长期，第二天转染时细胞密度能达到1.2-1.6×10⁶细胞/ml；

b)37℃，125rpm，5％CO₂过夜摇床培养；

c)转染当天，使用前预热LPEI到室温并轻轻混匀；

d)用0.67ml无血清培养基，如FreeStyle^TM 293，稀释20μg DNA，混匀；

e)用0.67ml无血清培养基，如FreeStyle^TM 293，稀释40μg LPEI，混匀；

f)将步骤5中稀释过的LPEI加入到步骤4中稀释过的DNA中，迅速混匀，并且室温孵育15分钟以使复合物形成；

g)将步骤6中的转染复合物均匀加入到准备好的20ml处于对数生长期的细胞中，加入后立即摇匀，并放置在摇床培养37℃，125rpm，5％CO₂；

h)转染后第1，3天进行补料，补料体积为细胞总体积的5％；

i)表达至第6天收获。

(3)共转染的质粒DNA具体如下：

1)表达图1所示的双特异性抗体1，需要质粒pFL和pFH共转染至CHO-S或293E细胞进行表达；

2)表达图2所示的双特异性抗体2，需要质粒pL和pFH2共转染至CHO-S或293E细胞进行表达；

3)表达图3所示的双特异性抗体3，需要质粒pFP单转染至CHO-S或293E细胞进行表达；

4)表达图4所示的双特异性抗体4，需要质粒pFL2和pFH3共转染至CHO-S或293E细胞进行表达。

一般情况下，如是两种质粒共转染表达，则两种质粒的摩尔数之比可以为1∶1，也可以为其他任意比例。

2.双特异性抗体的纯化方法：

抗体纯化主要为亲和层析、离子交换层析、疏水层析及分子筛，具体如下：

(1)收获：表达抗体的细胞培养液，3000×g离心10分钟后，取上清，用0.22μm的滤器过滤后4℃保存备用；

(2)亲和层析(MabSelect SuRe GE 17-5438-01，以18ml柱体积为例)

a)平衡：结合缓冲液(25mM三羟甲基氨基甲烷，pH7.0-7.4)平衡层析柱，直至UV检测器、电导数值至保持稳定或基线，至少平衡5个柱体积；

b)上样：将过滤的上清以流速5ml/min上样；

c)洗平衡：结合缓冲液冲洗5个柱体积；

d)洗脱：用洗脱缓冲液(50mM柠檬酸，pH 3.4±0.1)洗脱样品，流速5ml/min，洗脱5个柱体积，收集洗脱峰；

e)中和：洗脱液以1M Tris三羟甲基氨基甲烷pH8.0中和，调节样品pH至6.0±0.1。

(3)离子交换层析(以阳离子交换层析为例，HiTrap SP-HP GE 17-1151-01 5ml柱体积)

a)样品准备：亲和层析样品经过微滤后，用超纯水稀释，使得电导小于5mS/cm，然后调pH到6.0±0.1；

b)平衡及上样：先用5个柱体积的缓冲液B(25mM柠檬酸+1M氯化钠，电导应为80～90mS/cm，pH为6.0±0.1)平衡，再用至少5个柱体积的缓冲液A(25mM柠檬酸，电导应小于5mS/cm，pH为60±01)平衡层析柱，至电导、pH、紫外基线平稳后，上样，流速3ml/min；

c)洗平衡：用5个柱体积的缓冲液A进行清洗，流速5ml/min；

d)洗脱：0-30％缓冲液B，20个柱体积；100％缓冲液B 10个柱体积，整个过程流速3ml/min，洗脱液分管收集并进行检测。

(4)疏水层析(Capto phenyl ImpRes填料GE XK16/20 11.5cm/23ml)

a)样品处理：用5M氯化钠调节样品至1M氯化钠，调节pH至6.0；

b)平衡及上样：先用缓冲液A(25mM柠檬酸盐+1M氯化钠，pH为6.0±0.1)平衡5个柱体积，流速5ml/min；流速3.3ml/min上样；

c)洗平衡：用5个柱体积的缓冲液A进行清洗，流速5ml/min；10％缓冲液B(25mM柠檬酸盐，pH为6.0±0.1)清洗5个柱体积，流速5ml/min；

d)洗脱：90％缓冲液B洗脱，流速5ml/min，分管收集洗脱峰并进行检测；

(5)分子筛(HiLoad Superdex 200pg GE 2898933626/600)

a)平衡及上样：缓冲液(20mM组氨酸+0.15M氯化钠，pH6.0±0.1)平衡2个柱体积后上样，流速3ml/min；

b)洗脱：缓冲液洗脱2个柱体积，分管收集洗脱峰并进行检测。

本发明的部分双特异性抗体结构1的表达情况见图5A-D。图5A显示Y100-A系列和Y100-B系列抗体在CHO细胞中瞬时转染表达水平。图5B显示Y101/Y103/Y104/Y105-A系列和Y101/Y103/Y104/Y105-B系列抗体在CHO细胞中瞬时转染表达水平。图5C显示Y106/Y110/Y116-A系列和Y106/Y110/Y116-B系列抗体在CHO细胞中瞬时转染表达水平。图5D显示Y100/Y101/Y103/Y104/Y105/Y106/Y110/Y116-A和B系列抗体表达量超过5mg/L的抗体，经过proteinA亲和层析后的HPLC-SEC检测纯度。

由图5A-C可知，双特异性抗体结构1的两个系列：A系列和B系列，瞬转表达水平有显著差异，A系列表达量很少超过10mg/L，B系列具有更高的表达量。另外由图5D可以看到，双特异性抗体结构I的B系列的抗体纯度都超过70％，双特异性抗体结构1的A系列的抗体纯度与B系列基本一致。表达量低于5mg/L的抗体没有检测纯度。

对比的部分双特异性抗体结构2的表达情况见图6，显示Y200/Y201/Y203/Y204/Y205/Y206/Y210/Y216-A系列和B系列抗体在CHO细胞中瞬时转染表达水平，以及经过proteinA亲和层析后的HPLC-SEC检测纯度。

由图6可知，双特异性抗体结构2的两个系列：A系列和B系列，瞬转表达水平无显著差异，表达量均没有超过20mg/L。另外双特异性抗体结构2经proteinA亲和层析后HPLC-SEC检测纯度，不同分子之间差异极大，30％-90％均有分布。部分抗体表达量过低没有检测纯度。

对比的部分双特异性抗体结构3的表达情况见图7，显示Y300/Y304/Y316-A系列、B系列、C系列和D系列抗体在CHO细胞中瞬时转染表达水平，以及经过proteinA亲和层析后的HPLC-SEC检测纯度。

由图7可知，双特异性抗体结构3的4个系列：A系列、B系列、C系列和D系列，瞬转表达水平不高，表达量均没有超过12mg/L。另外双特异性抗体结构3经proteinA亲和层析后HPLC-SEC检测纯度，纯度较低，均没有超过50％。部分抗体表达量过低没有检测纯度。

对比的部分双特异性抗体结构4的表达情况见图8，显示Y400/Y404/Y416-A系列和B系列抗体在CHO细胞中瞬时转染表达水平，以及经过proteinA亲和层析后的HPLC-SEC检测纯度。

由图8可知，双特异性抗体结构4的两个系列：A系列和B系列，瞬转表达水平不高，表达量均没有超过6mg/L。另外双特异性抗体结构4经proteinA亲和层析后HPLC-SEC检测纯度，纯度差异大，30％-90％均有分布。部分抗体表达量过低没有检测纯度。

相同靶点及抗体可变区序列的双特异性抗体结构1-4抗体之间的表达水平及纯度对比见图9A-I。图9A为具有S70抗体可变区序列(序列号：41和42)和G631抗体可变区序列(序列号：57和58)的双特异性抗体结构1-4抗体的表达水平及纯度。图9B为具有S70抗体可变区序列(序列号：41和42)和3612抗体可变区序列(序列号：59和60)的双特异性抗体结构1和2抗体的表达水平及纯度。图9C为具有12A4抗体可变区序列(序列号：45和46)和3G12抗体可变区序列(序列号：59和60)的双特异性抗体结构1和2抗体的表达水平及纯度。图9D为具有S70抗体可变区序列(序列号：41和42)和LAG35抗体可变区序列(序列号：33和34)的双特异性抗体结构1和2抗体的表达水平及纯度。图9E为具有5C4抗体可变区序列(序列号：37和38)和Yervoy抗体可变区序列(序列号：27和28)的双特异性抗体结构1、3和4抗体的表达水平及纯度。图9F为具有5C4抗体可变区序列(序列号：37和38)和10A7抗体可变区序列(序列号：29和30)的双特异性抗体结构1和2抗体的表达水平及纯度。图9G为具有5C4抗体可变区序列(序列号：37和38)和G631抗体可变区序列(序列号：57和58)的双特异性抗体结构1和2抗体的表达水平及纯度。图9H为具有5C4抗体可变区序列(序列号：37和38)和B-N10抗体可变区序列(序列号：63和64)的双特异性抗体结构1和2抗体的表达水平及纯度。图9I为具有Elotuzumab抗体可变区序列(序列号：49和50)和NM3E2抗体可变区序列(序列号：47和48)的双特异性抗体结构1-4抗体的表达水平及纯度。

由图9A可知，双特异性抗体结构1的抗体具有比其他结构更高的表达抗体纯度，Y100-B6和Y100-B7具有比其他结构抗体更优的表达水平和/或纯度，其中Y100-B7具有最优的表达水平和纯度；由图9B可知，双特异性抗体结构1的抗体具有比其他结构更高的表达抗体纯度，Y101-B1和Y101-B2具有比其他结构抗体更优的表达水平和纯度，其中Y101-B2具有最优的表达水平和纯度；由图9C可知，双特异性抗体结构1的抗体具有比其他结构更高的表达水平和/或抗体纯度，Y101-B3和Y101-B4具有比双特异性抗体结构2的抗体更优的表达水平和纯度，其中Y101-B4具有最优的表达水平和纯度；由图9D可知，双特异性抗体结构1的抗体具有比其他结构更高的表达水平和/或抗体纯度，Y103-B1和Y103-B2具有比双特异性抗体结构2的抗体更优的表达水平和纯度，其中Y103-B2具有最优的表达水平和纯度；由图9E可知，双特异性抗体结构1的抗体具有比其他结构更高的表达水平和/或抗体纯度，Y104-B1和Y104-B2具有比双特异性抗体结构3和结构4的抗体更优的表达水平和/或纯度，其中Y104-B2具有最优的表达水平和纯度；由图9F可知，双特异性抗体结构1的抗体具有比其他结构更高的表达水平和/或抗体纯度，Y105-B1和Y105-B2具有比双特异性抗体结构2的抗体更优的表达水平和纯度，其中Y105-B2具有最优的表达水平和纯度；由图9G可知，双特异性抗体结构1的抗体具有比其他结构更高的表达水平和/或抗体纯度，Y106-B1和Y106-B2具有比双特异性抗体结构2的抗体更优的表达水平和/或纯度，其中Y106-B2具有最优的表达水平和纯度；由图9H可知，双特异性抗体结构1的抗体具有比其他结构更高的表达抗体纯度，Y110-B1和Y110-B2具有比双特异性抗体结构2的抗体更优的表达水平和纯度，其中Y110-B2具有最优的表达水平和纯度；由图9I可知，双特异性抗体结构1的抗体具有比其他结构更高的表达水平和/或抗体纯度，Y116-B1和Y116-B2具有比其他双特异性抗体结构更优的表达水平和纯度，其中Y116-B2具有最优的表达水平和纯度。

将上述每个抗体的铰链区，CH2结构域和CH3结构域同时替换为IgG2(GenBank登记号MH025834.2)，IgG3(GenBank登记号AJ390278)或IgG4(GenBank登记号KJ901516)对应序列，保持抗体可变区和接头序列相同情况下，替换后的抗体与原抗体之间的表达水平和纯度无显著差异。综合以上数据，可以看到，双特异性抗体结构1在表达水平和纯度方面，比其他双特异性抗体结构具有显著优势。

另外，Y100-B7，Y101-B2和Y101-B4等抗体在CHO细胞稳定表达pool中，表达水平均超过700mg/L，纯度均超过85％。从proteinA亲和层析，再通过常规的阴/阳离子交换层析等单克隆抗体纯化工艺，到最后获得纯度超过95％的目标产物，计算总的回收率均为40％，这与单克隆抗体在表达和纯化工艺是完全一致。

实施例2.双特异性抗体的生物学活性检测

1.抗原亲和力

1)抗原准备：抗原蛋白VEGFA，TGF-β1，IL-10，PD-1，CTLA-4，TIGIT，SLAMF7，LAG-3和CD16a(序列分别见表26)等均构建带His标签的表达质粒pcDNA3.1(购自invitrogen公司)，其中PD-1，CTLA-4，TIGIT，SLAMF7和CD16a这五个蛋白是选择的胞外结构域进行构建，再瞬时转染293E细胞中表达纯化。纯化方法为镍柱纯化和分子筛纯化两步，最后获得抗原蛋白SDS-PAGE检测纯度不小于95％；每种抗原蛋白调整浓度为2μg/ml，100μl/孔包被酶标板，4度过夜；弃上清，每孔加入250μl封闭液(3％BSA的PBS)；

2)抗体添加：按照实验设计，室温操作，梯度稀释抗体，稀释液为1％BSA的PBS。比如抗体稀释的初始浓度为3000nM，3倍稀释，稀释11个浓度梯度。将稀释好的抗体每孔200μl加入到酶标板孔中，室温下静置孵育2h，然后弃上清；

3)洗涤：用200μl/孔PBST(PBS含0.1％Tween20)洗涤3次；

4)二抗孵育：加入稀释好的二抗HRP标记抗人IgG(Sigma，A8792)，二抗1∶40000稀释使用，稀释液为1％BSA的PBS，体积为100μl/孔，同时设置只包被抗原和二抗的孔作为对照，室温孵育1h；

5)洗涤：用200μl/孔PBST(PBS含0.1％Tween20)洗涤5次；

6)显色：加TMB显色液(配制A，B显色液，购自武汉博士德公司；按A：B＝1∶1混匀，即用即配)100μl/well，37℃显色5min。

7)加2M HCl终止液100μl/well，终止液加入后，务必30min内进行酶标仪450nm读数，用Graphpad Prism 5做图，以抗体浓度(nM)为横坐标，平均荧光强度为纵坐标，采用Onesite--Specific binding方法计算EC50值，该值即为该抗体与对应的靶点抗原的亲和力。结果见表32。结果表明，在相同的抗体可变区序列的条件下，本发明的双特异性抗体(双特异性抗体结构1)与对应的靶点抗原的亲和力显著高于双特异性抗体结构2-4。并且，本发明的双特异性抗体(双特异性抗体结构1)对于任何靶点均具有最强的抗原结合活性。

2.细胞亲和力

1)细胞准备：双特异性抗体分子针对PD-L1端细胞结合活性检测用PD-L1阳性的H358细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)。取足够量细胞300×g离心5min，弃上清，用1％FBS-PBS重悬细胞，调整密度为4×10⁶/ml，每孔取50μl，按照细胞每孔为2×10⁵铺板。4度300×g，离心5min，弃上清，细胞铺板在冰上操作；

2)抗体添加：按照实验设计，梯度稀释抗体，稀释抗体在冰上操作。比如抗体稀释的初始浓度为3000nM，3倍稀释，稀释11个浓度梯度。将稀释好的抗体每孔50μl加入到细胞孔中，轻柔吹打混匀，在4度1100rpm/min震荡孵育2h；

3)洗涤：用150μl 1％FBS-PBS重悬细胞，4度300×g离心5min，弃上清。

重复洗涤一次；

4)二抗孵育：加入稀释好的二抗PE抗人IgG FC(Biolegend，409304)，二抗终浓度为8μg/ml，体积为50μl/孔，同时设置只加细胞和二抗的孔作为对照，轻柔吹打混匀，4度避光1100rpm/min震荡孵育1h；

5)洗涤：用150μl 1％FBS-PBS重悬细胞，4度300g离心5min，弃上清。

重复洗涤一次；

6)固定：每孔加入200μl的2％多聚甲醛重悬细胞在室温固定细胞20min.300×g离心5min，弃上清；

7)细胞重悬：用200μl 1％FBS-PBS重悬细胞，300×g离心5min，弃上清；

8)流式上样：用150μl 1％FBS-PBS重悬细胞，流式细胞仪上机检测；

9)数据分析：用流式分析软件FlowJo 7.6分析数据得到特定抗体浓度的平均荧光强度，用Graphpad Prism 5做图，以抗体浓度(nM)为横坐标，平均荧光强度为纵坐标，采用One site--Specific binding方法计算EC50值，该值即为该抗体与对应的靶点抗原的细胞亲和力。结果见表32。

由表32数据，可知在相同的抗体可变区序列的条件下，不同的双特异性抗体结构的靶点抗原结合活性存在显著差异，其中对于任何靶点，双特异性抗体结构1的抗体均具有最强的抗原结合活性。将上述每个抗体的铰链区，CH2结构域和CH3结构域同时替换为IgG2，IgG3或IgG4对应序列(同上)，保持抗体可变区和接头序列相同情况下，替换后的抗体与原抗体之间的抗原结合活性无显著差异。

实施例3.抗体的稳定性检测

实验操作：

1. 40℃热加速稳定性检测，具体操作步骤为：

1)将样品置换到特定缓冲液中，缓冲液的成分为20mM柠檬酸，pH5.5，并将样品浓度调整至1mg/mL；

2)将每种样品分装为500μL每管(共6管)密封后放置于40℃的水浴中，第0天、3天、5天、7天、10天和14天分别取样进行HPLC-SEC检测，水浴时间共计14天。

2.耐酸性检测，也称为低pH稳定性，是考察抗体分子在酸性环境中处理一段时间后再中和至生理条件是否还能保持原来的状态。具体操作步骤为：

抗体分子进行protein A亲和层析时，在酸洗脱步骤中(使用pH3.5的柠檬酸缓冲液)，洗脱下来的抗体溶液不进行中和，在该缓冲液中保持一段时间后，在第30min和第60min取样加入1/10体积的1M Tris-HCl(pH8.0)进行中和，并进行该样品的HPLC-SEC检测。

3. 1双特异性抗体结构1的稳定性检测

(1)不同的双特异性抗体结构的40℃加速热稳定性检测

检测结果见图10A-E。图10A为Y100-B6，Y100-B7，Y200-A1，Y200-B1，Y200-B3，Y300-A1和Y400-B1在0天，7天和14天40度处理的HPLC-SEC纯度检测：图10B为Y101-B1，Y101-B2，Y201-A1，Y201-B1，Y101-B3，Y101-B4，Y201-A2和Y201-B2在0天，7天和14天40度处理的HPLC-SEC纯度检测；图10C为Y103-B1，Y103-B2，Y203-A1，Y203-B1，Y104-B1，Y104-B2，Y304-A1和Y404-B1在0天，7天和14天40度处理的HPLC-SEC纯度检测；图10D为Y105-B1，Y105-B2，Y205-A2，Y205-B2，Y106-B1，Y106-B2，Y206-A2，Y206-B1和Y206-B2在0天，7天和14天40度处理的HPLC-SEC纯度检测；图10E为Y110-B1，Y110-B2，Y210-A1，Y210-B1，Y116-B1，Y116-B2，Y216-A1，Y216-B1，Y316-A1，Y416-B1在0天，7天和14天40度处理的HPLC-SEC纯度检测。

由图10可知，双特异性抗体结构1的不同抗体，40℃处理14天后纯度均维持在90％以上，没有出现大量聚集或降解情况，显示双特异性抗体结构1具有良好的热稳定性。其他的双特异性抗体结构，40℃处理14天后纯度均出现显著下降。

(2)不同的双特异性抗体结构的耐酸性检测

检测结果见图11A-E。图11A为Y100-B6，Y100-B7，Y200-A1，Y200-B1，Y200-B3，Y300-A1和Y400-B1在0分钟，30分钟和60分钟低pH处理后的HPLC-SEC纯度检测：图11B为Y101-B1，Y101-B2，Y201-A1，Y201-B1，Y101-B3，Y101-B4，Y201-A2和Y201-B2在0分钟，30分钟和60分钟低pH处理后的HPLC-SEC纯度检测；图11C为Y103-B1，Y103-B2，Y203-A1，Y203-B1，Y104-B1，Y104-B2，Y304-A1和Y404-B1在0分钟，30分钟和60分钟低pH处理后的HPLC-SEC纯度检测；图11D为Y105-B1，Y105-B2，Y205-A2，Y205-B2，Y106-B1，Y106-B2，Y206-A2，Y206-B1和Y206-B2在0分钟，30分钟和60分钟低pH处理后的HPLC-SEC纯度检测；图11E为Y110-B1，Y110-B2，Y210-A1，Y210-B1，Y116-B1，Y116-B2，Y216-A1，Y216-B1，Y316-A1，Y416-B1在0分钟，30分钟和60分钟低pH处理后的HPLC-SEC纯度检测。

由图11A-E可知，双特异性抗体结构1的抗体，在低pH条件下处理60分钟，抗体纯度均没有发生显著改变，说明双特异性抗体结构1具有良好的耐酸性。其他的双特异性抗体结构均出现部分抗体在低pH条件下处理60分钟后纯度显著下降。

综合图10和图11可以看到，相比其他的双特异性抗体结构，双特异性抗体结构1的抗体具有更好的热稳定性和耐酸性。

将上述每个抗体的铰链区，CH2结构域和CH3结构域同时替换为IgG2，IgG3或IgG4对应序列(同上)，保持抗体可变区和接头序列相同情况下，替换后的抗体与原抗体之间的稳定性无显著差异。

实施例4.双特异性抗体的体内药效实验1

1)实验材料：

细胞：MC38(小鼠结肠癌细胞株，购自ATCC)；

小鼠：C57BL/6小鼠，雌性，购自北京维通利华；

接种方式：培养MC38细胞，收集并调整细胞浓度，以1*10⁶个/只(0.1ml/只)背部皮下接种。肿瘤生长至100-200mm³分组给药，每组8只；

受试药：Y100-B7；

阴性对照：生理盐水；

阳性对照：Tecentriq(PD-L1单抗，Roche公司)；

给药方式：Y100-B7设置不同剂量(13.3mg/kg和4mg/kg)，Tecentriq给药剂量为10mg/kg，进行腹腔给药，第0天开始给药，每周3次，给药1周。

肿瘤体积：每2-3天对肿瘤长宽进行测量。一组瘤体积接近2000mm³或单只小鼠肿瘤体积达3000mm³时将结束该组。

2).实验结果

Y100-B7体内药效实验结果显示于图12。图12显示了双特异性抗体Y100-B7在小鼠肿瘤模型中的体内药效及瘤体积监测，结果显示Y100-B7高剂量组(13.3mg/kg)具有显著抑瘤效果，且优于Tecentriq。

实施例5.双特异性抗体的体内药效实验2

1)实验材料：

细胞：MC38(小鼠结肠癌细胞株，购自ATCC)；

小鼠：C57BL/6小鼠，雌性，购自北京维通利华；

受试药：Y101-B2；

阴性对照：生理盐水；

阳性对照：Tecentriq(PD-L1单抗，Roche公司)；

给药方式：Y101-B2设置不同剂量(13.3mg/kg和4.4mg/kg)，Tecentriq给药剂量为10mg/kg，进行腹腔给药，第0天开始给药，每周3次，给药3周。

肿瘤体积：每周3次对肿瘤长宽进行测量。一组瘤体积接近2000mm³或单只小鼠肿瘤体积达3000mm³时将结束该组。

2).实验结果

Y101-B2体内药效实验结果显示于图13。图13显示了双特异性抗体Y101-B2在小鼠肿瘤模型中的体内药效及瘤体积监测，结果显示Y101-B2高剂量组(13.3mg/kg)具有显著抑瘤效果，且优于Tecentriq。

实施例6：双旁原位抗体的制备及生物学活性检测

双旁原位抗体(biparatopic antibody)为双特异性抗体的一种，能结合相同抗原的两个不同表位。

表达质粒的构建，293E细胞瞬时转染及抗体制备方法同前。

涉及到的抗原为人Her2的胞外结构域(序列来源：UniProtKB-P04626)。

涉及到的抗体可变区序列见下表：

瞬时转染表达水平，单抗Herceptin mAb和Perjeta mAb均为30mg/L，双特异性抗体Y140-B1/B2/B3/B4均不低于25mg/L，双特异性抗体Y140-A1/A2/A3/A4表达分布在7-20mg/L之间，所有抗体的纯度SEC检测均不低于80％。

二、生物学活性检测

细胞亲和力

1)细胞准备：双特异性抗体分子Her2端亲和力检测用Her2阳性的BT-474细胞(购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)。取足够量细胞300×g离心5min，弃上清，用1％FBS-PBS重悬细胞，调整密度为2×10⁶/ml，每孔取50μl，按照细胞每孔为1×10⁵铺板。4度300×g，离心5min，弃上清，细胞铺板在冰上操作；

2)抗体添加：按照实验设计，梯度稀释表34的抗体，稀释抗体在冰上操作。比如抗体稀释的初始浓度为3000nM，3倍稀释，稀释11个浓度梯度。将稀释好的抗体每孔50μl加入到细胞孔中，轻柔吹打混匀，在4度1100rpm/min震荡孵育2h；

3)洗涤：用150μl 1％FBS-PBS重悬细胞，4度300×g离心5min，弃上清。重复洗涤一次；

5)洗涤：用150μl 1％FBS-PBS重悬细胞，4度300g离心5min，弃上清。重复洗涤一次；

9)数据分析：用流式分析软件FlowJo 7.6分析数据得到特定抗体浓度的平均荧光强度，用Graphpad Prism 5做图，以抗体浓度(nM)为横坐标，平均荧光强度为纵坐标，采用One site--Specific binding方法计算EC50值，该值即为该抗体与对应的靶点抗原的细胞亲和力。

[表35]部分双特异性抗体的结合活性

由上表可以看出，采用两种同抗原但表位相异的抗体组装的双特异性抗体，亲和力比两个单抗有明显提高，并且B系列双抗体亲和力要显著强于A系列抗体。

Claims

1.双特异性抗体，由2条相同的融合重链和2条相同的融合轻链组成，其中2条融合重链形成配对，融合轻链和融合重链形成配对，其中所述融合重链从N端到C端依次包含抗体a重链可变区VHa、第一恒定区CH1、抗体b可变区1和Fc片段，抗体b可变区1通过接头2连接CH1和通过接头3或肽键连接Fc片段，所述双特异性抗体的融合轻链从N端到C端依次包含抗体a轻链可变区VLa、轻链恒定区CL和抗体b可变区2，其中抗体b可变区2通过接头1连接CL的C端，其中，

（1）抗体b可变区1为抗体b的重链可变区VHb，抗体b可变区2为抗体b的轻链可变区VLb；

或

（2）抗体b可变区1为抗体b的轻链可变区VLb，抗体b可变区2为抗体b的重链可变区VHb；

其中VHa-VLa配对靶向抗原A，VHb-VLb配对靶向抗原B，

其中所述接头1和接头2为lin17，氨基酸序列如SEQ ID NO:85所示，

所述Fc片段包括铰链区、第二恒定区CH2和第三恒定区CH3。

2.权利要求1的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体是结构为F(ab)₂-(Fv)₂-Fc的4价对称双特异性抗体，其中F(ab)₂包括2个VHa，2个CH1，2个VLa和2个CL，(Fv)₂包括2个VH/VLb和2个VL/VHb，其中所述VH/VLb和所述VL/VHb的位置可以互换。

3.权利要求1的双特异性抗体，其中VHa-VLa配对形成一个或多个链间二硫键，VHb-VLb配对形成一个或多个链间二硫键。

4.权利要求1或2的双特异性抗体，其中抗体b可变区1为抗体b的轻链可变区VLb，抗体b可变区2为抗体b的重链可变区VHb。

5. 权利要求1-2任一项的双特异性抗体，其中所述接头3选自SEQ ID NO:69-90组成的组。

6. 权利要求1-2任一项的双特异性抗体，其中所述接头3选自SEQ ID NO: 71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，82，83，85，86，87，88，89或90。

7. 权利要求1-2任一项的双特异性抗体，其中CL的序列选自SEQ ID NO:104-110组成的组。

8. 权利要求1-2任一项的双特异性抗体，其中CH1的序列选自SEQ ID NO:111-114组成的组。

9.权利要求1-2任一项的双特异性抗体，其中CH2的序列选自SEQ ID NO:115-119组成的组。

10. 权利要求1-2任一项的双特异性抗体，其中CH3的序列选自SEQ ID NO:120-128组成的组。

11.权利要求1-2任一项的双特异性抗体结构，其中抗原A和抗原B可以相同或不同。

12.权利要求1-2任一项的双特异性抗体结构，其中，所述抗原A和抗原B各自独立地选自下组：免疫细胞表面抗原、肿瘤抗原、病毒、细菌、内毒素、细胞因子、或其组合。

13.权利要求1-2任一项的双特异性抗体结构，其中抗原A或抗原B不同或表示相同抗原的不同表位。

14.权利要求1-2任一项的双特异性抗体，其中所述抗原A和/或抗原B选自PD-L1，PD-1，VEGFA，IL-10，IL-10R，BCMA，VEGF，TGF-β，CTLA-4，LAG-3，TIGIT，CEA，CD38，SLAMF7，B7-H3，Her2，EpCAM，CD19，CD20，CD30，CD33，CD47，CD52，CD133，EGFR，GD2，GD3，GM2，RANKL，CD3和/或CD16a。

15. 权利要求1-2任一项的双特异性抗体结构，其中所述抗原A和/或抗原B为氨基酸序列选自SEQ ID NO:129-145所示的多肽。

16.权利要求1-2任一项的双特异性抗体，其中所述抗原A和抗原B选自以下各项组成的组：

PD-L1和VEGF，

PD-1和VEGF，

PD-L1和TGF-β，

PD-1和TGF-β，

PD-1和CTLA-4，

PD-1和LAG-3，

PD-1和TIGIT，

PD-1和IL-10，

SLAMF7和CD16a，和

Her2和Her2。

17.权利要求1-2任一项的双特异性抗体，其选自以下各项组成的组：

(1) 融合轻链包含SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:42；融合重链包含SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120；

(2) 融合轻链包含SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:46；融合重链包含SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120；

(3) 融合轻链包含SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:58；融合重链包含SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120；

(4) 融合轻链包含SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:104，SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:54；融合重链包含SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120；

(5) 融合轻链包含SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:104，SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:58；融合重链包含SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:120；

(6) 融合轻链包含SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:104，SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:58；融合重链包含SEQ ID NO:67，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120；

(7) 融合轻链包含SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:60；融合重链包含SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:120；

(8) 融合轻链包含SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:34；融合重链包含SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:120；

(9) 融合轻链包含SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:28；融合重链包含SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120；

(10) 融合轻链包含SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:28；融合重链包含SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:120；

(11) 融合轻链包含SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:30；融合重链包含SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120；

(12) 融合轻链包含SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:30；融合重链包含SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:120；

(13) 融合轻链包含SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:58；融合重链包含SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120；

(14) 融合轻链包含SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:60；融合重链包含SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120；

(15) 融合轻链包含SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:60；融合重链包含SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:120；

(16) 融合轻链包含SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:64；融合重链包含SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120；

(17) 融合轻链包含SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:64；融合重链包含SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:120；

(18) 融合轻链包含SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:48；融合重链包含SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120；

(19) 融合轻链包含SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:48；融合重链包含SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:120；

(20) 融合轻链包含SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:41；融合重链包含SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120；

(21) 融合轻链包含SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:45；融合重链包含SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120；

(22) 融合轻链包含SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:57；融合重链包含SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120；

(23) 融合轻链包含SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:53；融合重链包含SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:54，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120；

(24) 融合轻链包含SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:57；融合重链包含SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:120；

(25) 融合轻链包含SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:67；融合重链包含SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120；

(26) 融合轻链包含SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:57；融合重链包含SEQ ID NO:67，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120；

(27) 融合轻链包含SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:57；融合重链包含SEQ ID NO:67，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:120；

(28) 融合轻链包含SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:27；融合重链包含SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:120；

(29) 融合轻链包含SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:29；融合重链包含SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120；

(30) 融合轻链包含SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:29；融合重链包含SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:120；

(31) 融合轻链包含SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:57；融合重链包含SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120；

(32) 融合轻链包含SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:59；融合重链包含SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120；

(33) 融合轻链包含SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:59；融合重链包含SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:120；

(34) 融合轻链包含SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:63；融合重链包含SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:64，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120；

(35) 融合轻链包含SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:63；融合重链包含SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:64，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:120；

(36) 融合轻链包含SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:47；融合重链包含SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120；

(37) 融合轻链包含SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:47；融合重链包含SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:120；

（38）融合轻链包含SEQ ID NO:147，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:149；融合重链包含SEQ ID NO:146，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:148，SEQ IDNO:82，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120；

（39）融合轻链包含SEQ ID NO:149，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:147；融合重链包含SEQ ID NO:148，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:146，SEQ IDNO:82，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120；

（40）融合轻链包含SEQ ID NO:147，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:149；融合重链包含SEQ ID NO:146，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:148，SEQ IDNO:82，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:120；

（41）融合轻链包含SEQ ID NO:149，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:147；融合重链包含SEQ ID NO:148，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:146，SEQ IDNO:82，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:120；

（42）融合轻链包含SEQ ID NO:147，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:148；融合重链包含SEQ ID NO:146，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:149，SEQ IDNO:87，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120；

（43）融合轻链包含SEQ ID NO:149，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:146；融合重链包含SEQ ID NO:148，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:147，SEQ IDNO:82，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120；

（44）融合轻链包含SEQ ID NO:147，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:148；融合重链包含SEQ ID NO:146，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:149，SEQ IDNO:82，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:120；或

（45）融合轻链包含SEQ ID NO:149，SEQ ID NO:104， SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:146；融合重链包含SEQ ID NO:148，SEQ ID NO:111， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:147，SEQ IDNO:82，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:120。

18.药物组合物，其包含权利要求1-17任一项的双特异性抗体。

19.权利要求18所述的药物组合物，所述药物组合物的剂型包括胃肠给药剂型或胃肠外给药剂型。

20.权利要求18所述的药物组合物，所述药物组合物的剂型为注射剂，包括适于静脉注射、静脉滴注、皮下注射、局部注射、肌肉注射、瘤内注射、腹腔内注射、颅内注射、或腔内注射的注射剂。

21.缀合物或融合蛋白，其包含权利要求1-17任一项的双特异性抗体。

22.权利要求21的缀合物或融合蛋白，其包含与所述抗体缀合或融合的物质A，所述物质A为治疗剂。

23.权利要求21的缀合物或融合蛋白，其包含与所述抗体缀合或融合的物质A，所述物质A为药物前体。

24.权利要求21的缀合物或融合蛋白，其包含与所述抗体缀合或融合的物质A，所述物质A为蛋白。

25.权利要求21的缀合物或融合蛋白，其包含与所述抗体缀合或融合的物质A，所述物质A为病毒。

26.权利要求21的缀合物或融合蛋白，其包含与所述抗体缀合或融合的物质A，所述物质A为脂质。

27.权利要求21的缀合物或融合蛋白，其包含与所述抗体缀合或融合的物质A，所述物质A为生物反应调节剂。

28.权利要求21的缀合物或融合蛋白，其包含与所述抗体缀合或融合的物质A，所述物质A为PEG。

29.权利要求21的缀合物或融合蛋白，其包含与所述抗体缀合或融合的物质A，所述物质A为激素。

30.权利要求21的缀合物或融合蛋白，其包含与所述抗体缀合或融合的物质A，所述物质A为寡核苷酸。

31.权利要求21的缀合物或融合蛋白，其包含与所述抗体缀合或融合的物质A，所述物质A为诊断剂。

32.权利要求21的缀合物或融合蛋白，其包含与所述抗体缀合或融合的物质A，所述物质A为细胞毒性剂。

33.权利要求21的缀合物或融合蛋白，其包含与所述抗体缀合或融合的物质A，所述物质A为药物或毒素。

34.权利要求21的缀合物或融合蛋白，其包含与所述抗体缀合或融合的物质A，所述物质A为超声增强剂。

35.权利要求21的缀合物或融合蛋白，其包含与所述抗体缀合或融合的物质A，所述物质A为非放射性标记物。

36.权利要求21的缀合物或融合蛋白，其包含与所述抗体缀合或融合的物质A，所述物质A为可检测标记物。

37.权利要求21的缀合物或融合蛋白，其包含与所述抗体缀合或融合的物质A，所述物质A为荧光发光金属。

38.权利要求24所述的缀合物或融合蛋白，其中所述蛋白为酶。

39.权利要求27所述的缀合物或融合蛋白，其中所述生物反应调节剂为免疫调节剂。

40.权利要求36所述的缀合物或融合蛋白，其中所述可检测标记物为化学发光物标记化合物。

41.权利要求37所述的缀合物或融合蛋白，其中所述荧光发光金属为152Eu。

42.权利要求37所述的缀合物或融合蛋白，其中所述荧光发光金属为镧系标记。

43.权利要求40所述的缀合物或融合蛋白，其中所述化学发光物标记化合物为鲁米诺。

44.权利要求40所述的缀合物或融合蛋白，其中所述化学发光物标记化合物为异鲁米诺。

45.权利要求40所述的缀合物或融合蛋白，其中所述化学发光物标记化合物为热性吖啶鎓酯。

46.权利要求40所述的缀合物或融合蛋白，其中所述化学发光物标记化合物为咪唑。

47.权利要求40所述的缀合物或融合蛋白，其中所述化学发光物标记化合物为吖啶鎓盐。

48.权利要求40所述的缀合物或融合蛋白，其中所述化学发光物标记化合物为草酸酯。

49.编码权利要求1-17任一项的双特异性抗体的多核苷酸。

50.细胞，其包含权利要求49所述的多核苷酸。

51.权利要求1-17任一项的双特异性抗体或权利要求21-48任一项的缀合物或融合蛋白在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。

52.权利要求1-17任一项的双特异性抗体或权利要求21-48任一项的缀合物或融合蛋白在制备检测肿瘤的试剂或试剂盒的用途。

53.权利要求51或52所述的用途，其中所述肿瘤为癌症。