ES2537207T3 - Métodos para la generación de anticuerpos multiespecíficos y multivalentes - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo monoclonal aislado que porta una especificidad diferente en cada sitio de combinación y que consiste en dos copias de un único polipéptido de cadena pesada y una primera cadena ligera y una segunda cadena ligera, en el que las primera y segunda cadenas ligeras son diferentes.
Description
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de 96 pocillos (96wpl) de líneas celulares que expresan anticuerpo mono Kappa (KK), mono Lambda (LL) y biespecífico Kappa Lambda (KL) cinco semanas después de la transfección en dos experimentos independientes. Los niveles de producción de anticuerpo se determinaron por ELISA. mAb significa anticuerpo monoclonal. Las Figuras 15C y 15D son una serie de gráficas que representan la productividad de anticuerpos en cultivos discontinuos con crecimiento excesivo en placas de 24 pocillos (24wpl) con agitación de mono Kappa (KK), mono Lambda (LL) y Kappa biespecífico. La Figura 16A es una ilustración que representa los resultados del análisis SDS-PAGE reducido de moléculas de IgG κ monoespecíficas (es decir, moléculas monoespecíficas que tienen cadenas ligeras Kappa, también denominadas en el presente documento moléculas "Mono κ"), moléculas de IgG λ monoespecíficas (es decir, moléculas monoespecíficas que tiene cadenas ligeras Lambda, también denominadas en el presente documento moléculas "mono λ"), y anticuerpos κλ (es decir, anticuerpos que tienen cadenas ligeras tanto Kappa como Lambda) mediante las etapas de purificación descritas anteriormente. La Figura 16B es una ilustración que representa los resultados del análisis SDS-PAGE reducido de anticuerpos mono κ, mono λ y κλ obtenidos siguiendo las etapas de elución descritas anteriormente. En las Figuras 16A y 16B, el gel se tiñó usando simply blue, y E significa fracción de elución, FT significa flujo continuo de columna y MM significa marcador de peso molecular. La Figura 16C es una ilustración que representa el análisis en gel de isoelectroenfoque (IEF) de moléculas de IgG monoespecíficas purificadas IgG (κκ y λλ) y la molécula de IgG biespecífica ((κλ). Las Figuras 17A-D son una serie de gráficas e ilustraciones que representan que los métodos para generar anticuerpos biespecíficos de la invención producen anticuerpos que incluyen tanto una cadena ligera Kappa como una cadena ligera Lambda y que los anticuerpos purificados muestran biespecificidad. Las gráficas representan los resultados de ELISA usando cuerpo κλ purificado contra hIFNγ e IL6RC. El ELISA se realizó usando anticuerpos de detección anti-Kappa o anti-Lambda como se indica. Las Figuras 17A-D ilustran que la cadena ligera Lambda se une con hIFNγ, mientras que la cadena ligera Kappa se une con IL6RC. NI-0501 es un anticuerpo de cadena ligera Lambda anti-hIFNγ de control, y NI-1201 es un anticuerpo de cadena ligera Kappa anti-IL6RC de control. La Figura 18 es una ilustración de un gel de IEF de anticuerpos monoespecíficos y biespecíficos diferentes, que indica que la diferencia en pI puede variar dependiendo de la secuencia variable ligera de anticuerpo. Carril 1, IgGκ anti-NusA; Carril 2, IgGκλ anti-NusA/anti-INFγ; Carril 3, IgGλ anti-INFγ; Carril 4, IgGκ anti-IL6RC; Carril 5, IgGκλ anti-IL6RC/anti-IL6RC; Carril 6, IgGλ anti-IL6RC. La Figura 19 es una representación esquemática de tres proteínas híbridas diferentes obtenidas combinando un gen Lambda variable y un gen constante Kappa. Los puntos de fusión difieren entre los diferentes híbridos: en 19A, VLambda fusionado con CKappa; en 19B, VLambda hasta CDR3 fusionado con VKappa FR4 y CKappa; y en 19C, VLambda y los primeros cuatro aminoácidos de CLambda y CKappa excluyendo los primeros cuatro aminoácidos. CDR, Región Determinante de Complementariedad; FR, región marco conservada. La Figura 20 es una ilustración del análisis de dos construcciones de cadena ligera híbridas en un sistema Bionalyzer 2100 usando una microplaca de Proteína 80 (Agilent Technologies). Se indica el electroferograma correspondiente a la imagen en gel. La Figura 21 es una serie de gráficas que representan los resultados del ELISA de respuesta a dosis usando scFv específico para INFγ (A) o IL6RC (B) en el que el dominio VH fue el VH común originalmente seleccionado (curvas superiores) u otros dominios VH que permiten la expresión y purificación de scFv (curvas inferiores). La Figura 22 es una gráfica que representa los resultados obtenidos para la cuantificación de anticuerpo biespecífico IgGκλ usando un formato de ELISA de tipo sándwich. La respuesta a dosis se realizó usando anticuerpo biespecífico purificado solo o mezclado con anticuerpos Kappa o Lambda monoespecíficos a diferentes relaciones según se indica, para evaluar la interferencia de estas moléculas en el ensayo.
Descripción detallada
Para superar las limitaciones de los productos terapéuticos de anticuerpo monoclonal y monovalente que solamente pueden dirigirse a un único antígeno o para superar las limitaciones de las combinaciones de productos terapéuticos de anticuerpos monovalentes, se han dirigido intensos esfuerzos a dirección de múltiples antígenos usando formatos de anticuerpos biespecíficos. Dichos anticuerpos que portan más de una especificidad son de interés en biotecnología y tienen gran potencial como agentes terapéuticos que permiten nuevos enfoques terapéuticos (Fischer y Léger, Pathobiology 2007; 74:3-14; Morrison SL Nature Biotechnol 2007; 25:1233-1234). Los anticuerpos biespecíficos son ventajosos ya que permiten dirección múltiple, aumentan el potencial terapéutico, abordan la redundancia de los sistemas biológicos, y proporcionan nuevos mecanismos de acción mediante capacidades tales como redirección y/o especificidad aumentada. A medida que las dianas terapéuticas individuales validadas se agotan más, las combinaciones permitidas por anticuerpos biespecíficos proporcionan un nuevo universo expansivo de dianas para agentes terapéuticos y aplicaciones.
Se han usado varias estrategias para generar dichas moléculas biespecíficos tales como reticulación química de fragmentos de anticuerpo, heterodimerización forzada, tecnología de cuadroma, fusión de fragmentos de anticuerpo mediante enlazadores polipeptídicos y uso de anticuerpos de un único dominio. La disponibilidad de tecnologías de ADN recombinante ha conducido a la generación de una multitud de formatos de anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Ridgway JB et al. (1996) Protein Eng 9: 617-621). Se han introducido frecuentemente enlazadores y mutaciones en diferentes regiones del anticuerpo para forzar la formación de heterodímeros o para conectar
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Características y limitaciones de los formatos de anticuerpos biespecíficos
Las características clave de los formatos de anticuerpos biespecíficos actuales se resumen en la Tabla I. Todos los formatos excepto los basados en los dominios humanos contienen secuencias que no son de origen humano o contienen secuencias proteicas no humanas generadas por la fusión de diferentes dominios proteicos. La mayoría de los formatos que usan enlazadores conducen a problemas de fabricación potenciales debido a la agregación de dominios. La presencia de secuencias ajenas y características de estabilidad desfavorables pueden aumentar significativamente potencialmente el riesgo de inmunogenicidad. Una diferencia clave entre los formatos es la valencia de sus sitios de unión que está directamente ligada a su capacidad para mediar en la redirección o unión selectiva mediadas por avidez. Por lo tanto todos los formatos no pueden permitir todos los modos de acción. En particular, el único formato que es indistinguible de una inmunoglobulina completamente humana no puede mediar en la redirección o actividades de selectividad aumentadas. Por lo tanto existe la necesidad de generar nuevos anticuerpos biespecíficos con propiedades favorables para el desarrollo de productos terapéuticos, es decir, que sean indistinguibles de una molécula de inmunoglobulina completamente humana, buenas propiedades de fabricación y permitir el espectro completo de posibles modos de acción.
Tabla I. Características de diferentes formatos de anticuerpos biespecíficos.
- Fragmentos reticulados
- Cuadromas Formatos recombinantes – fragmentos de anticuerpos unidos Formatos recombinantes – heterodímeros forzados Formatos recombinantes – basados en dominios individuales
- Modo de unión
- Bivalente Bivalente Tetravalente (o más) Bivalente Tetravalente
- Modo de acción
- DI, R, IS DI, R, IS DI, IS DI, R, IS DI
- Fabricación
- Compleja, proceso multietapa Purificación a partir de una mezcla compleja de anticuerpos Puede ser difícil debido a la inestabilidad y agregación de los fragmentos de anticuerpos Mezcla sencilla (la mayor parte del producto es biespecífico) Sencilla
- Origen de secuencias
- Humano, sitios modificados por el proceso de reticulación Secuencia de roedores Humano, presencia de enlazadores y uniones proteicas no humanas Humano, presencia de mutaciones para forzar la heterodimerización Humano
- Modos de acción: DI, Inhibición Doble; R, Redirección; IS, Selectividad Aumentada
Métodos mejorados para generar anticuerpos biespecíficos y bivalentes.
La presente invención proporciona métodos para generar anticuerpos biespecíficos que tienen una estructura idéntica a una inmunoglobulina humana. Este tipo de molécula está compuesta de dos copias de un único polipéptido de cadena pesada, una primera región variable de cadena ligera fusionada con un dominio constante Kappa y una segunda región variable de cadena ligera fusionada con un dominio constante Lambda. Cada sitio de combinación presenta una especificidad de antígeno diferente a la que contribuyen la cadena tanto pesada como ligera. Las regiones variables de cadena ligera pueden ser de la familia Lambda o Kappa y se fusionan preferentemente con dominios constantes Lambda y Kappa, respectivamente. Esto se prefiere para evitar la generación de uniones polipeptídicas no naturales. Sin embargo también es posible obtener anticuerpos biespecíficos de la invención fusionando un dominio variable de cadena ligera Kappa con un dominio constante Lambda para una primera especificidad y fusionando un dominio variable de cadena ligera Lambda con un dominio constante Kappa para la segunda especificidad (Figura 3). Los anticuerpos biespecíficos descritos en el presente documento también se denominan anticuerpos IgGκλ o "cuerpos κλ", un nuevo formato de IgG biespecífico completamente humano. Este formato de cuerpo κλ permite la purificación de afinidad de un anticuerpo biespecífico que es indistinguible de una molécula de IgG convencional con características que son indistinguibles de un anticuerpo monoclonal convencional y, por lo tanto, favorables en comparación con formatos previos.
Una etapa esencial del método es la identificación de dos regiones Fv de anticuerpo (cada una compuesta por un dominio variable de cadena ligera y variable de cadena pesada) que tienen diferentes especificidades de antígenos que comparten el mismo dominio variable de cadena pesada. Se han descrito numerosos métodos para la generación de anticuerpos monoclonales y fragmentos de los mismos. (Véase, por ejemplo, Antibodies: A
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seleccionados aleatoriamente indicó que > 90 % de los clones tenían integrada una secuencia de CDRL3 que estaba en fase y era por lo tanto potencialmente funcional.
EJEMPLO 2: Rescate de fagos de las Bibliotecas
Cada biblioteca se rescató independientemente de acuerdo con procedimientos de presentación de fagos convencionales brevemente resumidos a continuación. Se añadió un volumen de células de las alícuotas de biblioteca congeladas suficientes para abarcar al menos 10 veces la diversidad teórica de la biblioteca a 500 ml de TYAG2x (ampicilina 100 µg/ml; glucosa al 2 %) y se dejó crecer a 37 °C con agitación (240 rpm) hasta que se alcanzó una DO600 de 0,3 a 0,5. El cultivo se superinfectó después con fago auxiliar MK13KO7 y se incubó durante una hora a 37 °C (150 rpm). El medio se cambió después centrifugando las células a 2000 rpm durante 10 minutos, retirando el medio y resuspendiendo el sedimento en 500 ml de TY-AK2x (ampicilina 100 µg/ml; kanamicina 50 µg/ml). El cultivo se dejó crecer después durante una noche a 30 °C (240 rpm). El cultivo se centrifugó a 4000 rpm durante 20 minutos para sedimentar las células. El sobrenadante se recogió y se añadió 30 % (v/v) de PEG 8000 (20 %)/NaCl 2,5 M para precipitar las partículas de fago incubando la mezcla 1 hora en hielo. Las partículas de fagos se recogieron por centrifugación a 10.000 rpm durante 30 minutos y se resuspendieron en 10 ml de tampón TE (Tris-HCl 10 mM pH 8,0; EDTA 1 mM). La solución resuspendida se centrifugó a 10.000 rpm para eliminar los residuos bacterianos y se repitió el procedimiento de precipitación. Después de la resuspensión final, el fago se valoró por infección de E. coli y absorción a 260 nm. El nivel de presentación de scFv en la superficie del fago también se evaluó por análisis de transferencia de Western usando un anticuerpo monoclonal anti-c-myc. Se almacenó el fago purificado de diferentes bibliotecas congelado a -80 °C después de la adición de glicerol hasta una concentración final de 15 % (p/v).
EJEMPLO 3: Secciones de presentación de fagos usando bibliotecas de cadena pesada fijas
Selecciones en fase líquida frente a proteína de fusión hCXCL10-NusA biotinilada (hCXCL10-NusA) y complejo de receptor de hIL6 biotinilado (hIL6RC): se mantuvieron separadas alícuotas de las bibliotecas de fagos VH-Vκ y VHVλ (1011-1012 Ufp) y se bloquearon con PBS que contenía leche desnatada al 3 % (p/v) durante una hora a temperatura ambiente en un mezclador rotatorio. El fago bloqueado se deseleccionó después en perlas magnéticas de estreptavidina (Dynal M-280) durante una hora a temperatura ambiente en un mezclador rotatorio. El fago deseleccionado se incubó después con hCXCL10-NusA o hIL6RC biotinilado in vivo (100 nM) durante dos horas a temperatura ambiente en un mezclador rotatorio. Se añadieron perlas a la diana y se capturaron usando un soporte magnético seguido de cuatro lavados con PBS/Tween 20 0,1 % y 3 lavados con PBS. Se añadieron directamente después perlas a 10 ml de células TG1 con crecimiento exponencial y se incubaron durante una hora a 37 °C con agitación lenta (100 rpm). Se diluyó en serie una alícuota de las TG1 infectadas para titular el resultado de selección. Las TG1 infectadas restantes se centrifugaron a 3000 rpm durante 15 minutos y se resuspendieron en 0,5 ml de TYAG2x (medio TY2x que contenía ampicilina 100 µg/ml y glucosa al 2 %) y se extendieron en placas de bioensayo de agar TYAG2x. Después de incubación durante una noche a 30 °C, se añadieron 10 ml de TYAG2x a las placas y las células se rasparon de la superficie y se transfirieron a un tubo de polipropileno de 50 ml. Se añadió TYAG2x que contenía glicerol al 50 % a la suspensión celular para obtener una concentración final de glicerol del 17 %. Las alícuotas del ciclo de selección se mantuvieron a -80 °C.
Rescate de fagos: se añadieron 100 µl de suspensión celular obtenida de ciclos de selección previos a 20 ml de TYAG2x y se cultivaron a 37 °C con agitación (240 rpm) hasta que se alcanzó una DO600 de 0,3 a 0,5. El cultivo se superinfectó después con 3,3x1010 fagos auxiliares MK13KO7 y se incubaron durante una hora a 37 °C (150 rpm). El medio se cambió después centrifugando las células a 3800 rpm durante 10 minutos, retirando el medio y resuspendiendo el sedimento en 20 ml de TY-AK2x (ampicilina 100 µg/ml; kanamicina 50 µg/ml). El cultivo se dejó crecer después durante una noche a 30 °C (240 rpm). Al día siguiente se usó una alícuota del sobrenadante centrifugado como un aporte para el siguiente ciclo de selección.
Rescate de fagos monoclonales para ELISA: Se seleccionaron clones individuales en una placa de microtitulación que contenía 150 µl de medio TYAG2x (glucosa 2 %) por pocillo y se cultivaron a 37 °C (100-120 rpm) durante 5-6 h. Se añadió fago auxiliar M13KO7 a cada pocillo para obtener una multiplicidad de infección (MOI) de 10 (es decir, 10 fagos por cada célula en el cultivo) y se incubó a 37 °C (100 rpm) durante 1 h. Después del cultivo, las placas se centrifugaron a 3.200 rpm durante 10 min. El sobrenadante se retiró cuidadosamente, las células se resuspendieron en 150 µl de medio TYAK2x y se cultivaron durante una noche a 30 °C (120 rpm). Para el ELISA, el fago se bloqueó añadiendo 150 µl de PBS de concentración 2x que contenía leche en polvo desnatada 5 % seguido de una hora de incubación a temperatura ambiente. Las placas se centrifugaron después 10 minutos a 3000 rpm y el sobrenadante que contenía fagos se usó para el ELISA.
ELISA de fagos: Se recubrieron durante una noche placas de ELISA (Maxisorp, NUNC) con hCXCL10-NusA 2 µg/ml en PBS o hIL6RC 2 µg/ml en PBS. Las placas se bloquearon después con leche desnatada al 3 %/PBS a temperatura ambiente durante 1 h. Las placas se lavaron 3 veces con PBS 0,05 % Tween 20 antes de transferir los sobrenadantes de fagos pre-bloqueados e incubación durante una hora a temperatura ambiente. Cada clon se ensayó frente a ambas dianas para ensayar su especificidad. Las placas se lavaron después 3 veces con PBS 0,05 % Tween 20. 50 µl de leche desnatada al 3 %/PBS que contenía anticuerpo anti-M13 conjugado con (HRP)
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ELISA. Los anticuerpos monoespecíficos IgGλ anti-INFγ e IgGκ anti-IL6RC y el biespecífico IgGκλ se ensayaron por ELISA con respecto a unión con INFγ e IL6RC. Los resultados mostrados en la Figura 11 indican que el IgGκλ biespecífico es capaz de unirse con ambas dianas y puede detectarse con anticuerpos secundarios tanto Cκ antihumano como Cλ anti-humano.
Resonancia de plasmón superficial (SPR). La afinidad y cinética de unión de los anticuerpos monoespecíficos IgGλ anti-INFγ, IgGκ anti-IL6RC y el biespecífico IgGκλ se caracterizaron en un instrumento Biacore 2000 (Biacore AB, Uppsala, Suecia). Se inmovilizaron 200UR de un IgG policlonal de cabra anti-humano (ahIgG; Biacore) por química de EDC/NHS en una microplaca de Biacore CM5. Esta superficie se usó para capturar IgG humano monoespecífico
o biespecífico. La superficie se regeneró después de cada ciclo por inyección de glicina 10 mM pH=1,5 a 30 µl/min, durante 30 segundos, seguido de 1 minuto de tiempo de estabilización en tampón de HBS-EP Los datos se ajustaron de acuerdo con un modelo de Langmuir 1:1 y se determinaron los valores de Kon, Koff y KD (Tabla III). Se obtuvieron valores de afinidad similares para los anticuerpos monoespecíficos y los anticuerpos IgGκλ biespecíficos. Los datos indican que los dos sitios de combinación de anticuerpos se unen con hIFNγ e IL6RC de forma similar en un formato monoespecífico y biespecífico.
La capacidad del IgGκλ biespecífico para interaccionar con ambos dianas simultáneamente se ensayó por SPR. Se inmovilizó INFγ biotinilado en una microplaca de Biacore CM5 recubierta con estreptavidina. Los anticuerpos monoespecíficos y biespecíficos se inyectaron en esta superficie seguidos de inyección de IL6RC. El sensograma mostrado en la Figura 11A muestra que el anticuerpo IgGκλ biespecífico era capaz de unirse con INFγ inmovilizado y era capaz de capturar IL6RC simultáneamente. También se usó SPR para evaluar las cantidades relativas de cadenas ligeras Kappa y Lambda en el anticuerpo biespecífico purificado. Se inmovilizó IgGκλ directamente mediante acoplamiento de amina en la superficie de una microplaca de Biacore CM5 y se inyectó un anticuerpo CKappa anti-humano seguido de un anticuerpo CLambda anti-humano a la misma concentración. Se obtuvieron respuestas equivalentes con ambos anticuerpos anti-cadena ligera lo que indica que, como se predecía por el formato, están presentes cantidades equivalentes de cadenas ligeras Kappa y Lambda en el anticuerpo de IgGκλ biespecífico (Figura 12B).
Tabla III. Análisis de cinético de unión para anticuerpos monoespecíficos y biespecíficos IgGκλ para IFNγ e IL6RC medido en un sistema Biacore 2000.
- Analito
- Ligando KD (M) kon (1/Ms) koff (1/s)
- IFNγ
- IgGκλ 1,84E-10 9,19E+05 1,69E-04
- IgGλλ
- 1,96E-10 6,08E+05 1,19E-04
- IL6RC
- IgGκλ 2,72E-07 7,44E+03 2,02E-03
- IgGκκ
- 2,66E-07 8,08E+03 2,15E-03
EJEMPLO 11: Fabricación de anticuerpos IgG
La expresión de anticuerpo biespecífico IgGκλ también se realizó en células de ovario de hámster chino (CHO), que se usan ampliamente para la fabricación de anticuerpos monoclonales. En el ejemplo presentado en el presente documento ambos grupos semi-estables de células CHO transfectadas así como líneas de CHO de células estables se generaron para la producción de anticuerpos biespecíficos IgGκλ. En los estudios presentados en el presente documento, se generaron líneas CHO estables y se cultivaron usando un proceso de fabricación sin componentes animales, químicamente definido (CDACF). El proceso general se representa en la Figura 13.
Grupos de CHO. Se sometieron a electroporación células CHO con el vector linealizado pNovi κHλκ que codifica el anticuerpo biespecífico IgGκλ anti-INFγ/anti-IL6RC descrito en los ejemplos anteriores así como con plásmidos que conducen la expresión de los monoespecíficos IgGλ anti-INFγ e IgGκ anti-IL6RC. Después de la electroporación, se cultivaron grupos de células transfectadas en condiciones de sobrecrecimiento de 10 días sin alimentación. Las células transfectadas con construcción biespecífica presentaron perfiles de crecimiento similares en comparación con las células transfectadas con vectores de expresión monoespecíficos. Además, las productividades también eran comparables y alcanzaron un intervalo típico de productividad de anticuerpos: entre 100 y 200 mg/l para cultivos de grupo con sobrecrecimiento sin alimentación (Figura 14A). Se consiguió con éxito aumento de escala entre la producción a pequeña escala en un matraz de Erlenmeyer (100 ml) y la producción a escala mediana en una Bolsa Wave de 25 l (Figura 14B). Estos resultados indican que se obtienen curvas de crecimiento y productividades similares durante la expresión del anticuerpo IgGκλ biespecífico en líneas celulares CHO y los anticuerpos monoespecíficos correspondientes.
Líneas celulares CHO estables. Se generaron líneas celulares recombinantes que producían anticuerpo biespecífico mediante electroporación de células CHO con el vector pNovi κHλκ. Después de la transfección, las líneas celulares recombinantes se seleccionaron diluyendo el cultivo celular en presencia de una concentración final de metionina
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sulfoximina (MSX) 50 µM. Después de 6 semanas de incubación, se exploraron las colonias de líneas celulares recombinantes con respecto a productividad de IgG total por FastELISA® (R&D Biotech) (Figura 15A-B). Las líneas celulares seleccionadas se expandieron en medio de cultivo celular que contenía MSX 25 µM, se transfirieron a placas de microtitulación de 24 pocillos y se exploraron con respecto a productividad y características de crecimiento 5 en cultivo en suspensión (Figura 15C-D). Los resultados revelaron que el anticuerpo biespecífico IgGκλ puede producirse en condiciones de sobrecrecimiento discontinuas con agitación a un nivel comparable a las líneas celulares que expresan anticuerpos monoespecíficos convencionales. Se seleccionaron líneas celulares productoras superiores y se manejaron en cultivos de sobrecrecimiento discontinuo de 50 ml en matraces de agitación durante un máximo de 10 días. Se usó HPLC de Proteína A para cuantificación de IgG total en el sobrenadante. Se purificó 10 IgG total de los sobrenadantes de las 10 líneas celulares de máxima producción por cromatografía de MabSelect SuRE usando 1 ml de columnas pre-empaquetadas HiTrap (GE Healthcare). Las cantidades relativas de anticuerpos monoespecíficos y biespecíficos en el IgG purificado total se evaluaron mediante IEX-HPLC como se ha descrito en el Ejemplo 10. Para la mayoría de las líneas celulares, la fracción de anticuerpo biespecífico IgGκλ varió entre el 37 y el 42 % del IgG total y dos líneas celulares tenían cantidades menores expresadas de IgGκλ (22 y 25 %). Los
15 resultados para las 10 líneas celulares CHO se resumen en la Tabla IV.
Tabla IV
- Título de anticuerpos total (mg/ml)
- Purificación de anticuerpos totales post MabSelect SuRr (mg) Cantidad relativa de anticuerpos biespecíficos de IEX-HPLC (%) Cantidad de anticuerpos biespecíficos totales (mg)
- Línea celular 1
- 0,35 10,73 37 3,97
- Línea celular 2
- 0,32 9,54 25 2,37
- Línea celular 3
- 0,31 10,02 37 3,72
- Línea celular 4
- 0,42 10,01 40 4,00
- Línea celular 5
- 0,38 11,59 38 4,39
- Línea celular 6
- 0,43 11,10 43 4,75
- Línea celular 7
- 0,49 12,67 42 5,32
- Línea celular 8
- 0,33 8,96 22 2,01
- Línea celular 9
- 0,38 9,94 42 4,18
- Línea celular 10
- 0,39 10,98 42 4,61
Purificación y caracterización de anticuerpo biespecífico IgGκλ expresado en CHO. El sobrenadante de grupos de
20 células CHO transfectados con construcciones biespecíficas y monoespecíficas se usó para purificación. Los IgGλ anti-INFγ e IgGκ anti-IL6RC monoespecíficos se purificaron usando cromatografía de afinidad de Proteína A y se desalaron en PBS, mientras que los anticuerpos biespecíficos IgGκλ se purificaron usando el proceso de cromatografía de afinidad de tres etapas descrito en el Ejemplo 8. Las fracciones de elución y flujo continuo de las diferentes etapas así como las muestras purificadas finales se analizaron por SDS-PAGE e IEF (Figura 16). La
25 especificidad del IgGκλ se controló después de cada etapa de purificación por ELISA (Figura 17). Los resultados demuestran que el proceso de purificación fue robusto y compatible con la expresión de CHO y produce anticuerpo biespecífico IgGκλ altamente puro.
EJEMPLO 12: Ejemplos adicionales de anticuerpos IgGimagen17 imagen18 biespecíficos
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