相互参照
[0001]本出願は、2018年9月19日出願の米国仮特許出願第62/733,444号、2018年9月19日出願の米国仮特許出願第62/733,443号、2018年9月19日出願の米国仮特許出願第62/733,435号の利益を主張し、これらはそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
[0002]がんに対する免疫応答の仲介における細胞傷害性T細胞の役割は十分に確立されているが、B細胞の役割はあまり知られていない。特に、がん患者において同定された抗体の効果は依然として不明である。一部の研究では、このような抗体が腫瘍の進行を促進する可能性が示唆されているが、他の研究では、抗腫瘍免疫を刺激する可能性があることが報告されている。
[0003]一態様では、本明細書には、相補性決定領域重鎖1(CDR−H1)、CDR−H2およびCDR−H3のうちの少なくとも1つを含む抗体またはその抗原結合性断片が提供され、CDR−H1は配列番号85〜98のいずれか1つから選択される再構築されたポリペプチドコンセンサス配列を含み、CDR−H2は配列番号57〜70のいずれか1つから選択される再構築されたポリペプチドコンセンサス配列を含み、CDR−H3は配列番号29〜42のいずれか1つから選択される再構築されたポリペプチドコンセンサス配列を含む。
[0004]一態様では、本明細書には、相補性決定領域軽鎖1(CDR−L1)、CDR−L2およびCDR−L3のうちの少なくとも1つを含む抗体またはその抗原結合性断片が提供され、CDR−L1は配列番号99〜112のいずれか1つから選択される再構築されたポリペプチドコンセンサス配列を含み、CDR−L2は配列番号71〜84のいずれか1つから選択される再構築されたポリペプチドコンセンサス配列を含み、CDR−L3は配列番号43〜56のいずれか1つから選択される再構築されたポリペプチドコンセンサス配列を含む。
[0005]一態様では、本明細書には、相補性決定領域重鎖1(CDR−H1)が配列番号85〜98のいずれか1つから選択される再構築されたポリペプチドコンセンサス配列を含み、CDR−H2が配列番号57〜70のいずれか1つから選択される再構築されたポリペプチドコンセンサス配列を含み、CDR−H3が配列番号29〜42のいずれか1つから選択される再構築されたポリペプチドコンセンサス配列を含むCDR−H1、CDR−H2およびCDR−H3と、相補性決定領域軽鎖1(CDR−L1)が配列番号99〜112のいずれか1つから選択される再構築されたポリペプチドコンセンサス配列を含み、CDR−L2が配列番号71〜84のいずれか1つから選択される再構築されたポリペプチドコンセンサス配列を含み、CDR−L3が配列番号43〜56のいずれか1つから選択される再構築されたポリペプチドコンセンサス配列を含むCDR−L1、CDR−L2およびCDR−L3とを含む抗体またはその抗原結合性断片が提供される。
[0006]一部の実施形態では、抗体は、IgG、IgA、またはIgM抗体である。一部の実施形態では、IgGは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgGA1、またはIgGA2である。一部の実施形態では、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、モノクローナル抗体、脱免疫抗体、二特異性抗体、多特異性抗体、またはそれらの組み合わせである。一部の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗体は多特異性抗体である。一部の実施形態では、抗体は多価抗体である。一部の実施形態では、抗原結合性断片は、Fab、Fab’、Fab’−SH、Fv、scFv、F(ab’)2、ダイアボディ、線状抗体、単一ドメイン抗体(sdAb)、ラクダ科VHHドメイン、または抗体断片から形成される多特異的抗体を含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、組換えまたは合成である。
[0007]一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、酵素、基質、補因子、蛍光マーカー、化学発光マーカー、ペプチドタグ、磁性粒子、薬物、毒素、放射性核種、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、またはそれらの組み合わせをさらに含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、腫瘍細胞またはがん細胞に対して細胞溶解性である。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、腫瘍成長またはがん細胞増殖を阻害する。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、皮膚がんを治療するのに有用である。一部の実施形態では、皮膚がんは、基底細胞癌腫、扁平上皮癌腫、皮膚黒色腫、メルケル細胞癌腫、非定型線維黄色腫、皮膚リンパ腫、または皮膚線維肉腫である。一部の実施形態では、皮膚黒色腫は、表在性黒色腫、結節性黒色腫、末端黒子型黒色腫、爪下黒色腫、悪性黒子黒色腫、線維形成性黒色腫、粘膜黒色腫、またはポリープ状黒色腫である。
[0008]一態様では、本明細書には、(a)配列番号1〜14のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも95%の同一性を有する再構築されたポリペプチドコンセンサス配列を含む可変重鎖、(b)配列番号15〜28のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも95%の同一性を有する再構築されたポリペプチドコンセンサス配列を含む可変軽鎖、または(c)(a)の可変重鎖と(b)の可変軽鎖を含む抗体またはその抗原結合性断片が提供される。
[0009]一態様では、本明細書には、上記の態様のいずれか1つの抗体またはその抗原結合性断片を産生するハイブリドーマが提供される。
[0010]一態様では、本明細書には、上記の態様のいずれか1つの抗体またはその抗原結合性断片を含む融合タンパク質が提供される。
[0011]本明細書には、(a)上記に開示された態様のいずれか1つの抗原結合性断片、(b)膜貫通ドメイン、および(c)細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体またはT細胞受容体融合タンパク質が提供される。
[0012]本明細書には、(i)上記に開示された態様のいずれか1つの抗体またはその抗原結合性断片、および(ii)T細胞受容体(TCR)サブユニットを含むT細胞受容体融合タンパク質が提供される。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトまたはヒト化抗がん抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態では、TCRサブユニットは、(i)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部、(ii)膜貫通ドメイン、および(iii)細胞内シグナル伝達ドメインからの刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインを含む。一部の実施形態では、TCRサブユニットの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3イプシロンのみに由来するかまたはCD3ガンマのみに由来する。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片およびTCR細胞外ドメインは、リンカー配列によって連結される。一部の実施形態では、リンカー配列は、(G4S)nの配列を含み、Gはグリシンであり、Sはセリンであり、n=1〜4である。
[0013]本明細書には、上記の態様のいずれか1つのT細胞受容体融合タンパク質をコードする単離された核酸分子が提供される。
[0014]本明細書には、上記される単離された核酸分子を含むベクターが提供される。
[0015]本明細書には、上記される単離された核酸分子またはベクターを含む宿主細胞が提供される。一部の実施形態では、宿主細胞はT細胞である。
[0016]一態様では、本明細書には、上記されるT細胞受容体融合タンパク質を発現するT細胞が提供される。一部の実施形態では、T細胞受容体融合タンパク質は、内因性T細胞受容体と機能的に統合される。一部の実施形態では、T細胞は、CD8+またはCD4+T細胞である。
[0017]本明細書には、上記の態様のいずれか1つの抗体またはその抗原結合性断片、および治療剤を含むイムノコンジュゲートが提供される。
[0018]本明細書には、上記される抗体またはその抗原結合性断片および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物または医薬が提供される。一部の実施形態では、医薬組成物は第2の治療剤をさらに含む。一部の実施形態では、第2の治療剤は、抗がん剤、細胞傷害剤、NSAID、コルチコステロイド、抗酸化剤などの栄養補助剤、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、抗がん剤は、抗がん抗体または化学療法剤である。
[0019]一部の実施形態では、医薬組成物は、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、筋肉内、脳室内、頭蓋内、腔内、または小脳内投与経路を介して投与するために製剤化される。一部の実施形態では、医薬組成物は、水性形態または凍結乾燥形態である。一部の実施形態では、医薬組成物は、シリンジ、先端を丸くしたシリンジ、カテーテル、および移植可能なポンプからなる群から選択される送達デバイスに含まれる。
[0020]本明細書には、がんを治療するための上記の態様のいずれか1つの抗体またはその抗原結合性断片の使用が提供される。一部の実施形態では、上記される抗体またはその抗原結合性断片のイムノコンジュゲートは、医薬の製造に使用される。一部の実施形態では、医薬は、がんの処置のためである。
[0021]一態様では、本明細書には、がんに罹患している対象を治療する方法が提供され、本方法は、上記の態様のいずれか1つの治療有効量の抗体またはその抗原結合性断片を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、腫瘍細胞に対して細胞溶解性である。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、腫瘍成長を阻害する。一部の実施形態では、がんは皮膚がんである。一部の実施形態では、皮膚がんは、基底細胞癌腫、扁平上皮癌腫、皮膚黒色腫、メルケル細胞癌腫、非定型線維黄色腫、皮膚リンパ腫、または皮膚線維肉腫である。一部の実施形態では、皮膚黒色腫は、表在性黒色腫、結節性黒色腫、末端黒子型黒色腫、爪下黒色腫、悪性黒子黒色腫、線維形成性黒色腫、粘膜黒色腫、またはポリープ状黒色腫である。
[0022]一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口、筋肉内または頭蓋内に投与される。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、第2の治療剤と組み合わせて対象に投与される。一部の実施形態では、第2の治療剤は、抗がん剤、放射線療法、細胞傷害性剤、NSAID、コルチコステロイド、抗酸化剤などの栄養補助剤、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、抗がん剤は、抗がん抗体または化学療法剤である。一部の実施形態では、第2の治療剤は、抗体またはその抗原結合性断片の投与の前、同時、または後に投与される。
[0023]本明細書には、(a)CDR−H1をコードする核酸配列であって、配列番号197〜210から選択される核酸配列、(b)CDR−H2をコードする核酸配列であって、配列番号169〜182から選択される核酸配列、(c)CDR−H3をコードする核酸配列であって、配列番号141〜154から選択される核酸配列、(d)CDR−L1をコードする核酸配列であって、配列番号211〜224から選択される核酸配列、(e)CDR−L2をコードする核酸配列であって、配列番号183〜196から選択される核酸配列、および(f)CDR−L3をコードする核酸配列であって、配列番号155〜168から選択される核酸配列のうちの少なくとも1つを含む単離された核酸分子が提供される。
[0024]本明細書には、抗体の重鎖ポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子が提供され、核酸配列は配列番号113〜126のいずれか1つから選択される。
[0025]本明細書には、抗体の軽鎖ポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子が提供され、核酸配列は配列番号127〜140のいずれか1つから選択される。
[0026]本明細書には、上記される単離された核酸分子を含むベクターが提供される。一部の実施形態では、単離された核酸分子は、調節制御配列に機能的に連結される。
[0027]本明細書には、上記されるベクターまたは単離された核酸分子を含む宿主細胞が提供される。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片を産生する方法であって、本方法は、(a)上記される宿主細胞を、単離された核酸分子によってコードされるポリペプチドの発現、および抗体またはその抗原結合性断片のアセンブルを可能にする条件下で、培地中で培養する工程、および(b)抗体またはその抗原結合性断片を、培養細胞または細胞の培地から精製する工程を含む。
[0028]本明細書には、(a)治療有効量の上記される抗体またはその抗原結合性断片のうちの少なくとも1つを含むキットが提供される。一部の実施形態では、キットは、治療有効量の第2の治療剤をさらに含む。一部の実施形態では、第2の治療剤は、抗がん剤、放射線療法、細胞傷害性剤、NSAID、コルチコステロイド、抗酸化剤などの栄養補助剤、またはそれらの組み合わせである。一部の実施形態では、抗がん剤は、抗がん抗体または化学療法剤である。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、凍結乾燥形態または水性形態である。一部の実施形態では、再構成溶液または希釈剤をさらに含む。
[0029]一態様では、本明細書には、(a)配列番号85の相補性決定領域重鎖1(CDR−H1)、配列番号57のCDR−H2、および配列番号29のCDR−H3を含む可変重鎖領域、(b)配列番号99の相補性決定領域軽鎖1(CDR−L1)、配列番号71のCDR−L2、および配列番号43のCDR−L3を含む可変軽鎖領域、または(c)(a)の可変重鎖と(b)の可変軽鎖のうちの少なくとも1つを含む、イノシトールポリリン酸5−ホスファターゼ1(SHIP1)タンパク質またはそのバリアントを含有するSrcホモロジー2(SH2)ドメインに結合する抗体またはその抗原結合性断片が提供される。
[0030]一部の実施形態では、可変重鎖は配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、可変軽鎖は配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトSHIP1、マウスSHIP1、ラットSHIP1、ウシSHIP1、カニクイザルSHIP1に結合する。一部の実施形態では、ヒトSHIP1は、配列番号281の配列を含む。
[0031]一態様では、本明細書には、SHIP1に結合するために上記される抗体またはその抗原結合性断片と競合する抗体が提供され、抗体はヒトSHIP1およびマウスSHIP1に結合する。
[0032]一態様では、本明細書には、(a)配列番号87の相補性決定領域重鎖1(CDR−H1)、配列番号59のCDR−H2、および配列番号31のCDR−H3を含む可変重鎖領域、(b)配列番号101の相補性決定領域軽鎖1(CDR−L1)、配列番号73のCDR−L2、および配列番号45のCDR−L3を含む可変軽鎖領域、または(c)(a)の可変重鎖と(b)の可変軽鎖のうちの少なくとも1つを含む、クロモボックスタンパク質(CBX)またはそのバリアントに結合する抗体またはその抗原結合性断片が提供される。一部の実施形態では、可変重鎖は配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含み、可変軽鎖は配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトCBX、マウスCBX、ラットCBX、ウシCBX、またはカニクイザルCBXに結合する。
[0033]一部の実施形態では、クロモボックス(CBX)タンパク質は、クロモボックスタンパク質ホモログ1、クロモボックスタンパク質ホモログ3、またはクロモボックスタンパク質ホモログ5である。一部の実施形態では、CBXタンパク質は、配列番号286の配列を含むヒトCBX1である。一部の実施形態では、CBXタンパク質は、配列番号291の配列を含むヒトCBX3である。一部の実施形態では、CBXタンパク質は、配列番号296の配列を含むヒトCBX5である。
[0034]本明細書には、CBXタンパク質への結合に関して、上記の態様のいずれか1つの抗体またはその抗原結合性断片と競合する抗体が提供され、抗体はヒトCBXおよびマウスCBXに結合する。
[0035]本明細書には、がん/精巣抗原1B(CTAG1A)またはそのバリアントに選択的に結合する抗体またはその抗原結合性断片が提供され、(a)配列番号89の相補性決定領域重鎖1(CDR−H1)、配列番号61のCDR−H2、および配列番号33のCDR−H3を含む可変重鎖領域、(b)配列番号103の相補性決定領域軽鎖1(CDR−L1)、配列番号75のCDR−L2、および配列番号47のCDR−L3を含む可変軽鎖領域;または(c)(a)可変重鎖と(b)可変軽鎖のうちの少なくとも1つを含む。一部の実施形態では、可変重鎖は配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含み、可変軽鎖は配列番号19のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトCTAG1A、マウスCTAG1A、ラットCTAG1A、ウシCTAG1A、カニクイザルCTAG1Aと結合する。一部の実施形態では、ヒトCTAG1Aは、配列番号301の配列を含む。
[0036]一態様では、本明細書には、CTAG1Aへの結合に関して、上記される抗体またはその抗原結合性断片と競合する抗体であり、抗体はヒトCTAG1AおよびマウスCTAG1Aに結合する。
[0037]一態様では、本明細書には、以下の少なくとも1つを含む、アルファおよびガンマアダプチン結合タンパク質(AAGAB)またはそのバリアントに選択的に結合する抗体またはその抗原結合性断片が提供される。
[0038](a)配列番号90の相補性決定領域重鎖1(CDR−H1)、配列番号62のCDR−H2、および配列番号34のCDR−H3を含む可変重鎖領域、(b)配列番号104の相補性決定領域軽鎖1(CDR−L1)、配列番号76のCDR−L2、および配列番号48のCDR−L3を含む可変軽鎖領域;または(c)(a)の可変重鎖と(b)の可変軽鎖。一部の実施形態では、可変重鎖は配列番号6のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含み、可変軽鎖は配列番号20のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトAAGAB、マウスAAGAB、ラットAAGAB、ウシAAGAB、カニクイザルAAGABに結合する。一部の実施形態では、ヒトAAGABは、配列番号303の配列を含む。
[0039]本明細書には、AAGABへの結合に関して、上記される抗体またはその抗原結合性断片と競合する抗体が提供され、抗体は、ヒトAAGABおよびマウスAAGABに結合する。
[0040]一態様では、本明細書には、キネシン軽鎖4タンパク質(KLC4)またはそのバリアントに選択的に結合する抗体またはその抗原結合性断片が提供され、(a)配列番号91の相補性決定領域重鎖1(CDR−H1)、配列番号63のCDR−H2、および配列番号35のCDR−H3を含む可変重鎖領域、(b)配列番号105の相補性決定領域軽鎖1(CDR−L1)、配列番号77のCDR−L2、および配列番号49のCDR−L3を含む可変軽鎖領域、または(c)(a)の可変重鎖と(b)の可変軽鎖のうちの少なくとも1つを含む。一部の実施形態では、可変重鎖は配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含み、可変軽鎖は配列番号21のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトKLC4、マウスKLC4、ラットKLC4、ウシKLC4、カニクイザルKLC4に結合する。一部の実施形態では、ヒトKLC4は、配列番号308の配列を含む。
[0041]本明細書には、KLC4への結合に関して、上記される抗体またはその抗原結合性断片と競合する抗体が提供され、抗体は、ヒトKLC4およびマウスKLC4に結合する。
[0042]本明細書には、黒色腫関連抗原3(MAGE−A3)またはそのバリアントに選択的に結合する抗体またはその抗原結合性断片が提供され、(a)配列番号92の相補性決定領域重鎖1(CDR−H1)、配列番号64のCDR−H2、および配列番号36のCDR−H3を含む可変重鎖領域、(b)配列番号106の相補性決定領域軽鎖1(CDR−L1)、配列番号78のCDR−L2、および配列番号50のCDR−L3を含む可変軽鎖領域;または(c)(a)の可変重鎖と(b)の可変軽鎖のうちの少なくとも1つを含む。一部の実施形態では、可変重鎖は配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含み、可変軽鎖は配列番号22のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトMAGE−A3、マウスMAGE−A3、ラットMAGE−A3、ウシMAGE−A3、カニクイザルMAGE−A3に結合する。一部の実施形態では、ヒトMAGE−A3は、配列番号313の配列を含む。
[0043]一態様では、本明細書には、MAGE−A3への結合に関して、上記の態様のいずれか1つの抗体またはその抗原結合性断片と競合する抗体が提供され、抗体は、ヒトMAGE−A3およびマウスMAGE−A3に結合する。
[0044]本明細書には、無機ピロホスファターゼ(PPA1)またはそのバリアントに選択的に結合する抗体またはその抗原結合性断片が提供され、(a)配列番号94の相補性決定領域重鎖1(CDR−H1)、配列番号66のCDR−H2、および配列番号38のCDR−H3を含む可変重鎖領域、(b)配列番号108の相補性決定領域軽鎖1(CDR−L1)、配列番号80のCDR−L2、および配列番号52のCDR−L3を含む可変軽鎖領域;または(c)(a)の可変重鎖と(b)可変軽鎖のうちの少なくとも1つを含む。一部の実施形態では、可変重鎖は配列番号10のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含み、可変軽鎖は配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含む。
[0045]一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトPPA1、マウスPPA1、ラットPPA1、ウシPPA1、カニクイザルPPA1に結合する。一部の実施形態では、ヒトPPA1は、配列番号315の配列を含む。
[0046]本明細書には、PPA1への結合に関して、上記の態様の抗体またはその抗原結合性断片と競合する抗体が提供され、抗体はヒトPPA1およびマウスPPA1に結合する。
[0047]本明細書には、インターロイキン−14A(IL−14A)またはそのバリアントに選択的に結合する抗体またはその抗原結合性断片が提供され、(a)配列番号95の相補性決定領域重鎖1(CDR−H1)、配列番号67のCDR−H2、および配列番号39のCDR−H3を含む可変重鎖領域、(b)配列番号109の相補性決定領域軽鎖1(CDR−L1)、配列番号81のCDR−L2、および配列番号53のCDR−L3を含む可変軽鎖領域、または(c)(a)の可変重鎖と(b)の可変軽鎖のうちの少なくとも1つを含む。一部の実施形態では、可変重鎖は配列番号11のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含み、可変軽鎖は、配列番号25のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトIL−14A、マウスIL−14A、ラットIL−14A、ウシIL−14A、カニクイザルIL−14Aに結合する。一部の実施形態では、ヒトIL−14Aは、配列番号319の配列を含む。
[0048]本明細書には、IL−14Aへの結合に関して、上記の態様の抗体またはその抗原結合性断片と競合する抗体が提供され、抗体は、ヒトIL−14AおよびマウスIL−14Aに結合する。
[0049]本明細書には、O−結合型N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)トランスフェラーゼ(OGT)またはそのバリアントに選択的に結合する抗体またはその抗原結合性断片が提供され、(a)配列番号98の相補性決定領域重鎖1(CDR−H1)、配列番号70のCDR−H2、および配列番号42のCDR−H3を含む可変重鎖領域、(b)配列番号112の相補性決定領域軽鎖1(CDR−L1)、配列番号84のCDR−L2、および配列番号56のCDR−L3を含む可変軽鎖領域、または(c)(a)の可変重鎖と(b)の可変軽鎖のうちの少なくとも1つを含む。一部の実施形態では、可変重鎖は配列番号14のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含み、可変軽鎖は配列番号28のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトOGT、マウスOGT、ラットOGT、ウシOGT、カニクイザルOGTに結合する。一部の実施形態では、ヒトOGTは、配列番号324の配列を含む。
[0050]本明細書には、OGTへの結合に関して、上記の態様のいずれか1つの抗体またはその抗原結合性断片と競合する抗体が提供され、抗体は、ヒトOGTおよびマウスOGTに結合する。
[0051]一態様では、本明細書には、(a)抗体またはその抗原結合性断片と抗原との選択的結合を可能にする条件下で、試料を上記の態様のいずれか1つの抗体またはその抗原結合性断片と接触させて、抗体−抗原複合体を形成する工程と、(b)免疫検出法によって抗体−抗原複合体の存在または不存在を検出する工程とを含む免疫組織化学アッセイが提供される。一部の実施形態では、試料は、血液試料または組織試料である。一部の実施形態では、試料は、がんに罹患していると疑われるかまたはがんと診断された対象由来である。
[0052]本明細書には、細胞、組織、臓器または対象におけるSrcホモロジー2(SH2)ドメイン含有イノシトールポリリン酸5−ホスファターゼ1(SHIP1)関連状態を診断または治療するための方法が提供され、以下を含む:
[0053]有効量の上記のいずれか1つの態様の少なくとも1つの抗体またはその抗原結合性断片を細胞、組織、臓器もしくは対象と接触させるかまたはそれに投与すること。
[0054]一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、(a)配列番号85の相補性決定領域重鎖1(CDR−H1)、配列番号57のCDR−H2、および配列番号29のCDR−H3を含む可変重鎖領域、(b)配列番号99の相補性決定領域軽鎖1(CDR−L1)、配列番号71のCDR−L2、および配列番号43のCDR−L3を含む可変軽鎖領域、または(c)(a)の可変重鎖と(b)の可変軽鎖のうちの少なくとも1つを含む。一部の実施形態では、可変重鎖は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、可変軽鎖は、配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含む。
[0055]本明細書には、細胞、組織、臓器または対象において、クロモボックスタンパク質(CBX)またはそのバリアントに関連する状態を診断または治療するための方法が提供され、以下を含む:
[0056]上記の態様のいずれか1つの、有効量の少なくとも1つの抗体またはその抗原結合性断片を細胞、組織、臓器もしくは対象と接触させるかまたはそれに投与すること。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、(a)配列番号87の相補性決定領域重鎖1(CDR−H1)、配列番号59のCDR−H2、および配列番号31のCDR−H3を含む可変重鎖領域、(b)配列番号101の相補性決定領域軽鎖1(CDR−L1)、配列番号73のCDR−L2、および配列番号45のCDR−L3を含む可変軽鎖領域、または(c)(a)の可変重鎖と(b)の可変軽鎖のうちの少なくとも1つを含む。一部の実施形態では、可変重鎖は配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含み、可変軽鎖は配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含む。一部の実施形態では、クロモボックスタンパク質(CBX)は、クロモボックスタンパク質ホモログ1、クロモボックスタンパク質ホモログ3、またはクロモボックスタンパク質ホモログ5である。
[0057]本明細書には、細胞、組織、臓器、または対象におけるがん/精巣抗原1B(CTAG1A)に関連する状態を診断または治療するための方法が提供され、上記の態様のいずれか1つの、有効量の少なくとも1つの抗体またはその抗原結合性断片を細胞、組織、臓器もしくは対象と接触させるかまたはそれに投与することを含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、(a)配列番号89の相補性決定領域重鎖1(CDR−H1)、配列番号61のCDR−H2、および配列番号33のCDR−H3を含む可変重鎖領域、(b)配列番号103の相補性決定領域軽鎖1(CDR−L1)、配列番号75のCDR−L2、および配列番号47のCDR−L3を含む可変軽鎖領域、または(c)(a)の可変重鎖と(b)の可変軽鎖のうちの少なくとも1つを含む。一部の実施形態では、可変重鎖は配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含み、可変軽鎖は配列番号19のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含む。
[0058]本明細書には、細胞、組織、臓器または対象におけるアルファおよびガンマアダプチン結合タンパク質(AAGAB)に関連する状態を診断または治療するための方法が提供され、上記の態様のいずれか1つの、有効量の少なくとも1つの抗体またはその抗原結合性断片を細胞、組織、臓器もしくは対象と接触させるかまたはそれに投与することを含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、(a)配列番号90の相補性決定領域重鎖1(CDR−H1)、配列番号62のCDR−H2、および配列番号34のCDR−H3を含む可変重鎖領域、(b)配列番号104の相補性決定領域軽鎖1(CDR−L1)、配列番号76のCDR−L2、および配列番号48のCDR−L3を含む可変軽鎖領域、または(c)(a)の可変重鎖と(b)の可変軽鎖のうちの少なくとも1つを含む。一部の実施形態では、可変重鎖は配列番号6のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含み、可変軽鎖は配列番号20のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含む。
[0059]本明細書には、細胞、組織、臓器、または対象におけるキネシン軽鎖4タンパク質(KLC4)に関連する状態を診断または治療する方法が提供され、上記の態様のいずれか1つの、有効量の少なくとも1つの抗体またはその抗原結合性断片を細胞、組織、臓器、もしくは対象と接触させるかまたはそれに投与することを含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、(a)配列番号91の相補性決定領域重鎖1(CDR−H1)、配列番号63のCDR−H2、および配列番号35のCDR−H3を含む可変重鎖領域、(b)配列番号105の相補性決定領域軽鎖1(CDR−L1)、配列番号77のCDR−L2、および配列番号49のCDR−L3を含む可変軽鎖領域、または(c)(a)の可変重鎖と(b)の可変軽鎖のうちの少なくとも1つを含む。一部の実施形態では、可変重鎖は配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含み、可変軽鎖は配列番号21のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含む。
[0060]本明細書には、細胞、組織、臓器、または対象における黒色腫関連抗原3(MAGE−A3)に関連する状態を診断または治療する方法が提供され、上記の態様のいずれか1つの、有効量の少なくとも1つの抗体またはその抗原結合性断片を細胞、組織、臓器、もしくは対象と接触させるかまたはそれに投与することを含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、(a)配列番号92の相補性決定領域重鎖1(CDR−H1)、配列番号64のCDR−H2、および配列番号36のCDR−H3を含む可変重鎖領域、(b)配列番号106の相補性決定領域軽鎖1(CDR−L1)、配列番号78のCDR−L2、および配列番号50のCDR−L3を含む可変軽鎖領域、または(c)(a)の可変重鎖と(b)の可変軽鎖のうちの少なくとも1つを含む。一部の実施形態では、可変重鎖は配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含み、可変軽鎖は配列番号22のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含む。
[0061]本明細書には、細胞、組織、臓器、または対象における無機ピロホスファターゼ(PPA1)に関連する状態を診断または治療する方法が提供され、上記の態様のいずれか1つの、有効量の少なくとも1つの抗体またはその抗原結合性断片を細胞、組織、臓器もしくは対象と接触させるかまたはそれに投与することを含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、(a)配列番号94の相補性決定領域重鎖1(CDR−H1)、配列番号66のCDR−H2、および配列番号38のCDR−H3を含む可変重鎖領域、(b)配列番号108の相補性決定領域軽鎖1(CDR−L1)、配列番号80のCDR−L2、および配列番号52のCDR−L3を含む可変軽鎖領域、または(c)(a)の可変重鎖と(b)の可変軽鎖のうちの少なくとも1つ含む。一部の実施形態では、可変重鎖は配列番号10のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含み、可変軽鎖は配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含む。
[0062]本明細書では、細胞、組織、臓器または対象におけるインターロイキン−14A(IL−14A)に関連する状態を診断または治療するための方法が提供され、上記の態様のいずれか1つの、有効量の少なくとも1つの抗体またはその抗原結合性断片を細胞、組織、臓器もしくは対象と接触させるかまたはそれに投与することを含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、(a)配列番号95の相補性決定領域重鎖1(CDR−H1)、配列番号67のCDR−H2、および配列番号39のCDR−H3を含む可変重鎖領域、(b)配列番号109の相補性決定領域軽鎖1(CDR−L1)、配列番号81のCDR−L2、および配列番号53のCDR−L3を含む可変軽鎖領域、または(c)(a)の可変重鎖と(b)の可変軽鎖のうちの少なくとも1つを含む。一部の実施形態では、可変重鎖は配列番号11のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含み、可変軽鎖は配列番号25のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含む。
[0063]本明細書に、細胞、組織、臓器または対象におけるO−結合型N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)転移酵素(OGT)に関連する状態を診断または治療する方法が提供され、上記の態様のいずれか1つの、有効量の少なくとも1つの抗体またはその抗原結合性断片を細胞、組織、臓器もしくは対象と接触させるかまたはそれに投与することを含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、(a)配列番号98の相補性決定領域重鎖1(CDR−H1)、配列番号70のCDR−H2、および配列番号42のCDR−H3を含む可変重鎖領域、(b)配列番号112の相補性決定領域軽鎖1(CDR−L1)、配列番号84のCDR−L2、および配列番号56のCDR−L3を含む可変軽鎖領域、または(c)(a)の可変重鎖と(b)の可変軽鎖のうちの少なくとも1つを含む。一部の実施形態では、可変重鎖は配列番号14のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含み、可変軽鎖は配列番号28のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含む。
参考文献による組み込み
[0064]本明細書に記載される全ての刊行物、特許および特許出願は、各個別の刊行物、特許または特許出願が、参照により組み込まれるように具体的であり、個別に示されたものと同じ範囲で参照により本明細書に組み込まれる。
[0065]本発明の新規な特徴を、特に添付した特許請求の範囲とともに説明する。本発明の原理を利用する実例的な実施形態を説明する以下の詳細な説明および添付した図面を参照することによって、本発明の特徴および利点をより良く理解することができる。
[0066]図1は、免疫グロブリンのクロノタイプを同定するための計算パイプラインの例示的なスキームを示す。
[0067]図2は、TCGA−SKCMコホートについての多変量Cox比例ハザード回帰解析を示し、共変量は患者の性別、診断時の年齢、腫瘍のステージ(TMNシステム)、ならびにMZB1およびFOXM1遺伝子の発現を含む。四角はハザード比(HR)を表し、水平のバーはハザード比の推測値の95%信頼区間の下限から上限まで延びている。プロットはまた、生存と任意の共変量との間の相互作用についての考慮した事象の数(N)およびWald検定のp値(p)を示す。
[0068]図3A〜3Jは、5名の患者のアラインメントの可視化および免疫グロブリンの配列を示す。RNAシーケンシングから得られた個別のリードを、選択した5名の患者について示す。アラインさせた生殖細胞系列VDJセグメントを、それぞれのトラックの下部に示す。予想(水平の着色した線)から乖離したIGVカラーペアードエンドのアラインメントおよびミスマッチした塩基を暗灰色の垂直線として表している。
図3A〜3Jは、5名の患者のアラインメントの可視化および免疫グロブリンの配列を示す。
図3A〜3Jは、5名の患者のアラインメントの可視化および免疫グロブリンの配列を示す。
図3A〜3Jは、5名の患者のアラインメントの可視化および免疫グロブリンの配列を示す。
図3A〜3Jは、5名の患者のアラインメントの可視化および免疫グロブリンの配列を示す。
図3A〜3Jは、5名の患者のアラインメントの可視化および免疫グロブリンの配列を示す。
図3A〜3Jは、5名の患者のアラインメントの可視化および免疫グロブリンの配列を示す。
図3A〜3Jは、5名の患者のアラインメントの可視化および免疫グロブリンの配列を示す。
図3A〜3Jは、5名の患者のアラインメントの可視化および免疫グロブリンの配列を示す。
図3A〜3Jは、5名の患者のアラインメントの可視化および免疫グロブリンの配列を示す。
[0069]図4は、VDJ同定パイプラインの例示的なスキームを表す。
[0070]図5は、体細胞VDJ配列同定の詳細なスキームを示す。
[0071]図6Aは、選択した患者について初期のアラインメントと比較した重鎖の改良したアラインメントを示す。
図6Bは、選択した患者について初期のアラインメントと比較した軽鎖の改良したアラインメントを示す。重鎖のDセグメントおよび軽鎖のV−Jジャンクションにおいて急激なカバレッジの低下が観察できる。
[0072]図7は、重鎖Dセグメントのアセンブリーの可視化を示す。
[0073]図8は、アラインメントステージの後の補正されたDセグメントを有する重鎖のIGVプロットを示す。
[0074]図9は、生殖細胞系列およびCDR配列の同定の詳細なスキームを図示する。
[0075]図10は、体細胞超変異の強い証拠を示す本明細書に記載した方法を使用して同定した例示的な抗体を示す。
[0076]図11は、本発明のT細胞受容体融合ポリペプチド(TFP)の使用を実証する概略説明図である。例示的なTFPは、(G4S)3リンカー配列を介して融合した抗がん抗原(CAg)scFvと全長のCD3イプシロンポリペプチドを含む。T細胞によって産生されまたはT細胞に導入されたとき、TFPは、内因性T細胞受容体(TCR)の他のポリペプチド(2つのCD3イプシロンポリペプチド、1つのCD3ガンマポリペプチド、1つのCD3デルタポリペプチド、2つのCD3ゼータポリペプチド、1つのTCRアルファサブユニット、および1つのTCRベータサブユニットを含むことが示されており、ここで水平の灰色のセグメントは原形質膜を表す)と会合し、内因性CD3イプシロンポリペプチドの一方または両方がTFPによって置換されたリプログラムされたTCRを形成する。
[0077]図12Aは、本発明のリプログラムされたT細胞受容体融合ポリペプチド(TFP)の例示的な変形を実証する概略説明図を表す。(G4S)3リンカー配列を介して融合した抗CAg scFvと全長のTCR Vαポリペプチドを含むTFPを含む例示的なリプログラムされたTCRを図示している。[0078]図12Bは、i)(G4S)3リンカー配列を介して融合した抗CAg scFvと全長のTCR Vαポリペプチド、およびii)(G4S)3リンカー配列を介して融合した抗CAg scFvと全長のTCR Vβポリペプチドを含む多種TFPを含む一連の例示的なリプログラムされたTCRを図示する。[0079]図12Cは、i)(G4S)3リンカー配列を介して融合した抗CAg scFvと切断された(Δ)TCRポリペプチド、およびii)(G4S)3リンカー配列を介して融合した抗CAg scFvと全長のCD3イプシロンポリペプチドを含む多種TFPを含む例示的なリプログラムされたTCRを図示する。切断された(Δ)TCRポリペプチドはVαの欠失によって切断されている。[0080]図12Dは、i)(G4S)3リンカー配列を介して融合した抗CAg scFvと切断された(Δ)TCR Vαポリペプチド、およびii)(G4S)3リンカー配列を介して融合した抗CAg scFvと切断された(Δ)TCR Vβポリペプチドを含む多種TFPを含む例示的なリプログラムされたTCRを図示する。切断された(Δ)TCRポリペプチドはVβの欠失によって切断されている。
[0081]図13は、本発明のT細胞受容体融合ポリペプチド(TFP)の使用を実証する概略説明図である。例示的なTFPは、(G4S)3リンカー配列を介して融合した抗CAg VHドメインと全長のCD3イプシロンポリペプチドを含む。T細胞によって産生されまたはT細胞に導入されたとき、TFPは、内因性T細胞受容体(TCR)の他のポリペプチド(2つのCD3イプシロンポリペプチド、1つのCD3ガンマポリペプチド、1つのCD3デルタポリペプチド、2つのCD3ゼータポリペプチド、1つのTCRアルファサブユニット、および1つのTCRベータサブユニットを含むことが示されており、ここで水平の灰色のセグメントは原形質膜を表す)と会合し、内因性CD3イプシロンポリペプチドの一方または両方がTFPによって置換されたリプログラムされたTCRを形成する。
[0082]図14は、種々のTFPをコードするDNA構築物を実証する一連の概略説明図である。
[0083]図15Aおよび図15Bは、イノシトールポリリン酸5−ホスファターゼ1(SHIP1)を含むSrcホモロジー2(SH2)ドメインとしても公知である抗原INPP5DのTMEL1001抗体による特異的結合を示すタンパク質アレイデータである。図15Aは実験レプリケート1を示す。
図15Aおよび図15Bは、イノシトールポリリン酸5−ホスファターゼ1(SHIP1)を含むSrcホモロジー2(SH2)ドメインとしても公知である抗原INPP5DのTMEL1001抗体による特異的結合を示すタンパク質アレイデータである。図15Bは実験レプリケート2を示す。
[0084]図16Aおよび図16Bは、抗原クロモボックスタンパク質ホモログ1(CBX1)のTMEL1003抗体による特異的結合を示すタンパク質アレイデータである。図16Aは実験レプリケート1を示す。
図16Aおよび図16Bは、抗原クロモボックスタンパク質ホモログ1(CBX1)のTMEL1003抗体による特異的結合を示すタンパク質アレイデータである。図16Bは実験レプリケート2を示す。
[0085]図17Aおよび図17Bは、抗原クロモボックスタンパク質ホモログ5(CBX5)のTMEL1003抗体による特異的結合を示すタンパク質アレイデータである。図17Aは実験レプリケート1を示す。
図17Aおよび図17Bは、抗原クロモボックスタンパク質ホモログ5(CBX5)のTMEL1003抗体による特異的結合を示すタンパク質アレイデータである。図17Bは実験レプリケート2を示す。
[0086]図18Aおよび図18Bは、NY−ESO−1としても公知である抗原がん/精巣抗原1(CTAG1A)のTMEL1005抗体による特異的結合を示すタンパク質アレイデータである。図18Aは実験レプリケート1を示す。
図18Aおよび図18Bは、NY−ESO−1としても公知である抗原がん/精巣抗原1(CTAG1A)のTMEL1005抗体による特異的結合を示すタンパク質アレイデータである。図18Bは実験レプリケート2を示す。
[0087]図19Aおよび図19Bは、抗原アルファおよびガンマアダプチン結合タンパク質(AAGAB)のTMEL1006抗体による特異的結合を示すタンパク質アレイデータである。図19Aは実験レプリケート1を示す。
図19Aおよび図19Bは、抗原アルファおよびガンマアダプチン結合タンパク質(AAGAB)のTMEL1006抗体による特異的結合を示すタンパク質アレイデータである。図19Bは実験レプリケート2を示す。
[0088]図20Aおよび図20Bは、抗原キネシン軽鎖4タンパク質(KLC4)のTMEL1007抗体による特異的結合を示すタンパク質アレイデータである。図20Aは実験レプリケート1を示す。
図20Aおよび図20Bは、抗原キネシン軽鎖4タンパク質(KLC4)のTMEL1007抗体による特異的結合を示すタンパク質アレイデータである。図20Bは実験レプリケート2を示す。
[0089]図21Aおよび図21Bは、抗原黒色腫関連抗原3(MAGE−A3)のTMEL1008抗体による特異的結合を示すタンパク質アレイデータである。図21Aは実験レプリケート1を示す。
図21Aおよび図21Bは、抗原黒色腫関連抗原3(MAGE−A3)のTMEL1008抗体による特異的結合を示すタンパク質アレイデータである。図21Bは実験レプリケート2を示す。
[0090]図22Aおよび図22Bは、抗原無機ピロホスファターゼ(PPA1)のTMEL1010抗体による特異的結合を示すタンパク質アレイデータである。図22Aは実験レプリケート1を示す。
図22Aおよび図22Bは、抗原無機ピロホスファターゼ(PPA1)のTMEL1010抗体による特異的結合を示すタンパク質アレイデータである。図22Bは実験レプリケート2を示す。
[0091]図23Aおよび図23Bは、インターロイキン−14Aとしても公知であるアルファタキシリン(TXLNA)のTMEL1011抗体による特異的結合を示すタンパク質アレイデータである。図23Aは実験レプリケート1を示す。
図23Aおよび図23Bは、インターロイキン−14Aとしても公知であるアルファタキシリン(TXLNA)のTMEL1011抗体による特異的結合を示すタンパク質アレイデータである。図23Bは実験レプリケート2を示す。
[0092]図24A〜図24Eは、抗原O−結合型N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)トランスフェラーゼ(OGT)のTMEL1014抗体による特異的結合を示すタンパク質アレイデータである。図24Aは実験レプリケート1を示す。
図24A〜図24Eは、抗原O−結合型N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)トランスフェラーゼ(OGT)のTMEL1014抗体による特異的結合を示すタンパク質アレイデータである。図24Bは実験レプリケート2を示す。
図24A〜図24Eは、抗原O−結合型N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)トランスフェラーゼ(OGT)のTMEL1014抗体による特異的結合を示すタンパク質アレイデータである。図24Cは実験レプリケート3を示す。
図24A〜図24Eは、抗原O−結合型N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)トランスフェラーゼ(OGT)のTMEL1014抗体による特異的結合を示すタンパク質アレイデータである。図24Dは実験レプリケート4を示す。
図24A〜図24Eは、抗原O−結合型N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)トランスフェラーゼ(OGT)のTMEL1014抗体による特異的結合を示すタンパク質アレイデータである。図24Eは実験レプリケート5を示す。
発明の詳細な説明
[0093]当然に、これらは変化し得るため、本出願は特定の製剤またはプロセスパラメータに限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的で使用され、限定することを意図しないことも理解されたい。さらに、本発明の実施において、本明細書に記載されるものと類似または同等の多数の方法および材料を使用することができることが理解される。
[0094]本出願によれば、当該技術分野において十分に説明されているように、従来の分子生物学、微生物学、および組換えDNA技術を用いることができる。
[0095]以下の定義は、当該技術分野における定義を補足するものであり、現在の出願を対象としており、例えば、共通して所有されている特許または出願にいずれも関連または無関係の場合に帰属されるものではない。したがって、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的であり、限定することを意図しない。
[0096]本出願において、単数形の使用は、特に断らない限り、複数形を含む。本明細書で使用されるように、単数形「1つ(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。さらに、用語「含んでいる」、ならびに「含む(include)」、「含む(includes)」、および「含んだ」などの他の形態の使用は、限定するものではない。
[0097]用語「および/または」および「それらの任意の組み合わせ」および本明細書で使用されるそれらの文法的同等物は、互換的に使用することができる。これらの用語は、任意の組み合わせが特に意図されていることを伝えることができる。例示の目的のためだけに、以下の語句「A、B、および/またはC」または「A、B、C、またはそれらの任意の組み合わせ」は、「A、個別に;B、個別に;C、個別に;AおよびB;BおよびC;AおよびC;ならびに、A、BおよびC」を意味することができる。
[0098]用語「または」は、文脈が特に選言的使用に言及していない限り、結合的にまたは分離的に使用することができる。
[0099]用語「約」または「およそ」は、当業者によって決定される特定の値について許容可能な誤差範囲内を意味し、その値がどのように測定または決定されるか、すなわち、測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、「約」とは、当該技術分野における実施ごとに、1標準偏差または1を超える標準偏差内を意味することができる。あるいは、「約」は、所与の値の最大20%、最大10%、最大5%、または最大1%の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物システムまたはプロセスに関して、この用語は、値の1桁以内、好ましくは5倍以内、より好ましくは2倍以内を意味することができる。特定の値が出願および請求項に記載されている場合、別段の記載がない限り、特定の値に対する許容可能な誤差範囲内を意味する「約」なる用語が仮定されるべきである。
[00100]本明細書および請求項(複数可)において使用される場合、「含んでいる」(「含む(comprise)」および「含む(comprises)」などの任意の形態を含む)、「有している」(「有する(have)」および「有する(has)」などの任意の形態を含む)、「含んでいる」(「含む(includes)」および「含む(include)」などの任意の形態を含む)、または「含有している」(「含有する(contains)」および「含有する(contain)」などの任意の形態を含む)なる用語は、包括的または開放的であり、追加の引用されていないエレメントまたは方法工程を排除しない。本明細書において検討される任意の実施形態は、本発明の任意の方法または組成物に関して実施することができ、その逆も可能であることが企図される。さらに、本発明の組成物を使用して、本発明の方法を達成することができる。
[00101]本明細書で使用される場合、用語「から本質的になる」とは、所与の実施形態に必要とされるエレメントを指す。この用語は、本発明のその実施形態の基本的であり、新規なまたは機能的な特徴(複数可)に実質的に影響を及ぼさないエレメントの存在を可能にする。
[00102]本明細書で使用される場合、用語「からなる」は、本明細書に記載されるような組成物、方法、およびそれらの各成分を指し、実施形態のその説明に記載されていない任意のエレメントを排除する。
[00103]明細書において、「一部の実施形態」、「実施形態」、「一実施形態」または「他の実施形態」への言及は、実施形態に関連して記載された特定の特性、構造または特徴が、本発明の少なくとも一部の実施形態に含まれていることを意味するが、必ずしも全ての実施形態に含まれているわけではない。
[00104]用語「疾患」、「障害」、または「状態」は、本明細書においては互換的に使用され、身体の状態または臓器の一部における何らかの変化を指し、機能の遂行を中断するかもしくは妨げ、および/または不快感、機能不全、苦痛、または死亡のような症状を苦しんでいるヒトまたはヒトと接触しているヒトに引き起こす。疾患または障害はまた、ジステンパー、不調(ailing)、病気(ailment)、病気(malady)、障害、病気(sickness)、病気(illness)、病状(complaint)、または病気(affection)に関連し得る。
[00105]「それを必要とする」という用語は、治療的または予防的処置との関連で使用される場合、疾患を有すること、疾患と診断されること、または、例えば、疾患を発症するリスクがある者について、疾患を予防する必要があることを意味する。したがって、それを必要とする対象は、疾患を治療または予防することを必要とする対象であり得る。
[00106]本明細書で使用される場合、用語「投与する」とは、化合物(例えば、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性断片)を、所望の部位への薬剤の少なくとも部分的な送達をもたらす方法または経路によって対象に配置することを指す。本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物は、限定されはないが、静脈内、動脈内、注射または組織実質への直接注入などを含む、対象に有効な処置をもたらす任意の適切な経路によって投与することができる。必要に応じてまたは場合により、投与には、例えば、脳室内(「icv」)投与、鼻腔内投与、頭蓋内投与、腔内投与、小脳内投与、またはくも膜下腔内投与が含まれ得る。
[00107]用語「がん」とは、異常細胞の急速であり、制御不能な増殖によって特徴付けられる疾患を指す。がん細胞は局所的に拡がることがあり、または血流およびリンパ系を介して生体の他の部位に拡がることがある。
[00108]用語「抗腫瘍効果」とは、種々の手段、例えば、限定されないが、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、平均寿命の増加、腫瘍細胞増殖の減少、腫瘍細胞生存の減少、またはがん性状態に関連する種々の生理学的症状の改善によって発現し得る生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」はまた、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体の、そもそも腫瘍の発生を防止する能力によっても表すことができる。
[00109]本明細書で使用される場合、「対象」、「患者」、「個体」および類似の用語は、互換的に使用され、脊椎動物、哺乳動物、霊長類、またはヒトを指す。哺乳類には、限定されないが、ヒト、霊長類、げっ歯類、野生動物または家畜動物、例えば、野生化した動物、家畜、スポーツ動物およびペットが含まれる。霊長類には、例えば、チンパンジー、カニクイザル、クモサル、およびマカク、例えば、アカゲザルが含まれる。げっ歯類には、例えば、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギおよびハムスターが含まれる。家畜および狩猟動物には、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種、例えば、家畜ネコ、およびイヌ種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、トリ種、例えば、ニワトリ、エム、ダチョウ、および魚、例えば、マス、ナマズおよびサケが含まれる。用語「個人」、「患者」および「対象」は、本明細書において互換的に使用される。対象は、男性または女性であり得る。
[00110]一部の実施形態では、対象は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、制御されない細胞増殖に関連する状態または障害(例えば、がん)の動物モデルを表す対象として有利に使用することができる。非限定的な例としては、マウス腫瘍モデルが挙げられる。さらに、本明細書に記載される組成物および方法は、家畜および/またはペットを治療するために使用することができる。対象は、以前にがんと診断されたかまたはがんに罹患していると同定された者であり得る。対象は、診断され、現在治療されているか、または既存の治療処置による処置、モニタリング、調整もしくは修正を求めているか、あるいは所与の障害(例えば、がん)を発症するリスクがある対象であり得る。
[00111]「細胞傷害剤」とは、細胞に対して細胞傷害効果および/または細胞増殖抑制効果を有する薬剤を指す。「細胞傷害効果」とは、標的細胞(複数可)の枯渇、除去および/または死滅を指す。「細胞増殖抑制効果」とは、細胞増殖の阻害を指す。
[00112]本明細書で使用される場合、用語「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」は、互換的に使用され、隣接残基のアルファ−アミノ基とカルボキシ基の間のペプチド結合によって互いに連結された一連のアミノ酸残基を指定する。用語「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」とは、そのサイズまたは機能にかかわらず、修飾されたアミノ酸(例えば、リン酸化された、糖化された、グリコシル化されたなど)およびアミノ酸アナログを含む、アミノ酸のポリマーを指す。「タンパク質」および「ポリペプチド」は、比較的大きなポリペプチドに関してしばしば使用され、一方、「ペプチド」という用語は、小さなポリペプチドに関してしばしば使用されるが、これらの用語の使用は重複している。用語「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」は、遺伝子産物およびその断片を参照する場合、本明細書で互換的に使用される。これらの用語は、例えば、タンパク質配列の天然および人工タンパク質、タンパク質断片およびポリペプチドアナログ(例えば、突然変異タンパク質、バリアント、および融合タンパク質)、ならびに翻訳後に、または他には共有結合的もしくは非共有結合的に修飾されたタンパク質を包含する。ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、モノマーまたはポリマーであり得る。ポリペプチドは、任意の哺乳動物由来の天然に存在するポリペプチドのアミノ酸配列を有することができる。このような天然配列ポリペプチドは、天然から単離することができるか、または組換えもしくは合成手段によって製造することができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、「バリアント」である。「バリアント」とは、配列をアラインさせ、ギャップを導入して、必要に応じて、配列同一性の最大パーセントを達成した後、配列同一性の一部としていずれもの保存的置換を考慮しないで、天然配列ポリペプチドと少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性なポリペプチドを意味する。このようなバリアントとしては、例えば、1つ以上のアミノ酸残基がポリペプチドのN末端またはC末端に付加または欠失されるポリペプチドが挙げられる。一部の実施形態では、バリアントは、少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性を有する。一部の実施形態では、バリアントは、少なくとも約90%のアミノ酸配列同一性を有する。一部の実施形態では、バリアントは、天然配列ポリペプチドと少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性を有する。ポリペプチドの「誘導体」は、例えば、別の化学的部分(例えば、ポリエチレングリコールまたはアルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン)へのコンジュゲーション、リン酸化、およびグリコシル化を介して化学的に修飾されているポリペプチド(例えば、抗体)である。
[00113]用語「増加した」、「増加する」、または「増強する」は全て、本明細書では、一般的に、静的に有意な量による増加を意味し、疑義を避けるために、用語「増加した」、「増加する」、または「増強する」は、参照レベルと比較して少なくとも10%の増加を意味し、例えば、少なくとも約10%、少なくとも約20%、もしくは少なくとも約30%、もしくは少なくとも約40%、もしくは少なくとも約50%、もしくは少なくとも約60%、もしくは少なくとも約70%、もしくは少なくとも約80%、もしくは少なくとも約90%または最大そこまでの増加が挙げられ、あるいは参照レベルと比較して100%の増加もしくは10〜100%の任意の増加、または参照レベルと比較して少なくとも約2倍、もしくは少なくとも約3倍、もしくは少なくとも約4倍、もしくは少なくとも約5倍、もしくは少なくとも約10倍の増加、または2倍から10倍もしくはそれを超える任意の増加が挙げられる。
[00114]用語「融合タンパク質」は、本明細書で使用される場合、抗体またはその断片のアミノ酸配列、および異種ポリペプチド(すなわち、無関係なポリペプチド)のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。
[00115]用語「減少する」、「低減する」、「低減」、「低下する」もしくは「低下」、または「阻害する」は全て、本明細書では、一般的に、統計的に有意な量だけ減少を意味するために使用される。例えば、「減少する」、「低減する」、「低減」、または「阻害する」とは、参照レベルと比較して少なくとも10%の減少を意味し、例えば、参照レベルと比較して少なくとも約20%、もしくは少なくとも約30%、もしくは少なくとも約40%、もしくは少なくとも約50%、もしくは少なくとも約60%、もしくは少なくとも約70%、もしくは少なくとも約80%、もしくは少なくとも約90%または最大そこまでの減少が挙げられ、あるいは100%の減少(例えば、処置前の参照レベルと比較した処置後の腫瘍サイズ)、または10〜100%の任意の減少が挙げられる。マーカーまたは症状との関連では、これらの用語は、このようなレベルにおける統計的に有意な減少を意味する。減少は、例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%またはそれを超えることができ、好ましくは、所与の疾患を有さない個体について正常範囲内であると認められるレベルまで低下する。低減または阻害とは、例えば、処置される障害の症状、転移もしくは微小転移の存在またはサイズ、原発腫瘍のサイズ、休眠腫瘍の存在またはサイズを指すことができる。
[00116]用語「合成ポリヌクレオチド」、「合成遺伝子」または「合成ポリペプチド」とは、本明細書で使用される場合、対応するポリヌクレオチド配列もしくはその一部、またはそのアミノ酸配列もしくはその一部が、同等の天然に存在する配列と比較して、設計され、またはデノボ合成され、または修飾された配列に由来することを意味する。合成ポリヌクレオチド(抗体またはその抗原結合性断片)または合成遺伝子は、限定されないが、核酸またはアミノ酸配列の化学合成を含む、当該技術分野において公知である方法によって調製することができる。合成遺伝子は、典型的には、アミノ酸レベルまたはポリヌクレオチドレベルのいずれか(またはその両方)で、天然に存在する遺伝子とは異なるものであり、典型的には、合成発現制御配列との関連の中で位置される。合成遺伝子ポリヌクレオチド配列は、天然遺伝子と比較して、必ずしも異なるアミノ酸を有するタンパク質をコードするとは限らなくてもよいが、例えば、異なるコドンを取り込むが、同一のアミノ酸をコードする合成ポリヌクレオチド配列を包含することもできる(すなわち、ヌクレオチド変化はアミノ酸レベルでのサイレント突然変異を表す)。
抗体用語
[00117]本明細書で使用される場合、用語「抗体」とは、天然であるか、または部分的もしくは全体的に合成的で産生されるかを問わず、免疫グロブリン(Ig)を指す。この用語はまた、抗原結合ドメインであるかまたはそれと相同である結合ドメインを有する任意のポリペプチドまたはタンパク質を包含する。用語はさらに、「抗原結合性断片」および以下に記載される類似の結合断片についての他の交換可能な用語を含む。
[00118]抗体は、限定されないが、任意の特異的結合メンバー、免疫グロブリンクラスおよび/またはアイソタイプ(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD、IgEおよびIgM);ならびにその生物学的に関連する断片または特異的結合メンバーを含む。したがって、抗体は、例えば、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、組換え抗体、化学的に操作された抗体、脱免疫抗体、親和性成熟抗体、多特異性抗体(例えば、二特異性抗体および多反応性抗体)、ヘテロコンジュゲート抗体、抗体断片、およびそれらの組み合わせ(例えば、さらに脱免疫されたモノクローナル抗体、さらに脱免疫されたヒト化抗体など)を含む。
[00119]本開示は、がんの治療および/または診断において使用を見出すがん関連抗体を提供する。「がん関連抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、がん関連抗原に特異的な抗体を指す。一部の実施形態では、がん関連抗体は、がん関連抗原に特異的な少なくとも1つの抗原結合領域を含む。本明細書には、抗体の可変重鎖(VH)および可変軽鎖(VL)の完全な再構築された核酸コンセンサス配列および完全な再構築されたポリペプチドコンセンサス配列が開示される。VHおよびVLのCDR1、CDR2、およびCDR3の核酸およびポリペプチド配列もまた提供される。
[00120]天然の抗体および天然の免疫グロブリンは、通常、約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、2つの同一の軽鎖(L)および2つの同一の重鎖(H)で構成される。各軽鎖は、典型的には、1つの共有結合ジスルフィド結合によって重鎖に連結され、一方、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変動する。各重鎖および軽鎖はまた、規則的に間隔を置いた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン(「VH」)を有し、続いて多数の定常ドメイン(「CH」)を有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(「VL」)および他端に定常ドメイン(「CL」)を有し;軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第1の定常ドメインとアラインされ、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインとアラインされる。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの間に界面を形成すると考えられる。
[00121]本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、軽鎖の末端における欠失を含むことができる。本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、軽鎖の末端に3つ以上のアミノ酸の欠失を含むことができる。本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、軽鎖の末端に7つ以下のアミノ酸の欠失を含むことができる。本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、軽鎖の末端に3、4、5、6、または7つのアミノ酸の欠失を含むことができる。
[00122]本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、軽鎖への挿入を含むことができる。本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、軽鎖への1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10個、またはそれを超えるアミノ酸の挿入を含むことができる。本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、軽鎖への3つのアミノ酸の挿入を含むことができる。
[00123]本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る、可能性のある天然に存在する突然変異を除き、同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位に対して指向される。さらに、典型的には、異なる決定基(エピトープ)に対して指向される異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。修飾語句の「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られるものとしての抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495により最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製することができ、または組換えDNA法によって作製することができる。モノクローナル抗体はまた、例えば、McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554に記載される技術を用いて生成されたファージライブラリーから単離することができる。
[00124]本明細書で使用される場合、「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含む、特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらの断片(例えば、Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2または抗体の他の抗原結合サブ配列)である非ヒト(例えば、マウス)抗体の形態を指す。ほとんどの場合、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)であり、レシピエントの相補性決定領域(CDR)由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種(ドナー抗体)のCDR由来の残基で置換される。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはインポートされたCDRもしくはフレームワーク配列のいずれにも見出されないが、さらに精製し、抗体性能を最適化するために含まれる残基を含み得る。一般的に、ヒト化抗体は、CDR領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、FR領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも1つ、および典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域またはドメイン(Fc)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを最適に含む。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体に関して改変された1つ以上のCDR(1、2、3、4、5、6つ)を有し、これはまた、元の抗体由来の1つ以上のCDRから「誘導された」1つ以上のCDRと呼ばれる。
[00125]本明細書で使用される場合、「単離された抗体」は、その天然環境の成分から分離および/または回収された抗体である。天然環境の夾雑物成分は、抗体の診断的または治療的使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性成分を含み得る。好ましい実施形態では、抗体は、(1)Lowry法によって決定された抗体の95重量%超、最も好ましくは99重量%超;(2)スピニングカップ配列決定装置の使用によってN末端または内部アミノ酸配列の少なくとも15残基を得るのに十分な程度まで;または(3)還元条件下または非還元条件下でSDS−PAGEにより、およびクーマシーブルーまたは好ましくは銀染色を使用して示される均一性まで精製される。単離された抗体は、抗体の天然環境の少なくとも1つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイチュ抗体を含む。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも1つの精製工程によって調製される。
[00126]本明細書で使用される場合、用語「相補性決定領域」(CDR、すなわち、CDR1、CDR2、およびCDR3)は、抗原結合に必要である抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指す。各可変ドメインは、典型的には、CDR1、CDR2およびCDR3として同定される3つのCDR領域を有する。可変重鎖のCDRは、CDR−H1、CDR−H2およびCDR−H3であり得る。可変軽鎖のCDRは、CDR−L1、CDR−L2およびCDR−L3であり得る。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基26〜32(L1)、50〜52(L2)、91〜96(L3)、26〜32(H1)、53〜55(H2)、および96〜101(H3)に存在する(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。典型的なCDR(CDR−L1、CDR−L2、CDR−L3、CDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3)は、L1のアミノ酸残基24〜34、L2の50〜56、L3の89〜97、H1の31〜35B、H2の50〜65、およびH3の95〜102に存在する(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. (1991))。したがって、HVは、対応するCDR内に含まれ得、本明細書においてVHドメインおよびVLドメインの「超可変ループ」への言及は、別段の指示がない限り、対応するCDRも包含するものとして解釈されるべきであり、またその逆もまた同様である。可変ドメインのより高度に保存された領域は、以下に定義されるように、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、各々、4つのFR(それぞれ、FR1、FR2、FR3およびFR4)を含み、主に、3つの超可変ループによって連結された[ベータ]シートコンフィギュレーションを採用している。各鎖の超可変ループは、FRによって近接して一緒に保持され、他の鎖の超可変ループとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。抗体の構造解析は、配列と、相補性決定領域によって形成される結合部位の形状との間の関係を明らかにした(Chothia et al., J. Mol. Biol. 227: 799-817 (1992));Tramontano et al., J. Mol. Biol, 215: 175-182 (1990))。配列のばらつきが大きいにもかかわらず、6つのループのうち5つは、「標準的構造」と呼ばれる小さなレパートリーの主鎖のコンホメーションをとっているにすぎない。これらのコンホメーションは、何よりもまず、ループの長さによって決まり、第2に、ループのパッキング、水素結合または異常な主鎖のコンホメーションをとる能力によってコンホメーションを決定するループ内およびフレームワーク領域内の特定の位置の重要な残基の存在によって決まる。
[00127]抗体の「可変領域」とは、単独でまたは組み合わせて、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を指す。重鎖および軽鎖の可変領域は各々、超可変領域としても公知である3つの相補性決定領域(CDR)によって連結された4つのフレームワーク領域(FR)からなる。各鎖のCDRは、FRによって近接して一緒に保持され、他の鎖のCDRとともに抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。CDRを決定するために少なくとも2つの技術がある:(1)種間配列の変動に基づくアプローチ(すなわち、Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.));および(2)抗原抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ(Allazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948))。CDRは、いずれかのアプローチまたは両方のアプローチの組み合わせによって定義されるCDRを指すことができる。
[00128]抗体の「定常領域」とは、単独でまたは組み合わせて、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域を指す。定常領域は、抗原特異性に関して変化しない。
[00129]本明細書で使用される場合、用語「重鎖領域」は、免疫グロブリン重鎖の定常ドメインに由来するアミノ酸配列を含む。重鎖領域を含むポリペプチドは、CH1ドメイン、ヒンジ(例えば、上部、中部、および/または下部ヒンジ領域)ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン、またはそれらのバリアントもしくは断片のうちの少なくとも1つを含む。ある実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、免疫グロブリン重鎖(例えば、ヒンジ部分、CH2ドメイン、およびCH3ドメイン)のFc領域を含み得る。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、少なくとも定常ドメイン(例えば、CH2ドメインの全部または一部)の領域を欠いている。ある種の実施形態では、定常ドメインの少なくとも1つ、好ましくは全てが、ヒト免疫グロブリン重鎖に由来する。例えば、1つの好ましい実施形態では、重鎖領域は、完全ヒトヒンジドメインを含む。他の好ましい実施形態では、重鎖領域は、完全ヒトFc領域(例えば、ヒト免疫グロブリン由来のヒンジ、CH2およびCH3ドメイン配列)を含む。ある種の実施形態では、重鎖領域の構成定常ドメインは、異なる免疫グロブリン分子に由来する。例えば、ポリペプチドの重鎖領域は、IgG1分子に由来するドメイン、およびIgG3またはIgG4分子に由来するヒンジ領域を含み得る。他の実施形態では、定常ドメインは、異なる免疫グロブリン分子の領域を含むキメラドメインである。例えば、ヒンジは、IgG1分子からの第1の領域、およびIgG3またはIgG4分子からの第2の領域を含み得る。上述したように、当業者には、重鎖領域の定常ドメインは、それらが天然に存在する(野生型)免疫グロブリン分子からアミノ酸配列が変化するように修飾され得ることが理解される。すなわち、本明細書に開示される本発明のポリペプチドは、重鎖定常ドメイン(CH1、ヒンジ、CH2またはCH3)および/または軽鎖定常ドメイン(CL)の1つ以上に対する改変または修飾を含み得る。例示的な修飾は、1つ以上のドメインにおける1つ以上のアミノ酸の付加、欠失または置換を含む。
[00130]本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、長さが少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30アミノ酸の長さであるCDR3領域を含むことができる。本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、長さが少なくとも約18アミノ酸であるCDR3領域を含むことができる。
[00131]本明細書で使用される場合、用語「ヒンジ領域」は、CH1ドメインをCH2ドメインに接続する重鎖分子の領域を含む。ヒンジ領域はおよそ25残基を含むことができ、可撓性であり、したがって、2つのN末端抗原結合領域が独立して移動することを可能にする。ヒンジ領域は、上部、中部、および下部のヒンジ領域の3つの異なるドメインに細分することができる(Roux et al. J. Immunol. 1998 161:4083)。
[00132]本明細書で使用される場合、用語「Fv」は、完全な抗原認識および結合部位を含む最小抗体断片である。この断片は、密接に非共有結合している1つの重鎖および1つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。
[00133]これら2つのドメインのフォールディングから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を付与する6つの超可変ループ(H鎖とL鎖からそれぞれ3つのループ)が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン(または抗原に特異的な3つのCDRのみを含むFvの半分)でさえ、抗原を認識し、結合する能力を有するが、結合部位全体よりも低い親和性である。
[00134]抗体に関する「重鎖可変領域」または「VH」とは、フレームワーク領域として公知である隣接するストレッチ間に介在する3つのCDRを含む重鎖の断片を指し、これらのフレームワーク領域は、一般的に、CDRよりも高度に保存され、CDRを支持する足場を形成する。
[00135]6つの超可変ループ(それぞれH鎖とL鎖から3つのループ)は抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン(または抗原に特異的な3つのCDRのみを含むFvの半分)でさえ、抗原を認識し、結合する能力を有するが、結合部位全体よりも低い親和性である。
[00136]「フレームワーク」またはFR残基は、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
[00137]抗体は、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも2つの重(H)鎖および2つの軽(L)鎖、またはその抗原結合部分を有する糖タンパク質であることが当該技術分野において理解される。重鎖は、重鎖可変領域(VH)および重鎖定常領域(CH1、CH2およびCH3)で構成される。軽鎖は、軽鎖可変領域(VL)および軽鎖定常領域(CL)で構成される。重鎖と軽鎖の両方の可変領域は、フレームワーク領域(FRまたはFWR)および超可変領域(HVR)を含む。HVRは、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基である。超可変領域は、一般的に、最も高い配列変動性を有し、および/または抗原認識に関与する相補性決定領域(CDR)由来のアミノ酸残基を含む。VH中のCDR1を除いて、CDRは、一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。CDRはまた、抗原と接触する残基である「特異性決定残基」または「SDR」を含む。SDRは、略称CDRまたはa−CDRと呼ばれるCDRの領域内に含まれる。例示的なa−CDR(a−CDR−L1、a−CDR−L2、a−CDR−L3、a−CDR−H1、a−CDR−H2、およびa−CDR−H3)は、L1のアミノ酸残基31〜34、L2の50〜55、L3の89〜96、H1の31〜35B、H2の50〜58、およびH3の95〜102に存在する(例えば、Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照されたい)。
[00138]別段の指示がない限り、可変ドメイン中のHVR残基および他の残基(例えば、FR残基)は、本明細書では、Kabatら(前掲)に従って番号付けされる。可変領域は、抗原に対する抗体の結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインである(例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., p.91 (2007)を参照されたい)。単一のVHまたはVLドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体からVHまたはVLドメインを用いて単離し、それぞれ相補的VLまたはVHドメインのライブラリーをスクリーニングすることができる(例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993);Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照されたい)。4つのFWR領域は、典型的には、より保存され、一方、CDR領域(CDR1、CDR2およびCDR3)は、超可変領域を表し、以下:FWR1、CDR1、FWR2、CDR2、FWR3、CDR3およびFWR4のようにNH2末端からCOOH末端に配列される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含み、一方、イソタイプに応じて、定常領域(複数可)は、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。抗体はまた、キメラ抗体、ヒト化抗体、および組換え抗体、トランスジェニック非ヒト動物から生成されたヒト抗体、ならびに当業者に利用可能な濃縮技術を使用してライブラリーから選択された抗体を含む。
[00139]用語「抗体重鎖」とは、天然に存在するコンホメーションで抗体分子中に存在し、通常、抗体が属するクラスを決定する2つのタイプのポリペプチド鎖のうち大きい方を指す。
[00140]用語「抗体軽鎖」とは、天然に存在するコンホメーションで抗体分子中に存在する2つのタイプのポリペプチド鎖のうちの小さい方を指す。カッパ(「κ」)およびラムダ(「λ」)軽鎖は、2つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
[00141]抗体またはその抗原結合性断片は、それが非関連ポリペプチド上のエピトープに結合するよりも高い親和性および/または結合活性で結合する場合、標的に「特異的に結合する」または「優先的に結合する」。抗体もしくはその抗原結合性断片またはその一部の特異性は、親和性および/または結合活性に基づいて決定することができる。このような特異的結合を決定する方法は、当該技術分野において周知である。本開示のある種の実施形態によれば、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトがん抗原に結合することができるが、他の種由来のがん抗原には結合することはできない。あるいは、ある種の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトがん抗原、および1つ以上の非ヒト種由来のがん抗原に結合する。例えば、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトがん抗原に結合することができ、場合に応じて、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、アレチネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザルまたはチンパンジーのがん抗原のうちの1つ以上に結合するかまたは結合しないことができる。
[00142]親和性は、抗原結合タンパク質を有する抗原の解離の平衡定数(KD)で表され、抗原決定基と抗原結合タンパク質上の抗原結合部位との結合強度の尺度である。KDの値が小さいほど、抗原決定基と抗原結合分子の結合強度は強くなる。あるいは、親和性は、1/KDである親和性定数(KA)として表すこともできる。当業者に明らかなように、親和性は、目的の特定の抗原に依存して、それ自体公知である方法で決定することができる。したがって、本明細書において定義される抗体またはその抗原結合性断片は、上記アミノ酸配列またはポリペプチドが別の標的またはポリペプチドに結合する親和性よりも少なくとも50倍、例えば、少なくとも100倍、好ましくは少なくとも1000倍、および最大10,000倍またはそれを以上である親和性(上記され、例えば、KD値として適切に表される)で第1の抗原に結合する場合、第2の標的または抗原と比較して、第1の標的または抗原「に特異的」であると言われる。好ましくは、抗体またはその抗原結合性断片が、別の標的または抗原と比較して、標的または抗原「に特異的」である場合、それは標的または抗原に結合することができるが、他の標的または抗原には結合しない。しかしながら、当業者に理解されるように、一部の実施形態では、標的上の結合部位が複数の異なるリガンドによって共有されるかまたは部分的に共有される場合、抗体またはその抗原結合性断片は、がん関連抗原などの標的に特異的に結合することができ、例えば、腫瘍進行を阻害/防止する機能的効果を有することができる。
[00143]一部の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、約1μM、100nM、10nM、5nM、2nM、1nM、0.5nM、0.1nM、0.05nM、0.01nM、もしくは0.001nMまたはそれ未満(例えば、10−8Mまたはそれ未満、例えば、10−8M〜10−13M、例えば、10−9M〜10−13M)の解離定数(KD)を有する。本発明の別の態様は、その標的に対する増大した親和性を有する抗体またはその抗原結合性断片、例えば親和性成熟抗体を提供する。親和性成熟抗体は、変化を持たない親抗体と比較して、1つ以上の超可変領域(HVR)における1つ以上の変化を有する抗体であり、このような変化は抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす。これらの抗体は、5×10−9M、2×10−9M、1×10−9M、5×10−10M、2×10−10M、1×10−10M、5×10−11M、1×10−11M、5×10−12M、1×10−12M、またはそれ未満のKDで抗原に結合することができる。一部の実施形態では、本開示は、重鎖配列および軽鎖配列、またはその両方を含む生殖細胞系列抗体と比較して、少なくとも1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍またはそれを超える増大した親和性を有する抗体またはその抗原結合性断片を提供する。他の実施形態では、本明細書に記載される抗体と同じエピトープへの結合について競合する抗体が提供される。一部の実施形態では、同一のエピトープに結合する、および/または抗体と同じエピトープに結合するために競合する抗体またはその抗原結合性断片は、例えば、ADCC活性を含むFc媒介細胞傷害性などのエフェクター機能活性を示す。
[00144]KDは、任意の適切なアッセイによって測定することができる。例えば、KDは、放射性標識抗原結合アッセイ(RIA)(例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999);Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997))によって測定することができる。例えば、KDは、表面プラズモン共鳴アッセイ(例えば、BIACORE(登録商標)−2000またはBIACORE(登録商標)−3000を使用する)を用いて測定することができる。例えば、KDは競合ELISAを用いて測定することができる。
[00145]結合活性は、抗原結合分子と関連抗原との結合の強さの尺度である。
結合活性は、抗原決定基と抗原結合分子上のその抗原結合部位との親和性、および抗原結合分子上に存在する関連結合部位の数の両方に関係する。典型的には、抗原結合タンパク質は、解離定数(10−5〜10−12モル/リットル以下、好ましくは10−7〜10−12モル/リットル以下、より好ましくは10−8〜10−12モル/リットル以下のKD(すなわち、105〜1012リットル/モル以上、好ましくは107〜1012リットル/モル以上、より好ましくは108〜1012リットル/モルの結合定数(KA)))で、それらのコグネートまたは特異的抗原に結合する。10−4mol/リットルを超える任意のKD値(または104M−1を下回る任意のKA値)は、一般的に、非特異的結合を示すと考えられる。意味のある(例えば特異的である)と考えられる生物学的相互作用のためのKDは、典型的には、10−10M(0.1nM)〜10−5M(10000nM)の範囲である。相互作用が強いほど、KDは低くなる。好ましくは、本明細書に記載される抗LAP抗体またはその抗原結合性断片上の結合部位は、500nM未満、好ましくは200nM未満、より好ましくは10nM未満、例えば500pM未満の親和性で結合する。抗原結合タンパク質の抗原または抗原決定基への特異的結合は、例えば、スキャッチャード分析および/または競合結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素イムノアッセイ(EIA)およびサンドイッチ競合アッセイ、ならびに当該技術分野においてそれ自体公知である異なるバリアント、ならびに本明細書に記載される他の技術を含む、任意の適切なそれ自体公知の方法で決定することができる。
[00146]用語「kon」は、本明細書で使用される場合、抗体またはその抗原結合性断片の抗原への結合の速度定数を指すことを意図する。
[00147]用語「Koff」は、本明細書で使用される場合、抗体/抗原複合体からの抗体またはその抗原結合性断片の解離の速度定数を指すことを意図する。
[00148]「組換えヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、組換え手段によって調製、発現、作製または単離された全てのヒト抗体、例えば、(a)ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックもしくはトランスクロモソームである動物(例えば、マウス)またはそれらから調製されたハイブリドーマから単離された抗体(以下にさらに記載される)、(b)ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体、(c)組換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、および(d)ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のDNA配列にスプライシングすることを伴う任意の他の手段によって調製、発現、作製または単離された抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、フレームワークおよびCDR領域が、本明細書に開示される再構築された免疫グロブリンコンセンサス配列に由来する可変領域を有する。しかしながら、ある種の実施形態では、このような組換えヒト抗体は、インビトロ突然変異誘発(または、ヒトIg配列についてトランスジェニックな動物が使用される場合、インビボ体細胞突然変異誘発)に供することができ、したがって、組換え抗体のVHおよびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト免疫グロブリンVHおよびVL配列から誘導され、それに関連するが、インビボではヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内には天然に存在し得ない配列である。
[00149]抗体またはその抗原結合性断片との関連では、用語「特異性」または「に特異的な」は、特定の抗体またはその抗原結合性断片が結合することができる異なるタイプの抗原または抗原決定基の数を指す。抗体もしくはその抗原結合性断片またはその一部の特異性は、親和性および/または結合活性に基づいて決定することができる。親和性は、抗原結合タンパク質を有する抗原の解離の平衡定数(KD)で表され、抗原決定基と抗原結合タンパク質上の抗原結合部位との結合強度の尺度である。KDの値が小さいほど、抗原決定基と抗原結合分子の結合強度は強くなる。あるいは、親和性は、1/KDである親和性定数(KA)として表すこともできる。当業者に明らかなように、親和性は、目的の特定の抗原に依存して、それ自体公知である方法で決定することができる。したがって、本明細書において定義される抗体またはその抗原結合性断片は、上記アミノ酸配列またはポリペプチドが別の標的またはポリペプチドに結合する親和性よりも少なくとも50倍、例えば、少なくとも100倍、好ましくは少なくとも1000倍、および最大10,000倍またはそれを以上である親和性(上記され、例えば、KD値として適切に表される)で第1の抗原に結合する場合、第2の標的または抗原と比較して、第1の標的または抗原「に特異的」であると言われる。好ましくは、抗体またはその抗原結合性断片が、別の標的または抗原と比較して、標的または抗原「に特異的」である場合、それは標的または抗原に結合することができるが、他の標的または抗原には結合しない。
[00150]しかしながら、当業者に理解されるように、一部の実施形態では、標的上の結合部位が複数の異なるリガンドによって共有されるかまたは部分的に共有される場合、抗体またはその抗原結合性断片は、がん関連抗原などの標的に特異的に結合することができ、例えば、腫瘍進行を阻害/防止する機能的効果を有することができる。
[00151]結合活性は、抗原結合分子と関連抗原との結合の強さの尺度である。結合活性は、抗原決定基と抗原結合分子上のその抗原結合部位との親和性、および抗原結合分子上に存在する関連結合部位の数の両方に関係する。典型的には、抗原結合タンパク質は、解離定数(10−5〜10−12モル/リットル以下、好ましくは10−7〜10−12モル/リットル以下、より好ましくは10−8〜10−12モル/リットルのKD(すなわち、105〜1012リットル/モル以上、好ましくは107〜1012リットル/モル以上、より好ましくは108〜1012リットル/モルの結合定数(KA)))で、それらのコグネートまたは特異的抗原に結合する。10−4mol/リットルを超える任意のKD値(または104M−1を下回る任意のKA値)は、一般的に非特異的結合を示すと考えられる。意味のある(例えば、特異的である)と考えられる生物学的相互作用のためのKDは、典型的には、10−10M(0.1nM)〜10−5M(10000nM)の範囲である。相互作用が強くなるほど、KDは低くなる。好ましくは、本明細書に記載される抗LAP抗体またはその抗原結合性断片上の結合部位は、500nM未満、好ましくは200nM未満、より好ましくは10nM未満、例えば500pM未満の親和性で結合する。抗原結合タンパク質の抗原または抗原決定基への特異的結合は、例えばラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素イムノアッセイ(EIA)およびサンドイッチ競合アッセイなどのスキャッチャード分析および/または競合結合アッセイ、および当該技術分野においてそれ自体が公知である異なるバリアント、ならびに本明細書に記載される他の技術を含む、それ自体が公知である任意の適切な方法で決定することができる。
[00152]用語「融合タンパク質」とは、本明細書で使用される場合、抗体またはその断片のアミノ酸配列、および異種ポリペプチド(すなわち、無関係なポリペプチド)のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。
[00153]本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され、記載されてきたが、このような実施形態が例示としてのみ提供されることは当業者には自明である。ここで、本発明から逸脱することなく、当業者に多くの変形、変化、および置換が生じる。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する種々の代替物が、本発明を実施する際に使用され得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を画定し、これらの特許請求の範囲およびそれらの同等物の範囲内の方法および構造が、それによってカバーされることが意図される。
[00154]一部の実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、単一ドメイン抗体である。「単一ドメイン抗体」(sdAbs)または「単一可変ドメイン(SVD)抗体」という表現は、一般的に、抗体−抗原結合が付与され得る単一可変領域(VHまたは’)を指す。言い換えると、単一可変ドメインは、別の可変領域と相互作用することによって標的抗原を認識する必要はない。単一ドメイン抗体モノマーは、各抗体可変領域(VH*VJ組成物によって結合する単一アーム抗原結合。単一ドメイン抗体の例としては、ラクダ科(ラクダおよびラマ)および軟骨魚(例えば、テンジクザメ)抗体由来のもの、ならびに組換え法によるヒトおよびマウス抗体由来の抗体(Ward et al, Nature (1989) 341: 544-546;Dooley and Flajnik, Dev Comp Immunol (2006) 30: 43-56;Muyldermans et, TrendBiochem Sci (2001) 26: 230-235;Holt et, Trends Biotechnol (2003): 21: 484-490;WO2005/035572;TO03/035694;Davies and Riechmann, Febs Lett (1994) 339: 285-290;WO00/29004;WO02/051870)が挙げられ、抗体の単一可変領域は、単一ドメイン抗体可変領域以外であり得、可変ドメインは抗原結合アーム(例えば、ともにホモまたはヘテロ多量体)に存在する。
計算により再構築された抗体
[00155]本明細書には、がん関連抗体のための再構築されたポリペプチドおよび核酸コンセンサス配列が提供される。コンセンサス配列をインシリコで再構築する。用語「ポリペプチドコンセンサス配列」とは、本明細書で使用される場合、任意の特定のサブクラスまたはサブユニット構造の全ての免疫グロブリン中の各位置において最も頻繁に生じるアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を指す。ポリペプチドコンセンサス配列は、特定の種または多くの種の免疫グロブリンに基づくことができる。ポリペプチド「コンセンサス」配列、「コンセンサス」構造、または「コンセンサス」抗体は、本明細書に提供されるある種の実施形態に記載されるヒトポリペプチドコンセンサス配列を包含し、任意の特定のサブクラスまたはサブユニット構造の全てのヒト免疫グロブリン中の各位置において最も頻繁に生じるアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を指すと理解される。本明細書における実施形態は、コンセンサスヒト構造、およびヒトに加えて他の種を考慮するコンセンサス構造を提供する。
[00156]用語「核酸コンセンサス配列」とは、本明細書で使用される場合、任意の特定のサブクラスまたはサブユニット構造の全ての免疫グロブリン核酸配列中の各位置において最も頻繁に生じるヌクレオチド残基を含む核酸配列を指す。核酸コンセンサス配列は、特定の種または多くの種の免疫グロブリンに基づくことができる。核酸「コンセンサス」配列、または「コンセンサス」構造は、本発明のある種の実施形態に記載されるヒト核酸コンセンサス配列を包含し、任意の特定のサブクラスまたはサブユニット構造の全てのヒト免疫グロブリン核酸中の各位置において最も頻繁に生じるヌクレオチド残基を含む核酸配列を指すと理解される。
[00157]本明細書には、コンセンサスヒト構造、およびヒトに加えて他の種のコンセンサス構造が提供される。RNA配列データからコンセンサス配列を計算的に再構築する方法は、本明細書の実施例に記載される。完全長抗体レパートリーを再構築するための、当該技術分野において公知である計算ツールの非限定的な例としては、MIGEC(Shugay et al. 2014)、PRESTO(Vander Heiden et al. 2014), MiXCR (Bolotin et al. 2015)、およびIGREPERTOIRECONSTRUCTOR(Safonova et al. 2015)が挙げられる。一部の実施形態では、StubbingtonおよびTeichmannによるTraCeRパイプラインが実施され、これは、国際免疫原性情報システム(IMGT)リポジトリー内の全ての公知のヒトVおよびJ遺伝子セグメント/対立遺伝子についてのインシリコでの組み合わせを含むカスタムデータベースに対する予備フィルタリング工程の後にデノボでアセンブリーを使用する。一部の実施形態では、TCR遺伝子にマッピングし、続いてTrinityベースのアセンブリーを行うことによってリード中でフィルタリングする別のパイプラインであるVDJPuzzleが実施される;それによって、総リードは、次に、最初のマッピング工程において見逃されたリードを回収するためにアセンブリーにマッピングされ、その後、Trinityを用いてアセンブリーの別のラウンドが行われる。コンセンサス配列を計算的に再構築するための例示的な方法は、体細胞配列同定、手動IGV調査、および(必要であれば)体細胞vdj配列の修正、ならびに生殖細胞系列配列およびCDR領域の同定を含むことができる。
[00158]一部の実施形態では、患者、例えば、がん患者のために検索されたRNA−seq FASTQファイルが記録され、分析される。一部の実施形態では、Kallisto、BWA、MiXCRまたは他の公知のツールを使用して、試料中に存在するレパートリーを同定するために、免疫グロブリンの参照V、DおよびJ遺伝子に対するRNA−seq試料の第1のアラインメントを行うことができる。さらなる実施形態では、同一のCDR3配列が同定され、クロノタイプ(Bolotin DA et al., Nature Methods, 2015.;Bolotin DA et al. Nature biotechnology, 2017)にグループ化される。一部の実施形態では、VDJtoolsを使用して(Shugay M. et al. PLoS computational biology, 2015)、非機能性(非コード)クロノタイプをフィルタリングし、基本的な多様性統計を計算する。さらなる実施形態では、非機能性クロノタイプは、それらの受容体配列中に停止コドンまたはフレームシフトを含むものとして同定される。一部の実施形態では、Igレパートリーの多様性は、Shannon−Wienerエントロピーインデックス(MacArthur RH. Biological reviews. 1965)の指数として計算される種の有効数に基づいて得られる。
[00159]一部の実施形態では、試料中に存在する免疫グロブリンセグメントに対するさらなるアラインメントが、V、D、J遺伝子セグメントに沿った配列ミスマッチの頻度分布、特にCDR3領域の長さの統計について調べるために結果を一覧するために実施される。このアラインメント工程は、例えば、レパートリーを要約するとともに、個々のクエリー配列について再構成および領域アラインメントの詳細な一覧を提供するのに有用であり得る。アライメントおよびアセンブリーのための例示的方法は、本明細書の実施例に記載される。
[00160]一部の実施形態では、試料中に存在する免疫グロブリンセグメントは、IMGT参照ファイルまたは同等物を用いて同定される。場合によっては、重鎖Dセグメントおよび軽鎖V−Jジャンクション配列は、アセンブラーを用いてアセンブルすることができる。当該技術分野において公知であるアセンブラーの非限定的な例としては、TrinityおよびV’DJerが挙げられる。一部の実施形態では、修正された重鎖Dおよび軽鎖V−Jジャンクション配列を有するFASTAファイルは各試料について生成することができる。アセンブルされたFASTAファイルに加えて、生殖細胞系列FASTファイルは、例えば、IgBLAST v1.9.0(Ye J, et al Nucleic Acids Research, 2013)およびIMGTデータベースを使用することによって生成することができる。さらなる実施形態では、体細胞FASTA配列を、IgBLASTに入力して、重鎖および軽鎖に対して最も近いセグメントidを得ることができる。IMGTデータベースから対応するセグメント配列をマージすることによって生殖細胞系列FASTAを生成することができる。最終的にアセンブルされたFASTA配列は、アラインメントおよび可視化工程のための「参照」配列として役立つことができる。
[00161]さらなる実施形態では、アセンブリー工程から生成された参照ファイルを使用して、FASTQをBowTie2デフォルトモードでアラインさせることができる。当技術分野で公知の他のアライメントツール、例えばSTARまたはTopHat2もまた使用することができる。出力BAMファイルは、IGVの可視化に使用することができ、患者の突然変異を観察することができる。
[00162]さらなる実施形態では、最終的にアセンブルされたFASTA配列からのCDR3領域および対応するV、D、およびJ鎖の同定は、例えばIgBLASTを用いて行うことができる。バージョンv.1.9.0のIgBLASTを使用する標準化された出力は、場合によっては、デフォルトパラメーターでIgBLASTnをラッピングすることによって得ることができる。他の例では、IgBLASTサービスからの出力は、CDR1、CDR2およびCDR3ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を抽出するように設計された目的構築パーサーツールを用いて抽出することができる。
例示的ながん関連抗体またはその抗原結合性断片
[00163]別の態様では、本開示は、インシリコで再構築されたコンセンサス配列を含むがん関連抗体を提供する。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、がん細胞の溶解を誘導する。溶解は、例えば、エフェクター機能、例えばC1q結合および補体依存性細胞傷害性(CDC);Fc受容体結合;抗体依存性の細胞媒介性細胞傷害性(ADCC);ファゴサイトーシス、または細胞アポトーシスの直接誘導を媒介することによる、任意のメカニズムによって誘導することができる。
[00164]一部の実施形態では、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性断片は、操作されていない親抗体またはその抗原結合性断片と比較して、エフェクター機能の少なくとも1つの増加を有するように操作される。エフェクター機能は、抗体のアイソタイプによって変化する、抗体のFc領域に起因する生物学的活性である。抗体エフェクター機能の例には、C1q結合および補体依存性細胞傷害性(CDC);Fc受容体結合;抗体依存性の細胞媒介性細胞傷害性(ADCC);ファゴサイトーシスが含まれる。例えば、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性断片は、糖操作されていない親と比較して、エフェクター機能の少なくとも1つの増加を有するように糖操作することができる。抗体依存性細胞傷害性(ADCC)は、抗体のIgG Fab部分と細胞表面上のウイルスタンパク質との間の複合体の形成、およびエフェクター細胞上のFc部分のFc受容体(FcγR)への結合の結果である。エフェクター機能の増加は、Fc受容体への結合親和性の増加、ADCCの増加、細胞媒介性免疫の増加;細胞傷害性CD8 T細胞への結合の増加;NK細胞への結合の増加;マクロファージへの結合の増加;多形核細胞への結合の増加;単球への結合の増加;マクロファージへの結合の増加;大型顆粒リンパ球への結合の増加;顆粒球への結合の増加;アポトーシスを誘導する直接シグナル伝達;樹状細胞成熟の増加;またはT細胞プライミングの増加であり得る。
TMEL1001−TMEL1014
[00165]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、および14のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するVH配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するVH配列は、参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入または欠失を含むが、抗体は、親と同じ抗原(例えば、がん関連抗原)に結合する能力を保持する配列を含む。一部の実施形態では、全部で1〜10個のアミノ酸が、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、および14のいずれか1つのアミノ酸配列において置換され、挿入されおよび/または欠失されている。一部の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(例えば、FR)において起こる。場合により、抗体は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、または14のアミノ酸配列のVH配列を含み、その配列の1つ以上の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、VHは、(a)配列番号85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、および98のいずれか1つのアミノ酸配列を含むCDR−H1、(b)配列番号57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、および70のいずれか1つのアミノ酸配列を含むCDR−H2、ならびに(c)配列番号29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、および42のいずれか1つのアミノ酸配列を含むCDR−H3から選択される1つ、2つまたは3つのCDRを含む。
[00166]一態様では、配列番号15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、および28のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン(VL)を含む抗体またはその抗原結合性断片が提供される。一部の実施形態では、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するVL配列は、参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入または欠失を含むが、抗体またはその抗原結合性断片は、親と同じ抗原(例えば、がん関連抗原)に結合する能力を保持する配列を含む。一部の実施形態では、全部で1〜10個のアミノ酸が、配列番号15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、および28のいずれか1つのアミノ酸配列のいずれか1つにおいて置換され、挿入され、および/または欠失されている。一部の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(例えば、FR)で起こる。場合により、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、および28のいずれか1つのVL配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、VLは、(a)配列番号99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、および112のいずれか1つのアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号71、72、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、および84のいずれか1つのアミノ酸配列を含むCDR−L2;ならびに(c)配列番号43、44、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、および56のいずれか1つのアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される1つ、2つまたは3つのCDRを含む。
[00167]一態様では、上記に提供された実施形態のいずれかにおけるVH、および上記に提供された実施形態のいずれかにおけるVLを含む抗体またはその抗原結合性断片が提供される。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、VHおよびVLを含み、VHは、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、および14のいずれか1つのアミノ酸配列を含み、VLは、配列番号15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、および28のいずれか1つのアミノ酸配列を含み、場合により、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
[00168]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、表1の任意のVHから選択されるVHを含む。一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、表1の任意のVLから選択されるVLを含む。一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、表1の任意のVHから選択されるVH、および表1の任意のVLから選択されるVLを含む。一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、表1の任意のVHから選択されるVH、および表1の任意のVLから選択されるVLを含み、選択されたVHおよびVLは表7に従って対合される。一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、表2の任意のCDR−H3から選択されるCDR−H3、および表2の任意のCDRL3から選択されるCDR−L3を含み、選択されたCDR−H3およびCDRL3は表7に従って対合される。一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、表2の任意のCDR−H2から選択されるCDR−H2、および表2の任意のCDR−L2から選択されるCDR−L2を含み、選択されたCDR−H2およびCDR−L2は表7に従って対合される。一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、表2の任意のCDR−H1から選択されるCDR−H1、および表2の任意のCDR−L1から選択されるCDR−L1を含み、選択されたCDR−H1およびCDR−L1は表7に従って対合される。一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、表2の任意のCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3から選択されるCDR−H1、CDR−H2、およびCDR−H3、ならびに表2の任意のCDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3から選択されるCDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3を含み、選択されたCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2、およびCDR−L3は表7に従って対合される。
TMEL1001
[00169]一態様では、本開示は、(a)配列番号1のアミノ酸配列を含むVH、(b)配列番号15のアミノ酸配列を含むVL、および(c)それらの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の可変領域を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00170]一態様では、本開示は、(a)配列番号85のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号57のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR−H3;(d)配列番号99のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(e)配列番号71のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(f)配列番号43のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される、少なくとも1、2、3、4、5または6つのCDRを含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00171]一態様では、本開示は、(a)配列番号85のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号57のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR−H3;および(d)配列番号15のアミノ酸配列を含むVLから選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00172]一態様では、本開示は、(a)配列番号99のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号71のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(c)配列番号43のアミノ酸配列を含むCDR−L3;および配列番号1のアミノ酸配列を含むVHから選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00173]一態様では、本開示は、CDR:配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR−H3;および配列番号43のアミノ酸配列を含むCDR−L3を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00174]一態様では、本明細書における開示は、(a)配列番号99のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号71のアミノ酸配列を含むCDR−L2、および(c)配列番号43のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。一態様では、本開示は、(a)配列番号85のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号57のアミノ酸配列を含むCDR−H2、および(c)配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR−H3から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00175]一態様では、本開示は、CDR:(a)配列番号85のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号57のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR−H3;(d)配列番号99のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(e)配列番号71のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(f)配列番号43のアミノ酸配列を含むCDR−L3を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00176]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するVH配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するVH配列は、参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入または欠失を含むが、抗体またはその抗原結合性断片は、抗原に結合する能力を保持する配列を含む。一部の実施形態では、全部で1〜10個のアミノ酸が、配列番号1のアミノ酸配列において置換され、挿入され、および/または欠失されている。一部の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(例えば、FR)において起こる。場合により、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号1のアミノ酸配列のVH配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、VHは、(a)配列番号85のアミノ酸配列を含むCDR−H1、(b)配列番号57のアミノ酸配列を含むCDR−H2、および(c)配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR−H3から選択される1つ、2つまたは3つのCDRを含む。
[00177]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン(VL)を含む。一部の実施形態では、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するVL配列は、参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入または欠失を含むが、抗体またはその抗原結合性断片は抗原に結合する能力を保持する配列を含む。一部の実施形態では、全部で1〜10個のアミノ酸が、配列番号15のアミノ酸配列のいずれか1つにおいて置換され、挿入され、および/または欠失されている。一部の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(例えば、FR)で起こる。場合により、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号15のVL配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、VLは、(a)配列番号99のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号71のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(c)配列番号43のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される1つ、2つまたは3つのCDRを含む。
[00178]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、上記に提供された実施形態のいずれかにおけるVH、および上記に提供された実施形態のいずれかにおけるVLを含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号1のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号15のVL配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
TMEL1002
[00179]一態様では、本開示は、(a)配列番号2のアミノ酸配列を含むVH、(b)配列番号16のアミノ酸配列を含むVL、および(c)それらの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の可変領域を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00180]一態様では、本開示は、(a)配列番号86のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号58のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号30のアミノ酸配列を含むCDR−H3;(d)配列番号100のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(e)配列番号72のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(f)配列番号44のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される、少なくとも1、2、3、4、5または6つのCDRを含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00181]一態様では、本開示は、(a)配列番号86のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号58のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号30のアミノ酸配列を含むCDR−H3;および(d)配列番号16のアミノ酸配列を含むVLから選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00182]一態様では、本開示は、(a)配列番号100のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号72のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(c)配列番号44のアミノ酸配列を含むCDR−L3;および配列番号2のアミノ酸配列を含むVHから選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00183]一態様では、本開示は、CDR:配列番号30のアミノ酸配列を含むCDR−H3;および配列番号44のアミノ酸配列を含むCDR−L3を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00184]一態様では、本明細書における開示は、(a)配列番号100のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号72のアミノ酸配列を含むCDR−L2、および(c)配列番号44のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。一態様では、本開示は、(a)配列番号86のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号58のアミノ酸配列を含むCDR−H2、および(c)配列番号30のアミノ酸配列を含むCDR−H3から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00185]一態様では、本開示は、CDR:(a)配列番号86のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号58のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号30のアミノ酸配列を含むCDR−H3;(d)配列番号100のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(e)配列番号72のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(f)配列番号44のアミノ酸配列を含むCDR−L3を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00186]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するVH配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するVH配列は、参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入または欠失を含むが、抗体またはその抗原結合性断片は、抗原に結合する能力を保持する配列を含む。一部の実施形態では、全部で1〜10個のアミノ酸が、配列番号2のアミノ酸配列において置換され、挿入され、および/または欠失されている。一部の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(例えば、FR)において起こる。場合により、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号2のアミノ酸配列のVH配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、VHは、(a)配列番号86のアミノ酸配列を含むCDR−H1、(b)配列番号58のアミノ酸配列を含むCDR−H2、および(c)配列番号30のアミノ酸配列を含むCDR−H3から選択される1つ、2つまたは3つのCDRを含む。
[00187]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号16のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン(VL)を含む。一部の実施形態では、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するVL配列は、参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入または欠失を含むが、抗体またはその抗原結合性断片は抗原に結合する能力を保持する配列を含む。一部の実施形態では、全部で1〜10個のアミノ酸が、配列番号16のアミノ酸配列のいずれか1つにおいて置換され、挿入され、および/または欠失されている。一部の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(例えば、FR)で起こる。場合により、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号16のVL配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、VLは、(a)配列番号100のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号72のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(c)配列番号44のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される1つ、2つまたは3つのCDRを含む。
[00188]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、上記に提供された実施形態のいずれかにおけるVH、および上記に提供された実施形態のいずれかにおけるVLを含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号2のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号16のVL配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
TMEL1003
[00189]一態様では、本開示は、(a)配列番号3のアミノ酸配列を含むVH、(b)配列番号17のアミノ酸配列を含むVL、および(c)それらの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の可変領域を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00190]一態様では、本開示は、(a)配列番号87のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号59のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR−H3;(d)配列番号101のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(e)配列番号73のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(f)配列番号45のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される、少なくとも1、2、3、4、5または6つのCDRを含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00191]一態様では、本開示は、(a)配列番号87のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号59のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR−H3;および(d)配列番号17のアミノ酸配列を含むVLから選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00192]一態様では、本開示は、(a)配列番号101のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号73のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(c)配列番号45のアミノ酸配列を含むCDR−L3;および配列番号3のアミノ酸配列を含むVHから選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00193]一態様では、本開示は、CDR:配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR−H3;および配列番号45のアミノ酸配列を含むCDR−L3を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00194]一態様では、本明細書における開示は、(a)配列番号101のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号73のアミノ酸配列を含むCDR−L2、および(c)配列番号45のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。一態様では、本開示は、(a)配列番号87のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号59のアミノ酸配列を含むCDR−H2、および(c)配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR−H3から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00195]一態様では、本開示は、CDR:(a)配列番号87のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号59のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR−H3;(d)配列番号101のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(e)配列番号73のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(f)配列番号45のアミノ酸配列を含むCDR−L3を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00196]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するVH配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するVH配列は、参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入または欠失を含むが、抗体またはその抗原結合性断片は、抗原に結合する能力を保持する配列を含む。一部の実施形態では、全部で1〜10個のアミノ酸が、配列番号3のアミノ酸配列において置換され、挿入され、および/または欠失されている。一部の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(例えば、FR)において起こる。場合により、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号3のアミノ酸配列のVH配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、VHは、(a)配列番号87のアミノ酸配列を含むCDR−H1、(b)配列番号59のアミノ酸配列を含むCDR−H2、および(c)配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR−H3から選択される1つ、2つまたは3つのCDRを含む。
[00197]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン(VL)を含む。一部の実施形態では、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するVL配列は、参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入または欠失を含むが、抗体またはその抗原結合性断片は抗原に結合する能力を保持する配列を含む。一部の実施形態では、全部で1〜10個のアミノ酸が、配列番号17のアミノ酸配列のいずれか1つにおいて置換され、挿入され、および/または欠失されている。一部の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(例えば、FR)で起こる。場合により、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号17のVL配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、VLは、(a)配列番号101のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号73のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(c)配列番号45のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される1つ、2つまたは3つのCDRを含む。
[00198]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、上記に提供された実施形態のいずれかにおけるVH、および上記に提供された実施形態のいずれかにおけるVLを含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号3のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号17のVL配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
TMEL1004
[00199]一態様では、本開示は、(a)配列番号4のアミノ酸配列を含むVH、(b)配列番号18のアミノ酸配列を含むVL、および(c)それらの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の可変領域を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00200]一態様では、本開示は、(a)配列番号88のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号60のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR−H3;(d)配列番号102のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(e)配列番号74のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(f)配列番号46のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される、少なくとも1、2、3、4、5または6つのCDRを含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00201]一態様では、本開示は、(a)配列番号88のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号60のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR−H3;および(d)配列番号18のアミノ酸配列を含むVLから選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00202]一態様では、本開示は、(a)配列番号102のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号74のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(c)配列番号46のアミノ酸配列を含むCDR−L3;および配列番号4のアミノ酸配列を含むVHから選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00203]一態様では、本開示は、CDR:配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR−H3;および配列番号46のアミノ酸配列を含むCDR−L3を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00204]一態様では、本明細書における開示は、(a)配列番号102のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号74のアミノ酸配列を含むCDR−L2、および(c)配列番号46のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。一態様では、本開示は、(a)配列番号88のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号60のアミノ酸配列を含むCDR−H2、および(c)配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR−H3から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00205]一態様では、本開示は、CDR:(a)配列番号88のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号60のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR−H3;(d)配列番号102のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(e)配列番号74のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(f)配列番号46のアミノ酸配列を含むCDR−L3を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00206]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するVH配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するVH配列は、参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入または欠失を含むが、抗体またはその抗原結合性断片は、抗原に結合する能力を保持する配列を含む。一部の実施形態では、全部で1〜10個のアミノ酸が、配列番号4のアミノ酸配列において置換され、挿入され、および/または欠失されている。一部の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(例えば、FR)において起こる。場合により、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号4のアミノ酸配列のVH配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、VHは、(a)配列番号88のアミノ酸配列を含むCDR−H1、(b)配列番号60のアミノ酸配列を含むCDR−H2、および(c)配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR−H3から選択される1つ、2つまたは3つのCDRを含む。
[00207]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号18のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン(VL)を含む。一部の実施形態では、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するVL配列は、参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入または欠失を含むが、抗体またはその抗原結合性断片は抗原に結合する能力を保持する配列を含む。一部の実施形態では、全部で1〜10個のアミノ酸が、配列番号18のアミノ酸配列のいずれか1つにおいて置換され、挿入され、および/または欠失されている。一部の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(例えば、FR)で起こる。場合により、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号18のVL配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、VLは、(a)配列番号102のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号74のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(c)配列番号46のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される1つ、2つまたは3つのCDRを含む。
[00208]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、上記に提供された実施形態のいずれかにおけるVH、および上記に提供された実施形態のいずれかにおけるVLを含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号4のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号18のVL配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
TMEL1005
[00209]一態様では、本開示は、(a)配列番号5のアミノ酸配列を含むVH、(b)配列番号19のアミノ酸配列を含むVL、および(c)それらの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の可変領域を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00210]一態様では、本開示は、(a)配列番号89のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号61のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR−H3;(d)配列番号103のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(e)配列番号75のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(f)配列番号47のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される、少なくとも1、2、3、4、5または6つのCDRを含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00211]一態様では、本開示は、(a)配列番号89のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号61のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR−H3;および(d)配列番号19のアミノ酸配列を含むVLから選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00212]一態様では、本開示は、(a)配列番号103のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号75のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(c)配列番号47のアミノ酸配列を含むCDR−L3;および配列番号5のアミノ酸配列を含むVHから選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00213]一態様では、本開示は、CDR:配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR−H3;および配列番号47のアミノ酸配列を含むCDR−L3を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00214]一態様では、本明細書における開示は、(a)配列番号103のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号75のアミノ酸配列を含むCDR−L2、および(c)配列番号47のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。一態様では、本開示は、(a)配列番号89のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号61のアミノ酸配列を含むCDR−H2、および(c)配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR−H3から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00215]一態様では、本開示は、CDR:(a)配列番号89のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号61のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR−H3;(d)配列番号103のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(e)配列番号75のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(f)配列番号47のアミノ酸配列を含むCDR−L3を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00216]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するVH配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するVH配列は、参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入または欠失を含むが、抗体またはその抗原結合性断片は、抗原に結合する能力を保持する配列を含む。一部の実施形態では、全部で1〜10個のアミノ酸が、配列番号5のアミノ酸配列において置換され、挿入され、および/または欠失されている。一部の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(例えば、FR)において起こる。場合により、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号5のアミノ酸配列のVH配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、VHは、(a)配列番号89のアミノ酸配列を含むCDR−H1、(b)配列番号61のアミノ酸配列を含むCDR−H2、および(c)配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR−H3から選択される1つ、2つまたは3つのCDRを含む。
[00217]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号19のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン(VL)を含む。一部の実施形態では、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するVL配列は、参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入または欠失を含むが、抗体またはその抗原結合性断片は抗原に結合する能力を保持する配列を含む。一部の実施形態では、全部で1〜10個のアミノ酸が、配列番号19のアミノ酸配列のいずれか1つにおいて置換され、挿入され、および/または欠失されている。一部の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(例えば、FR)で起こる。場合により、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号19のVL配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、VLは、(a)配列番号103のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号75のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(c)配列番号47のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される1つ、2つまたは3つのCDRを含む。
[00218]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、上記に提供された実施形態のいずれかにおけるVH、および上記に提供された実施形態のいずれかにおけるVLを含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号5のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号19のVL配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
TMEL1006
[00219]一態様では、本開示は、(a)配列番号6のアミノ酸配列を含むVH、(b)配列番号20のアミノ酸配列を含むVL、および(c)それらの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の可変領域を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00220]一態様では、本開示は、(a)配列番号90のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号62のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号34のアミノ酸配列を含むCDR−H3;(d)配列番号104のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(e)配列番号76のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(f)配列番号48のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される、少なくとも1、2、3、4、5または6つのCDRを含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00221]一態様では、本開示は、(a)配列番号90のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号62のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号34のアミノ酸配列を含むCDR−H3;および(d)配列番号20のアミノ酸配列を含むVLから選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00222]一態様では、本開示は、(a)配列番号104のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号76のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(c)配列番号48のアミノ酸配列を含むCDR−L3;および配列番号6のアミノ酸配列を含むVHから選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00223]一態様では、本開示は、CDR:配列番号34のアミノ酸配列を含むCDR−H3;および配列番号48のアミノ酸配列を含むCDR−L3を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00224]一態様では、本明細書における開示は、(a)配列番号104のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号76のアミノ酸配列を含むCDR−L2、および(c)配列番号48のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。一態様では、本開示は、(a)配列番号90のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号62のアミノ酸配列を含むCDR−H2、および(c)配列番号34のアミノ酸配列を含むCDR−H3から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00225]一態様では、本開示は、CDR:(a)配列番号90のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号62のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号34のアミノ酸配列を含むCDR−H3;(d)配列番号104のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(e)配列番号76のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(f)配列番号48のアミノ酸配列を含むCDR−L3を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00226]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号6のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するVH配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するVH配列は、参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入または欠失を含むが、抗体またはその抗原結合性断片は、抗原に結合する能力を保持する配列を含む。一部の実施形態では、全部で1〜10個のアミノ酸が、配列番号6のアミノ酸配列において置換され、挿入され、および/または欠失されている。一部の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(例えば、FR)において起こる。場合により、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号6のアミノ酸配列のVH配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、VHは、(a)配列番号90のアミノ酸配列を含むCDR−H1、(b)配列番号62のアミノ酸配列を含むCDR−H2、および(c)配列番号34のアミノ酸配列を含むCDR−H3から選択される1つ、2つまたは3つのCDRを含む。
[00227]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号20のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン(VL)を含む。一部の実施形態では、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するVL配列は、参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入または欠失を含むが、抗体またはその抗原結合性断片は抗原に結合する能力を保持する配列を含む。一部の実施形態では、全部で1〜10個のアミノ酸が、配列番号20のアミノ酸配列のいずれか1つにおいて置換され、挿入され、および/または欠失されている。一部の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(例えば、FR)で起こる。場合により、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号20のVL配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、VLは、(a)配列番号104のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号76のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(c)配列番号48のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される1つ、2つまたは3つのCDRを含む。
[00228]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、上記に提供された実施形態のいずれかにおけるVH、および上記に提供された実施形態のいずれかにおけるVLを含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号6のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号20のVL配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
TMEL1007
[00229]一態様では、本開示は、(a)配列番号7のアミノ酸配列を含むVH、(b)配列番号21のアミノ酸配列を含むVL、および(c)それらの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の可変領域を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00230]一態様では、本開示は、(a)配列番号91のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号63のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号35のアミノ酸配列を含むCDR−H3;(d)配列番号105のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(e)配列番号77のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(f)配列番号49のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される、少なくとも1、2、3、4、5または6つのCDRを含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00231]一態様では、本開示は、(a)配列番号91のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号63のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号35のアミノ酸配列を含むCDR−H3;および(d)配列番号21のアミノ酸配列を含むVLから選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00232]一態様では、本開示は、(a)配列番号105のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号77のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(c)配列番号49のアミノ酸配列を含むCDR−L3;および配列番号7のアミノ酸配列を含むVHから選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00233]一態様では、本開示は、CDR:配列番号35のアミノ酸配列を含むCDR−H3;および配列番号49のアミノ酸配列を含むCDR−L3を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00234]一態様では、本明細書における開示は、(a)配列番号105のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号77のアミノ酸配列を含むCDR−L2、および(c)配列番号49のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。一態様では、本開示は、(a)配列番号91のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号63のアミノ酸配列を含むCDR−H2、および(c)配列番号35のアミノ酸配列を含むCDR−H3から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00235]一態様では、本開示は、CDR:(a)配列番号91のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号63のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号35のアミノ酸配列を含むCDR−H3;(d)配列番号105のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(e)配列番号77のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(f)配列番号49のアミノ酸配列を含むCDR−L3を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00236]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するVH配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するVH配列は、参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入または欠失を含むが、抗体またはその抗原結合性断片は、抗原に結合する能力を保持する配列を含む。一部の実施形態では、全部で1〜10個のアミノ酸が、配列番号7のアミノ酸配列において置換され、挿入され、および/または欠失されている。一部の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(例えば、FR)において起こる。場合により、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号7のアミノ酸配列のVH配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、VHは、(a)配列番号91のアミノ酸配列を含むCDR−H1、(b)配列番号63のアミノ酸配列を含むCDR−H2、および(c)配列番号35のアミノ酸配列を含むCDR−H3から選択される1つ、2つまたは3つのCDRを含む。
[00237]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号21のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン(VL)を含む。一部の実施形態では、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するVL配列は、参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入または欠失を含むが、抗体またはその抗原結合性断片は抗原に結合する能力を保持する配列を含む。一部の実施形態では、全部で1〜10個のアミノ酸が、配列番号21のアミノ酸配列のいずれか1つにおいて置換され、挿入され、および/または欠失されている。一部の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(例えば、FR)で起こる。場合により、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号21のVL配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、VLは、(a)配列番号105のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号77のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(c)配列番号49のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される1つ、2つまたは3つのCDRを含む。
[00238]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、上記に提供された実施形態のいずれかにおけるVH、および上記に提供された実施形態のいずれかにおけるVLを含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号7のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号21のVL配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
TMEL1008
[00239]一態様では、本開示は、(a)配列番号8のアミノ酸配列を含むVH、(b)配列番号22のアミノ酸配列を含むVL、および(c)それらの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の可変領域を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00240]一態様では、本開示は、(a)配列番号92のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号64のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号36のアミノ酸配列を含むCDR−H3;(d)配列番号106のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(e)配列番号78のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(f)配列番号50のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される、少なくとも1、2、3、4、5または6つのCDRを含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00241]一態様では、本開示は、(a)配列番号92のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号64のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号36のアミノ酸配列を含むCDR−H3;および(d)配列番号22のアミノ酸配列を含むVLから選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00242]一態様では、本開示は、(a)配列番号106のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号78のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(c)配列番号50のアミノ酸配列を含むCDR−L3;および配列番号8のアミノ酸配列を含むVHから選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00243]一態様では、本開示は、CDR:配列番号36のアミノ酸配列を含むCDR−H3;および配列番号50のアミノ酸配列を含むCDR−L3を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00244]一態様では、本明細書における開示は、(a)配列番号106のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号78のアミノ酸配列を含むCDR−L2、および(c)配列番号50のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。一態様では、本開示は、(a)配列番号92のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号64のアミノ酸配列を含むCDR−H2、および(c)配列番号36のアミノ酸配列を含むCDR−H3から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00245]一態様では、本開示は、CDR:(a)配列番号92のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号64のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号36のアミノ酸配列を含むCDR−H3;(d)配列番号106のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(e)配列番号78のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(f)配列番号50のアミノ酸配列を含むCDR−L3を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00246]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するVH配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するVH配列は、参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入または欠失を含むが、抗体またはその抗原結合性断片は、抗原に結合する能力を保持する配列を含む。一部の実施形態では、全部で1〜10個のアミノ酸が、配列番号8のアミノ酸配列において置換され、挿入され、および/または欠失されている。一部の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(例えば、FR)において起こる。場合により、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号8のアミノ酸配列のVH配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、VHは、(a)配列番号92のアミノ酸配列を含むCDR−H1、(b)配列番号64のアミノ酸配列を含むCDR−H2、および(c)配列番号36のアミノ酸配列を含むCDR−H3から選択される1つ、2つまたは3つのCDRを含む。
[00247]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号22のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン(VL)を含む。一部の実施形態では、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するVL配列は、参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入または欠失を含むが、抗体またはその抗原結合性断片は抗原に結合する能力を保持する配列を含む。一部の実施形態では、全部で1〜10個のアミノ酸が、配列番号22のアミノ酸配列のいずれか1つにおいて置換され、挿入され、および/または欠失されている。一部の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(例えば、FR)で起こる。場合により、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号22のVL配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、VLは、(a)配列番号106のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号78のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(c)配列番号50のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される1つ、2つまたは3つのCDRを含む。
[00248]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、上記に提供された実施形態のいずれかにおけるVH、および上記に提供された実施形態のいずれかにおけるVLを含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号8のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号22のVL配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
TMEL1009
[00249]一態様では、本開示は、(a)配列番号9のアミノ酸配列を含むVH、(b)配列番号23のアミノ酸配列を含むVL、および(c)それらの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の可変領域を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00250]一態様では、本開示は、(a)配列番号93のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号65のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号37のアミノ酸配列を含むCDR−H3;(d)配列番号107のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(e)配列番号79のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(f)配列番号51のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される、少なくとも1、2、3、4、5または6つのCDRを含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00251]一態様では、本開示は、(a)配列番号93のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号65のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号37のアミノ酸配列を含むCDR−H3;および(d)配列番号23のアミノ酸配列を含むVLから選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00252]一態様では、本開示は、(a)配列番号107のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号79のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(c)配列番号51のアミノ酸配列を含むCDR−L3;および配列番号9のアミノ酸配列を含むVHから選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00253]一態様では、本開示は、CDR:配列番号37のアミノ酸配列を含むCDR−H3;および配列番号51のアミノ酸配列を含むCDR−L3を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00254]一態様では、本明細書における開示は、(a)配列番号107のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号79のアミノ酸配列を含むCDR−L2、および(c)配列番号51のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。一態様では、本開示は、(a)配列番号93のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号65のアミノ酸配列を含むCDR−H2、および(c)配列番号37のアミノ酸配列を含むCDR−H3から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00255]一態様では、本開示は、CDR:(a)配列番号93のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号65のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号37のアミノ酸配列を含むCDR−H3;(d)配列番号107のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(e)配列番号79のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(f)配列番号51のアミノ酸配列を含むCDR−L3を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00256]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号9のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するVH配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するVH配列は、参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入または欠失を含むが、抗体またはその抗原結合性断片は、抗原に結合する能力を保持する配列を含む。一部の実施形態では、全部で1〜10個のアミノ酸が、配列番号9のアミノ酸配列において置換され、挿入され、および/または欠失されている。一部の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(例えば、FR)において起こる。場合により、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号9のアミノ酸配列のVH配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、VHは、(a)配列番号93のアミノ酸配列を含むCDR−H1、(b)配列番号65のアミノ酸配列を含むCDR−H2、および(c)配列番号37のアミノ酸配列を含むCDR−H3から選択される1つ、2つまたは3つのCDRを含む。
[00257]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン(VL)を含む。一部の実施形態では、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するVL配列は、参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入または欠失を含むが、抗体またはその抗原結合性断片は抗原に結合する能力を保持する配列を含む。一部の実施形態では、全部で1〜10個のアミノ酸が、配列番号23のアミノ酸配列のいずれか1つにおいて置換され、挿入され、および/または欠失されている。一部の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(例えば、FR)で起こる。場合により、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号23のVL配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、VLは、(a)配列番号107のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号79のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(c)配列番号51のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される1つ、2つまたは3つのCDRを含む。
[00258]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、上記に提供された実施形態のいずれかにおけるVH、および上記に提供された実施形態のいずれかにおけるVLを含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号9のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号23のVL配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
TMEL1010
[00259]一態様では、本開示は、(a)配列番号10のアミノ酸配列を含むVH、(b)配列番号24のアミノ酸配列を含むVL、および(c)それらの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の可変領域を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00260]一態様では、本開示は、(a)配列番号94のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号66のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号38のアミノ酸配列を含むCDR−H3;(d)配列番号108のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(e)配列番号80のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(f)配列番号52のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される、少なくとも1、2、3、4、5または6つのCDRを含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00261]一態様では、本開示は、(a)配列番号94のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号66のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号38のアミノ酸配列を含むCDR−H3;および(d)配列番号24のアミノ酸配列を含むVLから選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00262]一態様では、本開示は、(a)配列番号108のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号80のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(c)配列番号52のアミノ酸配列を含むCDR−L3;および配列番号10のアミノ酸配列を含むVHから選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00263]一態様では、本開示は、CDR:配列番号38のアミノ酸配列を含むCDR−H3;および配列番号52のアミノ酸配列を含むCDR−L3を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00264]一態様では、本明細書における開示は、(a)配列番号108のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号80のアミノ酸配列を含むCDR−L2、および(c)配列番号52のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。一態様では、本開示は、(a)配列番号94のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号66のアミノ酸配列を含むCDR−H2、および(c)配列番号38のアミノ酸配列を含むCDR−H3から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00265]一態様では、本開示は、CDR:(a)配列番号94のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号66のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号38のアミノ酸配列を含むCDR−H3;(d)配列番号108のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(e)配列番号80のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(f)配列番号52のアミノ酸配列を含むCDR−L3を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00266]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号10のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するVH配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するVH配列は、参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入または欠失を含むが、抗体またはその抗原結合性断片は、抗原に結合する能力を保持する配列を含む。一部の実施形態では、全部で1〜10個のアミノ酸が、配列番号10のアミノ酸配列において置換され、挿入され、および/または欠失されている。一部の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(例えば、FR)において起こる。場合により、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号10のアミノ酸配列のVH配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、VHは、(a)配列番号94のアミノ酸配列を含むCDR−H1、(b)配列番号66のアミノ酸配列を含むCDR−H2、および(c)配列番号38のアミノ酸配列を含むCDR−H3から選択される1つ、2つまたは3つのCDRを含む。
[00267]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン(VL)を含む。一部の実施形態では、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するVL配列は、参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入または欠失を含むが、抗体またはその抗原結合性断片は抗原に結合する能力を保持する配列を含む。一部の実施形態では、全部で1〜10個のアミノ酸が、配列番号24のアミノ酸配列のいずれか1つにおいて置換され、挿入され、および/または欠失されている。一部の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(例えば、FR)で起こる。場合により、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号24のVL配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、VLは、(a)配列番号108のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号80のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(c)配列番号52のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される1つ、2つまたは3つのCDRを含む。
[00268]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、上記に提供された実施形態のいずれかにおけるVH、および上記に提供された実施形態のいずれかにおけるVLを含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号10のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号24のVL配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
TMEL1011
[00269]一態様では、本開示は、(a)配列番号11のアミノ酸配列を含むVH、(b)配列番号25のアミノ酸配列を含むVL、および(c)それらの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の可変領域を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00270]一態様では、本開示は、(a)配列番号95のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号67のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号39のアミノ酸配列を含むCDR−H3;(d)配列番号109のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(e)配列番号81のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(f)配列番号53のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される、少なくとも1、2、3、4、5または6つのCDRを含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00271]一態様では、本開示は、(a)配列番号95のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号67のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号39のアミノ酸配列を含むCDR−H3;および(d)配列番号25のアミノ酸配列を含むVLから選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00272]一態様では、本開示は、(a)配列番号109のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号81のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(c)配列番号53のアミノ酸配列を含むCDR−L3;および配列番号11のアミノ酸配列を含むVHから選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00273]一態様では、本開示は、CDR:配列番号39のアミノ酸配列を含むCDR−H3;および配列番号53のアミノ酸配列を含むCDR−L3を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00274]一態様では、本明細書における開示は、(a)配列番号109のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号81のアミノ酸配列を含むCDR−L2、および(c)配列番号53のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。一態様では、本開示は、(a)配列番号95のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号67のアミノ酸配列を含むCDR−H2、および(c)配列番号39のアミノ酸配列を含むCDR−H3から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00275]一態様では、本開示は、CDR:(a)配列番号95のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号67のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号39のアミノ酸配列を含むCDR−H3;(d)配列番号109のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(e)配列番号81のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(f)配列番号53のアミノ酸配列を含むCDR−L3を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00276]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号11のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するVH配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するVH配列は、参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入または欠失を含むが、抗体またはその抗原結合性断片は、抗原に結合する能力を保持する配列を含む。一部の実施形態では、全部で1〜10個のアミノ酸が、配列番号11のアミノ酸配列において置換され、挿入され、および/または欠失されている。一部の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(例えば、FR)において起こる。場合により、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号11のアミノ酸配列のVH配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、VHは、(a)配列番号95のアミノ酸配列を含むCDR−H1、(b)配列番号67のアミノ酸配列を含むCDR−H2、および(c)配列番号39のアミノ酸配列を含むCDR−H3から選択される1つ、2つまたは3つのCDRを含む。
[00277]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号25のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン(VL)を含む。一部の実施形態では、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するVL配列は、参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入または欠失を含むが、抗体またはその抗原結合性断片は抗原に結合する能力を保持する配列を含む。一部の実施形態では、全部で1〜10個のアミノ酸が、配列番号25のアミノ酸配列のいずれか1つにおいて置換され、挿入され、および/または欠失されている。一部の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(例えば、FR)で起こる。場合により、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号25のVL配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、VLは、(a)配列番号109のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号81のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(c)配列番号53のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される1つ、2つまたは3つのCDRを含む。
[00278]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、上記に提供された実施形態のいずれかにおけるVH、および上記に提供された実施形態のいずれかにおけるVLを含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号11のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号25のVL配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
TMEL1012
[00279]一態様では、本開示は、(a)配列番号12のアミノ酸配列を含むVH、(b)配列番号26のアミノ酸配列を含むVL、および(c)それらの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の可変領域を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00280]一態様では、本開示は、(a)配列番号96のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号68のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号40のアミノ酸配列を含むCDR−H3;(d)配列番号110のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(e)配列番号82のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(f)配列番号54のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される、少なくとも1、2、3、4、5または6つのCDRを含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00281]一態様では、本開示は、(a)配列番号96のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号68のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号40のアミノ酸配列を含むCDR−H3;および(d)配列番号26のアミノ酸配列を含むVLから選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00282]一態様では、本開示は、(a)配列番号110のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号82のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(c)配列番号54のアミノ酸配列を含むCDR−L3;および配列番号12のアミノ酸配列を含むVHから選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00283]一態様では、本開示は、CDR:配列番号40のアミノ酸配列を含むCDR−H3;および配列番号54のアミノ酸配列を含むCDR−L3を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00284]一態様では、本明細書における開示は、(a)配列番号110のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号82のアミノ酸配列を含むCDR−L2、および(c)配列番号54のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。一態様では、本開示は、(a)配列番号96のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号68のアミノ酸配列を含むCDR−H2、および(c)配列番号40のアミノ酸配列を含むCDR−H3から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00285]一態様では、本開示は、CDR:(a)配列番号96のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号68のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号40のアミノ酸配列を含むCDR−H3;(d)配列番号110のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(e)配列番号82のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(f)配列番号54のアミノ酸配列を含むCDR−L3を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00286]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号12のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するVH配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するVH配列は、参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入または欠失を含むが、抗体またはその抗原結合性断片は、抗原に結合する能力を保持する配列を含む。一部の実施形態では、全部で1〜10個のアミノ酸が、配列番号12のアミノ酸配列において置換され、挿入され、および/または欠失されている。一部の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(例えば、FR)において起こる。場合により、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号12のアミノ酸配列のVH配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、VHは、(a)配列番号96のアミノ酸配列を含むCDR−H1、(b)配列番号68のアミノ酸配列を含むCDR−H2、および(c)配列番号40のアミノ酸配列を含むCDR−H3から選択される1つ、2つまたは3つのCDRを含む。
[00287]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号26のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン(VL)を含む。一部の実施形態では、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するVL配列は、参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入または欠失を含むが、抗体またはその抗原結合性断片は抗原に結合する能力を保持する配列を含む。一部の実施形態では、全部で1〜10個のアミノ酸が、配列番号26のアミノ酸配列のいずれか1つにおいて置換され、挿入され、および/または欠失されている。一部の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(例えば、FR)で起こる。場合により、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号26のVL配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、VLは、(a)配列番号110のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号82のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(c)配列番号54のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される1つ、2つまたは3つのCDRを含む。
[00288]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、上記に提供された実施形態のいずれかにおけるVH、および上記に提供された実施形態のいずれかにおけるVLを含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号12のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号26のVL配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
TMEL1013
[00289]一態様では、本開示は、(a)配列番号13のアミノ酸配列を含むVH、(b)配列番号27のアミノ酸配列を含むVL、および(c)それらの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の可変領域を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00290]一態様では、本開示は、(a)配列番号97のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号69のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号41のアミノ酸配列を含むCDR−H3;(d)配列番号111のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(e)配列番号83のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(f)配列番号55のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される、少なくとも1、2、3、4、5または6つのCDRを含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00291]一態様では、本開示は、(a)配列番号97のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号69のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号41のアミノ酸配列を含むCDR−H3;および(d)配列番号27のアミノ酸配列を含むVLから選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00292]一態様では、本開示は、(a)配列番号111のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号83のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(c)配列番号55のアミノ酸配列を含むCDR−L3;および配列番号13のアミノ酸配列を含むVHから選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00293]一態様では、本開示は、CDR:配列番号41のアミノ酸配列を含むCDR−H3;および配列番号55のアミノ酸配列を含むCDR−L3を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00294]一態様では、本明細書における開示は、(a)配列番号111のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号83のアミノ酸配列を含むCDR−L2、および(c)配列番号55のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。一態様では、本開示は、(a)配列番号97のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号69のアミノ酸配列を含むCDR−H2、および(c)配列番号41のアミノ酸配列を含むCDR−H3から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00295]一態様では、本開示は、CDR:(a)配列番号97のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号69のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号41のアミノ酸配列を含むCDR−H3;(d)配列番号111のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(e)配列番号83のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(f)配列番号55のアミノ酸配列を含むCDR−L3を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00296]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するVH配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するVH配列は、参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入または欠失を含むが、抗体またはその抗原結合性断片は、抗原に結合する能力を保持する配列を含む。一部の実施形態では、全部で1〜10個のアミノ酸が、配列番号13のアミノ酸配列において置換され、挿入され、および/または欠失されている。一部の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(例えば、FR)において起こる。場合により、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号13のアミノ酸配列のVH配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、VHは、(a)配列番号97のアミノ酸配列を含むCDR−H1、(b)配列番号69のアミノ酸配列を含むCDR−H2、および(c)配列番号41のアミノ酸配列を含むCDR−H3から選択される1つ、2つまたは3つのCDRを含む。
[00297]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号27のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン(VL)を含む。一部の実施形態では、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するVL配列は、参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入または欠失を含むが、抗体またはその抗原結合性断片は抗原に結合する能力を保持する配列を含む。一部の実施形態では、全部で1〜10個のアミノ酸が、配列番号27のアミノ酸配列のいずれか1つにおいて置換され、挿入され、および/または欠失されている。一部の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(例えば、FR)で起こる。場合により、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号27のVL配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、VLは、(a)配列番号111のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号83のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(c)配列番号55のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される1つ、2つまたは3つのCDRを含む。
[00298]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、上記に提供された実施形態のいずれかにおけるVH、および上記に提供された実施形態のいずれかにおけるVLを含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号13のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号27のVL配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
TMEL1014
[00299]一態様では、本開示は、(a)配列番号14のアミノ酸配列を含むVH、(b)配列番号28のアミノ酸配列を含むVL、および(c)それらの組み合わせからなる群から選択される1つ以上の可変領域を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00300]一態様では、本開示は、(a)配列番号98のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号70のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号42のアミノ酸配列を含むCDR−H3;(d)配列番号112のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(e)配列番号84のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(f)配列番号56のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される、少なくとも1、2、3、4、5または6つのCDRを含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00301]一態様では、本開示は、(a)配列番号98のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号70のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号42のアミノ酸配列を含むCDR−H3;および(d)配列番号28のアミノ酸配列を含むVLから選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00302]一態様では、本開示は、(a)配列番号112のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号84のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(c)配列番号56のアミノ酸配列を含むCDR−L3;および配列番号14のアミノ酸配列を含むVHから選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00303]一態様では、本開示は、CDR:配列番号42のアミノ酸配列を含むCDR−H3;および配列番号56のアミノ酸配列を含むCDR−L3を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00304]一態様では、本明細書における開示は、(a)配列番号112のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号84のアミノ酸配列を含むCDR−L2、および(c)配列番号56のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。一態様では、本開示は、(a)配列番号98のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号70のアミノ酸配列を含むCDR−H2、および(c)配列番号42のアミノ酸配列を含むCDR−H3から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH CDR配列を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00305]一態様では、本開示は、CDR:(a)配列番号98のアミノ酸配列を含むCDR−H1;(b)配列番号70のアミノ酸配列を含むCDR−H2;(c)配列番号42のアミノ酸配列を含むCDR−H3;(d)配列番号112のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(e)配列番号84のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(f)配列番号56のアミノ酸配列を含むCDR−L3を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
[00306]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号14のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するVH配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するVH配列は、参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入または欠失を含むが、抗体またはその抗原結合性断片は、抗原に結合する能力を保持する配列を含む。一部の実施形態では、全部で1〜10個のアミノ酸が、配列番号14のアミノ酸配列において置換され、挿入され、および/または欠失されている。一部の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(例えば、FR)において起こる。場合により、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号14のアミノ酸配列のVH配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、VHは、(a)配列番号98のアミノ酸配列を含むCDR−H1、(b)配列番号70のアミノ酸配列を含むCDR−H2、および(c)配列番号42のアミノ酸配列を含むCDR−H3から選択される1つ、2つまたは3つのCDRを含む。
[00307]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号28のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン(VL)を含む。一部の実施形態では、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するVL配列は、参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入または欠失を含むが、抗体またはその抗原結合性断片は抗原に結合する能力を保持する配列を含む。一部の実施形態では、全部で1〜10個のアミノ酸が、配列番号28のアミノ酸配列のいずれか1つにおいて置換され、挿入され、および/または欠失されている。一部の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、CDRの外側の領域(例えば、FR)で起こる。場合により、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号28のVL配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、VLは、(a)配列番号112のアミノ酸配列を含むCDR−L1;(b)配列番号84のアミノ酸配列を含むCDR−L2;および(c)配列番号56のアミノ酸配列を含むCDR−L3から選択される1つ、2つまたは3つのCDRを含む。
[00308]一態様では、抗体またはその抗原結合性断片が提供され、抗体またはその抗原結合性断片は、上記に提供された実施形態のいずれかにおけるVH、および上記に提供された実施形態のいずれかにおけるVLを含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号14のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号28のVL配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
抗体
[00309]上記されるように、本開示の抗体は、TMEL1001、TMEL1002、TMEL1003、TMEL1004、TMEL1005、TMEL1006、TMEL1007、TMEL1008、TMEL1009、TMEL1010、TMEL1011、TMEL1012、TMEL1013、およびTMEL1014と呼ばれる。特定の抗体およびそれらのCDRについての個々のアミノ酸配列および核酸配列の同定を容易にする配列リストを本明細書中に提供する。表1〜4は、配列を開示し、個々の抗体についての配列の好ましい対合は、表7に要約される。本明細書には、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性断片の少なくとも1つを含み、例えば、特定のポリペプチド配列を含むか、または特定の配列と少なくとも80%、85%、90%、95%またはそれ以上同一である配列を有する組成物、および核酸が提供される。本開示は、がんの治療、予防および/または診断における使用を見出すがん関連抗体を提供する。用語「がん関連抗体」とは、本明細書で使用される場合、がん関連抗原に特異的な抗体を指す。一部の実施形態では、がん関連抗体は、がん関連抗原に特異的な少なくとも1つの抗原結合領域を含む。本明細書には、抗体の可変重鎖(VH)および可変軽鎖(VL)の完全な再構築された核酸コンセンサス配列および完全な再構築されたポリペプチドコンセンサス配列が開示される。VHおよびVLのCDR1、CDR2およびCDR3の核酸およびポリペプチド配列もまた提供される。
[00310]抗体は、例えば、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、組換え抗体、化学的に操作された抗体、脱免疫抗体、親和性成熟抗体、多特異性抗体(例えば、二特異性抗体および多反応性抗体)、ヘテロコンジュゲート抗体、抗体断片、およびそれらの組み合わせ(例えば、さらに脱免疫されたモノクローナル抗体、さらに脱免疫されたヒト化抗体など)を含む。抗体は、限定されないが、任意の特異的結合メンバー、免疫グロブリンクラスおよび/またはアイソタイプ(例えば、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD、IgEおよびIgM);ならびにそれらの生物学的に関連する断片または特異的結合メンバー、例えば、限定されないが、Fab、F(ab’)2、FvおよびscFv(一本鎖または関連実体)を含む。モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から得られ、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る、可能性のある天然に存在する突然変異を除き、同一である。ポリクローナル抗体とは、異なる決定因子(エピトープ)に対して指向される異なる抗体を含む調製物である。
[00311]抗体は、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも2つの重(H)鎖および2つの軽(L)鎖、またはその抗原結合部分を有する糖タンパク質であることが当該技術分野において理解される。重鎖は、重鎖可変領域(VH)および重鎖定常領域(CH1、CH2およびCH3)で構成される。軽鎖は、軽鎖可変領域(VL)および軽鎖定常領域(CL)で構成される。重鎖と軽鎖の両方の可変領域は、フレームワーク領域(FRまたはFWR)および超可変領域(HVR)を含む。HVRは、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基である。超可変領域は、一般的に、最も高い配列変動性を有し、および/または抗原認識に関与する相補性決定領域(CDR)由来のアミノ酸残基を含む。VH中のCDR1を除いて、CDRは、一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。CDRはまた、抗原と接触する残基である「特異性決定残基」または「SDR」を含む。SDRは、略称CDRまたはa−CDRと呼ばれるCDRの領域内に含まれる。例示的なa−CDR(a−CDR−L1、a−CDR−L2、a−CDR−L3、a−CDR−H1、a−CDR−H2、およびa−CDR−H3)は、L1のアミノ酸残基31〜34、L2の50〜55、L3の89〜96、H1の31〜35B、H2の50〜58、およびH3の95〜102に存在する(例えば、Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照されたい)。
[00312]別段の指示がない限り、可変ドメイン中のHVR残基および他の残基(例えば、FR残基)は、本明細書では、Kabatら(前掲)に従って番号付けされる。可変領域は、抗原に対する抗体の結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインである(例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., p.91 (2007)を参照されたい)。単一のVHまたはVLドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体からVHまたはVLドメインを用いて単離し、それぞれ相補的VLまたはVHドメインのライブラリーをスクリーニングすることができる(例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993);Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照されたい)。4つのFWR領域は、典型的には、より保存され、一方、CDR領域(CDR1、CDR2およびCDR3)は、超可変領域を表し、以下:FWR1、CDR1、FWR2、CDR2、FWR3、CDR3およびFWR4のようにNH2末端からCOOH末端に配列される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含み、一方、アイソタイプに応じて、定常領域(複数可)は、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。抗体はまた、キメラ抗体、ヒト化抗体、および組換え抗体、トランスジェニック非ヒト動物から生成されたヒト抗体、ならびに当業者に利用可能な濃縮技術を使用してライブラリーから選択された抗体を含む。
[00313]参照ポリペプチド配列に関する配列同一性パーセント(%)とは、配列をアラインさせ、ギャップを導入して、必要に応じて、配列同一性の最大パーセントを達成した後、配列同一性の一部として保存的置換を考慮しないで、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージである。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的でのアラインメントは、例えば、BLAST、BLAST−2、ALIGNまたはMegalign(DNASTAR)ソフトウェアなどの公衆に利用可能なコンピュータソフトウェアを用いて、当業者の範囲内にある種々の方法で達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインさせるための適切なパラメーターを決定することができる。しかしながら、本明細書の目的のために、アミノ酸配列同一性%値は、配列比較コンピュータプログラムALIGN−2を用いて生成される。ALIGN−2配列比較コンピュータプログラムは、Genentech,Inc.が著作者となり、ソースコードは、米国著作権登録第TXU510087号に基づいて登録されている、ワシントンD.C.、20559の米国著作権局のユーザ文書に保管されている。ALIGN−2プログラムは、カリフォルニア州サウスサンフランシスコのGenentech,Inc.から公開されて利用され得るか、またはソースコードからコンパイルすることができる。ALIGN−2プログラムは、デジタルUNIX V4.0Dを含むUNIXオペレーティングシステムで使用するためにコンパイルする必要がある。全ての配列比較パラメーターは、ALIGN−2プログラムによって設定され、変更しない。
[00314]ALIGN−2をアミノ酸配列比較に用いる状況において、所定のアミノ酸配列Bと、それと比較した、またはそれに対する所定のアミノ酸配列Aのアミノ酸配列同一性%(所定のアミノ酸配列Bと、それと比較して、またはそれに対してある種のアミノ酸配列同一性%を有するかまたは含む所定のアミノ酸配列Aとして代替的に表現することができる)は、以下:100×分率X/Yのように計算され、Xは、配列アラインメントプログラムALIGN−2による、AとBのプログラムアラインメントにおける同一の一致としてスコアリングされたアミノ酸残基の数であり、YはBのアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、BとのAのアミノ酸配列同一性%は、AとのBのアミノ酸配列同一性%と等しくないことが理解される。特に断らない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性%値は、ALIGN−2コンピュータプログラムを用いて、直前の段落に記載されているように得られる。
抗体特性
突然変異頻度
[00315]本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、生殖細胞系列配列から少なくとも約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、もしくは20%、またはそれより高い突然変異頻度を有する重鎖配列を含むことができる。一部の実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合性断片の再構築された生殖細胞系列ポリペプチド配列を表5から選択することができる。一部の実施形態では、可変重鎖の再構築された生殖細胞系列ポリペプチド配列は、配列番号225〜238に記載される配列から選択することができる。一部の実施形態では、可変軽鎖の再構築生殖細胞系列ポリペプチド配列は、配列番号239〜252から選択することができる。一部の実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合性断片の再構築された生殖細胞系列核酸配列を表6から選択することができる。一部の実施形態では、可変重鎖の再構築された生殖細胞系列核酸配列は、配列番号253〜266から選択することができる。一部の実施形態では、可変軽鎖の再構築された生殖細胞系列核酸配列は、配列番号267〜280から選択される。本開示の抗体は、生殖細胞系列配列から少なくとも約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、もしくは20%、またはそれより高い突然変異頻度を有する軽鎖配列であるCDR3領域を含むことができる。本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、生殖細胞系列配列から少なくとも約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、もしくは20%、またはそれより高い突然変異頻度を有する重鎖および軽鎖配列を含むことができる。本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、VHファミリー4−59のいずれか1つからなる群から選択されるVHファミリーからのVH領域を含むことができる。
重鎖および軽鎖の長さ
[00316]本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、長さが少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30アミノ酸の長さであるCDR1、CDR2、および/またはCDR3領域を含むことができる。本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、長さが少なくとも約18アミノ酸であるCDR1、CDR2、および/またはCDR3領域を含むことができる。
[00317]本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、軽鎖の末端に欠失を含むことができる。本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、軽鎖の末端に3つ以上のアミノ酸の欠失を含むことができる。本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、軽鎖の末端に7つ以下のアミノ酸の欠失を含むことができる。本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、軽鎖の末端に3、4、5、6、または7つのアミノ酸の欠失を含むことができる。
[00318]本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、軽鎖への挿入を含むことができる。本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、軽鎖への1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10個、またはそれを超えるアミノ酸の挿入を含むことができる。本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、軽鎖への3つのアミノ酸の挿入を含むことができる。
親和性
[00319]親和性は、分子の単一結合部位(例えば、抗体)とその結合パートナー(例えば、抗原)の間の非共有結合相互作用の総和の強度である。別段の指示がない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」とは、結合対(例えば、抗体および抗原)のメンバー間の1:1の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子XとそのパートナーのYとの親和性は、一般的に解離定数(kd)で表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含み、当該技術分野において公知である一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的に例証的であり、例示的な実施形態を以下に記載する。
[00320]一部の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、約1μM、100nM、10nM、5nM、2nM、1nM、0.5nM、0.1nM、0.05nM、0.01nM、もしくは0.001nM、またはそれ未満(例えば、10−8M以下、例えば10−8M〜10−13M、例えば10−9M〜10−13M)の解離定数(KD)を有する。本発明の別の態様は、その標的に対する増加した親和性を有する抗体またはその抗原結合性断片、例えば親和性成熟抗体を提供する。親和性成熟抗体は、このような変化を持たない親抗体と比較して、1つ以上の超可変領域(HVR)における1つ以上の変化を有する抗体であり、このような変化は、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす。これらの抗体は、約5×10−9M、2×10−9M、1×10−9M、5×10−10M、2×10−9M、1×10−10M、5×10−11M、1×10−11M、5×10−12M、1×10−12、またはそれ未満のKDで抗原に結合することができる。一部の実施形態では、本開示は、重鎖配列および軽鎖配列、またはその両方を含む生殖細胞系列抗体と比較して、少なくとも1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍またはそれを超える増加した親和性を有する抗体またはその抗原結合性断片を提供する。他の実施形態では、本明細書に記載される抗体と同じエピトープへの結合に対して競合する抗体が提供される。一部の実施形態では、同一のエピトープに結合する、および/または抗体と同じエピトープへの結合に対して競合する抗体またはその抗原結合性断片は、例えば、ADCC活性を含むFc媒介細胞傷害性などのエフェクター機能活性を示す。
[00321]KDは、任意の適切なアッセイによって測定することができる。例えば、KDは、放射性標識抗原結合アッセイ(RIA)(例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999);Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)を参照されたい)によって測定することができる。例えば、KDは、表面プラズモン共鳴アッセイ(例えば、BIACORE(登録商標)−2000またはBIACORE(登録商標)−3000を使用する)を用いて測定することができる。
抗原結合性断片
[00322]用語「抗体断片」、「抗原結合性断片」、または「抗体結合ドメイン」は、抗原結合ドメイン、すなわち、抗原およびその画定されたエピトープなどの標的に対する抗体断片の認識および特異的結合を付与するのに十分である、インタクトな抗体の抗原決定可変領域を含む抗体の少なくとも1つの部分、またはその組換えバリアントを指す。抗原結合性断片の例としては、限定されないが、Fab、Fab’、F(ab’)2、およびFv断片、一本鎖(sc)Fv(「scFv」)抗体断片、線状抗体、sdAb(VLまたはVHのいずれか)などの単一ドメイン抗体、ラクダ科VHHドメイン、および抗体断片から形成される多特異性抗体が挙げられる。別の実施形態では、抗体は、完全長抗体、例えば、本明細書に記載されるインタクトなIgG1抗体または他の抗体クラスもしくはアイソタイプである(例えば、Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003);Pluckthiin, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, pp. 269-315 (1994);Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照されたい)。全長抗体、インタクトな抗体、または全抗体は、天然抗体構造に実質的に類似する構造を有するか、または本明細書に定義されるFc領域を含む重鎖を有する抗体である。抗体断片は、種々の技術によって作製することができ、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクトな抗体のタンパク質分解消化、ならびに組換え宿主細胞(例えば、大腸菌またはファージ)による産生が含まれる。
[00323]Fvは、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この断片は、密接に非共有結合している1つの重鎖および1つの軽鎖可変領域ドメインの二量体を含む。これら2つのドメインのフォールディングから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を付与する6つの超可変ループ(H鎖とL鎖からそれぞれ3つのループ)が生じる。しかしながら、単一の可変領域(または抗原に特異的な3つのCDRのみを含むFvの半分)でさえ、抗原を認識し、結合する能力を有するが、結合部位全体よりも低い親和性である。
[00324]用語「scFv」とは、軽鎖の可変領域を含む少なくとも1つの抗体断片と、重鎖の可変領域を含む少なくとも1つの抗体断片とを含む融合タンパク質を指し、軽鎖および重鎖可変領域は、短い可撓性ポリペプチドリンカーを介して隣接して連結され、単一のポリペプチド鎖として発現され得、scFvは、それが由来するインタクトな抗体の特異性を保持する。明記されていない限り、本明細書で使用される場合、scFvは、例えばポリペプチドのN末端およびC末端に関して、いずれかの順序でVLおよびVH可変領域を有し得、scFvは、VL−リンカー−VHを含み得、またはVH−リンカー−VLを含み得る。
[00325]ダイアボディは、Vドメインの鎖内ではなく、鎖間対合が達成され、二価断片を生じるように、VHドメインとVLドメインの間に短いリンカー(約5〜10残基)を有するsFv断片を構築することによって調製される小さな抗体断片である。二特異性二重体は、2つの抗体のVHおよびVLドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する2つのクロスオーバーsFv断片のヘテロ二量体である(例えば、Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照されたい)。
[00326]完全にヒト型で産生され得るドメイン抗体(dAbs)は、約11kDa〜約15kDaの範囲の抗体の最も小さい公知の抗原結合性断片である。dAbは免疫グロブリンの重鎖および軽鎖(それぞれVHおよびVL)の頑強な可変領域である。それらは微生物細胞培養物中で高発現され、例えば、限定されないが、溶解度および温度安定性を含む好ましい生物物理学的特性を示し、例えばファージディスプレイなどのインビトロ選択系による選択および親和性成熟に十分に適している。dAbはモノマーとして生物活性があり、それらのサイズが小さく、固有の安定性があるため、より大きな分子にフォーマットすることができ、血清半減期の延長または他の薬理活性を有する薬物を作製することができる。
[00327]FvとscFvは、定常領域を持たないインタクトな結合部位を有する唯一の種である。したがって、それらは、インビボ使用中の還元型非特異的結合に適している。scFv融合タンパク質は、scFvのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかでエフェクタータンパク質の融合を生じるように構築することができる。抗体断片はまた、「線状抗体」であり得る。このような線状抗体断片は、単特異性または二特異性であり得る。
キメラ抗体
[00328]一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、キメラである。本明細書で使用される場合、用語「キメラ抗体」とは、重鎖および/または軽鎖の一部が特定の供給源または種に由来し、重鎖および/または軽鎖の残りが異なる供給源または種に由来する抗体を指す。1つの例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域)およびヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変化している「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合性断片を含む。詳細については、例えば、Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986);Reichmann et al., Nature 332: 323-329 (1988);Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992);Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)を参照されたい。
ヒト化抗体
[00329]一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ヒト化抗体である。一実施形態では、ヒト化抗体は、非ヒトHVR由来のアミノ酸残基およびヒトFR由来のアミノ酸残基を含む抗体である。ある種の実施形態では、ヒト化抗体は、HVR(例えば、CDR)の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、FRの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のものに対応する、少なくとも1つ、および典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、場合により、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含み得る。例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci.13:1619-1633 (2008);Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988);Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989);Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005);Padlan, Mol. Immunol.28:489-498 (1991);Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005);Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005);Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)を参照されたい。
[00330]非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性および親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を減少させるためにヒト化することができる。ヒト化抗体は、非ヒト抗体に由来する1つ以上のCDR、またはその一部を含む1つ以上の可変ドメインを含むことができる。ヒト化抗体は、ヒト抗体配列に由来する1つ以上のFR、またはその一部を含む1つ以上の可変ドメインを含むことができる。ヒト化抗体は、場合により、ヒト定常領域の少なくとも一部を含むことができる。一部の実施形態では、ヒト化抗体中の1つ以上のFR残基は、例えば、抗体特異性または親和性を回復または改善するために、非ヒト抗体(例えば、CDR残基が誘導される抗体)由来の対応する残基で置換される。
[00331]ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域には、限定されないが、「最良適合」方法を使用して選択されるフレームワーク領域;軽鎖可変領域または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域;ヒト成熟(体細胞突然変異)フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系列フレームワーク領域;およびFRライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域が含まれる(例えば、Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993);Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992);Presta et al., J. Immunol.,151:2623 (1993);Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997);Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)を参照されたい)。
ヒト抗体
[00332]一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野において公知である種々の技術を用いて産生することができる(例えば、van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001);Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)を参照されたい)。ヒト抗体は、ヒトもしくはヒト細胞により産生された抗体、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体をコードする配列を利用する非ヒト供給源由来の抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特異的に除外する。ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してインタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように修飾されたトランスジェニック動物に免疫原(例えば、がん細胞抗原)を投与することによって調製することができる(例えば、Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)を参照されたい)。このような動物によって生成されたインタクトな抗体からのヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、さらに修飾され得る。
[00333]ヒト抗体はまた、ハイブリドーマに基づく方法によって作製することができる。例えば、ヒト抗体は、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、および他の方法(例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984);Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (1987);Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991);Li et al., Proc. Natl. Acad., 103:3557-3562 (2006);Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006);Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005);Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)を参照されたい)を用いて、ヒト骨髄腫およびマウス−ヒト異種骨髄腫細胞系から産生することができる。ヒト抗体はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるFvクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成され得る。次に、このような可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。
脱免疫抗体
[00334]本明細書に記載される抗体またはその抗原結合性断片は、場合により、免疫原性について評価することができ、必要に応じて、脱免疫することができる(すなわち、抗体は、1つ以上のT細胞エピトープを変化させることによって、より免疫反応性が低いようにされる)。本明細書で使用される場合、「脱免疫抗体」とは、抗体配列中の1つ以上のT細胞エピトープが、対象への抗体の投与後のT細胞応答が、脱免疫されていない抗体と比較して減少されるが、抗体がその結合活性を保持するように修飾されていることを意味する。本明細書に記載される抗体および抗原結合性断片に存在する免疫原性およびT細胞エピトープの分析は、当該技術分野において公知であるソフトウェアおよび特異的データベースの使用を介して行うことができる。例示的なソフトウェアおよびデータベースは、英国ケンブリッジのAntitopeによって開発されたiTope(商標)を含む。iTope(商標)は、ヒトMHCクラスII対立遺伝子へのペプチド結合を分析するためのインシリコ技術である。iTope(商標)ソフトウェアは、ヒトMHCクラスII対立遺伝子へのペプチドの結合を予測し、それにより、このような「潜在的T細胞エピトープ」の位置について最初のスクリーニングを提供する。iTope(商標)ソフトウェアは、34個のヒトMHCクラスII対立遺伝子の結合溝内のペプチドのアミノ酸側鎖と特異的結合ポケットの間の好ましい相互作用を予測する。重要な結合残基の位置は、試験抗体可変領域配列にまたがる1つのアミノ酸によってオーバーラップする9マーのペプチドのインシリコ生成によって達成される。各9マーペプチドは、34個のMHCクラスIIアロタイプの各々に対して試験され得、それらの潜在的な「適合」およびMHCクラスII結合溝との相互作用に基づいてスコア化され得る。50%を超えるMHCクラスII対立遺伝子に対して高い平均結合スコア(iTope(商標)スコアリング機能において>0.55)をもたらすペプチドは、潜在的なT細胞エピトープと考えられる。このような領域では、MHCクラスII溝内のペプチド結合のためのコア9アミノ酸配列を分析して、MHCクラスIIポケット残基(P1、P4、P6、P7およびP9)および可能性のあるT細胞受容体(TCR)接触残基(P−1、P2、P3、P5、P8)を決定する。任意のT細胞エピトープの同定後、アミノ酸残基の変化、置換、付加および/または欠失を導入して、同定されたT細胞エピトープを除去することができる。このような変化は、同定されたエピトープを依然として除去しながら抗体の構造および機能を保存するようにすることができる。例示的な変化としては、限定されないが、保存的アミノ酸変化が挙げられる。
多特異性抗体および抗原結合性断片
[00335]一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、多特異性抗体、例えば、二特異性抗体である。多特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。一部の実施形態では、結合特異性の一方は、がん関連抗原に対するものであり、他方は、任意の他の抗原に対するものである。一部の実施形態では、二特異性抗体は、抗原の2つの異なるエピトープに結合し得る。また、二特異性抗体を用いて、細胞傷害剤をがん細胞に局在化させることもできる。二特異性抗体は、全長抗体または抗体断片として調製することができる。
[00336]多特異性抗体を作製するための例示的な技術は、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現、抗体Fc−ヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果の操作、2つ以上の抗体または断片の架橋、二特異性抗体断片を製造するためのロイシンジッパーの使用、二特異性抗体断片を産生するための「ダイアボディ」技術の使用、一本鎖Fv(sFv)二量体の使用、三特異性抗体の調製、および「ノブ−イン−ホール」操作を含む(例えば、Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983);Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991);米国特許第4,676,980号および第5,731,168号;Brennan et al., Science, 229: 81 (1985);Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992);Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993);Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994);およびTutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)を参照されたい)。3つ以上の機能的抗原結合部位を有する操作された抗体もまた意図される。
バリアント
[00337]別の態様では、本明細書には、抗体またはその抗原結合性断片のバリアントが提供される。
置換、挿入、および欠失バリアント
一部の実施形態では、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列バリアントが意図される。バリアントは、典型的には、1つ以上の置換、欠失、付加および/または挿入において、本明細書に具体的に開示されるポリペプチドと異なる。このようなバリアントは、天然に存在し得るか、または、例えば、本発明の上述のポリペプチド配列のうちの1つ以上を修飾し、本明細書に記載されるポリペプチドの1つ以上の生物学的活性を評価し、および/または当該技術分野において周知である多数の技術のいずれかを使用することによって、合成的に生成され得る。例えば、抗体の結合親和性および/または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合があり、抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製することができる。このような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列からの欠失、および/またはその配列内の残基への挿入、および/または残基の置換が含まれる。最終構築物が所望の特徴、例えば抗原結合を有することを条件に、欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせを行って最終構築物に到達させることができる。
[00338]一部の実施形態では、1つ以上のアミノ酸置換を有する抗体バリアントまたはその抗原結合性断片が提供される。置換による突然変異誘発に関して目的の部位には、CDRおよびFRが含まれる。アミノ酸置換は、目的の抗体、および所望の活性、例えば、保持/改善された抗原結合、減少された免疫原性、または改善されたADCCもしくはCDC機能についてスクリーニングされた生成物に導入され得る。
[00339]疎水性アミノ酸には、ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、およびIleが含まれる。中性親水性アミノ酸には、Cys、Ser、Thr、Asn、およびGlnが含まれる。酸性アミノ酸には、AspおよびGluが含まれる。塩基性アミノ酸には、His、Lys、およびArgが含まれる。鎖の配向に影響を及ぼす残基を有するアミノ酸には、GlyとProが含まれる。芳香族アミノ酸には、Trp、Tyr、およびPheが含まれる。
[00340]一部の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、1つ以上のCDR内で起こり得、置換、挿入、または欠失は、抗原に対する抗体結合を実質的に低減させない。例えば、結合親和性を実質的に低減させない保存的置換は、CDRにおいて作製することができる。このような変化は、CDR「ホットスポット」またはSDRの外側にある可能性がある。バリアントVHおよびVL配列の一部の実施形態では、各々のCDRは、変化していないか、または1、2もしくは3つ以下のアミノ酸置換を含むかのいずれかである。
[00341]変化(例えば、置換)は、CDRにおいて、例えば、抗体親和性を改善するために行われ得る。このような変化は、体細胞成熟の間に高い突然変異率を有するCDRコード化コドンにおいてなされ得(例えば、Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照されたい)、および得られたバリアントを結合親和性について試験することができる。親和性成熟(例えば、エラー傾向にあるPCR、鎖シャフリング、CDRのランダム化、またはオリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発を用いる)は、抗体親和性を改善するために使用され得る(例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (2001)を参照されたい)。抗原結合に関与するCDR残基は、例えば、アラニン走査突然変異誘発またはモデリングを用いて特異的に同定することができる(例えば、Cunningham and Wells Science, 244:1081-1085 (1989)を参照されたい)。特にCDR−H3およびCDR−L3が標的とされることが多い。あるいはまたはさらに、抗体と抗原の間の接触点を同定するための抗原−抗体複合体の結晶構造。このような接触残基および隣接残基は、置換のための候補として標的化され得るかまたは排除され得る。バリアントをスクリーニングして、それらが所望の特性を含むかどうかを決定することができる。
[00342]アミノ酸配列の挿入および欠失には、1残基から100個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端および/またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入および欠失が含まれる。末端挿入の例としては、N末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入バリアントは、例えば、N末端またはC末端で、抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。用語「エピトープタグ化」とは、エピトープタグに融合された抗体を指す。エピトープタグポリペプチドは、そこの抗体が作製され得るエピトープを提供するのに十分な残基を有するが、抗体の活性を妨げないほど十分に短い。エピトープタグは、好ましくは、そこの抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないように十分に固有である。適切なタグポリペプチドは、一般的に、少なくとも6つのアミノ酸残基、通常は約8〜50個のアミノ酸残基(好ましくは約9〜30個の残基)を有する。例としては、インフルエンザHAタグポリペプチドおよびその抗体12CA5[Field et al., Mal. Cell. Biol. 8: 2159-2165 (1988)];c−mycタグ、およびそれに対する8F9、3C7、6E10、G4、B7および9E10抗体[Evan et al., Mal. Cell. Biol. 5(12): 3610-3616 (1985)];単純ヘルペスウイルス糖タンパク質D(gD)タグおよびその抗体[Paborsky et al., Protein Engineering 3(6): 547-553 (1990)]が挙げられる。他の例示的なタグは、一般的に約6つのヒスチジン残基のポリヒスチジン配列であり、ニッケルキレート化を用いてそのように標識された化合物の単離を可能にする。本発明は、FLAG(登録商標)タグ(Eastman Kodak、Rochester、N.Y.)などの、当該技術分野において周知であり、日常的に使用される他のラベルおよびタグを包含する。
[00343]抗体分子の他の挿入バリアントは、酵素(例えば、ADEPTについて)または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの抗体のN末端またはC末端への融合を含む。抗体分子の配列内挿入バリアントの例には、軽鎖への3つのアミノ酸の挿入が含まれる。末端欠失の例としては、軽鎖の末端に7つ以下のアミノ酸の欠失を有する抗体が挙げられる。
グリコシル化バリアント
[00344]一部の実施形態では、抗体は、それらのグリコシル化を増加または減少させるように(例えば、1つ以上のグリコシル化部位が作製または除去されるようにアミノ酸配列を変化させることによって)変化される。抗体のFc領域に結合した炭水化物は、変化され得る。哺乳動物細胞由来の天然の抗体は、典型的には、Fc領域のCH2ドメインのAsn297へのN−結合によって結合された分枝した、二分岐オリゴ糖を含む(例えば、Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照されたい)。オリゴ糖は、種々の炭水化物、例えば、マンノース、N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)、ガラクトース、シアル酸、二分岐オリゴ糖構造の幹中のGlcNAcに結合したフコースであり得る。抗体中のオリゴ糖の修飾は、例えば、ある種の改善された特性を有する抗体バリアントを作製するために行うことができる。抗体グリコシル化バリアントは、改善されたADCCおよび/またはCDC機能を有することができる。
[00345]一部の実施形態では、Fc領域に(直接的または間接的に)結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体バリアントが提供される。例えば、このような抗体中のフコースの量は、1%〜80%、1%〜65%、5%〜65%、または20%〜40%であり得る。フコースの量は、Asn297に結合した全ての糖構造の合計に対して、Asn297における糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される(例えば、WO08/077546を参照されたい)。Asn297は、Fc領域の約297位に位置するアスパラギン残基(Fc領域残基のEu番号付け)を指す。しかしながら、Asn297は、抗体におけるわずかな配列変化のために、297位の上流または下流、すなわち294位と300位の間に位置する約±3アミノ酸であり得る。このようなフコシル化バリアントは、ADCC機能を改善することができる(例えば、Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004);Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)を参照されたい)。細胞系、例えば、ノックアウト細胞系およびそれらの使用方法を用いて、脱フコシル化抗体を産生することができ、例えば、Lec13 CHO細胞は、タンパク質フコシル化を欠損し、α−1,6−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子(FUT8)ノックアウトCHO細胞である(例えば、Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986);Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004);Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)を参照されたい)。他の抗体グリコシル化バリアントもまた意図される。
[00346]さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化は修飾される。例えば、アグリコシル化抗体を作製することができる(すなわち、抗体はグリコシル化を欠く)。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるように変化させることができる。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の1つ以上の部位を変化させることによって達成することができる。例えば、1つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の排除をもたらし、それによってその部位におけるグリコシル化を排除する1つ以上のアミノ酸置換を行うことができる。このようなアグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させ得る。このようなアプローチは、Coらによる米国特許第5,714,350号および第6,350,861号にさらに詳細に記載される。保存的置換は、アミノ酸をそのクラスの別のメンバーで置換することを伴う。非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーを別のクラスのメンバーに置換することを伴う。
[00347]したがって、本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、1つ以上の外因性および/または高内因性グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する宿主細胞によって産生され得る。グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する遺伝子には、β(1,4)−N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(GnTII)、α−マンノシダーゼII(ManII)、β(1,4)−ガラクトシルトランスフェラーゼ(GalT)、β(1,2)−N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI(GnTI)およびβ(1,2)−N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼII(GnTII)が含まれる。グリコトランスフェラーゼは、ゴルジ局在ドメイン含む融合物を含み得る(例えば、Lifely et al., Glycobiology 318:813-22 (1995);Schachter, Biochem. Cell Biol. 64:163-81 (1986)を参照されたい)。一部の実施形態では、抗体は、破壊されたまたは不活性化されたグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む宿主細胞において発現され得る。したがって、一部の実施形態では、本開示は、(a)グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列を含む単離された核酸;および(b)本開示の抗体またはその抗原結合性断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。一部の実施形態では、宿主細胞によって産生される修飾された抗体は、IgG定常領域またはFc領域を含むその断片を有する。別の特定の実施形態では、抗体は、ヒト化抗体またはFc領域を含むその断片である。単離された核酸は、その天然環境の成分から分離された核酸分子である。単離された核酸は、通常、核酸分子を含有する細胞に含まれる核酸分子を含むが、核酸分子は、染色体外またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
[00348]本発明の宿主細胞によって産生される、変化されたグリコシル化を有する抗体は、増大したFc受容体結合親和性(例えば、FcγRIIIa受容体などのFcγ活性化受容体への増大した結合)および/または増大したエフェクター機能を示すことができる。エフェクター機能の増加は、以下:抗体依存性細胞傷害性の増加、抗体依存性細胞食作用(ADCP)の増加、サイトカイン分泌の増加、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの増加、Fc媒介性細胞傷害性の増加、NK細胞への結合の増加、マクロファージへの結合の増加、多形核細胞(PMN)への結合の増加、単球への結合の増加、標的結合抗体の架橋の増加、アポトーシスを誘導する直接シグナル伝達の増加、樹状細胞の成熟の増加、およびT細胞プライミングの増加のうちの1つ以上の増加であり得る。したがって、一態様では、本発明は、糖操作されていない抗体と比較して増大したエフェクター機能を有する抗体の糖型を提供する(例えば、Tang et al., J. Immunol. 179:2815-2823 (2007)を参照されたい)。
[00349]本開示はまた、(a)本開示による抗体の産生を可能にする条件下で、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸を発現するように操作された宿主細胞を培養し、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する前記ポリペプチドを前記宿主細胞により産生される前記抗体のFc領域中のオリゴ糖を修飾するのに十分な量で発現させる工程、および(b)前記抗体を単離する工程を含む、修飾されたオリゴ糖を有する、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合性断片を産生するための方法に関する。別の実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する2つのポリペプチドが存在する。本発明の方法によって産生された抗体またはその抗原結合性断片は、Fc受容体結合親和性を増加させ、および/またはエフェクター機能を増加させることができる。
[00350]一部の実施形態では、抗体のFc領域においてバイセクト型のN−結合型オリゴ糖のパーセンテージは、全オリゴ糖の少なくとも約10%〜約100%、具体的には少なくとも約50%、より具体的には少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%〜95%である。さらに別の実施形態では、本発明の方法によって産生された抗体は、本発明の方法によるそのオリゴ糖の修飾の結果として、Fc領域における非フコシル化オリゴ糖の割合が増加する。一部の実施形態では、非フコシル化オリゴ糖のパーセンテージは、少なくとも約20%〜約100%、具体的には少なくとも約50%、少なくとも約60%〜約70%、より具体的には少なくとも約75%である。非フコシル化オリゴ糖は、ハイブリッド型または複合型であり得る。さらに別の実施形態では、本発明の方法によって産生された抗体またはその抗原結合性断片は、本発明の方法によるそのオリゴ糖の修飾の結果として、Fc領域においてバイセクト型オリゴ糖の割合が増加する。一部の実施形態では、バイセクト型オリゴ糖のパーセンテージは、少なくとも約20%〜約100%、具体的には少なくとも約50%、少なくとも約60%〜約70%、より具体的には少なくとも約75%である。
[00351]別の実施形態では、本発明は、本開示の方法によって産生される、増大したエフェクター機能および/または増大したFc受容体結合親和性を有するように操作された抗体またはその抗原結合性断片に関する。一部の実施形態では、抗体は、インタクトな抗体である。一部の実施形態では、抗体は、Fc領域を含む抗体断片、または免疫グロブリンのFc領域に相当する領域を含む融合タンパク質である。
[00352]一態様では、本開示は、修飾されたグリコシル化パターンを有する本開示の抗体またはその抗原結合性断片の生成のための宿主細胞発現系を提供する。特に、本開示は、改善された治療価値を有する、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性断片の糖型の生成のための宿主細胞系を提供する。したがって、本開示は、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを発現するように選択または操作された宿主細胞発現系を提供する。一般的に、上記で検討された細胞系を含む任意のタイプの培養細胞系は、本発明の宿主細胞系を操作するためのバックグラウンドとして使用することができる。一部の実施形態では、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髄腫細胞、P3X63マウス骨髄腫細胞、PER細胞、PER.C6細胞またはハイブリドーマ細胞、他の哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または植物細胞が、本発明の操作された宿主細胞を生成するためのバックグラウンド細胞系として使用される。
[00353]本発明の抗体またはその抗原結合性断片のコード配列を含み、生物学的に活性な遺伝子産物を発現する宿主細胞は、少なくとも4つの一般的なアプローチ;(a)DNA−DNAまたはDNA−RNAハイブリダイゼーション;(b)「マーカー」遺伝子機能の存在または不存在;(c)宿主細胞におけるそれぞれのmRNA転写物の発現によって測定した場合の転写レベルの評価;および(d)免疫アッセイまたはその生物活性によって測定した場合の遺伝子産物の検出によって同定することができる。
Fc領域バリアント
[00354]一部の実施形態では、1つ以上のアミノ酸修飾は、本明細書に提供される抗体のFc領域に導入され得、それによってFc領域バリアントを生成することができる。Fc受容体結合部位内の残基の突然変異は、変化したADCC、CDC活性、および/または変化した半減期などのエフェクター機能の変化をもたらすことができる。突然変異には、例えば、アラニンによる置換、保存的置換、非保存的置換、および/または異なるIgGサブクラスからの同じ位置における対応するアミノ酸残基との置換(例えば、IgG1残基をその位置の対応するIgG2残基と置換すること)を含む、上記でより詳細に記載される1つ以上の残基の挿入、欠失、および/または置換が含まれる。
[00355]本明細書中のFc領域は、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のC末端領域である。Fc領域は、天然配列Fc領域およびバリアントFc領域を含む。Fc領域バリアントは、1つ以上のアミノ酸位置におけるアミノ酸修飾(例えば、置換)を含むヒトFc領域配列(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4 Fc領域)を含み得る。
[00356]以前の研究は、FcγRに対するヒトおよびマウスIgG上の結合部位を、主にIgG残基233〜239で構成される下流のヒンジ領域にマッピングした。他の研究は、例えば、ヒトFcガンマ受容体IのGly316〜Lys338、ヒトFcγ受容体IIIのLys274〜Arg301およびTyr407Arg416などのさらなる広いセグメントが提唱したか、または例えば、マウスFcγ受容体IIと相互作用するマウスIgG2bのAsn297およびGlu318などの下流のヒンジの外側に少数の特異的残基を見出した。ヒトFcγ受容体IIIAを有するヒトIgG Fc断片の3.2−A結晶構造の報告は、Fc受容体γIIIAへの結合に関与するIgG1残基Leu234〜Ser239、Asp265〜Glu269、Asn297〜Thr299、およびAla327〜Ile332を記述した。下流のヒンジ(Leu234〜Gly237)に加えて、IgG CH2ドメインの残基、ループFG(残基326〜330)およびBC(残基265〜271)が、Fcγ受容体IIAへの結合において役割を果たすことが結晶構造に基づいて示唆されている。Shields et al., J. Biol. Chem., 276(9):6591-6604 (2001)を参照されたい。Shieldsらは、全てのヒトFc受容体への結合に関与するIgG1残基は、ヒンジの近位のCH2ドメインに位置し、以下の2つのカテゴリー:1)全てのFcRと直接相互作用し得る位置は、Leu234〜Pro238、Ala327、およびPro329(およびおそらくAsp265);2)炭水化物の性質または位置に影響する位置は、Asp265およびAsn297を含む、に分類されることを報告した。
[00357]一部の実施形態では、本発明は、全部ではないがいくつかのエフェクター機能を有する抗体バリアントを意図しており、それにより、インビボでの抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能(補体およびADCCなど)が不要または有害である用途の望ましい候補となる。インビトロおよび/またはインビボ細胞毒性アッセイを実施して、CDCおよび/またはADCC活性における1つ以上のFcアミノ酸修飾の効果を確認することができる。例えば、Fc受容体(FcR)結合アッセイを実施して、抗体がFcγR結合を欠くが(したがって、ADCC活性を欠く可能性が高い)、FcRn結合能力を保持することを確実にすることができる。
Fcガンマ受容体への結合が変化したFcバリアント
[00358]場合によっては、1つ以上のFcガンマ受容体(FcγR)に対する変化した親和性を示す。例えば、Fcバリアントは、1つ以上のFcガンマ受容体(FcγR)に対する親和性の増加、1つ以上のFcガンマ受容体(FcγR)に対する親和性の減少、またはそれらの組み合わせを示す。一例として、Fcバリアントは、増加したADCC活性を示す。さらに別の例では、Fc領域は、抗体依存性細胞傷害(ADCC)を媒介する抗体の能力を増加させるように修飾される。ヒトIgG1上のFcガンマRI(FcγRI)、FcガンマRII(FcγRII)、FcガンマRIII(FcγRIIII)、およびFcRnの結合部位がマッピングされ、結合が変化したバリアントが記載される。このような修飾の非限定的な例は、例えば、米国特許第6,737,056号;PrestaによるPCT公開番号WO00/42072;Shields, R. L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604;米国特許第7,332,581号などに記載される。一部の実施形態では、本明細書に開示される抗体の定常領域は、IGHG1で置換される。
[00359]一部の実施形態では、改善されたADCC活性を示す本明細書に提供されるFcバリアントは、Fc領域のアミノ酸位置298、333、および/または334(Kabat番号付けを使用する)における突然変異を有するFc領域を含む。
[00360]一例として、本明細書には、アミノ酸位置238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438、および/または439(Kabat番号付けを使用する)でヒトIgG Fc領域において少なくとも1つの突然変異を含む、変化させたエフェクターおよび/またはFc−ガンマ−受容体結合を有するFcバリアントが提供され、バリアントは、変化させたADCCまたはCDC活性に関連する受容体結合プロファイルを示す。
[00361]一例として、本明細書には、アミノ酸位置238、265、269、270、327、および/または329(Kabat番号付けを利用する)におけるアミノ酸修飾を含む、FcγRIへの結合の低減を示すFcバリアントが提供される。
[00362]一例として、本明細書には、アミノ酸位置238、265、269、270、292、294、295、298、303、324、327、329、333、335、338、373、376、414、416、419、435、438、および/または439(Kabat番号付けを利用する)におけるアミノ酸修飾を含む、FcγRIIへの結合の低減を示すFcバリアントが提供される。
[00363]一例として、本明細書には、アミノ酸位置255、256、258、267、268、272、276、280、283、285、286、290、301、305、307、309、312、315、320、322、326、330、331、337、340、378、398、および/または430(Kabat番号付けを利用する)におけるアミノ酸修飾を含む、FcγRIIへの結合の増加を示すFcバリアントが提供される。
[00364]一例として、本明細書には、アミノ酸位置Arg255、Thr256、Glu258、His268、Ser267、Asp270、Asn276、Glu272、Asp280、His285、Asn286、Lys290、Arg292、Gln295、Ser298、Arg301、Thr307、Leu309、Asn315、Lys322、Lys326、Pro331、Ser337、Ala339、Ala378、および/またはLys414(Kabat番号付けを利用する)におけるアミノ酸修飾を含むFcγRIIへの結合の変化を示すFcバリアントが提供される。
[00365]一例として、本明細書には、アミノ酸位置A327Q、A327S、P329A、D265A、および/またはD270A(Kabat番号付けを利用する)におけるアミノ酸修飾を含むFcγRIIへの結合の低減を示すFcバリアントが提供される。
[00366]一例として、本明細書には、アミノ酸位置238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、293、294、295、296、301、303、322、327、329、338、340、373、376、382、388、389、416、434、435、および/または437(Kabat番号付けを利用する)におけるアミノ酸修飾を含む、FcγRIIIへの結合の低減を示すFcバリアントが提供される。
[00367]一例として、本明細書には、アミノ酸位置T256Aおよび/またはK290A(Kabat番号付けを使用する)におけるアミノ酸修飾を含む、FcγRIIおよびFcγRIIIAへの結合の改善を示すFcバリアントが提供される。
[00368]一例として、本明細書には、アミノ酸位置D270A、Q295A、および/またはA327S(Kabat番号付けを使用する)におけるアミノ酸修飾を含む、FcγRIIおよびFcγRIIIAへの結合の低減を示すFcバリアントが提供される。
[00369]一例として、本明細書には、アミノ酸位置(Kabat番号付け)におけるアミノ酸修飾を含む、FcγRIIへの結合の改善を示すが、FcγRIIIAに影響を及ぼさないFcバリアントが提供される。
[00370]一例として、本明細書には、アミノ酸位置S298A(Kabat番号付けを使用する)におけるアミノ酸修飾を含む、FcγRIIへの結合の減少、およびFcγRIIIAへの結合の改善を示すFcバリアントが提供される。
[00371]一例として、本明細書には、アミノ酸位置H268A、R301A、および/またはK322A(Kabat番号付けを使用する)におけるアミノ酸修飾を含む、FcγRIIへの結合の改善、およびFcγRIIIAへの結合の低減を示すFcバリアントが提供される。
[00372]一例として、本明細書には、アミノ酸位置R292Aおよび/またはK414A(Kabat番号付けを使用する)におけるアミノ酸修飾を含む、FcγRIIへの結合の低減を示すが、FcγRIIIAに影響を及ぼさないFcバリアントが提供される。
[00373]一例として、本明細書には、アミノ酸位置S239A、E269A、E293A、V296F、V303A、A327G、K338A、および/またはD376A(Kabat番号付けを使用する)におけるアミノ酸修飾を含む、FcγRIIに影響を示さないが、FcγRIIIAへの結合の低減を示すFcバリアントが提供させる。
[00374]一例として、本明細書には、アミノ酸位置E333A、K334A、および/またはA339T(Kabat番号付けを使用する)におけるアミノ酸修飾を含む、FcγRIIIAへの結合の増加を示すFcバリアントが提供される。
[00375]FcγRへの結合の改善を示すFcバリアントはまた作製され得、アミノ酸位置255、256、258、267、268、272、276、280、283、285、286、290、298、301、305、307、309、312、315、320、322、326、330、331、333、334、337、340、360、378、398、および/または430(Kabat番号付けを利用する)におけるアミノ酸修飾を含み得る。一例として、本明細書には、FcγRIIIへの結合の改善を示し、場合によりFcγRIIへの結合の低減をさらに示し得るFcバリアントが提供され、バリアントは、Fc領域のアミノ酸位置298および/または333(Kabat番号付けを利用する)におけるアミノ酸修飾を含む。
[00376]一例として、本明細書には、アミノ酸位置255、256、258、267、268、272、276、280、283、285、286、290、301、305、307、309、312、315、320、322、326、330、331、337、340、378、398および/または430(Kabat番号付けを利用する)におけるアミノ酸修飾を含む、FcγRIIへの結合の改善を示すFcバリアントが提供される。このようなバリアントは、それがアミノ酸位置268、272、298、301、322または340(Kabat番号付けを利用する)のいずれか1つ以上でFc領域アミノ酸修飾を含む場合、FcγRIIIへの結合の減少をさらに示すことができる。
[00377]一例として、本明細書に記載されるバリアントは、アミノ酸位置240、243、245、247、262、263、266、299、313、325、328、および/または332(Kabat番号付けを使用する);またはアミノ酸位置234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、267、269、296、297、298、299、313、325、327、328、329、330、および/または332(Kabat番号付けを使用する)における突然変異を含み、そのうちのアミノ酸位置234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、267、269、296、297、298、299、313、325、327、328、329、330、または332は、ADCC活性を低減させるかまたはFcガンマ受容体への結合を低減させ得る。一例として、本明細書に記載されるFcバリアントは、ADCC活性を増加させる、アミノ酸位置234、235、239、240、243、264、266、328、330、332、および/または325(Kabat番号付けを使用する)における突然変異を含み、Fcバリアントは、234E、234Y、234I、235D、235S、235Y、235I、239D、239E、239N、239Q、239T、240I、240M、243L、264I、264T、264Y、266I、328M、328I、328Q、328D、328V、328T、330Y、330L、330I、332D、332E、332N、332Q、および325Tからなる群から選択される、少なくとも1つの置換を含む。
[00378]一例として、本明細書には、アミノ酸位置Arg255、Thr256、Glu258、His268、Ser267、Asp270、Asn276、Glu272、Asp280、His285、Asn286、Lys290、Arg292、Gln295、Ser298、Arg301、Thr307、Leu309、Asn315、Lys322、Lys326、Pro331、Ser337、Ala339、Ala378、および/またはLys414(Kabat番号付けを利用する)におけるアミノ酸修飾を含む、FcγRIIへの結合の変化を示すFcバリアントが提供される。
[00379]一例として、本明細書には、アミノ酸位置A327Q、A327S、P329A、D265A、および/またはD270A(Kabat番号付けを利用する)におけるアミノ酸修飾を含む、FcγRIIへの結合の低減を示すFcバリアントが提供される。
[00380]一例として、本明細書には、アミノ酸位置Ser239、Ser267(Glyのみ)、His268、Glu293、Gln295、Tyr296、Arg301、Va1303、Lys338、および/またはAsp376(Kabat番号付けを利用する)におけるアミノ酸修飾を含む、FcγRIIIAへの結合の低減を示すFcバリアントが提供される。
[00381]一例として、本明細書には、アミノ酸位置Lys414(Kabat番号付けを利用する)におけるアミノ酸修飾を含む、FcγRIIAおよびFcγRIIBへの結合の低減を示すFcバリアントが提供される。
[00382]一例として、本明細書には、アミノ酸位置Arg416(Kabat番号付けを利用する)におけるアミノ酸修飾を含む、FcγRIIAおよびFcγRIIIAへの結合の低減を示すFcバリアントが提供される。
[00383]一例として、本明細書には、アミノ酸位置Gln419(Kabat番号付けを利用する)におけるアミノ酸修飾を含む、FcγRIIAおよびFcγRIIBへの結合の低減を示すFcバリアントが提供される。
[00384]一例として、本明細書には、アミノ酸位置Lys360(Kabat番号付けを利用する)におけるアミノ酸修飾を含む、FcγRIIIAへの結合の改善(増加)を示すFcバリアントが提供される。
[00385]Armour et al. (Mol Immunol. 2003; 40(9):585-93)は、活性化受容体であるFcγRIIaと反応するIgG1バリアントを同定した。これは、野生型IgG1の10分の1以下の効率であるが、阻害受容体であるFcγRIIbへの結合は4分の1までしか低下していない。突然変異は、アミノ酸233〜236の領域、および/またはアミノ酸位置327、330および331においてなされた。WO99/58572も参照されたい。
[00386]目的の分子のADCC活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、例えば、米国特許第5,500,362号および第5,821,337号に記載される。あるいは、非放射性アッセイ法(例えば、ACTI(商標)およびCYTOX 96(登録商標)非放射性細胞毒性アッセイ)を使用することができる。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞(PBMC)およびナチュラルキラー(NK)細胞が含まれる。あるいはまたはさらに、目的の分子のADCC活性は、例えば、動物モデル(例えば、Clynes et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)を参照されたい)においてインビボで評価することができる。
C1q結合が減少したFcバリアント
[00387]別の例では、Fcバリアントは、C1q結合の低減を示す。C1q結合アッセイはまた、抗体がC1qに結合することができかまたは結合することができず、したがってCDC活性を含有するかまたはそれらを欠くことを確認するために行うことができる(Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000))。補体活性化を評価するために、CDCアッセイを実施することができる(例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996);Cragg, M. S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003);Cragg et al., Blood 103:2738-2743 (2004)を参照されたい)。
[00388]別の例では、1つ以上のアミノ酸は、抗体が、Clq結合を変化させ、および/または補体依存性細胞傷害性(CDC)を減少もしくは消失させるように、異なるアミノ酸残基で置換することができる。このアプローチは、Idusogieらによる米国特許第6,194,551号においてさらに詳細に記載される。別の例では、1つ以上のアミノ酸残基が変化され、それによって抗体の補体結合能が変化する。このアプローチは、BodmerらによるPCT公開番号WO94/29351号においてさらに記載される。一例として、本明細書に提供されるFcバリアントは、アミノ酸位置329、331、および/または322(Kabat番号付けを使用する)における突然変異を含むことができ、Clq結合および/またはCDC活性の低減を示す。場合によっては、抗体のClq結合活性および/またはCDC活性は、重鎖のアミノ酸残基318、320、および/または322(Kabat番号付けを使用する)を突然変異させることによって低減させることができ;残基297(Asn)を置換することによって、抗体の溶解活性の除去をもたらすことができる。
[00389]IgG1の細胞親和性活性は、その重鎖CH2ドメインの特性である。一例として、FcバリアントがIgGである場合、アミノ酸残基234〜237は、分子の細胞親和性活性を保存するために野生型として維持される。全ELLGGP配列(残基233〜238)を含むIgG2抗体は、場合によっては、野生型IgG1よりも活性であり得る。
[00390]場合によっては、IgG1抗体のClq結合活性および/または溶解活性は、アミノ酸残基Pro331をSerに突然変異させることによって低減させることができる。他の例では、IgG4抗体のClq結合活性および/または溶解活性は、アミノ酸残基ProをSer331に突然変異させることによって低減させることができる(Xu et al., J Biol Chem. 1994; 269(5):3469-74)。
鎖間ジスルフィドが結合するFcバリアントまたは二重Fc領域
[00391]さらに別の実施形態では、例えば、がんを処置する際の抗体の有効性を高めるために、エフェクター機能に関して本発明の抗体を修飾することが望ましい場合がある。例えば、1つ以上のシステイン残基(複数可)がFc領域に導入され得、それによって、この領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にする。このようにして生成されたホモ二量体抗体は、改善された内在化能力、増加した補体媒介細胞死滅、および/または抗体依存性細胞傷害性(ADCC)を有し得る。Caron et al., J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992)およびShapes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)を参照されたい。増強された抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体はまた、Wolff et al., Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されるように、ヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製することができる。
[00392]あるいは、二重Fc領域を有し、それによって増強された補体溶解および/またはADCC能力を有し得る抗体を操作することができる。Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)を参照されたい。
FcRn結合およびインビボ半減期が増加したFcバリアント
[00393]新生児受容体(FcRn)に対する変化させた結合親和性を有するFc領域バリアントはまた、本明細書において意図される。FcRnに対する改善された親和性を有するFc領域バリアントは、より長い血清半減期を有することが予想され、このようなバリアントは、投与されたポリペプチドの長い半減期が望まれる、例えば、慢性疾患または障害を治療するための対象を処置する方法において有用である。逆に、FcRn結合親和性が減少したFc領域バリアントは、より短い半減期を有することが予想され、このようなバリアントは、例えば、インビボ画像診断用、または血流中を長期間循環させたままである場合に、毒性の副作用を有する抗体に対してなど、循環時間の短縮が好ましい場合がある対象に投与することができる。
[00394]FcRnに対する変化させた結合親和力を有するFc領域バリアントは、アミノ酸位置238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439、および/または447(Kabat番号付けを利用する)におけるアミノ酸修飾を含むバリアントを含む。
[00395]FcRn結合親和性が減少したFc領域バリアントは、胎盤を通過する可能性が低く、したがって、妊婦における疾患または障害の処置に利用することができる。一例として、本明細書には、アミノ酸位置252、253、254、255、288、309、386、388、400、415、433、435、436、439、および/または447(Kabat番号付けを利用する)におけるアミノ酸修飾を含む、FcRnへの結合の低減を示すFcバリアントが提供される。
[00396]一例として、本明細書には、アミノ酸位置238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、および/または434(Kabat番号付けを利用する)におけるアミノ酸修飾を含む、FcRnへの結合の増加を示すFcバリアントが提供される。
[00397]一例として、本明細書には、Pro238Ala、Thr256Ala、Thr307Ala、Gln311Ala、Asp312Ala、Glu380Ala、Glu382Ala、および/またはAsn434Ala(Kabat番号付けを利用する)のアミノ酸を含む、FcRnへの結合の増加を示すFcバリアントが提供される。
[00398]一例として、本明細書には、Glu233−Gly236、Arg255、Lys288、Ser415、および/またはHis433(Kabat番号付けを利用する)のアミノ酸位置における修飾を含む、FcRnへの結合の低減を示すFcバリアントが提供される。
[00399]一例として、本明細書には、アミノ酸位置Ile253、Ser254、His435、および/またはTyr436(Kabat番号付けを利用する)における修飾を含む、FcRnへの結合の破棄を示すFcバリアントが提供される。
[00400]Schuurman et al., Mol Immunol. 2001; 38(1):1-8は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、重鎖間結合形成に関与するヒンジシステインの1つであるCys226をセリンに突然変異させると、より安定な重鎖間結合がもたらされたことを報告する。IgG4ヒンジ配列Cys−Pro−Ser−CysをIgG1ヒンジ配列Cys−Pro−Pro−Cysに突然変異させると、重鎖間の共有結合相互作用も顕著に安定化する。Angal et al., Mol Immunol. 1993; 30(1):105-8は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、IgG4中のアミノ酸位置241におけるセリンをプロリン(IgG1およびIgG2中のその位置に見出される)に突然変異させることは、均一な抗体の産生をもたらし、ならびに血清半減期を延長し、元のキメラIgG4と比較して組織分布を改善することを報告する。Fc領域バリアントの他のこのような例も企図される(例えば、Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988);Chan CA and Carter PJ (2010) Nature Rev Immunol 10:301-316);Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照されたい。
[00401]FcRn結合およびインビボでのクリアランス/半減期の測定は、当該技術分野において公知の方法を用いて行うことができる(例えば、Petkova, S. B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006))。
[00402]抗体断片のバリアントおよびサルベージ受容体結合エピトープ
[00403]本発明のある種の実施形態では、例えば、腫瘍浸透を増加させるために、インタクトな抗体ではなく、抗体断片を使用することが望ましい場合がある。この場合、その血清半減期を増加させるために抗体断片を修飾することが望ましく、例えば、半減期を増加させるために抗体断片にPEG、または多糖ポリマーを含む他の水溶性ポリマーなどの分子を添加することが望ましい場合がある。
[00404]これはまた、例えば、サルベージ受容体結合エピトープを抗体断片に取り込むことによって(例えば、抗体断片中の適切な領域の突然変異によって、またはエピトープをペプチドタグに取り込み、次に、いずれかの末端もしくは中央で抗体断片に融合されることによって、例えば、DNAまたはペプチド合成によって)達成することができる(例えば、WO96/32478を参照されたい)。サルベージ受容体結合エピトープは、好ましくは、Fcドメインの1つまたは2つのループからの任意の1つ以上のアミノ酸残基が抗体断片の類似の位置に移動される領域を構成する。さらにより好ましくは、Fcドメインの1つまたは2つのループからの3つ以上の残基が移動される。なおより好ましくは、エピトープは、Fc領域の(例えば、IgGの)CH2ドメインから取り出され、抗体のCHI、CH3、もしくはVH領域、または1つ以上のこのような領域に移動される。あるいは、エピトープは、Fc領域のCH2ドメインから取り出され、抗体断片のCL領域もしくはVL領域、またはその両方に移動される。WO97/34631および96/32478も参照されたい。
[00405]したがって、本発明の抗体は、Fcサルベージ受容体と相互作用する能力を保持する、ヒトFc部分、ヒトコンセンサスFc部分、またはそのバリアントを含み得、バリアントは、ジスルフィドに関与するシステインが修飾もしくは除去され、および/またはMetがN末端に付加され、および/またはN末端の20アミノ酸のうちの1つ以上が除去され、および/またはC1q結合部位などの、補体と相互作用する領域が除去されているバリアントが含まれる。
[00406]Isaacs et al., J Immunol. 1998; 161(8):3862-9は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、FcγR結合に重要なモチーフ内の突然変異(グルタミン酸233からプロリン、ロイシン/フェニルアラニン234からバリン、およびロイシン235からアラニン)は、標的細胞の枯渇を完全に防止することを報告する。グルタミン酸318からアラニンへの突然変異は、マウスIgG2bのエフェクター機能を排除し、ヒトIgG4の効力も低減させた。
システイン操作された抗体バリアント
[00407]一部の実施形態では、抗体の1つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作された抗体またはその抗原結合性断片、例えば「チオMAb」を作製することが望ましい場合がある。一部の実施形態では、置換残基は、抗体のアクセス可能な部位に存在する。反応性チオール基は、他の部分、例えば薬剤部分またはリンカー−薬剤部分へのコンジュゲーションのための部位に配置して、イムノコンジュゲートを作製することができる。一部の実施形態では、以下の残基のうちのいずれか1つ以上が、システインで置換され得る:軽鎖のV205(Kabat番号付け);重鎖のA118(EU番号付け);および重鎖Fc領域のS400(EU番号付け)。システイン操作された抗体は、記載されるように生成され得る。
[00408]モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはバリアント抗体の適切なコンホメーションの維持に関与しないシステイン残基はまた、分子の酸化的安定性を改善し、異常な架橋を防止するために、一般的にセリンで置換され得る。逆に、システイン結合(複数可)を抗体に加えて、その安定性を改善することができる(特に、抗体がFv断片などの抗体断片である場合)。
抗体誘導体
[00409]一部の実施形態では、本明細書に提供される抗体またはその抗原結合性断片は、当該技術分野において公知であり、容易に入手可能なさらなる非タンパク質性部分を含有するようにさらに修飾され得る。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーが挙げられる。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、限定されないが、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−1,3−ジオキソラン、ポリ−1,3,6−トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか)、およびデキストランまたはポリ(n−ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/酸化エチレンコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、およびそれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造において利点を有する可能性がある。ポリマーは、任意の分子量であり得、分枝または非分枝であり得る。抗体に結合したポリマーの数は様々であり、2つ以上のポリマーが結合している場合、それらは同一または異なる分子であり得る。
[00410]別の実施形態では、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体および非タンパク質性部分のコンジュゲートが提供される。一部の実施形態では、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである(例えば、Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)を参照されたい)。放射線は、任意の波長であり得、限定されないが、通常の細胞を傷つけないが、抗体−非タンパク質性部分に近い細胞が死滅される温度まで非タンパク質性部分を加熱する波長を含む。
二特異性抗体
[00411]一部の実施形態では、少なくとも2つの異なるエピトープに対する結合特異性を有するモノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはバリアント抗体を含む多特異性(例えば、二特異性)モノクローナル抗体を作製することが望ましい場合がある。一部の実施形態では、本明細書に開示される抗体は多特異性である。例示的な二特異性抗体は、抗原(例えば、がん関連抗原)の2つの異なるエピトープに結合し得る。あるいは、抗原結合領域は、細胞防御機構を抗原発現細胞に集中させるために、白血球上のトリガー分子、例えばT細胞受容体分子(例えば、CD2またはCD3)、またはIgGに対するFe受容体(FcyR)、例えば、FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)およびFcyRIII(CD16)に結合する領域と組み合わせることができる。また、二特異性抗体を用いて、所望の抗原を発現する細胞に細胞傷害剤を局在化させることができる。これらの抗体は、抗原結合アーム、および細胞傷害剤(例えば、サポリン、抗インターフェロン−60、ビンカアルカロイド、リシンA鎖、メトトレキサートまたは放射性同位体ハプテン)を結合するアームを有する。二特異性抗体は、全長抗体または抗体断片(例えば、F(ab’)2二特異性抗体)として調製することができる。
[00412]二特異性抗体を作製するための別のアプローチによれば、組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体のパーセンテージを最大にするように一対の抗体分子間の界面を操作することができる。好ましい界面は、抗体定常ドメインのCH3ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第1の抗体分子の界面からの1つ以上の小さなアミノ酸側鎖が、より大きな側鎖(例えば、チロシンまたはトリプトファン)に置換される。大きな側鎖(複数可)と同一または類似の大きさの代償的な「空洞」は、大きなアミノ酸側鎖をより小さな側鎖(例えば、アラニンまたはスレオニン)で置換することによって、第2の抗体分子の界面上に生成される。これは、ホモ二量体などの他の望ましくない最終産物よりもヘテロ二量体の収率を増加させるメカニズムを提供する。
[00413]二特異性抗体には、架橋抗体または「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲート中の抗体の1つは、アビジンにカップリングされ得、他方はビオチンにカップリングされ得る。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の便利な架橋方法を用いて作製することができる。適切な架橋剤が、多数の架橋技術とともに企図される。
[00414]抗体断片から二特異性抗体を作製するための技術もまた文献に記載される。例えば、二特異性抗体は、化学結合を用いて調製することができる。Brennan et al., Science 229: 81 (1985)は、インタクトな抗体をタンパク質分解的に切断して、F(ab’)2断片を生成する方法を記載する。これらの断片は、ジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元され、隣接ジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド形成を防止する。次に、生成されたFab’断片はチオニトロ安息香酸(TNB)誘導体に変換される。その後、Fab’−TNB誘導体の1つをメルカプトエチルアミンで還元することによりFab’−チオールに再変換し、等モル量の他のFab’−TNB誘導体と混合して、二特異性抗体を形成する。産生された二特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用することができる。なおさらなる実施形態では、大腸菌から直接回収されたFab’−SH断片をインビトロで化学的にカップリングさせて、二特異性抗体を形成することができる。(Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992))
モノクローナル抗体
[00415]一部の実施形態では、本開示の抗体はモノクローナルである。モノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製することができ、または組換えDNA法によって作製することができる。
[00416]ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えばハムスターまたはマカクザルを、本明細書に記載されるように免疫化して、免疫化に使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生することができるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化することができる。次に、リンパ球をポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986))。
[00417]このようにして調製されたハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する1つ以上の物質を含有する適切な培地中に播種され、増殖される。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRTまたはHPRT)を欠いている場合、ハイブリドーマの培地は、典型的には、HGPRT欠損細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン(HAT培地)を含む。好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高レベル産生を支持し、培地に感受性である細胞である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系は、ヒトモノクローナル抗体の産生についても記載される(Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984);Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。例示的なマウス骨髄腫系は、米国カリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerから入手可能なMOP−21およびM.C.−11マウス腫瘍に由来するもの、ならびに米国メリーランド州ロックビルのAmerican Type Culture Collectionから入手可能なSP−2またはX63−Ag8−653細胞を含む。ハイブリドーマ細胞が増殖している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。したがって、一態様では、本開示は、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合性断片を産生するハイブリドーマを提供する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法、またはラジオイムノアッセイ(RIA)もしくは酵素結合免疫吸収アッセイ(ELISA)などのインビトロ結合アッセイによって決定される。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、スキャッチャード分析(Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980))によって決定することができる。
[00418]所望の特異性、親和性、および/または活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを限定希釈法によりサブクローニングし、標準的方法(Goding, Monoclonal Anti- bodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986))により増殖させることができる。この目的に適した培地としては、例えば、D−MEMまたはRPMI−1640培地が挙げられる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖され得る。サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインA−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製法によって、培地、腹水、または血清から適切に分離される。
操作および修飾された抗体
[00419]本発明の少なくとも一部の実施形態による抗体は、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性断片、出発物質から誘導された1つ以上のVHおよび/またはVL配列を有する抗体を用いて、修飾された抗体を操作するためにさらに調製することができ、これは出発抗体から変化させた特性を有し得る。本明細書には、本明細書に開示される抗体のVHおよびVL鎖領域の完全に再構築されたアミノ酸配列および核酸コンセンサス配列が提供される。また、本明細書には、本明細書に記載される抗体のVHおよびVLのCDR3領域のアミノ酸配列および核酸配列が提供される。抗体は、例えば、1つ以上のCDR領域内および/または1つ以上のフレームワーク領域内で、1つまたは両方の可変領域(すなわち、VHおよび/またはVL)内の1つ以上の残基を修飾することによって操作することができる。さらにまたは代替的に、抗体は、定常領域内の残基を修飾することによって、例えば抗体のエフェクター機能を変化させることによって操作することができる。
[00420]実施可能な可変領域操作の1つのタイプはCDR移植である。抗体は、主に、6つの重鎖および軽鎖相補性決定領域(CDR)に位置するアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。このため、CDR内のアミノ酸配列は、CDRの外側の配列よりも個々の抗体間で多様である。CDR配列はほとんどの抗体−抗原相互作用に関与するため、異なる特性を有する異なる抗体からのフレームワーク配列上に移植された特異的抗体(例えば、本明細書に開示される抗体)からCDR配列を含む発現ベクターを構築することによって、特異的抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現することが可能である(例えば、Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327;Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525;Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033;Winterによる米国特許第5,225,539号、Queenらによる米国特許第5,530,101号;第5,585,089号;第5,693,762号および第6,180,370号を参照されたい)。
[00421]適切なフレームワーク配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む公開DNAデータベースまたは公開参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列DNA配列は、「VBase」ヒト生殖細胞系列配列データベース(インターネット上で入手可能である)、ならびにKabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242;Tomlinson, I. M., et al. (1992) “The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops” J. Mol. Biol. 227:776-798;Cox, J. P. L. et al. (1994) “A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage” Eur. J. Immunol. 24:827-836頁に見出すことができ、それら各々の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
[00422]可変領域修飾の別のタイプは、VHおよび/またはVL CDR1、CDR2および/またはCDR3領域内のアミノ酸残基を突然変異させ、それによって、目的の抗体の1つ以上の結合特性(例えば、親和性)を改善することである。部位特異的突然変異誘発またはPCR媒介突然変異誘発は、突然変異を導入するために行うことができ、抗体結合における効果または他の目的の機能的特性は、適切なインビトロまたはインビボアッセイにおいて評価することができる。好ましくは、保存的修飾(上記で検討される)を導入する。突然変異は、アミノ酸置換、付加または欠失であり得るが、好ましくは置換である。さらに、典型的には、CDR領域内の1、2、3、4または5つ以下の残基が変化される。
[00423]本発明の少なくとも一部の実施形態による操作された抗体は、例えば抗体の特性を改善するために、VHおよび/またはVL内のフレームワーク残基に修飾がなされた抗体を含む。典型的には、このようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を減少させるために行われる。例えば、1つのアプローチは、1つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖系列配列に「復帰突然変異」することである。より具体的には、体細胞突然変異を受けた抗体は、抗体が由来する生殖細胞系列配列とは異なるフレームワーク残基を含み得る。このような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖細胞系列配列と比較することによって同定することができる。
[00424]フレームワークまたはCDR領域内でなされた修飾に加えてまたはそれに代わるものとして、本開示の少なくとも一部の実施形態による抗体は、典型的には、血清半減期、補体結合、Fc受容体結合、および/または抗原依存性細胞傷害などの抗体の1つ以上の機能的特性を変化させるように、Fc領域内の修飾を含むように操作され得る。さらに、本発明の少なくとも一部の実施形態による抗体は、化学的に修飾され得(例えば、1つ以上の化学部分が抗体に結合され得る)、または修飾されて、そのグリコシル化を変化させて、やはり、抗体の1つ以上の機能的特性を変化させることができる。このような実施形態は上記される。Fc領域の残基の番号付けは、KabatのEUインデックスのものである。
[00425]一実施形態では、CH1のヒンジ領域は、ヒンジ領域におけるシステイン残基の数が変化するように、例えば、増加または減少するように修飾される。このアプローチは、Bodmerらによる米国特許第5,677,425号にさらに記載される。CH1のヒンジ領域におけるシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖のアセンブリーを容易にするため、または抗体の安定性を増加もしくは減少させるために変化させる。別の実施形態では、抗体のFcヒンジ領域を突然変異させて、抗体の生物学的半減期を減少させる。より具体的には、1つ以上のアミノ酸変異は、抗体が天然のFc−ヒンジドメインSpA結合と比較してブドウ球菌プロテインA(SpA)結合を損なうように、Fc−ヒンジ断片のCH2−CH3ドメイン界面領域に導入される。このアプローチは、Wardらによる米国特許第6,165,745号にさらに詳細に記載される。
[00426]別の実施形態では、抗体は、その生物学的半減期を増加させるように修飾される。様々なアプローチが可能である。例えば、生物学的半減期を増加させるために、抗体は、Prestaらによる米国特許第5,869,046号および第6,121,022号に記載されているように、IgGのFc領域のCH2ドメインの2つのループから取り出されたサルベージ受容体結合エピトープを含むように、CH1またはCL領域内で変化させることができる。
[00427]さらに他の実施形態では、Fc領域は、抗体のエフェクター機能を変化させるために、少なくとも1つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することによって変化させる。別の例では、抗体がC1q結合を変化させ、および/または補体依存性細胞傷害性(CDC)を低減もしくは消失させるように、1つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置換することができる。このアプローチは、Idusogieらによる米国特許第6,194,551号にさらに詳細に記載される。別の例では、1つ以上のアミノ酸残基が変化され、それによって抗体の補体結合能が変化する。このアプローチは、BodmerらによるPCT公開番号WO94/29351にさらに記載される。
[00428]さらに別の例において、Fc領域は、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)を媒介する抗体の能力を増加させるため、および/または1つ以上のアミノ酸を修飾することによって、Fc受容体に対する抗体の親和性を増加させるために修飾される。このアプローチは、PrestaによるPCT公開番号WO00/42072にさらに記載される。さらに、FcガンマRI、FcガンマRII、FcガンマRIIIおよびFcRnに対するヒトIgG1上の結合部位がマッピングされ、改善された結合を有するバリアントが記載されている(Shields, R. L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604を参照されたい)。位置における特異的突然変異は、FcγRIIIへの結合を改善することが示される。さらに、このような特異的突然変異は、FcRnへの結合を改善し、抗体循環半減期を増加させ得る(Chan CA and Carter PJ (2010) Nature Rev Immunol 10:301-316を参照されたい)。一部の実施形態では、本明細書に開示される抗体の定常領域は、IGHG1で置換される。
[00429]さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化は修飾される。例えば、アグリコシル化抗体を作製することができる(すなわち、抗体はグリコシル化を欠く)。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるために変化させることができる。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の1つ以上の部位を変化させることによって達成することができる。例えば、1つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の排除をもたらし、それによってその部位でのグリコシル化を排除する1つ以上のアミノ酸置換を行うことができる。このようなアグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させ得る。このようなアプローチは、Coらによる米国特許第5,714,350号および第6,350,861号にさらに詳細に記載される。保存的置換は、アミノ酸をそのクラスの別のメンバーで置換することを伴う。非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーを別のクラスのメンバーで置換することを伴う。
[00430]モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはバリアント抗体の適切なコンホメーションの維持に関与しない任意のシステイン残基は、分子の酸化的安定性を改善し、異常な架橋を防止するために、一般的にセリンで置換され得る。逆に、システイン結合(複数可)を抗体に加えて、その安定性を改善することができる(特に、抗体がFv断片などの抗体断片である場合)。
[00431]抗体の他の修飾も意図される。例えば、エフェクター機能に関して本発明の抗体を修飾し、例えば、がんを処置する際の抗体の有効性を高めることが望ましい場合がある。例えば、システイン残基(複数可)は、Fe領域に導入され得、それによって、この領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にする。このようにして生成されたホモ二量体抗体は、改善された内在化能力、ならびに/または増加した補体媒介細胞死滅および抗体依存性細胞傷害性(ADCC)を有し得る。Caron et al., J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992)、およびShapes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)を参照されたい。増強された抗腫瘍活性を有するホモジマー抗体はまた、Wolff et al., Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されるように、ヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製することができる。あるいは、二重Fe領域を有し、それによって増強された補体溶解およびADCC能力を有する抗体を操作することができる。Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)を参照されたい。さらに、CDR内の配列は、抗体をMHCクラスIIに結合させ、望ましくないヘルパーT細胞応答を誘発する可能性があることが示されている。保存的置換により、抗体は結合活性を保持しながら、望ましくないT細胞応答を誘発する能力を失う可能性がある。また、マウス可変領域がヒトガンマ1、ガンマ2、ガンマ3、およびガンマ4定常領域と接続されたキメラ抗体を記載する、その全体が参照により本明細書に組み込まれるSteplewski et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1988; 85(13):4852-6を参照されたい。
[00432]本発明のある種の実施形態では、例えば、腫瘍浸透を増加させるために、インタクトな抗体ではなく抗体断片を使用することが望ましい場合がある。この場合、その血清半減期を増加させるために抗体断片を修飾することが望ましく、例えば、半減期を増加させるために抗体断片に分子、例えば、PEG、または多糖ポリマーなどの他の水溶性ポリマーを添加することが望ましい場合がある。これはまた、例えば、サルベージ受容体結合エピトープを抗体断片に組み込むことによって(例えば、抗体断片中の適切な領域の突然変異によって、またはエピトープをペプチドタグに組み込み、次に、いずれかの末端または中央で抗体断片に、例えば、DNAまたはペプチド合成によって融合させることによって)達成することができる(例えば、WO96/32478を参照されたい)。
[00433]サルベージ受容体結合エピトープは、好ましくは、Feドメインの1つまたは2つのループからの任意の1つ以上のアミノ酸残基が抗体断片の類似の位置に移動される領域を構成する。なおより好ましくは、Feドメインの1つまたは2つのループからの3つ以上の残基が移動される。さらにより好ましくは、エピトープは、Fe領域の(例えば、igGの)CH2ドメインから取り出され、抗体のCHI、CH3、もしくはVH領域、または1つ以上のこのような領域に移動される。あるいは、エピトープは、Fe領域のCH2ドメインから取り出され、抗体断片のCL領域またはVL領域、またはその両方に移動される。Feバリアント、およびサルベージ受容体とのそれらの相互作用を記載するWO97/34631および96/32478も参照されたい。
[00434]したがって、本発明の抗体は、ヒトFe部分、ヒトコンセンサスFe部分、またはFeサルベージ受容体と相互作用する能力を保持するそのバリアントを含み得、これには、ジスルフィド結合に関与するシステインが修飾もしくは除去されているバリアント、ならびに/またはmetがN末端で付加され、および/もしくはN末端の20アミノ酸の1つ以上が除去され、および/もしくはC1q結合部位などの補体と相互作用する領域が除去され、および/もしくはADCC部位が除去されているバリアントが含まれる[例えば、Malec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992)を参照されたい]。
[00435]以前の研究は、FcRに対するヒトおよびマウスIgG上の結合部位を、主にIgG残基233〜239で構成される下流のヒンジ領域にマッピングした。他の研究は、追加の広範なセグメント、例えば、ヒトFe受容体IについてはGly316−Lys338、ヒトFe受容体IIIについてはLys274−Arg301およびTyr407−Arg416を提案し、または下流のヒンジの外側に少数の特異的残基、例えば、マウスFe受容体IIと相互作用するマウスIgG2bについてはAsn297およびGlu318を見出した。ヒトFe受容体IIIAを有するヒトIgG Fe断片の3.2−A結晶構造の報告は、Fe受容体IIIAへの結合に関与するIgG1残基Leu234−Ser239、Asp265−Glu269、Asn297−Thr299、およびAla327−Ile332を示した。下流のヒンジ(Leu234−Gly237)に加えて、IgG CH2ドメインループFGの残基(残基326〜330)およびBCの残基(残基265〜271)がFe受容体IIAへの結合に役割を果たし得ることが結晶構造に基づいて示唆されている。その全体が参照により本明細書に組み込まれるShields et al., J. Biol. Chem., 276(9):6591-6604 (2001)を参照されたい。Fe受容体結合部位内の残基の突然変異は、ADCCもしくはCDC活性の変化、または半減期の変化などのエフェクター機能の変化をもたらすことができる。上記されるように、潜在的突然変異には、1つ以上の残基の挿入、欠失または置換が含まれ、アラニンによる置換、保存的置換、非保存的置換、または異なるIgGサブクラスからの同じ位置における対応するアミノ酸残基との置換(例えば、IgG1残基をその位置で対応するIgG2残基と置換すること)を含む。
[00436]Shieldsらは、全てのヒトFc受容体への結合に関与するIgG1残基は、ヒンジの近位のCH2ドメインに位置し、以下の2つのカテゴリー:1)全てのFcRと直接相互作用し得る位置は、Leu234〜Pro238、Ala327、およびPro329(およびおそらくAsp265);2)炭水化物の性質または位置に影響する位置は、Asp265およびAsn297を含む、に分類されることを報告した。Fe受容体IIへの結合に影響を与えるさらなるIgG1残基は、以下の通りである:(最大効果)Arg255、Thr256、Glu258、Ser267、Asp270、Glu272、Asp280、Arg292、Ser298、および(より少ない効果)His268、Asn276、His285、Asn286、Lys290、Gln295、Arg301、Thr307、Leu309、Asn315、Lys322、Lys326、Pro331、Ser337、Ala339、Ala378、およびLys414。A327Q、A327S、P329A、D265AおよびD270Aは結合を低減させた。全てのFcRについて上記で同定された残基に加えて、Fe受容体IIIAへの結合を40%以上低減させたさらなるIgG1残基は、以下の通りである:Ser239、Ser267(Glyのみ)、His268、Glu293、Gln295、Tyr296、Arg301、Va1303、Lys338、およびAsp376である。FcRIIIAへの結合を改善するバリアントには、T256A、K290A、S298A、E333A、K334A、およびA339Tが含まれる。
[00437]Lys414は、FcRIIAおよびFcRIIBに対する結合が40%低減することを示し、Arg416は、FcRIIAおよびFcRIIIAに対して30%低減し、Gln419は、FcRIIAに対して30%低減し、FcRIIBに対して40%低減し、Lys360は、FcRIIIAに対して23%改善した。Presta et al., Biochem. Soc. Trans. (2001) 30, 487-490も参照されたい。
[00438]例えば、米国特許第6,194,551号は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、アミノ酸位置329、321または322(Kabat番号付けを使用する)でのヒトIgG Fe領域における突然変異を含む変化させたエフェクター機能を有するバリアントを記載し、そのうちのいくつかはC1q結合またはCDC活性の低減を示す。別の例として、米国特許第6,737,056号は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、アミノ酸位置238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438または439(Kabat番号付けを使用する)でのヒトIgG Fe領域における突然変異を含む変化させたエフェクター機能またはFeガンマ受容体結合を有するバリアントを記載し、そのうちのいくつかは、ADCCまたはCDC活性の低減と関連する受容体結合プロファイルを示す。これらのうち、アミノ酸位置238、265、269、270、327または329での突然変異は、FcRIへの結合を低減させることが記載され、アミノ酸位置238、265、269、270、292、294、295、298、303、324、327、329、333、335、338、373、376、414、416、419、435、438または439での突然変異は、FcRIIへの結合を低減させることが記載され、アミノ酸位置238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、293、294、295、296、301、303、322、327、329、338、340、373、376、382、388、389、416、434、435または437での突然変異は、FcRIIIへの結合を低減させることが記載される。
[00439]米国特許第5,624,821号は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、マウス抗体のC1q結合活性が、重鎖のアミノ酸残基318、320または322を突然変異させることにより変化させることができ、残基297(Asn)を置換することにより溶解活性が除去されることを報告する。
[00440]米国出願公開第2004/0132101号は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、アミノ酸位置240、24 245、247、262、263、266、299、313、325、328、もしくは332(Kabat番号付けを使用する)、または位置234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、267、269、296、297、298、299、313、325、327、328、329、330、もしくは332で突然変異を有するバリアントを記載し、そのうち位置234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、267、269、296、297、298、299、313、325、327、328、329、330、または332の突然変異は、ADCC活性を低減するかまたはFeガンマ受容体への結合を低減し得る。
[00441]Chappel et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1991; 88(20):9036-40は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、IgG1の細胞親和性活性がその重鎖CH2ドメインの固有の特性であることを報告する。IgG1のアミノ酸残基234〜237のいずれかにおける単一点突然変異は、その活性を有意に低下させ、または消失させた。完全な結合活性を回復するためには、IgG2およびIgG4への全てのIgG1残基234〜237(LLGG)の置換が必要であった。全ELLGGP配列(残基233〜238)を含むIgG2抗体は、野生型IgG1よりも活性が高いことが観察された。
[00442]Isaacs et al., J Immunol. 1998; 161(8):3862-9は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、FeガンマR結合に重要なモチーフ内の突然変異(グルタミン酸233からプロリン、ロイシン/フェニルアラニン234からバリン、およびロイシン235からアラニン)は、標的細胞の枯渇を完全に防止したことを報告する。グルタミン酸318からアラニンへの突然変異は、マウスIgG2bのエフェクター機能を排除し、さらにヒトIgG4の効力を低減させた。
[00443]Armour et al., Mol Immunol. 2003; 40(9):585-93は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、活性化受容体、FcガンマRIIaと反応するIgG 1バリアントを同定し、これは野生型IgG1の10分の1以下の効率であるが、阻害受容体、FcガンマRIIbへの結合は4分の1までしか低減していない。突然変異は、アミノ酸233〜236の領域、および/またはアミノ酸位置327、330および331において行われた。その全体が参照により本明細書に組み込まれるWO99/58572も参照されたい。Xu et al., J Biol Chem. 1994; 269(5):3469-74は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、IgG1 Pro331をSerに突然変異させると、C1q結合が顕著に減少し、溶解活性が実質的に排除されたことを報告する。対照的に、IgG4におけるProのSer331への置換は、IgG4 Pro331バリアントに部分的溶解活性(40%)を与えた。
[00444]Schuurman et al., Mol Immunol. 2001; 38(1):1-8は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、重鎖間結合形成に関与するヒンジシステインの1つであるCys226をセリンに突然変異させると、より安定な重鎖間結合がもたらされたことを報告する。また、IgG4ヒンジ配列Cys−Pro−Ser−CysをIgG1ヒンジ配列Cys−Pro−Pro−Cysに変異させると、重鎖間の共有結合相互作用を顕著に安定化する。Angal et al., Mol Immunol. 1993; 30(1):105-8は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、IgG4中のアミノ酸位置241におけるセリンをプロリンに突然変異させること(IgG1およびIgG2中のその位置に見出される)は、均一な抗体の産生をもたらし、血清半減期を延長し、元のキメラIgG4と比較して組織分布を改善したことを報告する。
親和性成熟
[00445]親和性成熟は、親抗体のCDR内に置換を有する抗体バリアントを調製およびスクリーニングし、親抗体に対する結合親和性などの改善された生物学的特性を有するバリアントを選択することを伴う。このような置換バリアントを生成するための便利な方法は、ファージディスプレイを用いる親和性成熟である。簡単に説明すると、いくつかの超可変領域部位(例えば、6〜7部位)が突然変異されて、各部位で可能性のある全てのアミノ置換が生成される。このようにして生成された抗体バリアントは、各粒子内にパッケージ化されたM13の遺伝子III産物への融合として、フィラメント状ファージ粒子から一価様式で提示される。次に、ファージ提示バリアントは、それらの生物活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。
[00446]アラニンスキャニング突然変異誘発は、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定するために行うことができる。あるいはまたはさらに、抗体と抗原の間の接触点を同定するために、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析することが有益であり得る。このような接触残基および隣接残基は、本明細書に詳述された技術による置換の候補である。このようなバリアントが生成されると、バリアントのパネルは、本明細書に記載されるようにスクリーニングに供され、1つ以上の関連するアッセイにおいて優れた特性を有する抗体が、さらなる開発のために選択され得る。
グリコシル化の変化
[00447]さらにまたは代替的に、減少した量のフコシル残基を有する低フコシル化抗体、または増加したバイセクト型GlcNac構造を有する抗体などの、変化させたタイプのグリコシル化を有する抗体を作製することができる。このように変化させたグリコシル化パターンは、抗体のADCC能力を増加させることが示されている。グリコシル化抗体またはその抗原結合性断片を包含する実施形態は、上記のセクションに記載されている。このような炭水化物修飾は、例えば、変化させたグリコシル化機構を用いて宿主細胞中で抗体を発現させることによって達成することができる。変化させたグリコシル化機構を有する細胞は、当該技術分野で報告されており、本開示の少なくとも一部の実施形態に従って組換え抗体を発現させ、それによって変化させたグリコシル化を有する抗体を産生する宿主細胞として使用することができる。例えば、細胞系Ms704、Ms705、およびMs709は、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子FUT8(アルファ(1,6)フコシルトランスフェラーゼ)を欠いており、その結果、Ms704、Ms705、およびMs709細胞系において発現される抗体は、それらの炭水化物上にフコースを欠いている。Ms704、Ms705、およびMs709 FUT8.−/−細胞系は、2つの置換ベクターを用いて、CHO/DG44細胞中のFUT8遺伝子の標的化破壊によって作製される(Yamaneらによる米国特許公開第20040110704号、およびYamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22を参照されたい)。別の例として、Hanaiらにより欧州特許第1,176,195号は、フコシルトランスフェラーゼをコードする機能的に破壊されたFUT8遺伝子を有する細胞系を記載し、そのような細胞系で発現された抗体は、α1,6結合関連酵素を低減または排除することによって低フコシル化を示す。Hanaiらはまた、抗体のFc領域に結合するかまたは酵素活性を有さないN−アセチルグルコサミンにフコースを添加するための低い酵素活性を有する細胞系、例えばラット骨髄腫細胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)を記載する。PrestaによるPCT公開番号WO03/035835は、Asn(297)結合型炭水化物にフコースを結合する能力が低下したバリアントCHO細胞系Lec13細胞を記載し、さらに、その宿主細胞において発現される抗体の低フコシル化をもたらすことを記載する(Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照されたい)。UmanaらによるPCT公開番号WO99/54342は、操作された細胞系で発現された抗体が、抗体のADCC活性の増加をもたらすバイセクト型GlcNac構造の増加を示すように、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ(例えば、β(1,4)−N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(GnTIII))を発現するように操作された細胞系を記載する(Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180も参照されたい)。あるいは、抗体のフコース残基は、フコシダーゼ酵素を使用して切断され得る。例えば、フコシダーゼアルファ−L−フコシダーゼは、抗体からフコシル残基を除去する(Tarentino, A. L. et al. (1975) Biochem. 14:5516-23)。
ペグ化
[00448]本開示によって意図される本明細書中の抗体の別の修飾は、ペグ化である。抗体をペグ化して、例えば、抗体の生物学的(例えば血清)半減期を増加させることができる。抗体をペグ化するために、典型的には、1つ以上のポリエチレングリコール(PEG)基が抗体または抗体断片に結合するようになる条件下で、抗体またはその断片を、PEGの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのPEGと反応させる。好ましくは、ペグ化は、反応性PEG分子(または類似の反応性水溶性ポリマー)とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して行われる。本明細書で使用される場合、用語「ポリエチレングリコール」は、モノ(C1〜C10)アルコキシ−もしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなどの他のタンパク質を誘導体化するために使用されたPEGの形態のいずれかを包含することが意図される。ある種の実施形態では、ペグ化される抗体は、アグリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は、当該技術分野において公知であり、本発明の少なくとも一部の実施形態に従って抗体に適用することができる。例えば、Nishimuraらによる欧州特許第0154316号、およびIshikawaらによる欧州特許第0401384号を参照されたい。
他の共有結合修飾
[00449]抗体の共有結合修飾はまた、本発明の範囲内に含まれる。それらは、化学的合成によって、または、該当する場合、抗体の酵素的もしくは化学的切断によって行うことができる。抗体の他のタイプの共有結合修飾は、抗体の標的化アミノ酸残基を、選択された側鎖またはN末端もしくはC末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることによって分子に導入される。
[00450]システイニル残基は、ハロ酢酸(および対応するアミン)、例えばクロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応させて、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得るのが最も一般的である。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、アルファ−ブロモ−(5−イミドゾイル)プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、N−アルキルマレイミド、3−ニトロ−2−ピリジルジスルフィド、メチル2−ピリジルジスルフィド、p−クロロ水銀安息香酸塩、2−クロロ水銀−4−ニトロフェノール、またはクロロ−7−ニトロベンゾ−2−オキサ−1,3−ジアゾールとの反応によって誘導体化される。
[00451]ヒスチジル残基は、pH5.5〜7.0でジエチルピロカルボネートとの反応によって誘導体化される。これは、この薬剤がヒスチジル側鎖に対して比較的特異的であるためである。パラ−ブロモフェナシルブロミドもまた有用であり、反応は、好ましくは、pH6.0で0.1Mカコジル酸ナトリウム中で行われる。リジニルおよびアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの薬剤による誘導体化は、リジン残基の電荷を逆転させる効果がある。アルファアミノ含有残基を誘導体化するための他の適切な試薬としては、イミドエステル、例えば、メチルピコリンイミデート、ピリドキサールリン酸、ピリドキサール、クロロホウ水素化物、トリニトロベンゼンスルホン酸、メチルイソウレア、2,4−ペンタンジオン、およびグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が挙げられる。
[00452]アルギニル残基は、1種または数種の慣用的試薬、それらのうち、フェニルグリオキサール、2,3−ブタンジオン、1,2−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンとの反応によって修飾される。アルギニン残基の誘導体化には、グアニジン官能基のpKaが高いため、アルカリ性条件下で反応を行う必要がある。さらに、これらの試薬は、アルギニンイプシロン−アミノ基と同様にリジンの基と反応し得る。
[00453]チロシル残基の特異的修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によって、チロシル残基にスペクトル標識を導入することに特に関心を持って行うことができる。最も一般的には、N−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンが、それぞれ0−アセチルチロシル種および3−ニトロ誘導体を形成するために使用される。チロシル残基を125Iまたは131Iを用いてヨウ化し、ラジオイムノアッセイに使用するための標識タンパク質を調製する。カルボキシル側基(アスパルチルまたはグルタミル)は、カルボジイミド(R−N.dbd.C.dbd.N−R’)との反応によって選択的に修飾され、この場合、RおよびR’は、1−シクロヘキシル−3−(2−モルホリニル−4−エチル)カルボジイミドまたは1−エチル−3−(4−アゾニア−4,4−ジメチルペンチル)カルボジイミドなどの異なるアルキル基である。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。
[00454]グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、それぞれ対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミド化されることが多い。これらの残基は、中性または塩基性条件下で脱アミド化される。これらの残基の脱アミド化形態は、本発明の範囲内にある。他の修飾には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のアルファアミノ基のメチル化(T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983))、N末端アミンのアセチル化、および任意のC末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
[00455]別のタイプの共有結合修飾は、グリコシドを抗体に化学的または酵素的にカップリングさせることを伴う。これらの手法は、N−結合型またはO−結合型グリコシル化のためのグリコシル化能力を有する宿主細胞における抗体の産生を必要としない点で有利である。使用されるカップリングモードに依存して、糖(複数可)は、(a)アルギニンおよびヒスチジン、(b)遊離カルボキシル基、(c)システインなどの遊離スルフヒドリル基、(d)セリン、スレオニンまたはヒドロキシプロリンなどの遊離ヒドロキシル基、(e)フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンなどの芳香族残基、または(f)グルタミンのアミド基に結合され得る。これらの方法は、1987年9月11日に公開されたWO87/05330およびAplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載される。
[00456]抗体上に存在する任意の炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に達成され得る。化学的脱グリコシル化には、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または同等の化合物への抗体の曝露を必要とする。この処置は、連結糖(N−アセチルグルコサミンまたはN−アセチルガラクトサミン)を除くほとんどまたは全ての糖の切断をもたらし、抗体はインタクトなまま残る。化学的脱グリコシル化は、Hakimuddin, et al. Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 (1987)およびEdge et al. Anal. Biochem., 118: 131 (1981)に記載される。抗体上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura et al. Meth. Enzymol. 138: 350 (1987)によって記載される種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用によって達成することができる。
[00457]抗体の別のタイプの共有結合修飾は、抗体を種々の非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール、ポリオキシアルキレン、またはデキストランなどの多糖ポリマーの1つに連結させることを含む。このような方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許第4,640,835号、第4,496,689号、第4,301,144号、第4,670,417号、第4,791,192号、第4,179,337号、第4,766,106号、第4,179,337号、第4,495,285号、第4,609,546号または欧州特許第315456号を参照されたい。
競合抗体
[00458]一部の実施形態では、特定の抗原(例えば、表9および表10の抗原)への結合に関して本明細書に提供される抗体と競合する抗体が提供される。一部の実施形態では、抗体は、特定の抗原上のエピトープに結合するために本明細書に提供される抗体と競合する。
[00459]一部の実施形態では、競合アッセイを使用して、本明細書に記載される抗体と競合するモノクローナル抗体を同定することができる。競合アッセイを用いて、2つの抗体が、同一または立体的に重複するエピトープを認識することによって同一のエピトープに結合するか、または1つの抗体が別の抗体の抗原への結合を競合的に阻害するかを決定することができる。一部の実施形態では、このような競合する抗体は、本明細書に記載される抗体によって結合される同じエピトープに結合する。例示的な競合アッセイは、限定されないが、Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.)に提供されるルーチンなアッセイを含む。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法は、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol.66 (Humana Press, Totowa, N.J.)に提供されている。一部の実施形態では、2つの抗体は、各々が50%以上、他方の結合をブロックする場合に、同一のエピトープに結合すると言われる。一部の実施形態では、本明細書に記載される抗体と競合する抗体は、キメラ、ヒト化またはヒト抗体である。一部の実施形態では、本明細書に記載されるキメラ、ヒト化またはヒト抗体と競合する抗体が提供される。
[00460]一部の実施形態では、本明細書に提供される抗体が結合するエピトープのいずれか1つ以上に結合する抗体が提供される。一部の実施形態では、本抗体が結合するエピトープに結合し、重複する抗体が提供される。一部の実施形態では、本明細書に提供される抗体の少なくとも1つと競合する抗体が提供される。一部の実施形態では、本明細書に提供される抗体の少なくとも2つと競合する抗体が提供される。一部の実施形態では、本明細書に提供される抗体の少なくとも3つと競合する抗体が提供される。一部の実施形態では、抗体は、本明細書の実施例に記載される抗体として、重複するエピトープに結合する。一部の実施形態では、全エピトープは、競合する抗体によって結合および/または妨害される。一部の実施形態では、エピトープの一部は、競合する抗体によって結合および/または妨害される。一部の実施形態では、競合する抗体のパラトープは、本明細書に提供される抗体のエピトープの少なくとも一部に結合する。一部の実施形態では、競合する抗体のパラトープは標的に結合し、競合する抗体の構造の異なるセクションは、本明細書に提供される抗体のエピトープの少なくとも一部を妨害する。
[00461]用語「競合」または「交差競合」は、抗体分子、例えば、標的への本発明の抗体の結合を妨げる抗体分子、例えば、表9および表10の抗原の能力を指し、本明細書では互換的に使用される。結合への妨げは、(例えば、抗体分子または標的のアロステリック調節を介して)直接的であるかまたは間接的であり得る。抗体分子が標的への他の抗体分子の結合を妨げる程度、したがって、それらが競合し得るかどうかは、FACS分析、ELISAまたはBIACORE分析などの競合結合アッセイを用いて決定することができる。一部の実施形態では、競合結合アッセイは、定量的競合アッセイである。一部の実施形態では、第一の抗体分子は、二次抗体分子の抗体と比較して、10%以上大きい、例えば20%以上大きい(例えば、10%以上、30%以上、40%以上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%、99%を超える)標的への第1の抗体分子の結合を有する。
抗体を作製する方法
[00462]本開示の抗体またはその抗原結合性断片を、本明細書で開示されるがん関連抗体またはその抗原結合性断片のインシリコで再構築された完全な核酸配列およびアミノ酸配列を使用して得ることができる。いくつかの実施形態では、下記で説明する方法により調製された抗体またはその抗原結合性断片が提供される。いくつかの実施形態では、この抗体またはその抗原結合性断片は、宿主細胞中で調製される。いくつかの実施形態では、この抗体またはその抗原結合性断片は、宿主細胞から単離される。いくつかの実施形態では、この抗体またはその抗原結合性断片は、無細胞系で調製される。いくつかの実施形態では、この抗体またはその抗原結合性断片は精製される。本発明はまた、本発明の抗体分子を産生する方法であって、本発明の抗体の形成を可能にする条件下で、本発明の抗体分子をコードする核酸を含む発現ベクターを含む宿主細胞を培養する工程と;培養物から、この宿主細胞により発現された抗体分子を単離する工程と;任意選択で、本発明の抗体分子をさらに精製するおよび/または改変するおよび/または製剤化する工程とを全体として含む方法も提供する。
[00463]本開示の抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸分子は、例えば、成熟哺乳動物Bリンパ球から、またはハイブリドーマ培養物の一部として不死化細胞と融合している場合には、従来の手順を使用して(例えば、所望の抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用して)単離され得る。本開示は、抗体ポリペプチドまたはその抗原結合性断片をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を提供する。本明細書で開示される配列を含む単離された核酸分子は、当分野で公知であり、かつ後述するように、(a)組換え法、(b)合成技術、(c)精製技術、および/または(d)それらの組み合わせを使用して調製され得る。
[00464]抗体またはその抗原結合性断片(例えば重鎖または軽鎖)をコードするメッセンジャーRNAは、RNA単離の標準的な技術を用いて、およびポリA mRNAを分離するためのオリゴdTセルロースクロマトグラフィーの使用により、成熟B細胞またはハイブリドーマ培養物のいずれかの適切な供給源から単離され得る。場合によっては、このポリA mRNAをさらに分画して、所望の抗体の軽鎖または重鎖のアミノ酸配列をコードするのに十分なサイズの配列を得ることができる。
[00465]例えば、cDNAライブラリーは、ポリA+mRNA(好ましくは膜関連mRNA)の逆転写により構築し得、このライブラリーは、適切なプライマー(好ましくは、所望のcDNAに特徴的な核酸配列)を使用してスクリーニングされ得る。そのようなプライマーは、配列が既知である場合には抗体のcDNAまたはアミノ酸配列に基づいて容易に仮定して合成され得、例えば、このプライマーは、本明細書で開示される抗体の核酸配列またはアミノ酸配列に基づいて合成され得る。
[00466]しかしながら、いくつかの実施形態では、前述したプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して、目的の1つまたは複数の免疫グロブリン遺伝子セグメント(例えば軽鎖可変セグメント)をコードするcDNA(または全長cDNAの一部)を増幅させる。増幅された配列は、任意の適切なベクター(例えば、発現ベクター、ミニ遺伝子ベクター、またはファージディスプレイベクター)に容易にクローニングされ得る。いくつかの実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合性断片の核酸配列は、任意の適切なベクター(例えば、発現ベクター、ミニ遺伝子ベクター、またはファージディスプレイベクター)に容易にクローニングされ得る。クローニングは、標準的な技術(例えば、参照により本明細書に組み込まれるSambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Pressを参照されたい)を使用して実行する。目的の免疫グロブリンポリペプチドの一部の配列を決定することが可能である限りは、使用されるクローニングの具体的な方法は重要ではないことが理解されるだろう。
[00467]所望の抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸配列をクローニングして単離するために使用されるRNAの供給源の1つは、この抗体を産生するB細胞を不死化細胞に融合させることにより生成されるハイブリドーマである。ハイブリドーマを使用する利点は、このハイブリドーマを容易にスクリーニングして、目的の抗体を産生するハイブリドーマを容易に選択し得ることである。或いは、RNAは、対象(例えば、ヒトまたは他の適切な動物)の末梢血、または好ましくは脾臓もしくはリンパ節、または全脾臓からの抗体産生細胞(例えばB細胞)から単離され得る。いくつかの実施形態では、このヒトまたは適切な動物は、標的抗原(例えば、表9および表10の抗原)に対して免疫化されている。組換え抗原またはその断片を使用してマウスを免疫化し、本開示の抗体を産生するハイブリドーマを生成し得る。いくつかの実施形態では、抗体または本開示を生成するハイブリドーマが本明細書で提供される。抗原として、抗原性ポリペプチド、融合タンパク質、またはそれらのバリアントが挙げられ得る。ポリペプチドの性質(即ち、疎水性の割合、親水性の割合、安定性、正味電荷、等電点など)に応じて、この抗原を、免疫化される哺乳動物において免疫原性であることが既知のタンパク質にコンジュゲートすることが有用であり得る。本開示に関連して、この対象は、がんに罹患している対象であり得る。
[00468]がん関連抗体のインシリコで再構築された核酸配列およびアミノ酸配列に基づいて、がん関連抗体またはその抗原結合性断片をコードする単離された核酸分子は、公知の方法(例えば、Ausubel他、上記参照、WO1999014318A1を参照されたい)による直接化学合成によっても調製され得る。化学合成により、一般的には、一本鎖オリゴヌクレオチドが生成され、この一本鎖オリゴヌクレオチドを、相補配列とのハイブリダイゼーションによるか、またはこの一本鎖を鋳型として使用するDNAポリメラーゼによる重合により、dsDNAにし得る。当業者は、DNAの化学合成は約100個以上の塩基の配列に限定され得、より長い配列は、より短い配列のライゲーションに得られる場合があることを認識するだろう。
[00469]いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、抗体の重鎖ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号113〜126から選択される。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、抗体の軽鎖ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号127〜140から選択される。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、可変重鎖のCDR1ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、可変重鎖のCDR2ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、単離された核分子は、可変重鎖のCDR3ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、可変重鎖のCD1ポリペプチド(CDR−H1)をコードする核酸配列は、配列番号197〜210から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、可変重鎖のCD2ポリペプチド(CDR−H2)をコードする核酸配列は、配列番号169〜182から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、可変重鎖のCD3ポリペプチド(CDR−H3)をコードする核酸配列は、配列番号141〜154から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、可変軽鎖のCDR1ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、可変軽鎖のCDR2ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、可変軽鎖のCDR3ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、可変軽鎖ポリペプチドのCDR1領域(CDR−L1)をコードする核酸配列は、配列番号211〜224から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、可変軽鎖ポリペプチドのCDR2領域(CDR−L2)をコードする核酸配列は、配列番号183〜196から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、可変軽鎖ポリペプチドのCDR3領域(CDR−L3)をコードする核酸配列は、配列番号155〜168から選択される配列を含む。
[00470]「核酸分子」、「核酸」、および「ポリヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され得、ヌクレオチドのポリマーを指す。そのようなヌクレオチドのポリマーは、天然のおよび/または非天然のヌクレオチドを含有し得、DNA、RAN、およびPNAが挙げられるが、これらに限定されない。「核酸配列」は、ヌクレオチドの線状配列を指す。
[00471]本明細書で使用される場合、「単離された」核酸分子または「単離された」核酸配列は、(1)核酸の天然供給源において通常会合している少なくとも1種の夾雑核酸分子から同定されて分離されているか、または(2)クローン化され、増幅され、標識化され、もしくはそうでなければ、目的の核酸の配列が決定され得るようにバックグラウンド核酸から別の方法で区別されている核酸分子であり、単離されているとみなされる。単離された核酸分子は、自然界で見出される形態または設定以外で存在する。従って、単離された核酸分子は、天然細胞中に存在する核酸分子と区別される。しかしながら、単離された核酸分子には、抗体を通常発現する細胞に含有される核酸分子であって、例えば、この細胞では、この核酸分子が天然細胞とは異なる染色体上の位置に存在する、核酸分子が含まれる。「単離された核酸」は、本明細書で使用される場合、天然配列を天然に伴う他のゲノムDNA配列およびタンパク質または複合体(例えば、リボソームおよびポリメラーゼ)から実質的に分離されている核酸である。この用語は、その天然に存在する環境から取り出されている核酸配列を包含し、組換えDNA単離物またはクローン化DNA単離物、および化学的に合成された類似体、または異種システムにより生物学的に合成された類似体を含む。実質的に純粋な核酸は、この核酸の単離形態を含む。当然のことながら、これは、最初に単離された核酸を指し、人の手により、この単離された核酸に後に追加された遺伝子または配列を除外しない。「ポリペプチド」という用語は、その従来の意味で使用され、即ち、アミノ酸の配列として使用される。
[00472]本開示の抗体、一部、またはポリペプチドをコードする単離された核酸分子は、従来の技術(ライゲーションのための平滑末端または互い違いの(staggered−ended)末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じた粘着末端のフィルイン、望ましくない接合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および適切なリガーゼとのライゲーションを含む)に従って、ベクターDNA(例えば発現ベクター)と組み換えられ得る。そのような操作のための技術は、例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning, Lab. Manual (Cold Spring Harbor Lab. Press, NY, 1982および 1989)、およびAusubel, 1987, 1993により開示されており、抗体分子またはその抗原結合性領域をコードする核酸配列を構築するために使用され得る。従って、本開示は、本明細書に記載される単離された核酸を含むベクターまたは発現ベクターを提供する。一実施形態では、軽鎖をコードする核酸、および重鎖をコードする核酸は、先に概説の手順により別々に単離される。一実施形態では、軽鎖をコードする単離された核酸、および重鎖をコードする単離された核酸は、それぞれが適切なプロモータ下および翻訳制御下である限りにおいて、別々の発現プラスミドに挿入されてもよいし、同一のプラスミドに一緒に挿入されてもよい。
[00473]単離された核酸分子を発現ベクターに入れると、次いで、この発現ベクターを、他の手段では免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞(例えば、大腸菌(E.coli)細胞、サルCOS細胞、ヒト胎児性腎臓293細胞(例えば293E細胞)、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、または骨髄腫細胞)にトランスフェクトして、組換え宿主細胞中での抗体またはその抗原結合性断片の合成を得る。抗体の組換え産生は、当分野で周知である。多くのベクターが利用可能である。ベクターの成分として、一般的には下記のうちの1つまたは複数が挙げられるが、これらに限定されない:シグナル配列、複製起点、1種または複数の選択マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写集結配列。
[00474]単離された核酸分子は、ベクターDNA中において、発現制御配列に作動可能に連結されている。発現制御配列は、特定の宿主生物において、作動可能に連結されたコード配列の発現に必要はDNA配列を指す。原核生物に適した制御配列として、例えば、プロモーター、任意選択のオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている。「作動可能に連結された」または「転写制御」という用語は、制御配列と異種核酸配列との間の機能的連結であって、異種核酸配列の発現をもたらす機能的連結を指す。例えば、第1の核酸配列が第2の核酸配列との機能的関係に置かれている場合には、第1の核酸配列は、第2の核酸配列に作動可能に連結されている。例えば、プロモーターは、コード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、このコード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されたDNA配列は、互いに連続し得、例えば、2つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合には、同一のリーディングフレーム中に存在する。
[00475]核酸は、別の核酸配列との機能的関係に置かれている場合には、作動可能に連結れている。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合には、この配列に作動可能に連結されており、またはリボソーム結合部位は、転写を促進するように配置されている場合には、コード配列に作動可能に連結されている。一般的に、作動可能に連結されたは、連結されているDNA配列が連続していること、および/または連続しており、かつリーディングフェーズにあり得ることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続している必要がない。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合には、従来の慣行に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。
[00476]細胞、細胞系、および細胞培養物は、互換的に使用されることが多く、本明細書でのそのような名称は全て、子孫を含む。形質転換体および形質転換細胞は、移入の回数に関係なく、初代の対象の細胞、およびこの細胞に由来する培養物を含む。意図的なまたは偶発的な変異に起因して、全ての子孫はDNAの内容が正確に同一ではない可能性があることも理解される。最初に形質転換された細胞でスクリーニングされたのと同一の機能または生物活性を有する変異体子孫が含まれる。別々の名称が意図されている場合には、文脈から明らかになるだろう。代替実施形態では、適切なコード核酸配列は、目的の免疫グロブリンの既知のアミノ酸配列に基づいて、ユニバーサルコドン表に従って設計され得る。
[00477]コードDNAに適切なヌクレオチド変化を導入することによるか、またはペプチド合成により、所望の抗体のアミノ酸配列バリアントを調製し得る。そのようなバリアントとして、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および/またはこの残基への挿入、および/またはこの残基の置換が挙げられる。欠失、挿入、および置換を任意に組み合わせることにより、最終構築物に到達するが、但し、この最終構築物は、望ましい特性を有する。アミノ酸変化はまた、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはバリアント抗体の翻訳後のプロセスも変更し得、例えば、グリコシル化部位の数または位置を変化させる。
[00478]抗体のアミノ酸配列バリアントをコードする核酸分子は、様々な方法により調製する。これらの方法として、天然供給源からの単離(天然に存在するアミノ酸配列バリアントの場合)またはオリゴヌクレオチド媒介型(または部位特異的)変異誘発による調製、PCR変異誘発、および抗体の先に調製されたバリアントまたは非バリアントバージョンのカセット変異誘発が挙げられるが、これらに限定されない。
[00479]本開示はまた、宿主細胞により認識される調節制御配列に任意選択で作動可能に連結された、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合性断片をコードする単離された核酸分子、この核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびにこの核酸が発現されるようにこの宿主細胞を培養すること、および任意選択で、宿主細胞培養物または培養培地から抗体を回収することを含み得る、抗体の産生のための組換え技術も提供する。
[00480]抗体またはその抗原結合性断片の組換え産生のために、抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸分子を単離し、さらなるクローニング(DNAの増幅)または発現のために複製可能なベクターに挿入し得る。従って、単離された抗体またはその抗原結合性断片が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗体または本開示、またはその抗原結合性断片は、組換え抗体であり得る。「組換え抗体」という用語は、抗体のコード配列を含む発現ベクター(または場合により複数種の発現ベクター、典型的には2種の発現ベクター)をトランスフェクトされた細胞または細胞系から発現される抗体であって、前記コード配列が、この細胞とは自然界では関連していない、抗体を指す。一実施形態では、組換え抗体は、自然界に存在した場合に同一の配列を有する抗体のグリコシル化パターンと異なるグリコシル化パターンを有する。一実施形態では、組換え抗体は、ヒト宿主細胞ではない哺乳動物宿主細胞中で発現させる。特に、個々の哺乳動物宿主細胞は、特有のグリコシル化パターンを有する。
[00481]いくつかの実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合性断片は単離される。単離された抗体ポリペプチドまたは抗原結合性断片ポリペプチドに関して、「単離された」は、このポリペプチドが、このポリペプチドが産生された細胞(例えば宿主細胞)の成分の少なくとも一部から分離される場合を指す。ポリペプチドが発現後に宿主細胞から分泌される場合には、このポリペプチドを含有する上清を、産生した宿主細胞から物理的に分離することは、ポリペプチドを「単離する」と見なされる。「単離された」という用語は、他の細胞物質および/または化学物質を実質的に含まないタンパク質(例えば抗体)を指す。一実施形態では、単離された抗体は、同一種からの他のタンパク質を実質的に含まない。一実施形態では、単離された抗体は、異なる種からの細胞により発現され、且つこの異なる種からの他のタンパク質を実質的に含まない。タンパク質は、当分野で周知のタンパク質精製技術を使用して、単離により、自然界で関連する成分(または、抗体を産生するために使用される細胞発現系と関連する成分)を実質的に含まない状態にされ得る。
[00482]いくつかの実施形態では、本明細書で開示される抗体またはその抗原結合性断片は、無細胞系で産生される。非限定的な例示の無細胞系は、例えば、Sitaraman et al., Methods Mol. Biol.498: 229-44 (2009); Spirin, Trends Biotechnol.22: 538-45 (2004); Endo et al., Biotechnol. Adv.21: 695-713 (2003)に記載される。そのような目的のために、このポリペプチドをコードする核酸を、mRNAを生成するためにin vitroでの転写を可能にするように、および利用する特定の無細胞系(哺乳動物もしくは酵母無細胞翻訳系などの真核生物、または細菌無細胞翻訳系などの原核生物)でのこのmRNAの無細胞翻訳を可能にするように改変しなければならない。抗体ポリペプチドは、化学合成(例えば、Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.に記載される方法)によっても生成され得る。タンパク質への改変は、化学合成によっても生じさせ得る。いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合性断片は、合成である。本開示のポリペプチドは、タンパク質化学の分野で一般に知られているタンパク質の単離/精製方法により精製され得る。
[00483]ハイブリドーマ以外の供給源を使用して抗体を得る場合には、特異的な結合特性を有する免疫グロブリンまたは免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列に関してスクリーニングすることが望ましい場合がある。そのようなスクリーニングの1つの方法は、ファージディスプレイ技術の使用である。ファージディスプレイは、例えば、Dower et al., McCafferty et al., およびCaton and Koprowski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6450-6454 (1990)に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態では、ファージディスプレイ技術を使用して、免疫化されたトランスジェニックマウスからのcDNA(例えば全脾臓cDNA)を単離し、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、免疫グロブリンポリペプチドの一部(例えばCDR領域)をコードするcDNA配列を増幅させ、増幅された配列を、ファージベクターに挿入する。目的のペプチド(例えば、所望の結合特性を有する可変領域ペプチド)をコードするcDNAは、パニングなどの標準的な技術により同定される。次いで、増幅されたかまたはクローニングされた核酸の配列を決定する。典型的には、免疫グロブリンポリペプチドの全可変領域をコードする配列が決定されるが、可変領域の一部(例えばCDRコード部分)のみを配列決定することが適切な場合もある。典型的には、配列決定された部分は、少なくとも30個の塩基の長さであり、より多くの場合には、可変領域の長さの約3分の1以下または約2分の1以下をコードする塩基を配列決定する。
[00484]配列決定は、cDNAライブラリーから単離されたクローンで実行され得るか、またはPCRを使用する場合には、増幅された配列のサブクローニング後に実行され得るか、または増幅されたセグメントの直接PCR配列決定により実行され得る。配列決定は、標準的な技術を使用して実行される(例えば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press、およびSanger, F. et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467(参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい)。クローン化された核酸の配列と、ヒト免疫グロブリンの遺伝子およびcDNAの公開された配列とを比較することにより、当業者は、配列決定される領域に応じて、(i)ハイブリドーマ免疫グロブリンポリペプチド(重鎖のアイソタイプを含む)の生殖細胞系列セグメントの使用、ならびに(ii)重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列(N領域の付加および体細胞突然変異のプロセスにより得られる配列を含む)を容易に決定し得る。免疫グロブリン遺伝子配列の情報源の1つは、National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, Mdである。
宿主細胞の選択および形質転換
[00485]一態様では、本明細書に記載される単離された核酸分子を含む宿主細胞、または本明細書に記載される前記単離された核酸分子を含むベクターが本明細書で提供される。このベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る。本明細書でのベクター中のDNAのクローニングまたは発現に適した宿主細胞は、前述した原核生物、酵母、または高等真核生物の細胞である。この目的に適した原核生物として下記が挙げられる:真正細菌(例えば、グラム陰性生物またはグラム陽性生物)、例えば、腸内細菌科、例えば、エシェリキア属(Escherichia)、例えば、大腸菌、エンテロバクター属(Enterobacter)、エルウィニア属(Erwinia)、クレブシエラ属(Klebsiella)、プロテウス属(Proteus)、サルモネラ属(Salmonella)、例えば、サルモネラ・チフィリウム(Salmonella typhimurium)、セラチア属(Serratia)、例えば、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescans)、およびシゲラ属(Shigella)、ならびに桿菌、例えば、B.サブチリス(B.subtilis)、およびB.リケニホルミス(B.licheniformis)(例えば、1989年4月12に公開されたDD 266,710で開示されるB.リケニホルミス41P)、シュードモナス属(Pseudomonas)、例えば、P.エルギノーザ(P.aeruginosa)、およびストレプトマイセス属(Streptomyces)。好ましい大腸菌クローニング宿主の1つは、大腸菌294(ATCC 31,446)であるが、大腸菌B、大腸菌X1 776(ATCC 31,537)、および大腸菌W3110(ATCC 27,325)などの他の株も適している。これらの例は、限定的ではなく例示的である。
[00486]原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物は、抗体をコードするベクターの適切なクローニング宿主または発現宿主である。サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)(即ち、一般的なパン酵母)は、下等真核宿主微生物の中でも最も一般に使用されている。しかしながら、他の属、種、および株のメンバーが一般に利用可能であり、かつ本明細書で有用であり、このメンバーとして下記が挙げられる:シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe);クリベロミセス属(Kluyveromyces)宿主、例えば、K.ラクティス(K.lactis)、K.フラギリス(K.fragilis)(ATCC 12,424)、K.ブルガリクス(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、K.ウィッケラミイ(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.ワルティイ(K.waltii)(ATCC 56,500)、K.ドロソフィラルム(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、K.サーモトレランス(K.thermotolerans)、およびK.マルキシアナス(K.marxianus);ヤロウイア属(yarrowia)(EP 402,226);ピキア・パストリス(Pichia pastors)(EP 183,070);カンジダ属(Candida);トリコデルマ・リージア(Trichoderma reesia)(EP 244,234);アカパンカビ(Neurospora crassa);シュワニオミセス(Schwanniomyces)、例えば、シュワニオミセス・オクシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis);ならびに糸状菌、例えば、アカパンカビ属(Neurospora)、アオカビ属(Penicillium)、トリポクラディウム属(Tolypocladium)、およびアスペルギルス属(Aspergillus)宿主、例えば、A.ニデュランス(A.nidulans)、およびA.ニガ−(A.niger)。
[00487]グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎細胞の例として、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)(イモムシ)、ネッタイシマカ(Aedes aegypti)(カ)、ヒトスジシマカ(Aedes albopictus)(カ)、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)(ショウジョウバエ)、およびカイコ(Bombyx mori)などの宿主からの多数のバキュロウイルス株、およびバリアント、および対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。オートグラファ・カリホルニカ(Autographa californica)NPVのL−1バリアント、およびカイコNP\7のBm−5株などのトランスフェクション用の様々なウイルス株が公的に利用可能であり、そのようなウイルスは、本発明に従って本明細書のウイルスとして使用し得、特に、スポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションに使用され得る。
[00488]ワタ、コム(com)、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア属(petunia)、トマト、タバコ、アオウキクサ属(lemna)、および他の植物細胞の植物細胞培養物も、宿主として利用され得る。しかしながら、脊椎動物細胞への関心が最も高く、培養(組織培養)での脊椎動物細胞の増殖が日常的な手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞系の例は、CHOKl細胞(ATCC CCL61)、DXB−11、DG−44、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞/−DHFR(CHO、Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980));SV40で形質転換されたサル腎臓CV1系(COS−7、ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓系(懸濁培養での増殖に関してサブクローニングされた293または293細胞、[Graham et al., J. Gen Viral. 36: 59 (1977)];ベビーハムスター腎細胞(BHK、ATCC CCL 10);マウスセルトリ細胞(TM4、Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980));サル腎細胞(CVl ATCC CCL 70);アフリカミドリザル腎細胞(VER0−76、ATCC CRL−1587);ヒト子宮頸癌細胞(HELA、ATCC CCL 2);イヌ腎細胞(MDCK、ATCC CCL 34);バッファローラット肝細胞(BRL 3A、ATCC CRL 1442);ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL 75);ヒト肝細胞(Hep G2、HB 8065);マウス乳房腫瘍(MMT 060562、ATCC CCL51);TRI細胞(Mather et al., Annals N.Y Acad. Sci. 383: 44-68 (1982));MRC 5細胞;FS4細胞;およびヒト肝細胞腫系(Hep G2)を含む、チャイニーズハムスター卵巣細胞である。
[00489]宿主細胞を、前述した抗体産生用の発現ベクターまたはクローニングベクターで形質転換するかトランスフェクトし、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適したように改変された従来の栄養培地で培養する。加えて、選択マーカーにより分離された複数コピーの転写単位を有する新規のベクターおよびトランスフェクトされた細胞系は、本明細書に記載される抗体の発現に特に有用であり、かつ好ましい。
[00490]発現ベクターのトランスフェクション、および本明細書に記載されるキメラ抗体、ヒト化抗体、または複合ヒト抗体の産生の場合には、レシピエント細胞系は、骨髄腫細胞であり得る。骨髄腫細胞は、トランスフェクトされた免疫グロブリン核酸配列によりコードされる免疫グロブリンを合成し得、アセンブルし得、および分泌し得、免疫グロブリンのグリコシル化のメカニズムを有する。例えば、いくつかの実施形態では、このレシピエント細胞は、組換えIg産生骨髄腫細胞SP2/0(ATCC #CRL 8287)である。SP2/0は、トランスフェクト遺伝子によりコードされる免疫グロブリンのみを産生する。骨髄腫細胞は、培養でまたはマウスの腹腔中で増殖され得、分泌された免疫グロブリンを、腹水から得ることができる。他の適切なレシピエント細胞として、ヒト起源もしくは非ヒト起源のBリンパ球などのリンパ系細胞、ヒト起源もしくは非ヒト起源のハイブリドーマ細胞、または種間ヘテロハイブリドーマ細胞が挙げられる。本明細書に記載されるキメラの、ヒト化された、または複合のヒト抗体構築物または抗体ポリペプチドを有する発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、およびジエチルアミノエチル(DEAE)デキストランなどのポリカチオンによる適用などの生化学的手段、ならびに電気穿孔、直接マイクロインジェクション、およびマイクロプロジェクタイル照射(microprojectile bombardment)などの機械的手段を含む、様々な適切な手段のいずれかにより適切な宿主細胞に導入され得る。当業者に公知のJohnston et al., 240 Science 1538 (1988)。
[00491]酵母は、免疫グロブリンのH鎖およびL鎖の産生に関して、細菌と比べてある特定の利点をもたらす。酵母は、グリコシル化を含む翻訳後ペプチド修飾を実行する。酵母中での所望のタンパク質の産生に使用され得る強力なプロモーター配列および高コピー数プラスミドを利用するいくつかの組換えDNA戦略が存在する。酵母は、クローン化された哺乳動物遺伝子産物のリーダー配列を認識し、リーダー配列を持つペプチド(即ちプレペプチド)を分泌する。Hitzman et al., 11th Intl. Conf. Yeast, Genetics & Molec. Biol. (Montpelier, France, 1982)。酵母遺伝子発現系を、抗体ポリペプチドまたはその抗原結合性断片ペプチド、ならびにアセンブルされたキメラ抗体、ヒト化抗体、または複合ヒト抗体、その断片および領域の産生、分泌、および安定性のレベルについて日常的に評価し得る。グルコースに富む培地中で酵母が増殖した場合に大量に産生された解糖酵素をコードする活発に発現された遺伝子からのプロモーターおよび終結エレメントを組み込む一連の酵母遺伝子発現系のうちのいずれかを利用し得る。既知の解糖遺伝子も、非常に効率的な転写制御シグナルを提供し得る。例えば、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)遺伝子のプロモーターシグナルおよびターミネーターシグナルを利用し得る。酵母中でのクローニングされた免疫グロブリンcDNAの発現に最適な発現プラスミドを評価するために、いくつかのアプローチが採用され得る。
[00492]細菌株(大腸菌K12株、例えば大腸菌W3110(ATCC 27325)、バチルス属(Bacillus)の種、腸内細菌、例えば、サルモネラ・チフィリウムまたはセラチア・マルセセンス)も、本明細書に記載される抗体分子またはその断片の産生用の宿主として利用され得、様々なシュードモナス属の種を使用され得る。宿主細胞に適合する種に由来するレプリコン配列および制御配列を含有するプラスミドベクターを、これらの細菌宿主と共に使用する。このベクターは、複製部位、および形質転換された細胞中で表現型選択を行ない得る特定の遺伝子を有する。細菌中での、クローン化された免疫グロブリンcDNAまたはCDRによりコードされるキメラ抗体、ヒト化抗体、または複合ヒト化抗体、およびその断片の産生に関する発現プラスミドの評価に、いくつかのアプローチが採用され得る(Glover, 1985;Ausubel, 1987, 1993;Sambrook, 1989;Colligan, 1992-1996を参照されたい)。
[00493]宿主哺乳動物細胞は、in vitroまたはin vivoで増殖され得る。哺乳動物細胞は、免疫グロブリンタンパク質分子への翻訳後改修飾(リーダーペプチドの除去、H鎖およびL鎖のフォールディングおよびアセンブリー、抗体分子のグリコシル化、ならびに機能性抗体タンパク質の分泌を含む)を提供する。抗体タンパク質の産生用の宿主として有用であり得る哺乳動物細胞として、上記のリンパ系起源の細胞に加えて、線維芽細胞起源の細胞、例えば、Vero細胞(ATCC CRL 81)またはCHO−K1(ATCC CRL 61)細胞が挙げられる。ポリペプチドを発現するために使用され得る例示的な真核生物細胞として、COS細胞、例えばCOS7細胞;293細胞、例えば293−E細胞;CHO細胞、例えばCHO−S細胞およびDG44細胞;PER.C6.RTM.細胞(Crucell);ならびにNSO細胞が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、可変重鎖および/または可変軽鎖に所望の翻訳後改修飾を行なう能力に基づいて、特定の真核生物宿主細胞が選択される。例えば、いくつかの実施形態では、CHO細胞は、293細胞中で産生された同一のポリペプチドより高レベルのシアル化を有するポリペプチドを産生する。
[00494]いくつかの実施形態では、本明細書で開示される抗体またはその抗原結合性断片のポリペプチドは、任意の適切な方法に従って、このポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸分子で操作されているかまたはトランスフェクトされている動物中において、in vivoで産生され得る。
[00495]いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、無細胞系で産生される。非限定な例示の無細胞系は、例えば、Sitaraman et al., Methods Mol. Biol. 498: 229-44 (2009);Spirin, Trends Biotechnol. 22: 538-45 (2004);Endo et al., Biotechnol. Adv. 21: 695-713 (2003)に記載される。
[00496]哺乳動物細胞中でのH鎖核酸配列およびL鎖核酸配列の発現に、多くのベクター系が利用可能である(Glover, 1985を参照されたい)。完全なH2L2抗体を得るために、異なるアプローチが後に続き得る。上記で論じたように、同一の細胞中でH鎖およびL鎖を共発現させて、H鎖およびL鎖の細胞内での会合ならびに完全な4量体H2L2抗体および/または抗原結合性断片ペプチドへの連結を達成することが可能である。この共発現は、同一の宿物中で同一のまたは異なるプラスミドを使用することにより起こり得る。H鎖およびL鎖ならびに/またはCD3領域のペプチドの遺伝子を、同一のプラスミドに配置し得、次いで、このプラスミドを細胞にトランスフェクトさせ、それにより、両鎖を発現する細胞が直接選択される。或いは、細胞にまず、1本の鎖(例えばL鎖)をコードするプラスミドをトランスフェクトし、続いて、得られた細胞系を、第2の選択可能なマーカーを含有するH鎖プラスミドをトランスフェクトし得る。抗原結合ペプチド断片および/またはH2L2分子を産生する細胞系に、いずれかの経路を介して、追加の選択可能なマーカーと共にペプチド、H鎖、L鎖、またはH+L鎖の追加のコピーをコードするプラスミドをトランスフェクトして、特性が増強された細胞系が生成される可能性がある(例えば、アセンブルされたH2L2抗体分子のより高い産生、またはトランスフェクトされた細胞系の安定性の増強)。
[00497]加えて、植物は、微生物および動物細胞の大規模培養に基づく組換え抗体産生の主要な発現系に代わり、便利であり、安全であり、かつ経済的であるとして現れている。抗体は、植物の細胞培養物中でまたは従来の方法で成長した植物中で発現され得る。植物中での発現は、全身性であってもよいし、細胞内色素体に限定されてもよいし、種子(胚乳)に限定されてもよい。いくつかの植物由来抗体が、開発の進んだ段階に達している(例えば、Biolex,NCを参照されたい)。
[00498]いくつかの態様では、このヒト化抗体は、このヒト化抗体の軽鎖をコードする第1の発現ベクターで形質転換され、このヒト化抗体の重鎖をコードする第2の発現ベクターで形質転換された宿主を、各鎖が発現されるような条件下で維持すること、およびそのように発現された鎖のアセンブリーにより形成されたヒト化抗体を単離することを含むプロセスにより調製されるヒト化抗体の産生のための方法およびシステムが本明細書で提供される。第1の発現ベクターおよび第2の発現ベクターは、同一のベクターであり得る。ヒト化抗体の軽鎖または重鎖をコードするDNA配列、前記DNA配列が組み込まれている発現ベクター、および前記発現ベクターで形質転換された宿主も本明細書で提供される。本明細書で提供される配列および情報からヒト化抗体を生成することは、過度に実験することなく当業者に実施され得る。一アプローチでは、モノクローナル抗体をヒト化するために、4つの全体的な工程が用いられる。これらは、(1)出発抗体の軽可変ドメインおよび重可変ドメインのヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配列を決定する工程;(2)ヒト化抗体を設計する工程、即ち、ヒト化プロセスの最中にどの抗体フレームワーク領域を使用するかを決定する工程;(3)実際のヒト化方法論/技術;ならびに(4)ヒト化抗体のトランスフェクションおよび発現である。
精製
[00499]「単離された」という用語は、天然状態から変更されたかまたは取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物中に天然に存在する核酸またはポリペプチド(例えば、本明細書で開示される抗体またはその抗原結合性断片)は、「単離され」てはいないが、この核酸またはポリペプチドの天然状態の共存する物質から部分的にまたは完全に分離された同一の核酸またはポリペプチドは「単離され」ている。単離された核酸分子またはポリペプチドは、実質的に純粋な形態で存在し得るか、または例えば宿主細胞などの非天然環境中で存在し得る。単離されたポリペプチドは、このポリペプチドの天然環境の成分から分離されているおよび/または回収されているポリペプチドである。天然環境の夾雑物成分は、ポリペプチドの診断または治療での使用を妨げるであろう物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性の成分を含み得る。いくつかの実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、適切な方法により精製され得る。好ましい実施形態では、ポリペプチドは(1)Lowry法で決定されたポリペプチドの95重量%超まで、最も好ましくは99重量%超まで精製されるか、(2)スピニングカップ配列決定装置の使用により、N末端もしくは内部のアミノ酸配列の少なくとも15個の残基を得るのに十分な程度まで精製されるか、または(3)還元条件下もしくは非還元条件下でのおよびクーマシーブルー(好ましくは銀染色)を使用するSDS−PAGEにより示される均一性まで精製される。単離された抗体として、ポリペプチドの天然環境の少なくとも1つの成分が存在しないであろうことから組換え細胞内のin situのポリペプチドが挙げられる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは、少なくとも1回の精製工程により調製されるだろう。一態様では、本明細書で開示されるのは、本明細書で提供される精製された抗体または抗原結合性断片である。
[00500]発現されると、本発明の全抗体、それらの二量体、個々の軽鎖および重鎖、または他の免疫グロブリン形態は、既知の技術(例えば、免疫吸着または免疫親和性クロマトグラフィー、クロマトグラフィー法、例えばHPLC(高速液体クロマトグラフィー)、硫酸アンモニウム沈殿、ゲル電気泳動、またはこれらの任意の組み合わせ)により回収され精製され得る。Scopes, PROTEIN PURIF. (Springer-Verlag, NY, 1982)を全体的に参照されたい。少なくとも約90%〜95%の均一性の実質的に純粋の免疫グロブリン(98%〜99%またはより高い均一性を有する免疫グロブリンである)が、特に医薬品用途に有利である。組換え技術を使用する場合には、抗体は、細胞内で産生され得るか、細胞膜周辺腔中で産生され得るか、または微生物培養からの場合を含めて、培地に直接分泌され得る。抗体が細胞内で産生される場合には、最初の工程として、粒子デブリ(宿主細胞または溶解した断片のいずれか)を、例えば遠心分離または限外濾過により除去する。Better et al. Science 240: 1041-1043 (1988); ICSU Short Reports 10: 105 (1990);およびProc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 457-461 (1993)は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離する手順を説明する([Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)]も参照されたい)。
[00501]微生物細胞または哺乳動物細胞から単離された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーカチオンまたはトリ交換クロマトグラフィー(avian exchange chromatography)、および親和性クロマトグラフィーを使用して精製され得、親和性クロマトグラフィーが好ましい精製技術である。親和性リガンドとしてのプロテインAの適合性は、種、および抗体に存在する任意の免疫グロブリンFeドメインのアイソタイプに依存する。プロテインAを使用して、ヒトy1、y2、またはy4重鎖に基づく抗体を精製し得る(Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983))。プロテインGは、全てのマウスアイソタイプおよびヒトy3に推奨されている(Guss et al., EMBO J. 5: 15671575 (1986))。親和性リガンドが付着するマトリックスは、最も多くはアガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。細孔が制御されたガラスまたはポリ(スチレンジビニル)ベンゼンなどの機械的に安定したマトリックスは、アガロースにより達成され得るより速い流速および短い処理時間を可能にする。抗体がCH3ドメインを含む場合には、精製にはBakerbond ABX(商標)樹脂(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)が有用である。タンパク質精製のための他の技術(例えば、イオン交換カラムによる分画、エタノール沈殿、逆相HPLC、シリカによるクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂(例えばポリアスパラギン酸カラム)によるヘパリンSEPHAROSE(商標)クロマトグラフィーによるクロマトグラフィー、等電点電気泳動、SDS−PAGE、および硫酸アンモニウム沈殿)も、回収する抗体に応じて利用可能である。必要に応じて部分的にまたは均一に精製した後、ヒト化抗体または複合ヒト抗体を治療に使用し得るか、またはアッセイ手順、免疫グロブリン染色、および同類ものの開発および実施で使用し得る。Vols. I & II Immunol. Meth. (Lefkovits & Pernis, eds., Acad. Press, NY, 1979および 1981)を全体的に参照されたい。
[00502]本明細書で開示される抗体または抗原結合性断片の機能的活性。そのような機能的活性として、生物活性、およびがん細胞抗原に結合する能力が挙げられる。加えて、機能的活性を有するポリペプチドは、このポリペプチドが、用量依存性の有無にかかわらず、例えば生物学的アッセイなどの特定のアッセイで測定した場合に、本明細書に記載される抗体(成熟形態を含む)の活性と類似しているが必ずしも同一ではない活性を示すことを意味する。用量依存性が存在する場合には、この用量依存性は、本開示の抗体のものと同一である必要はなく、むしろ、本明細書に記載される抗体と比較した場合に、所与の活性における用量依存性と実質的に類似している(即ち、候補ポリペプチドは、本明細書に記載される抗体と比較してより高い活性を示すか、または約25分の1、約10分の1、もしくは約3分の1の活性を示すだろう)。
ライブラリー誘導
[00503]本開示の抗体またはその抗原結合性断片を、所望の活性(1または複数)を有する抗体に関するコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより単離し得る(例えば、Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178:1-37 (2001);McCafferty et al., Nature 348:552-554;Clackson et al.,Nature 352: 624-628 (1991);Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992);Marks and Bradbury, Methods in Molecular Biology 248:161-175 (2003);Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004);Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004);Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004);およびLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)を参照されたい)。VH遺伝子およびVL遺伝子のレパートリーを、(例えばPCRにより)別々にクローニングし得、ライブラリー(例えばファージライブラリー)中で無作為に再結合させ得、かつスクリーニングし得る(例えば、Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)を参照されたい)。あるいは、ナイーブなレパートリーを、(例えばヒトから)クローニングして、いかなる免疫化も行なうことなく、広範囲な非自己抗原および自己抗原に対する抗体の単一供給源を提供し得る(例えば、Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)を参照されたい)。あるいは、ランダムプライマーを使用して、幹細胞からのCDR3領域をコードする未再構成V遺伝子セグメントをクローニングするか、またはin vitroでV遺伝子セグメントを再構成することにより、ナイーブライブラリーを合成し得る(例えば、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)を参照されたい)。ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片は、本明細書ではヒト抗体またはヒト抗体断片とみなされる。
抗体をコードする核酸分子
[00504]本明細書で提供される情報(例えば、がん関連抗体の再構築された核酸配列およびアミノ酸配列)を使用して、抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸分子を得ることができる。そのような核酸分子を、例えば、当分野で開示される従来の方法を使用して得ることができる。本開示の核酸分子は、RNAの形態(例えば、mRNA、hnRNA、tRNA、または任意の他の形態)、またはDNAの形態(限定されないが、クローニングにより得られたかもしくは合成により生成されたcDNAおよびゲノムDNAを含む)、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。DNAは、三本鎖、二本鎖、もしくは一本鎖、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。DNAまたはRNAの少なくとも1本の鎖の任意の部分は、センス鎖としても既知であるコード鎖であってもよいし、アンチセンス鎖としても既知であるアンチセンス鎖であり得る。
[00505]「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」は、本明細書で互換的に使用される場合、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、DNAおよびRNAを含む。このヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、改変されたヌクレオチドもしくは塩基、および/またはこれらのアナログ、またはDNAポリメラーゼもしくはRNAポリメラーゼによりポリマーに組み込まれ得る任意の基質であり得る。核酸分子は、改変されたヌクレオチド(例えば、メチル化ヌクレオチドおよびそのアナログ)を含み得る。存在する場合には、ヌクレオチド構造に対する改変は、ポリマーのアセンブリーの前後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断され得る。ポリヌクレオチドは、例えば標識成分とのコンジュゲーションにより、重合後にさらに改変され得る。他のタイプの改変として、例えば下記が挙げられる:「キャップ」、アナログによる天然に存在するヌクレオチドの1つまたは複数の置換、ヌクレオチド間改変、例えば、非荷電連結を有するもの(例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど)、および荷電連結を有するもの(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど)、ペンダント部分を含有するもの、例えばタンパク質(例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ply−L−リジンなど)、インターカレーターを有するもの(例えば、アクリジン、ソラレンなど)、キレート剤を含有するもの(例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など)、アルキル化剤を含有すもの、改変連結を有するもの(例えば、アルファアノマー核酸など)、ならびにポリヌクレオチドの非改変形態。さらに、糖中に通常存在するヒドロキシル基のうちのいずれかは、例えば、ホスホン酸基、リン酸基に置き換えられてもよいし、標準的な保護基により保護されてもよいし、活性化されて追加のヌクレオチドへの追加の連結が作られてもよいし、固体支持体にコンジュゲートされてもよい。5’末端および3’末端のOHは、リン酸化され得るか、またはアミンもしくは1〜20個の炭素原子の有機キャッピング基部分に置換され得る。他のヒドロキシルも、標準的な保護基に誘導体化され得る。ポリヌクレオチドはまた、当分野で一般に既知であるリボース糖またはデオキシリボース糖の類似形態も含み得、この類似形態として例えば下記が挙げられる:2’−O−メチル−、2’−O−アリル、2’−フルオロ−または2’−アジド−リボース、炭素環式糖アナログ、α−アノマー糖、エピマー糖、例えば、アラビノース、キシロース、またはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログ、および脱塩基ヌクレオシドアナログ、例えばメチルリボシド。1つまたは複数のホスホジエステル連結を、代替の連結基に置き換え得る。この代替連結基として下記が挙げられるが、これらに限定されない:リン酸塩がP(O)S(「チオエート」)、P(S)S(「ジチオエート」)、「(O)NR2(「アミデート」)、P(O)R、P(O)OR’、CO、またはCH2(「ホルムアセタール」)に置き換えられており、各RまたはR’は、独立して、H、または置換されいているかもしくは非置換のアルキル(1〜20個のC)であり、アルキルがエーテル(−O−)連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、またはアラルジルを任意選択で含む実施形態。ポリヌクレオチド中の全ての連結が同一である必要はない。前述の説明は、本明細書で言及される全てのポリヌクレオチド(例えば、単離された核酸、RNA、およびDNA)に当てはまる。
[00506]本発明の文脈では、通常存在する核酸塩基の下記の略語が使用される。「A」は、アデノシンを指し、「C」は、シトシンを指し、「G」はグアノシンを指し、「T」は、チミジンを指し、「U」は、ウリジンを指す。いくつかの実施形態では、核酸分子は、単離された核酸を含む。
[00507]核酸は、全細胞に、細胞溶解物に、または部分的に精製されたかもしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸分子は、標準的な技術(限定されないが、アルカリ/SDS処理、CsClバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当分野で周知の他のものを含む)により、他の細胞成分または他の夾雑物(例えば、他の細胞核酸または細胞タンパク質)から精製された場合には、「単離された」かまたは「実質的に純粋になっている」。F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New Yorkを参照されたい。本開示の少なくともいくつかの実施形態に係る核酸は、例えば、DNAまたはRNAであり得、かつイントロン配列を含んでもよいし含まなくてもよい。好ましい実施形態では、核酸は、cDNA分子である。
[00508]本開示の別の態様は、本明細書に記載される抗体ポリペプチドまたはその抗原結合性断片をコードする再構築されたコンセンサス核酸配列を含む核酸分子に関連する。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、抗体の重鎖ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号113〜126から選択される。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、抗体の軽鎖ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号127〜140から選択される。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、可変重鎖のCDR1ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、可変重鎖のCDR2ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、単離された核分子は、可変重鎖のCDR3ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、可変重鎖のCDR1ポリペプチド(CDR−H1)をコードする核酸配列は、配列番号197〜210から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、可変重鎖のCDR2ポリペプチド(CDR−H2)をコードする核酸配列は、配列番号169〜182から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、可変重鎖のCDR3ポリペプチド(CDR−H3)をコードする核酸配列は、配列番号141〜154から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、可変軽鎖のCDR1ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、可変軽鎖のCDR2ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、可変軽鎖のCDR3ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、可変軽鎖ポリペプチドのCDR1領域(CDR−L1)をコードする核酸配列は、配列番号211〜224から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、可変軽鎖ポリペプチドのCDR2領域(CDR−L2)をコードする核酸配列は、配列番号183〜196から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、可変軽鎖ポリペプチドのCDR3領域(CDR−L3)をコードする核酸配列は、配列番号155〜168から選択される配列を含む。
[00509]本開示の少なくともいくつかの実施形態に係る核酸分子は、標準的な分子生物学技術を使用して得ることができる。ハイブリドーマ(例えば、下記でさらに説明するようにヒト免疫グロブリン遺伝子を担持するトランスジェニックマウスから調製されたハイブリドーマ)により発現された抗体の場合、このハイブリドーマにより作製された抗体の軽鎖および重鎖をコードするcDNAを、標準的なPCR増幅技術またはcDNAクローニング技術により得ることができる。(例えば、ファージディスプレイ技術を使用して)免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから得られた抗体の場合には、この抗体をコードする核酸を、このライブラリーから回収し得る。
[00510]VHセグメントおよびVLセグメントをコードするDNA断片が得られると、これらのDNA断片を、標準的な組換えDNA技術によりさらに操作して、例えば、可変領域遺伝子を、全長抗体鎖遺伝子へ、Fab断片遺伝子へ、またはscFv遺伝子へ変換し得る。この操作では、VLまたはVHをコードするDNA断片は、別のタンパク質(例えば、抗体定常領域または柔軟なリンカー)をコードする別のDNA断片に作動可能に連結される。「作動可能に連結した」という用語は、この文脈で使用される場合、2つのDNA断片が、これら2つのDNA断片によりコードされるアミノ酸配列がインフレームのままでるように連結されることを意味するように意図されている。VH領域をコードする単離されたDNAを、このVHをコードするDNAを、重鎖定常領域(CH1、CH2、およびCH3)をコードする別のDNA分子に作動可能に連結することにより、全長重鎖遺伝子へと変換し得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当分野で公知であり(例えば、Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照されたい)、これらの領域を包含するDNA断片は、標準的なPCR増幅により得ることができる。重鎖定常領域は、IgG1定常領域、IgG2定常領域、IgG3定常領域、IgG4定常領域、IgA定常領域、IgE定常領域、IgM定常領域、またはIgD定常領域であり得るが、最も好ましくは、IgG1定常領域またはIgG4定常領域である。Fab断片重鎖遺伝子の場合には、VHをコードするDNAは、重鎖CH1定常領域のみをコードする別のDNA分子に作動可能に連結され得る。
[00511]VL領域をコードする単離されたDNAは、このVLをコードするDNAを、軽鎖定常領域(CL)をコードする別のDNA分子に作動可能に連結させることにより、全長軽鎖遺伝子(およびFab軽鎖遺伝子)へと変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当分野で公知であり(例えば、Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照されたい)、これらの領域を包含するDNA断片は、標準的なPCR増幅により得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパ定常領域またはラムダ定常領域であり得るが、最も好ましくは、カッパ定常領域である。
[00512]scFv遺伝子を作るために、VHをコードするDNA断片およびVLをコードするDNA断片を、VH配列およびVL配列が、VL領域およびVH領域が柔軟なリンカーで連結されている連続した一本鎖タンパク質として発現され得るように、柔軟なリンカーをコードする(例えば、アミノ酸配列(Gly−4−Ser)3をコードする)別の断片に作動可能に連結させる(例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554を参照されたい)。
[00513]本開示から単離された核酸分子として、任意選択で1つまたは複数のイントロンと共にオープンリーディングフレーム(ORF)を含む核酸分子が挙げられ得るが、例えば、限定されないが、少なくとも1本の軽鎖(例えば配列番号127〜140)または少なくとも1本の重鎖(例えば配列番号113〜126)の少なくともCDR(CDR1、CDR2、および/またはCDR3として)の少なくとも1つの特定の部分;本明細書で開示されるがん関連抗体または可変領域(例えば、軽鎖(配列番号127〜140)の可変領域および重鎖(配列番号113〜126)の可変領域)のコード配列を含む核酸分子;ならびに上述されたものとは実質的に異なるヌクレオチド配列を含むが、遺伝暗号の縮重に起因して、本明細書に記載されるおよび/または当分野で公知である抗体またはその抗原結合性断片を依然として少なくともコードする核酸分子が挙げられ得る。当然のことながら、遺伝暗号は、当分野で周知である。従って、当業者にとっては、本開示の特定の抗体をコードするそのような縮重核酸バリアントを生成することは日常的であるだろう。例えば、Ausubel他、上記参照を参照されたい。そのような核酸バリアントは、本発明に含まれる。
[00514]抗体の1本または複数の鎖をコードする核酸配列を含む核酸分子が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、核酸分子は、抗体の重鎖または軽鎖をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、抗体の重鎖をコードする核酸配列と、抗体の軽鎖をコードする核酸配列子との両方を含む。いくつかの実施形態では、第1の核酸分子は、重鎖をコードする第1の核酸配列を含み、第2の核酸分子は、軽鎖をコードする第2の核酸配列を含む。
[00515]いくつかの実施形態では、重鎖および軽鎖は、1つの核酸分子から発現されるか、または2つの別々のポリペプチドとして2つの別々の核酸分子から発現される。いくつかの実施形態では、例えば、抗体がscFvである場合には、単一の核酸配列が、一緒に連結された重鎖および軽鎖の両方を含む単一のポリペプチドをコードする。
[00516]いくつかの実施形態では、本明細書で開示される抗体の重鎖または軽鎖をコードする核酸配列は、本明細書で提供されるCDRのうちの少なくとも1つをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される抗体の重鎖または軽鎖をコードする核酸配列は、本明細書で提供されるCDRのうちの少なくとも3つをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体の重鎖または軽鎖をコードする核酸配列は、本明細書で提供されるCDRのうちの少なくとも6つをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体の重鎖または軽鎖をコードする核酸配列は、翻訳された場合にはこの重鎖または軽鎖のN末端に位置するリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含む。このリーダー配列は、天然の重鎖リーダー配列または軽鎖リーダー配列であってもよいし、別の異種リーダー配列であってもよい。「リーダー配列」という用語は、哺乳動物細胞からのポリペプチドの分泌を促進する、ポリペプチドのN末端に位置するアミノ酸残基の配列を指す。リーダー配列は、このポリペプチドの哺乳動物細胞からの排出時に切断され得、成熟タンパク質が形成される。リーダー配列は、天然または合成であり得、付着するタンパク質に対して異種または同種であり得る。
[00517]いくつかの実施形態では、核酸分子は、本明細書の表1〜2中の抗体のアミノ酸配列のうちのいずれかをコードするものである。いくつかの実施形態では、核酸配列は、本明細書の表1〜2中の抗体のアミノ酸配列のうちのいずれかをコードする核酸と少なくとも80%同一(例えば、少なくとも80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99%同一)のものである。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書で提供される核酸配列のうちのいずれか1つまたは複数にハイブリダイズするものである。実施形態のうちのいくつかでは、ハイブリダイゼーションは、中程度の条件下である。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションは、高度にストリンジェントな条件(例えば、65℃で少なくとも約6×SSCおよび1%SDS、0.1×SSC中の約20%(v/v)のホルムアミドによる約42℃での10分にわたる最初の洗浄、ならびに65℃での0.2×SSCおよび0.1%SDSによるその後の洗浄)下である
[00518]核酸分子は、当分野で従来の組換えDNA技術を使用して構築され得る。いくつかの実施形態では、核酸分子を、選択された宿主細胞中での発現に適した発現ベクター中に配置される。
[00519]本明細書の抗体または抗原結合性断片をコードする核酸分子を含むベクターが提供される。重鎖および/または軽鎖をコードする核酸分子を含むベクターも提供される。そのようなベクターとして、DNAベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、軽鎖をコードする核酸および重鎖をコードする核酸は、上記で概説した手順により別々に単離される。一実施形態では、軽鎖をコードする単離された核酸、および重鎖をコードする単離された核酸は、別々の発現プラスミドに挿入されてもよいし、それぞれが適切なプロモーターおよび翻訳制御下にある限りにおいて同一のプラスミドに一緒に挿入されてもよい。いくつかの実施形態では、重鎖および軽鎖は、例えば抗体がscFVなどである場合に、単一のポリペプチドの一部として発現される。
[00520]いくつかの実施形態では、第1のベクターは、重鎖をコードする核酸分子を含み、第2のベクターは、軽鎖をコードする核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、第1のベクターおよび第2のベクターは、同様の量(例えば、同様のモル量または同様の質量)で宿主細胞にトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、第1のベクターおよび第2のベクターの5:1〜1:5の間のモル比または質量比を、宿主細胞にトランスフェクトする。いくつかの実施形態では、重鎖をコードするベクターおよび軽鎖をコードするベクターの1:1〜1:5の間の質量比を使用する。いくつかの実施形態では、重鎖をコードするベクターおよび軽鎖をコードするベクターの1:2の質量比を使用する。いくつかの実施形態では、CHOもしくはCHO由来細胞中でのまたはNSO細胞中でのポリペプチドの発現に最適化されたベクターが選択される。そのようなベクターの例が、例えばRunning Deer et al., Biotechnol. Prog.20:880-889 (2004)に記載される。
[00521]一態様では、本開示は、がんの治療または予防の方法であって、核酸分子を投与する工程を含み、この核酸分子が、VH、VL、VHのCDR3領域、もしくはVLのCDR3領域、またはこれらの抗原結合性断片をコードし、遺伝子治療として本明細書(例えば表3または表4)で開示される配列を含む、方法を提供する。遺伝子治療は、発現されたかまたは発現可能な核酸の対象への投与により実施される治療を指す。本発明のこの実施形態では、核酸は、予防効果または治療効果を媒介する、この核酸によりコードされたタンパク質を生じる。当分野で利用可能な遺伝子治療の方法のうちのいずれかを、本明細書の実施形態に従って使用し得る。
[00522]遺伝子治療方法の一般的な概説に関して、Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505;Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95;Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596;Mulligan, 1993, Science 260:926-932;およびMorgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIBTECH 11(5):155-215を参照されたい。使用され得る組換えDNA技術の当分野で一般に既知の方法が、Ausubel et al. (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY;およびKriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NYに記載される。治療用抗体の適切な細胞への送達は、当分野で公知の任意の適切なアプローチの使用による(物理的なDNA移入方法(例えば、リポソームもしくは化学処理)の使用によるか、またはウイルスベクター(例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはレトロウイルス)の使用による場合を含む)ex vivo、in situ、またはin vivoでの遺伝子治療により引き起こされ得る。例えば、in vivoでの治療の場合には、所望の抗体をコードする核酸は、単独で、またはベクター、リボソーム、もしくは沈殿物と組み合わせて、対象に直接注射してもよく、いくつかの実施形態では、抗体化合物の発現が望まれる部位に注射してもよい。ex vivoでの処置の場合には、対象の細胞を取り出し、この細胞に核酸を導入し、改変された細胞を、対象に直接戻すか、または、例えば、患者に移植される多孔質膜内に封入する。例えば、米国特許第4,892,538号および同第5,283,187号を参照されたい。生存細胞に核酸を導入するのに利用可能な様々な技術が存在する。この技術は、核酸を、in vitroで培養細胞に移入するかまたは意図された宿主の細胞中でin vivoで移入するかに応じて変わる。in vitroでの哺乳動物細胞への核酸の移入に適した技術として、リポソーム、電気穿孔、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAE−デキストラン、およびリン酸カルシウム沈殿の使用が挙げられる。核酸のex vivoでの送達に一般に使用されるベクターは、レトロウイルスである。
[00523]「宿主細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、核酸分子をトランスフェクトされる特定の対象細胞、およびそのような細胞の後代または潜在的な後代を指す。そのような細胞の後代は、後続の世代で起こり得る突然変異もしくは環境の影響または核酸分子の宿主細胞ゲノムへの組み込みに起因して、核酸分子をトランスフェクトされた親細胞と同一ではない場合がある。
[00524]他のin vivoでの核酸移入技術として、ウイルスベクター(例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスI型ウイルス、またはアデノ随伴ウイルス)によるトランスフェクション、および脂質ベースのシステムが挙げられる。核酸およびトランスフェクション剤は、微粒子と任意選択で会合する。例示的なトランスフェクション剤として、下記が挙げられる:リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムの共沈、DEAE−デキストラン媒介性トランスフェクション、第4級アンモニウム両親媒性DOTMA((ジオレオイルオキシプロピル)トリメチルアンモニウムブロミド、GIBCO−BRLよりLipofectinとして商品化されている)(Felgner et al, (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417;Malone et al. (1989) Proc. Natl Acad. Sci. USA 86 6077-6081);ペンダントトリメチルアンモニウムヘッドを有する親油性グルタミン酸ジエステル(Ito et al. (1990) Biochem. Biophys. Acta 1023, 124-132);カチオン性脂質であるジオクタデシルアミドグリシルスペルミン(DOGS、Transfectam、Promega)およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミルスペルミン(DPPES)などの代謝可能な親脂質(J. P. Behr (1986) Tetrahedron Lett. 27, 5861-5864;J. P. Behr et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6982-6986);代謝可能な第4級アンモニウム塩(DOTB、N−(1−[2,3−ジオレオイルオキシ]プロピル)−N,N,N−トリメチルアンモニウムメチルサルフェート(DOTAP)(Boehringer Mannheim)、ポリエチレンイミン(PEI)、ジオレオイルエステル、ChoTB、ChoSC、DOSC)(Leventis et al. (1990) Biochim. Inter. 22, 235-241);3ベータ[N−(N’,N’−ジメチルアミノエタン)カルバモイル]コレステロール(DC−Chol)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)/3ベータ[N−(N’,N’−ジメチルアミノエタン)カルバモイル]コレステロールDC−Cholの1対1混合物(Gao ct al., (1991) Biochim. Biophys. Acta 1065, 8-14)、スペルミン、スペルミジン、リポポリアミン(Behr et al., Bioconjugate Chem, 1994, 5: 382-389)、親油性ポリリジン(LPLL)(Zhou et al., (1991) Biochim. Biophys. Acta 939, 8-18)、過剰のホスファチジルコリン/コレステロールを有する[[(1,1,3,3 テトラメチルブチル)クレソキシ]エトキシ]エチル]ジメチルベンジルアンモニウムヒドロキシド(DEBDAヒドロキシド)(Ballas et al., (1988) Biochim. Biophys. Acta 939, 8-18)、セチルトリメチルアンモニウムブロミド(CTAB)/DOPE混合物(Pinnaduwage et al, (1989) Biochim. Biophys. Acta 985, 33-37)、DOPEを有するグルタミン酸の親油性ジエステル(TMAG)、CTAB、DEBDA、ジドデシルアンモニウムブロミド(DDAB)、およびステアリルアミンの、ホスファチジルエタノールアミンとの混合物(Rose et al., (1991) Biotechnique 10, 520-525)、DDAB/DOPE(TransfectACE、GIBCO BRL)、ならびにオリゴガラクトース担持脂質。移入効率を高める例示的なトランスフェクションエンハンサー剤として、例えば下記が挙げられる:DEAE−デキストラン、ポリブレン、リソソーム破壊ペプチド(Ohmori N I et al, Biochem Biophys Res Commun Jun. 27, 1997; 235(3):726-9)、コンドロイタン系プロテオグリカン、硫酸化プロテオグリカン、ポリエチレンイミン、ポリリジン(Pollard H et al. J Biol Chem, 1998 273 (13):7507-11)、インテグリン結合ペプチドCYGGRGDTP、直鎖状デキストラン非糖類、グリセロール、オリゴヌクレオチドの3’末端インターヌクレオシドリンクに繋がれたコレステリル基(Letsinger, R. L. 1989 Proc Natl Acad Sci USA 86: (17):6553-6)、リゾホスファチド、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、および1−オレオイル リゾホスファチジルコリン。
[00525]状況によっては、核酸含有ベクターを標的細胞に誘導する薬剤により核酸を送達することが望ましい場合がある。そのような「標的化」分子として、標的細胞上の細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体、または標的細胞上の受容体に対するリガンドが挙げられる。リポソームを用いる場合には、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質は、標的化および/または取り込みの促進に使用され得る。そのようなタンパク質の例として、下記が挙げられる:特定の細胞型に向性のキャプシドタンパク質およびその断片、循環中に内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、ならびに細胞内局在化を標的とし、かつ細胞内半減期を向上させるタンパク質。他の実施形態では、受容体媒介性エンドサイトーシスを使用し得る。そのような方法は、例えばWu et al., 1987またはWagner et al., 1990に記載される。現在知られている遺伝子マーキングおよび遺伝子治療プロトコールの概説に関しては、Anderson 1992を参照されたい。WO93/25673およびそこに引用された参考文献も参照されたい。
融合タンパク質
[00526]一態様では、本明細書で開示されている抗体または抗原結合性断片を含む融合タンパク質が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、本明細書で開示されている1種または複数の抗体またはその抗原結合性断片と、免疫調節剤または毒素部分とを含む。抗体融合タンパク質を作製する方法は公知である。インターロイキン−2部分を含む抗体融合タンパク質が、Boleti et al., Ann. Oneal. 6:945 (1995)、Nicolet et al., Cancer Gene Ther. 2:161 (1995)、Becker et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 93:7826 (1996)、Hank et al., Clin. Cancer Res. 2:1951 (1996)、およびHu et al., Cancer Res. 56:4998 (1996)により説明されている。加えて、Yang et al., Hum. Antibodies Hybridomas 6:129 (1995)では、F(ab’)2断片と、腫瘍壊死因子アルファ部分とを含む融合タンパク質が記載される。
[00527]組換え分子が1種または複数の抗体成分と毒素または化学療法剤とを含む抗体−毒素融合タンパク質を作製する方法も、当業者に公知である。例えば、抗体−シュードモナス属外毒素A融合タンパク質が、Chaudhary et al., Nature 339:394 (1989)、Brinkmann et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88:8616 (1991)、Batra et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 89:5867 (1992)、Friedman et al., J. Immunol. 150:3054 (1993)、Weis et al., Int. J. Can. 60:137 (1995)、Fominaya et al., J. Biol. Chem. 271:10560 (1996)、Kuan et al., Biochemistry 35:2872 (1996)、およびSchmidt et al., Int. J. Can. 65:538 (1996)により説明される。ジフテリア毒素部分を含有する抗体−毒素融合タンパク質が、Kreitman et al., Leukemia 7:553 (1993)、Nicholls et al., J. Biol. Chem. 268:5302 (1993)、Thompson et al., J. Biol. Chem. 270:28037 (1995)、およびVallera et al., Blood 88:2342 (1996)により説明されている。Deonarain et al., Tumor Targeting 1:177 (1995)では、RNアーゼ部分を有する抗体−毒素融合タンパク質が記載されており、Linardou et al., Cell Biophys. 24-25:243 (1994)では、DNアーゼI成分を含む抗体−毒素融合タンパク質が産生される。ゲロニンが、Wang et al., Abstracts of the 209th ACS National Meeting, Anaheim, Calif., Apr. 2-6, 1995, Part 1, BIOT005の抗体−毒素融合タンパク質における毒素部分として使用された。さらなる例として、Dohlsten et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 91:8945 (1994)では、ブドウ球菌(Staphylococcal)エンテロトキシン−Aを含む抗体−毒素融合タンパク質が報告された。
[00528]そのようなコンジュゲートの調製で適切に用いられる毒素の例は、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ、DNアーゼI、ブドウ球菌エンテロトキシン−A、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス属外毒素、およびシュードモナス属(内毒素である。例えば、Pastan et al., Cell 47:641 (1986)、およびGoldenberg, C A-A Cancer Journal for Clinicians 44:43 (1994)を参照されたい。他の適切な毒素が、当業者に公知である。
[00529]本明細書で開示されている抗体またはその抗原結合性断片は、プロドラッグ(例えば、ペプチジル化学療法剤、WO81/01145を参照されたい)を活性の抗がん薬物へと変換するプロドラッグ活性化酵素に抗体をコンジュゲートさせることにより、ADEPTでも使用され得る。例えば、WO88/07378および米国特許第4,975,278号を参照されたい。ADEPTに有用なイムノコンジュゲートの酵素成分として、プロドラッグをより活性の細胞毒性形態に変換するような方法でプロドラッグに作用し得るあらゆる酵素が挙げられる。
[00530]本発明の方法で有用な酵素として下記が挙げられるが、これらに限定されない:リン酸塩含有プロドラッグの遊離薬物への変換に有用なアルカリホスファターゼ;硫酸塩含有プロドラッグの遊離薬物への変換に有用なアリールスルファターゼ;無毒な5−フルオロシトシンの抗がん薬物5−フルオロウラシルへの変換に有用なシトシンデアミナーゼ;ペプチド含有プロドラッグの遊離薬物への変換に有用なプロテアーゼ、例えば、セラチアプロテアーゼ、サーモリシン、スブチリシン、カルボキシペプチダーゼ、およびカテプシン(例えば、カテプシンBおよびL);D−アミノ酸置換基を含むプロドラッグの変換に有用なD−アラニルカルボキシペプチダーゼ;グリコシル化されたプロドラッグの遊離薬物への変換に有用な炭水化物切断酵素、例えば、ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼ;ラクタムで誘導体化された薬物の遊離薬物への変換に有用なラクタマーゼ;およびそれぞれフェノキシアセチル基またはフェニルアセチル基によりアミン窒素で誘導体化された薬物の遊離薬物への変換に有用なペニシリンアミダーゼ、例えば、ペニシリンVアミダーゼまたはペニシリンGアミダーゼ。あるいは、酵素活性を有する抗体(当分野ではアブザイムとしても既知である)を使用して、本発明のプロドラッグを遊離活性薬物に変換し得る(例えば、Massey, Nature 328: 457-458 (1987)を参照されたい)。腫瘍細胞集団にアブザイムを送達するために、本明細書で説明されているように、抗体−アブザイムコンジュゲートを調製し得る。
[00531]本発明の酵素を、上述のヘテロ二官能性架橋試薬の使用などの当分野で周知の技術により、抗体に共有結合させ得る。あるいは、本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部分に連結された本発明の抗体の抗原結合領域を少なくとも含む融合タンパク質は、当分野で周知の組換えDNA技術を使用して構築し得る(例えば、Neuberger et al., Nature 312: 604-608 (1984)を参照されたい)。
キメラ抗原受容体
[00532]一態様では、本開示は、本明細書で開示されている抗原結合性断片、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を提供する。「キメラ抗原受容体」(CAR)、「人工T細胞受容体」、「キメラT細胞受容体」、または「キメラ免疫受容体」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫エフェクター細胞上に任意の特異性を付与する操作された受容体を指す。CARは、典型的には、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメイン(エンドドメイン)とを含む細胞外ドメイン(エクトドメイン)を有する。「シグナル伝達ドメイン」という用語は、細胞内で情報を伝達して、第2のメッセンジャーを生成することによるかまたはそのようなメッセンジャーに応答してエフェクターとして機能することにより、定義されたシグナル伝達経路を介して細胞活動を制御することにより作用するタンパク質の機能的部分を指す。
[00533]「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、本明細書で使用される場合、分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、CAR含有細胞(例えばCART細胞)の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。例えばCART細胞中での免疫エフェクター機能の例として、細胞溶解活性およびヘルパー活性(サイトカインの分泌を含む)が挙げられる。
[00534]ある実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。例示的な一次細胞内シグナル伝達ドメインとして、一次刺激または抗原依存性シミュレーションの原因となる分子に由来するものが挙げられる。ある実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含み得る。例示的な共刺激細胞内シグナル伝達ドメインとして、共刺激シグナルまたは抗原非依存性刺激の原因となる分子に由来するものが挙げられる。例えば、CARTの場合には、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、T細胞受容体の細胞質配列を含み得、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共受容体または共刺激分子からの細胞質配列を含み得る。
[00535]一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはITAMとして既知であるシグナル伝達モチーフを含み得る。ITAM含有一次細胞質シグナル伝達配列の例として、CD3ゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79b、ならびにCD66d DAP10およびDAP12に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
[00536]「ゼータ」、もしくは代替的に「ゼータ鎖」、「CD3−ゼータ」、もしくは「TCR−ゼータ」という用語は、GenBan Acc.No.BAG36664.1として提供されるタンパク質と定義されるか、または非ヒト種(例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿、および同類のもの)からの同等の残基と定義され、「ゼータ刺激ドメイン」、または代替的に「CD3−ゼータ刺激ドメイン」もしくは「TCR−ゼータ刺激ドメイン」は、T細胞活性化に必要な初期シグナルを機能的に伝達するのに十分なゼータ鎖の細胞質ドメインからのアミノ酸残基と定義される。一態様では、ゼータの細胞質ドメインは、GenBank受託番号BAG36664.1の残基52〜164を含むか、またはその機能的オルソログである非ヒト種(例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿、および同類のもの)からの同等の残基を含む。
[00537]「共刺激分子」という用語は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによりT細胞による共刺激応答(例えば、限定されないが、増殖)を媒介するT細胞上のコグネート結合パートナーを指す。共刺激分子は、効率的な免疫応答に必要な、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子として、MHCクラスI分子、BTLAおよびTollリガンド受容体、ならびにOX40、CD2、CD27、CD28、CD5、ICAM−1、LFA−1(CD11a/CD18)および4−1BB(CD137)が挙げられるが、これらに限定されない。
[00538]共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分に由来し得る。共刺激分子は、下記のタンパク質ファミリーで表現され得る:TNF受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAMタンパク質)、および活性化NK細胞受容体。そのような分子の例として、下記が挙げられる:CD27、CD28、4−1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、リンパ球機能関連抗原−1(LFA−1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7−H3、およびCD83に特異的に結合するリガンド、および同類のもの。
[00539]細胞内シグナル伝達ドメインは、このドメインが由来する分子の細胞内タンパク質全体、もしくは天然細胞内シグナル伝達ドメイン全体、またはそれらの機能的断片を含み得る。
[00540]別の態様では、抗原結合性断片は、ヒト化抗体または抗体断片を含む。一実施形態では、抗原結合性断片は、本明細書に記載される抗体の1つまたは複数(例えば、1つ、2つ、または3つ全て)の軽鎖相補性決定領域1(CDR−L1)、軽鎖相補性決定領域2(CDR−L2)、および軽鎖相補性決定領域3(CDR−L3)と、本明細書に記載される抗体の1つまたは複数(例えば、1つ、2つ、または3つ全て)の重鎖相補性決定領域1(CDR−H1)、重鎖相補性決定領域2(CDR−H2)、および重鎖相補性決定領域3(CDR−H3)とを含む。一実施形態では、CDR−L1は、配列番号99〜112のうちのいずれか1つから選択される配列を含む。一実施形態では、CDR−L2は、配列番号71〜84のうちのいずれか1つから選択される配列を含む。一実施形態では、CDR−L3は、配列番号43〜56のうちのいずれか1つから選択される配列を含む。一実施形態では、CDR−H1は、配列番号85〜98のうちのいずれか1つから選択される配列を含む。一実施形態では、CDR−H2は、配列番号57〜70のうちのいずれか1つから選択される配列を含む。一実施形態では、CDR−H3は、配列番号29〜42のうちのいずれか1つから選択される配列を含む。一実施形態では、抗原結合性断片は、本明細書に記載される軽鎖可変領域および/または本明細書に記載される重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号15〜28のうちのいずれか1つから選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号1〜14のうちのいずれか1つから選択される配列を含む。一実施形態では、抗原結合性断片は、アミノ酸配列の軽鎖可変領域および重鎖可変領域(例えば、本明細書に記載される軽鎖可変領域および重鎖可変領域)を含むscFvである。ある実施形態では、抗原結合性断片(例えばscFv)は、本明細書で提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも1個、2個、もしくは3個の改変(例えば置換)を有するが30個、20個、もしくは10個以下の改変(例えば置換)を有するアミノ酸配列または本明細書で提供されるアミノ酸配列と85〜99%(例えば、90〜99%または95〜99%)の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域;および/または本明細書で提供される重鎖可変領域のアミノ鎖配列の少なくとも1個、2個、もしくは3個の改変(例えば置換)を有するが30個、20個、もしくは10個以下の改変(例えば置換)を有するアミノ酸配列または本明細書で提供されるアミノ酸配列と85〜99%(例えば、90〜99%または95〜99%)の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。
膜貫通ドメイン
[00541]膜貫通ドメインに関して、様々な実施形態では、CARは、このCARの細胞外ドメインに付着している膜貫通ドメインを含むように設計され得る。膜貫通ドメインとして、膜貫通領域に隣接する1個もしくは複数の追加のアミノ酸(例えば、膜貫通が由来するタンパク質の細胞外領域と会合している1個または複数のアミノ酸(例えば、細胞外領域の1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、最大15個のアミノ酸))、および/または膜貫通タンパク質が由来するタンパク質の細胞内領域と会合している1個もしくは複数の追加のアミノ酸(例えば、細胞内領域の1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、最大15個のアミノ酸)が挙げられ得る。一態様では、膜貫通ドメインは、使用されるCARの他のドメインのうちの1つと会合しているものである。場合によっては、膜貫通ドメインは、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、同一のまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を避けるように選択され得るかまたはアミノ酸置換により改変され得る。一態様では、膜貫通ドメインは、CAR T細胞表面上の別のCARとホモ二量体化し得る。異なる態様では、膜貫通ドメインのアミノ鎖配列は、同一のCAR T細胞中に存在する天然結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小限に抑えるように改変され得るかまたは置換され得る。
[00542]膜貫通ドメインは、天然供給源に由来してもよいし、組換え供給源に由来してもよい。供給源が天然である場合には、このドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。一態様では、膜貫通ドメインは、CARが標的に結合した場合は常に、細胞内ドメインにシグナル伝達し得る。膜貫通ドメインは、例えばT細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖、またはゼータ鎖、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154の膜貫通領域を少なくとも含み得る。
[00543]場合によっては、膜貫通ドメインは、ヒンジ(例えば、ヒトタンパク質由来のヒンジ)を介して、CARの細胞外領域(例えば、CARの抗原結合ドメイン)に付着され得る。例えば、一実施形態では、このヒンジは、ヒトIg(免疫グロブリン)ヒンジ、例えば、IgG4ヒンジまたはCD8aヒンジであり得る。一態様では、このヒンジまたはスペーサーは、IgG4ヒンジを含む。
細胞質ドメイン
[00544]CARの細胞質ドメインまたは領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、概して、CARが導入されている免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも1つの活性化に関与する。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊な機能を指す。T細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性またはヘルパー活性(サイトカインの分泌を含む)であり得る。「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、タンパク質の、エフェクター機能シグナルを伝達して細胞に特殊な機能を実施させる部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体が用いられ得るが、多くの場合には、この鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインのトランケートされた部分が使用される限りにおいて、そのようなトランケートされた部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限りにおいてインタクトな鎖の代わりに使用され得る。そのため、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意のトランケートされた部分を含むことを意味する。
[00545]本発明のCARで使用される細胞内シグナル伝達ドメインの例として、抗原受容体エンゲージメント後にシグナル伝達を開始するために共に作用するT細胞受容体(TCR)および共受容体の細胞質配列、ならびにこの配列の任意の誘導体またはバリアント、および同一の機能的能力を有する任意の組換え配列が挙げられる。
[00546]TCRのみを介して生成されたシグナルは、T細胞の完全な活性化には不十分であり、二次シグナルおよび/または共刺激シグナルも必要とされることが知られている。そのため、T細胞の活性化は、下記の2種の異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列により媒介されると言われ得る:TCRを介して抗原依存性の一次活性化を開始するもの(一次細胞内シグナル伝達ドメイン)、および抗原非依存的に作用して、二次シグナルまたは共刺激シグナル(二次細胞質シグナル伝達ドメイン、例えば共刺激ドメイン)を提供するもの。
[00547]一次シグナル伝達ドメインは、刺激経路または阻害経路のいずれかで、TCR複合体の一次活性化を制御する。刺激で作用する一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはITAMとしても既知であるシグナル伝達モチーフを含有し得る。
[00548]本発明で特に使用されるITAM含有一次細胞内シグナル伝達ドメインの例として、TCRゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dのものが挙げられる。一実施形態では、本発明のCAR(例えばCAR)は、CD3−ゼータの細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば一次シグナル伝達ドメイン)を含む。一実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、改変されたITAMドメイン、例えば、天然のITAMドメインと比較した場合に活性が変更されている(例えば、増加しているかまたは減少している)突然変異ITAMドメインを含む。一実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、改変されたITAM含有一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、最適化されたおよび/またはトランケートされたITAM含有一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、1個、2個、3個、4個、またはより多くのITAMモチーフを含む。
[00549]CARの細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3−ゼータシグナル伝達ドメインそれ自体を含み得るか、または本発明のCARの文脈で有用な任意の他の所望の細胞内シグナル伝達ドメインと組み合わされ得る。例えば、CARの細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ゼータ鎖部分と、共刺激シグナル伝達ドメインとを含み得る。共刺激シグナル伝達ドメインは、CARの、共刺激分子の細胞内ドメインを含む部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要な、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。そのような分子の例として、CD27、CD28、4−1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD−1、ICOS、リンパ球機能関連抗原−1(LFA−1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7−H3、およびCD83に特異的に結合するリガンド、および同類のものが挙げられる。例えば、CD27共刺激は、in vitroでのヒトCART細胞の増殖、エフェクター機能、および生存を増強し、in vivoでのヒトT細胞の持続性および抗腫瘍活性を増加させることが実証されている(Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706)。
[00550]本発明のCARの細胞質部分内の細胞内シグナル伝達配列は、無作為にまたは特定の順序で互いに連結され得る。任意選択で、例えば2〜10個の間のアミノ酸(例えば、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個のアミノ酸)の長さの短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーが、細胞内シグナル伝達配列間の連結を形成し得る。一実施形態では、グリシン−セリンダブレットが、適切なリンカーとして使用され得る。一実施形態では、単一のアミノ酸(例えば、アラニン、グリシン)が、適切なリンカーとして使用され得る。
[00551]一態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、2個以上(例えば、2個、3個、4個、5個、またはより多く)の共刺激シグナル伝達ドメインを含むように設計されている。ある実施形態では、2個以上(例えば、2個、3個、4個、5個、またはより多く)の共刺激シグナル伝達ドメインは、リンカー分子(例えば、本明細書に記載されるリンカー分子)により分離されている。一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、2つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、リンカー分子は、グリシン残基である。いくつかの実施形態では、リンカーは、アラニン残基である。
[00552]いくつかの実施形態では、CARは、実際には抗原全体を認識せず、代わりに、抗原の表面の一部(抗原決定基またはエピトープと呼ばれる領域)のみに結合する。
[00553]いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるCAR(その機能的部分および機能的バリアントを含む)として、グリコシル化されたもの、アミド化されたもの、カルボキシル化されたもの、リン酸化されたもの、エステル化されたもの、N−アシル化されたもの、例えばジスルフィド架橋を介して環化されたもの、または酸付加塩に変換されたもの、および/または任意選択で二量体化されたかもしくは重合化されたもの、またはコンジュートされたものが挙げられる。
T細胞受容体融合タンパク質(TFP)
[00554]本明細書で使用される場合、「T細胞受容体(TCR)融合タンパク質」または「TFP」は、TCRを含む様々なポリペプチドに由来する組換えポリペプチドであって、一般的に、i)標的細胞上の表面に結合し得、およびii)典型的には、T細胞中にまたはT細胞の表面上に同時に配置された場合に、インタクトなTCR複合体の他のポリペプチド成分と相互作用し得る、組換えポリペプチドを含む。TFPの非限定的な例が、図11〜14に示される。
[00555]一態様では、ヒトまたはヒト化抗がん抗原(抗CAg)結合ドメインと、TCR細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含む単離されたTFP分子が本明細書で提供される。
[00556]一態様では、ヒトまたはヒト化抗CAg結合ドメインと、TCR細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む単離されたTFP分子であって、内因性TCR複合体および/または少なくとも1種の内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用し得るTFP分子が本明細書で提供される。
[00557]一態様では、ヒトまたはヒト化抗CAg結合ドメインと、TCR細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む単離されたTFP分子であって、内因性TCR複合体に機能的に統合し得るTFP分子が本明細書で提供される。
[00558]場合によっては、単離されたTFP分子は、ヒトまたはヒト化抗CAg結合ドメインと、TCR細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含む抗体または抗体断片を含む。場合によっては、抗CAg結合ドメインは、scFvまたはVHドメインである。場合によっては、抗CAg結合ドメインは、配列番号1〜14のアミノ酸配列と95〜100%の同一性を有する重鎖、その機能的断片、または少なくとも1個であるが30個以下である改変を有するそのアミノ酸配列を含む。場合によっては、抗CAg結合ドメインは、配列番号15〜28のアミノ酸配列と95〜100%の同一性を有する軽鎖、その機能的断片、または少なくとも1個であるが30個以下である改変を有するそのアミノ酸配列を含む。場合によっては、単離されたTFP分子は、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、それらの機能的断片、および少なくとも1個であるが20個以下の改変を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含むTCR細胞外ドメインを含む。場合によっては、抗CAg結合ドメインは、リンカー配列によりTCR細胞外ドメインに接続されている。場合によっては、リンカー領域は、(G4S)n(式中、n=1〜4)を含む。
[00559]一態様では、本明細書で提供されるTFPをコードする核酸分子を含むベクターが本明細書で提供される。場合によっては、このベクターは、DNA、RNA、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)ベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択される。場合によっては、このベクターは、プロモーターをさらに含む。場合によっては、このベクターは、in vitroで転写されたベクターである。場合によっては、このベクター中の核酸配列は、ポリ(A)テールをさらに含む。場合によっては、このベクター中の核酸配列は、3’UTRをさらに含む。
[00560]一態様では、本明細書で提供されるベクターを含む宿主細胞が本明細書で提供される。場合によっては、この宿主細胞は、ヒトT細胞である。場合によっては、このT細胞は、CD8+T細胞またはCD4+T細胞である。いくつかの実施形態では、この宿主細胞は、ヒトエフェクター細胞である。「ヒトエフェクター細胞」は、1種または複数のFcRを発現し、かつエフェクター機能を発揮する白血球である。いくつかの実施形態では、この細胞は、少なくともFcγRIIIを発現し、かつADCCエフェクター機能を発揮する。ADCCを媒介するヒト白血球の例として、末梢血単核細胞(PBMC)、ナチュラルキラー(NK)細胞、単球、細胞傷害性T細胞、および好中球が挙げられる。エフェクター細胞は、天然の供給源(例えば血液)から単離され得る。場合によっては、宿主細胞は、細胞内シグナル伝達ドメインからのポジティブなシグナルを含む第2のポリペプチドと関連する、阻害分子の少なくとも一部を含む第1のポリペプチドを含む阻害分子をコードする核酸をさらに含む。場合によっては、阻害分子は、PD1の少なくとも一部を含む第1のポリペプチドと、共刺激ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む第2のポリペプチドとを含む。
[00561]一態様では、ヒトまたはヒト化抗CAg結合ドメインと、TCR細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含む、少なくとも2つのTFP分子を含むヒトCD8+またはCD4+T細胞であって、TFP分子が、ヒトCD8+またはCD4+T細胞中で、この細胞の表面で、および/またはこの細胞の表面上で、内因性TCR複合体および/または少なくとも1つの内因性TCRポリペプチドと機能的に相互作用し得る、T細胞が本明細書で提供される。
[00562]一態様では、ヒトまたはヒト化抗CAg結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含むTFP分子と、少なくとも1種の内因性TCR複合体とを含むタンパク質複合体が本明細書で提供される。
[00563]場合によっては、TCRは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、およびCD3デルタTCRサブユニットからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む。場合によっては、抗CAg結合ドメインは、リンカー配列によりTCR細胞外ドメインに接続されている。場合によっては、リンカー領域は、(G4S)n(式中、n=1〜4)を含む。
[00564]場合によっては、がん抗原発現と関連する疾患は、増殖性疾患、がん、悪性腫瘍、骨髄異形成、骨髄異形成症候群、前白血病、がん抗原の発現と関連する非がん性の関連する徴候からなる群から選択される。場合によっては、この疾患は、がんまたはその転移である。場合によっては、TFP分子を発現する細胞は、TFP分子を発現する細胞の有効性を増加させる薬剤と組み合わせて投与される。
[00565]一態様では、本明細書で提供される単離された核酸分子、本明細書で提供される単離されたポリペプチド分子、本明細書で提供される単離されたTFP、本明細書で提供される複合体、本明細書で提供されるベクター、または本明細書で提供される細胞は、医薬として使用されるためのものである。
[00566]「刺激」という用語は、刺激ドメインまたは刺激分子(例えばTCR/CD3複合体)とそのコグネートリガンドとの結合により誘発される一次反応を指し、それにより、シグナル伝達事象(例えば、限定されないが、TCR/CD3複合体によるシグナル伝達)が媒介される。刺激により、ある特定の分子の発現の変更、および/または細胞骨格構造の再構築、および同類のものが媒介され得る。
[00567]TFPを作製する方法、発現させる方法、および単離する方法は、当分野で例えば、米国付与前公表第20170166622A1号で公知であり、これにより参照により本明細書に組み込まれる。
抗原結合ドメイン
[00568]一態様では、本発明のTFPは、抗原結合ドメインと別途称される標的特異的結合エレメントを含む。この部分の選択は、標的細胞の表面を定義する標的抗原のタイプおよび数に依存する。例えば、抗原結合ドメインは、特定の疾患状態と関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用する標的抗原を認識するように選択され得る。そのため、本発明のTFPにおける抗原結合ドメインの標的抗原として作用し得る細胞表面マーカーの例として、がん性疾患(例えば悪性疾患)と関連するものが挙げられる。
[00569]一態様では、TFP媒介性T細胞応答は、所望の抗原に特異的に結合するTFPへの抗原結合ドメインの操作により、目的の抗原に誘導され得る。一態様では、抗原結合ドメインを含む、TFPの部分は、がん抗原(CAg)を標的とする抗原結合ドメインを含む。一態様では、この抗原結合ドメインは、ヒトCAgを標的とする。
[00570]抗原結合ドメインは、CAgに結合する任意のドメイン(限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、およびこれらの機能的断片を含む(例えば、限定されないが、一本鎖抗体、例えば、重鎖可変ドメイン(VH)、軽鎖可変ドメイン(VL)、およびラクダ由来ナノボディの可変ドメイン(VHH)))、および抗原結合ドメインとして機能することが当分野で公知である代替足場に結合する任意のドメイン(例えば、組換えフィブロネクチンドメイン、アンチカリン、DARPIN、および同類のもの)であり得る。同様に、標的CAgを特異的に認識して結合する天然または合成のリガンドは、TFPの抗原結合ドメインとして使用され得る。場合によっては、TFPが最終的に使用されるのと同一の種に抗原結合ドメインが由来することが有利である。例えば、ヒトでの使用の場合には、抗体または抗体断片の抗原結合ドメインのヒト残基またはヒト化残基をTFPの抗原結合ドメインが含むことが有利であり得る。
[00571]抗体またはその抗体断片を含む、本発明のTFP組成物の部分は、抗原結合ドメインが、マウス抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体に由来する連続的なポリペプチド鎖(例えば、単一ドメイン抗体断片(sdAb)、一本鎖抗体(scFv)を含む)の一部として発現される様々な形態で存在し得る(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.;Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.;Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883;Bird et al., 1988, Science 242:423-426)。一態様では、本発明のTFP組成物の抗原結合ドメインは、抗体断片を含む。さらなる態様では、TFPは、scFvまたはsdAbを含む抗体断片を含む。
[00572]別の態様では、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体または抗原結合ドメインを含む。一実施形態では、抗原結合ドメインは、本明細書に記載される抗体の1つまたは複数(例えば、1つ、2つ、または3つ全て)の軽鎖相補性決定領域1(CDR−L1)、軽鎖相補性決定領域2(CDR−L2)、および軽鎖相補性決定領域3(CDR−L3)と、本明細書に記載される抗体の1つまたは複数(例えば、1つ、2つ、または3つ全て)の重鎖相補性決定領域1(CDR−H1)、重鎖相補性決定領域2(CDR−H2)、および重鎖相補性決定領域3(CDR−H3)とを含む。一実施形態では、CDR−L1は、配列番号99〜112のうちのいずれか1つから選択される配列を含む。一実施形態では、CDR−L2は、配列番号71〜84のうちのいずれか1つから選択される配列を含む。一実施形態では、CDR−L3は、配列番号43〜56のうちのいずれか1つから選択される配列を含む。一実施形態では、CDR−H1は、配列番号85〜98のうちのいずれか1つから選択される配列を含む。一実施形態では、CDR−H2は、配列番号57〜70のうちのいずれか1つから選択される配列を含む。一実施形態では、CDR−H3は、配列番号29〜42のうちのいずれか1つから選択される配列を含む。一実施形態では、抗原結合ドメインは、本明細書に記載される軽鎖可変領域、および/または本明細書に記載される重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号15〜28のうちのいずれか1つから選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号1〜14のうちのいずれか1つから選択される配列を含む。一実施形態では、抗原結合ドメインは、アミノ酸配列の軽鎖可変領域および重鎖可変領域(例えば、本明細書に記載される軽鎖可変領域および重鎖可変領域)を含むscFvである。ある実施形態では、抗原結合ドメイン(例えばscFv)は、本明細書で提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも1個、2個、もしくは3個の改変(例えば置換)を有するが30個、20個、もしくは10個以下の改変(例えば置換)を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供されるアミノ酸配列と85〜99%(例えば、90〜99%または95〜99%)の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域;および/または本明細書で提供される重鎖可変領域のアミノ鎖配列の少なくとも1個、2個、もしくは3個の改変(例えば置換)を有するが30個、20個、もしくは10個以下の改変(例えば置換)を有するアミノ酸配列または本明細書で提供されるアミノ酸配列と85〜99%(例えば、90〜99%もしくは95〜99%)の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。
[00573]「刺激分子」または「刺激ドメイン」という用語は、T細胞シグナル伝達経路の少なくともいくつかの態様に対して刺激的にTCR複合体の一次活性化を制御する一次細胞質シグナル伝達配列を生じるT細胞により発現される分子またはその一部を指す。一態様では、一次シグナルは、例えば、TCR/CD3複合体と、ペプチドが含まれるMHC分子との結合により開始され、T細胞応答(限定されないが、増殖、活性化、分化、および同類のものを含む)が媒介される。刺激的に作用する一次細胞質シグナル伝達配列(「一次シグナル伝達ドメイン」とも称される)は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ(ITAM)として既知であるシグナル伝達モチーフを含有し得る。本発明で特に使用されるITAM含有一次細胞質シグナル伝達配列の例として、TCRゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(「ICOS」としても既知である)、およびCD66dに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
[00574]「抗原提示細胞」または「APC」という用語は、その表面上で、主要組織適合性複合体(MHC)と複合体化した外来抗原を提示する免疫系細胞(例えば、アクセサリー細胞(例えば、B細胞、樹状細胞、および同類のもの)を指す。T細胞は、T細胞受容体(TCR)を使用して、この複合体を認識し得る。APCは、抗原をプロセシングしてT細胞に提示する。
[00575]「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、本明細書で使用される場合、分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、TFP含有細胞(例えば、TFP発現T細胞)の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。例えばTFP発現T細胞中での免疫エフェクター機能の例として、細胞溶解活性およびTヘルパー細胞活性(サイトカインの分泌を含む)が挙げられる。ある実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。例示的な一次細胞内シグナル伝達ドメインとして、一次刺激または抗原依存性シミュレーションの原因となる分子に由来するものが挙げられる。ある実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含み得る。例示的な共刺激細胞内シグナル伝達ドメインとして、共刺激シグナルまたは抗原非依存性刺激の原因となる分子に由来するものが挙げられる。
[00576]一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ITAM(「免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ」)を含み得る。ITAM含有一次細胞質シグナル伝達配列の例として、CD3ゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79b、ならびにCD66d DAP10およびDAP12に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
[00577]「共刺激ドメイン」という用語は、共刺激リガンドに特異的に結合し、それによりT細胞による共刺激応答(例えば、限定されないが、増殖)を媒介するT細胞上のコグネート結合パートナーを指す。共刺激分子は、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子であって、効率的な免疫応答に必要な分子である。共刺激分子として、MHCクラスI分子、BTLAおよびTollリガンド受容体、ならびにOX40、CD2、CD27、CD28、CD5、ICAM−1、LFA−1(CD11a/CD18)および4−1BB(CD137)が挙げられるが、これらに限定されない。共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分であり得る。共刺激分子は、下記のタンパク質ファミリーで表現され得る:TNF受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAMタンパク質)、および活性化NK細胞受容体。そのような分子の例として、下記が挙げられる:CD27、CD28、4−1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、リンパ球機能関連抗原−1(LFA−1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7−H3、およびCD83に特異的に結合するリガンド、および同類のもの。細胞内シグナル伝達ドメインは、このドメインが由来する分子の細胞内タンパク質全体、または天然細胞内シグナル伝達ドメイン全体、またはこれらの機能的断片を含み得る。「4−1BB」という用語は、GenBank受託番号AAA62478.2として提供されるアミノ酸配列を有するかまたは非ヒト種(例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿、および同類のもの)からの同等の残基を有するTNFRスーパーファミリのメンバーを指し、「4−1BB共刺激ドメイン」は、GenBank受託番号AAA62478.2のアミノ酸残基214〜255と定義されるか、または非ヒト種(例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿、および同等のもの)からの同等の残基と定義される。
細胞外ドメイン
[00578]細胞外ドメインは、天然供給源に由来してもよいし、組換え供給源に由来してもよい。供給源が天然である場合には、このドメインは、任意のタンパク質に由来し得るが、特に膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。一態様では、細胞外ドメインは、膜貫通ドメインと会合し得る。本発明での特定の用途の細胞外ドメインは、例えばT細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖、もしくはゼータ鎖、またはCD3イプシロン、CD3ガンマ、もしくはCD3デルタ、または代替実施形態では、CD28、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154の細胞外領域を少なくとも含み得る。
膜貫通ドメイン
[00579]一般に、TFP配列は、単一ゲノム配列によりコードされる細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含有する。代替実施形態では、TFPは、このTFPの細胞外ドメインに対して異種である膜貫通ドメインを含むように設計され得る。膜貫通ドメインとして、膜貫通領域に隣接する1個もしくは複数の追加のアミノ酸(例えば、膜貫通が由来したタンパク質の細胞外ドメインと会合している1個もしくは複数のアミノ酸(例えば、細胞外領域の1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、または最大15個のアミノ酸))、および/または膜貫通タンパク質が由来するタンパク質の細胞内領域と会合している1個もしくは複数の追加のアミノ酸(例えば、細胞内領域の1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、または最大15個のアミノ酸)が挙げられ得る。一態様では、膜貫通ドメインは、使用されるTFPの他のドメインのうちの1つと会合しているものである。場合によっては、膜貫通ドメインは、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、同一のまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を避けるように選択され得るかまたはアミノ酸置換により改変され得る。一態様では、膜貫通ドメインは、TFP−T細胞表面上の別のTFPとホモ二量体化し得る。異なる態様では、膜貫通ドメインのアミノ鎖配列は、同一のTFP中に存在する天然結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小限に抑えるように改変され得るかまたは置換され得る。
[00580]膜貫通ドメインは、天然供給源に由来してもよいし、組換え供給源に由来してもよい。供給源が天然である場合には、このドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。一態様では、膜貫通ドメインは、TFPが標的に結合した場合は常に、細胞内ドメインにシグナル伝達し得る。本発明での特定の用途の膜貫通ドメインは、例えばT細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖、またはゼータ鎖、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154の膜貫通領域を少なくとも含み得る。
[00581]場合によっては、膜貫通ドメインは、ヒンジ(例えば、ヒトタンパク質由来のヒンジ)を介して、TFPの細胞外領域(例えば、TFPの抗原結合ドメイン)に付着され得る。例えば、一実施形態では、このヒンジは、ヒト免疫グロブリン(Ig)ヒンジであり得、例えば、IgG4ヒンジまたはCD8aヒンジであり得る。
リンカー
[00582]任意選択で、リンカーは、TFPの膜貫通ドメインと細胞質領域との間に連結を形成し得る。リンカーの配向およびサイズの例に関して、例えば、参照により本明細書に組み込まれるHollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448、米国特許出願公開第2005/0100543号、同第2005/0175606号、同第2007/0014794号、ならびにPCT公開番号WO2006/020258およびWO2007/024715を参照されたい。
[00583]例えば、2〜10個の間のアミノ酸の長さの短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーは、TFPの膜貫通ドメインと細胞質領域との間に連結を形成し得る。場合によっては、リンカーは、VL領域とVH領域との間の約10個、11個、12個、13個、14個、15個、または15個超の残基であり得る。リンカー配列は、任意の天然に存在するアミノ酸を含み得る。リンカー長の変形形態は、活性を保持し得るかまたは増強し得、活性研究において優れた有効を生じる。
[00584]一態様では、リンカーは、長さおよび/またはアミノ酸組成が最適化されているアミノ酸グリシンおよびセリンを含む。リンカー長は、ポリペプチドの可変領域がどれくらいフォールドして相互作用するかに大きな影響を及ぼし得る。実際には、短いポリペプチドリンカー(例えば5〜10個の間のアミノ酸)が用いられる場合には、鎖内フォールディングが妨げられる。鎖内フォールディングはまた、2つの可変領域をまとめて機能的エピトープ結合部位を形成するためにも必要である。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、(Gly4Ser)n(式中、nは、1以上の正の整数である)などのグリシンおよびセリンの繰り返しのセットを含む。場合によっては、リンカー配列は、長いリンカー(LL)配列を含む。場合によっては、長いリンカー配列は、(G4S)n(式中、n=2〜4)を含む。場合によっては、リンカー配列は、短いリンカー(SL)配列を含む。場合によっては、短いリンカー配列は、(G4S)n(式中、n=1〜3)を含む。グリシン−セリンダブレットは、特に適切なリンカーを提供する。例えば、一態様では、リンカーは、GGGGSGGGGSのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCCのヌクレオチド配列によりコードされる。一実施形態では、リンカーは、(Gly4Ser)4または(Gly4Ser)3であり得る。
抗体を操作する方法
[00585]上記で論じたように、本明細書で開示されているVH配列を有する抗体およびVL配列を有する抗体をそれぞれ使用して、VH配列および/もしくはVL配列またはこれらに付着している定常領域を改変することにより、新規の抗体を作製し得る。そのため、本開示の少なくともいくつかの実施形態に係る別の態様では、本開示の少なくともいくつかの実施形態に係る本明細書で開示されている抗体の構造的特徴をそれぞれ使用して、ヒトがん細胞抗原への結合などの本開示の少なくともいくつかの実施形態に係る親抗体の少なくとも1つの機能的特性を保持する構造的に関連する抗体を作製する。例えば、本明細書で開示される1つの抗体の1つもしくは複数のCDR領域またはその突然変異を、上記で論じたように、既知のフレームワーク領域および/または他のCDRとの組換えにより合わせて、本開示の少なくともいくつかの実施形態に係る追加の組換えにより操作された抗体を作製し得る。改変の他のタイプとして、前節で説明されているものが挙げられる。この操作する方法のための出発材料は、本明細書で提供されるVH配列および/もしくはVL配列のうちの1つもしくは複数、またはそれらの1つもしくは複数のCDR領域、または本明細書で提供されるCDR1領域配列、CDR2領域配列、およびCDR3領域配列のうちの1つもしくは複数である。操作された抗体を作製するために、本明細書で提供されるVH配列および/もしくはVL配列のうちの1つもしくは複数、またはそれらの1つもしくは複数のCDR領域を有する抗体を実際に調製する(即ち、タンパク質として発現させる)必要はない。むしろ、配列に含まれる情報を出発材料として使用して、元の配列に由来する「第二世代」配列を作製し、次いで、この「第二世代」配列を調製してタンパク質として発現させる。
[00586]標準的な分子生物技術を使用して、変更された抗体配列を調製して発現させ得る。好ましくは、変更された抗体配列によりコードされた抗体は、本明細書で提供される方法および配列によりそれぞれ産生された、本明細書で開示されている抗体の機能的特性のうちの1つ、いくつか、または全てを保持するものであり、この機能的特性として、特定のKDレベル以下でのがん細胞抗原への結合、および/または免疫刺激の調節、および/または例えばがん関連抗原を発現する所望の標的細胞への選択的結合が挙げられる。
[00587]変更された抗体の機能的特性を、当分野で利用可能なおよび/または本明細書に記載される標準的アッセイを使用して評価し得る。いくつかの実施形態では、突然変異を、本明細書で開示される抗体コード配列の全てまたは一部に沿って無作為にまたは選択的に導入し得、得られた改変抗体を、結合活性および/または他の所望の機能的特性に関してスクリーニングし得る。突然変異方法は、当分野で説明されている。例えば、ShortによるPCT公開番号WO02/092780では、飽和変異誘発、合成ライゲーションアセンブリー、またはそれらの組み合わせを使用して抗体突然変異を作製してスクリーニングする方法が記載される。あるいは、Lazar他によるPCT公開番号WO03/074679では、抗体の生理化学的特性を最適化するためにコンピュータによるスクリーニング方法を使用する方法が記載される。
種選択性および種交差反応性
[00588]本開示のある特定の実施形態によれば、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトがん抗原に結合し得るが、他の種からのがん抗原には結合し得ない。あるいは、ある特定の実施形態での抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトがん抗原と、1種または複数の非ヒト種からのがん抗原とに結合する。例えば、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトがん抗原に結合し得、場合によっては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザル、またはチンパンジーのがん抗原のうちの1つまたは複数に結合し得るかまたは結合し得ない。
標的抗原の同定
スクリーニング方法
[00589]抗体は、当技術で公知の方法により結合親和性についてスクリーニングされ得る。たとえば、ゲルシフトアッセイ、ウェスタンブロット、放射線標識競合アッセイ、クロマトグラフィーによる共分別、共沈殿、架橋、ELISA、その他が使用でき、これらはたとえば参照によりその全体が本明細書に組み込まれるCurrent Protocols in Molecular Biology (1999) John Wiley & Sons, NYに記載されている。
[00590]抗原(たとえばがん関連抗原)上の所望のエピトープに結合する抗体について最初にスクリーニングするため、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載されているような通常の交差ブロッキングアッセイを実施することができる。通常の競合結合アッセイを使用することもでき、この場合、未知の抗体は本発明の抗原特異的抗体への抗原の結合を阻害する能力によって特徴付けられる。インタクトな抗原、その断片、または線状エピトープを使用することができる。エピトープマッピングはChampe et al., J. Biol. Chem. 270: 1388-1394 (1995)に記載されている。
[00591]本明細書に記載した抗体またはその抗原結合性断片は、がんの予防または治療においても有用であり得る。がんの転移の予防または治療における候補抗体またはその抗原結合性断片の有効性は、Filderman et al., Cancer Res 52: 36616, 1992に記載されたヒト羊膜基底膜浸潤モデルを使用してスクリーニングされ得る。さらに、種々の型のがんの転移についての動物モデル系のいずれかも使用され得る。そのようなモデル系は、それだけに限らないが、Wenger et al., Clin. Exp. Metastasis 19: 169 73, 2002、Yi et al., Cancer Res. 62: 917 23, 2002、Tsutsumi et al., Cancer Lett 169: 77-85, 2001、Tsingotjidou et al., Anticancer Res. 21: 971 8, 2001、Wakabayashi et al., Oncology 59: 75 80, 2000、Culp and Kogerman, Front Biosci. 3:D672 83, 1998、Runge et al., Invest Radiol. 32: 212 7、Shioda et al., J. Surg. Oneal. 64: 122 6, 1997、Ma et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 37: 2293 301, 1996、Kuruppu et al., J Gastroenterol Hepatol. 11: 26 32, 1996に記載されたものを含む。効果的な抗体の存在下においては、がんの転移は防止され、または阻害されて転移が少なくおよび/または小さくなる。
[00592]特定の抗体、抗体の組み合わせ、またはそれらの断片は、好適な動物モデルを使用してin vivoで評価され得る。たとえば、ヒトリンパ腫細胞がヌードマウスまたはSCIDマウスなどの免疫機能が低下した動物に導入される異種リンパ腫がんモデルである。有効性は、腫瘍形成の阻害、腫瘍の縮退または転移、その他を測定するアッセイを使用して予測され得る。
[00593]in vitroアッセイの1つの変形形態では、本開示は、(a)固定化された抗原を候補抗体と接触させるステップ、および(b)候補抗体の抗原への結合を検出するステップを含む方法を提供する。代替の実施形態では、候補抗体が固定化され、抗原の結合が検出される。固定化は、支持体、ビーズ、もしくはクロマトグラフィー用樹脂への共有結合ならびに抗体結合などの非共有、高親和性の相互作用、または固定化された化合物がビオチン部分を含むストレプトアビジン/ビオチン結合の使用を含む当技術で周知の方法のいずれかを使用して達成される。結合の検出は、(i)固定化されていない化合物上の放射活性標識を使用して、(ii)固定化されていない化合物上の蛍光標識を使用して、(iii)固定化されていない化合物に対して免疫特異性の抗体を使用して、(iv)固定化された化合物が結合されている蛍光支持体を励起する固定化されていない化合物上の標識を使用して、ならびに当技術において周知で通常実施されている他の技術を使用して、達成することができる。
[00594]所望の標的の活性または発現をモジュレート(即ち増大、低減、またはブロック)する抗体は、想定されるモジュレーターを所望の標的を発現している細胞とインキュベートし、標的の活性または発現に対する想定されるモジュレーターの効果を判定することによって同定され得る。標的ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性をモジュレートする抗体の選択性は、標的ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対するその効果を、他の関連する化合物に対するその効果と比較することによって、評価することができる。選択的なモジュレーターは、たとえば抗体およびその他のタンパク質、ペプチド、または標的ポリペプチドもしくは標的ポリペプチドをコードする核酸に特異的に結合する有機分子を含み得る。標的活性のモジュレーターは、標的ポリペプチドの正常なまたは異常な活性が関与する疾患および生理学的病態の処置において治療のために有用である。標的は、たとえばがん関連抗原であり得るが、それだけに限定されない。
[00595]本発明はまた、抗原と相互作用し、または抗原の生物活性を阻害する(即ち酵素活性、結合活性、その他を阻害する)抗体を同定するための高スループットスクリーニング(HTS)アッセイを包含する。HTSアッセイにより、多数の化合物を効率的にスクリーニングすることが可能になる。細胞系HTSシステムは、抗体とその標的抗原および結合パートナーとの間の相互作用を検討するために意図される。HTSアッセイは所望の特性を有する「ヒット」または「リード化合物」を同定するように設計され、これらから所望の特性を改善するように改変を設計することができる。「ヒット」または「リード化合物」の化学的改変は、「ヒット」と標的抗原との間の同定可能な構造/活性の関係に基づくことが多い。
[00596]本発明の別の態様は、標的抗原を抗体と接触させて、抗体が抗原の活性を改変するか否かを判定するステップを含む、標的抗原の活性をモジュレートする(即ち低減させる)抗体を同定する方法を指向している。試験抗体の存在下における活性は、試験抗体の非存在下における活性と比較される。試験抗体を含む試料の活性が試験抗体を含まない試料における活性より低ければ、抗体は活性を阻害したことになる。
[00597]当業者には周知の組換えポリペプチドの機能発現のために種々の異種系が利用可能である。そのような系は、細菌(Strosberg, et al., Trends in Pharmacological Sciences (1992) 13:95-98)、酵母(Pausch, Trends in Biotechnology (1997) 15:487-494)、数種類の昆虫細胞(Vanden Broeck, Int. Rev. Cytology (1996) 164:189-268)、両生類細胞(Jayawickreme et al., Current Opinion in Biotechnology (1997) 8: 629-634)、およびいくつかの哺乳動物細胞系(CHO、HEK293、COS、その他、Gerhardt, et al., Eur. J. Pharmacology (1997) 334:1-23を参照)を含む。これらの例は、線虫から得られた細胞系(PCT出願WO98/37177)を含むその他の可能な細胞発現系の使用を排除しない。
[00598]本発明の一実施形態では、標的抗原の活性をモジュレートする抗体をスクリーニングする方法は、抗体を標的抗原のポリペプチドと接触させて、抗体と標的抗原との間の複合体の存在をアッセイするステップを含む。そのようなアッセイでは、リガンドは典型的には標識される。好適なインキュベーションの後、遊離のリガンドは結合した形態で存在するものから分離され、遊離のまたは複合体化していない標識の量が、特定の抗体が標的抗原に結合する能力の尺度となる。
[00599]本開示は、標的抗原を同定し特徴付けるためのHTSの使用を包含する。HTSはタンパク質アレイ(たとえば抗体アレイ、抗体マイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ)であり得る。アレイは、固体支持体上に固定化された本明細書で開示した1つもしくは複数の抗体またはその抗原結合性断片を含み得る。そのようなアレイを生成し使用する方法は当技術で周知である(たとえばBuessow et al., 1998、Lueking et al., 2003、Angenendt et al., 2002, 2003 a,b, 2004a, 2004b, 2006)。一部の実施形態では、極少量(たとえば1〜500μg)の抗体またはその抗原結合性断片が固定化される。一部の実施形態では、1μg〜100μg、1μg〜50μg、1μg〜20μg、3μg〜100μg、3μg〜50μg、3μg〜20μg、5μg〜100μg、5μg〜50μg、5μg〜20μgの抗体が単一試料中に存在することになる。一態様では、複数の試料中の少なくとも1つの試料が1μg〜100μg、1μg〜50μg、1μg〜20μg、3μg〜100μg、3μg〜50μg、3μg〜20μg、5μg〜100μg、5μg〜50μg、5μg〜20μgで存在する抗体を有することになる。固体支持体は、抗体が直接または間接的に可逆的に結合することができ、それによりその抗体を望ましくない材料、たとえば過剰の試薬、夾雑物、および溶媒から分離することを可能にする不溶性の官能化材料を指す。固体支持体の例は、たとえば官能化されたポリマー材料、たとえばアガロースもしくはそのビーズ形態のセファロース(登録商標)、デキストラン、ポリスチレンおよびポリプロピレン、またはそれらの混合物、微小流体チャネル構造を含むコンパクトディスク、タンパク質アレイチップ、ピペットチップ、膜、たとえばニトロセルロースもしくはPVDF膜、ならびに微粒子、たとえば常磁性もしくは非常磁性のビーズを含む。一部の実施形態では、親和性媒体が固体支持体に結合され、抗体は親和性媒体を介して間接的に固体支持体に結合されることになる。一態様では、固体支持体はプロテインA親和性媒体またはプロテインG親和性媒体を含む。「プロテインA親和性媒体」および「プロテインG親和性媒体」は、それぞれプロテインAもしくはプロテインGのFc結合ドメイン、またはそれぞれプロテインAもしくはプロテインGのFc結合ドメインの変異したバリアントまたは断片を含む天然または合成のタンパク質がその上に結合した固相をそれぞれ指し、そのバリアントまたは断片は抗体のFc部分の親和性を保持している。抗体アレイは、組織化された高密度フォーマットで固体表面上に抗体を移送し、続いて化学的に固定化することによって作製することができる。アレイの作製のための代表的な手法は、光リソグラフィー、インクジェットおよび接触印刷、液体吐出、ならびにピエゾ電気を含む。抗体アレイのパターンおよび寸法は、それぞれの特定の用途によって決定すべきである。それぞれの抗体スポットの寸法は使用者によって容易に制御され得る。抗体は拡散、吸着/吸収、または共有架橋および親和性を介して種々の種類の表面に結合され得る。抗体は平坦なガラス表面上に直接スポットされ得る。印刷プロセスの間に抗体を湿潤環境中に保持するために、試料緩衝液中で高パーセント(たとえば30〜40%)のグリセロールを使用してよく、湿度を制御した環境中でスポッティングを実施する。
[00600]より良い結合容量を達成するために基材の表面が改質され得る。たとえば、ガラス表面を薄いニトロセルロース膜またはポリ−L−リシンでコートし、それにより改質した表面に抗体を非特異的相互作用によって受動的に吸着させることができる。抗体は共有結合または非共有結合による化学的ライゲーションによって支持体表面に固定化され得る。抗体を固体支持体上に共有結合によって固定化するために多くの公知の方法がある。たとえば、MacBeath et al., (1999) J. Am. Chem. Soc. 121:7967-7968)らはマイケル付加を使用して、チオール含有化合物をマレイミド誘導ガラススライドに連結し、小分子のマイクロアレイを形成している。また、Lam & Renil (2002) Current Opin. Chemical Biol. 6:353-358を参照されたい。潜在的な抗原が特定の型のがんに関連しているかに応じて、さらなるバイオマーカーに特異的な抗体が抗体アレイに含まれ得る。バイオマーカーの代表的な例は、TROP/TNFRSF19、IL−1 sRI、uPAR、IL−10、VCAM−1(CD106)、IL−10受容体−β、VE−カドヘリン、IL−13受容体−α1、VEGF、IL−13受容体−α2、VEGF R2(KDR)、IL−17、VEGF R3を含む。
[00601]アレイは、単一抗体(標識ベース)検出または2抗体(サンドイッチ系)検出を採用することができる。一部の実施形態では、以下の標準的な手法に従う(抗体サンドイッチアッセイとしても公知である)ELISAを実施し得る。固体支持体上に配置された(たとえばその上にコートされた)抗原に対する捕捉抗体として使用される抗体は次に少なくとも1回、(たとえば水および/またはPBS−tなどの緩衝液によって)洗浄され、次に標準的なブロッキング緩衝液で洗浄され、次いで少なくとももう1回洗浄される。次いで固体支持体は抗体−抗原複合体を形成させる条件で(たとえば約4℃〜約室温の温度で1時間〜約24時間インキュベートする)試料/生体試料と接触させられる。本明細書で使用される場合、「生体試料」および「試料」は相互交換可能に使用され、対象から得られる流体(本明細書で流体試料および生体流体とも称される)および組織を包含する。本明細書で使用される用語「生体流体」は、血液試料、脳脊髄液(CSF)、尿、および対象から得られるその他の液体などの生物学的流体試料、または細胞成分が溶解して細胞内容物を緩衝液またはその他の液体媒体中に放出しているそれらの流体の可溶化された調製物を指す。その定義は、その入手の後で試薬による処置、またはタンパク質もしくはポリヌクレオチドなどのある種の成分の富化などの何らかの方法で操作された試料をも含む。用語「血液試料」は、全血、血漿、および血清を包含する。固体組織試料は、生検検体および組織培養またはそれから誘導された細胞、ならびにそれらの子孫を含む。試料は単一細胞または単一を超える細胞を含み得る。生体試料は対象のヒトまたは動物から誘導された培養細胞の集団であってもよい。しかし、生体試料が細胞集団を含むときは常に、本方法は最初に細胞を溶解することによって細胞成分を可溶化して固体状の細胞デブリを除去し、それによりバイオマーカーの溶液を準備することを必要とする。試料は、溶解、分別、親和性精製を含む精製、FACS、レーザー捕捉顕微解剖、または等密度遠心法などの当技術で公知の方法によって調製することができる。次いで支持体を少なくとも1回(たとえばPBS−tなどの緩衝液で)洗浄してよい。捕捉抗体と試料中に存在し得る抗原との間の複合体生成を検出するために、二次抗体とそれぞれのバイオマーカーとの間の複合体形成を可能にする条件(たとえば室温で少なくとも1時間)で、二次抗体または「検出」抗体を(たとえばブロッキング緩衝液で希釈された)固体支持体に加える。二次抗体は、抗原上の捕捉抗体とは異なるエピトープに結合するように選択される。捕捉および検出抗体の最適濃度は、「クリス−クロス」希釈法などの標準的な手法を使用して決定される。検出抗体は直接または間接的に、検出可能な標識にコンジュゲートされ得る。
[00602]本明細書で使用される用語「検出可能な標識」は、当技術で公知の標識部分を指す。前記部分は、たとえば放射標識(たとえば3H、125I、35S、14C、32P、その他)、検出可能な酵素(たとえばセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ、その他)、色素(たとえば蛍光色素)、金コロイドまたは着色したガラスもしくはプラスチック(たとえばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス、その他)などの比色標識、ビーズ、または比色、蛍光、化学発光、もしくは電気化学発光(ECL)シグナルなどの検出可能なシグナルを生成することができる任意の他の部分であってよい。本明細書で使用される用語「色素」は、その存在がその吸光特性または発光特性によって検出され得る任意のレポーター群を指す。たとえば、Cy5はシアニン色素ファミリーの反応性水溶性蛍光色素である。Cy5は赤色領域(約650〜約670nm)で蛍光性である。これは窒素側鎖の一方または両方に反応性基を有するように合成することができ、それによりこれらを核酸またはタンパク質の分子に化学的に連結することができる。標識は可視化および定量の目的のために行なわれる。Cy5は約649nmで最大励起されて、スペクトルの遠赤部分である約670nmで最大発光し、量子収率は0.28(FW=792)である。本開示のプローブのために適した蛍光分子(クロム)は、それだけに限定することを意図していないが、フルオレセインイソチオシアネート(FITC、緑色)、シアニン色素Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、Cy7.5(緑色〜近赤外の範囲)、テキサスレッド、その他から選択することができる。本開示の実施形態における使用のためのこれらの色素の誘導体としては、それだけに限らないが、Cy色素(Amersham Bioscience社)、Alexa Fluors(Molecular Probes Inc.社)、HILYTE(商標)Fluors(AnaSpec社)、およびDYLITE(商標)Fluors(Pierce,Inc社)があり得る。一部の実施形態では、検出可能な標識はビオチンなどの発色性標識であり、この場合には検出抗体−ビオチンコンジュゲートはストレプトアビジン/セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)またはその等価物を使用して検出される。ストレプトアビジンは適切なブロックで希釈され、室温で30分インキュベートされ得る。本発明における使用に適したその他の検出可能な標識は、蛍光標識および化学発光標識を含む。
[00603]次いで支持体が洗浄され、以下の発色システム(SIGMA FAST(商標)OPDシステム)、蛍光システム、または化学発光システムなどの標準的なプロトコールを使用して標識(たとえばストレプトアビジン上のHRP酵素コンジュゲート)が検出される。次いで試料中に存在する抗原の量がELISAプレートリーダー(たとえばSpectraMax384または等価物)で読み取られる。次いで抗原のそれぞれの濃度が(たとえば精製された抗原から生成した標準曲線を用い、標準的な曲線適合法に従って希釈倍率をかけることによって)逆算され、次いで(健常な対象から得られた組織試料から生成された)対照と比較され得る。
[00604]一実施形態では、生体試料、たとえば生体流体は、試料の構成成分の一部または全てに、特にバイオマーカーを含むそのタンパク質またはペプチド成分にビオチン部分を結合させることができる当技術で周知の試薬のシステムと接触させられる。このビオチニル化ステップに続いて、ビオチニル化された生体試料は、次に抗原のそれぞれに特異的な抗体のアレイを含む抗体アレイと接触させられる。
[00605]試料中に抗原があればそれがアレイの対応する抗体と結合することを可能にするように容易に選択される適切なインキュベーション期間の後、流体試料はアレイから洗浄される。次いでアレイは、(ELISAに関連して上述した)検出可能な標識にコンジュゲートしたアビジンまたはストレプトアビジンなどのビオチン結合ポリペプチドと接触させられる。(対照に対する)アレイ上の標識の検出は、それぞれの抗体によって捕捉されたバイオマーカーのうちいずれが試料中に存在するかを指示することになる。
[00606]特定のアッセイフォーマットに関わらず、ビオチン標識に基づくアレイ方法はいくつかの見地から比較的有利である。ビオチン標識はシグナルの増幅として使用することができる。ビオチンはタンパク質を標識するための最も一般的な方法であり、標識プロセスは極めて効率的であり得る。さらに、ビオチンは蛍光ストレプトアビジンを使用して検出することができ、したがってレーザースキャナーまたは化学発光を用いるHRP−ストレプトアビジンを介して可視化することができる。ビオチン標識に基づく抗体アレイを使用して、大部分の標的タンパク質をpg/mlのレベルで検出することができる。本方法の検出感度は3−DNA検出技術またはローリングサークル増幅を用いることによってさらに向上させることができる(Schweitzer et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:10113-10119、Horie et al., (1996) Int. J. Hematol. 63:303-309)。
[00607]本開示に関しては、試料は疾患(たとえばがん)を有する対象および健常な対象から得ることができる。
[00608]一部の実施形態では、公知の同一性を有するタンパク質抗原が捕捉分子として固体支持体上に固定化され、公知の抗原が候補抗体に結合するか否かを判定しようとする場合に、タンパク質アレイを使用することができる。固定化された抗体によって捕捉した後に検出または免疫沈降を可能にするタグによって抗原を標識することができる。タンパク質抗原は、たとえばがん患者またはがん細胞から得ることができる。いくつかの市販のタンパク質アレイ、たとえばProtoArray(登録商標)、Kinex(商標)、RayBio(登録商標)Human RTK Phosphorylation Antibody Arrayが利用可能である。抗体−抗原複合体は当技術で公知の方法(たとえば免疫沈降またはウェスタンブロット)によって得ることができる。本研究において目的となり得るタンパク質アレイおよび抗体アレイに関する総説については、Reymond Sutandy, et al.. 2013、Liu, B. C.-S., et al. 2012; Haab BB, 2005を参照されたい。
[00609]例示的な免疫沈降法では、抗原を含む試料に本明細書に記載した抗体またはその抗原結合性断片を最初に添加し、インキュベートして、抗原−抗体複合体を形成させる。続いて、抗原−抗体複合体をプロテインA/Gコートビーズと混合して、ビーズに複合体を吸収させる。改変したアプローチでは、抗体またはその抗原結合性断片を組換えDNA手法によってHisタグまたはその他のタグ(たとえばFLAGタグ、ビオチンタグ)と融合させ、タグに対する抗体を使用して免疫沈降させる(プルダウンアッセイ)。次いでビーズを完全に洗浄し、酸性溶液またはSDSによってビーズから抗原を溶出させる。溶出した試料を質量分析またはSDSpageを使用して分析し、抗原を同定し確認することができる。タンパク質マイクロアレイ上で形成された抗体−抗原複合体を分析して質量分析によって抗原を同定する方法は公知である。
[00610]一態様では、本明細書で開示した抗体またはその抗原結合性断片は、がんの治療のための治療用抗体として意図されている。したがって、抗体またはその抗原結合性断片は、抗体依存性細胞媒介細胞傷害(ADCC)アッセイおよび/または補体依存性細胞傷害(CDC)アッセイにおいてさらにスクリーニングすることができる。「ADCC活性」は、ADCC反応を誘発する抗体の能力を指す。ADCCはFcRを発現する抗原非特異的細胞傷害性細胞(たとえばナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、およびマクロファージ)が標的細胞の表面に結合した抗体を認識し、続いて標的細胞(たとえばがん細胞)の溶解を惹起する(即ち「殺す」)細胞媒介反応である。一次メディエーター細胞はナチュラルキラー(NK)細胞である。NK細胞はFcγRIIIのみを発現し、FcγRIIIAは活性化受容体であり、FcγRIIIBは阻害性受容体である。単球はFcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIを発現する(Ravetch et al. (1991) Annu. Rev. Immunol., 9:457-92)。ADCC活性はin vitroアッセイ、たとえば実施例およびShields et al. (2001) J. Biol. Chem., 276:6591-6604に記載された末梢血単核細胞(PBMC)および/もしくはNKエフェクター細胞を使用する51Cr放出アッセイ、または当技術で公知の別の好適な方法を用いて直接評価することができる。ADCC活性は標的細胞の溶解が最大値の半分になる抗体の濃度として表わし得る。したがって、一部の実施形態では、溶解レベルが野生型対照による最大半値の溶解レベルと同じになる本開示の抗体またはその抗原結合性断片の濃度は、野生型対照それ自体の濃度の2分の1、3分の1、5分の1、10分の1、20分の1、50分の1、100分の1以下である。
[00611]さらに、一部の実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、野生型対照と比較してより高い最大標的細胞溶解を示し得る。たとえば、本発明の抗体またはFc融合タンパク質の最大標的細胞溶解は、野生型対照のそれより10%、15%、20%、25%、またはそれ以上高くてよい。「補体依存性細胞傷害」または「CDC」は、補体の存在下において標的(たとえばがん細胞)を溶解する分子の能力を指す。補体活性化の経路は、コグネート関連抗原と複合体を形成した分子(たとえば抗体)への補体系の第1成分(C1q)の結合によって開始される。補体の活性化を評価するため、たとえばGazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されたCDCアッセイが実施され得る。
エピトープマッピング
[00612]用語「エピトープ」は、本明細書で使用される場合、パラトープとして公知の抗体分子の可変領域における特定の抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は2つ以上のエピトープを有し得る。したがって、異なる抗体は抗原の異なる区域に結合することができ、異なる生物学的効果を有し得る。エピトープはコンフォメーショナルでも、線状でもあり得る。コンフォメーショナルなエピトープは、線状のポリペプチド鎖の異なるセグメントから空間的に並置されたアミノ酸によって生成される。線状エピトープはポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基によって生成されるエピトープである。ある特定の状況では、エピトープは抗原上の糖類、ホスホリル基、またはスルホニル基の部分を含み得る。
[00613]当業者には公知の種々の手法を用いて、抗体の抗原結合ドメインがポリペプチドまたはタンパク質中の「1つまたは複数のアミノ酸と相互作用する」か否かを判定することができる。例示的な手法は、たとえばAntibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY)に記載されている日常的な交差ブロックアッセイ、アラニンスキャンニング変異解析、ペプチドブロット解析(Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463)、およびペプチド切断解析を含む。さらに、エピトープ切除、エピトープ抽出、および抗原の化学的改変などの方法を採用することができる(Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496)。抗体の抗原結合ドメインが相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために使用することができる別の方法は、質量分析によって検出される水素/重水素交換である。一般論としては、水素/重水素交換法は目的のタンパク質の重水素標識およびそれに続く重水素標識タンパク質への抗体の結合を含む。次にタンパク質/抗体複合体を水に移して、抗体によって保護された残基(これは重水素標識されたままである)を除く全ての残基において水素−重水素交換を起こさせる。抗体を解離した後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断および質量分析に供し、それによって重水素標識残基を明示する。これは抗体が相互作用する特異的アミノ酸に対応する。たとえばEhring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259、Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265Aを参照されたい。抗原/抗体複合体のX線結晶解析もエピトープマッピングの目的に使用され得る。
[00614]本明細書で開示した抗体または抗原結合性断片が結合する抗原上のエピトープは、抗原の3つまたはそれを超える(たとえば3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれを超える)アミノ酸の単一の連続した配列からなり得る。あるいは、エピトープは抗原の複数の非連続なアミノ酸(またはアミノ酸配列)からなり得る。
抗原
[00615]一部の実施形態では、本明細書で開示した抗体またはその抗原結合性断片は、がん関連抗原を指向している。一部の実施形態では、がん関連抗原は腫瘍抗原、即ち腫瘍細胞中で発現され、細胞原形質、細胞表面、または細胞核から誘導され得るタンパク質またはペプチド、特に主として細胞内で、または腫瘍細胞の表面抗原として生じるタンパク質またはペプチドなどの腫瘍細胞の一部である。たとえば、腫瘍抗原は癌胎児性抗原、α1−フェトプロテイン、イソフェリチン、ならびに胎児性スルホ糖タンパク質、α2−H−フェロプロテインおよびγ−フェロプロテインを含む。本明細書で使用される用語「がん関連抗原」は、がんに関連し得る(たとえばがん細胞中で産生されもしくは過発現され、またはがんに関連することが当技術で公知である)任意の型のがん抗原であってよく、腫瘍細胞を含む細胞表面に見出される抗原ならびに可溶性がん抗原を含む。腫瘍および正常細胞の上のいくつかの細胞表面抗原は、可溶性の対応物を有している。がん関連抗原は、細胞表面抗原または腫瘍の微小環境内もしくはそれ以外に処置される腫瘍のごく近傍に存在する可溶性がん抗原であってよい。そのような抗原は、がん関連線維芽細胞(CAF)、腫瘍内皮細胞(TEC)、および腫瘍関連マクロファージ(TAM)の上で見出される抗原を含むが、これらに限定されない。がん関連線維芽細胞(CAF)標的抗原の例は、炭酸脱水素酵素IX(CAIX)、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ(FAPα)、ならびにMMP−2およびMMP−9を含むマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)を含むが、これらに限定されない。腫瘍内皮細胞(TEC)標的抗原の例は、VEGFR−1、2、および3を含む血管内皮増殖因子(VEGF)、CD−105(エンドグリン)、TEM1およびTEM8を含む腫瘍内皮マーカー(TEM)、MMP−2、サービビン、ならびに前立腺特異的膜抗原(PMSA)を含むが、これらに限定されない。腫瘍関連マクロファージ抗原の例は、CD105、MMP−9、VEGFR−1、2、3、およびTEM−8を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、がん関連抗原に特異的ながん関連抗体は、非腫瘍細胞上に位置するがん抗原、たとえばVEGFR−2、MMP、サービビン、TEM8、およびPMSAに特異的であり得る。がん関連抗原は、上皮がん抗原(たとえば乳房、胃腸、肺)、前立腺特異的がん抗原(PSA)もしくは前立腺特異的膜抗原(PSMA)、膀胱がん抗原、肺(たとえば小細胞肺)がん抗原、結腸がん抗原、卵巣がん抗原、脳がん抗原、胃がん抗原、腎細胞癌抗原、膵がん抗原、肝がん抗原、食道がん抗原、または頭頚部がん抗原であり得る。がん抗原はまた、リンパ腫抗原(たとえば非ホジキンリンパ腫またはホジキンリンパ腫)、B細胞リンパ腫がん抗原、白血病抗原、骨髄腫(即ち多発性骨髄腫または原形質細胞骨髄腫)抗原、急性リンパ芽球性白血病抗原、慢性骨髄性白血病抗原、または急性骨髄性白血病抗原であり得る。本発明によれば、がん関連抗原は、好ましくは腫瘍もしくはがんならびに腫瘍細胞もしくはがん細胞の中で、必要に応じてそれらの型および/または発現レベルに関連する特徴を有して発現される任意の抗原を含む。一実施形態では、用語「腫瘍抗原」または「腫瘍関連抗原」または「がん抗原」または「がん関連抗原」は、正常な条件下で、限られた数の組織および/または臓器の中でまたは特定の発達段階において特異的に発現されるタンパク質を指し、たとえばがん関連抗原は正常な条件下で胃の組織、好ましくは胃粘膜で、生殖器官、たとえば精巣で、栄養膜組織、たとえば胎盤で、または生殖細胞系列の細胞で特異的に発現され、1つもしくは複数の腫瘍またはがん組織で発現されまたは異常に発現され得る。これに関して「限られた数」は、好ましくは3を超えず、より好ましくは2を超えない数を意味する。本発明の文脈におけるがん関連抗原は、たとえば分化抗原、好ましくは細胞型特異的分化抗原、即ちある分化の段階におけるある細胞型で、正常な条件下で特異的に発現されるタンパク質、がん/精巣抗原、即ち精巣および時には胎盤で、正常な条件下で特異的に発現されるタンパク質、ならびに生殖細胞系列特異的抗原を含む。好ましくは、がん関連抗原またはがん関連抗原の異常な発現によって、がん細胞が同定される。本発明の文脈において、対象、たとえばがん疾患に罹患している患者においてがん細胞によって発現されるがん関連抗原は、好ましくは前記対象の自己タンパク質である。好ましい実施形態では、本発明の文脈におけるがん関連抗原は、正常な条件下で、必須でない組織または臓器、即ち免疫系によって損傷を受けた場合に対象の死をもたらさない組織または臓器、または免疫系によってアクセスされないもしくは容易にアクセスされない臓器もしくは身体の構造において特異的に発現される。「がん関連抗原」は、本明細書で使用される場合、腫瘍細胞中で産生されまたは過発現される任意の抗原性物質であってよい。これは、たとえば宿主中で免疫応答を誘発し得る。あるいは、本開示の目的のため、がん関連抗原は健常細胞および腫瘍細胞の両方によって発現されるタンパク質であってよいが、これらはある種の腫瘍の型を同定するので、これらは好適な治療標的となり得る。がん関連抗原の非限定的な例としては、CD19、CD20、CD30、CD33、CD38、Her2/neu、ERBB2、CA125、MUC−1、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、CD44表面接着分子、メソテリン、癌胎児性抗原(CEA)、上皮増殖因子受容体(EGFR)、EGFRvIII、血管内皮増殖因子受容体−2(VEGFR2)、高分子量黒色腫関連抗原(HMW−MAA)、MAGE−A1、IL−13R−a2、GD2、またはそれらの任意の組み合わせである。一部の実施形態では、がん関連抗原は、1p19q、ABL1、AKT1、ALK、APC、AR、ATM、BRAF、BRCA1、BRCA2、cKIT、cMET、CSF1R、CTNNB1、EGFR、EGFRvIII、ER、ERBB2(HER2)、FGFR1、FGFR2、FLT3、GNA11、GNAQ、GNAS、HER2、HRAS、IDH1、IDH2、JAK2、KDR(VEGFR2)、KRAS、MGMT、MGMT−Me、MLH1、MPL、NOTCH1、NRAS、PDGFRA、Pgp、PIK3CA、PR、PTEN、RET、RRM1、SMO、SPARC、TLE3、TOP2A、TOPO1、TP53、TS、TUBB3、VHL、CDH1、ERBB4、FBXW7、HNF1A、JAK3、NPM1、PTPN11、RB1、SMAD4、SMARCB1、STK1、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、マイクロサテライトインスタビリティ(MSI)、ROS1、ERCC1、またはそれらの任意の組み合わせである。本発明によれば、用語「がん関連抗原」、「腫瘍抗原」、「腫瘍発現抗原」、「がん抗原」、「がん関連抗原」、および「がん発現抗原」は等価であり、本明細書において相互交換可能に用いられる。
イノシトールポリリン酸5−ホスファターゼ1(SHIP1)を含むSrcホモロジー2(SH2)ドメイン
[00616]一部の実施形態では、本明細書で開示した抗体またはその抗原結合性断片は、イノシトールポリリン酸5−ホスファターゼ1(SHIP1)ポリペプチドを含むSrcホモロジー2(SH2)ドメインに結合する。用語「SHIP1」は、本明細書で使用される場合、任意の天然のまたは(天然であろうと合成であろうと)バリアントのSHIP1ポリペプチドを指す。用語「天然の配列」は、具体的には、天然に存在する切断されもしくは分泌された形態(たとえば細胞外ドメイン配列)、天然に存在するバリアントの形態(あるいはスプライスされた形態)、および天然に存在する対立遺伝子バリアントを包含する。SHIP1はホスファターゼ活性を有する酵素である。SHIP1は多数のドメインによって構成されており、Sandra Fernandes et al. Ann N Y Acad Sci. 2013 Mar; 1280(1): 6-10によって記述されているようにヒトのINPP5D遺伝子によってコードされている。本明細書で使用される用語「SHIP1」は、天然に存在する対立遺伝子およびそのプロセシングされた形態を伴う1189アミノ酸ポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、用語「SHIP1」は、全長のSHIP1ポリペプチドまたはその断片もしくは誘導体を指す。SHIP1ポリペプチドは、全長のヒトFGF1および/またはその機能性断片、種ホモログおよび/またはその機能性断片、ヒトSHIP1のオルソログおよび/またはその機能性断片であり得る。SHIP1ポリペプチドは哺乳動物のSHIP1ポリペプチドであり得る。SHIP1ポリペプチドは全長のSHIP1の機能性アイソフォームまたはその断片であってもよい。
[00617]一部の実施形態では、SHIP1ポリペプチドは、配列番号281の以下のアミノ酸配列(その全体が本明細書に組み込まれるNCBI参照配列番号NP_001017915.1)を有するヒトSHIP1を含みまたはこれから誘導される。SHIP1ならびにヒト由来およびいくつかの動物のファミリーの他のメンバーのポリペプチドおよびコードする核酸配列は、たとえばNCBIのウェブサイトから公に利用可能である。用語「SHIP1」は、マウス(たとえばNCBI:NP_034696.2、配列番号282)、ラット(たとえばNCBI ref:NP_062184.1、配列番号283)、ウシ(たとえばNCBI NP_001095352.1、配列番号284)、またはサル(たとえばEHH21775.1、配列番号285)などの非ヒト種からのSHIP1をも指す。
[00618]用語「SHIP1」は、1189アミノ酸のヒトSHIP1の切断された形態を指すためにも使用される。本明細書で使用される用語「SHIP1バリアント」は、天然のSHIP1配列中の1つまたは複数のアミノ酸突然変異を含むSHIP1ポリペプチドを指す。必要に応じて、1つまたは複数のアミノ酸突然変異は、アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、本明細書で開示した抗体またはその抗原結合性断片の少なくとも1つは、SHIP1に結合する。一部の実施形態では、SHIP1に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号85の相補性決定領域重鎖1(CDR−H1)、配列番号57のCDR−H2、および配列番号29のCDR−H3を含む。一部の実施形態では、SHIP1に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号99の相補性決定領域軽鎖1(CDR−L1)、配列番号71のCDR−L2、および配列番号43のCDR−L3を含む。一部の実施形態では、SHIP1に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む可変重鎖を含む。一部の実施形態では、SHIP1に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含む可変軽鎖を含む。
クロモボックスホモログ1
[00619]一部の実施形態では、本明細書で開示した抗体またはその抗原結合性断片は、クロモボックスタンパク質ホモログ1(CBX1)ポリペプチドに結合する。本明細書で使用される用語「CBX1」は、任意の天然のまたは(天然であろうと合成であろうと)バリアントのCBX1を指す。用語「天然の配列」は、具体的には、天然に存在する切断されもしくは分泌された形態(たとえば細胞外ドメイン配列)、天然に存在するバリアントの形態(あるいはスプライスされた形態)、および天然に存在する対立遺伝子バリアントを包含する。CBX1はタンパク質のHP1ファミリーに属し、lombrek et al. Genome Biology volume 7, Article number: 228 (2006)に記載されているように、ヘテロクロマチンに局在化していることが公知である。本明細書で使用される用語「CBX1」は、天然に存在する対立遺伝子およびそのプロセシングされた形態を伴う185アミノ酸ポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、用語「CBX1」は、全長のCBX1ポリペプチドまたはその断片もしくは誘導体を指す。CBX1ポリペプチドは、全長のヒトCBX1および/またはその機能性断片、種ホモログおよび/またはその機能性断片、ヒトCBX1のオルソログおよび/またはその機能性断片であり得る。CBX1ポリペプチドは哺乳動物のCBX1ポリペプチドであり得る。CBX1ポリペプチドは全長のCBX1の機能性アイソフォームまたはその断片であってもよい。
[00620]一部の実施形態では、CBX1ポリペプチドは、配列番号286の以下のアミノ酸配列(その全体が本明細書に組み込まれるNCBI参照配列番号NP_001120700.1)を有するヒトCBX1を含みまたはこれから誘導される。CBX1ならびにヒト由来およびいくつかの動物のファミリーの他のメンバーのポリペプチドおよびコードする核酸配列は、たとえばNCBIのウェブサイトから公に利用可能である。用語「CBX1」は、マウス(たとえばNCBI:NP_001349489.1、配列番号287)、ラット(たとえばNCBI ref:NP_001008314.2、配列番号288)、ウシ(たとえばNCBI NP_001193344.1、配列番号289)、またはサル(たとえばAFH30900.1、配列番号290)などの非ヒト種からのCBX1をも指す。
[00621]用語「CBX1」は、185アミノ酸のヒトCBX1の切断された形態を指すためにも使用される。本明細書で使用される用語「CBX1バリアント」は、天然のCBX1配列中の1つまたは複数のアミノ酸突然変異を含むCBX1ポリペプチドを指す。必要に応じて、1つまたは複数のアミノ酸突然変異は、アミノ酸置換を含む。
クロモボックスホモログ3
[00622]一部の実施形態では、本明細書で開示した抗体またはその抗原結合性断片は、クロモボックスタンパク質ホモログ3(CBX3)ポリペプチドに結合する。本明細書で使用される用語「CBX3」は、任意の天然のまたは(天然であろうと合成であろうと)バリアントのCBX3を指す。用語「天然の配列」は、具体的には、天然に存在する切断されもしくは分泌された形態(たとえば細胞外ドメイン配列)、天然に存在するバリアントの形態(あるいはスプライスされた形態)、および天然に存在する対立遺伝子バリアントを包含する。CBX3はタンパク質のHP1ファミリーに属し、lombrek et al. Genome Biology volume 7, Article number: 228 (2006)に記載されているように、ヘテロクロマチンに局在化していることが公知である。本明細書で使用される用語「CBX3」は、天然に存在する対立遺伝子およびそのプロセシングされた形態を伴う183アミノ酸ポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、用語「CBX3」は、全長のCBX3ポリペプチドまたはその断片もしくは誘導体を指す。CBX3ポリペプチドは、全長のヒトCBX3および/またはその機能性断片、種ホモログおよび/またはその機能性断片、ヒトCBX3のオルソログおよび/またはその機能性断片であり得る。CBX3ポリペプチドは哺乳動物のCBX3ポリペプチドであり得る。CBX3ポリペプチドは全長のCBX3の機能性アイソフォームまたはその断片であってもよい。
[00623]一部の実施形態では、CBX3ポリペプチドは、配列番号291の以下のアミノ酸配列(その全体が本明細書に組み込まれるNCBI参照配列番号NP_009207.2)を有するヒトCBX3を含みまたはこれから誘導される。CBX3ならびにヒト由来およびいくつかの動物のファミリーの他のメンバーのポリペプチドおよびコードする核酸配列は、たとえばNCBIのウェブサイトから公に利用可能である。用語「CBX3」は、マウス(たとえばNCBI:AAH59831.1、配列番号292)、ラット(たとえばNCBI ref:NP_001008314.2、配列番号293)、ウシ(たとえばNCBI AAI47956.1、配列番号294)、またはサル(たとえばNP_001180536.1、配列番号295)などの非ヒト種からのCBX3をも指す。
[00624]用語「CBX3」は、183アミノ酸のヒトCBX3の切断された形態を指すためにも使用される。本明細書で使用される用語「CBX3バリアント」は、天然のCBX3配列中の1つまたは複数のアミノ酸突然変異を含むCBX3ポリペプチドを指す。必要に応じて、1つまたは複数のアミノ酸突然変異は、アミノ酸置換を含む。
クロモボックスホモログ5
[00625]一部の実施形態では、本明細書で開示した抗体またはその抗原結合性断片は、クロモボックスタンパク質ホモログ5(CBX5)ポリペプチドに結合する。本明細書で使用される用語「CBX5」は、任意の天然のまたは(天然であろうと合成であろうと)バリアントのCBX5を指す。用語「天然の配列」は、具体的には、天然に存在する切断されもしくは分泌された形態(たとえば細胞外ドメイン配列)、天然に存在するバリアントの形態(あるいはスプライスされた形態)、および天然に存在する対立遺伝子バリアントを包含する。CBX5はタンパク質のHP1ファミリーに属し、lombrek et al. Genome Biology volume 7, Article number: 228 (2006)に記載されているように、ヘテロクロマチンに局在化していることが公知である。本明細書で使用される用語「CBX5」は、天然に存在する対立遺伝子およびそのプロセシングされた形態を伴う191アミノ酸ポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、用語「CBX5」は、全長のCBX5ポリペプチドまたはその断片もしくは誘導体を指す。CBX5ポリペプチドは、全長のヒトCBX5および/またはその機能性断片、種ホモログおよび/またはその機能性断片、ヒトCBX5のオルソログおよび/またはその機能性断片であり得る。CBX5ポリペプチドは哺乳動物のCBX5ポリペプチドであり得る。CBX5ポリペプチドは全長のCBX5の機能性アイソフォームまたはその断片であってもよい。
[00626]一部の実施形態では、CBX5ポリペプチドは、配列番号296の以下のアミノ酸配列(その全体が本明細書に組み込まれるNCBI参照配列番号NP_001120793.1)を有するヒトCBX5を含みまたはこれから誘導される。CBX5ならびにヒト由来およびいくつかの動物のファミリーの他のメンバーのポリペプチドおよびコードする核酸配列は、たとえばNCBIのウェブサイトから公に利用可能である。用語「CBX5」は、マウス(たとえばNCBI: NP_001345879.1、配列番号297)、ラット(たとえばNCBI ref:NP_001100267.1、配列番号298)、ウシ(たとえばNCBI NP_001180142.1、配列番号299)、またはサル(たとえばNP_001253841.1、配列番号300)などの非ヒト種からのCBX5をも指す。
[00627]用語「CBX5」は、191アミノ酸のヒトCBX5の切断された形態を指すためにも使用される。本明細書で使用される用語「CBX5バリアント」は、天然のCBX5配列中の1つまたは複数のアミノ酸突然変異を含むCBX5ポリペプチドを指す。必要に応じて、1つまたは複数のアミノ酸突然変異は、アミノ酸置換を含む。
一部の実施形態では、本明細書で開示した抗体またはその抗原結合性断片は、クロモボックスタンパク質(たとえばCBX1、CBX2、CBX3)に結合する。一部の実施形態では、クロモボックスタンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号87の相補性決定領域重鎖1(CDR−H1)、配列番号59のCDR−H2、および配列番号31のCDR−H3を含む。一部の実施形態では、クロモボックスタンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号101の相補性決定領域軽鎖1(CDR−L1)、配列番号73のCDR−L2、および配列番号45のCDR−L3を含む。一部の実施形態では、クロモボックスタンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含む可変重鎖を含む。一部の実施形態では、クロモボックスタンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含む可変軽鎖を含む。
がん/精巣抗原1A
[00628]一部の実施形態では、本明細書で開示した抗体またはその抗原結合性断片は、がん/精巣抗原1A(CTAG1A)ポリペプチドに結合する。用語「CTAG1A」は本明細書で使用される「NY−ESO−1」と相互交換可能に使用され、任意の天然のまたは(天然であろうと合成であろうと)バリアントのCTAG1Aを指す。用語「天然の配列」は、具体的には、天然に存在する切断されもしくは分泌された形態(たとえば細胞外ドメイン配列)、天然に存在するバリアントの形態(たとえば、あるいはスプライスされた形態)、および天然に存在する対立遺伝子バリアントを包含する。CTAG1Aはmartins et. al. Cancer Cell International volume 5, Article number: 4 (2005)に記載されているように、がん精巣抗原(CTA)のファミリーに属するタンパク質である。本明細書で使用される用語「CTAG1A」は、天然に存在する対立遺伝子およびそのプロセシングされた形態を伴う180アミノ酸ポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、用語「CTAG1A」は、全長のCTAG1Aポリペプチドまたはその断片もしくは誘導体を指す。CTAG1Aポリペプチドは、全長のヒトCTAG1Aおよび/またはその機能性断片、種ホモログおよび/またはその機能性断片、ヒトCTAG1Aのオルソログおよび/またはその機能性断片であり得る。CTAG1Aポリペプチドは哺乳動物のCTAG1Aポリペプチドであり得る。CTAG1Aポリペプチドは全長のCTAG1Aの機能性アイソフォームまたはその断片であってもよい。
[00629]一部の実施形態では、CTAG1Aポリペプチドは、配列番号301の以下のアミノ酸配列(たとえば、その全体が本明細書に組み込まれるNCBI参照配列番号NP_640343.1)を有するヒトCTAG1Aを含みまたはこれから誘導される。CBX5ならびにヒト由来およびいくつかの動物のファミリーの他のメンバーのポリペプチドおよびコードする核酸配列は、たとえばNCBIのウェブサイトから公に利用可能である。用語「CTAG1A」は、マウス(たとえばNCBI:NP_081578.1、配列番号302)、ラット、ウシ、またはサルなどの非ヒト種からのCTAG1Aをも指す。
[00630]用語「CTAG1A」は、180アミノ酸のヒトCTAG1Aの切断された形態を指すためにも使用される。本明細書で使用される用語「CTAG1Aバリアント」は、天然のCTAG1A配列中の1つまたは複数のアミノ酸突然変異を含むCTAG1Aポリペプチドを指す。必要に応じて、1つまたは複数のアミノ酸突然変異は、アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、CTAG1Aに結合する抗体または抗原結合性断片は、配列番号90の相補性決定領域重鎖1(CDR−H1)、配列番号62のCDR−H2、および配列番号34のCDR−H3を含む。一部の実施形態では、CTAG1Aに結合する抗体または抗原結合性断片は、配列番号103の相補性決定領域軽鎖1(CDR−L1)、配列番号75のCDR−L2、および配列番号47のCDR−L3を含む。一部の実施形態では、CTAG1Aに結合する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含む可変重鎖を含む。一部の実施形態では、CTAG1Aに結合する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号19のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含む可変軽鎖を含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、CTAG1Bポリペプチドに結合する。
アルファおよびガンマアダプチン結合タンパク質
[00631]一部の実施形態では、本明細書で開示した抗体またはその抗原結合性断片は、アルファおよびガンマアダプチン結合タンパク質(AAGAB)ポリペプチドに結合する。本明細書で使用される用語「AAGAB」は、任意の天然のまたは(天然であろうと合成であろうと)バリアントのAAGABを指す。用語「天然の配列」は、具体的には、天然に存在する切断されもしくは分泌された形態(たとえば細胞外ドメイン配列)、天然に存在するバリアントの形態(たとえば、あるいはスプライスされた形態)、および天然に存在する対立遺伝子バリアントを包含する。AAGABは、Pohler et al. Nature Genet. 44: 1272-1276, 2012に記載されているように、AP1のガンマアダプチンサブユニットおよびAP2のアルファアダプチンサブユニットと相互作用する。本明細書で使用される用語「AAGAB」は、天然に存在する対立遺伝子およびそのプロセシングされた形態を伴う206アミノ酸ポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、用語「AAGAB」は、全長のAAGABポリペプチドまたはその断片もしくは誘導体を指す。AAGABポリペプチドは、全長のヒトAAGABおよび/またはその機能性断片、種ホモログおよび/またはその機能性断片、ヒトAAGABのオルソログおよび/またはその機能性断片であり得る。AAGABポリペプチドは哺乳動物のAAGABポリペプチドであり得る。AAGABポリペプチドは全長のAAGABの機能性アイソフォームまたはその断片であってもよい。
[00632]一部の実施形態では、AAGABポリペプチドは、配列番号303の以下のアミノ酸配列(その全体が本明細書に組み込まれるNCBI参照配列番号NP_001258814.1)を有するヒトAAGABを含みまたはこれから誘導される。AAGABならびにヒト由来およびいくつかの動物のファミリーの他のメンバーのポリペプチドおよびコードする核酸配列は、たとえばNCBIのウェブサイトから公に利用可能である。用語「AAGAB」は、マウス(たとえばNCBI:NP_001344252.1、配列番号304)、ラット(たとえばNCBI ref:NP_599225.1、配列番号305)、ウシ(たとえばNCBI NP_001092366.1、配列番号306)、またはサル(たとえばXP_014998028.1、配列番号307)などの非ヒト種からのAAGABをも指す。
[00633]用語「AAGAB」は、206アミノ酸のヒトAAGABの切断された形態を指すためにも使用される。本明細書で使用される用語「AAGABバリアント」は、天然のAAGAB配列中の1つまたは複数のアミノ酸突然変異を含むAAGABポリペプチドを指す。必要に応じて、1つまたは複数のアミノ酸突然変異は、アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、AAGABに結合する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号90の相補性決定領域重鎖1(CDR−H1)、配列番号62のCDR−H2、および配列番号34のCDR−H3を含む。
キネシン軽鎖4タンパク質
[00634]一部の実施形態では、本明細書で開示した抗体またはその抗原結合性断片は、キネシン軽鎖4タンパク質(KLC4)ポリペプチドに結合する。本明細書で使用される用語「KLC4」は、任意の天然のまたは(天然であろうと合成であろうと)バリアントのKLC4を指す。用語「天然の配列」は、具体的には、天然に存在する切断されもしくは分泌された形態(たとえば細胞外ドメイン配列)、天然に存在するバリアントの形態(たとえば、あるいはスプライスされた形態)、および天然に存在する対立遺伝子バリアントを包含する。キネシンはオルガネラの輸送において役割を果たし得る微小管関連の力生成タンパク質である。軽鎖は重鎖への積荷の連結またはそのATPアーゼ活性のモジュレーションにおいて機能し得る。本明細書で使用される用語「KLC4」は、天然に存在する対立遺伝子およびそのプロセシングされた形態を伴う619アミノ酸ポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、用語「KLC4」は、全長のKLC4ポリペプチドまたはその断片もしくは誘導体を指す。KLC4ポリペプチドは、全長のヒトKLC4および/またはその機能性断片、種ホモログおよび/またはその機能性断片、ヒトKLC4のオルソログおよび/またはその機能性断片であり得る。KLC4ポリペプチドは哺乳動物のKLC4ポリペプチドであり得る。KLC4ポリペプチドは全長のKLC4の機能性アイソフォームまたはその断片であってもよい。
[00635]一部の実施形態では、KLC4ポリペプチドは、配列番号308の以下のアミノ酸配列(その全体が本明細書に組み込まれるNCBI参照配列番号NP_001275963.1)を有するヒトKLC4を含みまたはこれから誘導される。KLC4ならびにヒト由来およびいくつかの動物のファミリーの他のメンバーのポリペプチドおよびコードする核酸配列は、たとえばNCBIのウェブサイトから公に利用可能である。用語「KLC4」は、マウス(たとえばNCBI:NP_001344059.1、配列番号309)、ラット(たとえばNCBI ref:NP_001009601.1、配列番号310)、ウシ(たとえばNCBI XP_024839789.1、配列番号311)、またはサル(たとえばXP_028703383.1、配列番号312)などの非ヒト種からのKLC4をも指す。
[00636]用語「KLC4」は、619アミノ酸のヒトKLC4の切断された形態を指すためにも使用される。本明細書で使用される用語「KLC4バリアント」は、天然のKLC4配列中の1つまたは複数のアミノ酸突然変異を含むKLC4ポリペプチドを指す。必要に応じて、1つまたは複数のアミノ酸突然変異は、アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、KLC4に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号91の相補性決定領域重鎖1(CDR−H1)、配列番号63のCDR−H2、および配列番号35のCDR−H3を含む。一部の実施形態では、KLC4に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号105の相補性決定領域軽鎖1(CDR−L1)、配列番号77のCDR−L2、および配列番号49のCDR−L3を含む。一部の実施形態では、KLC4に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含む可変重鎖を含む。一部の実施形態では、KLC4に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号21のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含む可変軽鎖を含む。
黒色腫関連抗原3
[00637]一部の実施形態では、本明細書で開示した抗体またはその抗原結合性断片は、黒色腫関連抗原3(MAGE−A3)ポリペプチドに結合する。本明細書で使用される用語「MAGE−A3」は、任意の天然のまたは(天然であろうと合成であろうと)バリアントのMAGE−A3を指す。用語「天然の配列」は、具体的には、天然に存在する切断されもしくは分泌された形態(たとえば細胞外ドメイン配列)、天然に存在するバリアントの形態(たとえば、あるいはスプライスされた形態)、および天然に存在する対立遺伝子バリアントを包含する。MAGE−A3は共通のMAGEホモロジードメインを共有するタンパク質の大きな高度に保存された群のメンバーである。本明細書で使用される用語「MAGE−A3」は、天然に存在する対立遺伝子およびそのプロセシングされた形態を伴う314アミノ酸ポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、用語「MAGE−A3」は、全長のMAGE−A3ポリペプチドまたはその断片もしくは誘導体を指す。MAGE−A3ポリペプチドは、全長のヒトMAGE−A3および/またはその機能性断片、種ホモログおよび/またはその機能性断片、ヒトMAGE−A3のオルソログおよび/またはその機能性断片であり得る。MAGE−A3ポリペプチドは哺乳動物のMAGE−A3ポリペプチドであり得る。MAGE−A3ポリペプチドは全長のMAGE−A3の機能性アイソフォームまたはその断片であってもよい。
[00638]一部の実施形態では、MAGE−A3ポリペプチドは、配列番号313の以下のアミノ酸配列(その全体が本明細書に組み込まれるNCBI参照配列番号NP_005353.1)を有するヒトMAGE−A3を含みまたはこれから誘導される。MAGEA−3ならびにヒト由来およびいくつかの動物のファミリーの他のメンバーのポリペプチドおよびコードする核酸配列は、たとえばNCBIのウェブサイトから公に利用可能である。用語「MAGE−A3」は、マウス(たとえばNCBI:NP_064401.2、配列番号314)、ラット、ウシ、またはサルなどの非ヒト種からのMAGE−A3をも指す。
[00639]用語「MAGE−A3」は、314アミノ酸のヒトMAGE−A3の切断された形態を指すためにも使用される。本明細書で使用される用語「MAGE−A3バリアント」は、天然のMAGE−A3配列中の1つまたは複数のアミノ酸突然変異を含むMAGE−A3ポリペプチドを指す。必要に応じて、1つまたは複数のアミノ酸突然変異は、アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、MAGE−A3に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号92の相補性決定領域重鎖1(CDR−H1)、配列番号64のCDR−H2、および配列番号36のCDR−H3を含む。一部の実施形態では、MAGE−A3に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号106の相補性決定領域軽鎖1(CDR−L1)、配列番号78のCDR−L2、および配列番号50のCDR−L3を含む。一部の実施形態では、MAGE−A3に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含む可変重鎖を含む。一部の実施形態では、MAGE−A3に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号22のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含む可変軽鎖を含む。
無機ピロホスファターゼ
[00640]一部の実施形態では、本明細書で開示した抗体またはその抗原結合性断片は、無機ピロホスファターゼ(PPA1)ポリペプチドに結合する。本明細書で使用される用語「PPA1」は、任意の天然のまたは(天然であろうと合成であろうと)バリアントのPPA1を指す。用語「天然の配列」は、具体的には、天然に存在する切断されもしくは分泌された形態(たとえば細胞外ドメイン配列)、天然に存在するバリアントの形態(たとえば、あるいはスプライスされた形態)、および天然に存在する対立遺伝子バリアントを包含する。PPA1はピロホスフェートの1つのイオンの2つのホスフェートイオンへの変換を触媒する酵素である。本明細書で使用される用語「PPA1」は、天然に存在する対立遺伝子およびそのプロセシングされた形態を伴う289アミノ酸ポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、用語「PPA1」は、全長のPPA1ポリペプチドまたはその断片もしくは誘導体を指す。PPA1ポリペプチドは、全長のヒトPPA1および/またはその機能性断片、種ホモログおよび/またはその機能性断片、ヒトPPA1のオルソログおよび/またはその機能性断片であり得る。PPA1ポリペプチドは哺乳動物のPPA1ポリペプチドであり得る。PPA1ポリペプチドは全長のPPA1の機能性アイソフォームまたはその断片であってもよい。
[00641]一部の実施形態では、PPA1ポリペプチドは、配列番号315の以下のアミノ酸配列(その全体が本明細書に組み込まれるNCBI参照配列番号NP_066952.1)を有するヒトPPA1を含みまたはこれから誘導される。PPA1ならびにヒト由来およびいくつかの動物のファミリーの他のメンバーのポリペプチドおよびコードする核酸配列は、たとえばNCBIのウェブサイトから公に利用可能である。用語「PPA1」は、マウス(たとえばNCBI: NP_080714.2、配列番号316)、ラット(たとえばNCBI ref:NP_001094304.1、配列番号317)、ウシ(たとえばNCBI NP_001068586.1、配列番号318)、またはサル(たとえばNCBI XP_015002942.1、配列番号329)などの非ヒト種からのPPA1をも指す。
[00642]用語「PPA1」は、289アミノ酸のヒトPPA1の切断された形態を指すためにも使用される。本明細書で使用される用語「PPA1バリアント」は、天然のPPA1配列中の1つまたは複数のアミノ酸突然変異を含むPPA1ポリペプチドを指す。必要に応じて、1つまたは複数のアミノ酸突然変異は、アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、PPA1に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号94の相補性決定領域重鎖1(CDR−H1)、配列番号66のCDR−H2、および配列番号38のCDR−H3を含む。一部の実施形態では、PPA1に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号108の相補性決定領域軽鎖1(CDR−L1)、配列番号80のCDR−L2、および配列番号52のCDR−L3を含む。一部の実施形態では、PPA1に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号10のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含む可変重鎖を含む。一部の実施形態では、PPA1に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含む可変軽鎖を含む。
インターロイキン−14A
[00643]一部の実施形態では、本明細書で開示した抗体またはその抗原結合性断片は、インターロイキン−14A(IL−14A)ポリペプチドに結合する。本明細書で使用される用語「IL−14A」は、任意の天然のまたは(天然であろうと合成であろうと)バリアントのIL−14Aを指す。用語「天然の配列」は、具体的には、天然に存在する切断されもしくは分泌された形態(たとえば細胞外ドメイン配列)、天然に存在するバリアントの形態(たとえば、あるいはスプライスされた形態)、および天然に存在する対立遺伝子バリアントを包含する。IL−14AはB細胞の増殖を誘起し、抗体の分泌を阻害し、選択されたB細胞サブグループを拡張するサイトカインである。本明細書で使用される用語「IL−14A」は、天然に存在する対立遺伝子およびそのプロセシングされた形態を伴う546アミノ酸ポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、用語「IL−14A」は、全長のIL−14Aポリペプチドまたはその断片もしくは誘導体を指す。IL−14Aポリペプチドは、全長のヒトIL−14Aおよび/またはその機能性断片、種ホモログおよび/またはその機能性断片、ヒトIL−14Aのオルソログおよび/またはその機能性断片であり得る。IL−14Aポリペプチドは哺乳動物のIL−14Aポリペプチドであり得る。IL−14Aポリペプチドは全長のIL−14Aの機能性アイソフォームまたはその断片であってもよい。
[00644]一部の実施形態では、IL−14Aポリペプチドは、配列番号319の以下のアミノ酸配列(その全体が本明細書に組み込まれるNCBI参照配列番号NP_787048.1)を有するヒトIL−14Aを含みまたはこれから誘導される。IL−14Aならびにヒト由来およびいくつかの動物のファミリーの他のメンバーのポリペプチドおよびコードする核酸配列は、たとえばNCBIのウェブサイトから公に利用可能である。用語「IL−14A」は、マウス(たとえばNCBI:NP_001005506.2、配列番号320)、ラット(たとえばNCBI ref:NP_001121105.1、配列番号321)、ウシ(たとえばNCBI XP_024852996.1、配列番号322)、またはサル(たとえばAFH31416.1、配列番号323)などの非ヒト種からのIL−14Aをも指す。
[00645]用語「IL−14A」は、546アミノ酸のヒトIL−14Aの切断された形態を指すためにも使用される。本明細書で使用される用語「IL−14Aバリアント」は、天然のIL−14A配列中の1つまたは複数のアミノ酸突然変異を含むIL−14Aポリペプチドを指す。必要に応じて、1つまたは複数のアミノ酸突然変異は、アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、IL−14Aに結合する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号95の相補性決定領域重鎖1(CDR−H1)、配列番号67のCDR−H2、および配列番号39のCDR−H3を含む。一部の実施形態では、IL−14Aに結合する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号109の相補性決定領域軽鎖1(CDR−L1)、配列番号81のCDR−L2、および配列番号53のCDR−L3を含む。一部の実施形態では、IL−14Aに結合する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号11のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含む可変重鎖を含む。一部の実施形態では、IL−14Aに結合する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号25のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含む可変軽鎖を含む。
O−結合型N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)トランスフェラーゼ
[00646]一部の実施形態では、本明細書で開示した抗体またはその抗原結合性断片は、O−結合型N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)トランスフェラーゼ(OGT)ポリペプチドに結合する。本明細書で使用される用語「OGT」は、任意の天然のまたは(天然であろうと合成であろうと)バリアントのOGTを指す。用語「天然の配列」は、具体的には、天然に存在する切断されもしくは分泌された形態(たとえば細胞外ドメイン配列)、天然に存在するバリアントの形態(たとえば、あるいはスプライスされた形態)、および天然に存在する対立遺伝子バリアントを包含する。OGTは、O−グリコシドリンケージにおける単一のN−アセチルグルコサミンの、細胞内タンパク質のセリンまたはスレオニン残基への付加を触媒する。本明細書で使用される用語「OGT」は、天然に存在する対立遺伝子およびそのプロセシングされた形態を伴う1046アミノ酸ポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、用語「OGT」は、全長のOGTポリペプチドまたはその断片もしくは誘導体を指す。OGTポリペプチドは、全長のヒトOGTおよび/またはその機能性断片、種ホモログおよび/またはその機能性断片、ヒトOGTのオルソログおよび/またはその機能性断片であり得る。OGTポリペプチドは哺乳動物のOGTポリペプチドであり得る。OGTポリペプチドは全長のOGTの機能性アイソフォームまたはその断片であってもよい。
[00647]一部の実施形態では、OGTポリペプチドは、配列番号324の以下のアミノ酸配列(その全体が本明細書に組み込まれるNCBI参照配列番号NP_858058.1)を有するヒトOGTを含みまたはこれから誘導される。OGTならびにヒト由来およびいくつかの動物のファミリーの他のメンバーのポリペプチドおよびコードする核酸配列は、たとえばNCBIのウェブサイトから公に利用可能である。用語「OGT」は、マウス(たとえばNCBI:NP_001277464.1、配列番号325)、ラット(たとえばNCBI ref:NP_058803.2、配列番号326)、ウシ(たとえばNCBI NP_001091539.1、配列番号327)、またはサル(たとえばXP_014983153.1、配列番号328)などの非ヒト種からのOGTをも指す。
[00648]用語「OGT」は、1046アミノ酸のヒトOGTの切断された形態を指すためにも使用される。本明細書で使用される用語「OGTバリアント」は、天然のOGT配列中の1つまたは複数のアミノ酸突然変異を含むOGTポリペプチドを指す。必要に応じて、1つまたは複数のアミノ酸突然変異は、アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、OGTに結合する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号98の相補性決定領域重鎖1(CDR−H1)、配列番号70のCDR−H2、および配列番号42のCDR−H3を含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号112の相補性決定領域軽鎖1(CDR−L1)、配列番号84のCDR−L2、および配列番号56のCDR−L3を含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号14のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含む可変重鎖を含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号28のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドコンセンサス配列を含む可変軽鎖を含む。
イムノコンジュゲート
[00649]本開示の一態様では、本明細書で開示した抗体またはその抗原結合性断片は、腫瘍に対する強力な免疫応答を開始することができ、および/または直接の細胞傷害の能力がある。これに関して、本明細書の抗体またはその抗原結合性断片は、補体媒介または抗体依存性の細胞傷害(ADCC)機構のいずれかによって腫瘍細胞の溶解を誘発することができ、それらは両方ともエフェクター細胞のFc受容体部位または補体タンパク質との相互作用のために免疫グロブリン分子のインタクトなFc部分を必要とする。さらに、腫瘍成長に対して直接の生物学的効果を発揮する抗体は、本開示の実施において有用である。そのような直接に細胞傷害性の抗体が作用する可能な機構は、細胞増殖の阻害、細胞分化の調節、腫瘍の血管形成因子のプロファイルの調節、およびアポトーシスの誘起を含む。本明細書で開示した特定の抗体またはその抗原結合性断片が抗腫瘍効果を発揮する機構は、ADCC、ADMMC、補体媒介細胞溶解、その他を決定するように設計された、当技術で一般に公知の任意の数のin vitroアッセイを用いて評価し得る。
[00650]本明細書で開示した抗体またはその抗原結合性断片は、その「裸の」またはコンジュゲートしない形態で投与し得るか、またはそれらに治療剤をコンジュゲートし得る。一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、放射増感剤として使用される。そのような実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、放射増感剤にコンジュゲートされる。用語「放射増感剤」は、本明細書で使用される場合、治療有効量で動物に投与されて、放射増感される細胞の電磁放射に対する感度を増大させ、および/または電磁放射によって治療可能な疾患の治療を促進する分子、好ましくは低分子量の分子として定義される。電磁放射によって治療可能な疾患は、新生物疾患、良性および悪性の腫瘍、ならびにがん性細胞を含む。
[00651]本明細書で使用される用語「電磁放射」および「放射」は、10〜20ないし100mの波長を有する放射を含むが、これに限定されない。本開示の好ましい実施形態は、たとえばガンマ放射(10−20〜10−13m)、X線放射(10−12〜10−9m)、紫外光(10nm〜400nm)、可視光(400nm〜700nm)、赤外放射(700nm〜1.0mm)、およびマイクロ波放射(1mm〜30cm)の電磁放射を採用することができる。
[00652]放射増感剤は、電磁放射の毒性効果に対するがん性細胞の感度を増大させることが公知である。現在多くのがん治療プロトコールが、X線の電磁放射によって活性化される放射増感剤を採用している。X線活性化放射増感剤の例は、以下の、メトロニダゾール、ミソニダゾール、デスメチルミソニダゾール、ピモニダゾール、エタニダゾール、ニモラゾール、マイトマイシンC、RSU 1069、SR 4233、E09、RB 6145、ニコチンアミド、5−ブロモデオキシウリジン(BUdR)、5−ヨードデオキシウリジン(IUdR)、ブロモデオキシシチジン、フルオロデオキシウリジン(FUdR)、ヒドロキシウレア、シスプラチン、ならびにそれらの治療に有効なアナログおよび誘導体を含むが、これらに限定されない。
[00653]がんの光線力学療法(PDT)は、増感剤の放射活性化剤として可視光を採用する。光線力学放射増感剤の例は、以下の、ヘマトポルフィリン誘導体、Photofrin(登録商標)、ベンゾポルフィリン誘導体、NPe6、スズエチオポルフィリン(SnET2)、フェオボルバイド−a、バクテリオクロロフィル−a、ナフタロシアニン類、フタロシアニン類、亜鉛フタロシアニン、ならびにそれらの治療に有効なアナログおよび誘導体を含むが、これらに限定されない。
[00654]別の実施形態では、抗体は、腫瘍のプレターゲティングにおける使用のために受容体(ストレプトアビジンなど)にコンジュゲートされ得る。プレターゲティングでは抗体−受容体のコンジュゲートが患者に投与され、続いて除去剤の使用により未結合のコンジュゲートが循環から除去され、細胞傷害剤(たとえば放射性核種)にコンジュゲートしたリガンド(たとえばアビジン)が投与される。
[00655]本開示は、検出可能に標識した形態の上記の抗体またはその抗原結合性断片をさらに提供する。抗体は、放射性同位元素、親和性標識(ビオチン、アビジン、その他)、酵素標識(セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、その他)、蛍光もしくは発光もしくは生物発光標識(FITCまたはローダミンなど)、常磁性原子、その他の使用によって検出可能に標識することができる。そのような標識を達成するための手順は当技術で周知であり、たとえばSternberger, L. A. et al., J. Histochem. Cytochem. 18:315 (1970)、Bayer, E. A. et al., Meth. Enzym. 62:308 (1979)、Engval, E. et al., Immunol. 109:129 (1972)、Goding, J.W. J. Immunol. Meth. 13:215 (1976)を参照されたい。
[00656]「標識」は、抗体に直接または間接的にコンジュゲートされた検出可能な化合物または組成物を指す。標識はそれ自体、それ自体によって検出可能である(たとえば放射性同位元素標識または蛍光標識)か、酵素標識の場合には検出可能な基質化合物または組成物の化学的な改変を触媒することができる。あるいは、標識はそれ自体では検出可能でないが、検出可能な別の薬剤(たとえばエピトープタグまたはビオチン−アビジンなどの結合パートナー対の一方)によって結合される要素であってもよい。したがって、抗体はその単離を容易にする標識またはタグを含んでよく、抗体を同定するための本発明の方法は、標識またはタグとの相互作用によって抗原/抗体を単離するステップを含む。
[00657]例示的な治療用イムノコンジュゲートは、化学療法剤、毒物(たとえば細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒物、またはその断片)、または放射性同位元素(即ち放射性コンジュゲート)などの細胞傷害剤にコンジュゲートした本明細書に記載した抗体を含む。融合タンパク質については以下により詳細に述べる。
[00658]一部の実施形態では、本明細書で開示した抗体およびその抗原結合性断片は、細胞増殖抑制剤または殺細胞剤(たとえばパクリタキソール、サイトカラシンBもしくはジフテリア毒素、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド類、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびプロマイシン、ならびにそれらのアナログまたはホモログ)、代謝拮抗物質(たとえばメトトレキサート、6−メルカプトプリン、6−チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、5−フルオロウラシルデカルバジン)、アルキル化剤(たとえばメクロレタミン、チオエパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BSNU)およびロムスチン(CCNU)、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、およびcis−ジクロロジアミン白金(II)(DDP)シスプラチン)、アントラサイクリン類(たとえばダウノルビシン(以前はダウノマイシン)およびドキソルビシン)、抗生剤(たとえばダクチノマイシン(以前はアクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン(AMC)、ならびに抗有糸分裂剤、血栓剤もしくは抗血管形成剤、または放射性標識などの化学療法用の細胞毒素などの治療剤にコンジュゲートすることができる。イムノコンジュゲートを形成するための好適な細胞傷害剤および化学療法剤の例は当技術で公知であり、たとえばWO05/103081を参照されたい。別の実施形態では、本明細書で開示した抗体およびその抗原結合性断片は、たとえば酵素、蛍光マーカー、化学発光マーカー、生物発光材料、または放射性材料などの検出可能な基質にコンジュゲートされる。本明細書に記載した態様の一部の実施形態では、本明細書で開示した抗体およびその抗体断片は、毒素(たとえば細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒素、またはその断片)、小分子、siRNA、ナノ粒子、ターゲティング剤(たとえば微小泡)、または放射性同位元素(即ち放射性コンジュゲート)にコンジュゲートされる。そのようなコンジュゲートは、本明細書で「イムノコンジュゲート」と称される。そのようなイムノコンジュゲートは、たとえば診断、セラノスティクス、またはターゲティング法に使用することができる。
[00659]使用することができる酵素活性毒素およびその断片は、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エキソトキシンA鎖(Pseudomonas aeruginosa由来)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、アルファ−サルシン、Aleurites fordiiタンパク質、ジアンチンタンパク質、Phytolaca americanaタンパク質(PAPI、PAPII、およびPAP−S)、momordica charantia阻害剤、クルシン、クロチン、sapaonaria officinalis阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセン類を含む。種々の放射性同位元素が放射コンジュゲート抗体の産生のために利用可能である。例は212Bi、131I、131In、90Y、および186Reを含むが、これらに限定されない。
[00660]本明細書に記載した抗体またはその抗原結合性断片と細胞傷害剤とのコンジュゲートは、N−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオール)プロピオネート(SPDP)、イミノチオラン(IT)、イミドエステル類の二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートHCLなど)、活性エステル類(ジスクシニミジルスベレートなど)、アルデヒド類(グルタルアルデヒドなど)、ビスアジド化合物(ビス(p−アジドベンゾイル)ヘキサンジアミンなど)、ビスジアゾニウム誘導体(ビス−(p−ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミンなど)、ジイソシアネート類(トリエン−2,6−ジイソシアネートなど)、ならびにビス活性フッ素化合物(1,5−ジフルオロ−2,4−ジニトロベンゼンなど)などの種々の二官能性タンパク質カップリング剤のいずれかを使用して作製することができる。たとえば、リシン免疫毒素は、Vitetta et al., 238 Science 1098 (1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素14標識1−イソチオシアナトベンジル−3−メチルジエチレントリアミン五酢酸(MX−DTPA)は、抗体への放射性核種のコンジュゲート化のための例示的なキレート化剤である。WO94/11026を参照されたい。
[00661]他の実施形態では、抗体またはその部分は、腫瘍のプレターゲティングにおける使用のために「受容体」(たとえばストレプトアビジン)にコンジュゲートされ得る。プレターゲティングでは抗体−受容体のコンジュゲートが対象に投与され、続いて除去剤の使用により未結合のコンジュゲートが循環から除去され、細胞傷害剤(たとえば放射性核種)にコンジュゲートした「リガンド」(たとえばアビジン)が投与される。一部の実施形態では、抗体またはその抗体断片がビオチンにコンジュゲートされ、ビオチンコンジュゲートされた抗体またはその抗体断片が、たとえば血管形成の分子イメージングにおける使用のために、ストレプトアビジンコート微小泡などのストレプトアビジンが結合された薬剤またはストレプトアビジンでコートされた薬剤に、さらにコンジュゲートまたは連結され得る。
[00662]そのような治療部分を抗体にコンジュゲートする手法は周知であり、たとえばAmon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)、Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)、Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)、"Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)、およびThorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982)を参照されたい。
[00663]イムノコンジュゲートの生成は米国特許第6,306,393号に記載されている。イムノコンジュゲートは、抗体成分に治療剤を間接的にコンジュゲートすることによって調製することができる。一般的な手法は、Shih et al., Int. J. Cancer 41 :832-839 (1988)、Shih et al., Int.J. Cancer 46:1101-1106 (1990)、およびShih et al.,米国特許第5,057,313号に記載されている。一般的な方法は、酸化された炭水化物部分を有する抗体成分を、少なくとも1つの遊離アミン官能基を有し、複数の薬物、毒素、キレート化剤、ホウ素アデンド、またはその他の治療剤を担持した担体ポリマーと反応させるステップを含む。この反応は最初にシッフ塩基(イミン)リンケージをもたらし、これは二級アミンへの還元によって安定化されて最終のコンジュゲートを形成することができる。
[00664]担体ポリマーは好ましくはアミノデキストランまたは少なくとも50アミノ酸残基のポリペプチドであるが、他の実質的に等価のポリマー担体を使用することもできる。好ましくは、治療における使用のための投与の容易さおよび効果的なターゲティングのために、最終のイムノコンジュゲートは哺乳動物血清などの水性溶液に可溶である。したがって、担体ポリマーへの可溶化機能が最終のイムノコンジュゲートの血清への溶解性を向上させることになる。特にアミノデキストランが好まれる。
[00665]アミノデキストラン担体を用いてイムノコンジュゲートを調製するプロセスは、典型的にはデキストランポリマー、有利には平均分子量が約1万〜約10万のデキストランを用いて開始する。デキストランはその炭水化物環の部分の制御された酸化に影響する酸化剤を用いて反応させて、アルデヒド基を生成させる。酸化は従来の手順に従って、NaIO4などの解糖作用のある化学的試薬によって都合よく影響される。
[00666]酸化されたデキストランを次にポリアミン、好ましくはジアミン、より好ましくはモノ−もしくはポリ−ヒドロキシジアミンと反応させる。好適なアミンはエチレンジアミン、プロピレンジアミン、またはその他の同様のポリメチレンジアミン類、ジエチレントリアミンまたは同様のポリアミン類、1,3−ジアミノ−2−ヒドロキシプロパン、またはその他の同様のヒドロキシル化ジアミン類、またはポリアミン類などを含む。アルデヒド官能基のシッフ塩基群への実質的に完全な変換を保証するために、デキストランのアルデヒド基に対して過剰のアミンを使用する。
[00667]得られるシッフ塩基中間体の還元的安定化をもたらすために、NaBH4、NaBH3CNなどの還元剤を使用する。得られるアダクトは、従来のサイジングカラムを通して架橋デキストランを除去することによって精製することができる。デキストランを誘導体化してアミン官能基を導入する他の従来法、たとえばシアノゲンブロミドとの反応および引き続くジアミンとの反応も使用することができる。次にアミノデキストランを、活性化された形態、好ましくは従来の手段で、たとえばジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)またはその水溶性バリアントを使用して調製したカルボキシル活性化誘導体の形態の、特定の薬物、毒素、キレート化剤、免疫調節剤、ホウ素アデンド、または担持すべきその他の治療剤の誘導体と反応させて、中間アダクトを形成する。
[00668]あるいは、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質またはリシンA鎖などのポリペプチド毒素を、グルタルアルデヒド縮合によって、またはタンパク質の活性化されたカルボキシル基とアミノデキストランのアミンとの反応によって、アミノデキストランに連結することができる。放射性金属または磁気共鳴強化剤のためのキレート化剤は当技術で周知である。典型的なものは、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)およびジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)の誘導体である。これらのキレート化剤は、典型的にはキレート化剤がそれによって担体に結合できる基を側鎖上に有している。そのような基は、たとえばベンジルイソチオシアネートを含み、それによってDTPAまたはEDTAを担体のアミン基に連結することができる。あるいは、キレート化剤上のカルボキシル基またはアミン基を、全て周知の手段によって、活性化または予め誘導体化した後に連結して、担体に連結することができる。
[00669]カルボランなどのホウ素アデンドを従来の方法によって抗体成分に結合させることができる。たとえば、当技術で周知のように、カルボランはペンダント側鎖上のカルボキシル官能基によって調製することができる。そのようなカルボランの担体、たとえばアミノデキストランへの結合は、カルボランのカルボキシル基の活性化および担体上のアミンとの縮合によって中間コンジュゲートを産生させて達成することができる。そのような中間コンジュゲートを次に、以下に記載するように抗体成分に結合させて、治療に有用なイムノコンジュゲートを産生させる。
[00670]アミノデキストランの代わりにポリペプチド担体を使用することもできるが、ポリペプチド担体は鎖中に少なくとも50アミノ酸残基、好ましくは100〜5000アミノ酸残基を有する必要がある。アミノ酸の少なくともいくつかはリジン残基またはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸残基である必要がある。リジン残基のペンダントアミンならびにグルタミン酸およびアスパラギン酸のペンダントカルボキシレートは、薬物、毒素、免疫調節剤、キレート化剤、ホウ素アデンド、またはその他の治療剤を結合させるのに好都合である。好適なポリペプチド担体の例は、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、それらのコポリマー、ならびに得られる担持された担体およびイムノコンジュゲートに所望の溶解特性を付与するためのこれらのアミノ酸とその他、たとえばセリンとの混合ポリマーを含む。
[00671]中間コンジュゲートと抗体成分とのコンジュゲート化は、抗体成分の炭水化物部分を酸化し、得られるアルデヒド(およびケトン)カルボニルを、薬物、毒素、キレート化剤、免疫調節剤、ホウ素アデンド、またはその他の治療剤を担持させた後の担体上に残存しているアミン基と反応させることによって達成される。あるいは、中間コンジュゲートを、治療剤を担持させた後の中間コンジュゲートに導入したアミン基を介して、酸化された抗体成分に結合することができる。酸化はたとえばNaIO4もしくはその他の解糖試薬を用いて化学的に、またはたとえばニューラミニダーゼおよびガラクトースオキシダーゼを用いて酵素的に、都合よく達成される。アミノデキストラン担体の場合には、アミノデキストランのアミンの全ては典型的には治療剤を担持するために使用されない。アミノデキストランの残留アミンは酸化された抗体成分と縮合してシッフ塩基アダクトを形成し、これが次に通常は水素化ホウ素還元剤によって還元的に安定化される。
[00672]本発明による他のイムノコンジュゲートを産生するために類似の手順が用いられる。担持されたポリペプチド担体は、好ましくは抗体成分の酸化された炭水化物部分との縮合のために残存する遊離のリジン残基を有する。ポリペプチド担体上のカルボキシルは、必要であれば、たとえばDCCによる活性化および過剰のジアミンとの反応によってアミンに変換することができる。
[00673]最終のイムノコンジュゲートは、Sephacryl S−300上のサイズクロマトグラフィーまたは1つもしくは複数のCD84Hyエピトープを用いる親和性クロマトグラフィーなどの従来の手法を用いて精製される。あるいは、イムノコンジュゲートは、抗体成分を治療剤と直接コンジュゲート化することによって調製することができる。一般的な手順は、治療剤が酸化された抗体成分に直接結合されることを除いて、間接的なコンジュゲート化の方法に類似している。他の治療剤が本明細書に記載したキレート化剤を代替できることが認識されよう。当業者であれば、不必要な実験を行なわずにコンジュゲート化のスキームを考案することができる。
[00674]さらなる実例として、治療剤を、還元された抗体成分のヒンジ領域にジスルフィド結合の形成を介して結合することができる。たとえば、破傷風トキソイドペプチドを、ペプチドを抗体成分に結合するために使用される単一のシステイン残基によって構築することができる。代替案として、そのようなペプチドを、N−スクシニル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)などのヘテロ二官能性架橋剤を使用して抗体成分に結合することができる。Yu et al., Int. J. Cancer56:244 (1994)。そのようなコンジュゲート化の一般的な手法は当技術で周知である。たとえば、Wong, Chemistry Of Protein Conjugation and Cross-Linking (CRC Press 1991)、Upeslacis et al., "Modification of Antibodies by Chemical Methods," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al. (eds.), pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995)、Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-De- rived Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995)を参照されたい。
[00675]抗体と細胞傷害剤とのコンジュゲートは、N−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオール)プロピオネート(SPDP)、イミノチオラン(IT)、イミドエステル類の二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートHCLなど)、活性エステル類(ジスクシニミジルスベレートなど)、アルデヒド類(グルタルアルデヒドなど)、ビスアジド化合物(ビス(p−アジドベンゾイル)ヘキサンジアミンなど)、ビスジアゾニウム誘導体(ビス−(p−ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミンなど)、ジイソシアネート類(トリエン−2,6−ジイソシアネートなど)、ならびにビス活性フッ素化合物(1,5−ジフルオロ−2,4−ジニトロベンゼンなど)などの種々の二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製される。たとえば、リシン免疫毒素は、Vitetta et al., Science 238 :1098 (1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素14標識1−イソチオシアナトベンジル−3−メチルジエチレントリアミン五酢酸(MX−DTPA)は、抗体への放射性核種のコンジュゲート化のための例示的なキレート化剤である(たとえばWO94/11026を参照されたい)。
[00676]上述のように、抗体のFc領域における炭水化物部分を使用して、治療剤をコンジュゲート化することができる。しかし、イムノコンジュゲートの抗体成分として抗体断片を使用する場合はFc領域が存在しないことがある。それにも関わらず、炭水化物部分を抗体または抗体断片の軽鎖可変領域に導入することは可能である。たとえばLeung et al., J. Immunol. 154:5919 (1995)、Hansen et al.,米国特許第5,443,953号を参照されたい。次いで操作された炭水化物部分を使用して治療剤を結合する。[0404]さらに、当業者であれば、コンジュゲート法の数多くの可能な変形を認識することになる。たとえば、血液、リンパ、またはその他の細胞外流体中におけるインタクトな抗体またはその抗原結合性断片の半減期を延長するために、炭水化物部分を使用してポリエチレングリコールを結合することができる。さらに、治療剤を炭水化物部分および遊離のスルフヒドリル基に結合させることによって、「二価イムノコンジュゲート」を構築することが可能である。そのような遊離のスルフヒドリル基は、抗体成分のヒンジ領域に位置し得る。
一部の実施形態では、本明細書で開示した抗原(たとえば表9〜表10に列挙した抗原)に関連する病態を診断しまたは治療する方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、抗原に関連する病態は、抗原の発現または生物活性の増大による結果である。一部の実施形態では、抗原に関連する病態は、抗原の発現または生物活性の低減による結果である。一部の実施形態では、本明細書で開示した抗体またはその抗原結合性断片は抗原(たとえば表9〜表10に列挙した抗原)に結合し、それにより、抗原の発現および/または少なくとも1つの生物活性を部分的にまたは実質的に阻害する。本明細書で開示した抗原の発現および/または少なくとも1つの生物活性を部分的にまたは好ましくは実質的に阻害する抗体またはその特定された部分もしくはバリアントは、タンパク質抗原またはその断片に結合することができ、それにより、抗原によって媒介される活性、たとえば1つもしくは複数の受容体または当技術で特定の抗原に結合することが公知のリガンドへの抗原の結合を阻害することができる。一部の実施形態では、抗体は抗原活性を約20〜120%、好ましくは少なくとも約10、20、30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%またはそれ以上、阻害することができる。本明細書で開示した抗原の発現および/または少なくとも1つの生物活性を部分的にまたは好ましくは実質的に増大させる抗体またはその特定された部分もしくはバリアントは、タンパク質抗原またはその断片に結合することができ、それにより、抗原によって媒介される活性を増大させることができる。一部の実施形態では、抗体は抗原活性を約20〜120%、好ましくは少なくとも約10、20、30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%またはそれ以上、増大させることができる。
[00677]抗原依存性活性を増大させる抗体の能力は、好ましくは本明細書に記載した、および/または当技術で公知の、少なくとも1つの好適なアッセイによって評価される。一部の実施形態では、抗原に関連する病態は、免疫関連疾患、心血管系疾患、感染疾患、悪性疾患、または神経疾患であり得る。
医薬組成物および医薬
[00678]本明細書に記載した抗体もしくはその抗原結合性断片または組成物は、疾患のスクリーニング、疾患の存在もしくは重症度の検出、疾患の予後の提供、疾患の進行もしくは再発のモニタリング、ならびに治療の有効性および/または疾患、障害、もしくは病態の再発の評価、ならびに疾患の療法および/もしくは処置の選択、疾患のための所与の療法の最適化、疾患の治療のモニタリング、および/または特定の患者もしくは副集団のための治療の適合性の予測または患者もしくは副集団における治療製品の適切な用量の決定のために使用することができる。一部の実施形態では、疾患はがんである。
[00679]本明細書に記載した方法の臨床使用のため、本開示の抗体またはその抗原結合性断片の投与は、たとえば皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口、筋肉内、頭蓋内、またはその他の投与経路への投与のための医薬組成物もしくは医薬製剤、または医薬への製剤化を含み得る。一部の実施形態では、本明細書に記載した抗体またはその抗原結合性断片は、対象における効果的な治療をもたらす任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤とともに投与することができる。したがって一態様では、本開示は1つもしくは複数の薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤と組み合わせた、本明細書に記載した1つもしくは複数の抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物を提供する。
[00680]語句「薬学的に許容される」は、適切な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、またはその他の問題もしくは合併症を伴わず、妥当な利益/リスク比との釣り合いをもった、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に適した化合物、材料、組成物、および/または剤型を指す。本明細書で使用される語句「薬学的に許容される担体」は、本開示の抗体またはその抗原結合性断片の安定性、溶解性、または活性の維持に関与する液体もしくは固体のフィラー、希釈剤、賦形剤、溶媒、媒体、カプセル化材料、製造助剤(たとえば滑剤、タルクマグネシウム、カルシウムもしくは亜鉛のステアレート、またはステアリン酸)、または溶媒カプセル化材料などの薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを意味する。その例は、無菌リン酸緩衝食塩液、静菌水、その他のいくつかの標準的な薬学的担体のいずれかを含むが、これらに限定されない。種々の水性担体、たとえば水、緩衝された水、0.4%食塩水、0.3%グリシン、その他が使用でき、温和な化学的改変などに供されるアルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどの安定性の向上のための他のタンパク質を含み得る。それぞれの担体は、製剤の他の成分と適合性であり、患者に傷害を与えないという意味で「許容され」なければならない。用語「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」などは、本明細書では相互交換可能に使用される。本開示の組成物は、移入、送達、耐性などを改善するために製剤に組み込まれる1つまたは複数の薬学的に許容される担体、賦形剤、およびその他の薬剤(本明細書ではまとめて「薬学的に許容される担体または希釈剤」と称する)をさらに含んでよい。多数の適切な製剤化を、全ての薬化学者に公知の処方集Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa.で見出すことができる。これらの製剤化は、たとえば粉末、ペースト、軟膏、ジェリー、ワックス、油、脂質、ベシクル(たとえばLIPOFECTIN(商標)を含む脂質(カチオン性またはアニオン性)、DNAコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油および油中水エマルジョン、エマルジョンカーボワックス(種々の分子量のポリエチレングリコール)、半固体ゲル、およびカルボワックスを含む半固体混合物を含む。またPowell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA, 1998, J Pharm Sci Technol 52:238-311を参照されたい。
[00681]許容される担体、賦形剤、または安定剤は、採用される用量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、リン酸塩、クエン酸塩、およびその他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤、保存剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール、メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン類、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、3−ペンタノール、およびm−クレゾールなど)、低分子量(約10残基未満)のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸、単糖、二糖、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含むその他の炭水化物、EDTAなどのキレート化剤、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖類、ナトリウムなどの塩形成カウンターイオン、金属複合体(たとえば亜鉛−タンパク質複合体)、ならびに/またはTWEEN(商標)、PLURONICS(商標)、もしくはポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン界面活性剤を含む。
[00682]必要に応じて、本明細書に記載した組成物を含む製剤は、薬学的に許容される塩、典型的にはたとえば塩化ナトリウムを、好ましくはほぼ生理学的濃度で含む。必要に応じて、本発明の製剤は、薬学的に許容される保存剤を含み得る。一部の実施形態では、保存剤の濃度は典型的にはv/vで0.1〜2.0%の範囲である。好適な保存剤は、薬学技術で公知のものを含む。ベンジルアルコール、フェノール、m−クレゾール、メチルパラベン、およびプロピルパラベンは保存剤の例である。必要に応じて、本発明の製剤は薬学的に許容される界面活性剤を0.005〜0.02%の濃度で含み得る。
[00683]本明細書に記載した組成物は、以下(1)たとえば無菌の溶液もしくは懸濁液、または持続放出製剤としての、たとえば皮下、筋肉内、静脈内、または硬膜外の注射による非経口投与、(2)皮膚に適用される、たとえばクリーム、軟膏、もしくは制御放出用のパッチもしくはスプレーとしての局所的適用、(3)たとえばペッサリー、クリーム、もしくはフォームとしての膣内または直腸内、(4)眼内、(5)経皮、(6)経粘膜、または(7)経鼻のために適合されたものを含む固体、液体、またはゲル形態での抗体またはその抗原結合性断片の対象への投与のために特に製剤化することができる。さらに、本開示の抗体もしくはその抗原結合性断片または組成物は、薬物送達システムを使用して患者にインプラントしまたは注射することができる。たとえばUrquhart et al., 24 Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 199 (1984)、Controlled Release of Pesticides & Pharmaceuticals (Lewis, ed., Plenum Press, New York, 1981)、米国特許第3、773、919号、第3、270、960号を参照されたい。
[00684]本明細書に記載した抗体または抗原結合性断片を含む本明細書に開示した組成物は、治療すべき特定の適応症に必要な2つ以上の活性化合物、好ましくは相互に有害に影響しない相補的な活性を有する化合物を含んでもよい。たとえば、組成物は細胞傷害剤、サイトカイン、増殖阻害剤、および/またはVEGFRアンタゴニストなどの血管形成阻害剤をさらに含み得る。そのような分子は、意図した目的のために効果的な量で組み合わせ中に好適に存在する。本明細書に記載した抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物の活性成分は、たとえばコアセルベーション手法もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、たとえばそれぞれヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンのマイクロカプセル、およびポリ(メチルメタクリレート)マイクロカプセルによって調製されたマイクロカプセル中に、コロイド状薬物送達システム(たとえばリポソーム、アルブミンマイクロスフィア、微粒子、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル)中に、またはマクロエマルジョン中に、トラップすることもできる。そのような手法はRemington's Pharmaceutical Sciences (16th ed., Osol, ed., 1980)に開示されている。医薬組成物はまた、ビシクル中、特にリポソーム中で送達することもできる(Langer 1990 Science 249:1527-1533、Treat et al. (1989) in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365、Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327を参照されたい;全般的なことに関しては前掲を参照されたい)。リポソームはエマルジョン、フォーム、ミセル、不溶性単層、リン脂質分散液、ラメラ層、その他を含み、M−CSF抗体を特定の組織に標的させ、ならびに組成物の半減期を延長させるためのビヒクルとして働き得る。たとえば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第4,837,028号および第5,019,369号に記載されているリポソームを調製するための種々の方法が利用可能である。
[00685]抗体を含むリポソームは、Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688 (1985)、Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77: 4030 (1980)、ならびに米国特許第4,485,045号および第4,544,545号に記載されているような当技術で公知の方法によって調製される。循環時間が延長されたリポソームは米国特許第5,013,556号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびPEG−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(PEG−PE)を含む液体組成物を用いる逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームを所定の孔径を有するフィルターから押し出すことによって、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のFab’断片を、Martin et al., J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) に記載されているように、ジスルフィド交換反応によってリポソームにコンジュゲート化することができる。化学療法剤(ドキソルビシンなど)を必要に応じてリポソーム中に含ませる(たとえばGabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19): 1484 (1989) を参照されたい)。
[00686]一部の実施形態では、持続放出調製物を使用することができる。持続放出調製物の好適な例は、本開示の抗体または抗原結合性断片を含む固体の疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、そのマトリックスは賦形された物品の形態、たとえばフィルムまたはマイクロカプセルである。持続放出マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル(たとえばポリ(2−ヒドロキシエチルメタクリレート)、またはポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド類(米国特許第3,773,919号)、L−グルタミン酸とyエチル−L−グルタメートとのコポリマー、非分解性のエチレン−酢酸ビニル、LUPRONDEPO(商標)などの分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー(乳酸−グリコール酸コポリマーおよびリュープロライドアセテートから構成される注射可能なマイクロスフィア)、およびポリ−D−(−)−3−ヒドロキシ酪酸を含む。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは100日以上の分子の放出を可能にするが、ある種のヒドロゲルはタンパク質をより短い期間で放出する。抗体はカプセル化されると体内に長期間残留し、37℃における水分への曝露の結果として変性し、または凝集することがあり、その結果、生物活性が失われ、免疫原性が変化する可能性がある。関与する機構に応じて安定化のために合理的な戦略を考案することができる。たとえば、凝集機構がチオジスルフィドの交換による分子間S−S結合の形成であることが発見されれば、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含量を制御し、適切な添加剤を使用し、特定のポリマーマトリックス組成物を開発することによって、安定化を達成することができる。ある特定の状況では、医薬組成物を制御放出システムの中で送達することができる。一実施形態では、ポンプを用いてよい(Langer, 上記、Sefton 1987 CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201を参照されたい)。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる。さらに別の実施形態では、制御放出システムを組成物の標的の近傍に設置し、それにより全身用量の一部のみが必要となるようにしてもよい。(たとえばGoodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138を参照されたい)。
[00687]本開示の医薬組成物は、標準的な針およびシリンジを用いて、たとえば皮下または静脈内に送達することができる。さらに、皮下送達に関して、ペン送達デバイスは、本発明の医薬組成物の送達に容易に適用できる。そのようなペン送達デバイスは再使用可能でも使い捨てでもよい。再使用可能なペン送達デバイスは一般に、医薬組成物を含む置き換え可能なカートリッジを利用する。カートリッジ内の医薬組成物の全てが投与されてカートリッジが空になれば、空のカートリッジを容易に廃棄して、医薬組成物を含む新たなカートリッジに置き換えることができる。次いでペン送達デバイスを再使用することができる。使い捨てペン送達デバイスでは、置き換え可能なカートリッジは存在しない。むしろ、使い捨てペン送達デバイスは、デバイス内のリザーバーに保持された医薬組成物を充填済みで供給される。医薬組成物のリザーバーが空になれば、デバイス全体が廃棄される。数多くの再使用可能なペンおよびオートインジェクターの送達デバイスが、本発明の医薬組成物の皮下送達において用途を有している。その例は、二、三の例のみを挙げるとAUTOPEN(商標)(Owen Mumford,Inc.社、Woodstock,UK)、DISETRONIC(商標)ペン(Disetronic Medical Systems社、Burghdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25(商標)ペン、HUMALOG(商標)ペン、HUMALIN70130(商標)ペン(Eli Lilly and Co.社、Indianapolis,Ind.)、NOVOPEN(商標)I、II、およびIII(Novo Nordisk社、Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIOR(商標)(Novo Nordisk社、Copenhagen,Denmark)、BD(商標)ペン(Becton Dickinson社、Franklin Lakes,N.J.)、OPTIPEN(商標)、OPTIPEN PRO(商標)、OPTIPEN STARLET(商標)、およびOPTICLIK(商標)(Sanofi−Aventis社、Frankfurt,Germanyを含むが、もちろんこれらに限定されない。医薬組成物の皮下送達における用途を有する使い捨てペン送達デバイスの例は、SOLOSTAR(商標)ペン(Sanofi−Aventis社)、FLEXPEN(商標)(Novo Nordisk社)、およびKWIKPEN(商標)(Eli Lilly社)を含むが、もちろんこれらに限定されない。
[00688]注射可能な調製物は、静脈内、皮下、皮内、および筋肉内の注射、滴下注入、その他のための剤形を含み得る。これらの注射可能な調製物は公知の方法によって調製され得る。たとえば、注射可能な調製物は、上記の抗体またはその塩を無菌の水性媒体または従来から注射用に使用されている油性媒体中に、たとえば溶解、懸濁、または乳濁することによって、調製され得る。注射用の水性媒体としては、たとえば生理的食塩水、グルコースおよびその他の補助剤を含む等浸透圧溶液があり、これらはアルコール(たとえばエタノール)、ポリアルコール(たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール)、非イオン性界面活性剤(たとえばポリソーベート80、HCO−50(水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン(50モル)アダクト))、その他の適切な可溶化剤と組み合わせて使用され得る。油性媒体としては、たとえばゴマ油、大豆油、その他が使用され、これらは安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール、その他の可溶化剤と組み合わせて使用し得る。このようにして調製された注射剤は、好ましくは適切なアンプルに充填される。
[00689]本開示の組成物は、たとえば顆粒、粉末、錠剤、カプセル、シロップ、坐剤、注射剤、エマルジョン、エリキシル、懸濁液、または溶液の形態であってよい。含まれる上記の抗体の量は、単位用量において剤形あたり約5〜約500mgであってよい。特に注射剤の形態においては、上記の抗体が他の剤形について約5〜約100mg、および約10〜約250mgで含まれていることが好ましい。
[00690]経口、経頬、および舌下腺の投与のためには、粉末、懸濁液、顆粒、錠剤、ピル、カプセル、ゲルキャップ、およびキャプレットが固体剤形として許容される。これらは、たとえば本発明の1つもしくは複数の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは互変異生体を、デンプンもしくは他の添加物などの少なくとも1つの添加物と混合することによって、調製することができる。好適な添加物は、スクロース、ラクトース、セルロース糖、マンニトール、マルチトール、デキストラン、デンプン、寒天、アルギネート、キチン、キトサン、ペクチン、トラガントガム、アラビアガム、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、合成もしくは半合成のポリマー、またはグリセリドである。必要に応じて、経口剤形は、不活性希釈剤、またはステアリン酸マグネシウムなどの滑剤、またはパラベンもしくはソルビン酸などの保存剤、またはアスコルビン酸、トコフェロール、もしくはシステインなどの抗酸化剤、崩壊剤、結合剤、増粘剤、緩衝剤、甘味剤、香味剤もしくは着香剤などの投与における補助のためのその他の成分を含み得る。錠剤およびピルは、当技術で公知の好適なコーティング材料でさらに処理してもよい。
[00691]経口投与のための液体剤形は、薬学的に許容されるエマルジョン、シロップ、エリキシル、懸濁液、および溶液の形態であってよく、これらは水などの不活性希釈剤を含み得る。一部の実施形態では、医薬製剤および医薬は、たとえば油、水、アルコール、およびこれらの組み合わせなどであるがこれらに限定されない無菌の液体を使用して液体懸濁液または水性溶液として調製され得る。一部の実施形態では、医薬組成物は凍結乾燥された形態で調製され得る。凍結乾燥された調製物は当技術で公知の凍結保護剤を含み得る。本明細書で使用される用語「凍結保護剤」は一般に、凍結によって誘起されるストレスに対する安定性をタンパク質に提供する薬剤を含む。凍結保護剤の例は、たとえばマンニトールなどのポリオールを含み、たとえばスクロースなどの糖類を含み、たとえばポリソーベート、ポロキサマー、またはポリエチレングリコール、その他の界面活性剤を含む。凍結保護剤は製剤の浸透圧性にも寄与する。薬学的に好適な界面活性剤、懸濁剤、乳濁剤は、経口または非経口の投与のために添加され得る。
[00692]上で注記したように、懸濁液は油を含み得る。そのような油は、ピーナツ油、ゴマ油、綿実油、コーン油、およびオリーブ油を含むが、これらに限定されない。懸濁調整物は、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピルなどの脂肪酸エステル、脂肪酸グリセリド、およびアセチル化脂肪酸グリセリドを含んでもよい。懸濁製剤は、エタノール、イソプロピルアルコール、ヘキサデシルアルコール、グリセロール、およびプロピレングリコールなどであるがこれらに限定されないアルコール類を含み得る。ポリ(エチレングリコール)などであるがこれらに限定されないエーテル類、鉱油およびペトロラタムなどの石油系炭化水素、ならびに水も、懸濁製剤に使用し得る。
[00693]経鼻投与のために、医薬製剤および医薬は、適切な溶媒および必要に応じて安定剤、抗微生物剤、抗酸化剤、pH改質剤、界面活性剤、生物利用性改質剤、およびそれらの組み合わせなどであるがこれらに限定されない他の化合物を含むスプレーまたはエアロゾルであってよい。エアロゾル製剤のための噴射剤は、圧縮空気、窒素、二酸化炭素、または炭化水素系低沸点溶媒を含み得る。
[00694]注射可能な剤形は一般に、好適な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して調製され得る水性懸濁液または油性懸濁液を含む。注射可能な形態は溶液相または懸濁液の形態であり、これは溶媒または希釈剤を用いて調製され得る。許容される溶媒またはビヒクルは滅菌水、リンゲル液、または等張の水性食塩液を含む。あるいは、無菌の油を溶媒または懸濁剤として採用し得る。好ましくは、油または脂肪酸は非揮発性で、天然または合成の油、脂肪酸、モノ−、ジ−、もしくはトリ−グリセリドを含む。
[00695]注射のため、医薬製剤および/または医薬は、上記の適切な溶液での再構成に適した粉末であってよい。これらの例は、凍結乾燥された、回転乾燥もしくはスプレー乾燥された粉末、無定形粉末、顆粒、沈殿物、または粒子を含むが、これらに限定されない。注射のため、製剤は必要に応じて安定剤、pH改質剤、界面活性剤、生物利用性改質剤、およびこれらの組み合わせを含み得る。
[00696]直腸投与のため、医薬製剤および医薬は、腸、S字状結腸曲、および/または直腸における化合物の放出のための坐剤、軟膏、浣腸剤、錠剤、またはクリームの形態であってよい。直腸坐剤は、本発明の1つもしくは複数の化合物、または化合物の薬学的に許容される塩もしくは互変異生体と、許容されるビヒクル、たとえば通常の保存温度では固相で存在し、直腸内などの体内では薬物を放出するのに適した温度で液相で存在するココアバターまたはポリエチレングリコールとを混合することによって調製される。油は、軟ゼラチン型および坐剤の製剤の調製においても採用し得る。水、食塩液、水性のデキストロースおよび関連する糖の溶液、ならびにグリセロールは、ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースなどの懸濁剤、ならびに緩衝剤および保存剤を含んでもよい懸濁液製剤の調製に採用し得る。
[00697]これらの組成物中の抗体またはその抗原結合性断片の濃度は広く、即ち重量で約10%未満から、通常少なくとも約25%から75%または90%もの高さまで、変動することができ、主として選択した特定の投与の様式に従って流体の体積、粘度、その他によって選択されることになる。経口、局所、および非経口で投与し得る組成物を調製するための実際の方法は、当業者には公知または明白であり、たとえば参照により本明細書に組み込まれるRemington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1995)に詳細に記載されている。
[00698]本発明の別の実施形態では、がんの治療を含む上述の疾患、障害、または病態の治療のために有用な材料を含む製造物品が提供される。製造物品は容器およびラベルを含む。好適な容器は、たとえば瓶、バイアル、シリンジ、および試験管を含む。容器はガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。容器は病態の治療に効果的な組成物を保持し、無菌のアクセスポートを有し得る(たとえば容器は皮下注射用の針で穿刺可能な栓を有する静脈内液体バッグまたはバイアルであってよい)。組成物中の活性剤は本発明の抗体である。容器上の、または容器に関連するラベルは、組成物が選択した病態を治療するために使用されることを表示している。製造物品は、リン酸緩衝食塩液、リンゲル液、およびデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第2の容器をさらに含み得る。容器は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用説明書を含む包装挿入物を含む販売および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。本明細書に記載した医薬組成物および医薬は、がん性疾患の治療に有用である。
治療の方法
[00699]本開示は、本明細書で開示した抗体またはその抗原結合性断片を、患者を処置するための有効量で患者に投与することによる、新生物、腫瘍、転移、または制御されない細胞増殖によって特徴付けられる疾患もしくは障害を含むが、これらに限定されないがんの治療または予防のための方法を提供する。
[00700]一部の実施形態では、がんは癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞腫瘍、芽細胞腫、または黒色腫であり得る。一部の実施形態では、がんは膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯茎、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、または子宮からのがんであり得る。一部の実施形態では、がんは新生物、悪性癌腫、癌腫、未分化、巨細胞および紡錘細胞の癌腫、小細胞癌、乳頭癌、扁平上皮細胞癌、リンパ上皮細胞癌、基底細胞癌、ピロマトリックス癌、移行細胞癌、乳頭移行細胞癌、腺癌、ガストリノーマ、胆管癌、肝細胞癌、肝細胞癌と胆管癌の合併、索状腺癌、腺様嚢胞癌、腺腫性ポリープにおける腺癌、腺癌、家族性腺様ポリポーシス、固形癌、カルチノイド腫瘍、鰓肺胞腺癌、乳頭腺癌、嫌色素性癌、好酸性癌、好酸素性腺癌、好塩基性癌、明細胞腺癌、顆粒細胞癌、濾胞性腺癌、乳頭性および濾胞性の腺癌、非カプセル化硬化性癌、副腎皮質癌、内膜癌、皮膚付属物癌、アポクリン腺癌、脂肪質腺癌、耳垢腺癌、粘膜表皮癌、嚢胞腺癌、乳頭嚢胞腺癌、乳頭漿液嚢胞腺癌、粘液嚢胞腺癌、粘液腺癌、印環細胞癌、浸潤性導管癌、延髄癌、小葉癌、炎症性癌、パジェット病、乳腺腺房細胞癌、腺扁平上皮細胞癌、扁平上皮化生を伴う腺癌、胸腺腫、卵巣間質腫瘍、腱鞘腫、顆粒膜細胞腫瘍、アンドロブラストーマ、セルトリ細胞癌、レイディッヒ細胞腫瘍、脂肪細胞腫瘍、傍神経節腫、乳腺外傍神経節腫、褐色細胞腫、グロマンギオ肉腫、黒色腫、悪性黒子、悪性黒子型黒色腫、末端性黒子型黒色腫、粘膜黒色腫、結節性黒色腫、ポリープ状黒色腫、線維形成性黒色腫、皮膚黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、表在性瀰漫性黒色腫、巨大色素母斑における黒色腫、類上皮細胞黒色腫、青色母斑、肉腫、線維肉腫、線維性組織肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、胎児性横紋筋肉腫、肺胞性横紋筋肉腫、間質肉腫、混合腫瘍、ミュラー混合腫瘍、腎芽細胞腫、肝芽細胞腫、癌肉腫、間葉腫、ブレナー腫瘍、フィロデス腫瘍、滑膜肉腫、中皮腫、胚芽細胞腫、胚性癌腫、奇形腫、ストローマ卵巣腫、絨毛癌、中腎腫、血管肉腫、血管内皮腫、カポジ肉腫、血管周囲細胞腫、リンパ管肉腫、骨肉腫、皮質近傍骨肉腫、軟骨肉腫、軟骨芽細胞腫、間葉性軟骨肉腫、骨の巨大細胞腫瘍、ユーイング肉腫、歯原性腫瘍、骨髄芽球性歯肉腫、骨髄芽細胞腫、骨髄芽球性線維肉腫、松果体腫、脊索腫神経膠腫、上衣腫、星状細胞腫、原形質星状細胞腫、原線維性星状細胞腫、星状芽細胞腫、神経膠芽細胞腫、乏突起神経膠腫、乏突起膠芽腫、原始神経外胚葉性腫瘍、小脳肉腫、神経節芽細胞腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、嗅神経原腫瘍、髄膜腫、神経線維肉腫、神経膠腫、顆粒細胞腫瘍、悪性リンパ腫、ホジキン病、ホジキン傍肉芽腫、リンパ腫、小リンパ球性悪性リンパ腫、瀰漫性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、真菌性真菌症、その他の特定の非ホジキンリンパ腫、組織球症、多発性骨髄腫、マスト細胞肉腫、免疫増殖性小腸疾患、白血病、リンパ性白血病、形質細胞白血病 、赤白血病、リンパ肉腫細胞白血病、骨髄性白血病、好塩基性白血病、好酸球性白血病、単球性白血病、マスト細胞白血病、巨核芽球性白血病、骨髄性肉腫、または毛状細胞白血病であり得る。一部の実施形態では、がんは皮膚がんである。一部の実施形態では、皮膚がんは基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、皮膚黒色腫、メルケル細胞癌、異型線維黄色腫、皮膚リンパ腫、または皮膚線維肉腫である。一部の実施形態では、皮膚黒色腫は、表在性瀰漫性黒色腫、結節型黒色腫、末端性黒子型黒色腫、爪下黒色腫、黒子型悪性黒色腫、線維形成性黒色腫、粘膜黒色腫、またはポリープ状黒色腫である。
[00701]本開示の抗体は、それ自体、または疾患、たとえばがんの治療または予防のための本明細書で開示した医薬組成物の形態で、対象に投与し得る。本明細書に記載した抗体もしくはその抗原結合性断片または組成物は、単独で、またはがんを治療するために有用な第2の治療剤または療法と組み合わせて、投与し得る。がんを治療するために有用な第2の療法の例は、放射療法、凍結療法、抗体療法、化学療法、光線力学療法、手術、ホルモン療法、免疫療法、サイトカイン療法、または従来の薬物との組み合わせ療法を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、第2の治療剤は細胞傷害性薬物、腫瘍ワクチン、ペプチド、ぺプチボディ、小分子、細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤、免疫改質剤、インターフェロン、インターロイキン、免疫刺激増殖ホルモン、サイトカイン、ビタミン、ミネラル、アロマターゼ阻害剤、RNAi、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、がん化学療法剤、Tregs標的薬剤、別の抗体、免疫刺激抗体、NSAID、コルチコステロイド、抗酸化剤などの栄養補助剤、シスプラチン、イフォスファミド、パクリタキセル、タキサン類、トポイソメラーゼI阻害剤(たとえばCPT−11、トポテカン、9−AC、およびGG−211)、ゲムシタビン、ビノレルビン、オキサリプラチン、5−フルオロウラシル(5−FU)、ロイコボリン、ビノレルビン、テモダール、およびタキソールであり得る。一部の実施形態では、第2の治療剤は白金系化合物、抗がん活性を有する抗生剤、アントラサイクリン類、アントラセンジオン類、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗有糸分裂剤、タキサン類、タキソイド類、微小管阻害剤、ビンカアルカロイド類、葉酸アンタゴニスト、トポイソメラーゼ阻害剤、抗エストロゲン類、抗アンドロゲン類、アロマターゼ阻害剤、GnRhアナログ類、ならびに5α−リダクターゼ、ビホスホネート類の阻害剤からなる群から選択される化学療法剤である。
[00702]一部の実施形態では、第2の治療剤は、PD−1阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤、プロテアソーム阻害剤、mTOR経路阻害剤、JAK2阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤(TKI)、PI3K阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、セリン/スレオニンキナーゼの阻害剤、細胞内シグナル伝達の阻害剤、Ras/Rafシグナル伝達の阻害剤、MEK阻害剤、AKT阻害剤、生存シグナル伝達タンパク質の阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、治療用モノクローナル抗体、TRAIL経路アゴニスト、抗血管形成剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、カテプシン阻害剤、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体機能の阻害剤、イムノコンジュゲート、抗体薬物コンジュゲート、抗体断片二特異性抗体、二特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)であり得る。一部の実施形態では、別の抗体がセツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、リツキシマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、アレムツズマブ、ラベツズマブ、アデカツムマブ、オレゴボマブ、オナルツズマブ、アポマブ、マパツムマブ、レキサツムマブ、コナツムマブ、チガツズマブ、カツマキソマブ、ブリナツモマブ、イブリツモマブトリウキセタン、トシツモマブ、ブレンツキシマブベドチン、ゲムツズマブオゾガマイシン、クリバツズマブテトラキセタン、ペムツモマブ、トラスツズマブエムタンシン、ベバシズマブ、エタラシズマブ、ボロシキシマブ、ラムシルマブ、アフリベルセプトから選択される。さらに別の実施形態では、第2の治療剤は現在がんの治療に使用されている抗体であり得る。そのような抗体の例は、Herceptin(登録商標)、Retuxan(登録商標)、OvaRex、Panorex、BEC2、IMC−C225、Vitaxin、Campath I/H、Smart MI95、LymphoCide、Smart I D10、およびOncolymを含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、別の抗体は、CTLA4、PD−1、PDL−1、LAG−3、TIM−3、BTLA、B7−H4、B7−H3、VISTAのうち1つもしくは複数を標的とするアンタゴニスト抗体、および/またはCD40、CD137、OX40、GITR、CD27、CD28、ICOSのうち1つもしくは複数を標的とするアゴニスト抗体、またはそれらの組み合わせから選択される免疫刺激抗体である。一部の実施形態では、免疫抑制細胞Tregおよび/またはMDSCを標的とする第2の治療剤は、抗有糸分裂薬物、シクロホスファミド、ゲムシタビン、ミトキサントロン、フルダラビン、サリドマイド、サリドマイド誘導体、COX−2阻害剤、Treg細胞表面受容体の認識によってTregを直接標的とする欠乏抗体もしくは殺滅抗体、抗CD25ダクリズマブ、バシリキシマブ、リガンド指向毒素、デニロイキンジフチトクス(Ontak)(ヒトIL−2とジフテリア毒素の融合タンパク質)、またはLMB−2(CD25に対するscFvとシュードモナス外毒素の融合)、Treg細胞表面受容体を標的とする抗体、TLRモジュレーター、アデノシン作動性経路に干渉する薬剤、エクトヌクレオチダーゼ阻害剤、またはA2Aアデノシン受容体の阻害剤、TGF−β阻害剤、ケモカイン受容体阻害剤、レチノイン酸、全トランスレチノイン酸(ATRA)、ビタミンD3、ホスホジエステラーゼ5阻害剤、シルデナフィル、ROS阻害剤、およびニトロアスピリンから選択される。一部の実施形態では、第2の治療剤は、以下の、IL−2、IL−7、IL−12、IL−15、IL−17、IL−18およびIL−21、IL23、IL−27、GM−CSF、IFNα(インターフェロンアルファ)、IFNα−2b、IFNβ、IFNγなどのサイトカインのうち1つもしくは複数から選択されるサイトカイン療法、および送達のためのそれらの異なる戦略である。一部の実施形態では、第2の治療剤は、腫瘍抗原に対する免疫原性応答を仕掛けるために使用されるタンパク質もしくはペプチドを含む外因性がんワクチン、腫瘍抗原をコードする組換えウイルスおよび細菌のベクター、腫瘍抗原をコードするDNA系ワクチン、樹状細胞系ワクチンを標的とするタンパク質、全腫瘍細胞ワクチン、GM−CSF、ICOS、および/またはFlt3リガンドを発現する遺伝子修飾腫瘍細胞、腫瘍溶解性ウイルスワクチンからなる群から選択される治療用がんワクチンである。
[00703]一部の実施形態では、第2の治療剤は、EPO、G−CSF、ガンシクロビル、抗生剤、リュープロライド、メペリジン、ジドブジン(AZT)、変異体およびアナログを含むインターロイキン1〜18、インターフェロンaなどのインターフェロンもしくはサイトカイン、および黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)およびアナログ、ならびにゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)などのyホルモン類、トランスフォーミング増殖因子、線維芽細胞増殖因子(FGF)、神経増殖因子(NGF)、成長ホルモン放出因子(GHRF)、上皮増殖因子(EGF)、線維芽細胞増殖因子相同因子(FGFHF)、肝細胞増殖因子(HGF)、およびインスリン増殖因子(IGF)などの増殖因子、腫瘍壊死因子アルファ(TNF−α)、侵襲阻害因子2(IIF−2)、骨形成タンパク質1〜7(BMP1〜7)、ソマトスタチン、チモシン−a−1、y−グロブリン、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、補体因子、抗血管形成因子、抗原性物質、およびプロドラッグを含む。
[00704]プロドラッグは、親薬物と比較して腫瘍細胞に対する細胞傷害性が低いか細胞傷害性がなく、酵素によって活性化されまたは変換されて活性なまたはより活性な親形態になることができる薬学的に活性な物質の前駆体または誘導体の形態を指す。たとえばWilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Bel- fast (1986)、およびStella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985)を参照されたい。プロドラッグは、より活性な細胞傷害性遊離薬物に変換することができるリン酸塩含有プロドラッグ、チオリン酸塩含有プロドラッグ、硫酸塩含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、D−アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、ラクタム含有プロドラッグ、必要に応じて置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ、または必要に応じて置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、5−フルオロシトシンおよびその他の5−フルオロウリジンプロドラッグを含むが、これらに限定されない。本明細書における使用のためのプロドラッグ形態に誘導体化することができる細胞傷害性薬物の例は上記の化学療法剤を含むが、これらに限定されない。
[00705]別の実施形態では、本明細書で開示した抗体またはその抗原結合性断片は、がんの予防または治療のために、第2の治療剤の前に(たとえば1分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、8時間、12時間、24時間、2日、または1週間前に)、第2の治療剤に続いて(たとえば1分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、8時間、12時間、24時間、2日、または1週間後に)、または第2の治療剤に付随して、投与される。別の実施形態では、第2の治療剤は、1つまたは複数のがん細胞抗原に対して免疫特異性の抗体であり得る。一部の実施形態では、がんは他の抗がん治療または第2の治療剤に対して難治性である。一部の実施形態では、がんは再発している。一部の実施形態では、本明細書で開示した1つもしくは複数の抗体またはその抗原結合性断片は動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトに投与される。一部の実施形態では、本明細書で開示した抗体またはその抗原結合性断片はがんの外科的切除の後に投与される。本開示の方法および組成物は、本明細書で開示した単一の抗体またはその抗原結合性断片、ならびに本明細書で開示した2つ以上の抗体またはその抗原結合性断片の組み合わせ、または「カクテル」を意図している。一部の実施形態では、2つ以上の抗体は、本明細書で開示した少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、全てで5つの抗体またはその抗原結合性断片を含む。そのような抗体のカクテルは、これらが異なるエフェクター機構を利用する抗体を含み、または直接的に細胞傷害性の抗体と免疫エフェクター機能に依存する抗体とを組み合わせているので、ある種の利点を有し得る。
抗体に基づく遺伝子療法
[00706]本開示の別の態様では、抗体またはその抗原結合性断片をコードする配列を含む核酸分子が、遺伝子療法によって疾患または障害を治療し、阻害し、または予防するために投与される。一部の実施形態では、疾患はがんである。一部の実施形態では、疾患は皮膚がんである。一部の実施形態では、疾患は皮膚黒色腫である。一部の実施形態では、疾患は抗体が結合する抗原の異常な発現および/または活性に関連している。遺伝子療法は、発現されたまたは発現可能な核酸分子を対象に投与することによって実施される療法を指す。本開示のこの実施形態では、核酸分子は、治療効果を媒介するそのコードされたタンパク質(たとえば本明細書で開示した抗体または抗原結合性断片)を産生する。利用可能な遺伝子療法の方法のいずれも、本発明に従って使用することができる。例示的な方法を以下に記載する。遺伝子療法の方法の一般的な総説については、Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993)、Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991)を参照されたい。
[00707]一態様では、核酸分子は抗体をコードする核酸配列を含み、前記核酸分子は、好適な宿主の中で抗体もしくは断片、またはキメラタンパク質、またはその重鎖もしくは軽鎖を発現する発現ベクターの部分である。特に、そのような核酸配列は抗体コード領域に作動可能に連結されたプロモーターを有しており、前記プロモーターは誘起可能または構造的であり、必要に応じて組織特異的である。
[00708]別の特定の実施形態では、核酸分子は、ゲノムの所望の部位において抗体コード配列およびその他の任意の所望の配列の傍に相同組換えを促進する領域が存在し、それにより抗体をコードする核酸の染色体内における発現が提供されるように使用される(Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989)、Zijistra et al., Nature 342:435-438 (1989))。一部の実施形態では、発現された抗体は一本鎖抗体である。あるいは、核酸配列は抗体の重鎖および軽鎖の両方、またはその断片をコードする配列を含む。
[00709]患者への核酸分子の送達は、直接でもよく、その場合には患者は核酸または核酸を運搬するベクターに直接曝露され、または間接でもよく、その場合には細胞が最初にin vitroで核酸によって形質転換され、次いで患者に移植される。これら2つのアプローチはそれぞれ、in vivoまたはex vivo遺伝子療法として公知である。
[00710]特定の実施形態では、核酸分子は直接in vivoで投与され、これはコードされた産生物を産生するように発現される。これは当技術で公知の多くの方法のいずれかによって、たとえば適切な核酸発現ベクターの部分として核酸分子を構築し、たとえば欠如したもしくは弱毒化したレトロウイルスまたはその他のウイルスベクターを使用する感染(米国特許第4,980,286号を参照)、または裸のDNAの直接注射、または微粒子衝撃(たとえば遺伝子銃、Biolistic、Dupont社)の使用、または脂質もしくは細胞表面の受容体もしくはトランスフェクト剤によるコーティング、リポソーム、微粒子、もしくはマイクロカプセルへのカプセル化、または核に進入することが公知であるペプチドに連結された核酸分子を投与すること、受容体媒介エンドサイトーシスを受けるリガンドに連結された核酸分子を投与すること(たとえばWu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)を参照されたい)(これは受容体を特異的に発現している細胞型を標的とするために使用される)などにより、核酸分子が細胞内に入るように投与することによって、達成することができる。別の実施形態では、リガンドがエンドソームを破壊する融合性のウイルスペプチドを含み、それによって核酸がリソソーマル分解を回避することができる核酸−リガンド複合体を形成させることができる。さらに別の実施形態では、核酸は特定の受容体を標的とすることによって、細胞特異的な取り込みおよび発現のためにin vivoで標的とすることができる(たとえばPCT公開番号WO92/06180、WO92/22635、WO92/20316、WO93/14188、WO93/20221を参照されたい)。あるいは、核酸を細胞内に導入し、相同組換えによって発現のために宿主細胞DNAの中に組み込むことができる(Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989)、Zijistra et al., Nature 342:435-438 (1989))。
[00711]特定の実施形態では、本発明の抗体をコードする核酸配列を含むウイルスベクターが使用される。たとえば、レトロウイルスベクターを使用することができる(Miller et al., Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993)を参照されたい)。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングおよび宿主細胞DNAへの統合のために必要な成分を含んでいる。遺伝子療法において使用される抗体をコードする核酸分子は、患者への遺伝子の送達を容易にする1つまたは複数のベクターにクローニングされる。レトロウイルスベクターに関するさらなる詳細は、Boesen et al., Biotherapy 6:291-302 (1994)に見出すことができる。
[00712]本発明ではアデノウイルスも使用され得る。遺伝子療法への別のアプローチは、電気穿孔、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染などの方法で遺伝子を組織培養中の細胞に移入するステップを含む。通常、移入の方法は選択可能なマーカーを細胞に移入することを含む。次いで細胞を選択に供し、移入された遺伝子を取り込んで発現している細胞を単離する。次いでこれらの細胞を患者に送達する。
[00713]本実施形態では、得られる組換え細胞をin vivoで投与する前に、核酸分子を細胞に導入する。そのような導入は、トランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、核酸配列を含むウイルスまたはバクテリオファージのベクターによる感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子移入、ミクロ細胞媒介遺伝子移入、スフェロプラスト融合、その他を含むが、これらに限定されない当技術で公知の任意の方法によって行なうことができる。外来遺伝子を細胞に導入するための数多くの手法が当技術で公知であり(たとえばLoeffler and Behr, Meth. Enzymol. 217:599-618 (1993)を参照されたい)、レシピエント細胞の必要な発生上および生理学的な機能が妨害されない限り、本発明に従って使用し得る。手法は核酸を安定的に細胞に移入し、それにより核酸は細胞によって発現され、好ましくはその細胞の子孫に遺伝され、発現され得る。得られる組換え細胞は当技術で公知の種々の方法によって患者に送達することができる。組換え血液細胞(たとえば造血幹細胞または前駆細胞)は、好ましくは静脈内投与される。使用を予測される細胞の量は所望の効果、患者の状態、その他により、当業者によって決定することができる。
[00714]遺伝子療法の目的のために核酸を導入することができる細胞は任意の所望の利用可能な細胞型を包含し、上皮細胞、内皮細胞、角化細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞、Tリンパ球、Bリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒細胞などの血液細胞、種々の幹細胞もしくは前駆細胞、特にたとえば骨髄から得られる造血幹細胞もしくは造血前駆細胞、臍帯血、末梢血、胎児肝、その他を含むが、これらに限定されない。
[00715]一実施形態では、遺伝子療法に使用する細胞は患者と同種である。本発明の抗体をコードする核酸配列が細胞に導入され、それにより細胞またはその子孫によって抗体が発現可能になり、次いで治療効果のために組換え細胞がin vivoで投与される。特定の実施形態では、幹細胞または前駆細胞が使用される。in vitroで単離され維持され得る任意の幹細胞および/または前駆細胞が本発明の実施形態に従って使用できる可能性がある(たとえばPCT公開番号WO94/08598、Stemple and Anderson, Cell 71:973-985 (1992)、Rheinwald, Meth. Cell Bio. 21A:229 (1980)、およびPittelkow and Scott, Mayo Clinic Proc. 61:771 (1986)を参照されたい)。
投薬
[00716]がんの治療(予防を含む)のための抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物が本明細書で提供される。一部の実施形態では、組成物は薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。組成物は、がんの治療(予防を含む)に効果的な量で投与される。一部の実施形態では、組成物(たとえば抗体もしくはその抗原結合性断片、または前記抗体もしくはその抗原結合性断片をコードする核酸分子)は、対象における免疫応答を強化するためおよび/またはT細胞の活性化を増大するために効果的な量で投与される。組成物は、任意の利用可能な手段、たとえば非経口投与によって対象にin vivo投与するために使用される。対象への投与のため、本明細書に記載した組成物または抗体もしくはその抗原結合性断片を含む医薬は無菌であり得る。無菌は、無菌の濾過膜を通す濾過、またはその他の当業者には公知の方法によって容易に達成することができる。一実施形態では、組成物または医薬は、発熱性物質またはエンドトキシンが存在しないように処理されている。医薬組成物または医薬を発熱性物質またはエンドトキシンについて試験し、発熱性物質またはエンドトキシンが存在しない医薬組成物または医薬を調製すること、または臨床的に許容できるレベルでエンドトキシンを有する医薬組成物または医薬を調製することは、当業者にはよく理解されている。医薬組成物または医薬を発熱性物質またはエンドトキシンについて試験するための市販のキットが利用可能である。
[00717]本明細書に記載した方法におけるin vivo投与、たとえば非経口投与のために使用すべき組成物は無菌であり得る。無菌は、無菌の濾過膜を通す濾過、またはその他の当業者には公知の方法によって容易に達成される。
[00718]本明細書に記載した抗体またはその抗原結合性断片は、適正医療基準に合致する様式で製剤化され、投薬され、投与される。これに関して考慮すべき因子は、治療される特定の障害、治療される特定の対象、個別の対象の臨床病態、障害の原因、薬剤送達の部位、投与の方法、投与のスケジュール、および臨床医には公知の他の因子を含む。物質/分子、アゴニスト、またはアンタゴニストの「治療有効量」は、疾患の状態、個体の年齢、性別、および体重、ならびに物質/分子、アゴニスト、またはアンタゴニストが個体に所望の応答を誘発する能力などの因子に従って変動し得る。治療有効量は、物質/分子、アゴニスト、またはアンタゴニストの毒性または有害な効果があれば治療に有益な効果がそれを上回る量でもある。治療有効量は1回またはそれを超える投与で送達してよい。治療有効量は、所望の治療および/または予防の結果を達成するために必要な用量および時間で効果的な量を指す。投与すべき「治療有効量」は、そのような考慮によって左右され、がんを改善し、治療し、または安定化させて進行までの期間(無進行生存の継続期間)を延長し、または腫瘍、休眠腫瘍、もしくはミクロ転移の発生もしくは再発を治療しもしくは予防するために必要な最小の量を指す。本明細書で開示した抗体またはその抗原結合性断片は、必要によりがんまたはがんを進行させるリスクを予防しまたは治療するために現在使用されている1つまたは複数の追加の治療剤とともに製剤化される。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体もしくはその抗原結合性断片の量、障害または治療の型、および上で論じた他の因子による。これらは一般に、以前本明細書で使用した同じ用量および投与経路で、またはこれまでに採用した用量の約1〜99%の用量で使用される。
[00719]抗体の用量は、投与される対象の年齢および大きさ、標的疾患、病態、投与経路、その他によって変動し得る。好ましい用量は、典型的には体重または体表面積に従って計算される。本明細書に開示した抗体またはその抗原結合性断片が成人患者の病態または疾患の治療に使用される場合には、本発明の抗体を通常、約0.01〜約20mg/kg体重、より好ましくは約0.02〜約7、約0.03〜約5、または約0.05〜約3mg/kg、約5mg/kg、約7.5mg/kg、約10mg/kg、または約15mg/kg体重の単一用量で静脈内投与することが有利であり得る。病態の重症度に応じて、治療の頻度および継続期間を調整することができる。投与のための効果的な用量およびスケジュールは実験的に決定し得る。たとえば、定期的な評価によって患者の進行具合をモニターし、それに従って用量を調整することができる。さらに、当技術で周知の方法を用いて種の間の用量の増減を実施することができる(たとえばMordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351)。
一部の実施形態では、本明細書の組成物は、たとえばがんのリスクのある、または疾患の初期段階にある対象に投与する際に、予防効果量を含み得る。「予防効果量」は、所望の予防的結果を達成するために必要な用量および期間で有効な量を指す。典型的には、予防的用量は疾患の前または初期段階で対象に使用されるので、予防的用量は治療用量より少ない。
[00720]有利には、上記の経口または非経口の使用のための医薬組成物は、活性成分の用量に適合させるのに適した単位用量で剤形に調製される。単位用量におけるそのような剤形は、たとえば錠剤、ピル、カプセル、注射液(アンプル)、坐剤、その他を含む。
[00721]投与は、たとえば1回もしくは複数の個別の投与、または連続注入であってよい。数日またはそれ以上にわたる繰り返し投与のため、病態に応じて、治療はたとえば当技術で公知の方法によって測定してがんが治療されるまで持続される。しかし他の投薬レジメンも有用であり得る。1つの非限定的な例では、本明細書で開示した抗体またはその抗原結合性断片は毎週1回、2週ごと、または3週ごとに、5mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg、または15mg/kgを含むがこれらに限定されない約5mg/kg〜約15mg/kgの用量範囲で投与される。本明細書に記載した方法の使用の進行は、従来の手法およびアッセイによって容易にモニターし得る。本明細書に記載した方法を使用する療法の継続期間は、医学的に指示される限り、または所望の治療効果(たとえば本明細書に記載した効果)が達成されるまで、継続される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載した1つもしくは複数の抗体もしくはその抗原結合性断片または組成物の投与は、1か月、2か月、4か月、6か月、8か月、10か月、1年、2年、3年、4年、5年、10年、20年、または対象の寿命までの年の期間、継続される。
治療の有効性
[00722]本開示の抗体もしくはその抗原結合性断片または医薬組成物を投与するステップを含むがんの治療方法の有効性は、腫瘍の縮退、腫瘍の重量または寸法の縮小、進行までの期間、生存の継続期間、無進行生存、全体の応答率、応答の継続期間、および生活の質を含むがこれらに限定されない、がんの治療の評価に一般に用いられる種々のエンドポイントによって測定することができる。本明細書で開示した抗体またはその抗原結合性断片は、薬物に対する臨床応答の特有の尺度および定義を必要とすることがある。がんの場合には、治療有効量の本明細書で開示した抗体、その抗原結合性断片またはこれらを含む組成物は、がん細胞の数を減少させ、腫瘍の寸法を低減させ、周囲臓器へのがん細胞の浸潤を阻害(即ちある程度遅く、好ましくは停止)し、腫瘍の転移を阻害(即ちある程度遅く、好ましくは停止)し、腫瘍の増殖をある程度阻害し、および/または障害に関連する症状の1つもしくは複数をある程度軽減することができる。本明細書で開示した抗体またはその抗原結合性断片が増殖を防止しおよび/または存在するがん細胞を殺滅するように作用する程度に、これは細胞増殖抑制性および/または細胞傷害性であり得る。がん療法について、in vivoにおける有効性は、たとえば生存の継続期間、無進行生存(PFS)の継続期間、応答率(RR)、応答の継続期間、および/または生活の質を評価することによって測定することができる。
[00723]皮膚がん(たとえば皮膚黒色腫)の治療または予防に関するこれらの実施形態では。黒色腫の症状は、存在するほくろの形状もしくは色の変化、または結節性黒色腫の場合には皮膚のいずれの場所でも新たなしこりの出現を含むがこれらに限定されない。後の段階では、ほくろはかゆみ、潰瘍化、または出血を生じ得る。黒色腫の初期の兆候は、非対称、境界(縁部および隅部を伴い不規則)、色(斑状)、直径(6mm(0.24インチ)を超え、ほぼ字消しの寸法)、経時的な発達、奇妙な外観によってまとめられる。結節性黒色腫は、皮膚表面より高く出現し、触ると硬く、成長する。転移性黒色腫は、食欲の喪失、吐き気、嘔吐、および疲労を含む非特異的な腫瘍随伴性症状を惹起し得る。初期の黒色腫の転移はあり得るが、比較的まれであり、初期に診断された黒色腫の5分の1未満が転移する。転移黒色腫を有する患者の中では脳転移が特に一般的である。これは肝臓、骨、腹部、または遠位リンパ節にも広がり得る。一部の実施形態では、皮膚がん(たとえば皮膚黒色腫)の1つまたは複数の症状は、本明細書に記載した組成物および方法の使用によって阻害されまたは治療される。
[00724]他の実施形態では、がん、たとえば皮膚黒色腫などの皮膚がんに罹患しやすい、またはがんと診断されたヒト対象の無進行生存を増大するための方法を本明細書に記載する。疾患の進行までの時間は、薬物の投与から疾患の進行または死亡までの期間として定義される。好ましい実施形態では、本明細書で開示した抗体またはその抗原結合性断片および1つまたは複数の化学療法剤を使用する本発明の組み合わせ治療は、化学療法単独による治療と比較して、少なくとも約1か月、1.2か月、2か月、2.4か月、2.9か月、3.5か月、約1〜約5か月など、無進行生存を顕著に増大し得る。別の実施形態では、本明細書に記載した方法は、種々の療法で治療したがんに罹患しやすい、またはがんと診断されたヒト対象の群における応答率を顕著に増大させ得る。応答率は、治療に応答した治療された対象のパーセンテージとして定義される。一実施形態では、本明細書で開示した抗体またはその抗原結合性断片、たとえば組換え抗体またはその抗原結合性断片、および1つまたは複数の化学療法剤を使用する本明細書に記載した組み合わせ治療は、化学療法単独で治療した群と比較して、治療した対象群における応答率を顕著に増大させる。
[00725]本明細書で使用される場合、用語「治療する」、「治療」、「治療する」、または「改善」は、対象者が疾患または障害の進行またはそれに関連する病態の重症度を好転させ、軽減し、改善し、阻止し、遅らせ、または停止させるべき治療処置を指す。用語「治療する」は、慢性感染症またはがんなどであるが、これらに限定されない慢性的な免疫病態に関連する病態、疾患、または障害の少なくとも1つの有害影響または症状を低減しまたは軽減することを含む。1つまたは複数の症状または臨床的マーカーが低減すれば、治療は一般に「効果的」である。あるいは、疾患の進行が低減されまたは停止されれば、治療は「効果的」である。即ち、「治療」は症状またはマーカーの改善だけでなく、治療が存在しない場合に予想される症状の進行または悪化を少なくとも遅らせることの中断をも含む。有益なまたは望ましい臨床結果は、検出可能であっても検出不能であっても、1つもしくは複数の症状の軽減、疾患の程度の縮小、疾患の安定化(即ち悪化しない)状態、疾患の進行の遅延または遅らせること、疾患状態の改善または緩和、および寛解(部分的であっても全体的であっても)を含むが、これらに限定されない。用語、疾患の「治療」は、疾患の症状または副作用からの救済を提供することをも含む(緩和治療も含む)。
[00726]たとえば、一部の実施形態では、本明細書に記載した方法は、がんの症状を軽減するために、有効量の本明細書に記載した抗体またはその抗原結合性断片を対象に投与することを含む。本明細書で使用される場合、「がんの症状を軽減する」は、がんに関連するいずれの病態または症状をも改善し低減することである。相当する未治療の対照と比較し、そのような低減または予防の程度は、任意の標準的な手法によって測定して、少なくとも5%、10%、20%、40%、50%、60%、80%、90%、95%、または100%である。理想的には、がんは当技術で公知の任意の標準的な方法で検出して完全に除去され、その場合にはがんは治療されたと考えられる。がんについて治療される患者は、臨床医がそのような病態を有していると診断した者である。診断は任意の好適な手段であり得る。診断およびモニタリングは、たとえば生体試料(たとえば組織もしくはリンパ節の生検、血液検査、または尿検査)中のがん細胞のレベルの検出、生体試料中のがんの代理マーカーのレベルの検出、特定のがんに関連する症状の検出、またはそのようながんに典型的な免疫応答に関与する免疫細胞の検出を含み得る。
[00727]本明細書で使用される用語「有効量」は、疾患または障害の少なくとも1つもしくは複数の症状を軽減するために必要な抗体もしくはその抗原結合性断片またはこれらを含む組成物の量を指し、所望の効果を提供するための医薬組成物の十分な量に関連する。したがって、用語「治療有効量」は、典型的な対象に投与した際に特定の効果を及ぼすために十分な本明細書で開示した抗体またはその抗原結合性断片の量を指す。本明細書で使用する有効量は、疾患の症状の進行を遅延させ、疾患の症状の経過を改変し(たとえば疾患の症状の進行を遅くするがそれだけに限定されない)、または疾患の症状を好転させるために十分な量をも含んでよい。したがって、正確な「有効量」を特定することは不可能である。しかし任意の所与の場合について、日常の実験のみを用いて当業者によって適切な「有効量」を決定することはできる。
[00728]有効量、毒性、および治療有効性は、たとえばLD50(集団の50%に致死的な用量)およびED50(集団の50%に治療有効な用量)を決定するための細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。用量は、採用した剤形および利用した投与経路に応じて変動し得る。毒性効果と治療効果との間の用量の比が治療インデックスであり、比LD50/ED50として表わすことができる。大きな治療インデックスを示す組成物および方法が好ましい。治療有効用量は最初に細胞培養アッセイから推定することができる。また、用量を動物モデルで数式化して、細胞培養または適切な動物モデルで決定される症状の最大半値阻害を達成するIC50(即ち抗体またはその抗原結合性断片の濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成することができる。血漿中のレベルは、たとえば高性能液体クロマトグラフィーによって測定することができる。任意の特定の用量の効果は、好適なバイオアッセイによってモニターすることができる。用量は医師によって決定し、必要に応じて治療の観察された効果に適合するように調節することができる。
[00729]がんの治療および/または予防は、がんに関連する症状の軽減、がんの進行の阻害、がんの縮退の促進、免疫応答の促進、腫瘍増殖の阻害、腫瘍寸法の阻害、転移の阻害、がん細胞の成長の阻害、がん細胞の増殖の阻害、またはがん細胞の死の惹起を含むが、これらに限定されない。
投与の様式
[00730]本明細書に記載した抗体またはその抗原結合性断片は、対象に効果的な治療をもたらす任意の適切な経路で、それを必要とする対象に投与することができる。本明細書で使用される場合、用語「投与」および「導入」は相互交換可能に用いられ、所望の効果が生じるように、所望の部位、たとえば炎症またはがんの部位における薬剤の少なくとも部分的局在化をもたらす方法または経路によって抗体またはその抗体部分を対象に配置することを指す。
[00731]一部の実施形態では、本明細書に記載した抗体もしくはその抗原結合性断片またはこれらを含む組成物は、薬剤を全身的にまたは所望の表面もしくは標的に送達し、注射、注入、点滴、および吸入による投与を含み得るがこれらに限定されない任意の様式の投与によって阻害されるべきがんを有する対象に投与される。経口投与形態も本明細書で意図される。「注射」は、限定なく静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、心室内、関節包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、関節包下、くも膜下、頭蓋内、脊椎内、脳脊椎内、および胸骨内の注射ならびに注入を含む。
[00732]本明細書で使用される語句「非経口投与」および「非経口的に投与される」は、経腸および局所の投与以外の投与の様式、通常は注射による投与を指す。本明細書で使用される語句「全身投与」、「全身的に投与される」、「末梢投与」、および「末梢に投与される」は、二特異性または多特異性のポリペプチド薬剤が対象の循環系に進入し、それにより代謝およびその他の同様のプロセスを受けるような、標的の部位、組織、または臓器、たとえば腫瘍部位へのそれらの薬剤の直接以外の投与を指す。
[00733]一部の実施形態では、本明細書に記載した抗体もしくはその抗原結合性断片またはこれらを含む組成物は、ボーラスとして、またはある期間にわたる連続的注入として、静脈内投与を介して、筋肉内、腹腔内、脳脊椎内、皮下、関節内、滑膜内、髄腔内、経口、局所、または吸入の経路によって、投与することができる。広範な副作用または毒性が本明細書に記載した抗体もしくはその抗原結合性断片またはこれらを含む組成物の使用に関連する場合には、たとえば血管形成が起こっている腫瘍またはがんの部位への局所投与が特に望ましい。一部の実施形態における治療用途には、ex vivo戦略を用いることもできる。ex vivo戦略は、対象から得た細胞を本明細書に開示した核酸配列でトラスフェクトまたは形質導入することを含む。トランスフェクトしたまたは形質導入された細胞は次いで対象に返される。細胞は限定なく造血細胞(たとえば骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、T細胞、またはB細胞)、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、角化細胞、または筋肉細胞を含む広範囲の型のいずれかであり得る。
[00734]一部の実施形態では、本明細書に開示した抗体もしくはその抗原結合性断片またはこれらを含む組成物は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、および鼻内、ならびに局所免疫抑制治療のために望まれれば病巣内の投与を含む任意の好適な手段によって投与される。
[00735]非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下の投与を含む。一部の実施形態では、本開示の抗体もしくはその抗原結合性断片または組成物は、パルス注入によって、特に抗体の用量を減少させながら好適に投与される。投薬は好ましくは注射、最も好ましくは静脈内または皮下の注射により、部分的に投与が一次的か長期かに応じて与えられる。一部の実施形態では、本開示の抗体もしくはその抗原結合性断片または組成物は、障害または腫瘍の位置によってそれが可能であり、また注射を定期的に繰り返すことが可能である場合には、局所的に、たとえば直接注射によって投与される。一部の実施形態では、本開示の抗体もしくはその抗原結合性断片または組成物は、たとえば休眠腫瘍または微小転移の局所的再発または転移を防止しまたは低減するために、対象に全身的に、または腫瘍細胞に直接、たとえば腫瘍の外科的切除の後の腫瘍または腫瘍床に、送達することもできる。
[00736]本明細書で提供する抗体およびその抗原結合性断片を含む治療用組成物の有効性および能力を向上させるために、本明細書に記載した腫瘍を阻害するための方法の一部の実施形態における使用のための抗体標的ソノポレーション法が意図される。本明細書で使用される場合、「ソノポレーション」は、細胞原形質膜の透過性を一時的に改変するための、それにより大分子、たとえば治療剤の取り込みが可能になる、好ましくは超音波周波数における音、または超音波と造影剤(たとえば安定化された微小泡)との相互作用の使用を指す。ソノポレーションによって惹起される膜の透過性は一過性であり、超音波曝露の後で薬剤を細胞内にトラップさせたままにする。ソノポレーションは、大分子の送達を促進するために微小泡の音響キャビテーションを採用する。
[00737]したがって、本方法の一部の実施形態では、微小泡などの超音波造影剤と混合された本明細書に記載した抗体またはその抗原結合性断片は、がんの治療を必要とする対象に局所的または全身的に注射することができ、超音波を定義された区域、たとえば腫瘍部位に連結し、集中さえさせて、標的送達を達成することができる。一部の実施形態では、本方法は標的送達を達成するために集中超音波法を用いる。本明細書で使用される場合、HIFUまたは「高強度集中超音波」は、上にあるまたは周囲の健常な組織に損傷を与えずに悪性または病原性の組織を加熱して崩壊させる高強度の超音波を使用する非侵襲的治療法を指す。Khaibullina et al., 49 J. Nucl. Med. 295 (2008)およびWO2010/127369に記載されているように、HIFUは抗体またはその抗体断片などの治療剤の送達の手段としても使用することができる。
[00738]造影強化超音波(CEUS)を使用する方法は、本明細書に記載した抗体またはその抗原結合性断片との使用についても意図される。造影強化超音波(CEUS)は、従来の医学的ソノグラフフィーへの超音波造影媒体および超音波造影剤の適用を指す。超音波造影剤は、音波が物質間の界面から反射される異なる様式に頼る薬剤を指す。本明細書に記載した組成物および方法とともに使用するために種々の微小泡造影剤が利用可能である。微小泡はその殻の構成、気体コアの構成、およびそれらが標的とされているかいないかにおいて異なり得る。血管形成性障害に特徴的な受容体に結合する標的リガンドを微小泡にコンジュゲートし、微小泡の複合体が目的の区域、たとえば疾患を有するまたは異常な組織に選択的に集積させることを可能にすることができる。標的された造影強化超音波として公知のこの形態の分子造影は、標的された微小泡が目的の区域に結合するならば、強い超音波シグナルのみを生成することになる。標的された造影強化超音波は、医学診断と医学治療の両方において多くの用途を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載した抗体またはその抗原結合性断片は、標的超音波送達を用いて、がんまたは腫瘍の治療を必要とする対象に投与される。
診断およびその他の用途
[00739]抗原の発現(正常試料に対して増加しもしくは減少した、ならびに/または通常はエピトープの発現がない組織および/もしくは細胞における発現の存在などの不適切な発現)に関連する疾患、障害、または病態の検出、診断、およびモニタリングのための抗体の使用の方法が本明細書で提供される。患者が抗体療法に応答するか否かを判定する方法が本明細書で提供される。
[00740]一部の実施形態では、本方法は、患者が標的抗原を発現する細胞を有しているか否かを本明細書で開示した抗体を使用して検出するステップを含む。一部の実施形態では、検出の方法は、試料を本開示の抗体またはその抗原結合性断片と接触させ、結合のレベルが参照または比較の試料(たとえば対照)の結合のレベルと異なるか否かを決定するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、本明細書に記載した抗体またはポリペプチドが対象のための適切な治療であるか否かを判定するために有用であり得る。
[00741]一部の実施形態では、細胞または細胞/組織の溶解物が抗体と接触させられ、抗体と細胞との結合が決定される。試験細胞が同じ組織型の参照細胞と比較される結合活性を示せば、対象は抗体による治療から恩恵を受けることが指示され得る。一部の実施形態では、試験細胞はヒト組織からのものである。一部の実施形態では、試験細胞はヒト血液からのものである。
[00742]特定の抗体−抗原結合を検出するための当技術で公知の種々の方法を使用することができる。実施できる例示的なイムノアッセイは、蛍光分極イムノアッセイ(FPIA)、蛍光イムノアッセイ(FIA)、酵素イムノアッセイ(EIA)、ネフェロメトリー阻害イムノアッセイ(NIA)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、および放射イムノアッセイ(RIA)を含む。指示部分または標識基は、対象の抗体に結合することができ、またアッセイ装置および適合性のあるイムノアッセイ手順の利用可能性によって決定付けられることが多い本方法の種々の使用の必要性に合致するように選択される。
[00743]適切な標識は、限定なく放射性核種(たとえば125I、131I、35S、3H、または32P)、酵素(たとえばアルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、またはβ−ガラクトシダーゼ)、蛍光部分もしくはタンパク質(たとえばフルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、GFP、またはBFP)、または発光部分(たとえばQuantum Dot Corporation社、Palo Alto,Calif.から供給されているQdot(商標)ナノ粒子)を含む。上記の種々のイムノアッセイの実施において使用されるべき一般的な手法は当業者には公知である。
[00744]診断の目的のため、抗体およびその抗原結合性断片は、放射性同位元素、蛍光標識、および当技術で公知の種々の酵素−基質標識を含むがこれらに限定されない検出可能な部分で標識され得る。抗体に標識をコンジュゲートする方法は当技術で公知である。
[00745]一部の実施形態では、抗体は標識する必要がなく、その存在は、第1の抗体に結合する第2の標識抗体を使用して検出することができる。本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、がん関連抗原の親和性精製剤として、またはたとえば特定の細胞、組織、または血清中におけるその発現を検出することで、がん関連抗原タンパク質の診断アッセイにおいて使用され得る。本明細書で開示した抗体またはその抗原結合性断片は、in vivo診断アッセイのためにも使用し得る。一般に、これらの目的のため、抗体は放射性核種(たとえば111In、99Tc、14C、131I、125I、3H、32P、または32S)によって標識され、それにより腫瘍はイムノシンチグラフィーによって位置が特定され得る。
[00746]本発明の抗体は任意の公知のアッセイ法、たとえば競合結合アッセイ、ELISAなどの直接および間接のサンドイッチアッセイ、および免疫沈降アッセイにおいて採用され得る(Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987))。抗体は、当技術で公知の方法を用いて腫瘍試料を標識する免疫組織化学でも使用され得る。便宜上、本発明の抗体はキット、即ち診断アッセイを実施するための使用説明書とともに包装された所定の量の試薬の組み合わせで提供され得る。抗体が酵素で標識される場合には、キットは酵素が必要とする基質およびコファクター(たとえば検出可能な発色基または蛍光基を提供する基質前駆体)を含むことになる。さらに、他の添加物、たとえば安定剤、緩衝剤(たとえばブロック緩衝剤または溶解緩衝剤)、その他が含まれてもよい。種々の試薬の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する溶液中の試薬の濃度を提供するために広く変動し得る。特に、試薬は溶解に際して適切な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含む、通常凍結された乾燥粉末として提供され得る。
キット
[00747]本明細書に記載した方法のいずれかにおける使用のためのキット、医薬、組成物、および単位剤形も本明細書で提供される。治療有効量の本明細書で開示した抗体またはその抗原結合性断片のうち少なくとも1つを含むキットが本明細書で提供される。一部の実施形態では、キットは第2の治療剤(たとえば化学療法剤)をさらに含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、水性形態または凍結形態である。キットは希釈剤または再構成溶液をさらに含む。
[00748]キットは、抗体(または単位剤形および/もしくは製造物品)を含む1つまたは複数の容器を含み得る。一部の実施形態では、単位用量が抗体を含む所定量(たとえば治療有効量)の組成物を、1つまたは複数の追加の薬剤とともに、またはそれなしに含む単位用量が提供される。一部の実施形態では、そのような単位用量は、注射用の使い捨て充填済みシリンジの中で供給される。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物は、食塩液、スクロース、その他、リン酸塩などの緩衝剤、その他を含んでよく、および/または安定で効果的なpH範囲内で製剤化され得る。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、適切な液体、たとえば無菌水の添加によって再構成され得る凍結乾燥粉末として提供され得る。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、スクロースおよびアルギニンを含むがこれらに限定されない、タンパク質の凝集を阻害する1つまたは複数の物質をさらに含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ヘパリンおよび/またはプロテオグリカンをさらに含む。
[00749]一部の実施形態では、キットは本明細書に記載した方法のいずれかによるがんの治療における使用のための使用説明書をさらに含む。キットは好適な個体または治療の選択に関する説明をさらに含み得る。キット中に供給される使用説明書は、典型的にはラベルまたは包装挿入物(たとえばキットに含まれる紙のシート)に書かれた使用説明書であるが、機械読み取り可能な使用説明書(たとえば磁気または光学の格納ディスクに搭載された使用説明書)も許容される。一部の実施形態では、キットは別の治療剤(たとえば抗がん抗体または化学療法剤)をさらに含む。
[00750]キットは好適な包装に入っている。好適な包装は、バイアル、瓶、ジャー、可撓性包装(たとえばシールされたマイラーまたはプラスチックの袋)、その他を含むがこれらに限定されない。キットは必要に応じて緩衝剤および説明情報などのさらなる成分を提供し得る。したがって本出願はバイアル(シールされたバイアルなど)、瓶、ジャー、可撓性包装、その他を含む製造物品をも提供する。
[00751]がん関連抗体のコンセンサス配列のインシリコ再構築のための例示的な方法が以下に提供される。免疫グロブリンのレパートリーの多様性の推定およびそのレパートリーの中に存在するクローン再構成された免疫グロブリンのCDR3配列の同定のためのコンピュータ解析アプローチも本明細書に記載されている。このアプローチは、前記免疫グロブリンの可変重鎖、可変軽鎖、およびそれぞれのCDR3の完全なコンセンサス配列の再構築のために意図される。
実施例1:免疫グロブリンのレパートリーの多様性の推定
[00752]TCGAコンソーシウム(The Cancer Genome Atlas,NCI&NHGRI)によって収集された473名のTCGA皮膚黒色腫(SKCM)患者についてのRNA−seq FASTQファイルを記録し、解析した。試料中に存在するレパートリーを同定するためにRNA−seq試料(n=473)を免疫グロブリンの参照V、D、およびJ遺伝子とアラインさせた。次いで同一のCDR3配列を同定し、クロノタイプに群別した。情報を、タブ区切りした理解可能なテキストファイル(図1)にエキスポートした。最初の473試料から、免疫グロブリンの重鎖遺伝子にアラインするリードがないか、またはリード数がダウンサンプリング閾値より低い178試料、およびリンパ節に対応するさらなる25試料を除外した。全体として、黒色腫の270試料からの免疫グロブリン(Ig)の多様性に関する情報を収集して解析した。
[00753]VDJtoolsを使用して非機能的(非コーディング)クロノタイプをフィルタリングで除き、基礎的多様性統計を計算した。非機能的クロノタイプは、その受容体配列の中に停止コドンまたはフレームシフトを含むクロノタイプとして同定された。Igレパートリーの多様性は、種の頻度p1、...pi...psを有するS種のコミュニティの場合、多様性(D)が式1
によって与えられるShannon−Wienerエントロピーインデックス(H)の指数であるような、Shannon−Wienerエントロピーインデックスの指数として計算される種の有効数に基づいていた。
[00754]第1のアラインメントステップから得られたファイルにおいてRソフトウェアを用いて、CDR3配列の多様性と患者の全体の生存率との関係を解析した。270試料の中で、50試料は腫瘍のステージについて情報がなく、2試料は生存期間についての情報がなかった。多変数Cox回帰を実施して、免疫グロブリンのレパートリーの多様性が共変量としての疾患の生存率、使用する年齢、性別、腫瘍のステージ、ならびにMZB1およびFOXM1遺伝子の発現と相関するか否かを検討した。0.05未満のP値を、全てのCox回帰解析についての有意差と設定した(図2)。
実施例2:クローナル免疫グロブリン配列の同定
[00755]患者の免疫グロブリン配列をより詳細に検討するため、上位50名の患者(高度にクローナルな患者)を選択した。免疫グロブリンの予測の手作業による精選および対応するリードアラインメントによって、さらにアラインメントを検討する14名の患者を選択した。下の表8に、選択した患者についての臨床およびクローナル性の情報を示す。
実施例3:アラインメントおよびVDJ配列のアセンブリー
[00756]結果を一覧するために第1のアラインメントステップによって同定した免疫グロブリンセグメントに対してアラインメントを実施し、V、D、J遺伝子セグメントに沿った配列ミスマッチの頻度分布、特にCDR3領域の長さの統計について調べることを可能にした。このアラインメントステップは、レパートリーをまとめること、ならびに個別のクエリー配列について再構成および領域アラインメントの詳細な一覧を提供するために有用であった。アラインメントおよびアセンブリーの方法論に関するさらなる詳細を下の表5に示す。
[00757]簡単に述べると、IMGTからの第1のアラインメントステップによる同定されたセグメントを、BraCeRツールにおいて提供された参照ファイルを使用して最初に準備した。次いで自家製のアセンブラーを使用して重鎖Dセグメントおよび軽鎖V−Jジャンクション配列を再構築した(詳細な説明については実施例5を参照されたい)。それぞれの試料について、補正した重鎖Dおよび軽鎖V−Jジャンクション配列を含むFASTAファイルを生成した。アセンブルしたFASTAファイルに加えて、IgBLAST v1.9.0およびIMGTデータベースを使用する生殖細胞系列FASTAファイルも生成した。体細胞FASTA配列をIgBLASTに入力して、重鎖および軽鎖について最も近いセグメントidを得た。次いで、IMGTデータベースからの対応するセグメント配列をマージすることによって生殖細胞系列FASTAを生成した。最終的にアセンブルしたFASTA配列は、アラインメントおよび以下に述べる可視化ステップのための「参照」配列として役立った。全ての最終的な「再構築」したヌクレオチドおよびアミノ酸のコンセンサス配列を本明細書に提供する(表1〜表4)。
品質管理およびアラインメントの視認確認
[00758]アセンブリーステップから生成した参照ファイルを使用して、FASTQをBowTie2デフォルトモードでアラインさせた。出力されたBAMファイルはIGVの可視化のために使用することができ、患者における突然変異を観察することができる。
[00759]4名の例示的な患者についてのデフォルトパラメーターを含むBowTie2を使用する例示のアラインメントおよび対応する超変異を図3A〜3Jに示す。特製のローカルアセンブリーツールを使用して重鎖のDセグメントを同定し、FASTAファイルの対応する部分を編集した。したがって、IGVプロットのDセグメントには突然変異は示されていない。
実施例4:再構成された免疫グロブリンCDR3アミノ酸配列の同定
[00760]最終的にアセンブルしたFASTA配列からのCDR3領域および対応するV、D、およびJ鎖の同定を、IgBLASTによって達成した。IgBLASTのバージョンv.1.9.0を使用する標準化された出力を、デフォルトパラメーターを含むIgBLASTnをラッピングすることによって得た。CDR1、CDR2、およびCDR3のヌクレオチドならびにアミノ酸配列を抽出するように設計された専用の構文解析ツールを使用してIgBLASTサービスからの出力を抽出した。選択した腫瘍試料についてのCDR3の同定されたヌクレオチドおよびアミノ酸コンセンサス配列のまとめを本明細書で提供する(たとえば表2および表4)。
実施例5:VDJ配列同定のワークフロー
[00761]VDJ配列同定のワークフローを使用して、所与の患者の体細胞および生殖細胞系列の配列ならびにCDR領域および変異率などの情報を決定した。例示的なパイプラインは以下の3つのステップを含んでいた(図4)。
1.体細胞の配列同定
2.手作業によるIGVの検討および(必要であれば)体細胞vdj配列の補正
3.生殖細胞系列の配列およびCDR領域の同定
[00762]ワークフローはそれぞれの標的患者について2つの入力を許容した。(1)TCGAアーカイブファイル:患者のTCGAアーカイブファイル。全ての出力ファイルの接頭辞を、患者のアーカイブファイルのメタデータ(即ちアリコートid)に基づいて決定した。(2)予備的アラインメント出力ファイル:予備的アラインメントのIGクローン出力を使用して初期セグメントid予測を得た。このテキストファイルは重鎖および軽鎖の両方の結果を含んでいた。
[00763]パイプラインの3ステップ全てを完了することによって、以下の出力ファイルが得られた。
・体細胞配列:所与の患者の同定されたVDJ配列についてのFASTAファイル
・生殖細胞系列の配列:IMGTデータベースを使用する所与の患者の予測された生殖細胞系列の配列についてのFASTAファイル
・体細胞および生殖細胞系列のFASTAファイルのアミノ酸翻訳
・体細胞FASTAファイルについてのIgBLAST出力ログ:CDR領域を含む。
・アラインメントログ:体細胞配列の重鎖D領域および軽鎖V−Jジャンクションの可視テキスト表現(バリデーションの目的のため)
・パイルアップログ:内部品質管理基準として使用するセグメントの体細胞変異率ならびに重鎖および軽鎖のV−Cセグメントのカバレッジ比率を含む。
ステップ1:体細胞配列の同定
[00764]VDJ配列同定ワークフローの第1のステップは体細胞配列の同定であった。この目的のため、2つの入力を最初に取り出した。これらは、最初のアラインメントステップの間に同定されたIGセグメントid、および患者のFASTQファイルであった。体細胞配列の同定は3つのサブステージで実施した(図5)。
アセンブリーステージ
[00765]予備的なアラインメントステップの間、重鎖および軽鎖の両方についてvdjcセグメントidを同定した。次いでセグメントidおよびIMGTデータベースを使用し、セグメント配列を付加することによって重鎖および軽鎖の配列を生成し、V(D)JC構造を形成した。
[00766]患者のFASTQを最初のアラインメントステップで生成した参照FASTAとアラインさせたときに、重鎖のDセグメント(図6A)と軽鎖のV−Jジャンクション(図6B)が適正にアラインしないことがしばしば観察された。これらの区域で低いカバレッジが観察される1つの理由は、抗体構築における高い突然変異率であり得る。これら2つの領域における体細胞突然変異は十分高く、IMGT参照に対するアラインメントの間に、多くのリードが排除された。さらにリードのサイズはTCGA患者について典型的には小さく(即ち黒色腫データセットについて50bp)、困難な(変異した)領域にアラインさせることがより困難であった。
[00767]重鎖のDおよび軽鎖のV−Jジャンクションにおける正しい配列を同定するために、特製のアセンブリーに基づくアルゴリズムを実行した。最初のアラインメントステップの間に同定されたVDJセグメントから、Vセグメントの終端から22bpのシード配列を選択した。Vセグメントの終端から、リード長さを逆向きに読み取った。そのインデックスから、初期シードとして次の22bpを選択した。
[00768]シード配列が選択されれば、このシード配列を含むリードについて、FASTQファイルを検索した。体細胞突然変異が起こり得るので、4編集距離ペナルティの一致を許容することによって、ファジーパターン検索アルゴリズム(即ちバイタップアルゴリズム)を使用した。
[00769]最初の反復でリードを選択した後、全体のリードをVセグメントと比較することによって、関係のないリードを排除した。最初のアラインメントステップの間に同定されたリードとVセグメントとの共通部分について一致率を検討した。一致率が0.84未満であれば、そのリードは除去した。関係のないリードが除去されれば、リードをその一致率の低下順に分類し、最初の半分のリードをパイルアップ処理のために選択した。
[00770]選択したリードを使用して、塩基をパイルアップし、単一の配列を形成した。生成した配列から別の22bpシードを選択し、新たな反復を開始した。以下の反復では、最大の編集距離ペナルティを1に減少させ、最初の反復とは対照的にリード排除を実施しなかった。Jセグメントの半分を超えてカバーする十分に長い最終的にアセンブルされた配列が得られるまで、反復を継続した(図7)。
[00771]アセンブルした重鎖D領域および軽鎖V−Jジャンクションが得られれば、参照の対応する部分を編集し、アラインメントステージのための中間FASTAファイルを生成した。
b.アラインメントステージ
[00772]特製のアセンブリー法を使用して困難な領域(即ち重鎖Dおよび軽鎖V−Jジャンクション)を同定した後、目的は、リードをアラインさせ、続いてバリアントコーリング操作を行なう標準的なバリアントコーリングパイプラインを使用することによって、残存するバリアント(即ち図8に見られるバリアント)を補正することであった。この目的のため、デフォルトパラメーターを含むBowTie2 2.2.6を使用した。出力BAMファイルのサイズを小さくするため、アラインしなかったリードはBAMファイルから廃棄した。その後、Sambamba0.5.9を使用して出力BAMファイルを分類した。
c.パイルアップステージ
[00773]第3のステージでは、バリアントコーラーを使用するよりは、BAMファイルをアラインメントステージから使用してパイルアップ処理を行ない、参照ファイル中のバリアントを同定して補正した。アラインメントの中のそれぞれの位置について、SNPおよびINDELを検討した。20クォリティ閾値未満のリードは無視した。特定の位置におけるバリアントを同定するため、最小の比率として0.5を適用した。これは、全リードの少なくとも半分がその位置にそのバリアントを含むべきであることを意味している。全カバレッジが200リード未満の位置におけるバリアントも無視した。Vセグメントの最初の数塩基対およびCセグメントの最後の数塩基対における低いカバレッジ値が多くの場合に観察された。
突然変異率の計算
[00774]最終配列が得られれば、その配列を、BAMファイルを生成した元の初期参照ファイルと比較した。突然変異率は、セグメント間のLevenshtein距離をセグメントのアラインメント長さで除すことによって計算した(即ちPython Levenshtein比(seq1、seq2))。
VセグメントおよびCセグメントの間のカバレッジ比率
[00775]患者が高度にクローナルであることを保証するための内部品質管理ステップとして両方の鎖のVセグメントとCセグメントの間の平均カバレッジを検討した。パイルアップログファイルにおいてカバレッジ比率が0.3を超えれば、これは高いクローナル性を示唆していた。高いV/C比は必ずしも患者が高度にクローナルであることを意味しない。しかし低いV/C比は低いクローナル性の強い兆候であり得る。
ステップ2:手作業によるIGVの調査および体細胞配列の補正
[00776]ステップ1によって体細胞FASTAファイルが得られれば、IGVブラウザを使用して手作業によってFASTAファイルを調査した。IGVブラウザは体細胞参照ファイルにおいてバリアントを示すか否かのチェックであった。ステップ1のパイルアップステージにおけるリードの数が少ないために以前省略された塩基が大部分補正された。
ステップ3:生殖細胞系列の配列およびCDR領域の同定
[00777]図9は、生殖細胞系列およびCDR配列の同定の詳細なスキームを図示する。最初の2つのステップで最終の体細胞配列が同定されれば、参照をIgBLASTツールに入力して、IMGTデータベースから最も近いセグメントidを同定した。最も近いidが同定されれば、IMGTデータベースからの配列をV(D)JC形態でマージすることによって生殖細胞系列の配列を生成した。
[00778]IgBLASTは例示的な抗体のCDR1、CDR2、およびCDR3の配列の位置も報告した。これらの位置を使用して、体細胞配列を切り取り、CDR領域をそのアミノ酸翻訳とともに戻した。
[00779]最終ステップとして、再構築した完全な生殖細胞系列および体細胞のVDJコンセンサス配列のアミノ酸翻訳を生成した。
[00780]可変重鎖、可変軽鎖、およびそれらの対応するCDR3の例示的な再構築されたアミノ酸および核酸のコンセンサス配列を以下に提供する。
実施例6:標的がん抗原の同定
大スケールのタンパク質アレイは、抗体の特異性の評価のための多用途で高感度のプラットフォームである。これらは、研究および臨床の用途に広く採用されているタンパク質の結合または親和性試薬の評価のために使用することができる。本発明者らの標的同定実験において使用されるマイクロアレイは、単一の顕微鏡スライド上における最大数で特有かつ全長の個別に精製されたヒトタンパク質を提供する。これにより、数千の相互作用を高いスループット様式でプロファイリングすることが可能になる。全長の組換えタンパク質を酵母S.cerevisiae中で発現し、精製し、一組の対照タンパク質(GST、BSA、ヒストン類、IgG、その他)とともにデュプリケートでガラススライド上に印刷する。そのようなマイクロアレイは特定の種類の表面コーティングに限定されないが、デフォルトは活性タンパク質の表面への非共有結合性であるが不可逆な捕捉のための超薄膜ニトロセルロースフィルムでコートされたガラスである。試料の抗体交差反応アッセイのために14種のタンパク質アレイを使用した。抗体を1μg/mlでアレイ上にプローブし、室温で1時間インキュベートした。プロービングの後、プロトコールに従ってアレイを洗浄し、シグナル検出に最適化された条件下でAlexa647抗ヒトIgG Fcガンマ特異的二次抗体でプローブした。アレイ上に現れたそれぞれのタンパク質について抗体−抗原結合スコアを計算し、zスコアとして表わした。本明細書に記載した抗体のそれぞれについての結果を図15A〜24Eに示す。
[00781]標的抗原ならびに同定された標的抗原についての特異性および親和性を決定するため、単一アレイの上に最大のヒトタンパク質コレクションを含むHuProt(商標)ヒトプロテオームアレイにおけるHigh−Spec(登録商標)交差反応性アレイを使用して、本明細書に記載した抗体を解析する。HuProt(商標)Human Proteome Microarrayによって、抗体とプロファイリングすべき候補抗原タンパク質との相互作用が高いスループット様式で可能になる。全長の組換え候補抗原タンパク質を酵母S.cerevisiae中で発現し、精製し、一組の対照タンパク質(GST、BSA、ヒストン類、IgG、その他)とともにデュプリケートでガラススライド上に印刷する。HuProt(商標)マイクロアレイは特定の種類の表面コーティングに限定されないが、デフォルトは活性タンパク質の表面への非共有結合性であるが不可逆な捕捉のための超薄膜ニトロセルロースフィルムでコートされたガラスである。
[00782]抗体試料を1μg/mlで未処理のHuProtアレイ上にプローブし、室温で1時間インキュベートする。プロービングの後、標準プロトコールに従ってアレイを洗浄し、シグナル検出に最適化された条件下でAlexa647抗ヒトIgG Fcガンマ特異的二次抗体でプローブする。
データ解析
[00783]二次抗体に直接結合する非特異的ヒットは、試料の解析から除外する。アレイ上の特定の標的抗原タンパク質に対するそれぞれの個別の抗体試料の特異性を、Zスコアに基づいて定量する。
[00784]Zスコアは、所与のタンパク質のデュプリケートスポットの平均Zスコアである(それぞれのタンパク質をHuProt(商標)アレイ上にデュプリケートで印刷する)。所与のアレイの上のそれぞれのスポットのZスコアを式
式2.Z=[F635−F635(avg)]/F635(std)
に従って計算する。
[00785]F635(avg)およびF635(std)は、それぞれアレイ上の全てのスポットのF635値の平均および標準偏差である。Sスコアは、所与のタンパク質のZスコアと、その1ランク隣のZスコアとの差である。上位ヒットのSスコアが3を超えれば、抗体は上位ヒットに対して高度に特異的であると考えられる。
[00786]F635は、検出チャネル(635nm)における所与のタンパク質の2つのリプリケートスポットの平均フォアグラウンドシグナル強度である。B635は、検出チャネル(635nm)における所与のタンパク質の2つのリプリケートスポットの平均バックグラウンドシグナル強度である。範囲は3つの数、即ち2つのリプリケートスポットのF635値およびそれらの差を含む。差が(F635値と比較して)あまりにも大きければ、これは2つのスポットが一致せず、ヒットの信頼性が低いことを示す。二次抗体が結合した非特異的ヒットは、試料の解析から除外する。