CN106661122A - 具有针对cd79和cd22的特异性的分子 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及包含特异性针对抗原CD22的结合结构域和特异性针对抗原CD79a和/或CD79b的结合结构域的多特异性分子，包含所述多特异性分子的组合物和二者在治疗(例如自身免疫性疾病的治疗)中的用途。

Description

具有针对CD79和CD22的特异性的分子
发明领域
本公开涉及至少对抗原CD22和CD79是双特异性的分子，包含所述分子的制剂，以及其中任一种在治疗中用途。本公开还扩展至制备所述分子和所述制剂的方法。在独立的方面，本公开还扩展至本文所描述的新的抗体序列和片段。
发明背景
体内生物学机制是极其复杂的信号级联，其难以解卷积和理解。此类信号传导的一个实例是激活B细胞所需的信号传导。B细胞抗原受体(BCR)由膜免疫球蛋白(mIg)分子和缔合的Igα/Igβ(CD79a/CD79b)异二聚体(α/β)组成。mIg亚单位结合抗原，导致受体聚集，而α/β亚单位将信号转导到细胞内部。BCR聚集快速激活Src家族激酶Lyn、Blk和Fyn以及Syk和Btk酪氨酸激酶。这启动由BCR、上述酪氨酸激酶、衔接体蛋白质(诸如CD19和BLNK)以及信号传导酶(诸如PLCγ2、PI3K和Vav)组成的“信号体”的形成。
从信号体发出的信号激活涉及激酶、GTP酶和转录因子的多个信号级联。这导致细胞代谢、基因表达和细胞骨架组构的变化。BCR信号传导的复杂性允许许多不同的结果，包括存活、耐受性(无反应性)或凋亡、增殖和分化为抗体产生细胞或记忆B细胞。应答的结果由细胞的成熟状态、抗原的性质、BCR信号传导的幅度和持续时间以及来自其它受体(诸如CD40、IL-21受体和BAFF-R)的信号确定。许多其它跨膜蛋白质(其中一些是受体)调节BCR信号传导的特定元件。其中一些，包括CD45、CD19、CD22、PIR-B和FcγRIIB1(CD32)。BCR信号传导的幅度和持续时间受包括涉及Lyn/CD22/SHP-1途径、Cbp/Csk途径、SHIP、Cbl、Dok-1、Dok-3、FcγRIIB1、PIR-B的负反馈环和BCR的内化限制。在体内，B细胞通常由捕获抗原并在其细胞表面上展示它们的抗原呈递细胞激活。通过此类膜相关抗原激活B细胞需要BCR诱导的细胞骨架重构。
自身反应性B细胞负责产生可直接或间接引起或加重自身免疫病症的致病性自身抗体。CD20阳性B细胞的耗尽已经用于成功治疗许多自身免疫病症，并因此结论性地确定B细胞在引起或维持许多自身免疫性疾病中起重要作用。尽管B细胞耗尽已经是成功的治疗选择，但也存在控制B细胞生长和激活状态也可以是调节B细胞功能的有效方式的证据。因此，需要不耗尽B细胞并提供控制B细胞而没有已被证明与一些副作用相关的长期抑制B细胞免疫性的灵活性的替代策略。此外，并非所有B细胞应答或活性都是有害的，并且证据表明维持调节性B细胞群可能是保护性的。这样的方法应该在由不适当或过量的BcR信号传导引起的具有异常B细胞功能的疾病中有效。实例包括但不限于炎症、自身免疫和癌症。特别感兴趣的是对BcR信号传导具有直接需求或需要抑制或刺激体液免疫应答的疾病。
双特异性抗体被广泛预期在下一代生物治疗剂中起主要作用(D.Holmes,NatureRev Drug Disc Nov 2011:10；798)。它们具有在更大比例的患者中提供优异的、长期的、广泛的功效的潜力。这可以通过在共同疾病途径中同时共同接合不同的抗原从而减少冗余来实现；或通过靶向来自独立途径的抗原以提供累加或协同效应来实现。
迄今为止，抑制B细胞功能而不缺失B细胞的策略已经集中在利用CD32b(FcgRIIB)的天然调节机制。这些包括针对CD79b/CD32b(Veri等人，Arthritis&Rheumatism 2010 621933-1943)、CD19/CD32b(Karnell等人，J.Immunol 2014 192 1480-1490)的双特异性抗体和具有增强的CD32b结合的具有Fc的CD19抗体(Chu等人，Arthritis&Rheumatology 201466 1153-1164)。
发生Fcγ受体IIb(CD32b)与B细胞受体的共连接以天然地调节信号传导，特别是当抗原与小的免疫复合物中的抗体结合时。然后CD32b募集拮抗BcR激活的磷酸酶SHP-1和SHIP-1。尽管这种天然调节机制可以控制B细胞功能，但是由CD32b的蛋白质序列变异引起的CD32b功能的破坏可以导致自身免疫疾病，并且该受体可以在自身免疫疾病中下调，例如在SLE的情况下。因此，阻断B细胞活性的替代方式是优选的，因为它们提供调节BcR功能的替代的、非天然的方式。当天然机制在给定疾病中失去功能时，这些替代机制可能是特别重要的。
双特异性抗体有助于获得新型生物学，诸如：
1)如果合适的话，细胞上的交联受体，
2)诱导细胞介导的效应，
3)将细胞因子定位于细胞以调节信号传导或局部阻断细胞因子功能，
4)同时接合多个表位以产生“新活性”、增加功能或特异性，其可能不会由单一单克隆抗体表现或实际上是未连接的抗体的混合物(“聚-单克隆”)，包括涉及不同抗原的混合物。
本发明人已经出乎意料地发现，通过使用双特异性抗体将BcR(CD79)偶联到阴性调节分子CD22(在正常生理条件下CD22将被从复合物中排除)上可以抑制BcR信号传导。CD22负责在不存在抗原结合的情况下通过BcR调节补充性(tonic)信号传导。然而，一旦抗原结合，CD22通常被从BcR复合物中排除。通过使用双特异性抗体物理连接BcR与CD22信号传导，本发明人已发现可抑制B细胞中的激活。
因此，本发明人已经鉴定了至少针对CD22和CD79是双特异性的分子的协同功能。当以双特异性(多特异性)形式提供具有特异性组合的结合区而不是简单地作为例如单克隆抗体或其结合片段的混合物提供时，这种功能似乎是初始可检测的。
因此，本发明的多特异性分子可用于控制与某些疾病诸如自身免疫和癌症相关的异常B细胞功能。
本公开内容的概述
因此提供了包含特异性针对抗原CD22的结合结构域和特异性针对抗原CD79的结合结构域的多特异性分子。
根据本公开的双特异性形式的组合在功能性体外测定中显示出令人感兴趣的生物活性，例如抑制B细胞信号传导，如通过以下任一测量而得：除了在B细胞上抑制CD86、CD71和/或CD40的表达外，抑制Akt S473的磷酸化、抑制P38和PLCγ2Y759的磷酸化、抑制IkB。单独的组分或混合物中提供的组分的相同水平的活性不明显。然而，当提供具有针对CD22和CD79b的特异性的双特异性构建体时，活性明显。
在这些测定中观察到的抑制表明包含特异性针对CD22的结合结构域和特异性针对CD79的结合结构域的本发明的多特异性分子可用于改变B细胞功能并提供B细胞耗尽的治疗性替代物。
B细胞受体信号传导是B细胞的关键功能并且是B细胞的抗原特异性激活所必需的。BcR信号传导从B细胞发展的早期到记忆B细胞应答的激活和发展是关键的。B细胞受体由与CD79a和CD79b的异二聚体复合物缔合的表面免疫球蛋白(Ig)分子组成。当表面Ig识别抗原时，据认为这导致CD79a/b复合物的聚集，其导致包括Src家族激酶以及Syk和Btk酪氨酸激酶的即时信号级联的下游激活。然后，该信号传导复合物可以募集衔接体蛋白质诸如CD19和BLNK，并导致PLCγ2和PI3K的激活，其继而可以激活进一步的下游途径，诸如控制B细胞生长、存活和分化的那些途径。该信号传导复合物可以通过经由BAFF-R、IL-21R和CD40的信号传导的其它第二信号进一步调节，并且还可以通过其他信号传导分子诸如CD19、CD21、CD83、CD22、CD32b和CD45等调节。在通过BcR识别抗原时，激活的第一应答之一是表面受体诸如共刺激分子CD80和CD86的上调。这些分子结合T细胞上的相应受体，其提供进一步的存活和激活信号，所述信号允许在MHC II类的背景中识别抗原的T细胞的存活和扩增。通过B细胞在II类MHC的背景下将抗原呈递回释放诸如IL-2和IL-21的因子的T细胞的能力，该应答得到进一步放大。这些细胞因子又大大扩增了B细胞的数量。因此，CD86在细胞表面上的下调可以指示B细胞信号传导的抑制。
此外，B细胞受体信号传导的抑制可导致下游功能的抑制。一个这样的结果是抑制共刺激分子诸如CD86(或其表达降低)，这将导致T细胞功能、存活和分化的抑制。
因此，B细胞受体信号传导的抑制可有益于控制与自身免疫和癌症相关的异常B细胞功能。B细胞受体信号传导是自身免疫疾病中B细胞增殖、分化、抗原呈递和细胞因子释放所必需的。因此，抑制BcR活性可以调节B细胞功能，诸如免疫球蛋白分泌、T细胞激活和控制与例如自身免疫病症相关的不适当的B细胞活性。此外，还有一些B细胞白血病和淋巴瘤需要B细胞受体信号传导来存活和生长，这可以通过B细胞受体激活的抑制剂来控制。
在一个实施方案中，本发明的多特异性分子的结合结构域各自独立地包含特异性针对相关抗原(诸如CD22或CD79或如果是三特异性则为另外的抗原分子)的一个或两个(诸如两个)抗体可变结构域。
本文所用的CD79是指由CD79a和CD79b组成的复合物。因此，结合CD79的抗体或结合结构域可以结合CD79a和/或CD79b。本文所用的结合CD79a和/或CD79b是指特异性针对CD79a、特异性针对CD79b和既特异性针对CD79a又特异性针对CD79b(即识别CD79a上的表位并且相同的抗体或结合结构域也识别CD79b上的表位，即泛(pan)特异性)或特异性针对CD79a和CD79b的复合物(即识别以复合物形式的CD79a和CD79b的相互作用形成的表位，并且这能够区分复合物与个体成分)。
在一个实施方案中，在本公开的分子中使用的抗体或其结合片段特异性针对CD79a。
在一个实施方案中，在本公开的分子中使用的抗体或其结合片段特异性针对CD79b。
在一个实施方案中，在本公开的分子中使用的抗体或其结合片段特异性针对CD79复合物，即它识别存在于复合物中并且特异性针对例如包含CD79a和CD79b之间相互作用的表位。
在一个实施方案中，甚至在结合结构域特异性针对CD79a或CD79b的情况下，应当理解，当处于复合物形式时，结合结构域优选仍结合CD79a或CD79b，因为两种蛋白质在细胞表面上天然共表达。
当在一个结合结构域和/或在每个结合结构域中存在两个可变区时，则两个可变区通常协同工作以提供对相关抗原的特异性，例如它们是同源对或亲和力成熟以提供足够的亲和力，使得所述结构域特异性针对特定抗原。通常它们是重链和轻链可变区对(VH/VL对)。
在一个实施方案中，本公开的分子是双特异性的。
在一个实施方案中，本公开的分子是三特异性的。
在一个实施方案中，本公开的分子对CD79是单特异性的，对CD22是单特异性的，即该分子仅包含一个结合CD79的结合结构域和一个结合CD22的结合结构域。
在一个实施方案中，本公开的多特异性分子是单链。
在一个实施方案中，本公开的多特异性分子包含重链以及轻链。在一个实例中，本文所用的重链和轻链对不被称为二聚体，特别是在一个实施方案中本公开的分子不包含多聚体，诸如抗体、单位/片段或成分的二聚体。
在一个方面，提供了多特异性抗体分子，其包含或由以下组成：
a)式(I)的多肽链：
VH-CH1-X-(V1)p；
b)式(II)的多肽链：
VL-CL-Y-(V2)q；
其中：
VH表示重链可变结构域；
CH1表示重链恒定区的结构域，例如其结构域1；
X表示键或接头，例如氨基酸接头；
Y表示键或接头，例如氨基酸接头；
V1表示dab、scFv、dsscFv或dsFv；
VL表示可变结构域，例如轻链可变结构域；
CL表示来自恒定区的结构域，例如轻链恒定区结构域，诸如Cκ；
V2表示dab、scFv、dsscFv或dsFv；
p是0或1；
q是0或1；以及
当p是1时q是0或1并且当q是1时p是0或1，即p和q不同时为0。
在一个实施方案中，所述分子包含针对CD22的不超过一个结合结构域和针对CD79的不超过一个结合结构域。
上述形式对于筛选可变区的组合特别有用，例如在长期测定中和用于治疗用途。
在一个实施方案中，q是0并且p是1。
在一个实施方案中，q是1并且p是1。
在一个实施方案中，V1是dab并且V2是dab，并且它们一起形成可操作的可变区对、诸如同源VH/VL对的单一结合结构域。
在一个实施方案中，VH和VL特异性针对CD79，例如CD79a或CD79b。
在一个实施方案中，V1特异性针对CD79，例如CD79a或CD79b。
在一个实施方案中，V2特异性针对CD79，例如CD79a或CD79b。
在一个实施方案中，V1和V2一起(例如作为一个结合结构域)特异性针对CD79，例如CD79a或CD79b。
在一个实施方案中，VH和VL特异性针对CD22。
在一个实施方案中，V1特异性针对CD22。
在一个实施方案中，V2特异性针对CD22。
在一个实施方案中，V1和V2一起(例如作为一个结合结构域)特异性针对CD22。
在一个实施方案中，本公开的分子是或包含融合蛋白。
在一个实施方案中，提供了根据本公开的多特异性分子，其是具有式A-X:Y-B的双特异性蛋白质复合物，其中：
A-X是第一融合蛋白；
Y-B是第二融合蛋白；
X:Y是异二聚体系链；
A包含特异性针对CD22或CD79的第一结合结构域；
B包含特异性针对CD22或CD79的第二结合结构域；
X是结合对的第一结合伴侣；
Y是该结合对的第二结合伴侣；以及
:是X和Y之间的相互作用(诸如结合相互作用)，以及
其中A或B中的至少一个特异性针对CD22而另一个特异性针对CD79。
上述形式是方便的形式，因为其提供了组装双特异性形式的快速和有效的方式，例如可以在功能测定中进行体外测试。这可以促进优选的可变区对的选择，其随后可以并入替代的、治疗性多特异性抗体形式中。虽然不希望受理论束缚，但是特异性针对CD22的可变区的不同排列与一系列特异性针对CD79的可变区组合可以获得生物功能中的不同细微差别。
本发明还提供了用于本发明的多特异性分子或掺入任何其它合适的抗体形式的新型CD22抗体。
本发明还提供了用于本发明的多特异性分子或掺入任何其它合适的抗体形式的新型CD79抗体。
附图说明
图1是具有针对CD22和CD79b的特异性的抗体的双特异性和二价组合抑制磷酸化Akt的相对效力的条形图。
图2是具有针对CD22和CD79b的特异性的抗体的双特异性和二价组合抑制磷酸化PLCγ2的相对效力的条形图。
图3是具有针对CD22和CD79b的特异性的抗体的双特异性和二价组合抑制CD86表达的相对效力的条形图。
图4是具有针对CD22和CD79b的特异性的双特异性抗体、二价抗体或抗体混合物抑制磷酸化Akt的相对效力的条形图。
图5是具有针对CD22和CD79b的特异性的双特异性抗体、二价抗体或抗体混合物抑制磷酸化PLCγ2的相对效力的条形图。
图6是显示CD22和CD79b的双特异性组合对抗IgM刺激的B细胞中的总IkB水平的影响的滴定的图。
图7是显示CD22和CD79b的双特异性组合对抗IgM刺激的B细胞上CD86表达的作用的滴定的图。
图8是具有针对具有不同V区的CD22和CD79b的特异性的双特异性蛋白抑制磷酸化PLCγ2的图。
图9是提取自Chan和Carter,Nature Reviews Immunology vol 10,May 2010,301的图，其显示某些抗体形式。
图10是显示抗原网格交叉特异性的数据的表。抗原2＝CD79b，抗原3＝CD22。值是Syk的磷酸化的抑制百分数(激活则为负值)并且代表所评估的多个V区组合的平均值。
图11是显示抗原网格交叉特异性的数据的表。抗原2＝CD79b，抗原3＝CD22。值是PLCγ2的磷酸化的抑制百分数(激活则为负值)并且代表所评估的多个V区组合的平均值。
图12是显示抗原网格交叉特异性的数据的表。抗原2＝CD79b，抗原3＝CD22。值是AKT的磷酸化的抑制百分数(激活则为负值)并且代表所评估的多个V区组合的平均值。
图13是显示与Fab-Y中CD22特异性的组合的Fab-X中CD79b特异性的每个V区组合的Syk、PLCγ2和AKT的磷酸化的抑制百分数的图
图14是显示与Fab-Y中CD79b特异性的组合的Fab-X中CD22特异性的每个V区组合的Syk、PLCγ2和AKT的磷酸化的抑制百分数的图。
图15显示了通过CD79b和CD22特异性Fab-Kd-Fab或BYbe对B细胞中抗IgM诱导的磷酸化PLCγ2的抑制百分数的数据。
图16显示了通过CD79b和CD22特异性Fab-Kd-Fab或BYbe对B细胞中抗IgM诱导的磷酸化P38的抑制百分数的数据。
图17显示了CD79b和CD22特异性Fab-Kd-Fab或BYbe对B细胞中抗IgM诱导的磷酸化Akt的抑制百分数的数据。
图18显示了CD79b和CD22特异性Fab-Kd-Fab或BYbe对B细胞上抗IgM诱导的CD71表达的抑制百分数的数据。
图19显示了CD79b和CD22特异性Fab-Kd-Fab或BYbe对B细胞上抗IgM诱导的CD40表达的抑制百分数的数据。
图20显示了CD79b和CD22特异性Fab-Kd-Fab或BYbe对B细胞上抗IgM诱导的CD86表达的抑制百分数的数据。
图21显示CD79b和CD22特异性VR4447/VR4126 BYbe和VR4447/VR4126/VR645BYbe/白蛋白对B细胞上的CD27表达的抑制。
图22显示CD79b和CD22特异性VR4447/VR4126 BYbe和VR4447/VR4126/VR645BYbe/白蛋白对B细胞上的CD71表达的抑制。
图23显示CD79b和CD22特异性VR4447/VR4126 BYbe和VR4447/VR4126/VR645BYbe/白蛋白对B细胞上的CD86表达的抑制。
图24显示CD79b和CD22特异性VR4447/VR4130 Bybe和VR4447/VR4130/VR645BYbe/白蛋白对B细胞上的CD27表达的抑制。
图25显示CD79b和CD22特异性VR4447/VR4130 Bybe和VR4447/VR4130/VR645BYbe/白蛋白对B细胞上的CD71表达的抑制。
图26显示CD79b和CD22特异性VR4447/VR4130 Bybe和VR4447/VR4130/VR645BYbe/白蛋白对B细胞上的CD86表达的抑制。
图27显示来自用VR4447/VR4126 BYbe、VR4447/VR4127 BYbe和VR4447/VR4130BYbe培养的PBMC的破伤风类毒素IgG产生的抑制。数据表示来自3个供体的合并数据。
图28显示来自用VR4447/VR4126 BYbe、VR4447/VR4127 BYbe和VR4447/VR4130BYbe培养的纯化B细胞的破伤风类毒素IgG产生的抑制。数据表示来自2个供体的合并数据。
图29显示来自用VR4447/VR4126 BYbe、VR4447/VR4127 BYbe、VR4447/VR4130BYbe、VR4447/VR4126/VR645 BYbe/白蛋白和VR4447/VR4130/VR645BYbe/白蛋白培养的PBMC或纯化B细胞的破伤风类毒素IgG产生的抑制。数据来自单个供体。
图30显示来自12个健康者和12个SLE患者样品的未刺激的B细胞中磷酸化的基线水平。
图31显示CD79b+CD22特异性VR4447/VR4130 BYbe对抗IgM诱导的B细胞的NFkB磷酸化的作用，
来自12个健康志愿者(HV)和12个SLE供体。
图32显示CD79b+CD22特异性VR4447/VR4130 BYbe对抗IgM诱导的B细胞的Akt磷酸化的作用，来自12个健康志愿者(HV)和12个SLE供体。
图33显示CD79b+CD22特异性VR4447/VR4130 BYbe对抗IgM诱导的B细胞的Syk磷酸化的作用，来自12个健康志愿者(HV)和12个SLE供体。
图34显示CD79b+CD22特异性VR4447/VR4130 BYbe对抗IgM诱导的B细胞的Erk 1&2磷酸化的作用，来自12个健康志愿者(HV)和12个SLE供体。
本公开内容的详述
本文所用的“多特异性分子”是指具有特异性结合至少两种独特抗原(例如不同抗原)的能力的分子。在一个实施方案中，多特异性分子是双特异性、三特异性或四特异性分子，特别是双特异性或三特异性分子。
在一个方面，本公开扩展至对至少CD22和CD79a特异的合适形式的分子，以及在多特异性分子(诸如双特异性或三特异性形式)中对CD22和CD79a特异的抗体/片段或其组合的用途。
在一个方面，本公开扩展至对至少CD22和CD79b特异的合适形式的分子，以及在多特异性分子(诸如双特异性或三特异性形式)中针对CD22和CD79b的特异性的抗体/片段或其组合的用途。
在一个方面，本公开扩展至对至少CD22和CD79a/b复合物特异的合适形式的分子，以及在多特异性分子(诸如双特异性或三特异性形式)中对CD22和CD79a/b复合物特异性的抗体/片段或其组合的用途。
在一个实施方案中，本公开的分子是三特异性的，例如其中第三结合结构域能够延长分子的半衰期，例如通过结合血清载体蛋白。
血浆中存在各种蛋白质，包括甲状腺素结合蛋白，甲状腺素视黄质运载蛋白，α1-酸性糖蛋白，转铁蛋白，血纤蛋白原和白蛋白，或其任何片段(Bartalena&Robbins,1993,Clinics in Lab.Med.13:583-598；Bree等人,1986,Clin.Pharmacokin.11:336-342；Gitlin等人.1964,J.Clin.Invest.10:1938-1951；Peters,1985,Adv Protein Chem.37:161-245；Waldeman&Strober,1969,Progr.Allergy,13:1-110)。在一个实例中，第三结合结构域对血清白蛋白、例如人血清白蛋白是特异性的。
多特异性分子形式
合适的多特异性分子的实例是本领域已知的，例如在以下综述中公开的：“Thecoming of Age of Engineered Multivalent Antibodies,Nunez-Prado等人DrugDiscovery Today Vol 20Number 5Mar 2015,page 588-594，D.Holmes,Nature Rev DrugDisc Nov 2011:10；798，Chan和Carter,Nature Reviews Immunology vol 10,May 2010,301”，通过引用并入本文。
在一个实施方案中，多特异性形式包括本领域已知的那些和本文所述的那些，诸如其中分子形式选自包含或由以下组成的组：
·串联sdAb、串联sdAb-sdAb(三个sdAb)；
·(scFv)2(也称为串联scFv)、scFv-dsFv、dsscFv-dsFv(dsFv)2；
·双抗体(diabody)、ds双抗体、dids双抗体；
·sc双抗体、dssc双抗体、didssc双抗体；
·Dart抗体，即VL1接头VH2接头和VH1接头VL2，其中VH1和VH2的C末端通过二硫键连接；
·dsBiTE,didsBiTE；
·di双抗体(参见Nunez-Prado等人，特别是其中的图1里的第25号分子)、dsdi双抗体、didsdi双抗体；
·三抗体、ds三抗体、dids三抗体、trids三抗体；
·；
·四抗体、ds四抗体、dids四抗体、trids四抗体、tetrads四抗体；
·tandab(参见Nunez-Prado等人，特别是其中的图1里的第22号分子)、dstandab、didstandab、tridstandab、tetradstandab；
·[sc(Fv)2]2(参见Nunez-Prado等人，特别是其中的图1里的第22号分子)、ds[sc(Fv)2]2、dids[sc(Fv)2]2、trids[sc(Fv)2]2、tetrads[sc(Fv)2]2；
·五抗体(参见Nunez-Prado等人，特别是其中的图1里的第27号分子)；
·Fab-scFv(也称为双靶向抗体(bibody))、Fab’scFv、FabdsscFv(或BYbe)、Fab’dsscFv；
·三体(tribody)、ds三体、dids三体(也称为FabdidsscFv或TrYbe或Fab-(dsscFv)2)、Fab’didsscFv；
·Fabdab、FabFv、Fab’dab、Fab’Fv；
·Fab单接头Fv(本文中也称为如WO2014/096390中所公开的FabdsFv)、Fab’单接头Fv(本文中也称为Fab’dsFv)；
·FabscFv单接头Fv、Fab’scFv单接头Fv；
·FabdsscFv单接头Fv、Fab’dsscFv单接头Fv；
·FvFabFv、FvFab’Fv、dsFvFabFv、dsFvFab’Fv、FvFabdsFv、FvFab’dsFv、dsFvFabdsFv、dsFvFab’dsFv，
·FabFvFv、Fab’FvFv、FabdsFvFv、Fab’dsFvFv、FabFvdsFv、Fab’FvdsFv、FabdsFvdsFv、Fab’dsFvdsFv，
·diFab、diFab’包括化学缀合的diFab’，
·(FabscFv)2、(Fab)2scFvdsFv、(Fab)2dsscFvdsFv、(FabdscFv)2，
·(Fab’scFv)2、(Fab’)2scFvdsFv、(Fab’)2dsscFvdsFv、(Fab’dscFv)2，
·VHHCK(参见Nunez-Prado等人，特别是其中的图1里的第6号分子)；
·微型抗体(minibody)、ds微型抗体、dids微型抗体，
·微抗体(miniantibody)(ZIP)[参见Nunez-Prado等人，特别是其中的图1里的第7号分子]、ds微抗体(ZIP)和dids微抗体(ZIP)；
·tribi微型抗体[参见Nunez-Prado等人，特别是其中的图1里的第15号分子]、dstribi微型抗体、didstribi微型抗体、tridstribi微型抗体；
·双抗体-CH3、ds双抗体-CH3、dids双抗体-CH3、sc双抗体-CH3、dssc双抗体-CH3、didssc双抗体-CH3，
·串联scFv-CH3、串联dsscFv-CH3、串联didsscFv-CH3、串联tridsscFv-CH3、串联tetradsscFv-CH3，
·scFv-Fc(本文中也称为如WO2008/012543中所述的(scFvCH2CH3)2)及其单链形式、dsscFvscFv-Fc、dsscFv-Fc(本文中也称为(dsscFvCH2CH3)2)、scFv-dsFv-Fc、dsscFv-dsFv-Fc、dsFv-Fc(本文中也称为(dsFvCH2CH3)2)，
·蝎型分子(Trubion)即结合结构域、接头-CH2CH3结合结构域，如US8,409,577中所述；
·SMIP(Trubion)即(scFv-CH2CH3)2；
·(dsFvCH2CH3)2、串联scFv-Fc、串联dsscFvscFv-Fc、串联dsscFv-Fc，
·scFv-Fc-scFv、dsscFv-Fc-scFv、scFv-Fc-dsscFv，
·双抗体-Fc、ds双抗体-Fc、dids双抗体-Fc、三抗体-Fc、ds三抗体-Fc、dids三抗体-Fc、trids三抗体-Fc、四抗体-Fc、ds四抗体-Fc、dids四抗体-Fc、trids四抗体-Fc、tetrads四抗体-Fc、ds四抗体-Fc、dids四抗体-Fc、trids四抗体-Fc、tetrads四抗体-Fc、sc双抗体-Fc、dssc双抗体、didssc双抗体；
·双功能或三功能抗体，例如具有不同重链可变区和共同的轻链例如Merus双特异性抗体形式其具有固定序列的共同轻链和不同重链(包括不同CDR)和改造的CH3结构域以驱动不同重链的二聚化，
·Duobody(即其中抗体中的一条全长链相对于抗体中另一条全长链具有不同的特异性)；
·全长抗体，其中已经使用Fab臂交换来产生双特异性形式；
·双功能或三功能抗体，其中全长抗体具有共同的重链和不同的轻链，也称为κ/λ体，参见WO2012/023053；
·从重链或轻链的C末端的一、二、三或四个Ig-scFv、从重链或轻链的N末端的一、二、三或四个scFv-Ig、单接头Ig-Fv、从重链或轻链的C末端的一、二、三或四个Ig-dsscFv(具有一、二、三或四个二硫键)；
·从重链或轻链的N末端的一、二、三或四个Ig-dsscFv(具有一、二、三或四个二硫键)，
·Ig单接头Fv(参见PCT/EP2015/064450)，
·Ig-dab、dab-Ig、scFv-Ig、V-Ig、Ig-V，
·scFabFvFc、scFabdsFvFc(单接头形式的scFavFv)、(FabFvFc)2、(FabdsFvFc)2、scFab’FvFc、scFab’dsFvFc、(Fab’FvFc)2、(Fab’dsFvFc)2和
·DVDIg，这些将在下面进行更详细地讨论。
在一个实施方案中，多特异性分子形式包括本领域已知的那些和本文所述的那些，诸如其中分子形式选自包含以下或者由以下组成的组：双抗体、sc双抗体、三抗体、四抗体、串联scFv、FabFv、Fab’Fv、FabdsFv、Fab-scFv、Fab-dsscFv、Fab-(dsscFv)2、diFab、diFab’、串联scFv-Fc、scFv-Fc-scFv、sc双抗体-Fc、sc双抗体-CH3、Ig-scFv、scFv-Ig、V-Ig、Ig-V、Duobody和DVDIg，这些将在下面进行更详细地讨论。
在一个实施方案中，本公开的多特异性抗体分子不包含Fc结构域，即不包含CH2和CH3结构域，例如分子选自：串联scFv、scFv-dsFv、dsscFv-dsFv didsFv、双抗体、ds双抗体、dids双抗体、sc双抗体(也称为(scFv)2)、dssc双抗体、三抗体、ds三抗体、dids三抗体、trids三抗体、四抗体、ds四抗体、dids四抗体、trids四抗体、tetrads四抗体、三体、ds三体、dids三体、Fabdab、FabFv、Fab’dab、Fab’Fv、Fab单接头Fv(如WO2014/096390中所公开的)、Fab’单接头Fv、FabdsFv、Fab’dsFv、Fab-scFv(也称为双靶向抗体)、Fab’scFv、FabdsscFv、Fab’dsscFv、FabdidsscFv、Fab’didsscFv、FabscFv单接头Fv、Fab’scFv单接头Fv、FabdsscFvs单接头Fv、Fab’dsscFv单接头Fv、FvFabFv、FvFab’Fv、dsFvFabFv、dsFvFab’Fv、FvFabdsFv、FvFab’dsFv、dsFvFabdsFv、dsFvFab’dsFv、FabFvFv、Fab’FvFv、FabdsFvFv、Fab’dsFvFv、FabFvdsFv、Fab’FvdsFv、FabdsFvdsFv、Fab’dsFvdsFv、diFab、diFab’，包括化学缀合的diFab’、(FabscFv)2、(Fab)2scFvdsFv、(Fab)2dsscFvdsFv、(FabdscFv)2、微型抗体、ds微型抗体、dids微型抗体、双抗体-CH3、ds双抗体-CH3、dids双抗体-CH3、sc双抗体-CH3、dssc双抗体-CH3、didssc双抗体-CH3、串联scFv-CH3、串联dsscFv-CH3、串联didsscFv-CH3、串联tridsscFv-CH3和串联tetradsscFv-CH3。
在一个实施方案中，本公开的分子不包含Fc结构域。
在一个实施方案中，本公开的分子包含如下文所述的改变的Fc结构域。
除非上下文明确指明，否则本文中所使用的Fc结构域一般是指–(CH2CH3)2。
在一个实施方案中，本公开的分子不包含-CH2CH3片段。
在一个实施方案中，本公开的分子不包含CH2结构域。
在一个实施方案中，本公开的分子不包含CH3结构域。
如本文以生物化学意义使用的分子，是指形成有机、特别是蛋白质物质的一组原子，其包括适合在合适的条件下一旦形成复合物就作为单一实体处理的复合物，例如由两条或多条多肽链形成的复合物。
除非上下文另有说明，否则分子和构建体在本文中可互换使用。虽然，构建体可以更经常地用于指多核苷酸分子，而分子可以更经常地用于指主要包含氨基酸序列的实体。
本文使用的特异性(或特异性的)是指其中相互作用中的伴侣仅相互识别或相对于非伴侣彼此具有显著更高的亲和力，例如是例如背景结合水平或结合另一种无关蛋白的亲和力的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10倍。
本文使用的“结合结构域”是指能够结合靶抗原的结合区，通常是多肽，例如具有足够的亲和力以表征对抗原特异的结构域。
任何合适的结合结构域可以用于本发明的多特异性分子中。这些可以源自任何合适的来源。
在一个实施方案中，生物相容性框架结构用于本公开的分子的结合结构域中，并且这样的结构基于除免疫球蛋白结构域之外的蛋白质支架或骨架。例如，可以使用基于纤连蛋白、锚蛋白、脂质运载蛋白、新制癌菌素(neocarzinostain)、细胞色素b、CP1锌指、PST1、卷曲螺旋、LACI-D1、Z结构域和tendramisat的那些(参见例如Nygren和Uhlen,1997,Current Opinion in Structural Biology,7,463-469)。
本文使用的术语“多特异性分子”还可以包括基于生物支架的结合剂，包括Adnectins、Affibodies、Darpins、Phylomers、Avimers、适体、Anticalins、Tetranectins、微体、Affilins和Kunitz结构域。
本发明的多特异性分子通常是多特异性抗体分子，即所述多特异性分子的至少一个或多个结合结构域衍生自抗体或其片段。
当结合结构域衍生自抗体时，本文所用的“结合结构域或位点”是与抗原接触的抗体部分。在一个实施方案中，结合结构域含有至少一个可变结构域或其衍生物，例如可变结构域对或其衍生物，诸如可变结构域的同源对或其衍生物。通常这是VH/VL对。
可变区(本文中也称为可变结构域)通常包含3个CDR和合适的框架。在一个实施方案中，结合结构域包含两个可变区，一个轻链可变区和一个重链可变区，并且这些元件一起有助于抗体或结合片段的结合相互作用的特异性。
本文使用的“同源对”是指作为预先形成的对的从宿主分离的可变结构域的重链和轻链对(或其衍生物，诸如其人源化形式)。该定义不包括从文库中分离的可变结构域，其中不保留来自宿主的原始配对。同源对可能是有利的，因为它们通常在宿主中亲和成熟，并且因此可以比选自文库诸如噬菌体文库的可变结构域对的组合对它们特异性针对的抗原具有更高的亲和力。
本文所用的“天然存在结构域的衍生物”意指其中天然存在序列中的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸已经被替换或缺失，例如以优化结构域的性质，诸如通过消除不期望的性质但是其中保留了结构域的表征特征。修饰的实例是去除糖基化位点、GPI锚或溶剂暴露的赖氨酸的那些。这些修饰可以通过用保守氨基酸取代替换相关的氨基酸残基来实现。
CDR中的修饰可以例如包括用例如丝氨酸残基取代一个或多个半胱氨酸。Asn可以是用于脱氨的基质，并且可以通过用替代氨基酸(诸如保守取代)替换Asn和/或相邻氨基酸来降低这种倾向。CDR中的氨基酸Asp可以进行异构化。可以通过用替代氨基酸(例如保守取代)替换Asp或相邻氨基酸来最小化后者。
在本说明书的上下文中，可变区的人源化形式也是其衍生物。人源化可包括非人构架替换为人框架和任选地一个或多个残基的回复突变为“供体残基”。本文使用的供体残基是指在从宿主分离的原始可变区中发现的残基，特别是用供体框架中相应位置中的氨基酸替换人框架中的给定氨基酸。
在一个实施方案中，结合结构域或每个结合结构域是抗体或抗体片段的一部分(被包括或掺入于抗体或抗体片段中)。
在一个实施方案中，本公开的分子中的结合结构域在免疫球蛋白/抗体分子中。
本文所用的“抗体分子”包括抗体及其结合片段。
在一个实施方案中，本文所用的术语“抗体”是指能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点(本文中也称为结合位点或结合结构域)特异性结合靶抗原(诸如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽、肽等)的免疫球蛋白分子。
本文使用的“抗体片段”是指抗体结合片段，包括但不限于Fab、修饰的Fab、Fab'、修饰的Fab'、F(ab')2、Fv、单结构域抗体、scFv、Fv、二价、三价或四价抗体、Bis-scFv、双抗体、三抗体、四抗体和上述任何的表位结合片段(参见例如Holliger和Hudson,2005,NatureBiotech.23(9):1126-1136；Adair和Lawson,2005,Drug Design Reviews-Online 2(3),209-217)。
本文所用的“结合片段”是指能够以足够亲和力结合靶肽或抗原以表征对肽或抗原具有特异性的片段的片段。
用于产生和制造这些抗体片段的方法是本领域熟知的(参见例如Verma等人,1998,Journal of Immunological Methods,216:165-181)。用于本公开的其它抗体片段包括WO05/003169、WO05/003170和WO05/003171中所述的Fab和Fab’片段。多价抗体可以包含多种特异性，例如双特异性或可以是单特异性的(参见例如WO92/22853、WO05/113605、WO2009/040562和WO2010/035012)。
本文所用的术语“Fab片段”是指包含轻链的VL(轻链可变)结构域和恒定结构域(CL)的轻链片段和重链的VH(重链可变)结构域和第一恒定结构域(CH1)的抗体片段。
Fv是指两个可变结构域，例如协作的可变结构域，诸如同源对或亲和成熟的可变结构域，即VH和VL对。
本文所使用的协作的可变结构域是彼此互补和/或两者有助于抗原结合以使得Fv(VH/VL对)特异性针对所述抗原的可变结构域。
本文所用的“单结构域抗体”(本文中也称为dab和sdAb)是指由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。单结构域抗体的实例包括VH或VL或VHH。
本文所用的串联sdAb是指通过接头(例如肽接头)连接的两个结构域抗体，特别是其中结构域抗体对不同抗原具有特异性。
本文所用的串联sdAb-sdAb是指通过两个接头(例如肽接头)串联连接的三个结构域抗体，特别是其中结构域抗体对不同抗原具有特异性。
本文所用的dsFv是指具有可变区内二硫键的Fv。dsFv可以是较大分子的成分，例如可变结构域之一可以例如通过氨基酸接头连接到另一抗体片段/成分。
本文所用的(dsFv)2是指具有一个结构域的dsFv，例如通过肽接头或二硫键(例如，两个VH的C末端之间)与第二dsFv中的结构域连接，形式类似于下述的(scFv)2，但每对可变区包含可变区内二硫键。
本文所用的成分是指本公开的多特异性分子的构建单元或部分，特别是其中该成分是抗体片段，诸如scFv、Fab或其他片段，特别是如本文所述的。
本文所用的单链Fv或缩写为“scFv”是指包含被连接(例如通过肽接头)以形成单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。在该形式中省略了重链和轻链的恒定区。
本文所用的dsscFv是指具有可变区内二硫键的scFv。
本文所用的串联scFv(本文中也称为discFv或(scFv)2)是指经由单接头连接的两个scFv，使得存在单个Fv间接头，例如图9b所示。
本文所用的串联dsscFv(本文中也称为scFvdsscFv或dsscFvscFv)是指经由单接头连接的两个scFv，使得存在单个Fv间接头，例如图9b所示，并且其中scFv之一具有可变区内二硫键。
本文所用的串联didsscFv(本文中也称为didsscFv)是指通过单接头连接的两个scFv，使得存在单个Fv间接头，例如图9b所示，并且其中每个scFv包含可变区内二硫键。
本文所用的scFv-dsFv是例如通过肽接头连接到Fv结构域的scFv，所述Fv结构域由通过二硫键连接以形成dsFv的两个可变结构域组成。在该形式中，scFv的VH或VL可以连接到dsFv的VH或VL。
本文所用的dsscFv-dsFv是例如通过肽接头连接到Fv结构域的dsscFv，所述Fv结构域由通过二硫键连接以形成dsFv的两个可变结构域组成。在该形式中，dsscFv的VH或VL可以连接到dsFv的VH或VL。
本文所用的双抗体指具有两个Fv间接头的两个Fv对VH/VL，使得第一Fv的VH连接到第二Fv的VL，并且第一Fv的VL连接到第二Fv的VH。
本文所用的ds双抗体是指包含可变区内二硫键的双抗体。
本文所用的dids双抗体是指包含两个可变区内二硫键的双抗体，即每对可变区之间的一个ds。
本文所用的sc双抗体是指包含Fv内接头的双抗体，使得所述分子包含三个接头并形成两个正常scFv，例如VH1接头VL1接头VH2接头VL2。
本文所用的dssc双抗体是指具有可变区内二硫键的sc双抗体。
本文所用的didssc双抗体是指在每对可变区之间具有可变区内二硫键的sc双抗体。
本文所用的Dart是指VL1接头VH2接头和VH1接头VL2，其中VH1和VH2的C末端通过二硫键连接，Paul A.Moore等人，Blood,2011；117(17):4542-4551。
本文所用的是指包含以下形式的两对可变结构域的分子：来自对1的结构域(例如VH1)经由接头连接至来自对2的结构域(例如VH2或VL2)，所述第二结构域经由接头连接至来自对1的其它结构域(例如VL1)进而连接至来自对2的剩余结构域(即VL2或VH2)。
di双抗体，参见Nunez-Prado等人，特别是其中的图1里的第25号分子。
本文所用的dsdi双抗体是具有可变区内二硫键的di双抗体。
本文所用的didsdi双抗体是在每对可变区之间具有可变区内二硫键的di双抗体。
本文所用的三抗体是指与双抗体类似包含三个Fv和三个Fv间接头的形式。
本文所用的ds三抗体是指在可变结构域对中之一之间包含可变区内二硫键的三抗体。
本文所用的dids三抗体是指包含两个变区内二硫键的三抗体，即在两个可变结构域对中的每一个之间一个ds。
本文所用的trids三抗体是指包含三个变区内二硫键的三抗体，即在每对可变区之间一个ds。
本文所用的四抗体是指与双抗体类似包含四个Fv和四个Fv间接头的形式。
本文所用的ds四抗体是指在可变结构域对中之一之间包含可变区内二硫键的四抗体。
本文所用的dids四抗体是指包含两个变区内二硫键的四抗体，即在两个可变结构域对的每一个之间一个ds。
本文所用的trids四抗体是指包含三个变区内二硫键的四抗体，即在三对可变区的每一对之间一个ds。
本文所用的tetrads四抗体是指包含四个变区内二硫键的四抗体，即在每个可变结构域之间一个ds。
本文所用的三体(也称为Fab(scFv)2)是指具有附加到轻链的C端的第一scFv和附加到重链的C端的第二scFv的Fab片段。
本文所用的ds三体是指在两个位置中之一包含dsscFv的三体。
本文所用的dids三体或TrYbe是指包含两个dsscFv的三体。
本文所用的dsFab是指具有可变区内二硫键的Fab。
本文所用的dsFab’是指具有可变区内二硫键的Fab’。
scFab是单链Fab片段。
scFab’是单链Fab’片段。
dsscFab是为单链的dsFab。
dsscFab’是为单链的dsFab’。
本文所用的Fabdab是指具有任选地经由接头附加至其重链或轻链的结构域抗体的Fab片段。
本文所用的Fab’dab是指具有任选地经由接头附加至其重链或轻链的结构域抗体的Fab’片段。
本文所用的FabFv是指具有附加至以下中每一个的C末端的另外的可变区的Fab片段：重链的CH1和轻链的CL，参见例如WO2009/040562。该形式可以提供为其聚乙二醇化的形式，参见例如WO2011/061492。
本文所用的Fab’Fv与FabFv类似，其中Fab部分被Fab’替换。该形式可以提供为其聚乙二醇化的形式。
本文所用的FabdsFv是指FabFv，其中Fv内二硫键稳定化所附加的C末端可变区，参见例如WO2010/035012。该形式可以提供为其聚乙二醇化的形式。
本文所用的Fab单接头Fv和Fab’单接头是指连接至可变结构域的Fab或Fab’(例如通过肽接头)，并且所述可变结构域经由可变结构域内二硫键连接至第二可变区从而形成dsFv，参见例如WO2014/096390。
本文所用的Fab-scFv(也称为双靶向抗体)是具有任选地经由接头附加至轻链或重链的C末端上的scFv的Fab分子。
本文所用的Fab’-scFv是具有任选地经由接头附加至轻链或重链的C末端上的scFv的Fab’分子。
本文所用的FabdsscFv或BYbe是在单链Fv的可变区之间具有二硫键的Fab-scFv。
本文所用的Fab’dsscFv是在单链Fv的可变区之间具有二硫键的Fab’scFv。
本文所用的FabscFv-dab是指具有附加至一条链的C末端的scFv和附加至另一条链的C末端的结构域抗体的Fab。
本文所用的Fab’scFv-dab是指具有附加至一条链的C末端的scFv和附加至另一条链的C末端的结构域抗体的Fab’。
本文所用的FabdsscFv-dab是指具有附加至一条链的C末端的dsscFv和附加至另一条链的C末端的结构域抗体的Fab。
本文所用的Fab’dsscFv-dab是指具有附加至一条链的C末端的dsscFv和附加至另一条链的C末端的结构域抗体的Fab’。
本文所用的FabscFv单接头Fv是指一种Fab单接头Fv，其中Fv的结构域连接至Fab的重链或轻链并且scFv连接至其它Fab链并且Fv的结构域通过可变区内二硫键连接。
本文所用的FabdsscFv单接头Fv是指一种FabscFv单接头Fv，其中scFv包含可变区内二硫键连接。
本文所用的Fab’scFv单接头Fv是指一种Fab’单接头Fv，其中Fv的结构域连接至Fab的重链或轻链并且scFv连接至其它Fab链并且Fv的结构域通过可变区内二硫键连接。
本文所用的Fab’dsscFv单接头Fv是指一种Fab’scFv单接头Fv，其中scFv包含可变区内二硫键连接。
本文所用的FvFabFv是指具有附加至Fab的重链和轻链的N末端的第一Fv的结构域和附加至重链和轻链的C末端的第二Fv的结构域的Fab。
本文所用的FvFab’Fv是指具有附加至Fab’的重链和轻链的N末端的第一Fv的结构域和附加至重链和轻链的C末端的第二Fv的结构域的Fab’。
本文所用的dsFvFabFv是指具有附加至Fab的重链和轻链的N末端的第一Fv的结构域和附加至重链和轻链的C末端的第二Fv的结构域的Fab，其中第一Fv包含可变区内二硫键。
本文所用的FvFabdsFv是指具有附加至Fab的重链和轻链的N末端的第一Fv的结构域和附加至重链和轻链的C末端的第二Fv的结构域的Fab，其中第二Fv包含可变区内二硫键。
本文所用的dsFvFab’Fv是指具有附加至Fab’的重链和轻链的N末端的第一Fv的结构域和附加至重链和轻链的C末端的第二Fv的结构域的Fab’，其中第一Fv包含可变区内二硫键。
本文所用的FvFab’dsFv是指具有附加至Fab’的重链和轻链的N末端的第一Fv的结构域和附加至重链和轻链的C末端的第二Fv的结构域的Fab’，其中第二Fv包含可变区内二硫键。
本文所用的dsFvFabdsFv是指具有附加至Fab的重链和轻链的N末端的第一Fv的结构域和附加至重链和轻链的C末端的第二Fv的结构域的Fab，其中第一Fv包含可变区内二硫键，其中第二Fv也包含可变区内二硫键。
本文所用的dsFvFab’dsFv是指具有附加至Fab’的重链和轻链的N末端的第一Fv的结构域和附加至重链和轻链的C末端的第二Fv的结构域的Fab’，其中第一Fv包含可变区内二硫键，其中第二Fv也包含可变区内二硫键。
本文所用的FabFvFv是指具有串联附加至重链和轻链的C末端的两对Fv的Fab片段，参见例如WO2011/086091。
本文所用的Fab’FvFv是指具有串联附加至重链和轻链的C末端的两对Fv的Fab’片段，参见例如WO2011/086091。
本文所用的FabdsFvFv是指具有串联附加至重链和轻链的C末端的两对Fv的Fab片段，参见例如WO2011/086091，其中直接附接至C末端的第一Fv对包含可变区内二硫键。
本文所用的Fab’dsFvFv是指具有串联附加至重链和轻链的C末端的两对Fv的Fab’片段，参见例如WO2011/086091，其中直接附接至C末端的第一Fv对包含可变区内二硫键。
本文所用的FabFvdsFv是指具有串联附加至重链和轻链的C末端的两对Fv的Fab片段，其中分子“C”末端的第二Fv对包含可变区内二硫键。
本文所用的Fab’FvdsFv是指具有串联附加至重链和轻链的C末端的两对Fv的Fab’片段，其中分子“C”末端的第二Fv对包含可变区内二硫键。
本文所用的FabdsFvdsFv是指具有串联附加至重链和轻链的C末端的两对Fv的Fab片段，其中第一和第二Fv对包含可变区内二硫键。
本文所用的Fab’dsFvdsFv是指具有串联附加至重链和轻链的C末端的两对Fv的Fab’片段，其中第一和第二Fv对包含可变区内二硫键。
本文所用的diFab是指经由它们的重链C末端连接的两个Fab分子。
本文所用的diFab’是指经由其铰链区的一个或多个二硫键连接的两个Fab’分子。
diFab和diFab’分子包括其化学缀合形式。
本文所用的(FabscFv)2是指具有附加至其的两个scFv的diFab分子，例如附加至重链或轻链(诸如重链)的C末端。
本文所用的(Fab’scFv)2是指具有附加至其的两个scFv的diFab’分子，例如附加至重链或轻链(诸如重链)的C末端。
本文所用的(Fab)2scFvdsFv是指具有附加的scFv和dsFv的diFab，例如来自重链C末端中每一个的一个的。
本文所用的(Fab’)2scFvdsFv是指具有附加的scFv和dsFv的diFab’，例如来自重链C末端中每一个的一个的。
本文所用的(Fab)2dsscFvdsFv是指具有附加的dsscFv和dsFv的diFab，例如来自重链C末端的。
本文所用的(Fab’)2dsscFvdsFv是指具有附加的dsscFv和dsFv的diFab’，例如来自重链C末端的。
本文所用的微型抗体是指(VL/VH-CH3)2。
本文所用的ds微型抗体是指(VL/VH-CH3)2，其中一个VL/VH包含可变区内二硫键。
本文所用的dids微型抗体是指(dsFv-CH3)2。
κ/λ体是具有两条重链和两条轻链的正常IgG形式，其中两条轻链彼此不同，一条是λ轻链(VL-CL)而另一条是κ轻链(VK-CK)。如WO2012/023053中所述，重链(即使在CDR)是相同的。
本文所用的scFv-Fc是指例如经由铰链附加至恒定区片段–(CH2CH3)的CH2结构域的N末端的scFv，使得该分子具有2个结合结构域。
本文所用的dsscFv-Fc是指例如经由铰链附加至恒定区片段–(CH2CH3)2的CH2结构域的N末端的dsscFv和附加至恒定区片段–(CH2CH3)2的第二CH2结构域的N末端的scFv，使得该分子具有2个结合结构域。
本文所用的didsscFv-Fc是指例如经由铰链附加至恒定区片段–(CH2CH3)2的CH2结构域的N末端的scFv，使得该分子具有2个结合结构域。
本文所用的串联scFv-Fc是指两个串联的scFv，其中每一个例如经由铰链串联附加至恒定区片段–(CH2CH3)的CH2结构域的N末端，使得该分子具有4个结合结构域。
本文所用的sc双抗体-Fc是两个sc双抗体，其中每一个例如经由铰链串联附加至恒定区片段–CH2CH3的CH2结构域的N末端。
本文所用的scFv-Fc-scFv是指四个scFv，其中每个之一附加至CH2CH3片段的重链和轻链二者的N末端和C末端。
本文所用的sc双抗体-CH3是指各自例如经由铰链连接至CH3结构域的两个sc双抗体分子。
本文所用的IgG-scFv是在重链中每一条或轻链中每一条的C末端上具有scFv的全长抗体。
本文所用的scFv-IgG是在重链中每一条或轻链中每一条的N末端上具有scFv的全长抗体。
本文所用的V-IgG是在重链中每一条或轻链中每一条的N末端上具有可变结构域的全长抗体。
本文所用的IgG-V是在重链中每一条或轻链中每一条的C末端上具有可变结构域的全长抗体。
DVD-Ig(也称为双V结构域IgG)是具有4个另外的可变结构域的全长抗体，每个可变结构域在每条重链和每条轻链的N末端上。
本文所用的Duobody或‘Fab臂交换’是双特异性IgG形式抗体，其中在混合后两种不同单克隆抗体的恒定结构域(通常为CH3)中的匹配的和互补的经改造的氨基酸改变导致异二聚体的形成。作为残基改造的结果，来自第一抗体的重链:轻链对将优选与第二抗体的重链:轻链对缔合。参见例如WO2008/119353、WO2011/131746和WO2013/060867。
当多特异性抗体分子中的一对或多对可变区包含VH和VL之间的二硫键时，其可以在任何合适的位置，诸如在下面列出的两个残基之间(除非上下文另有说明，在下面列表中使用Kabat编号)。无论在任何提到Kabat编号的情况下，相关参考文献是Kabat等人,1987,Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Department of Health andHuman Services,NIH,USA。
在一个实施方案中，二硫键在选自以下的位置：
·VH37+VL95C，参见例如Protein Science 6,781-788 Zhu等人(1997)；
·VH44+VL100，参见例如Biochemistry 33 5451-5459 Reiter等人(1994)；或者Journal of Biological Chemistry Vol.269 No.28 pp.18327-18331 Reiter等人(1994)；或者Protein Engineering,vol.10no.12 pp.1453-1459Rajagopal等人(1997)；
·VH44+VL105，参见例如J Biochem.118,825-831Luo等人(1995)；
·VH45+VL87，参见例如Protein Science 6,781-788Zhu等人(1997)；
·VH55+VL101，参见例如FEBS Letters 377 135-139Young等人(1995)；
·VH100+VL50，参见例如Biochemistry 29 1362-1367Glockshuber等人(1990)；
·VH100b+VL49；
·VH98+VL 46，参见例如Protein Science 6,781-788Zhu等人(1997)；
·VH101+VL46；
·VH105+VL43，参见例如Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.90pp.7538-7542Brinkmann等人(1993)；或者Proteins 19,35-47Jung等人(1994)，
·VH106+VL57，参见例如FEBS Letters 377 135-139Young等人(1995)
以及对应于其在分子中位于可变区对中的位置。
在一个实施方案中，二硫键在位置VH44和VL100之间形成。
本文所用的“单特异性”是指仅结合靶抗原一次的能力。
因此，在一个实施方案中，本发明的多特异性分子对于每种抗原是单特异性的。
因此，在一个实施方案中，根据本公开的多特异性分子的结合结构域是单特异性的。这在一些治疗应用中是有利的，因为本公开的分子不能通过结合靶抗原多于一次来交联抗原。因此，在一个实施方案中，本公开的双特异性或多特异性分子不能通过在两个不同位置、例如在相同细胞或两个不同细胞上结合相同靶标两次而交联。
交联、特别是与相同细胞或不同细胞上的CD79b相关的交联，可以在体内产生信号，例如其刺激靶抗原的活性。
在一个实例中，本发明的多特异性分子含有不超过一个CD22的结合结构域和不超过一个CD79的结合结构域。每个结合结构域是单特异性的。
因此，在一个实施例中，多特异性分子对于CD22是单价的并且对于CD79是单价的。
在一个实施方案中，本公开的多特异性分子中采用的每个抗体或抗体片段是单价的。
因此，在一个实施方案中，本公开的多特异性分子的结合结构域是单价的。
因此，在一个实施方案中，本公开的多特异性分子的结合结构域是单价和单特异性的。
在一个实施方案中，本公开的多特异性分子由两个或更多个单特异性单价结合结构域组成，诸如Fab、Fab'、scFv、VH、VL、VHH、Fv、dsFv，以任何合适的方式组合或连接以构建多特异性分子，例如如本文上述。
在另一个实施方案中，例如其中本公开的分子包含至少三个结合结构域，则两个或三个结合结构域(例如抗体、片段或抗体和片段的组合)可以具有不同的抗原特异性，例如结合三种不同的靶抗原。
恒定区
如果存在本发明的多特异性分子的抗体恒定区结构域，则可考虑所提出的多特异性抗体分子的功能，并且特别是可能需要的效应子功能来选择本发明的多特异性分子的抗体恒定区结构域。例如，恒定区结构域可以是人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM的结构域。特别地，当抗体分子意欲用于治疗用途并且需要抗体效应子功能时，可以使用人IgG恒定区结构域，特别是IgG1和IgG3同种型的恒定区结构域。或者，当抗体分子意欲用于治疗目的并且不需要抗体效应子功能时，可使用IgG2和IgG4同种型。
应当理解，也可以使用这些恒定区结构域的序列变体。例如，可使用如Angal等人，1993,Molecular Immunology,1993,30:105-108中所述的其中241位的丝氨酸已经改变为脯氨酸的IgG4分子。因此，在其中抗体是IgG4抗体的实施方案中，抗体可包括突变S241P。
在一个实施方案中，抗体重链包含CH1结构域，抗体轻链包含κ或λ的CL结构域。
在一个实施方案中，抗体重链包含CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域，并且抗体轻链包含κ或λ的CL结构域。
四种人IgG同种型以不同的亲和力结合激活的Fcγ受体(FcγRI，FcγRIIa，FcγRIIIa)，抑制性FcγRIIb受体和补体的第一成分(C1q)，产生非常不同的效应子功能(Bruhns P.等人,2009.Specificity and affinity of human Fcgamma receptors andtheir polymorphic variants for human IgG subclasses.Blood.113(16):3716-25)，还参见Jeffrey B.Stavenhagen,等人，Cancer Research 2007Sep 15；67(18):8882-90。
IgG与FcγR或C1q的结合取决于位于铰链区和CH2结构域中的残基。CH2结构域的两个区域对于FcγR和C1q结合是关键的，并且在IgG2和IgG4中具有独特的序列。已经显示，在位置233-236处的IgG2残基和在位置327、330和331处的IgG4残基对人IgG1的取代大大降低了ADCC和CDC(Armour KL.等人,1999.Recombinant human IgG molecules lackingFcgamma receptor I binding and monocyte triggering activities.Eur JImmunol.29(8):2613-24和Shields RL.等人,2001.High resolution mapping of thebinding site on human IgG1for Fc gamma RI,Fc gamma RII,Fc gamma RIII,and FcRnand design of IgG1variants with improved binding to the Fc gamma R.J BiolChem.276(9):6591-604)。此外，Idusogie等人证明在不同位置(包括K322)的丙氨酸取代显著降低补体激活(Idusogie EE.等人,2000.Mapping of the C1q binding site onrituxan,a chimeric antibody with a human IgG1Fc.J Immunol.164(8):4178-84)。类似地，鼠IgG2A的CH2结构域中的突变显示降低与FcγRI和C1q的结合(Steurer W.等人,1995.Ex vivo coating of islet cell allografts with murine CTLA4/Fc promotesgraft tolerance.J Immunol.155(3):1165-74)。
在一个实施方案中，所采用的Fc区是突变的，特别是本文所述的突变。在一个实施方案中，突变是去除结合和/或效应子功能。
在一个实施方案中，Fc突变选自：去除Fc区结合的突变，增加或去除效应子功能的突变，增加半衰期的突变及其组合。
在pH 6.0、但不是pH 7.4选择性结合FcRn的一些抗体在各种动物模型中表现出较高的半衰期。位于CH2和CH3结构域之间的界面的几个突变，诸如T250Q/M428L(Hinton PR.等人,2004.Engineered human IgG antibodies with longer serum half-lives inprimates.J Biol Chem.279(8):6213-6)和M252Y/S254T/T256E+H433K/N434F(Vaccaro C.等人,2005.Engineering the Fc region of immunoglobulin G to modulate in vivoantibody levels.Nat Biotechnol.23(10):1283-8)，已经显示在体内增加对FcRn的结合亲和力和IgG1的半衰期。
然而，在增加的FcRn结合和改善的半衰期之间并不总是有直接的关系(Datta-Mannan A.等人,2007.Humanized IgG1Variants with Differential BindingProperties to the Neonatal Fc Receptor:Relationship to Pharmacokinetics inMice and Primates.Drug Metab.Dispos.35:86–94)。
IgG4亚类显示降低的Fc受体(FcγRIIIa)结合，其他IgG亚类的抗体通常显示强结合。这些其它IgG亚型中降低的受体结合可以通过改变而实现，例如替换选自Pro238、Asp265、Asp270、Asn270(Fc碳水化合物缺失)、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434和His435的一个或多个氨基酸。
在一个实施方案中，根据本公开的分子具有IgG亚类(例如IgG1、IgG2或IgG3)的Fc，其中Fc在一个、两个或所有以下位置S228、L234和/或D265中突变。
在一个实施方案中，Fc区中的突变独立选自S228P、L234A、L235A、L235A、L235E及其组合。
可能需要减少或增加Fc区的效应子功能。需要靶向细胞表面分子、特别是免疫细胞上的那些并消除效应子功能的抗体。在一些实施方案中，例如为了治疗自身免疫，通过增加阴性Fc受体(FcgRIIb或CD32b)结合增强免疫细胞上的Fc结合可能是需要的，参见Stavenhagen JB,等人，Advances in Enzyme Regulation 2007December 3和Veri MC等人，Arthritis Rheum,2010Mar 30；62(7):1933-43。相反，对于预期用于肿瘤学使用的抗体，增加效应子功能可以改善治疗活性。
已经在人IgG1的CH2结构域中产生了许多突变，并且在体外测试了它们对ADCC和CDC的影响(Idusogie EE.等人,2001.Engineered antibodies with increased activityto recruit complement.J Immunol.166(4):2571-5)。值得注意的是，据报道在位置333处的丙氨酸取代增加ADCC和CDC二者。Lazar等人描述了对FcγRIIIa具有更高亲和力和对FcγRIIb具有更低亲和力从而导致增强的ADCC的三重突变体(S239D/I332E/A330L)(LazarGA.等人,2006.Engineered antibody Fc variants with enhanced effectorfunction.PNAS 103(11):4005–4010)。使用相同的突变产生具有增加的ADCC的抗体(RyanMC.等人,2007.Antibody targeting of B-cell maturation antigen on malignantplasma cells.Mol.Cancer Ther.,6:3009–3018)。Richards等人研究了具有改善的FcγRIIIa亲和力和介导巨噬细胞增强的靶细胞吞噬作用的FcγRIIa/FcγRIIb比率的略微不同的三重突变体(S239D/I332E/G236A)(Richards JO等人，2008.Optimization ofantibody binding to Fcgamma RIIa enhances macrophage phagocytosis of tumorcells.Mol Cancer Ther.7(8):2517-27)。
由于缺乏效应子功能，IgG4抗体代表合适的用于受体阻断而没有细胞耗尽的IgG亚类。IgG4分子可在称为Fab臂交换的动态过程中交换半分子。这种现象可以在治疗性抗体和内源性IgG4之间发生。已经显示S228P突变防止这种重组过程，允许设计不太不可预测的治疗性IgG4抗体(Labrijn AF等人，2009.Therapeutic IgG4antibodies engage in Fab-arm exchange with endogenous human IgG4in vivo.Nat Biotechnol.27(8):767-71)。该技术可用于产生双特异性抗体分子。
本领域技术人员还将理解，抗体可经历各种翻译后修饰。这些修饰的类型和程度常常取决于用于表达抗体的宿主细胞系以及培养条件。此类修饰可以包括糖基化、甲硫氨酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺中的变化。频繁的修饰是由于羧肽酶的作用(如Harris,RJ.Journal of Chromatography 705:129-134,1995中所述的)而导致的羧基末端碱性残基(诸如赖氨酸或精氨酸)的丢失。因此，抗体重链的C末端赖氨酸可以不存在。
亲和力
本发明的多特异性分子包含特异性针对抗原CD22的结合结构域和特异性针对抗原CD79a和/或CD79b的结合结构域。
在一个实施方案中，本公开的分子中使用的结合结构域特异性针对CD22。
在一个实施方案中，本公开的分子中使用的结合结构域特异性针对CD79a。
在一个实施方案中，本公开的分子中使用的结合结构域特异性针对CD79b。
在一个实施方案中，本公开的分子中使用的结合结构域特异性针对CD79复合物，即其识别存在于复合物中且对其具有特异性的表位，例如包含CD79a和CD79b之间相互作用的表位。
CD22(也称为分化群-22)是已知的蛋白质。CD22是B细胞受体(BCR)的抑制性共受体，并且在建立B细胞激活的信号传导阈值中起关键作用。人序列可在UniProt条目号P20273(SEQ ID NO：161和没有信号肽的SEQ ID NO：161的氨基酸20-847)中获得。鼠形式可在UniProt条目号P35329中获得。本公开涉及来自任何物种、特别是人和其天然变体的所有形式的CD22。在一个实施方案中，CD22指该蛋白质的人形式。
在一个实施方案中，本公开的分子中结合结构域对CD22的亲和力为约100nM或更强，诸如约50nM、20nM、10nM、1nM、500pM、250pM、200pM、100pM或更强、特别是50pM或更强的结合亲和力。
CD79的结合结构域可以结合CD79a和/或CD79b。
CD79a(也称为免疫球蛋白α和B细胞抗原受体复合物相关蛋白α链)是已知的蛋白质。CD79a的表达限于B淋巴细胞。人序列在UniProt条目号P11912(SEQ ID NO：162和没有信号序列的SEQ ID NO：162的氨基酸33-226)下可获得。鼠形式在UniProt条目号11911下可获得。本公开涉及来自任何物种、特别是人和其任何天然变体的所有形式的CD79a。在一个实施方案中，CD79a指该蛋白质的人形式。
CD79b(也称为免疫球蛋白相关β和分化群79B)是已知的蛋白质。CD79b的表达限于B淋巴细胞。人序列在UniProt条目号P40259(SEQ ID NO：163和没有信号序列的SEQ ID NO：163的氨基酸29-229)下可获得。鼠形式在UniProt条目号P15530下可获得。本公开涉及来自任何物种、特别是人和其任何天然变体的所有形式的CD79b。在一个实施方案中，CD79b指该蛋白质的人形式。
在一个实施方案中，特异性针对CD79的结合结构域结合CD79a。
在一个实施方案中，特异性针对CD79的结合结构域结合CD79b。
在一个实施方案中，特异性针对CD79的结合结构域结合CD79a和CD79b的复合物。
在一个实施方案中，本公开的分子中结合结构域对CD79的亲和力为约100nM或更强，诸如约50nM、20nM、10nM、1nM、500pM、250pM、200pM、100pM或更强、特别是50pM或更强的结合亲和力。
在一个实施方案中，本公开的分子中结合结构域对CD79a的亲和力为约100nM或更强，诸如约50nM、20nM、10nM、1nM、500pM、250pM、200pM、100pM或更强、特别是50pM或更强的结合亲和力。
在一个实施方案中，本公开的分子中结合结构域对CD79b的亲和力为约100nM或更强，诸如约50nM、20nM、10nM、1nM、500pM、250pM、200pM、100pM或更强、特别是50pM或更强的结合亲和力。
应当理解，结合结构域对CD22的亲和力可以与结合结构域对CD79的亲和力相同或不同。
在一个实施方案中，加工本公开的多特异性抗体分子或其抗体/片段成分以提供改善的对靶抗原的亲和力。这样的变体可以通过许多亲和力成熟操作方案获得，包括突变CDR(Yang等人,J.Mol.Biol.,254,392-403,1995)，链混编(Marks等人,Bio/Technology,10,779-783,1992)，使用大肠杆菌的突变菌株(Low等人，J.Mol.Biol.,250,359-368,1996)，DNA混编(Patten等人，Curr.Opin.Biotechnol.,8,724-733,1997)，噬菌体展示(Thompson等人，J.Mol.Biol.,256,77-88,1996)和有性PCR(Crameri等人，Nature,391,288-291,1998)。Vaughan等人(同上)讨论了这些亲和成熟方法。
抗体及其产生
用于本发明的结合结构域可以通过本领域已知的任何合适的方法产生，例如CDR可以取自非人抗体(包括市售的抗体)并且移植到人框架中，或者可以用非人可变区和人恒定区制备嵌合抗体等。
通常，用于本发明的结合结构域是来源于结合所选抗原的抗体的结合结构域，诸如结合CD22、CD79a和/或CD79b的抗体。
CD22和CD79抗体的实例是本领域已知的，并且这些可以直接用于本发明的分子中，或者使用本文所述的方法筛选适合性，并且随后如果需要则使用本文所述的方法进行修饰，例如进行人源化。临床中CD22抗体的实例包括依帕珠单抗和奥英妥珠单抗。本领域已经描述了其他治疗性抗体，例如US2003202975和WO14011520中公开的抗CD22抗体，WO14011521和WO15021089中公开的抗CD79b抗体。非人抗CD22抗体包括来自克隆SP104的兔单克隆抗体LS-C2210357(LSBio)，来自克隆4C3的小鼠单克隆LS-C174778，小鼠单克隆LS-C4802，来自克隆1B1的小鼠单克隆LS-B9996，来自克隆2E6的小鼠单克隆LS-C340404，小鼠单克隆LS-C312263，小鼠单克隆LS-C152867，小鼠单克隆LS-C87523，来自克隆FRB4的小鼠单克隆LS-C134333，小鼠单克隆LS-C134336，来自克隆HIB22的小鼠单克隆LS-C40961，小鼠单克隆LS-C134332，来自Santa Cruz Biotechnology的以下抗体：sc-271579，sc-377304，sc-7032，sc-18909，sc-7932，sc-7323，sc-7307，sc-7031，sc-20053，sc-189000，sc-136440，sc-136507，sc-53031，sc-73363，sc-53032，Abcam兔单克隆Ab33859(EP498Y)，小鼠单克隆抗体AA 1-687目录号ABIN1999423，来自克隆HIB22的来自Biolegend车间号VCD22.14的小鼠单克隆。
市售的抗CD79a抗体包括来自克隆HM57的小鼠单克隆抗体LS-B4504(LSBio)，小鼠单克隆抗体LS-B8330，小鼠单克隆抗体LS-C44954，兔单克隆抗体LS-B9093，来自克隆JCB117的小鼠单克隆抗体LS-B8513，来自克隆SP18的兔单克隆抗体LS-C210607，来自克隆5E2的小鼠单克隆抗体LS-C175441，来自克隆3D3的小鼠单克隆抗体LS-C338670，来自克隆HM47/A9的小鼠单克隆抗体LS-C88120，小鼠单克隆抗体LS-C191714，小鼠单克隆抗体LS-C87592，小鼠单克隆抗体LS-C44955，小鼠单克隆抗体LS-C95934，小鼠单克隆抗体LS-C121584，小鼠单克隆抗体LS-C121585，小鼠单克隆抗体LS-C204347，小鼠单克隆抗体LS-C88122，Abcam小鼠单克隆抗体ab3121[HM47/A9]，兔单克隆抗体ab79414和兔单克隆抗体ab133483。
市售的CD79b抗体包括小鼠单克隆Abcam抗体ab33295，大鼠单克隆抗体ab23826，小鼠单克隆抗体ab103422，兔单克隆抗体ab134103，兔单克隆抗体ab134147和兔单克隆抗体ab183343。
此类市售的抗体可能是发现其他治疗性抗体的有用工具。
技术人员可以使用本领域已知的任何合适的方法产生用于本发明的多特异性分子的抗体。
用于产生例如用于免疫宿主或用于淘选诸如用于噬菌体展示的抗体的抗原多肽可以通过本领域熟知的方法从包含表达系统的遗传工程改造的宿主细胞制备，或者它们可以是从天然生物来源回收。在本申请中，术语“多肽”包括肽、多肽和蛋白质。除非另有说明，否则这些可互换使用。在一些情况下，抗原多肽可以是较大蛋白质的一部分，诸如融合蛋白，例如与亲和标签或类似物融合。在一个实施方案中，可用转染了相关蛋白或多肽(例如用CD79a和CD79b共转染)的细胞(诸如成纤维细胞)免疫宿主。
可以获得针对抗原多肽产生的抗体，其中动物的免疫是必需的，通过使用众所周知的常规操作方案将多肽施用于动物，优选非人动物，参见例如Handbook ofExperimental Immunology,D.M.Weir(编辑)，Vol 4,Blackwell Scientific Publishers,Oxford,England,1986)。可以免疫许多温血动物，诸如兔、小鼠、大鼠、羊、牛、骆驼或猪。然而，小鼠、兔、猪和大鼠通常是最合适的。
单克隆抗体可以通过本领域已知的任何方法制备，诸如杂交瘤技术(Kohler&Milstein,1975,Nature,256:495-497)，三源杂交瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，1983,Immunology Today,4:72)和EBV-杂交瘤技术(Cole等人，Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy,pp77-96,Alan R Liss,Inc.,1985)。
还可以使用单淋巴细胞抗体方法通过克隆和表达由选择用于产生特异性抗体的单个淋巴细胞产生的免疫球蛋白可变区cDNA来产生抗体，例如由Babcook,J.等人，1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93(15):7843-7848l；WO92/02551；WO2004/051268和WO2004/106377所述的方法。
还可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法产生用于本公开内容的抗体，包括以下公开的那些：Brinkman等人(于J.Immunol.Methods,1995,182:41-50),Ames等人(J.Immunol.Methods,1995,184:177-186),Kettleborough等人(Eur.J.Immunol.1994,24:952-958),Persic等人(Gene,1997 187 9-18),Burton等人(Advances in Immunology,1994,57:191-280)和WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15982；WO95/20401；和US 5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743；5,969,108,和WO20011/30305。
在一个实例中，本公开的多特异性分子是完全人的，特别是一个或多个可变结构域是完全人的。
完全人分子是其中重链和轻链的可变区和恒定区(如果存在)都是人源的，或基本上与人源的序列相同，而不必来自相同抗体的那些。完全人抗体的实例可以包括例如通过上述噬菌体展示方法产生的抗体和由小鼠产生的抗体，其中鼠免疫球蛋白可变区和任选地恒定区基因已被其对应物例如如EP0546073、US5,545,806、US5,569,825、US5,625,126、US5,633,425、US5,661,016、US5,770,429、EP 0438474和EP0463151中一般术语中所述。
在一个实例中，根据本公开的多特异性分子的结合结构域是人源化的。
本文使用的人源化(其包括CDR移植抗体)是指具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区的分子(参见例如US 5,585,089；WO91/09967)。应当理解，可能仅需要转移CDR的特异性决定残基而不是整个CDR(参见例如，Kashmiri等人,2005,Methods,36,25-34)。人源化抗体可任选地进一步包含一个或多个来源于CDR所来源的非人物种的构架残基。
本文所用的术语“人源化抗体分子”是指其中重链和/或轻链含有来自供体抗体(例如鼠单克隆抗体抗体)移植到受体抗体(例如人抗体)的重链和/或轻链可变区框架中的一个或多个CDR(包括，如果需要的话，一个或多个修饰的CDR)的抗体分子。有关综述，请参阅Vaughan等人,Nature Biotechnology,16,535-539,1998。在一个实施方案中，不是转移整个CDR，而是只有一个或多个来自本文上述任何一个CDR的特异性决定残基被转移到人抗体框架(参见例如，Kashmiri等人，2005，Methods，36，25-34)。在一个实施方案中，仅将来自一个或多个本文上述CDR的特异性决定残基转移到人抗体框架。在另一个实施方案中，仅将来自上文描述的每个CDR的特异性决定残基转移至人抗体框架。
当CDR或特异性决定残基被移植时，考虑到CDR来源的供体抗体的类型/类型，包括小鼠、灵长类动物和人框架区，可以使用任何合适的受体可变区框架序列。合适地，根据本发明的人源化抗体具有包含人受体构架区以及本文提供的一个或多个CDR的可变结构域。
可用于本公开的人类框架的实例是KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和POM(Kabat等人，同上)。例如，KOL和NEWM可以用于重链，REI可以用于轻链和EU、LAY和POM可以用于重链和轻链二者。或者，可以使用人种系序列；这些可在以下网址获得：http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/list2.php。
在本公开的人源化抗体分子中，受体重链和轻链不一定需要衍生自相同的抗体，并且如果需要，可以包含具有衍生自不同链的框架区的复合链。
框架区不需要具有与受体抗体完全相同的序列。例如，稀有残基可以改变为该受体链类或类型的更频繁存在的残基。或者，可以改变受体构架区中的选定残基，使得它们对应于在供体抗体中相同位置处发现的残基(参见Reichmann等人，1998,Nature,332,323-324)。这样的变化应保持在恢复供体抗体亲和力所需的最小值。用于在受体构架区中选择可能需要改变的残基的操作方案在WO91/09967中阐述。
框架的衍生物可具有用替代氨基酸替换的1、2、3或4个氨基酸，例如用供体残基替换。
供体残基是来自供体抗体的残基，即，从其最初衍生CDR的抗体，特别是来自供体序列所采用的相应位置的残基。供体残基可以被衍生自人受体框架的合适残基(受体残基)替换。
抗体可变结构域中的残基通常根据Kabat等人设计的系统进行编号。该系统在Kabat等人，1987，Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Departmentof Health and Human Services，NIH，USA(下文称为“Kabat等人(同上)”)中阐述。该编号系统用于本说明书中，除非另有说明。
Kabat残基命名并不总是直接对应于氨基酸残基的线性编号。实际的线性氨基酸序列可以含有比严格Kabat编号更少或额外的氨基酸，其对应于基本可变结构域结构的构架或互补决定区(CDR)的结构成分的缩短或插入。可以通过抗体序列与“标准”Kabat编号序列中同源性残基的比对来确定给定抗体的正确Kabat编号残基。
根据Kabat编号系统，重链可变结构域的CDR位于残基31-35(CDR-H1)，残基50-65(CDR-H2)和残基95-102(CDR-H3)。然而，根据Chothia(Chothia,C.和Lesk,A.M.J.Mol.Biol.,196,901-917(1987))，等同于CDR-H1的环扩展为从残基26至残基32。因此，除非另有说明，本文所用的‘CDR-H1’旨在指残基26至35，如Kabat编号系统和Chothia的拓扑环定义的组合所述。
根据Kabat编号系统，轻链可变结构域的CDR位于残基24-34(CDR-L1)，残基50-56(CDR-L2)和残基89-97(CDR-L3)。
在一个实例中，提供了包含特异性针对CD79的包含三个CDR的重链可变区(例如VH)的结合结构域，其中CDR H1具有SEQ ID NO：78中给出的序列，CDR H2具有给定的序列在SEQ ID NO：79中给出，CDR H3具有在SEQ ID NO：80中给出的序列。
在一个实施方案中，提供了包含特异性针对CD79的包含3个重链CDR的重链可变区(例如VH)的结合结构域，CDRH1为SEQ ID NO：88，CDRH2为SEQ ID NO：89，CDRH3为SEQ IDNO：90。
在一个实施方案中，提供了包含特异性针对CD79的包含3个轻链CDR的轻链可变区(例如VL)的结合结构域，CDRL1为SEQ ID NO：75，CDRL2为SEQ ID NO：76，CDRL3为SEQ IDNO：77。
在一个实施方案中，提供了包含特异性针对CD79的包含3个轻链CDR的轻链可变区(例如VL)的结合结构域，CDRL1为SEQ ID NO：85，CDRL2为SEQ ID NO：86，CDRL3为SEQ IDNO：87。
在一个实例中，提供了包含特异性针对CD79的包含三个CDR的重链可变区(VH)和包含三个CDR的轻链可变区(VL)的结合结构域，其中CDR H1具有SEQ ID NO：78中给出的序列，CDR H2具有SEQ ID NO：79中给出的序列，CDR H3具有SEQ ID NO：80中给出的序列，其中CDR L1具有SEQ ID NO：75中给出的序列，CDR L2具有SEQ ID NO：76中给出的序列，并且CDRL3具有SEQ ID NO：77中给出的序列。
在一个实例中，提供了包含特异性针对CD79的包含三个CDR的重链可变区(VH)和包含三个CDR的轻链可变区(VL)的结合结构域，其中CDR H1具有SEQ ID NO：88中给出的序列，CDR H2具有SEQ ID NO：89中给出的序列，CDR H3具有SEQ ID NO：90中给出的序列，其中CDR L1具有SEQ ID NO：85中给出的序列，CDR L2具有SEQ ID NO：86中给出的序列，并且CDRL3具有SEQ ID NO：87中给出的序列。
在一个实施方案中，根据本公开的多特异性分子包含特异性针对CD22的结合结构域，其包含3个选自SEQ ID NO：98、99、100、108、109、110、118、119、120、128、129、130、138、139、140、148、149和150的重链CDR。
在一个实施方案中，根据本公开的多特异性分子包含特异性针对CD22的结合结构域，其包含3个选自SEQ ID NO：95、96、97、105、106、107、115、116、117、125、126、127、136、137、138、145、146和147的轻链CDR。
在一个实施方案中，根据本公开的多特异性分子包含特异性针对CD22的结合结构域，其包含3个选自SEQ ID NO：98、99、100、108、109、110、118、119、120、128、129、130、138、139、140、148、149和150的重链CDR和选自SEQ ID NO：95、96、97、105、106、107、115、116、117、125、126、127、136、137、138、145、146和147的3个轻链CDR。
在一个实施方案中，提供了包含特异性针对CD22的包含3个重链CDR的重链可变区(VH)的结合结构域，CDRH1为SEQ ID NO：98，CDRH2为SEQ ID NO：99和CDRH3为SEQ ID NO：100。
在一个实施方案中，提供了包含特异性针对CD22的包含3个重链CDR的重链可变区(VH)的结合结构域，CDRH1为SEQ ID NO：108，CDRH2为SEQ ID NO：109和CDRH3为SEQ ID NO：110。
在一个实施方案中，提供了包含特异性针对CD22的包含3个重链CDR的重链可变区(VH)的结合结构域，CDRH1为SEQ ID NO：118，CDRH2为SEQ ID NO：119和CDRH3为SEQ ID NO：120。
在一个实施方案中，提供了包含特异性针对CD22的包含3个重链CDR的重链可变区(VH)的结合结构域，CDRH1为SEQ ID NO：128，CDRH2为SEQ ID NO：129和CDRH3为SEQ ID NO：130。
在一个实施方案中，提供了包含特异性针对CD22的包含3个重链CDR的重链可变区(VH)的结合结构域，CDRH1为SEQ ID NO：138，CDRH2为SEQ ID NO：139和CDRH3为SEQ ID NO：140。
在一个实施方案中，提供了包含特异性针对CD22的包含3个重链CDR的重链可变区(VH)的结合结构域，CDRH1为SEQ ID NO：148，CDRH2为SEQ ID NO：149和CDRH3为SEQ ID NO：150。
在一个实施方案中，提供了包含特异性针对CD22的包含3个轻链CDR的轻链可变区的结合结构域，CDRL1为SEQ ID NO：95，CDRL2为SEQ ID NO：96和CDRL3的SEQ ID NO：97。
在一个实施方案中，提供了包含特异性针对CD22的包含3个轻链CDR的轻链可变区的结合结构域，CDRL1为SEQ ID NO：105，CDRL2为SEQ ID NO：106和CDRL3的SEQ ID NO：107。
在一个实施方案中，提供了包含特异性针对CD22的包含3个轻链CDR的轻链可变区的结合结构域，CDRL1为SEQ ID NO：115，CDRL2为SEQ ID NO：116和CDRL3的SEQ ID NO：117。
在一个实施方案中，提供了包含特异性针对CD22的包含3个轻链CDR的轻链可变区的结合结构域，CDRL1为SEQ ID NO：125，CDRL2为SEQ ID NO：126和CDRL3的SEQ ID NO：127。
在一个实施方案中，提供了包含特异性针对CD22的包含3个轻链CDR的轻链可变区的结合结构域，CDRL1为SEQ ID NO：135，CDRL2为SEQ ID NO：136和CDRL3的SEQ ID NO：137。
在一个实施方案中，提供了包含特异性针对CD22的包含3个轻链CDR的轻链可变区的结合结构域，CDRL1为SEQ ID NO：145，CDRL2为SEQ ID NO：146和CDRL3的SEQ ID NO：147。
在一个实例中，提供了特异性针对CD22的结合结构域，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含三个CDR，其中CDR H1具有SEQ ID NO：98中给出的序列，CDR H2具有SEQ ID NO：99中给出的序列，并且CDR H3具有SEQ ID NO：100中给出的序列，所述轻链可变区包含三个CDR，其中CDR L1具有SEQ ID NO：95中给出的序列，CDR L2具有序列SEQ ID NO：96中给出的序列并且CDR L3具有SEQ ID NO：97中给出的序列。
在一个实例中，提供了特异性针对CD22的结合结构域，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含三个CDR，其中CDR H1具有SEQ ID NO：108中给出的序列，CDR H2具有SEQ ID NO：109中给出的序列，并且CDR H3具有SEQ ID NO：110中给出的序列，所述轻链可变区包含三个CDR，其中CDR L1具有SEQ ID NO：105中给出的序列，CDR L2具有序列SEQ ID NO：106中给出的序列并且CDR L3具有SEQ ID NO：107中给出的序列。
在一个实例中，提供了特异性针对CD22的结合结构域，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含三个CDR，其中CDR H1具有SEQ ID NO：118中给出的序列，CDR H2具有SEQ ID NO：119中给出的序列，并且CDR H3具有SEQ ID NO：120中给出的序列，所述轻链可变区包含三个CDR，其中CDR L1具有SEQ ID NO：115中给出的序列，CDR L2具有序列SEQ ID NO：116中给出的序列并且CDR L3具有SEQ ID NO：117中给出的序列。
在一个实例中，提供了特异性针对CD22的结合结构域，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含三个CDR，其中CDR H1具有SEQ ID NO：128中给出的序列，CDR H2具有SEQ ID NO：129中给出的序列，并且CDR H3具有SEQ ID NO：130中给出的序列，所述轻链可变区包含三个CDR，其中CDR L1具有SEQ ID NO：125中给出的序列，CDR L2具有序列SEQ ID NO：126中给出的序列并且CDR L3具有SEQ ID NO：127中给出的序列。
在一个实例中，提供了特异性针对CD22的结合结构域，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含三个CDR，其中CDR H1具有SEQ ID NO：138中给出的序列，CDR H2具有SEQ ID NO：139中给出的序列，并且CDR H3具有SEQ ID NO：140中给出的序列，所述轻链可变区包含三个CDR，其中CDR L1具有SEQ ID NO：135中给出的序列，CDR L2具有序列SEQ ID NO：136中给出的序列并且CDR L3具有SEQ ID NO：137中给出的序列。
在一个实例中，提供了特异性针对CD22的结合结构域，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含三个CDR，其中CDR H1具有SEQ ID NO：148中给出的序列，CDR H2具有SEQ ID NO：149中给出的序列，并且CDR H3具有SEQ ID NO：150中给出的序列，所述轻链可变区包含三个CDR，其中CDR L1具有SEQ ID NO：145中给出的序列，CDR L2具有序列SEQ ID NO：146中给出的序列并且CDR L3具有SEQ ID NO：147中给出的序列。
在一个实例中，本发明提供了包含特异性针对抗原CD79的结合结构域和特异性针对抗原CD22的结合结构域的多特异性分子，其中这对结合结构域包含来自CD79和CD22抗体对的6个CDR，所述抗体对选自以下CD79和CD22抗体对的列表：4447和4120、4447和4126、4447和4127、4447和4128、4447和4130、4447和4132、4450和4120、4450和4126、4450和4127、4450和4128、4450和4130以及4450和4132。
下文提供了这些CD79抗体(抗体4447和抗体4450)的序列，包括VH、VL和CDR序列。下文提供了这些CD22抗体(抗体4120、4126、4127、4128、4130、4132)的序列，包括VH、VL和CDR序列，并且可以组合作为本发明分子中的结合结构域。
在一个实施方案中，本公开扩展至本文公开的抗体序列。
在一个实例中，提供了特异性针对白蛋白的结合结构域，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含三个CDR，其中CDR H1具有SEQ ID NO：151中给出的序列，CDR H2具有SEQ ID NO：152中给出的序列，并且CDR H3具有SEQ ID NO：153中给出的序列，所述轻链可变区包含三个CDR，其中CDR L1具有SEQ ID NO：154中给出的序列，CDRL2具有序列SEQ ID NO：155中给出的序列并且CDR L3具有SEQ ID NO：156中给出的序列。
在一个实例中，提供了特异性针对白蛋白的结合结构域，其包含具有SEQ ID NO：157中给出的序列的重链可变区(VH)和具有SEQ ID NO：159中给出的序列的轻链可变区(VL)。
在一个实例中，提供了特异性针对白蛋白的结合结构域，其包含具有SEQ ID NO：158中给出的序列的重链可变区(VH)和具有SEQ ID NO：160中给出的序列的轻链可变区(VL)。
在一个实例中，结合结构域是人源化的。
在一个实例中，本文提供的一个或多个CDR可以被修饰以去除不需要的残基或位点，诸如半胱氨酸残基或天冬氨酸(D)异构化位点或天冬酰胺(N)脱酰胺位点。
例如，任何一个CDR中的一个或多个半胱氨酸残基可以被另一个氨基酸取代，诸如丝氨酸。
在一个实例中，可通过将天冬酰胺残基(N)和/或相邻残基突变为任何其它合适的氨基酸，从一个或多个CDR中除去天冬酰胺脱酰胺位点。在一个实例中，天冬酰胺脱酰胺位点诸如NG或NS可以突变为例如NA或NT。
在一个实例中，可通过将天冬氨酸残基(D)和/或相邻残基突变为任何其它合适的氨基酸，从一个或多个CDR中除去天冬氨酸异构化位点。在一个实例中，天冬氨酸异构化位点诸如DG或DS可以被突变为例如EG、DA或DT。
在一个实例中，可以通过将天冬酰胺残基(N)突变为任何其它合适的氨基酸，例如SLS或QLS，来除去N-糖基化位点诸如NLS。在一个实例中，可以通过将丝氨酸残基(S)突变为除苏氨酸(T)以外的任何其它残基来除去N-糖基化位点诸如NLS。
本领域技术人员能够在任何合适的测定(诸如本文所述的那些)中测试CDR的变体或人源化序列以确认活性得到维持。
可以使用任何合适的测定来测试与抗原的特异性结合，所述测定包括例如ELISA或表面等离子体共振方法，诸如BIAcore，其中可以测量与抗原(CD22或CD79)的结合。这样的测定可以使用分离的天然或重组CD22或CD79(a和/或b)或合适的融合蛋白/多肽。在一个实例中，使用重组CD22(诸如SEQ ID NO：161中提供的序列或SEQ ID NO：161的氨基酸20-847)或CD79(诸如SEQ ID NO：162和SEQ ID NO：163中提供的序列和SEQ ID NO：162的氨基酸33-226和SEQ ID NO：163的氨基酸29-229)通过例如表面等离子体共振(诸如BIAcore)测量结合。或者，蛋白质可以在细胞上表达，诸如HEK细胞，并且使用基于流式细胞术的亲和力测定来测量亲和力。
本发明提供的抗体序列可用于鉴定适合用于本发明的多特异性分子中的其它抗体和因此的结合结构域。交叉阻断根据本发明的抗体分子与CD79特异性结合的抗体，特别是包含SEQ ID NO：73中给出的重链序列和SEQ ID NO：71中给出的轻链序列的抗体分子或包含SEQ ID NO：83中给出的重链序列和SEQ ID NO：81中给出的轻链序列的抗体分子可以类似地用于结合CD79，因此类似地可用于本发明的多特异性分子。因此，本发明还提供了包含特异性针对抗原CD22的结合结构域和对抗原CD79b特异性的结合结构域的多特异性分子，其中CD79b的结合结构域交叉阻断本文上述CD79的任何一种抗体分子的结合和/或通过这些抗体中的任一种而被交叉阻断与CD79结合。在一个实施方案中，这样的抗体与本文上述的抗体结合相同的表位。在另一个实施方案中，交叉阻断抗体结合与由本文上述的抗体结合的表位相邻和/或重叠的表位。
类似地，交叉阻断根据本发明的抗体分子与CD22的结合的抗体，特别是包含SEQID NO：93中给出的重链序列和SEQ ID NO：91中给出的轻链序列的抗体分子或包含SEQ IDNO：103中给出的重链序列和SEQ ID NO：101中给出的轻链序列的抗体分子或包含SEQ IDNO：113中给出的重链序列和SEQ ID NO：111中给出的轻链序列的抗体分子，或包含SEQ IDNO：123中给出的重链序列和SEQ ID NO：121中给出的轻链序列的抗体分子，或包含SEQ IDNO：133中给出的重链序列和SEQ ID NO：131中给出的轻链序列的抗体分子或包含SEQ IDNO：143中给出的重链序列和SEQ ID NO：141中给出的轻链序列的抗体分子可以类似地用于结合CD22并且因此类似地可用于本发明的多特异性分子。因此，本发明还提供了包含特异性针对抗原CD22的结合结构域和特异性针对抗原CD79的结合结构域的多特异性分子，其中CD22的结合结构域交叉阻断本文上述的任何一种抗体分子与CD22的结合并且/或者通过这些抗体中的任一种而被交叉阻断与CD22结合。在一个实施方案中，这样的抗体与本文上述的抗体结合相同的表位。在另一个实施方案中，交叉阻断抗体结合与由本文上述的抗体结合的表位相邻和/或重叠的表位。
交叉阻断抗体可以使用本领域任何合适的方法鉴定，例如通过使用竞争ELISA或BIAcore测定，其中交叉阻断抗体与抗原(CD22和/或CD79)的结合阻止本发明的抗体的结合或反之亦然。这样的交叉阻断测定可以使用细胞表达的、分离的天然或重组CD22或CD79(a和/或b)或合适的融合蛋白/多肽。在一个实例中，使用重组CD22或其合适的片段或其天然变体(诸如SEQ ID NO：161中提供的序列或SEQ ID NO：161的氨基酸20-847中提供的序列)测量结合和交叉阻断，或CD79，诸如SEQ ID NO：162中提供的序列或SEQ ID NO：162的氨基酸33-226中提供的序列(CD79a)和/或SEQ ID NO：163中提供的序列或氨基SEQ ID NO：163的氨基酸29-229中提供的序列。
或者或另外，根据本发明这一方面的抗体可以通过本文公开的以下结合结构域而被交叉阻断与抗原(CD22或CD79)的结合，例如包含衍生自以下中给出的重链可变序列和轻链序列的CDR：SEQ ID NO：71和73、81和83、91和93、101和103、111和113、121和123、131和133以及141和143。因此还提供了多特异性分子，其包含特异性针对抗原CD22的结合结构域和特异性针对抗原CD79b的结合结构域，其中CD79b的结合结构域交叉阻断本文上述的任一抗体分子与CD79b的结合和/或通过这些抗体中的任一种而被交叉阻断了例如大于80％，例如大于85％，例如大于90％，特别是大于95％的与CD79b结合，并且任选地其中CD22的结合结构域交叉阻断本文上述的任何一种抗体分子与CD22的结合和/或通过这些抗体中的任一种而被交叉阻断了大于80％，例如大于85％，例如大于90％，特别是大于95％的与CD22结合。
在一个方面，提供了多特异性抗体分子，其包含或由以下组成：
a)式(I)的多肽链：
VH-CH1-X-(V1)p；
b)式(II)的多肽链：
VL-CL-Y-(V2)q；
其中
VH表示重链可变结构域；
CH1表示重链恒定区的结构域，例如其结构域1；
X表示键或接头，例如氨基酸接头；
Y表示键或接头，例如氨基酸接头；
V1表示dab、scFv、dsscFv或dsFv；
VL表示可变结构域，例如轻链可变结构域；
CL表示来自恒定区的结构域，例如轻链恒定区结构域，诸如Cκ；
V2表示dab、scFv、dsscFv或dsFv；
p是0或1；
q是0或1；以及
当p是1时q是0或1并且当q是1时p是0或1，即p和q不同时表示0。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体分子包含不超过一个针对CD22的结合结构域和不超过一个针对CD79的结合结构域。
在一个实施方案中，q是0且p是1。
在一个实施方案中，q是1且p是1。
在一个实施方案中，V1是dab并且V2是dab，并且它们一起形成可操作的可变区对、诸如同源VH/VL对的单一结合结构域，所述可变区对任选地由二硫键连接。
在一个实施方案中，VH和VL特异性针对CD79，例如CD79a或CD79b。
在一个实施方案中，V1特异性针对CD79，例如CD79a或CD79b。
在一个实施方案中，V2特异性针对CD79，例如CD79a或CD79b。
在一个实施方案中，V1和V2一起(例如作为结合结构域)特异性针对CD79，例如CD79a或CD79b并且VH和VL特异性针对CD22。
在一个实施方案中，V1特异性针对CD22。
在一个实施方案中，V2特异性针对CD22。
在一个实施方案中，V1和V2一起(例如作为一个结合结构域)特异性针对CD22并且VH和VL特异性针对CD79。
在一个实施方案中，V1特异性针对CD22，V2特异性针对白蛋白并且VH和VL特异性针对CD79。
在一个实施方案中，V1特异性针对白蛋白，V2特异性针对CD22并且VH和VL特异性针对CD79。
在一个实施方案中，V1特异性针对CD79，V2特异性针对白蛋白并且VH和VL特异性针对CD22。
在一个实施方案中，V1特异性针对白蛋白，V2特异性针对CD79并且VH和VL特异性针对CD22。
在一个实施方案中，V1是特异性针对CD22的dsscFv，V2是特异性针对白蛋白的dsscFv并且VH和VL特异性针对CD79。
在一个实施方案中，V1是特异性针对白蛋白的dsscFv，V2是特异性针对CD22的dsscFv并且VH和VL特异性针对CD79。
在一个实施方案中，V1是特异性针对CD79的dsscFv，V2是特异性针对白蛋白的dsscFv并且VH和VL特异性针对CD22。
在一个实施方案中，V1是特异性针对白蛋白的dsscFv，V2是特异性针对CD79的dsscFv并且VH和VL特异性针对CD22。
上述构建体中的V1、V2、VH和VL可各自表示结合结构域并掺入本文提供的任何序列。
X和Y表示任意合适的接头，例如X和Y可以是SGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:17)。
在一个实施方案中，当V1和/或V2是dab、dsFv或dsscFv时，V1和/或V2的可变结构域VH和VL之间的二硫键形成于位置VH44和VL100之间。
本公开还扩展至本文公开的新的多肽序列和与其至少80％相似或相同的序列，例如85％或更大，例如90％或更大，特别是95％或更大的相似性或同一性。
本文所用的“同一性”表示在比对序列中的任何特定位置，氨基酸残基在序列之间是相同的。本文所用的“相似性”表示在比对序列中的任何特定位置，氨基酸残基在序列之间具有相似类型。例如，亮氨酸可以替代异亮氨酸或缬氨酸。通常可以彼此取代的其他氨基酸包括但不限于：
-苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳香族侧链的氨基酸)；
-赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；
-天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；
-天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)；和
-半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。
可以容易地计算同一性和相似性的程度(Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.编辑,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing.Informaticsand Genome Projects,Smith,D.W.编辑,Academic Press,New York,1993；ComputerAnalysis of Sequence Data,Part 1,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,AcademicPress,1987,Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.编辑,M StocktonPress,New York,1991)，可获取自NCBI的BLASTTM软件(Altschul,S.F.等人,1990,J.Mol.Biol.215:403-410；Gish,W.&States,D.J.1993,Nature Genet.3:266-272.Madden,T.L.等人,1996,Meth.Enzymol.266:131-141；Altschul,S.F.等人,1997,Nucleic AcidsRes.25:3389-3402；Zhang,J.&Madden,T.L.1997,Genome Res.7:649-656)。
特别地，在一个方面，本发明提供了任何合适的抗体形式的本文所述的CD22和CD79抗体。
因此，在一个方面，本发明提供了抗CD22抗体或其片段，其含有一个或多个本文上述的结合结构域，其包含本文提供的CDR并于SEQ ID NO：95、96、97、98、99和100(抗体4120)或105、106、107、108、109和110(抗体4126)或115、116、117、118、119和120(抗体4127)或125、126、127、128、129和130(抗体4128)或135、136、137、138、139和140(抗体4130)或145、146、147、148、149和150(抗体4132)中。还提供了抗CD79抗体或其片段，其含有一个或多个本文上述的结合结构域，其包含本文提供的CDR并于SEQ ID NO：75、76、77、78、79和80(抗体4447)或SEQ ID NO：85、86、87、88、89和90(抗体4450)中。
所述CDR可以掺入任何合适的抗体构架和任何合适的抗体形式。这样的抗体包括完整抗体及其功能活性片段或衍生物，其可以是但不限于单克隆抗体、人源化抗体、完全人抗体或嵌合抗体。因此，这样的抗体可以包含具有全长重链和轻链或其片段的完整抗体分子，并且可以是但不限于Fab、修饰的Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单结构域抗体、scFv、二价、三价或四价抗体、Bis-scFv、双抗体、三抗体、四抗体和上述任何的表位结合片段(参见例如Holliger和Hudson，2005，Nature Biotech.23(9)：1126-1136；Adair和Lawson，2005，DrugDesign Reviews-Online 2(3)，209-217)。用于产生和制备这些抗体片段的方法是本领域公知的(参见例如Verma等人，1998，Journal of Immunological Methods，216,165-181)。多价抗体可以包含多种特异性或可以是单特异性的(参见例如WO 92/22853和WO05/113605)。应当理解，如本文上文所述的，本发明的这个方面还扩展到这些抗CD22和CD79抗体的变体，包括人源化形式和修饰形式，包括其中在CDR中氨基酸已被突变以去除一个或多个异构化、脱酰胺、糖基化位点或半胱氨酸残基。
接头
本文中在一种环境中对接头的教导同样可以应用于使用接头的不同环境(诸如本发明的任何多特异性分子)中的接头。
在一个实施方案中，在本公开的分子中使用的接头是长度为50个残基或更少的氨基酸接头，例如选自序列5至70所示的序列。
表1.铰链接头序列
表2.柔性接头序列
(S)在序列17至20中是任选的。
刚性接头的实例包括肽序列GAPAPAAPAPA(SEQ ID NO:69)、PPPP(SEQ ID NO:70)和PPP。
其它接头示于表3中：
SEQ ID NO: 序列
55 DLCLRDWGCLW
56 DICLPRWGCLW
57 MEDICLPRWGCLWGD
58 QRLMEDICLPRWGCLWEDDE
59 QGLIGDICLPRWGCLWGRSV
60 QGLIGDICLPRWGCLWGRSVK
61 EDICLPRWGCLWEDD
62 RLMEDICLPRWGCLWEDD
63 MEDICLPRWGCLWEDD
64 MEDICLPRWGCLWED
65 RLMEDICLARWGCLWEDD
66 EVRSFCTRWPAEKSCKPLRG
67 RAPESFVCYWETICFERSEQ
68 EMCYFPGICWM
效应子分子
如果需要，用于本发明的多特异性分子可以与一个或多个效应子分子缀合。应当理解，效应子分子可以包含单个效应子分子或两个或更多个这样的分子，所述两个或更多个这样的分子经连接以形成可以附接到本发明的多特异性分子上的单个部分。当期望获得连接至效应子分子的根据本公开的抗体或多特异性分子时，可以通过标准化学或重组DNA方法制备，其中抗体片段直接或通过偶联剂连接到效应子分子。将这些效应子分子与抗体缀合的技术是本领域熟知的(参见，Hellstrom等人,Controlled Drug Delivery,第二版,Robinson等人编辑,1987,pp.623-53；Thorpe等人,1982,Immunol.Rev.,62:119-58和Dubowchik等人,1999,Pharmacology and Therapeutics,83,67-123)。具体的化学方法包括，例如在WO 93/06231、WO 92/22583、WO 89/00195、WO 89/01476和WO 03/031581中所述的那些。或者，当效应子分子是蛋白质或多肽时，可以使用重组DNA方法实现连接，例如在WO86/01533和EP0392745中所述的。
在一个实施方案中，本公开的多特异性分子可以包含效应子分子。
本文所用的术语效应子分子包括例如抗肿瘤剂、药物、毒素、生物活性蛋白，例如酶、其他抗体或抗体片段、合成或天然存在的聚合物、核酸及其片段，例如DNA、RNA及其片段、放射性核素，特别是放射性碘、放射性同位素、螯合金属、纳米颗粒和报告基团，诸如荧光化合物或可通过NMR或ESR光谱法检测的化合物。
效应子分子的实例可包括细胞毒素或细胞毒性剂，包括对细胞有害(例如杀死细胞)的任何试剂。实例包括combrestatin，尾海兔素，埃博霉素，星形孢菌素，美登木素生物碱，海绵抑制素，rhizoxin，软海绵素，杆孢菌素，hemiasterlins，紫杉醇，松胞菌素B，短杆菌肽D，溴化乙锭，依米丁，丝裂霉素，依托泊苷，tenoposide，长春花新碱，长春花碱，秋水仙碱，阿霉素，柔红霉素，二羟基炭疽菌素二酮，米托蒽醌，光神霉素，放线菌素D，1-脱氢睾酮，糖皮质激素，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，心得安和嘌呤霉素及其类似物或同系物。
效应子分子还包括但不限于抗代谢物(例如氨甲蝶呤，6-巯基嘌呤，6-硫鸟嘌呤，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶decarbazine)，烷化剂(例如氮芥，三胺硫磷苯丁酸氮芥(thioepachlorambucil)，美法仑，卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)，环磷酰胺，白消安，二溴甘露醇，链脲佐菌素，丝裂霉素C和顺式二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)，蒽环类抗生素(例如柔红霉素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(例如更生霉素(以前称为放线菌素)，博来霉素，光神霉素，氨曲霉素(AMC)，加利车霉素或倍癌霉素)和抗有丝分裂剂(例如长春花新碱和长春花碱)。
其它效应子分子可包括螯合放射性核素诸如111In和90Y、Lu177、铋213、锎252、铱192和钨188/铼188；或药物诸如但不限于烷基磷酸胆碱、拓扑异构酶I抑制剂、紫杉烷类和苏拉明。
其他效应子分子包括蛋白质、肽和酶。感兴趣的酶包括但不限于蛋白水解酶，水解酶，裂合酶，异构酶，转移酶。感兴趣的蛋白质、多肽和肽包括但不限于免疫球蛋白，毒素诸如相思豆毒蛋白，蓖麻毒蛋白A，假单胞菌外毒素或白喉毒素，蛋白质诸如胰岛素，肿瘤坏死因子，α-干扰素，β-干扰素，神经生长因子，血小板衍生生长因子或组织纤溶酶原激活剂，血栓形成剂或抗血管生成剂，例如血管抑素或内皮抑制蛋白，或，生物应答调节剂诸如淋巴因子，白细胞介素-1(IL-1)，白细胞介素-2(IL-2)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，神经生长因子(NGF)或其它生长因子和免疫球蛋白。
其他效应子分子可以包括可用于例如诊断的可检测物质。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性核素、正电子发射金属(用于正电子发射断层成像)和非放射性顺磁金属离子。一般参见美国专利号4,741,900中关于可与抗体缀合用作诊断剂的金属离子。合适的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基包括链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白和生物素；合适的荧光材料包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯和藻红蛋白；合适的发光材料包括鲁米诺；合适的生物发光材料包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；和合适的放射性核素包括125I、131I、111In和99Tc。
在另一个实例中，效应子分子可以增加体内抗体的半衰期和/或降低抗体的免疫原性和/或增强抗体跨上皮屏障至免疫系统的递送。这种类型的合适效应子分子的实例包括聚合物、白蛋白、白蛋白结合蛋白或白蛋白结合化合物诸如在WO05/117984中所述的那些。
当效应子分子是聚合物时，其通常可以是合成或天然存在的聚合物，例如任选取代的直链或支链聚亚烷基、聚亚烯基或聚氧化烯聚合物或支链或非支链多糖，例如同多糖或异多糖。
可存在于上述合成聚合物上的特定任选取代基包括一个或多个羟基、甲基或甲氧基。
合成聚合物的具体实例包括任选取代的直链或支链聚(乙二醇)、聚(丙二醇)聚(乙烯醇)或其衍生物，特别是任选取代的聚(乙二醇)诸如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。
功能测定和筛选形式
用于本发明的典型合适的结合结构域可以通过在功能测定中测试一个或多个结合结构域对来鉴定。例如，可以在一种或多种功能测定中测试包含特异性针对抗原CD22的结合结构域和特异性针对抗原CD79a和/或CD79b的结合结构域的多特异性分子。
本文所用的“功能测定”是可用于确定经受测定条件的蛋白质复合物、抗体复合物或抗体混合物的一种或多种所需性质或活性的测定。合适的功能测定可以是结合测定，细胞凋亡测定，抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定，补体依赖性细胞毒性(CDC)测定，细胞生长或增殖抑制(细胞抑制作用)测定，细胞杀伤(细胞毒性效应)测定，细胞信号传导测定，细胞因子产生测定，抗体生产和同种型转换，和细胞分化测定。
根据本公开的多特异性抗体的功效可以通过本领域普通技术人员通常已知的方法与这些模型中的个体抗体或抗体(或片段)的混合物进行比较。
功能测定可以根据需要重复多次以增强结果的可靠性。可以采用本领域技术人员已知的各种统计学检验来鉴定统计学显著的结果，从而鉴定具有生物功能的多特异性分子。
合适的功能测定的实例描述于本文的实施例中，并且包括测量本发明的多特异性分子在用抗IgM刺激后抑制B细胞激活的能力，如通过检测B细胞激活的标志物诸如磷酸化Akt表达、磷酸化P38表达、PLCγ信号传导、CD40表达、CD71表达和/或CD86表达。
当建立用于筛选的功能测定时，本领域技术人员可以设定合适的阈值，其中超过该阈值的所鉴定的活性被认为是“命中”。在使用多于一种功能测定的情况下，可以将每种测定的阈值设定在合适的水平以建立可控的命中率。在一个实例中，命中率可以是3-5％。在一个实例中，当在B细胞激活测定中搜索抑制B细胞功能的结合结构域对时所设定的标准可以是至少两个磷酸读出数据(phospho-readout)的至少30％抑制，如上文和本文实施例所述。
在一个实例中，本发明的多特异性分子对于抗IgM刺激的B细胞中磷酸化P38的抑制具有小于1nM的IC50，优选小于0.5nM的IC50。在一个实例中，多特异性分子在该测定中的IC50小于0.05nM。
在一个实例中，本发明的多特异性分子对于抗IgM刺激的B细胞中磷酸化Akt的抑制具有小于1nM的IC50，优选小于0.1nM的IC50。在一个实施例中，多特异性分子在该测定中的IC50小于0.05nM。
在一个实例中，本发明的多特异性分子对于抗IgM刺激的B细胞中磷酸化的PLCγ2的抑制具有小于1nM的IC50，优选小于0.8nM的IC50。在一个实施例中，多特异性分子在该测定中的IC50小于0.05nM。
在一个实例中，本发明的多特异性分子对于抑制抗IgM刺激的B细胞中的CD71表达具有小于5nM的IC50，优选小于3nM的IC50。在一个实施例中，多特异性分子在该测定中的IC50小于0.5nM。
在一个实例中，本发明的多特异性分子对于抑制抗IgM刺激的B细胞中的CD40表达具有小于5nM的IC50。在一个实施例中，多特异性分子在该测定中的IC50小于0.5nM。
在一个实例中，本发明的多特异性分子对于抑制抗IgM刺激的B细胞中的CD86表达具有小于5nM的IC50，优选小于2nM的IC50。在一个实施例中，多特异性分子在该测定中的IC50小于0.5nM。
在一个实例中，本发明的多特异性分子对于抑制抗IgM刺激的B细胞中的CD71、CD40和CD86表达具有小于5nM的IC50和/或对于抑制抗IgM刺激的B细胞中的磷酸化的PLCγ2、P38和AKT的表达具有小于1nM的IC50。
在一个实施方案中，可以使用体内测定，诸如动物模型，包括小鼠肿瘤模型、自身免疫疾病模型、病毒感染或细菌感染的啮齿动物或灵长类动物模型等，来测试本公开的分子。
下文描述了用于筛选和发现结合结构域的合适形式的实例。
筛选以鉴定用于本发明的结合结构域可以使用双特异性蛋白质复合物。
本文所用的“双特异性蛋白质复合物”是指包含通过异二聚体系链保持在一起的两种蛋白质(本文称为双特异性成分的A和B)的分子。在一个实施方案中，蛋白质中的一种或两种具有结合结构域，例如蛋白质中的一种或两种是抗体或其片段。
通常，双特异性蛋白质复合物具有式A-X:Y-B，其中：
A-X是第一融合蛋白；
Y-B是第二融合蛋白；
X:Y是异二聚体系链；
A包含第一结合结构域；
B包含第二结合结构域；
X是结合对的第一个结合伴侣；
Y是所述结合对的第二结合伴侣；和
:是X和Y之间的相互作用(例如结合相互作用)，和
本文所用的“融合蛋白”包含与另一个实体例如结合伴侣X或Y(视情况而定)融合的蛋白质成分，例如A或B。在实施方案中，融合蛋白是通过重组技术从遗传构建体表达的翻译蛋白，例如在宿主中表达自DNA构建体。
系链X:Y的功能是保持蛋白A和B彼此接近，从而可以实现A和B的协同功能。
本文所用的“异二聚体系链”是指包含两个不同的结合伴侣X和Y的系链，所述结合伴侣形成彼此之间的相互作用(例如结合)，其具有足以将两个结合伴侣保持在一起的总亲和力。在一个实施方案中，X和/或Y不适合形成同二聚体。
异二聚体系链束缚和异二聚体系链在本文中可互换使用。
在一个实施方案中，“不适于形成同二聚体”是指一旦形成，则X-Y的异二聚体的形成是更优选的，例如稳定的，诸如热力学稳定的和/或物理上稳定的(例如由缺乏聚集所证明的)。
在一个实施方案中，X-Y相互作用比X-X或Y-Y相互作用更有利。当融合蛋白A-X和B-Y混合时，这减少了同二聚体X-X或Y-Y的形成。这也使得同二聚体的去除相对简单，例如一个纯化步骤(诸如柱层析)提供基本上纯的根据本公开的融合蛋白和/或双特异性蛋白质复合物。
在一个实施方案中，在融合蛋白表达后提供纯化步骤。因此，在一个实施方案中，在体外混合之前，以基本上纯的形式提供融合蛋白。本文所用的基本上纯的形式是指其中融合蛋白在85至100％范围内的，例如90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的单体。
在一个实施方案中，在双特异性蛋白质复合物形成之后不需要纯化。
在一个实施方案中，本发明方法的体外混合步骤中使用的融合蛋白的比例为A-X对B-Y是0.8:1至3:1，例如1.5:1或2:1。
在一个实施方案中，本发明方法的体外混合步骤中使用的融合蛋白的比例为B-Y对A-X是0.8:1至3:1，例如1.5:1或2:1。
在一个实施方案中，该比例为1:1。
在一个实施方案中，结合伴侣中的一个(或至少一个)不能形成同二聚体，例如，结合伴侣的氨基酸序列被突变以消除或最小化同二聚体的形成。
在一个实施方案中，两个结合伴侣不能形成同二聚体，例如结合伴侣之一是肽，而另一个结合伴侣是特异性针对所述肽的VHH。
在一个实施方案中，本公开的分子中使用的scFv不能形成同二聚体。
本文所使用的不能形成同二聚体，是指形成同二聚体的倾向低或为零。本文所用的低是指5％或更少，诸如4、3、2、1、0.5％或更少的聚集。
融合蛋白中的少量聚集或异二聚体系链束缚的双特异性蛋白质复合物中残余物通常对本公开的方法具有最小的影响。
在一个实施方案中，:是结合相互作用，例如基于吸引力诸如范德华力，诸如氢键和静电相互作用，例如基于对抗原(诸如肽)的抗体特异性。
在一个实施方案中，:是由特定化学相互作用(诸如点击化学)形成的共价键。
在一个实施方案中，:不是共价键。
本文所用的“形成复合物”是指当融合蛋白成分A-X和B-Y在复合物组装和融合蛋白保持在一起的适当条件下接触时充分特异和强的相互作用(包括结合相互作用或化学反应)。
本文所用的“保持在一起”是指将成分(融合蛋白)保持在彼此附近，使得在结合后，复合物可以被处理为好像它是一个分子，并且在许多情况下表现和行为类似单个分子。在一个实施方案中，保持使得复合物适合用于本文公开的方法，即适合用于至少一种功能筛选。
在一个实施方案中，结合相互作用是可逆的。
当涉及本文使用的X和Y时，特异性是指相互作用中的结合伴侣X和Y仅相互识别，或相对于非伴侣而言彼此具有显著更高的亲和力，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10倍的亲和力。
在一个实施方案中，X和Y之间的结合相互作用具有低解离常数。
低解离常数的实例包括1-9x10-2s-1或更低，例如1-9x10-3s-1、1-9x10-4s-1、1-9x10- 5s-1、1-9x10-6s-1或1-9x10-7s-1。特别合适的解离常数包括1x10-4s-1或更低，例如1x10-5s-1、1x10-6s-1或1x10-7s-1。
尽管不希望受理论束缚，但据信低解离常数(也称为解离速率)允许分子足够稳定以使双特异性蛋白质复合物有用，特别是在功能筛选测定中。
在一个实施方案中，X和Y彼此的亲和力为5nM或更强，例如4nM、3nM、2nM、1nM或更强。
在一个实施方案中，X和Y彼此的亲和力为900pM或更强，例如800、700、600、500、400、300、200、100或50pM或更强。
在另一个实施方案中，X和Y彼此的亲和力为10pM或更强，例如9、8、7、6或5pM。
亲和度是从相互作用的结合速率和解离速率所计算的值。本文所用的术语“亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合伴侣(例如肽)之间的非共价相互作用的总和的强度。分子对其结合伴侣的亲和力通常可以由平衡解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些，诸如表面等离子体共振方法，特别是BIAcore。
在一个实施方案中，平行或基本同时测试根据本公开的多个双特异性蛋白质复合物。
本文所用的同时是指在相同的分析中、例如在相同的“运行”中分析样品/分子/复合物。
在一个实施方案中，同时是指由仪器伴随分析在基本上相同的时间分析信号输出。该信号可能需要解卷积以解释所获得的结果。
有利地，测试多个双特异性蛋白质复合物允许更有效地筛选大量的双特异性蛋白质复合物和鉴定新的和有趣的关系。显然，针对有趣的CD22和CD79的靶抗原不同的可变区可以获得生物功能中的细微差别。
在一个实施方案中，通过使用如上所定义的多重测试法测试多个双特异性蛋白质复合物，并对其进行一种或多种功能测定。
本文使用的术语“生物功能”是指被测试的生物实体的天然活性或目的，例如细胞、蛋白质或类似物的天然活性。理想地，可以使用体外功能测定法来测试功能的存在，包括使用活哺乳动物细胞的测定。本文所用的天然功能包括异常功能，诸如与癌症相关的功能。
本文使用的相关“生物比较物”是指在针对双特异性蛋白质复合物所采用的相同测定中用于评估活性以确定是否存在任何变化或新的活性或功能的合适实体。适用于A-X:Y-B的比较物可包括天然形式或以与双特异性相同的形式存在的纯化蛋白质(包括重组蛋白质)，即其中A和B是相同的实体，诸如A-X:Y-A或B-X:Y-B。或者，可以使用未复合形式的融合蛋白A-X或B-Y作为比较物。或者，可以采用不同形式(特别是如本文所述)的多个比较物。本领域技术人员能够基于文献中发现的公知常识或信息来识别和包括合适的对照/比较物。
本文使用的术语“协同功能”是指未观察到或高于当本公开的双特异性蛋白质复合物的第一和第二蛋白没有一起使用时所观察到的生物活性，例如仅在双特异性形式中观察到的活性。因此，“协同”包括新的生物功能。
本公开提供了至少特异性针对具有新的生物功能的CD22和CD79的分子。
本文所用的新的生物功能是指直到两种或更多种协同实体[蛋白A和蛋白B]结合在一起(作为双特异性或其它方式)时才是明显或不存在的功能或以前未鉴定的功能。
本文所用的更高是指活性增加，包括从零增加，即双特异性中的一些活性，其中个别未复合的双特异性成分在相关功能测定中没有活性，本文也称为新活性或新生物功能。本文所用的更高还包括相比于个别未复合的双特异性成分或二价结合结构域，在相关功能测定中双特异性中的更多附加功能，例如相关活性中10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％或更高的增加。
在一个实施方案中，新的协同功能是更高的抑制活性。
在一个实施方案中，本发明的多特异性抗体分子具有比单独或混合提供的针对CD22的二价结合结构域和针对CD79a的二价结合结构域的活性的总和更高的抑制活性。
在一个实施方案中，结合对的第一结合伴侣X和第二结合伴侣Y中的至少一个独立地选自肽和蛋白质；例如第一结合伴侣或第二结合伴侣是肽。
合适的肽包括包含以下的组：GCN4，Fos/Jun(人和鼠Fos分别具有Uniprot编号P01100和P01101，人和鼠jun分别具有Uniprot编号P05412和P05627)，人流感血凝素(HA)，多组氨酸(His)，绿色荧光蛋白(GFP)和FLAG。也考虑了适用于本公开内容的其它肽，并且特别合适的肽是用于蛋白质纯化的亲和标签，因为这样的肽具有以高亲和力结合其各自的结合伴侣的趋势。
本文所用的术语“肽”是指通过肽键连接的氨基酸的短聚合物，其中所述肽含有2至100个氨基酸，例如5至99，诸如6至98、7至97或8至96。在一个实施方案中，本公开中使用的肽是具有50个氨基酸残基或更少，例如40、30、10个氨基酸残基或更少的氨基酸序列。本公开中使用的肽具有足够长度以适合目的，例如如果肽是接头，则其需要适当长以允许其连接的片段发挥其生物功能；或者如果肽是结合伴侣，则其必须能够特异性结合另一个实体，诸如抗体。
在一个实施方案中，结合对的另一个结合伴侣(备选的第一或第二结合伴侣)是蛋白质。
本文所用的蛋白质是指具有100个氨基酸或更多的氨基酸序列。在一个实施方案中，本文所用的“蛋白质”是指具有二级或三级结构的氨基酸序列。
在一个实施方案中，双特异性蛋白质复合物的第一蛋白A和/或第二蛋白B是抗体或抗体片段。这样的双特异性蛋白质复合物可以称为双特异性抗体复合物。
在一个实施方案中，本公开的双特异性抗体复合物中采用的每个抗体或片段包含一个结合位点。
在融合蛋白(A-X或B-Y)中使用的全长抗体或抗体片段可以是单特异性的、多价的或双特异性的。
有利地，使用两个双特异性抗体或抗体片段允许本公开的分子、诸如本文所述的双特异性抗体复合物潜在地对多达4种不同抗原具有特异性(即复合物可以是四特异性的)。这允许研究亲合力类型效应。
在一个实施方案中，本公开的分子或其成分(诸如第一融合蛋白A-X)中使用的抗体或抗体片段是单特异性抗体或抗体片段，例如Fab，Fab'，scFv或类似物，并且在特别是特异性针对CD22的。
在一个实施方案中，本公开的分子或其成分(诸如第二融合蛋白B-Y)中使用的抗体或抗体片段是单特异性抗体或抗体片段，例如Fab，Fab'，scFv或类似物，特别是特异性针对CD79a和/或CD79b的。
在一个实施方案中，本公开的分子或其成分(诸如第二融合蛋白B-Y)中使用的抗体或抗体片段是多价的，即具有两个或更多个结合结构域。
在一个实施方案中，本公开的分子或其成分(诸如第一融合蛋白A-X)中使用的抗体或抗体片段是单价的，并且在本公开的分子或其成分(诸如第二融合蛋白B-X)中使用的抗体或抗体片段是单价的。
因此，在一个实施方案中，本公开的多特异性分子的结合结构域是单价的。
因此，在一个实施方案中，本公开的多特异性分子的结合结构域是单价和单特异性的。
在一个实施方案中，本公开的分子或其成分(诸如第一融合蛋白A-X)中使用的抗体或抗体片段是单价的，并且本公开的分子或其成分(诸如第二融合蛋白B-Y)中使用的抗体或抗体片段是多价的。
在一个实施方案中，本公开的分子或其成分(诸如第一融合蛋白A-X)中使用的抗体或抗体片段是多价的，并且本公开的分子或其成分(诸如第二融合蛋白B-Y)中使用的抗体或抗体片段是单价的。
在一个实施方案中，本公开的分子或其成分(诸如第一融合蛋白A-X)中使用的抗体或抗体片段是多价的，并且本公开的分子或其成分(诸如第二融合蛋白B-Y)中使用的抗体或抗体片段是多价的。
在一个实施方案中，本公开分子或其成分(例如双特异性抗体复合物)的第一抗体、第二抗体或第一和第二抗体二者可以是IgG形式，例如抗CD22和/或抗CD79抗体可以以IgG形式提供。
在一个实施方案中，抗体片段选自：在第一融合蛋白(A-X)或第二融合蛋白(B-Y)中使用的片段抗原(Fab)片段，单链可变片段(scFv)和单结构域抗体(sdAb)，诸如scFv。有利地，小尺寸的scFv可以促进双特异性抗体复合物的正确折叠。
在一个实施方案中，本公开的双特异性抗体复合物的第一抗体/片段(A)、第二抗体/片段(B)或第一和第二抗体/片段两者可以是Fab。
在一个实施方案中，本公开的双特异性抗体复合物的第一、第二抗体/片段或第一和第二抗体/片段两者都是VHH。
在本公开的双特异性复合物的上下文中使用的“融合蛋白”是指蛋白质，例如附接于结合伴侣的抗体或抗体片段。
为了方便，本公开的双特异性蛋白质复合物在本文中称为A-X:Y-B。然而，该命名法并不旨在限制融合蛋白A-X和B-Y如何设计，因为我们的实验表明，结合伴侣X和Y可以颠倒(即A-Y和B-X)而不会不利地影响该方法。因此，A和B以及X和Y是被称为用于辅助本技术的解释的标称标签。
本文所用的“附接”是指通过接头直接或间接连接(connected或joined)，诸如肽接头，其实例在下文讨论。直接连接包括融合在一起(例如肽键)或化学缀合。
本文所用的“结合伴侣”是指结合对的一个组成部分。
在一个实施方案中，结合伴侣的亲和力高为5nM或更强，诸如900、800、700、600、500、400、300pM或更强。
本文所用的“结合对”是指彼此特异性结合的两个结合伴侣。结合对的实例包括肽和特异性针对其的抗体或结合片段，或酶和配体，或酶和该酶的抑制剂。
在一个实施方案中，第一结合伴侣(X)选自：全长抗体，Fab，Fab'，scFv，肽和sdAb，其中sdAb的实例包括VH或VL或VHH。
在一个实施方案中，第二伴侣(Y)选自全长抗体，Fab，Fab'，scFv，肽和sdAb，其中sdAb的实例包括VH或VL或VHH。
在一个实施方案中，在A是抗体或其片段的情况下，第一结合伴侣(X)附接到第一抗体或抗体片段的重链或轻链的C末端，例如，第一结合伴侣附接到第一抗体或抗体片段的重链的C末端。
在另一个实施方案中，在B是抗体或其片段的情况下，第二结合伴侣(Y)附接到第二抗体或抗体片段的重链或轻链的C末端，例如第二结合伴侣附接到第二抗体或抗体片段的重链的C末端。
在一个实施方案中，X附接到抗体或片段(蛋白A)的重链的C末端，Y附接到抗体或片段(蛋白B)的C末端。
在一个实施方案中，X通过接头(诸如ASGGGG或ASGGGGSG)附接到抗体或片段(蛋白A)的重链的C末端，并且Y通过接头(诸如ASGGGG或ASGGGGSG)附接到抗体或片段(蛋白B)的C末端。
在一个实施方案中，第一或第二结合伴侣(X或Y)是肽。
合适的结合对的实例可以包括GCN4(SEQ ID NO：1)或其变体和52SR4(SEQ ID NO：3)或其变体，其是特异性针对GCN4的scFv。
在一个实施方案中，第一结合伴侣(标称X)是GCN4(例如如SEQ ID NO：1所示)或其变体(例如没有His标签)，第二结合伴侣(标称Y)是特异性针对GCN4的scFv(例如如SEQ IDNO：3所示)或其变体。
在一个实施方案中，第一结合伴侣(标称X)是特异性针对GCN4的sFv(例如如SEQID NO：3所示)或其变体，并且第二结合伴侣(标称Y)是GCN4(例如SEQ ID NO：1所示)或其变体。
GCN4变体包括与SEQ ID NO：1具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％、或99％同一性的氨基酸序列。GCN4变体还包括与由核苷酸序列SEQID NO：2或在严格条件下与SEQ ID NO：2杂交的核苷酸序列编码的序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸。
特异性针对GCN4的合适的scFv是52SR4(SEQ ID NO：3)或其变体。52SR4的变体包括与SEQ ID NO：3具有至少80％、或85％、或90％、或95％、或98％、或99％同一性的氨基酸序列。52SR4变体还包括与由核苷酸序列SEQ ID NO：4或在严格条件下与SEQ ID NO：2杂交的核苷酸序列编码的序列具有至少80％、或85％、或90％、或95％、或98％、或99％同一性的氨基酸序列。
本发明人已经发现单链抗体52SR4和肽GCN4是适合用于本公开的双特异性蛋白质复合物的结合对。
或者，可以将任何合适的抗体/片段和抗原(诸如肽)用作X和Y.
在一个实施方案中，第一结合伴侣(X)和第二结合伴侣(Y)是蛋白质。
在一个实施方案中，第一结合伴侣(X)是酶或其活性片段，第二结合伴侣(Y)是配体，或反之亦然。
在一个实施方案中，第一结合伴侣(X)是酶或其活性片段，第二结合伴侣(Y)是该酶的抑制剂，或反之亦然。
本文使用的“活性片段”是指氨基酸片段，其小于实体的整个氨基酸序列，并保持基本上相同的生物活性或相关生物活性，例如大于50％活性，诸如60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在另一个实施方案中，第一结合伴侣X是谷胱甘肽(GSH)，第二结合伴侣Y是谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，反之亦然。
在另一个实施方案中，X是Fos，Y是Jun，或反之亦然。
在另一个实施方案中，X是His，Y是抗His，或反之亦然。
在另一个实施方案中，结合对是钙调蛋白结合肽，Y是钙调蛋白，或反之亦然。
在另一个实施方案中，X是麦芽糖结合蛋白，Y是抗麦芽糖结合蛋白或其片段，或反之亦然。
也考虑了其它酶-配体组合用于结合伴侣。还合适的是本领域已知的用于蛋白质纯化的亲和标签，因为它们具有以高亲和力结合其各自的结合伴侣的趋势。
在一个实施方案中，第一或第二结合伴侣(X或Y)是蛋白质或肽。
在一个实施方案中，第一和第二融合蛋白包含一个或多个肽接头。接头可以并入融合蛋白中的各个位置。例如，可以在结合伴侣和与其附接的蛋白质之间引入接头。
在一个实施方案中，接头是肽接头。
本文所用的术语“肽接头”是指具有氨基酸序列的肽。一系列合适的肽接头是本领域技术人员已知的。
在一个实施方案中，肽接头可以是合成来源的，即通过合成化学技术制备。
在一个实施方案中，双特异性蛋白质复合物的结合伴侣通过肽接头与其各自的蛋白质连接。
在一个实施方案中，融合蛋白是翻译融合物，其是在包含由其表达融合蛋白的遗传构建体的宿主细胞中表达的融合蛋白。
在一个实施方案中，融合蛋白通过任选地经由肽接头将A缀合至X或将B缀合至Y来制备。
在一个实施方案中，肽接头的长度为50个氨基酸或更少，例如20个氨基酸或更少。
通常重组表达融合蛋白将更有效，因此可由宿主细胞表达的直接肽键或肽接头可能是有利的。
在一个方面，提供了产生本公开的双特异性蛋白质复合物的方法，包括以下步骤：
(a)产生附接于结合对的第一结合伴侣(X)的包含特异性针对CD22或CD79a和/或CD79b(A)的结合结构域的第一融合蛋白(A-X)；
(b)产生附接于结合对的第二结合伴侣(Y)的包含特异性针对CD22或CD79a和/或CD79b(B)的结合结构域的第二融合蛋白(B-Y)；
其中至少第一融合蛋白或第二融合蛋白包含特异性针对CD22的结合结构域，剩下的另一融合蛋白包含特异性针对CD79a和/或CD79b的结合结构域，和
(c)将步骤a)和b)中制备的第一融合蛋白(A-X)和第二融合蛋白(B-Y)混合在一起。
特别地，通过在体外混合A-X和B-Y来制备异二聚体系链束缚的双特异性蛋白质复合物。因此，在一个实施方案中，该方法包括使A-X和B-Y接触的体外混合步骤。
因此，通常融合蛋白A-X和B-Y不共表达于相同的细胞中。这是有利的，因为其允许例如100种A-X融合蛋白和100种A-Y融合蛋白分开表达并任选地纯化，并且通过随后以各种排列混合这200种融合蛋白，可以提供10,000种异二聚体系链束缚的双特异性蛋白质复合物。
相比之下，现有技术方法需要双特异性的共表达，因此对于10,000种复合物，需要10,000个转染、表达和纯化。
结合伴侣X和Y彼此具有亲和力，并且作为或棒和磁体的生物等价物，并将复合物保持在一起。有利地，这意味着融合蛋白A-X和Y-B可以容易地通过简单地将融合蛋白混合在一起而组装成双特异性蛋白质复合物。因此，本公开的双特异性蛋白质复合物具有模块化结构，其允许容易地组装两种不同的蛋白，以便以例如网格样方式产生具有不同抗原特异性组合的双特异性蛋白质复合物的大组排列。这允许有效和系统筛选大量的双特异性蛋白质复合物，以便检测累加的、协同的或新的生物功能。
给定X和Y对彼此是特异性的，这显著降低了形成同二聚体的能力。X和Y在本文中统称为结合对或结合伴侣。在一个实施方案中，X对其它X不具有高亲和力。在一个实施方案中，Y对其它Y不具有高亲和力。有利地，当X和Y不形成同二聚体时，这防止了不期望的单特异性蛋白质复合物的形成，增加了所需双特异性蛋白质复合物的产量，并且消除了繁重的纯化步骤以除去单特异性蛋白质复合物的需要。
双特异性蛋白质复合物的这种快速组装、产率和/或纯度的水平不能通过现有技术方法有效获得，特别是现有技术的方法通常需要大量的纯化步骤。
有利地，X和Y成分允许包含由不同排列的融合蛋白组成的双特异性蛋白质复合物的多元体以快速且容易地组装。
在一个实施方案中，蛋白A和B是抗体或抗体片段。当抗体或抗体片段作为复合物通过X和Y保持在一起时，这形成双特异性抗体复合物。
混合通常在X和Y可以相互作用的条件下进行。在一个实施方案中，将融合蛋白在细胞培养条件下在细胞培养基中孵育，例如将融合蛋白在37℃/5％CO2环境中孵育90分钟。
在一个实施方案中，本公开的融合蛋白在水性环境中混合，例如一种融合蛋白可以结合到固体表面诸如珠或板，而另一种融合蛋白可以被以水溶液/悬液的形式引入其中。固相允许容易地洗掉多余的成分和试剂。在一个实施方案中，两种融合都不与固相附接而是简单地混合在液体/溶液/培养基中。
有利地，本公开的方法可用于制备异源对之间(即在第一融合蛋白[A-X]和第二融合蛋白[B-Y]之间)形成的复合物，其中同源对之间的相互作用(即两个第一融合蛋白[A-X]之间或两个第二融合蛋白[B-Y]之间)被最小化。因此，本发明的方法允许制备大量的双特异性蛋白质复合物，同时具有最小或没有同二聚体复合物的污染。使用现有技术的方法，这种纯度和产率水平是不可能的。
在一个实施方案中，形成的复合物不需要进一步的纯化步骤。
在一个实施方案中，形成的复合物需要一个纯化步骤，例如柱层析。
在一个实施方案中，所述方法还包括至少一个纯化步骤，例如在表达根据本公开的融合蛋白之后。
本文所用的“功能测定”是可用于确定经受测定条件的蛋白质复合物、抗体复合物或抗体混合物的一种或多种所需性质或活性的测定。合适的功能测定可以是结合测定，细胞凋亡测定，抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定，补体依赖性细胞毒性(CDC)测定，细胞生长或增殖抑制(细胞抑制作用)测定，细胞杀伤(细胞毒性效应)测定，细胞信号传导测定，细胞因子产生测定，抗体生产和同种型转换，和细胞分化测定。在一个实施方案中，可以使用体内测定，诸如动物模型，包括小鼠肿瘤模型、自身免疫疾病模型、病毒感染或细菌感染的啮齿动物或灵长类动物模型等，来测试本公开的分子。
在双特异性抗体复合物的上下文中，根据本公开的双特异性抗体复合物的功效可以通过本领域普通技术人员通常已知的方法与这些模型中的个体抗体或抗体(或片段)的混合物进行比较。
功能测定可以根据需要重复多次，具有或不具有特定双特异性抗体复合物的不同样品，以增强结果的可靠性。可以采用本领域技术人员已知的各种统计学检验来鉴定统计学显著的结果，从而鉴定具有生物功能的双特异性抗体复合物，特别是鉴定用于本发明的多特异性分子的最佳可变区对。
组合物和医疗用途
在一个方面，提供了根据本公开的分子或成分，诸如融合蛋白，异二聚体系链束缚的双特异性蛋白质复合物，包含本发明的分子的组合物，包括融合蛋白或所述双特异性蛋白质复合物，如本文定义的多元体、阵列、文库。
在一个实施方案中，本公开的分子，例如本文所述的抗体，多特异性分子和双特异性蛋白质复合物适合于治疗应用，并且可以提供用于治疗疾病的新疗法。因此，在另一方面，提供了本发明的分子，例如上述的双特异性蛋白质复合物，其用于治疗。包括本文所述的双特异性蛋白质复合物的本公开的分子适合于治疗一系列疾病，诸如癌症。
本公开的分子，包括本文所述的多特异性分子和双特异性蛋白质复合物，也特别适合于抑制B细胞功能，以便控制各种自身免疫疾病中的免疫和自身免疫反应。
因此，本公开扩展到治疗患者疾病的方法，包括施用治疗有效量的本公开的分子，例如本公开的多特异性分子或双特异性蛋白质复合物。
在一个方面，提供了包含一种或多种本公开分子、例如本公开的多特异性分子的药物组合物。
组合物中可包括各种不同的组分，包括药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。组合物可以任选地包含能够改变本发明的多特异性分子群体的特征从而例如降低、稳定、延迟、调节和/或激活抗体功能的其它分子。组合物可以是固体或液体形式，并且尤其可以是粉末、片剂、溶液或气雾剂的形式。
本发明还提供了药物或诊断组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体组合的本发明的抗体分子或多特异性分子。因此，提供了本发明的多特异性分子用于治疗和制造用于治疗病理性病况或病症的药物的用途。
病理学病况
病理学病况或病症可以例如选自感染(病毒、细菌、真菌和寄生虫)，与感染相关的内毒素性休克，关节炎诸如类风湿性关节炎，哮喘诸如重症哮喘，慢性阻塞性肺病(COPD)，骨盆炎性疾病，阿尔茨海默氏病，炎性肠病，克罗恩病，溃疡性结肠炎，佩罗尼氏病，乳糜泻，胆囊疾病，藏毛病，腹膜炎，银屑病，血管炎，手术粘连，中风，I型糖尿病，莱姆病，脑膜脑炎，自身免疫性葡萄膜炎，中枢和周围神经系统的免疫介导的炎性病症，诸如多发性硬化，狼疮(诸如系统性红斑狼疮)和吉兰-巴雷综合征，特应性皮炎，自身免疫性肝炎，纤维性肺泡炎，格雷夫斯病，IgA肾病，特发性血小板减少性紫癜，梅尼埃病，天疱疮，原发性胆汁性肝硬化，结节病，硬皮病，韦氏肉芽肿病，其它自身免疫性疾病，胰腺炎，创伤(手术)，移植物抗宿主病，移植排斥，心脏病包括缺血性疾病诸如心肌梗塞以及动脉粥样硬化，血管内凝血，骨吸收，骨质疏松，骨关节炎，牙周炎，胃酸过少症和癌症，包括乳腺癌，肺癌，胃癌，卵巢癌，肝细胞癌，结肠癌，胰腺癌，食管癌，头颈癌，肾脏癌症，特别是肾细胞癌，前列腺癌，肝癌，黑素瘤，肉瘤，骨髓瘤，成神经细胞瘤，胎盘绒毛膜癌，子宫颈癌和甲状腺癌及其转移形式。
在一个实施方案中，所述病症是癌症，例如白血病，包括淋巴细胞白血病，诸如急性淋巴细胞白血病或慢性淋巴细胞白血病；或骨髓性白血病，诸如急性骨髓性白血病或慢性骨髓性白血病。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病包括：-急性播散性脑脊髓炎(adem)，急性坏死性出血性白质脑炎，艾迪生病，肾上腺皮质功能不全，皮质醇减少症，斑秃，淀粉样变性，强直性脊柱炎，脊柱关节炎，Strumpell-marie疾病，抗GBM/抗TBM肾炎，抗磷脂综合征(aps)，自身免疫性血管性水肿，自身免疫性再生障碍性贫血，自身免疫性自主神经障碍，自身免疫性肝炎，自身免疫性高脂血症，自身免疫性免疫缺陷，自身免疫性内耳疾病(AIED)，自身免疫性淋巴细胞增生性综合征(ALPS)，Canale-Smith综合征，自身免疫性心肌炎，自身免疫性卵巢炎，自身免疫性胰腺炎(AIP)，自身免疫性多内分泌腺综合征(I、II&III型)，自身免疫性视网膜病变(AR)，自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)，自身免疫性甲状腺疾病，自身免疫性荨麻疹，轴突/神经元神经病变，巴洛病，白塞氏综合征疾病，大疱性类天疱疮，心肌病，卡斯特尔曼氏疾病，乳糜泻，美洲锥虫病(chagas disease)，慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)，慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)，Churg-Strauss综合征，瘢痕性类天疱疮/良性粘膜类天疱疮(CP)，克罗恩病，炎症性肠病，结肠炎，肠炎，回肠炎，Cogans综合征，冷凝集病，先天性心脏传导阻滞，柯萨奇心肌炎，crest病，冷球蛋白血症，脱髓鞘性神经病变，疱疹样皮炎，杜氏病，皮肌炎，糖尿病，I型，盘状红斑狼疮(DLE)，心肌梗死后综合征，子宫内膜异位症，大疱性表皮松解症(EB)和耳聋(EBA)，嗜酸性胃肠炎，食管炎，嗜酸性筋膜炎，舒曼综合征，结节性红斑，实验性变应性脑脊髓炎，伊文思综合征，纤维性肺泡炎，巨细胞动脉炎(颞动脉炎)，巨细胞性心肌炎，肾小球性肾炎(非增殖性：局灶性节段性肾小球硬化和膜性肾小球肾炎。增殖性：IgA肾病)，肺出血-肾炎综合征，具有多发性血管炎的肉芽肿病(GPA)(以前称为韦氏肉芽肿病)，格雷夫斯病，吉兰-巴雷综合征，米勒费希尔综合征，急性运动性轴突性神经病，急性运动感觉轴突性神经病，急性泛自主神经病，Bickerstaff的脑干脑炎，桥本氏脑炎，桥本甲状腺炎，溶血性贫血，过敏性紫癜，妊娠疱疹，低丙种球蛋白血症，特发性肺纤维化，特发性血小板减少性紫癜(ITP)，IgA肾病(IGAN)，berger综合征，咽炎性肾小球肾炎，IgA天疱疮，IgG4相关性硬化疾病，免疫调节不育，包涵体肌炎，胰岛素依赖型糖尿病，间质性膀胱炎，艾萨克综合征，神经性肌强直，幼年型关节炎，幼年型肌炎，川崎综合征，兰伯特伊顿综合征，白细胞分裂性血管炎，扁平苔藓，硬化萎缩性苔藓，木质性结膜炎，线性IgA皮肤病(LAD)，类天疱疮，红斑狼疮(SLE)，莱姆病，梅尼埃病，显微多血管炎(MPA)，混合性结缔组织病(MCTD)，单克隆γ病变，蚕食性角膜溃疡，Mucha-Habermann疾病，多发性硬化症，重症肌无力，肌炎，发作性睡病，视神经脊髓炎(Devic病)，神经性肌强直，艾萨克综合征(获得性，副肿瘤性，遗传性)，中性粒细胞减少症，眼瘢痕性类天疱疮，视神经炎，卵巢炎，视性眼阵挛-肌阵挛综合征，睾丸炎，复发性风湿病，pandas(与链球菌相关的儿科自身免疫性神经精神障碍)，副肿瘤性自身免疫多器官综合征(PAMS)，副肿瘤性小脑变性，副肿瘤性天疱疮(PNP)，阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)，帕里龙贝格综合征，Parsonnage-Turner综合征，pars planitis(周围葡萄膜炎)，妊娠性类天疱疮(PG)，寻常型天疱疮(PV)，叶状疱疹(PF)，周围神经病，静脉周围脑脊髓炎，恶性贫血，Poems综合征，结节性多动脉炎(PAN)，风湿性多肌痛，多发性肌炎，心肌梗塞后综合征，心包切开术后综合征，孕激素皮炎原发性胆汁性肝硬化，汉诺氏综合征，原发性硬化性胆管炎(PSC)，硬化性胆管炎，银屑病，银屑病关节炎，坏疽性脓皮病，纯红细胞再生障碍，拉斯马森脑炎，慢性局灶性脑炎(CFE)，雷诺现象，反应性关节炎，莱特尔综合征，康复相关性视网膜病(RAR)，反射性交感神经营养不良，莱特尔综合征，复发性多软骨炎，不宁腿综合征，腹膜后纤维化，风湿热，类风湿性关节炎，结节病，施密特综合征，巩膜炎，硬皮病，系统性硬化病，舍格伦综合征，精子&睾丸自身免疫，僵人综合征，亚急性细菌性心内膜炎(SBE)，Susac综合征，交感性眼炎，大动脉炎，颞动脉炎/巨细胞动脉炎，血栓闭塞性脉管炎，伯格氏病，血小板减少性紫癜(TTP)，托洛萨-亨特综合征，横贯性脊髓炎，溃疡性结肠炎，未分化结缔组织病(UCTD)，葡萄膜炎，风湿性多肌痛，大动脉炎，颞动脉炎，伯格氏病，皮肤血管炎，川崎病，结节性多动脉炎，白塞氏综合征，变应性肉芽肿性血管炎，皮肤血管炎，过敏性紫癜，显微多血管炎，韦氏肉芽肿病，高尔夫球性血管炎，水泡性皮肤病，Vitiligowegener肉芽肿病(现在称为具有多发性血管炎的肉芽肿病(GPA))。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病选自包含以下的组或由以下组成的组：ANCA血管炎，IgA肾病(Berger's)，寻常型天疱疮/大疱性类天疱疮，ITP，原发性胆汁性肝硬化，自身免疫性甲状腺炎(格雷夫斯病)，桥本氏病，狼疮性肾炎，膜性肾小球肾炎(或膜性肾病)，APS，重症肌无力，视神经脊髓炎，原发性舍格伦综合征，自身免疫性中性粒细胞减少症，自身免疫性胰腺炎，皮肤肌炎，自身免疫性葡萄膜炎，自身免疫性视网膜病，白塞氏病，IPF，系统性硬化病，肝纤维化，自身免疫性肝炎，原发性硬化性胆管炎，白癜风，肺出血-肾炎综合征，肺泡蛋白沉着症，慢性自身免疫性荨麻疹，银屑病，类风湿性关节炎，银屑病关节炎，轴向脊椎关节炎，移植术(包括GvHD)，哮喘，COPD，巨细胞动脉炎，难治性自身免疫性血细胞减少症，伊文思综合征(自身免疫性溶血性疾病)，I型糖尿病，结节病，多发性肌炎，溃疡性结肠炎，克罗恩病，乳糜泻，原发性巨球蛋白血症，局灶性节段性肾小球硬化症，慢性莱姆病(莱姆疏螺旋体病)，扁平苔藓，僵人综合征，扩张型心肌病，自身免疫性(淋巴细胞性)卵巢炎，获得性大疱性表皮松解症，自身免疫性萎缩性胃炎，恶性贫血，特应性皮炎，动脉粥样硬化，多发性硬化，拉斯马森脑炎，吉兰-巴雷综合征，获得性神经性肌强直，中风
在一个实施方案中，所述病症是癌症，例如白血病，例如淋巴细胞白血病，例如急性淋巴细胞白血病或慢性淋巴细胞白血病；或骨髓性白血病，诸如急性骨髓性白血病或慢性骨髓性白血病；或淋巴瘤，诸如弥漫性大B细胞淋巴瘤或霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。
本发明还提供了包含本公开的分子(诸如本文所述的多特异性分子)与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体组合的药物或诊断组合物。因此，提供了本公开的分子(诸如本文所述的多特异性分子)用于治疗和制造药物的用途。
组合物通常作为通常包括药学上可接受的载体的无菌药物组合物的一部分提供。本发明的药物组合物可另外包含药学上可接受的佐剂。
本发明还提供了制备药物或诊断组合物的方法，包括将本发明的多特异性分子与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体一起加入和混合。
本文所用的术语“药学上可接受的赋形剂”是指药学上可接受的制剂载体、溶液或添加剂，以增强本公开的组合物的期望特征。赋形剂是本领域众所周知的并且包括缓冲液(例如柠檬酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，乙酸盐缓冲液和碳酸氢盐缓冲液)，氨基酸，尿素，醇，抗坏血酸，磷脂，蛋白质(例如血清白蛋白)，EDTA，氯化钠，脂质体，甘露醇，山梨醇和甘油。溶液或悬浮液可以包封在脂质体或可生物降解的微球中。通常使用无菌制造方法以基本上无菌的形式提供制剂。
这可包括通过过滤用于制剂的缓冲溶剂溶液，抗体在无菌缓冲溶剂溶液中的无菌悬浮液的生产和灭菌，以及通过本领域普通技术人员熟悉的方法将制剂分配到无菌容器中。
药学上可接受的载体本身不应诱导对接受组合物的个体有害的抗体的产生，并且不应是有毒的。合适的载体可以是大的、缓慢代谢的大分子，诸如蛋白质，多肽，脂质体，多糖，聚乳酸，聚乙醇酸，聚合氨基酸，氨基酸共聚物和无活性病毒颗粒。
可以使用药学上可接受的盐，例如无机酸盐，诸如盐酸盐，氢溴酸盐，磷酸盐和硫酸盐，或有机酸盐，诸如乙酸盐，丙酸盐，丙二酸盐和苯甲酸盐。
治疗组合物中的药学上可接受的载体可另外含有液体，诸如水、盐水、甘油和乙醇。这样的载体使得药物组合物能够配制成片剂，丸剂，糖锭，胶囊，液体，凝胶，糖浆，浆液和悬浮液，以供患者摄取。
本公开的分子(诸如本文所述的多特异性分子)可以分散在溶剂中递送，例如以溶液或悬浮液的形式。它可以悬浮在适当的生理溶液中，例如生理盐水，药理学上可接受的溶剂或缓冲溶液中。本领域已知的缓冲溶液可以每1ml水含有0.05mg至0.15mg乙二胺四乙酸二钠，8.0mg至9.0mg NaCl，0.15mg至0.25mg聚山梨酯，0.25mg至0.30mg无水柠檬酸和0.45mg至0.55mg柠檬酸钠，以达到约4.0至5.0的pH。如上所述，悬浮液可以例如由冻干抗体制备。
药学上可接受的载体的详尽讨论可在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company，N.J.1991)中获得。
本文所用的术语“治疗有效量”是指治疗、改善或预防靶向疾病或病况或显示可检测的治疗或预防效果所需的治疗剂的量。对于任何抗体，可以在细胞培养测定或动物模型中，通常在啮齿动物、兔、狗、猪或灵长类动物中初始估计治疗有效量。动物模型也可用于确定施用的合适的浓度范围和途径。这样的信息然后可以用于确定用于在人中施用的有用剂量和途径。
对于人受试者，精确的治疗有效量将取决于疾病状态的严重性、受试者的一般健康状况、受试者的年龄、体重和性别、饮食、给药的时间和频率、药物组合、反应敏感性和对治疗的耐受性/应答。该量可以通过常规实验确定并且在临床医生的判断范围内。通常，治疗有效量为0.01mg/kg至50mg/kg，诸如0.1mg/kg至20mg/kg。或者，剂量可以是每天1至500mg，诸如每天10至100、200、300或400mg。药物组合物可以方便地以含有预定量的本发明活性剂的单位剂量形式提供。
组合物可以单独地施用给患者，或者可以与其他药剂、药物或激素组合(例如同时、顺序或分开)施用。
施用本公开的多特异性分子的剂量取决于待治疗的病况的性质、存在的炎症的程度以及抗体分子是被预防性使用还是治疗现有病况。
剂量的频率将取决于多特异性分子的半衰期和其作用的持续时间。如果多特异性分子具有短的半衰期(例如2至10小时)，则可能有必要每天给予一个或多个剂量。或者，如果多特异性分子具有长的半衰期(例如2至15天)，则可能仅需要每天一次、每周一次或甚至每1或2个月一次给予剂量。
在本公开中，最终制剂的pH与多特异性分子的等电点值不相似，因为如果制剂的pH为7，则8-9或更高的pI可能是合适的。尽管不希望受理论束缚，但据认为这可能最终提供具有改善的稳定性的最终制剂，例如抗体或片段保留在溶液中。
本发明的药物组合物可以通过任何数目的途径施用，包括但不限于口服，静脉内，肌内，动脉内，髓内，鞘内，心室内，透皮，经皮(例如参见WO98/20734)，皮下，腹膜内，鼻内，肠内，局部，舌下，阴道内或直肠途径。无痛皮下注射器也可以用于施用本发明的药物组合物。
组合物的直接递送通常通过皮下、腹膜内、静脉内或肌内注射，或递送到组织的间隙空间来完成。组合物也可以施用到感兴趣的特定组织中。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。
当产品用于注射或输注时，其可以采取在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且其可以含有配制剂，诸如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。或者，多特异性分子可以是干燥形式，用于在使用前用合适的无菌液体重构。如果组合物通过使用胃肠道的途径施用，组合物将需要含有保护抗体免于降解但是一旦其从胃肠道被吸收就释放双特异性蛋白质复合物的试剂。
根据本公开的可雾化制剂可以例如作为包装在箔包封中的单剂量单位(例如，密封塑料容器或小瓶)提供。每个小瓶含有一定体积、例如2ml的溶剂/溶液缓冲液的单位剂量。
本文所用的术语“变体”是指与相应的野生型肽或蛋白质的氨基酸或核苷酸序列相比，含有至少一个氨基酸序列或核苷酸序列改变的肽或蛋白质。变体可以包含与相应的野生型肽或蛋白质至少80％、或85％、或90％、或95％、或98％或99％的序列同一性。然而，变体可以包含小于80％的序列同一性，条件是所述变体表现出与其相应的野生型肽或蛋白质基本相似的功能。
在一个实施方案中，本公开的构建体是至少三特异性的。在这种情况下，进一步的特异性可以针对任何目标抗原，例如延长半衰期的抗原，诸如白蛋白或Fc新生儿受体(FcRn)；用于效应子功能(诸如激活或抑制Fc受体或共刺激分子)的抗原；组织或细胞靶向抗原；或帮助血液/脑屏障(BBB)转移的抗原，诸如转铁蛋白受体或LRP1。
本公开还扩展至组合物，诸如包含具有特定抗原特异性的所述新形式的药物组合物。
在另一方面，本公开包括所述形式和组合物在治疗中的用途。
本发明还提供了制备药物或诊断组合物的方法，包括将本发明的抗体分子或多特异性分子与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体一起添加并混合。
抗体分子或多特异性分子可以是药物或诊断组合物中的唯一活性成分，或者可以伴有其它活性成分，包括其他抗体成分或非抗体成分诸如类固醇或其他药物分子。
药物组合物适当地包含治疗有效量的本发明的抗体。本文所用的术语“治疗有效量”是指治疗、改善或预防靶向疾病或病症或显示可检测的治疗或预防效果所需的治疗剂的量。对于任何抗体，可以在细胞培养测定或动物模型中，通常在啮齿动物、兔、狗、猪或灵长类动物中初始估计治疗有效量。动物模型也可用于确定施用的适当的浓度范围和途径。这样的信息然后可以用于确定用于在人中施用的有用剂量和途径。
对于人受试者，精确的治疗有效量将取决于疾病状态的严重性、受试者的一般健康状况、受试者的年龄、体重和性别、饮食、施用的时间和频率、药物组合、反应敏感性和对治疗的耐受性/应答。该量可以通过常规实验确定并且在临床医生的判断范围内。通常，治疗有效量为0.01mg/kg至500mg/kg，例如0.1mg/kg至200mg/kg，诸如100mg/Kg。
药物组合物可以方便地以每剂含有预定量的本发明活性剂的单位剂量形式提供。
组合物可以单独地施用给患者，或者可以与其他药剂、药物或激素组合(例如同时、顺序或分开)施用。
本文所用的药剂是指当施用时具有生理作用的实体。
本文所用的药物是指在治疗剂量下具有适当的生理作用的化学实体。
在一个实施方案中，根据本公开的抗体或片段与免疫抑制剂治疗(诸如类固醇，特别是泼尼松)一起使用。
在一个实施方案中，根据本公开的抗体或片段与利妥昔单抗或其它B细胞疗法一起使用。
在一个实施方案中，根据本公开的抗体或片段与任何B细胞或T细胞调节剂或免疫调节剂一起使用。实例包括氨甲蝶呤、微苯酚盐和硫唑嘌呤。
施用本发明的抗体分子的剂量取决于待治疗的病况的性质、存在的炎症的程度以及抗体分子是被预防性使用还是治疗现有病况。
剂量的频率将取决于抗体分子的半衰期和其作用的持续时间。如果抗体分子具有短的半衰期(例如2至10小时)，则可能有必要每天给予一个或多个剂量。或者，如果抗体分子具有长的半衰期(例如2至15天)和/或长期的药效学(PD)谱(profile)，则可能仅需要每天一次、每周一次或甚至每1或2个月一次给予剂量。
在一个实施方案中，剂量每两周递送一次，即每月两次。
在一个实施方案中，剂量被间隔开以允许在施用更远剂量之前waine抗药物(在这种情况下是抗抗体)应答。
本文使用的半衰期意在指循环中分子的持续时间，例如在血清/血浆中。
本文所用的药效学是指根据本公开的分子的生物作用的谱，特别是持续时间。
药学上可接受的载体本身不应诱导对接受组合物的个体有害的抗体的产生，并且不应是有毒的。合适的载体可以是大的、缓慢代谢的大分子，诸如蛋白质，多肽，脂质体，多糖，聚乳酸，聚乙醇酸，聚合氨基酸，氨基酸共聚物和无活性病毒颗粒。
可以使用药学上可接受的盐，例如无机酸盐，例如盐酸盐，氢溴酸盐，磷酸盐和硫酸盐，或有机酸盐，诸如乙酸盐，丙酸盐，丙二酸盐和苯甲酸盐。
治疗组合物中的药学上可接受的载体可另外含有液体，诸如水、盐水、甘油和乙醇。另外，辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂或pH缓冲物质，可以存在于这样的组合物中。这样的载体使得药物组合物能够配制成片剂，丸剂，糖衣丸，胶囊，液体，凝胶，糖浆，浆液和悬浮液，以供患者摄取。
适合的给药形式包括适于肠胃外给药的形式，通过注射或输注，例如通过团注或连续输注。当产品用于注射或输注时，其可以采取在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且其可以含有配制剂，诸如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。或者，抗体分子可以是干燥形式，用于在使用前用合适的无菌液体重构。
一旦配制，本发明的组合物可以直接施用于受试者。待治疗的受试者可以是动物。然而，在一个或多个实施方案中，所述组合物适于施用于人类受试者。
适当地，在根据本公开的制剂中，最终制剂的pH不类似于抗体或片段的等电点的值，例如如果蛋白质的pI在8-9或以上的范围内，则制剂pH为7可能是合适的。尽管不希望受理论束缚，但据认为这可能最终提供具有改善的稳定性的最终制剂，例如抗体或片段保留在溶液中。
在一个实例中，pH在4.0至7.0范围内的药物制剂包含：1至200mg/mL根据本公开的抗体分子，1至100mM缓冲液，0.001至1％表面活性剂，a)10至500mM的稳定剂，b)10至500mM的稳定剂和5至500mM的张度剂，或c)5至500mM的张度剂。
本发明的药物组合物可以通过任何数目的途径施用，包括但不限于口服，静脉内，肌内，动脉内，髓内，鞘内，心室内，透皮，经皮(例如参见WO98/20734)，皮下，腹膜内，鼻内，肠内，局部，舌下，阴道内或直肠途径。无痛皮下注射器也可以用于施用本发明的药物组合物。通常，治疗组合物可以制备为注射剂，作为液体溶液或悬浮液。也可以制备适于在注射前溶解或悬浮在液体载体中的固体形式。
组合物的直接递送通常通过皮下、腹膜内、静脉内或肌内注射，或递送到组织的间隙空间来完成。组合物也可以施用到损伤中。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。
应当理解，组合物中的活性成分将是抗体分子。因此，其将易于在胃肠道中降解。因此，如果组合物通过使用胃肠道的途径施用，组合物将需要含有保护抗体免于降解但一旦其已经从胃肠道吸收就释放抗体的试剂。
药学上可接受的载体的详尽讨论可在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company，N.J.1991)中获得。
在一个实施方案中，制剂作为用于局部施用(包括吸入)的制剂提供。
合适的可吸入制剂包括可吸入粉末、含推进剂气体的计量气溶胶或不含推进剂气体的可吸入溶液。根据本发明的含有活性物质的可吸入粉末可以仅由上述活性物质或上述活性物质与生理上可接受的赋形剂的混合物组成。
这些可吸入粉末可以包括单糖(例如葡萄糖或阿拉伯糖)，二糖(例如乳糖，蔗糖，麦芽糖)，寡糖和多糖(例如葡聚糖)，多元醇(例如山梨醇，甘露醇，木糖醇)，盐(例如氯化钠，碳酸钙)或这些彼此的混合物。适合使用单糖或二糖，使用乳糖或葡萄糖，特别是但不限于以其水合物的形式。
用于在肺中沉积的颗粒需要小于10微米的颗粒尺寸，诸如1-9微米，例如1-5μm。活性成分(诸如抗体或片段)的粒度是最重要的。
可用于制备可吸入气溶胶的推进气体是本领域已知的。合适的推进剂气体选自烃诸如正丙烷、正丁烷或异丁烷和卤代烃诸如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、环丙烷或环丁烷的氯化和/或氟化衍生物。上述推进气体可以单独使用或以其混合物使用。
特别合适的推进气体是选自TG 11、TG 12、TG 134a和TG227的卤代烷烃衍生物。在上述卤代烃中，TG134a(1,1,1,2-四氟乙烷)和TG227(1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷)及其混合物是特别合适的。
含推进剂气体的可吸入气溶胶还可含有其它成分，诸如助溶剂、稳定剂、表面活性剂(表面活性剂)、抗氧化剂、润滑剂和调节pH的工具。所有这些成分在本领域中是已知的。
根据本发明的含推进剂气体的可吸入气溶胶可含有至多5重量％的活性物质。本发明的气溶胶含有例如0.002至5重量％，0.01至3重量％，0.015至2重量％，0.1至2重量％，0.5至2重量％或0.5至1重量％重量的活性成分。
或者，对肺的局部给药还可以是通过给予液体溶液或悬浮液制剂，例如使用装置诸如喷雾器，例如连接到压缩机的喷雾器(例如，连接到由Pari Respiratory Equipment，Inc.，Richmond，Va.制造的Pari Master(R)压缩机的Pari LC-Jet Plus(R)雾化器)。
本发明的抗体或多特异性分子可以分散在溶剂中递送，例如以溶液或悬浮液的形式。其可以悬浮在合适的生理溶液中，例如盐水或其它药理学上可接受的溶剂或缓冲溶液中。本领域已知的缓冲溶液可以每1ml水含有0.05mg至0.15mg乙二胺四乙酸二钠，8.0mg至9.0mg NaCl，0.15mg至0.25mg聚山梨酯，0.25mg至0.30mg无水柠檬酸和0.45mg至0.55mg柠檬酸钠，以达到约4.0至5.0的pH。悬浮液可以使用例如冻干抗体。
治疗性悬浮液或溶液制剂还可以含有一种或多种赋形剂。赋形剂是本领域众所周知的，包括缓冲液(例如柠檬酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，乙酸盐缓冲液和碳酸氢盐缓冲液)，氨基酸，尿素，醇，抗坏血酸，磷脂，蛋白质(例如血清白蛋白)，EDTA，氯化钠，脂质体，甘露醇，山梨醇和甘油。溶液或悬浮液可以包封在脂质体或可生物降解的微球中。通常使用无菌制造方法以基本上无菌的形式提供制剂。
这可包括通过过滤用于制剂的缓冲溶剂/溶液，抗体在无菌缓冲溶剂溶液中的无菌悬浮液的生产和灭菌，以及通过本领域普通技术人员熟悉的方法将制剂分配到无菌容器中。
根据本公开的可雾化制剂可以例如作为包装在箔包封中的单剂量单位(例如，密封塑料容器或小瓶)提供。每个小瓶含有一定体积、例如2ml的溶剂/溶液缓冲液的单位剂量。
本文公开的抗体可适于通过雾化递送。
还设想本发明的抗体可以通过使用基因治疗来施用。为了实现这一点，将在适当的DNA成分控制下编码抗体分子的重链和轻链的DNA序列引入患者，使得抗体链从DNA序列表达并原位组装。
在一个实施方案中，本公开的分子，诸如本文所述的双特异性蛋白质复合物可用于功能改变目的抗原的活性。例如，双特异性蛋白质复合物可以直接或间接中和、拮抗或激动所述一种或多种抗原的活性。
本公开还扩展至包含本公开的分子或其成分的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包含：
a)包含与结合对(X)的第一结合伴侣附接的特异性针对CD22或CD79a和/或CD79b的第一抗体或抗体片段(A)的一个或多个融合蛋白(A-X)；和
b)包含与结合对(Y)的第二结合伴侣附接的特异性针对CD22或CD79a和/或CD79b的第二抗体或抗体片段(B)的一种或多种融合蛋白(B-Y)，其中第二结合伴侣特异性针对第一结合伴侣；
例如其中第一结合伴侣(X)是肽或多肽，并且第二结合伴侣(Y)是特异性针对其的抗体或抗体片段；
其中所述第二结合伴侣Y特异性针对所述第一结合伴侣X，所述第二结合伴侣是例如特异性针对其的抗体或抗体片段；并且两个结合伴侣的特异性相互作用(例如结合相互作用)形成异二聚体-系链，其将来自a)和b)的两种融合蛋白物理地结合在一起以形成双特异性蛋白质复合物；和
其中A或B中的至少一个特异性针对CD22，另一个特异性针对CD79a和/或CD79b，和
所述融合蛋白是复合的或非复合的形式。
有利地，试剂盒可以包含本公开的双特异性蛋白质复合物，或可以包含复合或非复合形式的融合蛋白。在前一种情况下，双特异性蛋白质复合物准备好“开箱即用”，这提供了方便和易于使用，而在后一种情况下，可以根据使用者的要求通过使用组合不同的融合蛋白来组装双特异性蛋白质复合物。
在另一个实施方案中，试剂盒还包含使用说明书。
在另一个实施方案中，试剂盒还包含一种或多种用于进行一种或多种功能测定的试剂。
在一个实施方案中，提供本公开的分子，包括融合蛋白、双特异性蛋白质复合物或包含其的组合物用作实验室试剂。
其它方面
在其它方面，提供了核苷酸序列，例如编码如本文所述的构建体的DNA序列，包括如上定义的多特异性分子或融合蛋白。
在一个实施方案中，提供了核苷酸序列，例如编码本文所述构建体的DNA序列，包括根据本公开的多特异性分子或双特异性蛋白质复合物或抗体。
本文的公开内容还扩展至包含如上定义的核苷酸序列的载体。
本文所用的术语“载体”是指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。载体的实例是“质粒”，其是另外的DNA区段可以连接的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在导入它们的宿主细胞(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)中自主复制。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以整合到宿主细胞的基因组中，其中它们随后与宿主基因组一起复制。在本说明书中，术语“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是载体最常用的形式。
可以构建载体的一般方法、转染方法和培养方法是本领域技术人员众所周知的。在这方面，参考“Current Protocols in Molecular Biology”，1999，F.M.Ausubel(ed)，Wiley Interscience，New York和Cold Spring Harbor Publishing生产的ManiatisManual。
本文使用的术语“选择性标记”是指其表达允许鉴定已经用含有标记基因的载体转化或转染的细胞的蛋白质。多种选择性标记是本领域已知的。例如，通常选择性标记基因赋予载体已经导入的宿主细胞对药物诸如如G418、潮霉素或氨甲蝶呤的抗性。选择性标记也可以是视觉上可识别的标记，诸如荧光标记。荧光标记的实例包括罗丹明，FITC，TRITC，Alexa Fluors及其各种缀合物。
还提供了包含一个或多个克隆或表达载体的宿主细胞，所述载体包含编码本公开的抗体的一个或多个DNA序列。任何合适的宿主细胞/载体系统可以用于表达编码本公开的抗体分子的DNA序列。可以使用细菌、例如大肠杆菌和其他微生物系统，或者也可以使用真核生物的、例如哺乳动物的宿主细胞表达系统。合适的哺乳动物宿主细胞包括CHO、骨髓瘤或杂交瘤细胞。
本公开内容还提供了用于生产根据本公开的分子或其成分的方法，其包括在适于导致从编码本公开的分子的DNA表达蛋白的条件下培养含有本公开的载体的宿主细胞，并分离该分子。
包括本文所述的双特异性蛋白质复合物的本公开的分子可用于诊断/检测试剂盒。试剂盒可以例如包含对两种抗原特异的双特异性抗体复合物，两种抗原均存在于相同的细胞类型上，并且其中只有在成功检测到两种抗原时才可进行阳性诊断。通过使用本公开的分子诸如本文所述的双特异性抗体复合物而不是非复合形式的两种分开的抗体或抗体片段，可以极大地增强检测的特异性。
在一个实施方案中，本公开的分子诸如双特异性抗体复合物固定在固体表面上。固体表面可以例如是芯片或ELISA板。
还提供了根据本发明的分子、例如本文所述的双特异性蛋白质复合物用于在样品中检测第一和第二肽的存在的用途，其中所述分子用作检测剂。
本公开的分子诸如本文所述的双特异性抗体复合物可以例如与荧光标记偶联，所述荧光标记有助于检测结合的抗体-抗原复合物。这种双特异性抗体复合物可用于免疫荧光显微镜术。或者，双特异性抗体复合物也可用于蛋白质印迹或ELISA。
在一个实施方案中，提供了用于纯化根据本公开的分子或其成分的方法
在一个实施方案中，提供了用于纯化根据本公开的分子或其成分的方法，其包括以下步骤：以非结合模式进行阴离子交换层析，使得杂质保留在柱上，并且抗体保持在未结合中。该步骤可以例如在约6-8的pH下进行。
该方法可以进一步包括使用阳离子交换层析的初始捕获步骤，例如在约4至5的pH下进行。
该方法可以进一步包括另外的层析步骤，以确保产物和方法相关的杂质从产物流中适当地分离。
纯化方法还可以包括一个或多个超滤步骤，诸如浓缩和渗滤步骤。
如上所用的“纯化形式”意指至少90％的纯度，例如91、92、93、94、95、96、97、98、99％w/w或更纯。
下文提供了本公开的序列。
序列
GCN4(7P14P)序列
ASGGGRMKQLEPKVEELLPKNYHLENEVARLKKLVGERHHHHHH SEQ ID NO:1
其中粗体形式的氨基酸是任选的
GCTAGCGGAGGCGGAAGAATGAAACAACTTGAACCCAAGGTTGAAGAATTGCTTCCGAAAAATTATCACTTGGAAAATGAGGTTGCCAGATTAAAGAAATTAGTTGGCGAACGCCATCACCATCACCATCAC SEQ ID NO:2
52SR4dsscFv序列
DAVVTQESALTSSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYASWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCVLWYSDHWVFGCGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVQLQQSGPGLVAPSQSLSITCTVSGFLLTDYGVNWVRQSPGKCLEWLGVIWGDGITDYNSALKSRLSVTKDNSKSQVFLKMNSLQSGDSARYYCVTGLFDYWGQGTTLTVSSAAAHHHHHHEQKLISEEDL—SEQ ID NO:3
GATGCGGTGGTGACCCAGGAAAGCGCGCTGACCAGCAGCCCGGGCGAAACCGTGACCCTGACCTGCCGCAGCAGCACCGGCGCGGTGACCACCAGCAACTATGCGAGCTGGGTGCAGGAAAAACCGGATCATCTGTTTACCGGCCTGATTGGCGGCACCAACAACCGCGCGCCGGGCGTGCCGGCGCGCTTTAGCGGCAGCCTGATTGGCGATAAAGCGGCGCTGACCATTACCGGCGCGCAGACCGAAGATGAAGCGATTTATTTTTGCGTGCTGTGGTATAGCGACCATTGGGTGTTTGGCTGCGGCACCAAACTGACCGTGCTGGGTGGAGGCGGTGGCTCAGGCGGAGGTGGCTCAGGCGGTGGCGGGTCTGGCGGCGGCGGCAGCGATGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCGGGCCTGGTGGCGCCGAGCCAGAGCCTGAGCATTACCTGCACCGTGAGCGGCTTTCTCCTGACCGATTATGGCGTGAACTGGGTGCGCCAGAGCCCGGGCAAATGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATTTGGGGCGATGGCATTACCGATTATAACAGCGCGCTGAAAAGCCGCCTGAGCGTGACCAAAGATAACAGCAAAAGCCAGGTGTTTCTGAAAATGAACAGCCTGCAGAGCGGCGATAGCGCGCGCTATTATTGCGTGACCGGCCTGTTTGATTATTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGCGGCCGCCCATCACCATCACCATCACGAACAGAAACTGATTAGCGAAGAAGATCTGTAATAG SEQ ID NO:4
CD79b抗体
Ab4447
兔Ab 4447 VL区SEQ ID NO:71
兔Ab 4447 VL区SEQ ID NO:72
兔Ab 4447 VH区SEQ ID NO:73
兔Ab 4447 VH区SEQ ID NO:74
本公开内容还扩展至SEQ ID NO：77的衍生物，其中一个或两个半胱氨酸残基被另一个氨基酸取代，例如丝氨酸，特别是其中第一个半胱氨酸被丝氨酸取代，而第二个半胱氨酸保持不变，或第一个半胱氨酸保持不变，而第二半胱氨酸被丝氨酸取代，或其中两个半胱氨酸被丝氨酸取代。
Ab 4450
兔Ab 4450VL区SEQ ID NO:81
兔Ab 4450VL区SEQ ID NO:82
兔Ab 4450VH区SEQ ID NO:83
兔Ab 4450VH区SEQ ID NO:84
本公开还扩展至SEQ ID NO：87的衍生物，其中基序DG中的至少一个氨基酸被另一个氨基酸取代，例如基序突变为EG、DA或DS。
CD22抗体
Ab4120
兔Ab 4120 VL区SEQ ID NO:91
兔Ab 4120 VL区SEQ ID NO:92
兔Ab 4120 VH区SEQ ID NO:93
兔Ab 4120 VH区SEQ ID NO:94
本公开还扩展至SEQ ID NO：98的衍生物，其中半胱氨酸残基被另一个氨基酸、例如丝氨酸取代。
本公开还扩展至SEQ ID NO：99的衍生物，其中半胱氨酸残基被另一种氨基酸、例如丝氨酸取代。
Ab 4126
兔Ab 4126 VL区SEQ ID NO:101
兔Ab 4126 VL区SEQ ID NO:102
兔Ab 4126 VH区SEQ ID NO:103
兔Ab 4126 VH区SEQ ID NO:104
本公开内容还扩展至SEQ ID NO：108的衍生物，其中半胱氨酸被另一个氨基酸、例如丝氨酸取代。
本公开内容还扩展至SEQ ID NO：109的衍生物，其中半胱氨酸被另一个氨基酸、例如丝氨酸取代。
本公开内容还扩展至SEQ ID NO：110的衍生物，其中半胱氨酸被另一个氨基酸、例如丝氨酸取代。
Ab 4127
兔Ab 4127 VL区SEQ ID NO:111
兔Ab 4127 VL区SEQ ID NO:112
兔Ab 4127 VH区SEQ ID NO:113
兔Ab 4127 VH区SEQ ID NO:114
本公开内容还扩展至SEQ ID NO：117的衍生物，其中独立地进行以下突变，例如DS是修饰的EA、DA或DT，并且DG被修饰为EG、DA或DS。在一个实施方案中，DS：DG序列是DS，EG；DS，DA；DS，DS；EA，DG；EA，EG；EA，DA；EA，DS；DA，DG；DA，EG；DA，DA；DA，DS；DT，DG；DT，EG；DT，DA；和DT，DS。
本公开内容还扩展至SEQ ID NO：118的衍生物，其中半胱氨酸被另一个氨基酸、例如丝氨酸取代。
本公开内容还扩展至SEQ ID NO：119的衍生物，其中半胱氨酸被另一个氨基酸、例如丝氨酸取代。
Ab 4128
兔Ab 4128 VL区SEQ ID NO:121
兔Ab 4128 VL区SEQ ID NO:122
兔Ab 4128 VH区SEQ ID NO:123
兔Ab 4128 VH区SEQ ID NO:124
本公开内容还扩展至SEQ ID NO：128的衍生物，其中半胱氨酸被另一个氨基酸、例如丝氨酸取代。
本公开内容还扩展至SEQ ID NO：129的衍生物，其中半胱氨酸被另一个氨基酸、例如丝氨酸取代。
Ab 4130
兔Ab 4130 VL区SEQ ID NO:131
兔Ab 4130 VL区SEQ ID NO:132
兔Ab 4130 VH区SEQ ID NO:133
兔Ab 4130 VH区SEQ ID NO:134
本公开内容还扩展至SEQ ID NO：139的衍生物，其中半胱氨酸被另一种氨基酸、诸如丝氨酸取代。
本公开内容还扩展至SEQ ID NO：139的衍生物，其中基序NS修饰为例如NA或NT。
本公开内容还扩展至SEQ ID NO：140的衍生物，其中基序NS修饰为例如NA或NT。
Ab 4132
兔Ab 4132 VL区SEQ ID NO:141
兔Ab 4132 VL区SEQ ID NO:142
兔Ab 4132 VH区SEQ ID NO:143
兔Ab 4132 VH区SEQ ID NO:144
本公开内容还扩展至SEQ ID NO：148的衍生物，其中半胱氨酸被另一种氨基酸、诸如丝氨酸取代。
本公开内容还扩展至SEQ ID NO：149的衍生物，其中半胱氨酸被另一种氨基酸、诸如丝氨酸取代。
本公开内容还扩展至SEQ ID NO：149的衍生物，其中基序NS修饰为例如NA或NT。
血清白蛋白结合抗体
抗白蛋白抗体的重链可变结构域(无ds)SEQ ID NO：157
抗白蛋白抗体的重链可变结构域(ds)SEQ ID NO：158
抗白蛋白抗体的轻链可变结构域(无ds)SEQ ID NO：159
抗白蛋白抗体的轻链可变结构域(ds)SEQ ID NO：160
人CD22 SEQ ID NO:161
人CD79a SEQ ID NO:162
人CD79b SEQ ID NO:163
在本说明书的上下文中，“包含”被解释为“包括”。
包括某些元件的本公开的方面也旨在扩展到相关元件的“由......组成”或“基本上由......组成”的替代实施方案。
在此可以采用积极引述的实施方案作为免责声明的基础。
本文引用的所有参考文献通过引用具体并入。
参考文献
1.Ribosome display efficiently selects and evolves high-affinityantibodies in vitro from immune libraries.Hanes J,Jermutus L,Weber-BornhauserS,Bosshard HR,Plückthun A.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95,14130-14135
2.Directed in Vitro Evolution and Crystallographic Analysis of aPeptide-binding Single Chain Antibody Fragment(scFv)with Low PicomolarAffinity.Zhand C,Spinelli S,Luginbuhl B,Amstutz P,Cambillau C,Pluckthun A.(2004)J.Biol.Chem.279,18870-18877
3.Antigen recognition by conformational selection.Berger C,Weber-Bornhauser S,Eggenberger Y,Hanes J,Pluckthun A,Bosshard H.R.(1999)F.E.B.S.Letters 450,149-153
实施例
实施例中所用的术语Fab-Kd-Fab描述了具有式A-X:Y-B的双特异性蛋白质复合物，其中：
A-X是第一融合蛋白；
Y-B是第二融合蛋白；
X:Y是异二聚体系链；
A包含特异性针对抗原(诸如CD22或CD79)的Fab片段；
B包含特异性针对抗原(诸如CD22或CD79)的Fab片段；
X是结合对的第一结合伴侣，诸如scFv；
Y是结合对的第二结合伴侣，诸如肽；和
:是X和Y之间的相互作用(诸如结合相互作用)。
实施例1-产生Fab’-A(Fab-scFv[A-X])和Fab’-B(Fab-肽[B-Y)用于功能测定
克隆策略
通过PCR或基因合成产生侧接限制性酶切位点DNA序列的抗体可变区DNA。这些位点是用于可变重链的HindIII和XhoI以及用于可变轻链的HindIII和BsiWI。这使得重链可变区适于连接到两个重链载体(与FabB-Y连接的pNAFH和与FabA-Xds[二硫键稳定的]连接的pNAFH)，因为它们具有互补的限制性位点。这将可变区上游(或5')与鼠恒定区和肽Y(GCN4)或scFv X(52SR4)连接，产生整个阅读框。将轻链克隆到标准的内部鼠类恒定κ载体(pMmCK或pMmCK S171C)中，其再次使用相同的互补的限制性位点。如果可变区分离自兔，则使用pMmCK S171C载体。通过使用位于整个开放阅读框侧翼的引物进行测序来确认克隆事件。
培养CHO-S
将悬浮CHOS细胞预先适应于补充有2mM(100x)glutamx的CDCHO培养基(Invitrogen)。在摇床培养箱(Kuner AG，Birsfelden，Switzerland)上以140rpm摇动将细胞维持在对数生长期，并在补充有8％CO2的37℃下培养。
电穿孔转染
在转染前，使用CEDEX细胞计数器(Innovatis AG，Bielefeld，Germany)测定细胞数和存活率，将所需量的细胞(2x108个细胞/ml)转移到离心锥形管中，并以1400rpm旋转10分钟。将沉淀的细胞重悬于无菌Earls平衡盐溶液中，并以1400rpm再旋转10分钟。弃去上清液，将沉淀重悬浮至所需的细胞密度。
载体DNA的最终浓度为400ug用于2x108细胞/ml的混合物并将800μl用移液管移至比色杯(Biorad)中并使用内部电穿孔系统电穿孔。
将转染的细胞直接转移到含有富含2mM glutamx和抗生素抗有丝分裂(100X)溶液(1比500)的ProCHO 5培养基的1X3L锥形瓶中。将细胞在设定为37℃，5％CO2和140rpm摇动的Kuhner摇床培养箱中培养。在转染后24小时加入进料补充剂2g/L ASF(AJINOMOTO)，温度降至37℃进一步培养13天。在第4天，向培养物中加入3mM的丙酮酸钠(n-BUTRIC ACID钠盐，Sigma B-5887)。
在第14天，将培养物转移到管中，并在4000rpm离心30分钟后从细胞中分离上清液。将保留的上清液进一步通过0.22μm SARTO BRAN P Millipore，随后通过0.22μmγ金过滤器过滤。通过蛋白G-HPLC测定最终表达水平。
大规模(1.0L)纯化
通过使用AKTA Xpress系统和HisTrap Excel预包装的镍柱(GE Healthcare)的亲和捕获来纯化Fab-A和Fab-B。将培养物上清液0.22μm无菌过滤，并且如果需要，在加载到柱上之前用弱酸或碱将pH调节至中性。使用含有15-25mM咪唑的二次洗涤步骤从镍树脂中置换任何弱结合的宿主细胞蛋白/非特异性His结合物。用10mM磷酸钠，pH7.4+1M NaCl+250mM咪唑进行洗脱，收集2ml级分。将一个柱体积加入洗脱液中，将体系暂停10分钟以收紧洗脱峰，并因此降低总洗脱体积。合并最干净的级分并将缓冲液交换到PBS(Sigma)，pH7.4中并且0.22μm过滤。通过A280Scan，SE-HPLC(G3000方法)、SDS-PAGE(还原和非还原)和使用PTSEndosafe系统(针对内毒素)测定最终汇集物。
实施例2-使用异二聚体系链双特异性蛋白复合体形式的Fab’-A(Fab-scFv[A-X]) 和Fab’-b(Fab-肽[B-Y])来证实是CD79/CD22双特异性而不是二价组合抑制Akt信号传导
将源自血小板血浆置换圆锥的人PBMC作为冷冻等分试样存储。在进行测定之前，将细胞解冻，在DMEM(Life Technologies)中洗涤并使其适应37℃/5％CO2环境。在此期间，通过在含有10％小牛血清和2mM谷氨酰胺的DMEM中稀释等摩尔(200nM)量的对于细胞表面蛋白CD22和CD79b具有抗原特异性的Fab'-A(Fab-scFv)和Fab'-B(Fab-肽)产生双特异性或二价抗体的网格。该网格如表4所示。
表4：具有针对CD22和CD79b的特异性的抗体的双特异性和二价组合的可能网格。
其中X是scFv(52SR4)而Y是肽(GCN4)
将Fab'A-X和Fab'B-Y一起孵育90分钟(在37℃/5％CO2环境中)，然后与2.5×105个PBMC在V底96孔板中混合。然后将PBMC加双特异性或二价组合一起孵育另外90分钟。此后，通过在37℃下加入200nM的山羊F(ab')2抗人IgM(Southern Biotechnology)8分钟来激活B细胞。然后通过加入等体积的Cytofix缓冲液(BD Biosciences)停止信号传导反应。然后将板在室温下放置15分钟，然后以500g离心5分钟。从细胞沉淀中弃去过量的上清液，将细胞沉淀重新悬浮在流式缓冲液(PBS+1％BSA+0.01％NaN3)中并再次洗涤。然后将细胞在冰冷的Perm Buffer III(BD Biosciences)中重悬浮30分钟，然后在流式缓冲液中洗涤两次。
然后用荧光标记的抗CD20抗体(BD Biosciences)和荧光标记的抗磷酸Akt抗体染色细胞，所述荧光标记的抗磷酸Akt抗体识别蛋白质上473位的修饰的丝氨酸残基。然后将板重悬浮并在室温下在黑暗中孵育1小时。此后，将板再洗涤两次并重悬于25μl流式缓冲液中。使用Intellicyt HTFCTM流式细胞仪测量CD20和Akt的细胞表达。
使用数据分析软件包ForecytTM(Intellicyt)B细胞被鉴定为不同于其他细胞群体，并且计算每个孔的Akt水平的几何平均值。然后将所有数据表示为最大反应(仅抗IgM)减去背景(仅细胞)的抑制百分数。CD22和CD79b的组合的相对效果显示在表5中(↓＝抑制，↑＝刺激而)。
表5：具有针对CD22和CD79b的特异性的抗体的双特异性和二价组合抑制磷酸化Akt的相对效力的表。
其中X是scFv(52SR4)而Y是肽(GCN4)
该数据也以条形图(图1)的形式显示：数据表示平均值，误差条是95％置信区间。数据显示，CD22与CD79b的组合可以抑制用抗IgM刺激的B细胞中的磷酸化Akt表达。相比之下，CD22与CD22的组合表现出升高的磷酸Akt表达水平。
实施例3-使用异二聚体系链双特异性蛋白复合体形式的Fab’-A(Fab-scFv[A-X]) 和Fab’-b(Fab-肽[B-Y])来证实是CD79/CD22双特异性而不是二价组合抑制PLCγ2信号传 导。
将源自血小板血浆置换圆锥的人PBMC作为冷冻等分试样存储。在进行测定之前，将细胞解冻，在DMEM(Life Technologies)中洗涤，并使其适应37℃/5％CO2环境。在此期间，通过在含有10％小牛血清和2mM谷氨酰胺的DMEM中稀释等摩尔(200nM)量的对于细胞表面蛋白CD22和CD79b具有抗原特异性的Fab'-a(Fab-scFv[A-X])和Fab'-B(Fab-肽[B-Y])产生双特异性或二价抗体的网格。该网格如表4所示。
将Fab'A-X和Fab'B-Y一起孵育90分钟(在37℃/5％CO2环境中)，然后与2.5×105个PBMC在V底96孔板中混合。然后将PBMC加双特异性或二价组合一起孵育另外90分钟。此后，通过在37℃下加入200nM的山羊F(ab')2抗人IgM(Southern Biotechnology)8分钟来激活B细胞。然后通过加入等体积的Cytofix缓冲液(BD Biosciences)停止信号传导反应。然后将板在室温下放置15分钟，然后以500g离心5分钟。从细胞沉淀中弃去过量的上清液，将细胞沉淀重新悬浮在流式缓冲液中并再次洗涤。然后将细胞在冰冷的Perm Buffer III(BDBiosciences)中重悬浮30分钟，然后在流式缓冲液中洗涤两次。
然后用荧光标记的抗CD20抗体(BD Biosciences)和荧光标记的抗磷酸PLCγ2抗体染色细胞，所述荧光标记的抗磷酸PLCγ2抗体识别蛋白质上759位的修饰的酪氨酸残基。然后将板重悬浮并在室温下在黑暗中孵育1小时。此后，将板再洗涤两次并重悬于25μl流式缓冲液中。使用Intellicyt HTFCTM流式细胞仪测量CD20和PLCγ2的细胞表达。
使用数据分析软件包ForecytTM(Intellicyt)B细胞被鉴定为不同于其他细胞群体，并且计算每个孔的PLCγ2水平的几何平均值。然后将所有数据表示为最大反应(仅抗IgM)减去背景(仅细胞)的抑制百分数。CD22和CD79b的组合的相对效果显示在表6中(↓＝抑制，↑＝刺激而)。
表6：具有针对CD22和CD79b的特异性的抗体的双特异性和二价组合抑制磷酸化的PLCγ2的相对效力的表。
其中X是scFv而Y是肽
该数据还可以表示为条形图(图2)，数据表示平均值，误差条为95％置信区间。数据显示，CD22与CD79b和CD79b与CD79b的组合均可抑制用抗IgM刺激的B细胞中的磷酸PLCγ2表达。相比之下，CD22与CD22的组合表现出升高的磷酸PLCγ2表达水平。
实施例4-使用异二聚体系链双特异性蛋白复合体形式的Fab’-A(Fab-scFv[A-X]) 和Fab’-b(Fab-肽[B-Y])来证实是CD79/CD22双特异性组合抑制CD86表达。
将源自血小板血浆置换圆锥的人PBMC作为冷冻等分试样存储。在进行测定之前，将细胞解冻，在DMEM(Life Technologies)中洗涤，并使其适应37℃/5％CO2环境。在此期间，通过在含有10％小牛血清和2mM谷氨酰胺的DMEM中稀释等摩尔(200nM)量的对于细胞表面蛋白CD22和CD79b具有抗原特异性的Fab'-X(Fab-scFv)和Fab'-Y(Fab-肽)产生双特异性或二价抗体的网格。该网格如表4所示。
将Fab'A-X和Fab'B-Y一起孵育90分钟(在37℃/5％CO2环境中)，然后与2.5×105个PBMC在V底96孔板中混合。然后将PBMC加双特异性或二价组合一起孵育另外90分钟。此后，通过在37℃下加入200nM的山羊F(ab')2抗人IgM(Southern Biotechnology)24小时来激活B细胞。此后，将板置于冰上，并在冰冷的流式缓冲液(PBS+1％BSA+0.01％NaN3)中洗涤一次。然后用荧光标记的抗CD19抗体(BD Biosciences)和荧光标记的抗CD86抗体染色细胞，并在冰上在黑暗中孵育1小时。此后，将板再洗涤两次并重悬于25μl流式缓冲液中。使用Intellicyt HTFCTM流式细胞仪测量CD19和CD86的细胞表达。
使用数据分析软件包ForecytTM(Intellicyt)B细胞被鉴定为不同于其他细胞群体，并且计算每个孔的CD86水平的几何平均值。然后将所有数据表示为最大反应(仅抗IgM)减去背景(仅细胞)的抑制百分数。CD22和CD79b的组合的相对效果显示在表7中(↓＝抑制，↑＝刺激而)。
表7：具有针对CD22和CD79b的特异性的抗体的双特异性和二价组合抑制B细胞的CD86表达的相对效力的表。
其中X是scFv(52SR4)而Y是肽(GCN4)
该数据也以条形图的形式显示(图3)，数据表示平均值，误差条为95％置信区间。数据显示，CD22与CD79b和CD79b与CD79b的组合都能抑制用抗IgM刺激的B细胞上的CD86表达。相比之下，CD22与CD22的组合表现出升高的CD86表达水平。
实施例5-CD22和CD79b的抑制作用只有当抗体以双特异性取向排列时才能再现
将源自血小板血浆置换圆锥的人PBMC作为冷冻等分试样存储。在进行测定之前，将细胞解冻，在DMEM(Life Technologies)中洗涤，并使其适应37℃/5％CO2环境。在此期间，通过在含有10％小牛血清和2mM谷氨酰胺的DMEM中稀释等摩尔(200nM)量的对于细胞表面蛋白CD22和CD79b具有抗原特异性的Fab'-X(Fab-scFv)和/或Fab'-Y(Fab-肽)产生双特异性、二价或抗体混合物的组合。这些组合显示在表8中。然后，对于滴定曲线实验，将这些组合以1比2.5的稀释度逐步稀释8次，以产生用于该组合的剂量滴定。
表8：对CD22和CD79b具有特异性的双特异性、二价或混合物的网格。
其中X是scFv(52SR4)而Y是肽(GCN4)
将Fab'A-X和/或Fab'B-Y一起孵育90分钟(在37℃/5％CO2环境中)，然后与2.5×105个PBMC在V底96孔板中混合。然后将PBMC加上Fab'A-X和/或Fab'B-Y组合一起孵育另外90分钟。此后，通过在37℃下加入200nM的山羊F(ab')2抗人IgM(Southern Biotechnology)8分钟来激活B细胞。然后通过加入等体积的Cytofix缓冲液(BD Biosciences)停止信号传导反应。然后将板在室温下放置15分钟，然后以500g离心5分钟。从细胞沉淀中弃去过量的上清液，将细胞沉淀重新悬浮在流式缓冲液(PBS+1％BSA+0.01％NaN3)中并再次洗涤。然后将细胞在冰冷的Perm Buffer III(BD Biosciences)中重悬浮30分钟，然后在流式缓冲液中洗涤两次。
然后用荧光标记的抗CD20抗体(BD Biosciences)、识别473位的修饰的丝氨酸残基的抗磷酸Akt抗体和识别759位的修饰的酪氨酸残基的抗磷酸PLCγ2抗体染色细胞。然后将板重悬浮并在室温下在黑暗中孵育1小时。此后，将板再洗涤两次并重悬于25μl流式缓冲液中。使用Intellicyt HTFCTM流式细胞仪测量CD20、Akt和PLCγ2的细胞表达。
使用数据分析软件包ForecytTM(Intellicyt)B细胞被鉴定为不同于其他细胞群体，并且计算每个孔的Akt和PLCγ2水平的几何平均值。然后将所有数据表示为最大反应(仅抗IgM)减去背景(仅细胞)的抑制百分数。图4和5显示只有CD22和CD79b的双特异性组合而不是CD22和CD79b抗体的混合物抑制磷酸化Akt和PLCγ2表达(数据表示平均值，误差条是95％置信区间)。
为了验证用CD22和CD79b的双特异性组合观察到的抑制，滴定该组合以及CD22和CD79b抗体的混合物，并测量B细胞中总细胞内IkB(信号传导读出数据)和CD86(24小时后的激活标记)的抑制。
从图6中可以看出，如通过总IkB蛋白所测量的，CD22-X/CD79b-Y的组合而不是CD22-X/CD79b-X的组合能够抑制抗IgM刺激后NF-κB信号激活。使用Graphpad Prism 6使用4参数对数曲线拟合外推的IC50为7.5nM(数据表示平均值，误差条是标准偏差)。另外，在24小时后，滴定CD22-X/CD79b-Y的组合而不是CD22-X/CD79b-X的组合能够抑制抗IgM诱导的CD86在B细胞上的表达(参见图7)。
将源自血小板血浆置换圆锥的人PBMC作为冷冻等分试样存储。在进行测定之前，将细胞解冻，在DMEM(Life Technologies)中洗涤，并使其适应37℃/5％CO2环境。在此期间，通过在含有10％小牛血清和2mM谷氨酰胺的DMEM中稀释等摩尔(500nM)量的Fab'-X(Fab-scFv)和Fab'-Y(Fab-肽)，产生对细胞表面蛋白CD22和CD79b具有抗原特异性的双特异性组合。然后将这些组合以1比2.5的稀释度逐步稀释8次，以产生用于该组合的剂量滴定。将Fab'-X和Fab'-Y一起孵育90分钟(在37℃/5％CO2环境中)，然后向V底96孔板中加入2.5×105个PBMC。然后将PBMC加入Fab'-X和Fab'-Y组合中并一起孵育另外90分钟。此后，通过在37℃下加入200nM的山羊F(ab')2抗人IgM(Southern Biotechnology)激活B细胞24小时。为了能够检测细胞表面激活标记物，将板置于冰上，在冰冷的流式缓冲液(PBS+1％BSA+0.01％NaN3)中洗涤一次。然后用荧光标记的抗CD19抗体(BD Biosciences)和荧光标记的抗CD86抗体染色细胞，并在冰上在黑暗中孵育1小时。此后，将板再洗涤两次并重悬于25ul流式缓冲液中。使用Intellicyt HTFCTM流式细胞仪测量CD19和CD86的细胞表达。使用数据分析软件包ForecytTM(Intellicyt)B细胞被鉴定为不同于其他细胞群体，并且计算每个孔的CD86水平的几何平均值。然后将所有数据表示为最大反应(仅抗IgM)减去背景(仅细胞)的抑制百分数。从图7中可以看出，CD22-X/CD79b-Y的组合的滴定能够在24小时后抑制抗IgM诱导的B细胞上CD86表达。使用Graphpad Prism 6使用4参数对数曲线拟合外推的IC50为10.3nM(数据表示平均值，误差棒为标准偏差)。
实施例6-可用不同抗体V区再现CD22和CD79b双特异性蛋白的抑制作用
免疫：通过基因合成或商业来源获得编码所选抗原的DNA，并克隆到具有强组成型启动子的表达载体中。然后使用内部电穿孔系统将质粒DNA转染到Rab-9兔成纤维细胞(CRL-1414TM)中。二十四小时后，通过流式细胞术检查细胞的抗原表达，并在液氮中以等分试样冷冻直至使用。通过在相同细胞上共表达或制备单一或多个转染细胞的混合物，每只兔免疫多达6种抗原。用3剂量的细胞免疫兔。
抗体发现：使用与Zubler等人(1985)描述的方法类似的方法制备B细胞培养物。简言之，将来自免疫兔的脾或PBMC衍生的B细胞以约2000-5000个细胞/孔的密度在具有200μl/孔RPMI 1640培养基(Gibco BRL)的条形码96孔组织培养板中在37℃下、在5％CO2气氛中培养7天，所述RPMI 1640培养基补充有10％FCS(PAA laboratories ltd)，2％HEPES(SigmaAldrich)，1％L-谷氨酰胺(Gibco BRL)，1％青霉素/链霉素溶液(Gibco BRL)，0.1％β-巯基乙醇(Gibco BRL)，3％激活的脾细胞培养物上清液和γ照射的突变体EL4鼠胸腺瘤细胞(5×104个/孔)。
使用HEK293细胞并使用基于均匀荧光的结合测定来测定B细胞培养物上清液中抗原特异性抗体的存在，所述HEK293细胞使用免疫兔用的抗原共转染。筛选涉及使用MatrixPlatemate液体处理器将10ul来自条形码96孔组织培养板的上清液转移到含有用靶抗原转染的HEK293细胞(约3000个细胞/孔)的条形码384孔黑壁测定板中。用山羊抗兔IgG Fcγ特异性Cy-5缀合物(Jackson)显示结合。在Applied Biosystems 8200细胞检测系统上读板。
初次筛选后，使用Aviso Onyx命中挑取机器人将阳性上清液固定在96孔条形码母板上，并将细胞培养板中的B细胞在-80℃冷冻。然后在基于均匀荧光的结合测定中，在分别用抗原转染的HEK293细胞和用重组蛋白作为抗原来源的SuperavidinTM珠(BangsLaboratories)上筛选母板。这是为了确定每个孔的抗原特异性。
为了允许从感兴趣的孔的选择中回收抗体可变区基因，进行解卷积步骤以使得能够鉴定含有B细胞的异质群体的给定孔中的抗原特异性B细胞。这是使用荧光聚焦方法(Clargo等人，2014.Mabs 2014Jan 1:6(1)143-159；EP1570267B1)实现的。简言之，将来自阳性孔的分泌免疫球蛋白的B细胞与用靶抗原转染的HEK293细胞或用生物素化的靶抗原包被的链霉抗生物素蛋白珠(New England Biolabs)和1:1200最终稀释度的山羊抗兔Fcγ片段特异性FITC缀合物(Jackson)混合。在37℃下静态孵育1小时后，由于围绕B细胞的荧光晕的存在，可以鉴定抗原特异性B细胞。然后使用奥林巴斯显微镜鉴定的多个这些个体B细胞克隆用Eppendorf微操作器挑取并沉积到PCR管中。荧光聚焦方法也用于从直接来自免疫兔的骨髓的B细胞的异质群体中鉴定抗原特异性B细胞。
通过使用重链和轻链可变区特异性引物的逆转录(RT)-PCR从单细胞中回收抗体可变区基因。进行两轮PCR、巢式二级PCR在3'和5'末端引入限制性位点，允许将可变区克隆到小鼠Fab-X和Fab-Y(VH)或小鼠κ(VL)哺乳动物表达载体中。将Fab-X和Fab-Y表达载体的重链和轻链构建体使用Fectin 293(Life Technologies)共转染到HEK-293细胞中或使用Expifectamine(Life Technologies)Expi293细胞中，并在6孔组织中表达重组抗体培养板的体积为5ml。在5-7天表达后，收获上清液。在对用抗原转染的HEK293细胞和包被有重组蛋白或抗原转染的HEK细胞的SuperavidinTM珠(Bangs Laboratories)的基于均匀荧光的结合测定中测试上清液。这是为了确认克隆的抗体的特异性。
生产小规模Fab A-X和Fab B-Y(小规模(50mL)Expi293转染)
将Expi293细胞在Expi293TM表达培养基中常规地继代培养至终浓度为0.5×106个活细胞/mL，并在轨道摇床培养箱(Multitron，Infors HT)中以120rpm，8％CO2和37℃培养。
在转染当天，使用自动化细胞计数器(Vi-CELL，Beckman Coulter)测量细胞活力和浓度。为了达到2.5×106个活细胞/mL的最终细胞浓度，将适当体积的细胞悬浮液加入到无菌的250mL锥形瓶中，通过加入新鲜的、预热的Expi293TM表达培养基来达到42.5mL的体积每50mL转染。
为了为每次转染制备脂质-DNA复合物，将总共50μg的重链和轻链质粒DNA在I培养基(LifeTechnologies)中稀释至总体积为2.5mL，并将135μL的ExpiFectamineTM 293试剂(Life Technologies)在I培养基中稀释至总体积为2.5mL。将所有稀释液轻轻混合并在室温下孵育不超过5分钟，然后将每种DNA溶液加入各自稀释的ExpiFectamineTM 293试剂中，以获得5mL的总体积。轻轻混合DNA-ExpiFectamineTM 293试剂混合物，并在室温下孵育20-30分钟，以形成DNA-ExpiFectamineTM 293试剂复合物。
在DNA-ExpiFectamineTM 293试剂复合物孵育完成后，将5mL DNA-ExpiFectamineTM 293试剂复合物加入每个摇瓶中。将摇瓶在轨道摇床培养箱(Multitron，Infors HT)中以120rpm，8％CO2和37℃培养。
转染后约16-18小时，向每个摇瓶中加入250μL的ExpiFectamineTM 293转染增强子1(LifeTechnologies)和2.5mL的ExpiFectamineTM 293转染增强子2(LifeTechnologies)。
转染后7天收获细胞培养物。将细胞转移到50mL旋转管(Falcon)中并以4000rpm离心30分钟，然后通过0.22μm Stericup(Merck Millipore)无菌过滤。将澄清和无菌过滤的上清液储存在4℃。通过蛋白G-HPLC测定最终表达水平。
小规模(50ml)纯化：使用小规模基于真空的纯化系统通过亲和捕获分别纯化Fab-X和Fab-Y二者。简言之，将50ml培养物上清液0.22μm无菌过滤，然后加入500μLNiSepharose珠(GE Healthcare)。然后将上清液珠混合物翻滚约1小时，然后通过施加真空除去上清液。然后用洗涤液1(50mM磷酸钠、1M NaCl，pH 6.2)和洗涤液2(0.5M NaCl)洗涤珠。用50mM乙酸钠，pH4.0+1M NaCl进行洗脱。将洗脱的级分缓冲液交换到PBS(Sigma)，pH7.4中和0.22μm过滤。通过A280扫描，SE-UPLC(BEH200方法)、SDS-PAGE(还原和未还原)和使用PTSEndosafe系统(对于内毒素)测定最终汇集物。
将源自血小板血浆置换圆锥的人PBMC作为冷冻等分试样存储。在进行测定之前，将细胞解冻，在RPMI 1640(Life Technologies)中洗涤，并使其适应37℃/5％CO2环境。在此期间，通过在含有10％胎牛血清、50单位/mL青霉素、50μg/ml链霉素和2mM谷氨酰胺的RPMI 1640中稀释等摩尔(200nM)量的对细胞表面蛋白质CD22和CD79b具有抗原特异性的Fab'-X(Fab-scFv)和/或Fab'-Y(Fab-肽)产生双特异性、二价或抗体混合物的组合。3种不同的CD79b Fab-Y和3种不同的CD22Fab-X的这些组合显示在表9中。
表9：具有针对CD22和CD79b的特异性的双特异性蛋白的网格。
其中X是scFv(52SR4)而Y是肽(GCN4)
将Fab'A-X和Fab'B-Y一起孵育60分钟(在37℃/5％CO2环境中)，然后与2.5×105个PBMC在V底96孔板中混合。然后将PBMC加上Fab'A-X和/或Fab'B-Y组合一起孵育另外90分钟。此后，通过在37℃下加入12.5μg/ml的山羊F(ab')2抗人IgM(Southern Biotechnology)10分钟来激活B细胞。然后通过加入等体积的Cytofix缓冲液(BD Biosciences)停止信号传导反应。然后将板在室温下放置15分钟，然后以500g离心5分钟。从细胞沉淀中弃去过量的上清液，将细胞沉淀重新悬浮在流式缓冲液(PBS+1％BSA+0.1％NaN3+2mM EDTA)中并再次洗涤。然后将细胞在冰冷的Perm Buffer III(BD Biosciences)中重悬浮30分钟，然后在流式缓冲液中洗涤两次。
然后用荧光标记的抗CD20抗体(BD Biosciences)和识别759位上修饰的酪氨酸残基的抗磷酸PLCγ2抗体染色细胞。然后将平板重悬浮并在室温下在黑暗中孵育1小时。此后，将板再洗涤两次并重悬于40μl流式缓冲液中。使用Intellicyt HTFCTM流式细胞仪测量CD20和PLCγ2的细胞表达。
使用数据分析软件包ForecytTM(Intellicyt)B细胞被鉴定为不同于其他细胞群体，并且计算每个孔的PLCγ2水平的几何平均值。然后将所有数据表示为最大反应(仅抗IgM)减去背景(仅细胞)的抑制百分数。
从图8中可以看出，数据显示使用所有不同的抗体V区的CD22与CD79b的组合可以抑制用抗IgM刺激的B细胞中的磷酸化PLCγ2表达。
实施例7：网格筛选大组异二聚体系链束缚的蛋白质复合物来鉴定新的双特异性抗体靶
简介：在较早实施例中双特异性形式和筛选方法的成功验证之后，筛选扩展到更大数量的抗原对。产生针对在B细胞上表达的23种不同抗原的一组抗体可变(V)区。使用Fab-Kd-Fab[即A-X:Y-B，其中A和B是Fab片段]形式，形成异二聚体系链束缚的蛋白质复合物的网格，代表315种不同抗原对组合中的每一种的多种V区组合。在高通量流式细胞术测定中筛选这些组合调节BCR(B细胞受体)信号传导的能力，以选择用于用双特异性抗体干预的新靶对。
如实施例6中所述分离抗体。
筛选测定
使用设定为37℃的水浴将供体PBMC快速解冻，并小心地转移到50ml Falcon管中。然后将它们在测定培养基中逐滴稀释至5ml，以使渗透性休克最小化。然后将细胞小心稀释至20ml，然后加入最终的培养基稀释剂以使体积为50ml。然后将细胞以500g离心5分钟，然后除去上清液并将细胞重悬于1ml培养基中。然后计数细胞并稀释至1.66×106个细胞/ml，然后将每孔30μl分配到V-底TC板中，得到5.0×104个细胞/孔的最终测定浓度。然后将细胞板覆盖存储于37℃，5％CO2培养箱中，直到需要它们，给予它们至少1小时休息。
将Fab-X和Fab-Y试剂在测定培养基中以最终测定浓度的5倍等摩尔比混合，并在37℃，5％CO2下孵育90分钟。在96孔U形底聚丙烯板中制备样品，并在孵育期间覆盖。
将10μl的5x Fab-KD-Fab混合物加入到含有细胞的合适的测试孔中，并通过以1000rpm摇动混合30秒，然后在37℃，5％CO2下孵育90分钟。
然后用10μl抗人IgM刺激细胞。刺激的最终测定浓度根据测定面板读出数据而变化，以三种抗体混合物A、B和C(下文中详述)以50μg/ml(混合物A&C)或25μg/ml(混合物B)的最终测定浓度刺激。然后将测定板在1000rpm下温和混合30秒，然后在37℃，5％CO2孵育5分钟(抗体混合物A和C)或2分钟(抗体混合物B)。通过向所有孔中加入150μl冰冷的BDCytoFix来终止测定，并在室温下孵育15分钟。然后将固定的细胞以500g离心5分钟以沉淀细胞，并使用BioTek ELx405板洗涤器除去上清液。通过以2400rpm涡旋平板30秒来重悬沉淀。然后通过加入100μl冰冷的BD细胞透化缓冲液III在4℃下使细胞透化30分钟。然后将细胞在100μl FACS缓冲液中洗涤，并在500g离心5分钟。通过ELx405再次去除上清液，然后使用ELx405快速分配200μl FACS缓冲液以洗去任何残余的透化缓冲液。再次将细胞以500g旋转，通过倒置除去上清液。在前述旋转步骤期间，在FACS缓冲液中制备抗体混合物并保持屏蔽光。然后通过涡旋(2400RPM，30秒)将细胞重悬浮，然后向所有孔中加入20μl抗体混合物，并将板在1000rpm下摇动30秒。然后将细胞在室温下在黑暗中孵育60分钟。
然后将细胞在200μl FACS缓冲液中用500g旋转洗涤两次，并在每个步骤后除去上清液。最后，通过在2400rpm涡旋30秒来重悬细胞，然后加入最终20μl FACS缓冲液。然后在Intellicyt HTFC/iQue仪器上读板。
FACS缓冲液＝PBS+1％BSA+0.05％NaN3+2mM EDTA
抗体混合液A＝1:2CD20 PerCp-Cy5.5(BD Biosciences)+1:5 PLCγ2 AF88+1:10Akt AF647+1:50 ERK1/2 PE(稀释于FACS缓冲液中)。
抗体混合液B＝1:2 CD20 PerCp-Cy5.5(BD Biosciences)+1:5 Syk PE+1:5 BLNKAF647(稀释于FACS缓冲液中)
抗体混合液C＝1:5 CD20 PerCp-Cy5.5(Biolegend)+1:5 PLCγ2 AF488+1:10Akt AF647+1:5 Syk PE(稀释于FACS缓冲液中)
试剂 供应商 目录号
抗人IgM Southern Biotech 2022-14
CytoFix BD Biosciences 554655
Perm Buffer III BD Biosciences 558050
抗Akt(pS473)AF647 BD Biosciences 561670
抗SYK(pY348)PE BD Biosciences 558529
抗PLCγ2(pY759)AF488 BD Biosciences 558507
抗BLNK(pY84)AF647 BD Biosciences 558443
抗ERK1/2(pT202/pY204)PE BD Biosciences 561991
抗人CD20 PerCp-Cy5.5 BD Biosciences 558021
抗人CD20 AF488 BD Biosciences 558056
抗人CD20 PerCp-Cy5.5 Biolegend 340508
磷酸盐缓冲液(PBS) Fisher Scientific 10562765
RPMI 1640 Life Technologies 31870
胎牛血清(FCS) Life Technologies 16140
Glutamax Life Technologies 35050
青霉素/链霉素(P/S) Life Technologies 15070
EDTA Sigma 03690
叠氮化钠(NaN3) Sigma S2002
牛血清白蛋白(BSA) Sigma A1470
用抗体混合物A和B或单独的C筛选Fab-X+Fab-Y组合。所有筛选在来自2个不同血液供体的锥细胞上进行。使用市售的软件工具捕获和评价数据。将总共2500个Fab-X+Fab-Y组合筛选至315种不同的抗原组合。
结果
计算了每个Fab-Kd-Fab[即A-X:Y-B，其中A和B是Fab片段]组合对BCR信号传导级联蛋白的磷酸化的诱导的抑制百分数，在本实施例中寻找抑制B细胞功能的抗原的新组合，阳性组合的标准被设定为V区的至少一个组合对至少两种磷酸读出数据的至少30％的抑制。根据该阈值，在315个检查的组合中有11个新抗原对组合满足所需标准。这代表3.5％的命中率，证明了筛选大量组合以找到具有所需活性的组合的重要性以及CD79b和CD22的组合的活性有多么的稀有。
图10-12显示了抗原网格交叉特异性的数据。值分别为Syk、PLCγ2和AKT的磷酸化的抑制百分数(激活则为负值)，并且代表所评估的多个V区组合的平均值。测试了315种不同的抗原组合，并且可以看出，不同抗体组合对BCR信号传导的影响变化显著，从强抑制例如Fab-X上的抗原2(CD79b)与Fab-Y上的抗原3(CD22)(对磷酸Syk的69.66％抑制)和Fab-Y上的抗原2(CD79b)与Fab-X上的抗原3(CD22)的组合(对磷酸Syk的52.32％抑制，示于图11中)至激活例如X上的抗原6和Y上的抗原11(磷酸Syk的负的118.10％，图11)。
代表图10-12中所示的平均％值的每个数据点被针对Fab-X上的抗原2(CD79b)和Fab-Y上的抗原3(CD22)显示于图13中。在这种情况下，评估了不同抗体V区的23种不同组合。替代取向形式(即Fab-Y上的抗原2(CD79b)和Fab-X上的抗原3(CD22))的相同抗原组合被显示于图14中。在这种情况下，评估了不同抗体V区的9种不同组合。所有V区显示抑制，但有利地该方法也可用于选择最佳V区组合。
实施例8：比较Fab-Kd-Fab筛选形式与分子连接的双特异性BYbe形式的抗原CD79b加上抗原CD22共靶向活性。
简介：为了检查在Fab-Kd-Fab异二聚体系链束缚的筛选复合物中鉴定的CD79b/CD22靶对活性可以在替代的治疗性分子连接形式中转化为类似的所需活性，抗原CD79b特异性(VR4447)和抗原CD22特异性(VR4130)以BYbe格式生成。该BYbe形式由作为二硫键稳定的(ds)单链(sc)-Fv的抗抗原CD22V区(VR4130)经由接头SGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：17)与抗抗原CD79b Fab(VR4447)的重链融合。
方法:
如下进行用于功能筛选的BYbes的纯化：
如下纯化功能筛选BYbe(Fab-dsscFv[Fab重链的C末端解离(off)的scFv])形式。来自标准expiHEK或CHO表达的澄清的细胞培养上清液进行0.22μm无菌过滤。将过滤的上清液以2ml/min上样到在PBS pH7.4(Sigma Aldrich Chemicals)中平衡的50mlGammabindPlus Sepharose XK26柱(GE Healthcare)上。上样后，用PBS pH7.4洗涤柱，然后用0.1M甘氨酸/HCl、pH2.7洗脱。洗脱后在280nm处进行吸光度检测，收集洗脱峰，然后用1/25体积的2M Tris/HCl、pH8.5中和。使用具有10kDa(BYbes)截留分子量膜的Amicon Ultra-15浓缩器并在水平转头中以4000xg离心来浓缩中和的样品。将浓缩的样品施加于在PBS，pH7.4中平衡的XK16/60或XK26/60Superdex200柱(GE Healthcare)上。用等度梯度的PBS、pH 7.4以1ml/min或2.6ml/min展开(develop)。收集级分并通过在TSK凝胶G3000SWXL上的尺寸排阻色谱法分析；5μm，7.8×300mm柱，用等度梯度的0.2M磷酸盐、pH7.0以1ml/min展开，通过在280nm处进行吸光度检测。合并选择的单体级分，使用具有10kDa截留分子量膜的Amicon Ultra-15浓缩器并在水平转头中以4000xg离心浓缩至>1mg/ml。测定最终样品；通过A280扫描紫外可见分光光度计(Cary 50Bio)测量浓度；通过在TSK凝胶G3000SWXL上的尺寸排阻色谱测量单体％；5μm，7.8×300mm柱，用等浓度梯度的0.2M磷酸盐，pH7.0以1ml/min展开，通过在280nm处进行吸光度检测；通过在4-20％Tris-甘氨酸1.5mm凝胶(Novex)上以50mA(每凝胶)进行还原和非还原SDS-PAGE 53分钟；以及通过具有Limulus AmebocyteLysate(LAL)测试盒的Charles River的便携式测试系统测量内毒素。
功能测定
激活标志物测定：抗原CD79b特异性Fab'-Y和抗原CD22特异性Fab'-X以等摩尔浓度一起孵育60分钟(在37℃和5％CO2环境中)。从100nM的起始摩尔浓度以1:4连续稀释液滴定组合。抗原CD79b和CD22特异性BYbe也从100nM的起始摩尔浓度以1:4连续稀释液滴定。在V-底96孔板中，将1.5×105个PBMC加入孔中，向其中加入滴定的Fab'-X和Fab'-Y组合或滴定的BYbe。将Fab'-X和Fab'-Y组合或BYbe与细胞一起孵育90分钟。此后，通过在37℃和5％CO2下加入25μg/ml的山羊F(ab')2抗人IgM(Southern Biotechnology)24小时来激活B细胞。
向孔中加入100μL冰冷的FACS缓冲液(PBS+1％BSA+0.1％NaN3+2mM EDTA)中，将板密封并用湿冰覆盖约15分钟，然后在4℃下以500×g离心5分钟。从细胞沉淀中弃去过量的上清液，并将板在2000rpm下摇动30秒。
然后用荧光标记的抗CD19、抗CD20和抗CD71、抗CD40和抗CD86抗体(BDBiosciences)的混合物将细胞染色。稍稍摇动平板并在黑暗中于湿冰上孵育1小时。此后，将板洗涤两次并重悬于20μl FACS缓冲液中。使用IntellicytScreener流式细胞仪测量CD19、CD20和CD71、CD40和CD86的细胞表达。
使用数据分析软件包ForecytTM(Intellicyt)将B细胞鉴定为不同于其他细胞群，并且计算每个孔的CD71、CD40和CD86水平的几何平均值。然后将所有数据表示为相对于最大应答(仅抗IgM)减去背景(仅细胞)的抑制百分数。
PhosFlow测定：抗原CD79b特异性Fab'-Y和抗原CD22特异性Fab'-X以等摩尔浓度一起孵育60分钟(在37℃和5％CO2环境中)。从100nM的起始摩尔浓度以1:4连续稀释液滴定组合。还从100nM的起始摩尔浓度以1:4连续稀释滴定抗原CD79b和抗原CD22特异性BYbe。在V形底96孔板中，将5.0×104个PBMC添加至向其中添加了滴定的Fab'-X和Fab'-Y组合或滴定的BYbe的孔中。将Fab'-X和Fab'-Y组合或BYbe与细胞一起孵育另外的90分钟。此后，通过在37℃和5％CO2下添加25μg/ml山羊F(ab')2抗人IgM(Southern Biotechnology)持续15分钟来激活B细胞。然后通过添加等体积的Cytofix缓冲液(BD Biosciences)来停止信号传导反应。然后将板在室温下放置15分钟，然后以500×g离心5分钟。从细胞沉淀中弃去过量上清液，将其重悬于FACS缓冲液(PBS+1％BSA+0.01％NaN3+2mM EDTA)中并再次洗涤。然后将细胞在冰冷的Perm缓冲液III(BD Biosciences)中重悬30分钟，然后在流式缓冲液中洗涤两次。
然后用荧光标记的抗CD20抗体(BD Biosciences)和抗磷酸化的PLCγ2、抗磷酸化的Akt和抗磷酸化的p38抗体(BD Biosciences)将细胞染色。然后将板重悬并在室温下于黑暗中孵育1小时。此后，将板再洗涤两次并重悬于20μl FACS缓冲液中。使用Intellicyt流式细胞仪测量CD20和磷酸PLCγ2、磷酸Akt和磷酸p38的细胞表达。
使用数据分析软件包ForecytTM(Intellicyt)将B细胞鉴定为不同于其他细胞群体，并且计算每个孔的PLCγ2、Akt和p38水平的几何平均值。然后将所有数据表示为相对于最大应答(仅抗IgM)减去背景(仅细胞)的抑制百分数。
结果
PhosFlow测定：图15中的数据显示，以Fab-Kd-Fab或BYbe形式靶向抗原CD79b和抗原CD22可以抑制用抗IgM刺激的B细胞中磷酸化的PLCγ2。图16中的数据显示，以Fab-Kd-Fab或BYbe形式靶向抗原CD79b和抗原CD22可以抑制用抗IgM刺激的B细胞中磷酸化的P38。图17中的数据显示，以Fab-Kd-Fab或BYbe形式的靶向抗原CD79b和抗原CD22可以抑制用抗IgM刺激的B细胞中磷酸化的Akt。
激活标志物测定：如可从图18看到的，数据显示，以Fab-Kd-Fab或BYbe形式靶向抗原CD79b和抗原CD22可以抑制用抗IgM刺激的B细胞上CD71的表达。图19中的数据显示，以Fab-Kd-Fab或BYbe形式靶向抗原CD79b和抗原CD22可以抑制用抗IgM刺激的B细胞上CD40的表达。图20中的数据显示，以Fab-Kd-Fab或BYbe形式靶向抗原CD79b和抗原CD22可以抑制用抗IgM刺激的B细胞上CD86的表达。
实施例9—比较分子连接的双特异性Bybe形式的抗原CD79b加上抗原CD22与进一步加上抗白蛋白结合结构域以延长体内半寿期的共靶向活性。
简介：为了检查在Fab-Kd-Fab异二聚体系链束缚的筛选复合体中鉴定的CD79b/CD22靶标对的活性是否可以转化成具有抗白蛋白靶向的体内半寿期延长的潜在治疗性分子连接的形式的相似的所需活性，将抗白蛋白抗体片段经具有序列SGGGGSGGGGS(SEQ IDNO:17)的接头与实施例8中所述的BYbe形式的抗原CD22 Fab的轻链融合。在添加和不添加抗白蛋白片段(VR0645)的情况下以Bybe形式产生抗原CD79b特异性(VR4447)和抗原CD22特异性(VR4130和VR4126)。
在本实验中使用的构建体的描述。
构建体名称 Fab特异性 重链scFv 轻链scFv
VR4447/VR4126 BYbe 抗原CD79b 抗原CD22 无
VR4447/VR4126/VR645)BYbe/白蛋白 抗原CD79b 抗原CD22 白蛋白
VR4447/VR4130 BYbe 抗原CD79b 抗原CD22 无
VR4447/VR4130/VR645)BYbe/白蛋白 抗原CD79b 抗原CD22 白蛋白
方法
有/无抗白蛋白附加特异性的BYbe的纯化:
如下纯化BYbe(Fab-dsscFv[Fab重链的C末端解离的scFv])和具有抗白蛋白的BYbe(Fab-2xdsscFv[Fab重链和轻链的C末端解离的scFv])形式。将来自标准expiHEK或CHO表达的澄清的细胞培养上清液进行0.22μm无菌过滤。以2ml/min将过滤的上清液上样至于PBS pH7.4(Sigma Aldrich Chemicals)中平衡的50ml GammabindPlus Sepharose XK26柱(GE Healthcare)上。上样后，用PBS pH 7.4洗涤柱，然后用0.1M甘氨酸/HCl、pH2.7洗脱。洗脱后在280nm处进行吸光度检测，收集洗脱峰，然后用1/25体积的2M Tris/HCl、pH8.5中和。使用具有10kDa或30kDa截留分子量膜的Amicon Ultra-15浓缩器并在水平转头中以4000xg离心来浓缩中和的样品。将浓缩的样品施加于在PBS、pH 7.4中平衡的XK16/60或XK26/60Superdex200柱(GE Healthcare)上。用等度梯度的PBS、pH 7.4分别以1ml/min或2.6ml/min展开柱子。收集级分并在TSKgel G3000SWXL上通过尺寸排阻层析法进行分析；5μm、7.8X300mm柱子，用等度梯度的0.2M磷酸盐、pH 7.0以1ml/min展开，通过在280nm处进行吸光度检测。合并选择的单体级分，使用具有10kDa或30kDa截留分子量膜的Amicon Ultra-15浓缩器并在水平转头中以4000xg离心来浓缩至>1mg/ml。测定最终样品；通过A280扫描紫外-可见分光光度计(Cary 50Bio)测量浓度；通过在TSKgel G3000SWXL上的尺寸排阻层析测量单体％；5μm、7.8x300mm柱子，用等度梯度的0.2M磷酸盐、pH7.0以1ml/min展开，通过在280nm处进行吸光度检测；通过在4-20％Tris-甘氨酸1.5mm凝胶(Novex)上以50mA(每凝胶)进行还原和非还原SDS-PAGE 53分钟；以及通过具有Limulus Amebocyte Lysate(LAL)测试盒的Charles River’s便携式测试系统测量内毒素。
将100nM的每种构建体纯化的蛋白质与来自5个分开的供体的人PBMC在37℃/5％CO2下于RMPI 1640培养基(加上10％胎牛血清和2mM Glutamax(R10培养基))中预孵育60分钟。60分钟后，用25ug/ml被设计来仅刺激B细胞的山羊抗IgM抗体刺激细胞。24小时后，将板置于冰上以停止任何进一步的细胞激活，然后用冰冷的流式细胞术缓冲液(PBS+1％BSA+0.01％NaN3)洗涤一次。除去所有上清液，并重悬细胞沉淀。将细胞置于冰上，添加抗CD19、抗CD20、抗CD27、抗CD71和抗CD86抗体的混合物。将细胞孵育60分钟，然后在流式细胞术缓冲液中洗涤两次。使用iQUE高通量流式细胞仪产生抗CD27、抗CD71和CD86与CD19/CD20阳性B细胞的结合的数据。使用Forecyt软件产生直方图并得到抗CD27、抗CD71和CD86抗体与B细胞的结合的几何平均强度读数。将该数据输入至Excel中并为每个组合产生抑制百分数的值。然后将数据输入至Graphpad Prism中，并为每个组合产生盒和须图表，其中平均值由“+”表示。
图21显示由VR4447/VR4126 BYbe和VR4447/VR4126/VR645 BYbe/白蛋白诱导的B细胞上CD27表达的抑制。在所测试的5个供体中，两者均显示出始终相似的抗IgM诱导的CD27的抑制水平。图22显示由VR4447/VR4126 BYbe和VR4447/VR4126/VR645 BYbe/白蛋白诱导的B细胞上CD71表达的抑制。在5个供体当中，两者显示出始终相似的抗IgM诱导的CD71的抑制水平。图23显示由VR4447/VR4126 BYbe和VR4447/VR4126/VR645 BYbe/白蛋白诱导的B细胞上CD86表达的抑制。在5个供体当中，两者显示出始终相似的抑制抗IgM诱导的CD86的水平。
图24显示由VR4447/VR4130 BYbe和VR4447/VR4130/VR645 BYbe/白蛋白诱导的B细胞上的CD27表达的抑制。在所测试的5个供体中，两者均显示出始终相似的抗IgM诱导的CD27的抑制水平。图25显示由VR4447/VR4130 BYbe和VR4447/VR4130/VR645 BYbe/白蛋白诱导的B细胞上的CD71表达的抑制。在5个供体当中，两者显示出始终相似的抗IgM诱导的CD71的抑制水平。图26显示由VR4447/VR4130 BYbe和VR4447/VR4130/VR645 BYbe/白蛋白诱导的B细胞上CD86表达的抑制。在5个供体当中，两者显示出始终相似的抑制抗IgM诱导的CD86的水平。
实施例10—使用分子连接的双特异性BYbe在进一步加入抗白蛋白或者不加入抗白蛋白的情况下抗原CD79b加上抗原CD22对记忆B细胞功能的共靶向作用。
简介：为了评估靶向CD79b/CD22是否对长期培养中的B细胞具有功能效应，测量了分离或在混合的PBMC培养物中培养的B细胞的IgG产生。记忆抗原破伤风类毒素的特异性抗体的测量提供了记忆B细胞功能的读出数据。
在加入或不加入抗白蛋白片段(VR0645)的情况下以BYbe形式产生抗原CD79b特异性(VR4447)和抗原CD22特异性(VR4126、VR4127和VR4130)。将抗白蛋白抗体片段通过具有序列SGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：17)的接头与如实施例8所述的BYbe形式的抗原CD22 Fab的轻链融合。
在本实验中使用的构建体的描述。
构建体名称 Fab特异性 重链scFv 轻链scFv
VR4447/VR4126 BYbe 抗原CD79b 抗原CD22 无
VR4447/VR4126/VR645 BYbe/白蛋白 抗原CD79b 抗原CD22 白蛋白
VR4447/VR4127 BYbe 抗原CD79b 抗原CD22 无
VR4447/VR4130 BYbe 抗原CD79b 抗原CD22 无
VR4447/VR4130/VR645 BYbe/白蛋白 抗原CD79b 抗原CD22 白蛋白
方法
有/无抗白蛋白附加特异性的BYbe的纯化
如实施例9所述纯化BYbe(Fab-dsscFv[Fab重链的C末端解离的scFv])和具有抗白蛋白的BYbe(Fab-2xdsscFv[Fab重链和轻链的C末端解离的scFv])形式。
B细胞的激活和破伤风类毒素特异性IgG的测量
用在含有10％胎牛血清和2mM Glutamax(R10培养基)的1640培养基中的500ng/mlCD40L，1μg/ml CpG和50ng/ml IL-21刺激来源于至多3个分开的供体的人PBMC或纯化B细胞6天。在第0天以100nM的终浓度加入纯化蛋白的构建体，并在测定期间保留在培养基中。6天后收集上清液，通过ELISA检测破伤风类毒素特异性IgG的量。简言之，将Maxisorp半孔ELISA板(Nunc)在4℃下用10ug/ml破伤风类毒素的PBS溶液包被过夜。然后将平板在含有0.05％Tween20的5％牛奶的PBS溶液中封闭2小时。将上清液稀释，然后加入在室温下2小时。用PBS-0.05％Tween20洗涤平板，使用在5％牛奶-PBS-0.05％Tween20中稀释至1ug/ml的过氧化物酶-山羊抗人IgG(H+L)检测破伤风结合的抗体。使用TMB底物溶液(KPL)显影板，使用Synergy 2微量酶标仪(Biotek)测量450nM的吸光度。将数据导出到Excel中，并相对于没有测试抗体培养的细胞计算抑制百分数。然后将数据导入Graphpad并绘制为条形图。
图27显示来自用VR4447/VR4126 Bybe、VR4447/VR4127 BYbe和VR4447/VR4130BYbe培养的PBMC的破伤风类毒素IgG产生的抑制。数据表示来自3个供体的合并数据。
图28显示来自用VR4447/VR4126 BYbe、VR4447/VR4127 BYbe和VR4447/VR4130BYbe培养的纯化B细胞的破伤风类毒素IgG产生的抑制。数据表示来自2个供体的合并数据。
图29显示来自用VR4447/VR4126 BYbe、VR4447/VR4127 BYbe、VR4447/VR4130BYbe、VR4447/VR4126/VR645 BYbe/白蛋白和VR4447/VR4130/VR645 BYbe/白蛋白培养的PBMC或纯化B细胞的破伤风类毒素IgG产生的抑制。从单个供体显示的数据。
实施例11—SLE患者B细胞中BCR信号传导的失调和共靶向抗原CD79b加抗原CD22对SLE B细胞功能的影响。
简介：为了评估CD79b/CD22的组合是否可以用于治疗患有自身免疫性疾病的人，我们使用来自患有系统性红斑狼疮(SLE)的患者的B细胞作为模型系统。测试CD79b/CD22组合(VR4447/VR4130)对已知参与B细胞功能但在SLE患者中与健康志愿者相比失调的信号蛋白的激活状态的影响。在该实验中，比较来自12个SLE患者和12个健康志愿者的B细胞的共靶向CD79b和CD22对其激活状态的影响。
方法:
PhosFlow测定:所有测定使用2x105个PBMC/孔进行。
在处理的样品中，以100nM的浓度测试抗原CD79b和抗原CD22特异性BYbe。来自健康志愿者和SLE患者的PBMC在37℃下与BYbe预孵育90分钟。在未处理的样品中，在该孵育期间简单地省略BYbe。此后，细胞用25μg/ml的山羊F(ab')2抗人IgM(SouthernBiotechnology)在37℃和5％CO2下激活10分钟，并通过加入固定剂(Cytofix-BDBiosciences)停止反应。在未刺激的样品中，在该孵育期间简单地省略抗人IgM。在室温下15分钟后，将细胞沉淀(500×g 5分钟)，然后在冰冷的perm buffer III(BD Biosciences)中重悬浮，然后在流式缓冲液(PBS+1％BSA+0.01％NaN3+2mM EDTA)洗涤两次。然后用抗CD20、抗磷酸化(p)NF-κB、抗pSyk、抗pAtk和抗pErk1&2染色细胞，并在室温下在黑暗中孵育1小时。最后，板在流式缓冲液中洗涤两次，然后在iQUE流式细胞仪(Intellicyt)上测量。然后计算B细胞中pNF-κB、pSyk、pAkt和pErk1&2表达的几何平均值(平均荧光强度，MFI)，并以图形形式表示。
结果：
图30显示与来自健康志愿者的那些相比，SLE患者B细胞中NF-κB、Syk、Akt和Erk1&2(未刺激的和未治疗的)的基线磷酸化升高。
图31至34显示在健康志愿者和SLE患者中，CD79/CD22Bybe可以同等地抑制pNF-κB、pSyk、pAkt和pErk1&2。
结论：
该数据显示，与健康志愿者相比，来自SLE患者的B细胞在任何体外刺激之前都被激活。在通过B细胞受体刺激细胞时，与背景信号相比，健康志愿者和SLE患者都显示出增强的激活水平。在健康志愿者和SLE患者中，该信号基本上被CD79b/CD22组合阻断。该数据表明CD79b/CD22组合可以抑制来自健康志愿者以及具有潜在自身免疫疾病的人的B细胞，表明该途径对B细胞激活具有根本重要性。
序列表
<110> UCB Pharma
<120> 具有针对CD79和CD22的特异性的分子
<130> G0224_WO
<150> GB1412658.5
<151> 2014-07-16
<160> 163
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4(7P14P)序列
<400> 1
Ala Ser Gly Gly Gly Arg Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys
20 25 30
Lys Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His
35 40
<210> 2
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4(7P14P)序列
<400> 2
gctagcggag gcggaagaat gaaacaactt gaacccaagg ttgaagaatt gcttccgaaa 60
aattatcact tggaaaatga ggttgccaga ttaaagaaat tagttggcga acgccatcac 120
catcaccatc ac 132
<210> 3
<211> 262
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 52SR4 ds scFv序列
<400> 3
Asp Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Ser Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Ser Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asp
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Asp Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro
130 135 140
Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Leu Leu Thr
145 150 155 160
Asp Tyr Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Cys Leu Glu
165 170 175
Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ser Ala
180 185 190
Leu Lys Ser Arg Leu Ser Val Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val
195 200 205
Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Gly Asp Ser Ala Arg Tyr Tyr
210 215 220
Cys Val Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser Ala Ala Ala His His His His His His Glu Gln Lys Leu
245 250 255
Ile Ser Glu Glu Asp Leu
260
<210> 4
<211> 792
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 52SR4 ds scFv序列
<400> 4
gatgcggtgg tgacccagga aagcgcgctg accagcagcc cgggcgaaac cgtgaccctg 60
acctgccgca gcagcaccgg cgcggtgacc accagcaact atgcgagctg ggtgcaggaa 120
aaaccggatc atctgtttac cggcctgatt ggcggcacca acaaccgcgc gccgggcgtg 180
ccggcgcgct ttagcggcag cctgattggc gataaagcgg cgctgaccat taccggcgcg 240
cagaccgaag atgaagcgat ttatttttgc gtgctgtggt atagcgacca ttgggtgttt 300
ggctgcggca ccaaactgac cgtgctgggt ggaggcggtg gctcaggcgg aggtggctca 360
ggcggtggcg ggtctggcgg cggcggcagc gatgtgcagc tgcagcagag cggcccgggc 420
ctggtggcgc cgagccagag cctgagcatt acctgcaccg tgagcggctt tctcctgacc 480
gattatggcg tgaactgggt gcgccagagc ccgggcaaat gcctggaatg gctgggcgtg 540
atttggggcg atggcattac cgattataac agcgcgctga aaagccgcct gagcgtgacc 600
aaagataaca gcaaaagcca ggtgtttctg aaaatgaaca gcctgcagag cggcgatagc 660
gcgcgctatt attgcgtgac cggcctgttt gattattggg gccagggcac caccctgacc 720
gtgagcagcg cggccgccca tcaccatcac catcacgaac agaaactgat tagcgaagaa 780
gatctgtaat ag 792
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 5
Asp Lys Thr His Thr Cys Ala Ala
1 5
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 6
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10
<210> 7
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 7
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Ala
<210> 8
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 8
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
20 25
<210> 9
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 9
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Gly Lys Pro Thr Leu
1 5 10 15
Tyr Asn Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr
20 25 30
<210> 10
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 10
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Gly Lys Pro Thr His
1 5 10 15
Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys Tyr
20 25 30
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 11
Asp Lys Thr His Thr Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
<210> 12
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 12
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp
1 5 10 15
Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala
20 25
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 13
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Ser Cys Pro Ala
1 5 10
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 14
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
1 5
<210> 15
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 15
Asp Lys Thr His Thr Ser
1 5
<210> 16
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 16
Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 17
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 18
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 18
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 19
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 19
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser
20
<210> 20
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 20
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 21
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gly Ala Ser Ala Ser
1 5 10
<210> 22
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是天然存在的氨基酸
<400> 22
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser
1 5 10 15
<210> 23
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa可以是天然存在的氨基酸
<400> 23
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Ala Ser Ala Ser
20
<210> 24
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa可以是天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> Xaa可以是天然存在的氨基酸
<400> 24
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser
20 25
<210> 25
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa可以是天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> Xaa可以是天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> Xaa可以是天然存在的氨基酸
<400> 25
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser
20 25 30
<210> 26
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是天然存在的氨基酸
<400> 26
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Ser Gly Ala Ser Ala Ser
1 5 10
<210> 27
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 27
Pro Gly Gly Asn Arg Gly Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr
1 5 10 15
Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln Ser His Tyr
20 25
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 28
Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr
1 5 10
<210> 29
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 29
Ala Thr Thr Thr Gly Ser
1 5
<210> 30
<211> 0
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 30
000
<210> 31
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 31
Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Ser Pro Pro Ser Lys Glu
1 5 10 15
Ser His Lys Ser Pro
20
<210> 32
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 32
Gly Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
1 5 10 15
<210> 33
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 33
Gly Gly Gly Gly Ile Ala Pro Ser Met Val Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 34
Gly Gly Gly Gly Lys Val Glu Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 35
Gly Gly Gly Gly Ser Met Lys Ser His Asp Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 36
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 36
Gly Gly Gly Gly Asn Leu Ile Thr Ile Val Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 37
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 37
Gly Gly Gly Gly Val Val Pro Ser Leu Pro Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 38
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 38
Gly Gly Glu Lys Ser Ile Pro Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 39
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 39
Arg Pro Leu Ser Tyr Arg Pro Pro Phe Pro Phe Gly Phe Pro Ser Val
1 5 10 15
Arg Pro
<210> 40
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 40
Tyr Pro Arg Ser Ile Tyr Ile Arg Arg Arg His Pro Ser Pro Ser Leu
1 5 10 15
Thr Thr
<210> 41
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 41
Thr Pro Ser His Leu Ser His Ile Leu Pro Ser Phe Gly Leu Pro Thr
1 5 10 15
Phe Asn
<210> 42
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 42
Arg Pro Val Ser Pro Phe Thr Phe Pro Arg Leu Ser Asn Ser Trp Leu
1 5 10 15
Pro Ala
<210> 43
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 43
Ser Pro Ala Ala His Phe Pro Arg Ser Ile Pro Arg Pro Gly Pro Ile
1 5 10 15
Arg Thr
<210> 44
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 44
Ala Pro Gly Pro Ser Ala Pro Ser His Arg Ser Leu Pro Ser Arg Ala
1 5 10 15
Phe Gly
<210> 45
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 45
Pro Arg Asn Ser Ile His Phe Leu His Pro Leu Leu Val Ala Pro Leu
1 5 10 15
Gly Ala
<210> 46
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 46
Met Pro Ser Leu Ser Gly Val Leu Gln Val Arg Tyr Leu Ser Pro Pro
1 5 10 15
Asp Leu
<210> 47
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 47
Ser Pro Gln Tyr Pro Ser Pro Leu Thr Leu Thr Leu Pro Pro His Pro
1 5 10 15
Ser Leu
<210> 48
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 48
Asn Pro Ser Leu Asn Pro Pro Ser Tyr Leu His Arg Ala Pro Ser Arg
1 5 10 15
Ile Ser
<210> 49
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 49
Leu Pro Trp Arg Thr Ser Leu Leu Pro Ser Leu Pro Leu Arg Arg Arg
1 5 10 15
Pro
<210> 50
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 50
Pro Pro Leu Phe Ala Lys Gly Pro Val Gly Leu Leu Ser Arg Ser Phe
1 5 10 15
Pro Pro
<210> 51
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 51
Val Pro Pro Ala Pro Val Val Ser Leu Arg Ser Ala His Ala Arg Pro
1 5 10 15
Pro Tyr
<210> 52
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 52
Leu Arg Pro Thr Pro Pro Arg Val Arg Ser Tyr Thr Cys Cys Pro Thr
1 5 10 15
Pro
<210> 53
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 53
Pro Asn Val Ala His Val Leu Pro Leu Leu Thr Val Pro Trp Asp Asn
1 5 10 15
Leu Arg
<210> 54
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 54
Cys Asn Pro Leu Leu Pro Leu Cys Ala Arg Ser Pro Ala Val Arg Thr
1 5 10 15
Phe Pro
<210> 55
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白结合肽
<400> 55
Asp Leu Cys Leu Arg Asp Trp Gly Cys Leu Trp
1 5 10
<210> 56
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白结合肽
<400> 56
Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp
1 5 10
<210> 57
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白结合肽
<400> 57
Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Gly Asp
1 5 10 15
<210> 58
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白结合肽
<400> 58
Gln Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp
1 5 10 15
Glu Asp Asp Glu
20
<210> 59
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白结合肽
<400> 59
Gln Gly Leu Ile Gly Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp
1 5 10 15
Gly Arg Ser Val
20
<210> 60
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白结合肽
<400> 60
Gln Gly Leu Ile Gly Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp
1 5 10 15
Gly Arg Ser Val Lys
20
<210> 61
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白结合肽
<400> 61
Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp Asp
1 5 10 15
<210> 62
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白结合肽
<400> 62
Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu
1 5 10 15
Asp Asp
<210> 63
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白结合肽
<400> 63
Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp Asp
1 5 10 15
<210> 64
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白结合肽
<400> 64
Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp
1 5 10 15
<210> 65
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白结合肽
<400> 65
Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Ala Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu
1 5 10 15
Asp Asp
<210> 66
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白结合肽
<400> 66
Glu Val Arg Ser Phe Cys Thr Arg Trp Pro Ala Glu Lys Ser Cys Lys
1 5 10 15
Pro Leu Arg Gly
20
<210> 67
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白结合肽
<400> 67
Arg Ala Pro Glu Ser Phe Val Cys Tyr Trp Glu Thr Ile Cys Phe Glu
1 5 10 15
Arg Ser Glu Gln
20
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白结合肽
<400> 68
Glu Met Cys Tyr Phe Pro Gly Ile Cys Trp Met
1 5 10
<210> 69
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 刚性接头
<400> 69
Gly Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
1 5 10
<210> 70
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 刚性接头
<400> 70
Pro Pro Pro Pro
1
<210> 71
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4447 VL区
<400> 71
Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Val Ser Gly
20 25 30
Asn Tyr Leu Ala Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Gln
35 40 45
Leu Ile His Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Cys Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Glu Phe Ser Cys
85 90 95
Ser Ser His Asp Cys Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val
100 105 110
Lys
<210> 72
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4447 VL区
<400> 72
gcccaagtgc tgacccagac tccgtcccct gtgtctgcac ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcaattgcc aggccagtca gagtgttgtt agtggcaatt acctagcctg gcttcagcag 120
aaaccagggc agcctcccaa gcaactgatc cattctgcat ccactctggc atctggggtc 180
tcatcgcggt tcagcggcag tggatctggg acacaattca ctctcaccat cagcggcgtg 240
cagtgtgaag atgctgccac ttactactgt ctaggcgaat ttagttgtag tagtcatgat 300
tgtaatgctt tcggcggagg gaccgaggtg gtggtcaaa 339
<210> 73
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4447 VH区
<400> 73
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Ala
20 25 30
Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Tyr Ile Glu Thr Gly Thr Thr Trp Tyr Ala Asn Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Thr Ile
65 70 75 80
Thr Ser Pro Ser Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Glu
85 90 95
Pro Tyr Glu Pro Tyr Asp Asp Ser Asn Ile Tyr Tyr Gly Met Asp Pro
100 105 110
Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 74
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔 Ab 4447 VH区
<400> 74
cagtcgctgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc 60
tgcaccgtct ctggattctc cctcagtaac tatgcagtaa gctgggtccg ccaggctcca 120
ggggagggac tggaatggat cgggatcatt tatattgaaa ctggtaccac atggtacgcg 180
aactgggcga aaggccgatt caccatctcc aaaacctcga ccacggtgga tctgacaatc 240
accagtccgt caaccgagga cacggccacc tatttctgtg ccagagaacc ttatgaacct 300
tatgatgata gtaatattta ctacggcatg gacccctggg gcccaggcac cctcgtcacc 360
gtctcgagt 369
<210> 75
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 75
Gln Ala Ser Gln Ser Val Val Ser Gly Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 76
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 76
Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
<210> 77
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3
<400> 77
Leu Gly Glu Phe Ser Cys Ser Ser His Asp Cys Asn Ala
1 5 10
<210> 78
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 78
Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Ala Val Ser
1 5 10
<210> 79
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 79
Ile Ile Tyr Ile Glu Thr Gly Thr Thr Trp Tyr Ala Asn Trp Ala Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 80
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 80
Glu Pro Tyr Glu Pro Tyr Asp Asp Ser Asn Ile Tyr Tyr Gly Met Asp
1 5 10 15
Pro
<210> 81
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4450 VL区
<400> 81
Ala Ile Asp Met Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Ile Tyr Asn Asn
20 25 30
Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Asp Gly Ile Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Glu
100 105 110
<210> 82
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4450 VL区
<400> 82
gccattgata tgacccagac tccatccccc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcaattgcc agtccagtca gagtatttat aataataatg acttagcctg gtatcagcag 120
aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tacgaagcat ccaaactggc atctggggtc 180
ccatcgcggt tcaaaggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagtggcgtg 240
cagtgtgatg atgctgccac ttactactgt cagggcggtg gtagtggtgg tgatggcatt 300
gctttcggcg gagggaccaa ggtggtcgtc gaa 333
<210> 83
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4450 VH区
<400> 83
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Ala Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Asn Tyr Val
20 25 30
Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Tyr Val Ser Gly Asn Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Val Thr
65 70 75 80
Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Ala
85 90 95
Gly His Ser Asp Val Asp Val Leu Asp Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 84
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4450 VH区
<400> 84
cagtcggtgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg gggcacccct gacactcacc 60
tgcacagtct ctggattctc cctcaataac tatgtaatgg tctgggtccg ccaggctcca 120
gggaaggggc tggaatggat cggaatcatt tatgttagtg gtaatgcata ctacgcgagc 180
tgggcaaaag gccgattcac catctccaga acctcgacca cggtggatct gaaagtgacc 240
agtctgacaa ccgaggacac ggccacctat ttctgtgcca gagatgctgg tcatagtgat 300
gtcgatgttt tggatatttg gggcccgggc accctcgtca ccgtctcgag t 351
<210> 85
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 85
Gln Ser Ser Gln Ser Ile Tyr Asn Asn Asn Asp Leu Ala
1 5 10
<210> 86
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 86
Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 87
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3
<400> 87
Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Asp Gly Ile Ala
1 5 10
<210> 88
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 88
Gly Phe Ser Leu Asn Asn Tyr Val Met Val
1 5 10
<210> 89
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 89
Ile Ile Tyr Val Ser Gly Asn Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 90
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 90
Asp Ala Gly His Ser Asp Val Asp Val Leu Asp Ile
1 5 10
<210> 91
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4120 VL区
<400> 91
Ala Phe Glu Leu Ser Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Tyr Gly Thr Ser Ser
85 90 95
Gly Gly Ser Trp Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 92
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4120 VL区
<400> 92
gcattcgaat tgagccagac tccagcctcc gtggaggcag ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcaagtgcc aggccagtca gagcattagc actgcattag cctggtatca gcagaaacca 120
gggcagcgtc ccaagctcct gatctatggt gcatccactc tggcatctgg ggtctcatcg 180
cggttcaaag gcagtggatc tgggacagag ttcactctca ccatcagcga cctggagtgt 240
gccgatgctg ccacttacta ctgtcaaagc tattatggta cgagtagtgg tggttcttgg 300
gctttcggcg gagggaccaa ggtggtcgtc aaa 333
<210> 93
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4120 VH区
<400> 93
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Cys Ile Tyr Thr Gly Ser Ser Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Pro Tyr Val Gly Tyr Gly Tyr Asp Leu Gln Tyr Leu Tyr
100 105 110
Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 94
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4120 VH区
<400> 94
cagtcattgg aggagtccgg gggagacctg gtcaagcctg gggcatccct gacactcacc 60
tgcacagcct ctggattctc cttcagtagt agctactaca tgtgctgggt ccgccagtct 120
ccagggaagg ggctggagtg gatcgcatgc atttatactg gtagtagtgg tgacacttac 180
tacgcgagct gggcgaaagg ccgattcacc atctccaaaa cctcgtcgac cacggtgtct 240
ctgcaaatga ccagtctgac agccgcggac acggccactt atttctgtgc gagagggcct 300
tatgttggtt atggttatga tcttcaatac ttgtacttgt ggggcccggg gaccctcgtc 360
accgtctcga gt 372
<210> 95
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 95
Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Ala Leu Ala
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 96
Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3
<400> 97
Gln Ser Tyr Tyr Gly Thr Ser Ser Gly Gly Ser Trp Ala
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 98
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr Tyr Met Cys
1 5 10
<210> 99
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 99
Cys Ile Tyr Thr Gly Ser Ser Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 100
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 100
Gly Pro Tyr Val Gly Tyr Gly Tyr Asp Leu Gln Tyr Leu Tyr Leu
1 5 10 15
<210> 101
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4126 VL区
<400> 101
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Gly Ser Gly
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser His Asp Tyr Ser Ser Val
85 90 95
Arg Ser Tyr Gly Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 102
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4126 VL区
<400> 102
gacattgtga tgacccagac tccagcctcc gtggaggcag ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcaagtgcc aggccagtca gaacattggt agtggtttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggcagcctc ccaagctcct gatctattat gcatccactc tggcatctgg ggtcccatca 180
aggttcaaag gcagtggatc tgggacacag ttcactctca ccatcagcga cctggagtgt 240
gccgacgctg ccacttacta ctgtcaaagt catgattata gtagtgttcg gagttacggt 300
aatgctttcg gcggagggac cgaggtggtg gtcaaa 336
<210> 103
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4126 VH区
<400> 103
Gln Gln His Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Ile Asp Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Cys Ile Asp Pro Ala Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Thr
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val
65 70 75 80
Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Arg Ala Tyr Gly Ser Gly Gly Ser Gly Tyr Ile Gly Cys Tyr
100 105 110
Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 104
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4126 VH区
<400> 104
cagcagcacc tggaggagtc cgggggaggc ctggtcaagc ctggaggaac cctgacactc 60
acctgcaaag cctctggaat cgacttcagt agctactact acatgtgctg ggtccgccag 120
gctccaggga aggggctgga gtgggtcgcg tgcattgatc ctgctagtag tggtactact 180
tactacgcga cctgggcgaa aggccgattc accatctcca aaacctcgtc gaccacggtg 240
actctgcaaa tgaccagtct gacagccgcg gacacggcca cctatttctg tgcgagggca 300
tatggtagtg ggggtagtgg ttatataggg tgctactttg acttgtgggg ccaaggcacc 360
ctcgtcaccg tctcgagt 378
<210> 105
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 105
Gln Ala Ser Gln Asn Ile Gly Ser Gly Leu Ala
1 5 10
<210> 106
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 106
Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3
<400> 107
Gln Ser His Asp Tyr Ser Ser Val Arg Ser Tyr Gly Asn Ala
1 5 10
<210> 108
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 108
Gly Ile Asp Phe Ser Ser Tyr Tyr Tyr Met Cys
1 5 10
<210> 109
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 109
Cys Ile Asp Pro Ala Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 110
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 110
Ala Tyr Gly Ser Gly Gly Ser Gly Tyr Ile Gly Cys Tyr Phe Asp Leu
1 5 10 15
<210> 111
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4127 VL区
<400> 111
Ala Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Lys Ser Val Pro Met Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Gly Asn
20 25 30
Asn Glu Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Arg Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Tyr Lys Ser Asp
85 90 95
Ser Asp Asp Gly Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Glu
100 105 110
<210> 112
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4127 VL区
<400> 112
gccatcgtga tgacccagac tccatcttcc aagtctgtcc ctatgggagg cacagtcacc 60
atcaactgcc aggccagtca gagtgtttat ggtaataacg aattatcctg gtatcagcag 120
aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tatttggcat ccaggctggc atcgggggtc 180
ccatcgcggt ttagcggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagcggcgtg 240
cagtgtgacg atgctgccac ttactactgt gcaggctata aaagtgatag tgatgatggc 300
actactttcg gcggagggac caaggtggtg gtcgaa 336
<210> 113
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4127 VH区
<400> 113
Gln Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Leu Tyr
20 25 30
Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Ile
35 40 45
Gly Cys Ile Asp Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Tyr Ser Ser Asp Trp Gly Val Arg Phe Asn Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 114
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4127 VH区
<400> 114
cagcagctgg aggagtccgg gggagacctg gtcaagcctg gggcatccct gacactcacc 60
tgcacagcct ctggattctc cttcagtaat ctctattaca tgtgttgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtt gatcggatgc attgatatta gcagtagtgg tagcacttac 180
tacgcgagct gggcgaaagg ccgattcacc atctccaaaa cctcgtcgac cacggtgact 240
ctgcagatga ccagtctgac agccgcggac acggccacct atttctgtgc gagagattac 300
tattctagtg actggggtgt tagatttaac ttgtggggcc agggcaccct cgtcaccgtc 360
tcgagt 366
<210> 115
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 115
Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Gly Asn Asn Glu Leu Ser
1 5 10
<210> 116
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 116
Leu Ala Ser Arg Leu Ala Ser
1 5
<210> 117
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3
<400> 117
Ala Gly Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Asp Gly Thr Thr
1 5 10
<210> 118
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 118
Gly Phe Ser Phe Ser Asn Leu Tyr Tyr Met Cys
1 5 10
<210> 119
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 119
Cys Ile Asp Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 120
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 120
Asp Tyr Tyr Ser Ser Asp Trp Gly Val Arg Phe Asn Leu
1 5 10
<210> 121
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4128 VL区
<400> 121
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ser Ser Lys Leu Ser Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Asp Arg Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ile Tyr Tyr Ser Ala Ser Gly
85 90 95
Ser Arg Asp Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Glu
100 105 110
<210> 122
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4128 VL区
<400> 122
gacattgtga tgacccagac tccagcctcc gtggaggcag ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcaagtgcc aggccagtga aagcattagc aactacttat cctggtttca gcagaaacca 120
gggcagcctc ccaagctcct gatctatgct tcatccaaac tgtcatctgg ggtcccatcg 180
cggttcaaag gcgatagatc tgggacagag tacactctca ccatcagcga cctggagtgt 240
gccgatgctg ccacttacta ctgtcaaatc tattattcgg ctagtggcag tcgtgattgg 300
actttcggcg gagggaccaa ggtggtcgtc gaa 333
<210> 123
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4128 VH区
<400> 123
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Glu Gly Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Lys Gly Ser Gly Leu Asp Phe Ser Ser Tyr Trp
20 25 30
Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala
35 40 45
Cys Ile Val Thr Gly Ser Ser Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu
65 70 75 80
Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Gly Ala Gly Tyr Ser Gly Ala Phe Asp Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 124
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4128 VH区
<400> 124
cagtcgttgg aggagtccgg gggagacctg gtccagcctg agggatccct gacactcacc 60
tgcaaaggct ccgggttaga cttcagtagc tactggatat gctgggtccg ccaggctcca 120
gggaaggggc tggagtggat cgcatgcatt gttactggta gtagtgataa cacttactac 180
gcgagctggg cgaaaggccg attcaccatc tccaaaacct cgtcgaccac ggtgactctg 240
caaatgacca gtctgacagc cgcggacacg gccacctatt tctgtgcgag aggtggtggt 300
gctggttata gtggtgcctt tgacttgtgg ggccaaggga ccctcgtcac cgtctcgagt 360
<210> 125
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 125
Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Asn Tyr Leu Ser
1 5 10
<210> 126
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 126
Ala Ser Ser Lys Leu Ser Ser
1 5
<210> 127
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3
<400> 127
Gln Ile Tyr Tyr Ser Ala Ser Gly Ser Arg Asp Trp Thr
1 5 10
<210> 128
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 128
Gly Leu Asp Phe Ser Ser Tyr Trp Ile Cys
1 5 10
<210> 129
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 129
Cys Ile Val Thr Gly Ser Ser Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 130
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 130
Gly Gly Gly Ala Gly Tyr Ser Gly Ala Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 131
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4130 VL区
<400> 131
Ala Ala Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Ser Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Asn Thr
20 25 30
Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu
65 70 75 80
Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Gly Phe Ser Ser
85 90 95
Ser Asp Leu Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 132
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4130 VL区
<400> 132
gccgccgtgc tgacccagac tccatctccc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcagc 60
atcagttgcc agtccagtca gagtgtttat aatacaaagg acttagcctg gtatcagcag 120
aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tatggtacat ccactctggc atctggggtc 180
tcatcacggt tcagcggcag tggatctggg acagagttca ctctcaccat cagcgacctg 240
gagtgtgacg atgctgccac ttattactgt caaggcggtt ttagtagtag tgatttgaat 300
gttttcggcg gagggaccaa ggtggtggtc aaa 333
<210> 133
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4130 VH区
<400> 133
Gln Gln Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Arg Pro Glu Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Gly Gly
20 25 30
Tyr Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Cys Ile Tyr Gly Gly Ile Asn Ser Val Thr Asp Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val
65 70 75 80
Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Val Ser Asn Ser Asp His Tyr Thr Arg Leu Asp Leu
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 134
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4130 VH区
<400> 134
cagcagcagc tggaggagtc cgggggagac ctggtcaggc ctgagggatc cctgacactc 60
acctgcacag cctctggatt cgacttcagt ggcggctacg acatttcctg ggtccgccag 120
gctccaggga aggggctgga gtggatcgga tgcatttatg gtggtatcaa tagtgtcact 180
gactacgcga gctgggcgaa aggccgagtc accatctcca aaacctcgtc gaccacggtg 240
actctgcaga tgaccagtct gacagccgcg gacacggcca cctatttctg tgcgagagat 300
gttagtaata gcgatcatta tactcggttg gatctctggg gccaaggcac cctggtcacc 360
gtctcgagt 369
<210> 135
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 135
Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Asn Thr Lys Asp Leu Ala
1 5 10
<210> 136
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 136
Gly Thr Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
<210> 137
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3
<400> 137
Gln Gly Gly Phe Ser Ser Ser Asp Leu Asn Val
1 5 10
<210> 138
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 138
Gly Phe Asp Phe Ser Gly Gly Tyr Asp Ile Ser
1 5 10
<210> 139
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 139
Cys Ile Tyr Gly Gly Ile Asn Ser Val Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 140
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 140
Asp Val Ser Asn Ser Asp His Tyr Thr Arg Leu Asp Leu
1 5 10
<210> 141
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4132 VL区
<400> 141
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Thr Ile Ser Ser Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Tyr Ser Ser Gly
85 90 95
Ser Asp Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 142
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4132 VL区
<400> 142
gacattgtga tgacccagac tccagcctcc gtggaggcag ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcaagtgcc aggccagtga gaccattagt agtagattag cctggtatca gcagaagcta 120
gggcagcctc ccaaactcct gatctattct gcatccactc tggcgtctgg ggtcccatcg 180
cggttcaaag gcagtggatc tgggacagag tacactctca ccatcagcgg cgtgcagtgt 240
gccgatgctg ccacttatta ctgtcaaggc tattattata gtagtggtag tgattatggt 300
ttcggcggag ggaccaaggt ggtcgtcaaa 330
<210> 143
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4132 VH区
<400> 143
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ser
35 40 45
Gly Cys Ile Asn Ser Gly Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Ala Ser Trp Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Asn Ser Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu
65 70 75 80
Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Trp Val Ser Gly Tyr Tyr Lys Asp Ala Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 144
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 4132 VH区
<400> 144
cagtcgttgg aggagtccgg gggagacctg gtcaagcctg gggcatccct gacactcacc 60
tgcacagcct ctggattctc cttcagtagc agctactgga tatgctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg gagcggatgc attaatagtg gtactggtgg cactgcctac 180
gcgagctggg cgaaaggccg attcaccatc tccaattcct cgtcgaccac ggtgactctt 240
caaatgacca gtctgacagc cgcggacacg gccacctatt tctgtgcgag agaatgggtt 300
agtggttatt ataaagatgc ttttgatctc tggggccagg gcaccctggt caccgtctcg 360
agt 363
<210> 145
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 145
Gln Ala Ser Glu Thr Ile Ser Ser Arg Leu Ala
1 5 10
<210> 146
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 146
Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
<210> 147
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3
<400> 147
Gln Gly Tyr Tyr Tyr Ser Ser Gly Ser Asp Tyr Gly
1 5 10
<210> 148
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 148
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr Trp Ile Cys
1 5 10
<210> 149
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 149
Cys Ile Asn Ser Gly Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 150
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 150
Glu Trp Val Ser Gly Tyr Tyr Lys Asp Ala Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 151
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1 dAbH1
<400> 151
Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr Ala Ile Asn
1 5 10
<210> 152
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2 dAbH1
<400> 152
Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 153
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3 dAbH1
<400> 153
Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 154
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1 dAbL1
<400> 154
Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn Phe Leu Ser
1 5 10
<210> 155
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2 dAbL1
<400> 155
Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser
1 5
<210> 156
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3 dAbL1
<400> 156
Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr Thr
1 5 10
<210> 157
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗白蛋白抗体的重链可变结构域（无ds）
<400> 157
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 158
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗白蛋白抗体的重链可变结构域（ds）
<400> 158
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 159
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗白蛋白抗体的轻链可变结构域（无ds）
<400> 159
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn
20 25 30
Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile
85 90 95
Ser Asp Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
<210> 160
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗白蛋白抗体的轻链可变结构域（ds）
<400> 160
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Gly Lys Pro Thr His
1 5 10 15
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
20 25 30
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn
35 40 45
Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
50 55 60
Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
65 70 75 80
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
85 90 95
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile
100 105 110
Ser Asp Thr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
115 120 125
<210> 161
<211> 847
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD22
<400> 161
Met His Leu Leu Gly Pro Trp Leu Leu Leu Leu Val Leu Glu Tyr Leu
1 5 10 15
Ala Phe Ser Asp Ser Ser Lys Trp Val Phe Glu His Pro Glu Thr Leu
20 25 30
Tyr Ala Trp Glu Gly Ala Cys Val Trp Ile Pro Cys Thr Tyr Arg Ala
35 40 45
Leu Asp Gly Asp Leu Glu Ser Phe Ile Leu Phe His Asn Pro Glu Tyr
50 55 60
Asn Lys Asn Thr Ser Lys Phe Asp Gly Thr Arg Leu Tyr Glu Ser Thr
65 70 75 80
Lys Asp Gly Lys Val Pro Ser Glu Gln Lys Arg Val Gln Phe Leu Gly
85 90 95
Asp Lys Asn Lys Asn Cys Thr Leu Ser Ile His Pro Val His Leu Asn
100 105 110
Asp Ser Gly Gln Leu Gly Leu Arg Met Glu Ser Lys Thr Glu Lys Trp
115 120 125
Met Glu Arg Ile His Leu Asn Val Ser Glu Arg Pro Phe Pro Pro His
130 135 140
Ile Gln Leu Pro Pro Glu Ile Gln Glu Ser Gln Glu Val Thr Leu Thr
145 150 155 160
Cys Leu Leu Asn Phe Ser Cys Tyr Gly Tyr Pro Ile Gln Leu Gln Trp
165 170 175
Leu Leu Glu Gly Val Pro Met Arg Gln Ala Ala Val Thr Ser Thr Ser
180 185 190
Leu Thr Ile Lys Ser Val Phe Thr Arg Ser Glu Leu Lys Phe Ser Pro
195 200 205
Gln Trp Ser His His Gly Lys Ile Val Thr Cys Gln Leu Gln Asp Ala
210 215 220
Asp Gly Lys Phe Leu Ser Asn Asp Thr Val Gln Leu Asn Val Lys His
225 230 235 240
Thr Pro Lys Leu Glu Ile Lys Val Thr Pro Ser Asp Ala Ile Val Arg
245 250 255
Glu Gly Asp Ser Val Thr Met Thr Cys Glu Val Ser Ser Ser Asn Pro
260 265 270
Glu Tyr Thr Thr Val Ser Trp Leu Lys Asp Gly Thr Ser Leu Lys Lys
275 280 285
Gln Asn Thr Phe Thr Leu Asn Leu Arg Glu Val Thr Lys Asp Gln Ser
290 295 300
Gly Lys Tyr Cys Cys Gln Val Ser Asn Asp Val Gly Pro Gly Arg Ser
305 310 315 320
Glu Glu Val Phe Leu Gln Val Gln Tyr Ala Pro Glu Pro Ser Thr Val
325 330 335
Gln Ile Leu His Ser Pro Ala Val Glu Gly Ser Gln Val Glu Phe Leu
340 345 350
Cys Met Ser Leu Ala Asn Pro Leu Pro Thr Asn Tyr Thr Trp Tyr His
355 360 365
Asn Gly Lys Glu Met Gln Gly Arg Thr Glu Glu Lys Val His Ile Pro
370 375 380
Lys Ile Leu Pro Trp His Ala Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Glu Asn
385 390 395 400
Ile Leu Gly Thr Gly Gln Arg Gly Pro Gly Ala Glu Leu Asp Val Gln
405 410 415
Tyr Pro Pro Lys Lys Val Thr Thr Val Ile Gln Asn Pro Met Pro Ile
420 425 430
Arg Glu Gly Asp Thr Val Thr Leu Ser Cys Asn Tyr Asn Ser Ser Asn
435 440 445
Pro Ser Val Thr Arg Tyr Glu Trp Lys Pro His Gly Ala Trp Glu Glu
450 455 460
Pro Ser Leu Gly Val Leu Lys Ile Gln Asn Val Gly Trp Asp Asn Thr
465 470 475 480
Thr Ile Ala Cys Ala Ala Cys Asn Ser Trp Cys Ser Trp Ala Ser Pro
485 490 495
Val Ala Leu Asn Val Gln Tyr Ala Pro Arg Asp Val Arg Val Arg Lys
500 505 510
Ile Lys Pro Leu Ser Glu Ile His Ser Gly Asn Ser Val Ser Leu Gln
515 520 525
Cys Asp Phe Ser Ser Ser His Pro Lys Glu Val Gln Phe Phe Trp Glu
530 535 540
Lys Asn Gly Arg Leu Leu Gly Lys Glu Ser Gln Leu Asn Phe Asp Ser
545 550 555 560
Ile Ser Pro Glu Asp Ala Gly Ser Tyr Ser Cys Trp Val Asn Asn Ser
565 570 575
Ile Gly Gln Thr Ala Ser Lys Ala Trp Thr Leu Glu Val Leu Tyr Ala
580 585 590
Pro Arg Arg Leu Arg Val Ser Met Ser Pro Gly Asp Gln Val Met Glu
595 600 605
Gly Lys Ser Ala Thr Leu Thr Cys Glu Ser Asp Ala Asn Pro Pro Val
610 615 620
Ser His Tyr Thr Trp Phe Asp Trp Asn Asn Gln Ser Leu Pro Tyr His
625 630 635 640
Ser Gln Lys Leu Arg Leu Glu Pro Val Lys Val Gln His Ser Gly Ala
645 650 655
Tyr Trp Cys Gln Gly Thr Asn Ser Val Gly Lys Gly Arg Ser Pro Leu
660 665 670
Ser Thr Leu Thr Val Tyr Tyr Ser Pro Glu Thr Ile Gly Arg Arg Val
675 680 685
Ala Val Gly Leu Gly Ser Cys Leu Ala Ile Leu Ile Leu Ala Ile Cys
690 695 700
Gly Leu Lys Leu Gln Arg Arg Trp Lys Arg Thr Gln Ser Gln Gln Gly
705 710 715 720
Leu Gln Glu Asn Ser Ser Gly Gln Ser Phe Phe Val Arg Asn Lys Lys
725 730 735
Val Arg Arg Ala Pro Leu Ser Glu Gly Pro His Ser Leu Gly Cys Tyr
740 745 750
Asn Pro Met Met Glu Asp Gly Ile Ser Tyr Thr Thr Leu Arg Phe Pro
755 760 765
Glu Met Asn Ile Pro Arg Thr Gly Asp Ala Glu Ser Ser Glu Met Gln
770 775 780
Arg Pro Pro Pro Asp Cys Asp Asp Thr Val Thr Tyr Ser Ala Leu His
785 790 795 800
Lys Arg Gln Val Gly Asp Tyr Glu Asn Val Ile Pro Asp Phe Pro Glu
805 810 815
Asp Glu Gly Ile His Tyr Ser Glu Leu Ile Gln Phe Gly Val Gly Glu
820 825 830
Arg Pro Gln Ala Gln Glu Asn Val Asp Tyr Val Ile Leu Lys His
835 840 845
<210> 162
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD79a
<400> 162
Met Pro Gly Gly Pro Gly Val Leu Gln Ala Leu Pro Ala Thr Ile Phe
1 5 10 15
Leu Leu Phe Leu Leu Ser Ala Val Tyr Leu Gly Pro Gly Cys Gln Ala
20 25 30
Leu Trp Met His Lys Val Pro Ala Ser Leu Met Val Ser Leu Gly Glu
35 40 45
Asp Ala His Phe Gln Cys Pro His Asn Ser Ser Asn Asn Ala Asn Val
50 55 60
Thr Trp Trp Arg Val Leu His Gly Asn Tyr Thr Trp Pro Pro Glu Phe
65 70 75 80
Leu Gly Pro Gly Glu Asp Pro Asn Gly Thr Leu Ile Ile Gln Asn Val
85 90 95
Asn Lys Ser His Gly Gly Ile Tyr Val Cys Arg Val Gln Glu Gly Asn
100 105 110
Glu Ser Tyr Gln Gln Ser Cys Gly Thr Tyr Leu Arg Val Arg Gln Pro
115 120 125
Pro Pro Arg Pro Phe Leu Asp Met Gly Glu Gly Thr Lys Asn Arg Ile
130 135 140
Ile Thr Ala Glu Gly Ile Ile Leu Leu Phe Cys Ala Val Val Pro Gly
145 150 155 160
Thr Leu Leu Leu Phe Arg Lys Arg Trp Gln Asn Glu Lys Leu Gly Leu
165 170 175
Asp Ala Gly Asp Glu Tyr Glu Asp Glu Asn Leu Tyr Glu Gly Leu Asn
180 185 190
Leu Asp Asp Cys Ser Met Tyr Glu Asp Ile Ser Arg Gly Leu Gln Gly
195 200 205
Thr Tyr Gln Asp Val Gly Ser Leu Asn Ile Gly Asp Val Gln Leu Glu
210 215 220
Lys Pro
225
<210> 163
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD79b
<400> 163
Met Ala Arg Leu Ala Leu Ser Pro Val Pro Ser His Trp Met Val Ala
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Ser Ala Glu Pro Val Pro Ala Ala Arg Ser Glu
20 25 30
Asp Arg Tyr Arg Asn Pro Lys Gly Ser Ala Cys Ser Arg Ile Trp Gln
35 40 45
Ser Pro Arg Phe Ile Ala Arg Lys Arg Gly Phe Thr Val Lys Met His
50 55 60
Cys Tyr Met Asn Ser Ala Ser Gly Asn Val Ser Trp Leu Trp Lys Gln
65 70 75 80
Glu Met Asp Glu Asn Pro Gln Gln Leu Lys Leu Glu Lys Gly Arg Met
85 90 95
Glu Glu Ser Gln Asn Glu Ser Leu Ala Thr Leu Thr Ile Gln Gly Ile
100 105 110
Arg Phe Glu Asp Asn Gly Ile Tyr Phe Cys Gln Gln Lys Cys Asn Asn
115 120 125
Thr Ser Glu Val Tyr Gln Gly Cys Gly Thr Glu Leu Arg Val Met Gly
130 135 140
Phe Ser Thr Leu Ala Gln Leu Lys Gln Arg Asn Thr Leu Lys Asp Gly
145 150 155 160
Ile Ile Met Ile Gln Thr Leu Leu Ile Ile Leu Phe Ile Ile Val Pro
165 170 175
Ile Phe Leu Leu Leu Asp Lys Asp Asp Ser Lys Ala Gly Met Glu Glu
180 185 190
Asp His Thr Tyr Glu Gly Leu Asp Ile Asp Gln Thr Ala Thr Tyr Glu
195 200 205
Asp Ile Val Thr Leu Arg Thr Gly Glu Val Lys Trp Ser Val Gly Glu
210 215 220
His Pro Gly Gln Glu
225

Claims (37)

1.一种多特异性分子，其包含特异性针对抗原CD22的结合结构域和特异性针对抗原CD79a和/或CD79b的结合结构域。
2.权利要求1的多特异性分子，其中结合结构域包含特异性针对相关抗原的抗体可变区。
3.权利要求1或2的多特异性分子，其中每个结合结构域包含两个抗体可变结构域。
4.权利要求3的多特异性分子，其中两个抗体可变结构域是VH/VL对。
5.权利要求1至4的任一项的多特异性分子，其中所述分子是双特异性或三特异性的。
6.权利要求1至5的任一项的多特异性分子，其中所述分子是融合蛋白。
7.权利要求1至4的任一项的多特异性分子，其中分子形式选自双抗体、sc双抗体、三抗体、串联scFv、FabFv、Fab’Fv、FabdsFv、Fab-scFv、Fab-dsscFv、Fab-(dsscFv)2、diFab、diFab’、三体、串联scFv-Fc、scFv-Fc-scFv、sc双抗体-Fc、sc双抗体-CH3、Ig-scFv、scFv-Ig、V-Ig、Ig-V、Duobody和DVD-Ig。
8.权利要求1至7的任一项的多特异性分子，其中每个结合结构域是单特异性的。
9.权利要求1至8的任一项的多特异性分子，其中多特异性分子包含不超过一个特异性针对CD22的结合结构域和不超过一个特异性针对CD79a和/或CD79b的结合结构域。
10.权利要求1至9的任一项的多特异性分子，其中特异性针对CD22的结合结构域和特异性针对CD79a和/或CD79b的结合结构域独立地选自Fab、scFv、Fv、dsFv和dsscFv。
11.权利要求1至10的任一项的多特异性分子，其中特异性针对CD79b的结合结构域包含分别对应于CDRH1、CDRH2和CDRH3具有SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79和SEQ ID NO：80给出的序列的3个重链CDR。
12.权利要求1至10的任一项的多特异性分子，其中特异性针对CD79b的结合结构域包含分别对应于CDRH1、CDRH2和CDRH3具有SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：90给出的序列的3个重链CDR。
13.权利要求1至12的任一项的多特异性分子，其中特异性针对CD79b的结合结构域包含分别对应于CDRL1、CDRL2和CDRL3具有SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76和SEQ ID NO：77给出的序列的3个轻链CDR。
14.权利要求1至12的任一项的多特异性分子，其中特异性针对CD79b的结合结构域包含分别对应于CDRL1、CDRL2和CDRL3具有SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：87给出的序列的3个轻链CDR。
15.权利要求1至14的任一项的多特异性分子，其中特异性针对CD22的结合结构域包含分别对应于CDRH1、CDRH2和CDRH3具有SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：100给出的序列的3个重链CDR。
16.权利要求1至14的任一项的多特异性分子，其中特异性针对CD22的结合结构域包含分别对应于CDRH1、CDRH2和CDRH3具有SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109和SEQ ID NO：110给出的序列的3个重链CDR。
17.权利要求1至14的任一项的多特异性分子，其中特异性针对CD22的结合结构域包含分别对应于CDRH1、CDRH2和CDRH3具有SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：119和SEQ ID NO：120给出的序列的3个重链CDR。
18.权利要求1至14的任一项的多特异性分子，其中特异性针对CD22的结合结构域包含分别对应于CDRH1、CDRH2和CDRH3具有SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：129和SEQ ID NO：130给出的序列的3个重链CDR。
19.权利要求1至14的任一项的多特异性分子，其中特异性针对CD22的结合结构域包含分别对应于CDRH1、CDRH2和CDRH3具有SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：139和SEQ ID NO：140给出的序列的3个重链CDR。
20.权利要求1至14的任一项的多特异性分子，其中特异性针对CD22的结合结构域包含分别对应于CDRH1、CDRH2和CDRH3具有SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149和SEQ ID NO：150给出的序列的3个重链CDR。
21.权利要求1至20的任一项的多特异性分子，其中特异性针对CD22的结合结构域包含分别对应于CDRL1、CDRL2和CDRL3具有SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96和SEQ ID NO：97给出的序列的3个轻链CDR。
22.权利要求1至20的任一项的多特异性分子，其中特异性针对CD22的结合结构域包含分别对应于CDRL1、CDRL2和CDRL3具有SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106和SEQ ID NO：107给出的序列的3个轻链CDR。
23.权利要求1至20的任一项的多特异性分子，其中特异性针对CD22的结合结构域包含分别对应于CDRL1、CDRL2和CDRL3具有SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：117给出的序列的3个轻链CDR。
24.权利要求1至20的任一项的多特异性分子，其中特异性针对CD22的结合结构域包含分别对应于CDRL1、CDRL2和CDRL3具有SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126和SEQ ID NO：127给出的序列的3个轻链CDR。
25.权利要求1至20的任一项的多特异性分子，其中特异性针对CD22的结合结构域包含分别对应于CDRL1、CDRL2和CDRL3具有SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136和SEQ ID NO：137给出的序列的3个轻链CDR。
26.权利要求1至20的任一项的多特异性分子，其中特异性针对CD22的结合结构域包含分别对应于CDRL1、CDRL2和CDRL3具有SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146和SEQ ID NO：147给出的序列的3个轻链CDR。
27.权利要求1至26的任一项的多特异性分子，其中所述结合结构域是人源化的。
28.权利要求11至27的任一项的多特异性分子，其中一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸已经被另一个氨基酸取代。
29.权利要求28的多特异性分子，其中一个或多个半胱氨酸残基已经被另一个氨基酸取代。
30.权利要求28或29的多特异性分子，其中已经通过取代一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸来除去一个或多个天冬氨酸异构化位点和/或天冬酰胺脱酰胺位点和/或糖基化位点。
31.权利要求1至30的任一项的多特异性分子，其还包含特异性针对血清白蛋白诸如人血清白蛋白的结合结构域。
32.包含如权利要求1至31的任一项中所定义的一个或多个多特异性蛋白质的组合物。
33.编码如权利要求1至31的任一项中所定义的多特异性蛋白质或其成分的核苷酸序列。
34.包含权利要求33中所定义的核苷酸序列的载体。
35.权利要求1至31的任一项的多特异性蛋白质或权利要求32的组合物，其用于治疗。
36.权利要求1至31的任一项的多特异性蛋白质或权利要求30的组合物用于制备用于治疗的药物中的用途，特别是用于治疗本文所述的病况或病症。
37.一种治疗患者的方法，其包括施用治疗有效量的权利要求1至31的任一项的多特异性蛋白质或权利要求32的组合物。
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