KR20200118065A - 이중특이적 항원-결합 분자 및 이의 사용 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 제 1 표적 항원 (예컨대, T 세포 항원, 가령, CD3)에 특이적인 1가 아암 및 제 2 표적 항원 (예컨대, 종양 항원, 가령, HER2)에 특이적인 2가 아암을 가지는 이중특이적 항원-결합 분자를 제공한다. 이중특이적 항원-결합 분자는 질병, 가령, 암 (예를 들어, HER2-양성 암)의 치료에 유용하다. 본 발명은 또한 이중특이적 항원-결합 분자의 제조 방법, 이중특이적 항원-결합 분자를 사용하여 질병을 치료하는 방법, 및 이중특이적 항원-결합 분자를 포함하는 조성물을 특징으로 한다.
Description
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이의 전문은 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다. 2019년 2월 6일 작성된 상기 ASCII 사본의 파일명은 50474-162WO2_Sequence_Listing_02.06.19_ST25이고 크기가 293,645 바이트이다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 이중특이적 항원-결합 분자, 이의 조성물 및 질환, 가령, 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
배경
환자에서 특정 세포 유형들 간의 세포-대-세포 접촉을 조작하는 것은 다양한 질환 상태들을 치료하는 유망한 접근방법을 대표한다. 예를 들어, 각각 상이한 표적 항원에 특이적인 2개의 아암을 갖는 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 이중특이적 항체)는 면역 세포를 표적 세포와 접촉시키는 능력과 관련하여 개발 중에 있다. 이러한 이중특이적 항체는 암과 같은 다양한 질병에서 가능성이 있으며, 여기서 종양 표적 세포의 강력한 면역-매개 사멸이 임상 시험에서 관찰되었다. 종양-특이성을 부여하기 위해, 이중특이적 항체의 종양-표적화 아암은 종양 세포에서 과발현된 항원을 표적하도록 설계되었다.
기존의 이중특이적 항체는 짧은 반감기 및 건강한 조직에 대한 독성을 포함하여 몇 가지 제한이 있을 수 있다. 표적 항원의 종양 세포 과발현에 의존하는 이중특이적 항체는 종종 정상 수준의 항원을 발현하는 건강한 비-종양 세포를 사멸시킨다. 이러한 온-타겟, 오프-타겟 효과는 대상체가 관용하는 최대 용량을 제한함으로써 이중특이적 항체 요법의 치료 지수를 제한한다. 따라서, 표적 세포 또는 조직에 대한 향상된 선택성을 갖는 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 이중특이적 항체)의 개발 분야에서 충족되지 않은 수요가 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 1가 아암 및 2가 아암을 갖는 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 1가 아암 및 2가 아암을 갖는 T 세포-의존성 이중특이적 (TDB) 항체)에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 1가 아암 및 2가 아암을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자를 특징으로 하며, 여기서: (a) 1가 아암은 제 1 항원-결합 모이어티를 포함하고, 여기서 제 1 항원-결합 모이어티의 C-말단 제 1 Fc 소단위의 N-말단에 융합되고; (b) 2가 아암은 제 2 항원-결합 모이어티 및 제 3 항원-결합 모이어티를 포함하고, 여기서 제 3 항원-결합 모이어티의 C-말단은 제 2 항원-결합 모이어티의 N-말단에 융합되고, 제 2 항원-결합 모이어티의 C-말단은 제 2 Fc 소단위의 N-말단에 융합되고; 및 (c) 제 1 Fc 소단위는 제 2 Fc 소단위와 결합되어 Fc 도메인을 형성하고, 여기서 제 1 항원-결합 모이어티는 제 1 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있고, 제 2 항원-결합 모이어티 및 제 3 항원-결합 모이어티는 각각 제 2 표적 세포 항원에 특이적으로 결합 할 수 있다. 일부 구체예에서, 제 1 표적 항원은 활성화 T 세포 항원, 가령, CD3이고 및/또는 제 2 표적 세포 항원은 종양 항원 (예를 들어, HER2)이다. 일부 구체예에서, 종양 항원은 (a) 대상체의 종양 세포 및 (b) 대상체의 적어도 하나의 유형의 비-종양 세포에서 발현된다.
일부 구체예에서, 비-종양 세포 대 종양 세포의 종양 항원 복제수의 비는 1:10 내지 1:1,000 (예를 들어, 1:100 내지 1:200)이다. 일부 구체예에서, 종양 항원 복제수는 비 종양 세포에서 102 내지 105이고 종양 세포에서 103 내지 107이다.
일부 구체예에서, 종양 세포 (예를 들어, HER2-양성 종양 세포) 상의 종양 항원 복제수 (예를 들어, 평균 종양 항원 복제수, 예를 들어, HER2 복제수, 예를 들어, 평균 HER2 복제수)는 세포 당 105보다 크다 (예를 들어, 세포 당 105 내지 107, 또는 세포 당 105 내지 106). 일부 구체예에서, 종양 항원 복제수 (예를 들어, 평균 종양 항원 복제수, 예를 들어, HER2 복제수, 예를 들어, 평균 HER2 복제수)는 종양 세포 (예를 들어, HER2-양성 종양 세포) 당 ≥ 200,000이다. 일부 구체예에서, 종양 항원 복제수 (예를 들어, 평균 종양 항원 복제수, 예를 들어, HER2 복제수, 예를 들어, 평균 HER2 복제수)는 비-종양 세포 (예를 들어, 비-암 세포, 예를 들어, 건강한 세포) 당 ≤ 200,000이다.
일부 구체예에서, 제 2 항원-결합 모이어티 및/또는 제 3 항원-결합 모이어티의 1가 결합 친화도 (KD)는 10 nM 내지 100 nM (예를 들어, 20 nM 내지 90 nM, 30 nM 내지 80 nM, 40 nM 내지 60 nM, 예를 들어, 25 nM 내지 55 nM)이다. 한 구체예에서, 제 2 항원-결합 모이어티 및/또는 제 3 항원-결합 모이어티의 1가 결합 친화도 (KD)는 20 nM 내지 50 nM이다. 한 구체예에서, 제 2 항원-결합 모이어티 및 제 3 항원-결합 모이어티의 1가 결합 친화도 (KD)는 20 nM 내지 50 nM이다.
일부 구체예에서, 제 2 항원-결합 모이어티의 1가 KD는 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, BIACORE®표면 플라즈몬 공명)을 사용하여 측정된 Fab 형식의 제 2 항원-결합 모이어티의 KD이고, 이 때 제 3 항원-결합 모이어티의 1가 KD는 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, BIACORE®표면 플라즈몬 공명)을 사용하여 측정된 Fab 형식의 제 3 항원-결합 모이어티의 KD이다.
일부 구체예에서, 제 2 항원-결합 모이어 티 및 / 또는 제 3 항원-결합 모이어 티의 1가 해리 속도는 10-3/초 내지 10-1/초 (예를 들어, 10-2/초 내지 30-2/초)이다. 일부 구체예에서, 제 1 항원-결합 모이어티의 1가 KD는 10 nM 내지 100 nM (예를 들어, 20 nM 내지 90 nM, 20 nM 내지 80 nM, 30 nM 내지 70 nM, 또는 40 nM 내지 60 nM) 이다.
전술한 임의의 구체예들에서, 제 1 항원-결합 모이어티는 가변 중쇄 (VHA) 영역 및 가변 경쇄 (VLA) 영역을 포함하는 Fab 분자 (FabA) 일 수 있고; 제 2 항원-결합 모이어티는 가변 중쇄 (VHB1) 영역 및 가변 경쇄 (VLB1) 영역을 포함하는 Fab 분자 (FabB1)이고; 및/또는 제 3 항원-결합 모이어티는 가변 중쇄 (VHB2) 영역 및 가변 경쇄 (VLB2) 영역을 포함하는 Fab 분자 (FabB2)이다. 그러므로, 일부 구체예들에서, 제 1 항원-결합 모이어티는 VHA 영역 및 VLA 영역을 포함하는 FabA이고, 제 2 항원-결합 모이어티는 VHB1 영역 및 VLB1 영역을 포함하는 FabB1이고, 제 3 항원-결합 모이어티는 VHB2 영역 및 VLB2이다.
일부 구체예에서, VHB1 및 VHB2는 95% 이상 서열 동일성을 공유한다. 추가적으로 또는 대안적으로, VLB1 및 VLB2는 95% 이상 서열 동일성을 공유한다. 추가적으로 또는 대안적으로, VHB1 및 VHB2는 95% 이상 서열 동일성을 공유하고 VLB1 및 VLB2는 95% 이상 서열 동일성을 공유한다.
일부 구체예들에서, VHB1 영역 및/또는 VHB2 영역은 Kabat 넘버링 체계에 따라 N54, D98, F100, 및/또는 Y102 중 1, 2, 3, 또는 4개 잔기 모두에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들면, VH B1 영역 및/또는 VHB2 영역은 Kabat 넘버링 체계에 따라 다음 잔기들: N54E, D98A, D98T, F100A, 및/또는 Y102V 중 1, 2, 3, 4, 또는 5개 모두에서의 아미노산 치환을 특징으로 할 수 있다.
일부 구체예들에서, VLB1 영역 및/또는 VLB2 영역은 Kabat 넘버링 체계에 따라 N30, Y55, 및/또는 H91 중 1, 2, 또는 3개 잔기 모두에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들면, 상기 VLB1 영역 및/또는 VLB2 영역은 다음 잔기들: N30S, Y55E, 및/또는 H91A 중 1, 2, 또는 3개 모두에서의 아미노산 치환을 특징으로 한다.
일부 구체예들에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함하는 VHB1 영역을 특징으로 한다: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는 (c) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 17에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 17에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 17에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 17에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 17에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 17에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는 (c) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 서열 번호: 18에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 18에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 18에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 18에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 18에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 18에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB1은 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB1은 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 17에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 17에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 17에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 17에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 17에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 17에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; VLB1 영역은 서열 번호: 18에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 18에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 18에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 18에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 18에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 18에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, VHB1 영역은 서열 번호: 17의 아미노산을 포함하고; VLB1 영역은 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는 (c) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 17에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 17에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 17에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 17에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 17에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 17에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는 (c) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 서열 번호: 18에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 18에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 18에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 18에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 18에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 18에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB2는 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB2는 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 17에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 17에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 17에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 17에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 17에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 17에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; VLB2 영역은 서열 번호: 18에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 18에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 18에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 18에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 18에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 18에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, VHB2 영역은 서열 번호: 17의 아미노산을 포함하고; VLB2 영역은 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, VLB1 영역 및/또는 VLB2 영역은 H91에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, H91 잔기는 비극성 측쇄를 갖는 아미노산으로 치환된다. 일부 구체예에서, VLB1 영역 및/또는 VLB2 영역은 H91A에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, VLB1 영역 및/또는 VLB2 영역은 Y55에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, Y55 잔기는 산성 측쇄를 갖는 아미노산으로 치환된다. 일부 구체예에서, VLB1 영역 및/또는 VLB2 영역은 Y55E에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, VHB1 영역 및/또는 VHB2 영역은 F100 및/또는 Y102에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, F100 잔기 및/또는 Y102 잔기는 비극성 측쇄를 갖는 아미노산으로 치환된다. 일부 구체예에서, VHB1 영역 및/또는 VHB2 영역은 F100A 및/또는 Y102V에서 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, VLB1 영역 및/또는 VLB2 영역은 하나 이상의 경향성 고정 잔기 (liability fixed residues), 예를 들어, N30S의 아미노산 치환을 포함하는 하나 이상의 경향성 고정 잔기를 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, VHB1 영역 및/또는 VHB2 영역은 하나 이상의 경향성 고정 잔기, 예컨대, N54E, D98A, 및 D98T로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 하나 이상의 경향성 고정 잔기를 특징으로 할 수 있다.
일부 구체예들에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함하는 VHB1 영역을 특징으로 한다: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는 (c) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 24에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 24에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 24에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 24에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 24에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 24에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는 (c) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 서열 번호: 27에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 27에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 27에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 27에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 27에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 27에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB)이다.
일부 구체예들에서, VHB1은 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB1은 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 24에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 24에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 24에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 24에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 24에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 24에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; VLB1 영역은 서열 번호: 27에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 27에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 27에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 27에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 27에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 27에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, VHB1 영역은 서열 번호: 24의 아미노산을 포함하고; VLB1 영역은 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB)이다.
일부 구체예들에서, VHB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는 (c) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 24에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 24에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 24에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 24에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 24에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 24에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는 (c) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 서열 번호: 27에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 27에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 27에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 27에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 27에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 27에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB)이다.
일부 구체예들에서, VHB2는 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB2는 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 24에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 24에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 24에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 24에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 24에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 24에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; VLB2 영역은 서열 번호: 27에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 27에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 27에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 27에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 27에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 27에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, VHB2 영역은 서열 번호: 24의 아미노산을 포함하고; VLB2 영역은 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB)이다.
일부 구체예들에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함하는 VHB1 영역을 특징으로 한다: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는 (c) 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 33에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 33에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 33에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 33에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 33에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 33에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는 (c) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 서열 번호: 25에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 25에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 25에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 25에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 25에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 25에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 4D5 D98A.F100A.Y102V-1Fab-IgG TDB)이다.
일부 구체예들에서, VHB1은 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB1은 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 33에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 33에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 33에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 33에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 33에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 33에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; VLB1 영역은 서열 번호: 25에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 25에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 25에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 25에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 25에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 25에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, VHB1 영역은 서열 번호: 33의 아미노산을 포함하고; VLB1 영역은 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 4D5 D98A.F100A.Y102V-1Fab-IgG TDB)이다.
일부 구체예들에서, VHB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는 (c) 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 33에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 33에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 33에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 33에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 33에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 33에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는 (c) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 서열 번호: 25에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 25에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 25에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 25에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 25에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 25에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 4D5 D98A.F100A.Y102V-1Fab-IgG TDB)이다.
일부 구체예들에서, VHB2는 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB2는 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 33에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 33에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 33에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 33에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 33에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 33에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; VLB2 영역은 서열 번호: 25에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 25에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 25에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 25에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 25에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 25에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, VHB2 영역은 서열 번호: 33의 아미노산을 포함하고; VLB2 영역은 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 4D5 D98A.F100A.Y102V-1Fab-IgG TDB)이다.
일부 구체예들에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함하는 VHB1 영역을 특징으로 한다: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는 (c) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 41에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 41에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는 (c) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 48에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 48에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T-1Fab-IgG TDB)이다.
일부 구체예들에서, VHB1은 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB1은 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 41에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 41에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; VLB1 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 48에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 48에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, VHB1 영역은 서열 번호: 41의 아미노산을 포함하고; VLB1 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T-1Fab-IgG TDB)이다.
일부 구체예들에서, VHB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는 (c) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 41에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 41에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는 (c) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 48에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 48에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T-1Fab-IgG TDB)이다.
일부 구체예들에서, VHB2는 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB2는 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 41에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 41에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; VLB2 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 48에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 48에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, VHB2 영역은 서열 번호: 41의 아미노산을 포함하고; VLB2 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T-1Fab-IgG TDB)이다.
일부 구체예들에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함하는 VHB1 영역을 특징으로 한다: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는 (c) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 44에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 44에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는 (c) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 48에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 48에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB)이다.
일부 구체예들에서, VHB1은 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB1은 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 44에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 44에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; VLB1 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 48에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 48에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, VHB1 영역은 서열 번호: 41의 아미노산을 포함하고; VLB1 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB)이다.
일부 구체예들에서, VHB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는 (c) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 44에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 44에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는 (c) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 48에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 48에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB)이다.
일부 구체예들에서, VHB2는 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB2는 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 44에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 44에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; VLB2 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 48에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 48에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, VHB2 영역은 서열 번호: 44의 아미노산을 포함하고; VLB2 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB)이다.
일부 구체예들에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함하는 VHB1 영역을 특징으로 한다: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는 (c) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 41에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 41에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는 (c) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 49에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 49에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 4D5 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T-1Fab-IgG TDB)이다.
일부 구체예들에서, VHB1은 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB1은 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 41에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 41에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; VLB1 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 49에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 49에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, VHB1 영역은 서열 번호: 41의 아미노산을 포함하고; VLB1 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 4D5 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T-1Fab-IgG TDB)이다.
일부 구체예들에서, VHB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는 (c) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 41에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 41에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는 (c) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 49에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 49에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 4D5 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T-1Fab-IgG TDB)이다.
일부 구체예들에서, VHB2는 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB2는 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 41에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 41에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; VLB2 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 49에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 49에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, VHB2 영역은 서열 번호: 41의 아미노산을 포함하고; VLB2 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 4D5 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T-1Fab-IgG TDB)이다.
일부 구체예들에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함하는 VHB1 영역을 특징으로 한다: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는 (c) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 44에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 44에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는 (c) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 49에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 49에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 4D5 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB)이다.
일부 구체예들에서, VHB1은 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB1은 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 44에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 44에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; VLB1 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 49에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 49에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, VHB1 영역은 서열 번호: 44의 아미노산을 포함하고; VLB1 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 4D5 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB)이다.
일부 구체예들에서, VHB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는 (c) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 44에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 44에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는 (c) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 49에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 49에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 4D5 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB)이다.
일부 구체예들에서, VHB2는 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB2는 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 44에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 44에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; VLB2 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 49에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 49에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, VHB2 영역은 서열 번호: 44의 아미노산을 포함하고; VLB2 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 4D5 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB)이다.
일부 구체예들에서, 전술한 구체예들 중 어느 하나의 이중특이적 항원-결합 분자는 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함하는 VHA 영역을 특징으로 한다: (a) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는 (c) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. 일부 구체예들에서, VHA 영역은 서열 번호: 7에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 7에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 7에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 7에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 7에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 7에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, VHA 영역은 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLA 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는 (c) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VLA 영역은 서열 번호: 8에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 8에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 8에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 8에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 8에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 8에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, VLA 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-CD3 이중특이적 항원-결합 분자 (예컨대, 항-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB, 예컨대, 40G5c CD3 결합 도메인을 가지는 항-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB)이다.
일부 구체예들에서, VHA은 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLA은 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHA 영역은 서열 번호: 7에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 7에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 7에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 7에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 7에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 7에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; VLA 영역은 서열 번호: 8에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 8에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 8에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 8에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 8에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 8에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VHA 영역은 서열 번호: 7의 아미노산을 포함하고; 그리고 VLA 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-CD3 이중특이적 항원-결합 분자 (예컨대, 항-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB, 예컨대, 40G5c CD3 결합 도메인을 가지는 항-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB)이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 1가 아암 및 2가 아암을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자를 특징으로 하며, 여기서: (a) 1가 아암은 FabA 의 C-말단이 제 1 Fc 소단위의 N-말단에 융합된 FabA를 포함하고, 그리고 FabA 는 다음 HVR들을 포함하며: (i) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (b) 2가 아암은 FabB2의 C-말단이 FabB1의 N-말단에 융합되고, FabB1의 C-말단이 제 2 Fc 소단위의 N-말단에 융합된 FabB1 및 FabB2를 포함하고, 여기서 FabB1 및 FabB2 각각은 다음 HVR들을 포함하며: (i) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및 (c) 제 1 Fc 소단위는 제 2 Fc 소단위와 결합하여 Fc 도메인을 형성한다. 일부 구체예들에서, (a) FabA는 VHA 영역 및 VLA 영역을 포함하고, 여기서 VHA 영역은 서열 번호: 7에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, VLA 영역은 서열 번호: 8에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; (b) FabB1은 VHB1 영역 및 VLB1 영역을 포함하고, VHB1 영역은 서열 번호: 17에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, VLB1 영역은 서열 번호: 18에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 (c) FabB2는 VHB2 영역 및 VLB2 영역을 포함하고, 여기서 VHB2 영역은 서열 번호: 17에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 18에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, (a) VHA 영역은 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하고, VLA 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하고; (b) VHB1 영역은 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하고 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 (c) VHB2 영역은 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하고, VLB2 영역은 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 1가 아암 및 2가 아암을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자를 제공하며, 여기서: (a) 1가 아암은 FabA 의 C-말단이 제 1 Fc 소단위의 N-말단에 융합된 FabA를 포함하고, 그리고 FabA 는 다음 HVR들을 포함하며: (i) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (b) 2가 아암은 FabB2의 C-말단이 FabB1의 N-말단에 융합되고, FabB1의 C-말단이 제 2 Fc 소단위의 N-말단에 융합된 FabB1 및 FabB2를 포함하고, 여기서 FabB1 및 FabB2 각각은 다음 HVR들을 포함하며: (i) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및 (c) 제 1 Fc 소단위는 제 2 Fc 소단위와 결합하여 Fc 도메인을 형성한다. 일부 구체예들에서, (a) FabA는 VHA 영역 및 VLA 영역을 포함하고, 여기서 VHA 영역은 서열 번호: 7에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, VLA 영역은 서열 번호: 8에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; (b) FabB1은 VHB1 영역 및 VLB1 영역을 포함하고, VHB1 영역은 서열 번호: 24에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, VLB1 영역은 서열 번호: 27에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 (c) FabB2는 VHB2 영역 및 VLB2 영역을 포함하고, 여기서 VHB2 영역은 서열 번호: 24에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 27에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, (a) VHA 영역은 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하고, VLA 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하고; (b) VHB1 영역은 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하고 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 (c) VHB2 영역은 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하고, VLB2 영역은 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함한다.
또한 또 다른 양상에서, 본 발명은 1가 아암 및 2가 아암을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자를 특징으로 하며, 여기서: (a) 1가 아암은 FabA 의 C-말단이 제 1 Fc 소단위의 N-말단에 융합된 FabA를 포함하고, 그리고 FabA 는 다음 HVR들을 포함하며: (i) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (b) 2가 아암은 FabB2의 C-말단이 FabB1의 N-말단에 융합되고, FabB1의 C-말단이 제 2 Fc 소단위의 N-말단에 융합된 FabB1 및 FabB2를 포함하고, 여기서 FabB1 및 FabB2 각각은 다음 HVR들을 포함하며: (i) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및 (c) 제 1 Fc 소단위는 제 2 Fc 소단위와 결합하여 Fc 도메인을 형성한다. 일부 구체예들에서, (a) FabA는 VHA 영역 및 VLA 영역을 포함하고, 여기서 VHA 영역은 서열 번호: 7에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, VLA 영역은 서열 번호: 8에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; (b) FabB1은 VHB1 영역 및 VLB1 영역을 포함하고, VHB1 영역은 서열 번호: 33에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, VLB1 영역은 서열 번호: 25에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 (c) FabB2는 VHB2 영역 및 VLB2 영역을 포함하고, 여기서 VHB2 영역은 서열 번호: 33에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 25에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, (a) VHA 영역은 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하고, VLA 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하고; (b) VHB1 영역은 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하고 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 (c) VHB2 영역은 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하고, VLB2 영역은 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함한다.
또한 또 다른 양상에서, 본 발명은 1가 아암 및 2가 아암을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자를 특징으로 하며, 여기서: (a) 1가 아암은 FabA 의 C-말단이 제 1 Fc 소단위의 N-말단에 융합된 FabA를 포함하고, 그리고 FabA 는 다음 HVR들을 포함하며: (i) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (b) 2가 아암은 FabB2의 C-말단이 FabB1의 N-말단에 융합되고, FabB1의 C-말단이 제 2 Fc 소단위의 N-말단에 융합된 FabB1 및 FabB2를 포함하고, 여기서 FabB1 및 FabB2 각각은 다음 HVR들을 포함하며: (i) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및 (c) 제 1 Fc 소단위는 제 2 Fc 소단위와 결합하여 Fc 도메인을 형성한다. 일부 구체예들에서, (a) FabA는 VHA 영역 및 VLA 영역을 포함하고, 여기서 VHA 영역은 서열 번호: 7에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, VLA 영역은 서열 번호: 8에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; (b) FabB1은 VHB1 영역 및 VLB1 영역을 포함하고, VHB1 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, VLB1 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 (c) FabB2는 VHB2 영역 및 VLB2 영역을 포함하고, 여기서 VHB2 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, (a) VHA 영역은 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하고, VLA 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하고; (b) VHB1 영역은 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하고 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 (c) VHB2 영역은 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하고, VLB2 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함한다.
또한 또 다른 양상에서, 본 발명은 1가 아암 및 2가 아암을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자를 특징으로 하며, 여기서: (a) 1가 아암은 FabA 의 C-말단이 제 1 Fc 소단위의 N-말단에 융합된 FabA를 포함하고, 그리고 FabA 는 다음 HVR들을 포함하며: (i) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (b) 2가 아암은 FabB2의 C-말단이 FabB1의 N-말단에 융합되고, FabB1의 C-말단이 제 2 Fc 소단위의 N-말단에 융합된 FabB1 및 FabB2를 포함하고, 여기서 FabB1 및 FabB2 각각은 다음 HVR들을 포함하며: (i) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및 (c) 제 1 Fc 소단위는 제 2 Fc 소단위와 결합하여 Fc 도메인을 형성한다. 일부 구체예들에서, (a) FabA는 VHA 영역 및 VLA 영역을 포함하고, 여기서 VHA 영역은 서열 번호: 7에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, VLA 영역은 서열 번호: 8에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; (b) FabB1은 VHB1 영역 및 VLB1 영역을 포함하고, VHB1 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, VLB1 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 (c) FabB2는 VHB2 영역 및 VLB2 영역을 포함하고, 여기서 VHB2 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, (a) VHA 영역은 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하고, VLA 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하고; (b) VHB1 영역은 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하고 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 (c) VHB2 영역은 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하고, VLB2 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-CD3/HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예컨대, 항-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB, 예컨대, 40G5c CD3 결합 도메인 및 2개의 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V HER2 결합 도메인을 가지는 항-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB)이다.
또한 또 다른 양상에서, 본 발명은 1가 아암 및 2가 아암을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자를 제공하며, 여기서: (a) 1가 아암은 FabA 의 C-말단이 제 1 Fc 소단위의 N-말단에 융합된 FabA를 포함하고, 그리고 FabA 는 다음 HVR들을 포함하며: (i) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (b) 2가 아암은 FabB2의 C-말단이 FabB1의 N-말단에 융합되고, FabB1의 C-말단이 제 2 Fc 소단위의 N-말단에 융합된 FabB1 및 FabB2를 포함하고, 여기서 FabB1 및 FabB2 각각은 다음 HVR들을 포함하며: (i) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및 (c) 제 1 Fc 소단위는 제 2 Fc 소단위와 결합하여 Fc 도메인을 형성한다. 일부 구체예들에서, (a) FabA는 VHA 영역 및 VLA 영역을 포함하고, 여기서 VHA 영역은 서열 번호: 7에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, VLA 영역은 서열 번호: 8에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; (b) FabB1은 VHB1 영역 및 VLB1 영역을 포함하고, VHB1 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, VLB1 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 (c) FabB2는 VHB2 영역 및 VLB2 영역을 포함하고, 여기서 VHB2 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, (a) VHA 영역은 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하고, VLA 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하고; (b) VHB1 영역은 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하고 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 (c) VHB2 영역은 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하고, VLB2 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-CD3/HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예컨대, 항-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB, 예컨대, 40G5c CD3 결합 도메인 및 2개의 4D5 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T HER2 결합 도메인을 가지는 항-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB)이다.
또한 또 다른 양상에서, 본 발명은 1가 아암 및 2가 아암을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자를 특징으로 하며, 여기서: (a) 1가 아암은 FabA 의 C-말단이 제 1 Fc 소단위의 N-말단에 융합된 FabA를 포함하고, 그리고 FabA 는 다음 HVR들을 포함하며: (i) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (b) 2가 아암은 FabB2의 C-말단이 FabB1의 N-말단에 융합되고, FabB1의 C-말단이 제 2 Fc 소단위의 N-말단에 융합된 FabB1 및 FabB2를 포함하고, 여기서 FabB1 및 FabB2 각각은 다음 HVR들을 포함하며: (i) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및 (c) 제 1 Fc 소단위는 제 2 Fc 소단위와 결합하여 Fc 도메인을 형성한다. 일부 구체예들에서, (a) FabA는 VHA 영역 및 VLA 영역을 포함하고, 여기서 VHA 영역은 서열 번호: 7에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, VLA 영역은 서열 번호: 8에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; (b) FabB1은 VHB1 영역 및 VLB1 영역을 포함하고, VHB1 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, VLB1 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 (c) FabB2는 VHB2 영역 및 VLB2 영역을 포함하고, 여기서 VHB2 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, (a) VHA 영역은 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하고, VLA 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하고; (b) VHB1 영역은 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하고 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 (c) VHB2 영역은 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하고, VLB2 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-CD3/HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예컨대, 항-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB, 예컨대, 40G5c CD3 결합 도메인 및 2개의 4D5 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V HER2 결합 도메인을 가지는 항-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB)이다.
전술한 양상들 중 임의의 일부 구체예들에서, Fc 도메인은 IgG Fc 도메인 (예컨대, IgG1 또는 IgG4 Fc 도메인)이다. Fc 도메인은 인간 Fc 도메인 일 수 있다. 일부 구체예들에서, Fc 도메인은 Fc 수용체 및/또는 효과기 기능에 대한 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, Fc 수용체 및/또는 효과기 기능에 대한 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환은 L234, L235, 및 P329의 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치에 존재한다 (예컨대, 여기서 제 1 Fc 소단위 및 제 2 Fc 소단위 각각은 L234A, L235A 및 P329G의 아미노산 치환을 포함한다). 일부 구체예들에서, Fc 수용체 및/또는 효과기 기능에 대한 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환은 N297 (예컨대, N297G)에 존재한다. 일부 구체예들에서, Fc 수용체는 Fcγ수용체이다. 일부 구체예들에서, 효과기 기능은 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)이다.
전술한 양상들 중 임의의 일부 구체예들에서, Fc 도메인은 제 1 Fc 소단위와 제 2 Fc 소단위의 결합을 촉진시키도록 구성된 변형을 포함한다. 일부 구체예들에서, 제 2 Fc 소단위의 CH3 도메인 내 아미노산 잔기가 보다 큰 측쇄 부피를 가지는 아미노산 잔기로 대체되어 제 2 Fc 소단위의 CH3 도메인 내부에 돌기를 생성하고, 이는 제 1 Fc 소단위의 CH3 도메인 내부 공동에 위치가능하며, 제 1 Fc 소단위의 CH3 도메인 내 아미노산 잔기는 보다 작은 측쇄 부피를 가지는 아미노산 잔기로 대체되어, 제 1 Fc 소단위의 CH3 도메인 내부에 공동을 생성하고, 이 공동 내부에 제 2 Fc 소단위의 CH3 도메인 내부의 돌기가 이 공동 내부에 위치가능하다. 일부 구체예들에서, 제 2 Fc 소단위의 CH3 도메인은 T366의 아미노산 치환을 포함하고, 제 1 Fc 소단위의 CH3 도메인은 T366, L368, 및/또는 Y407 중 1, 2, 또는 3개 모두에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예들에서, 제 2 Fc 소단위의 CH3 도메인은 T366W의 아미노산 치환을 포함하고, 제 1 Fc 소단위의 CH3 도메인은 T366S, L368A, 및/또는 Y407V 중 1, 2, 또는 3개 모두의 아미노산 치환을 포함한다.
전술한 양상들 중 임의의 일부 구체예들에서, 제 3 항원-결합 모이어티의 C-말단은 펩티드 연결기에 의해 제 2 항원-결합 모이어티의 N-말단에 융합된다. 펩티드 연결기는 5-20 아미노산 길이 (예를 들어, 5-10, 10-15 또는 15-20, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 아미노산 길이)이다.
일부 구체예들에서, 펩티드 연결기는 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 55에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 55에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 55에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 55에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 55에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 55에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 59에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 59에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 59에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 59에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 59에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 59에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 63에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 63에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 63에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 63에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 63에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 63에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 83에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 83에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 83에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 83에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 83에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 83에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 85에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 85에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 85에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 85에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 85에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 85에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 87에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 87에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 87에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 87에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 87에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 87에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 89에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 89에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 89에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 89에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 89에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 89에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 펩티드 연결기는 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 56에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 56에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 56에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 56에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 56에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 56에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 60에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 60에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 60에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 60에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 60에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 60에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 64에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 64에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 64에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 64에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 64에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 64에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 84에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 84에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 84에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 84에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 84에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 84에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 86에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 86에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 86에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 86에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 86에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 86에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 88에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 88에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 88에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 88에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 88에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 88에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 90에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 90에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 90에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 90에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 90에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 90에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 전술한 양상들 중 임의의 이중특이적 항원-결합 분자를 인코드하는 분리된 핵산을 특징으로 한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 전술한 양상들 중 임의의 이중특이적 항원-결합 분자를 인코드하는 분리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 전술한 양상들 중 임의의 이중특이적 항원-결합 분자를 인코드하는 분리된 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포 (예컨대, 분리된 숙주 세포)를 제공한다. 일부 구체예들에서, 숙주 세포는 포유동물 세포 (예컨대, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포)이다. 다른 구체예들에서, 숙주 세포는 원핵 세포 (예컨대, 대장균 세포)이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 전술한 양상들 중 임의의 이중특이적 항원-결합 분자의 제조 방법을 특징으로 한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 배양 배지에서 상기 기재된 임의의 숙주 세포 (예를 들어, 전술한 양상들 중 임의의 이중특이적 항원-결합 분자를 인코드하는 분리된 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포)를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 상기 이중특이적 항원-결합 분자 를 회수하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 전술한 양상들 중 임의의 이중특이적 항원-결합 분자를 인코드하는 분리된 핵산들의 세트 (예컨대, 전술한 양상들 중 임의의 이중특이적 항원-결합 분자를 인코드하는 분리된 핵산들 2, 3, 4개, 또는 그 이상을 포함하는 세트)를 특징으로 한다. 일부 구체예들에서, 분리된 핵산들의 세트는 제 1 분리된 핵산 및 제 2 분리된 핵산을 포함하고, 여기서 제 1 분리된 핵산은 이중특이적 항원-결합 분자의 제 1 아암의 하나 이상의 아미노산 서열들을 인코드하고 제 2 분리된 핵산은 이중특이적 항원-결합 분자의 제 2 아암의 하나 이상의 아미노산 서열들을 인코드한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 벡터들의 세트를 제공하며, 여기서 이러한 세트의 각 벡터는 분리된 핵산들의 세트의 분리된 핵산을 포함하고, 여기서 분리된 핵산들의 세트 (예컨대, 전술한 양상들 중 임의의 이중특이적 항원-결합 분자를 인코드하는 분리된 핵산들 2, 3, 4개 또는 그 이상을 포함하는 세트)는 전술한 양상들 중 임의의 이중특이적 항원-결합 분자를 인코드한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 숙주 세포들의 세트 (예컨대, 분리된 숙주 세포들의 세트)를 제공한다. 일부 구체예들에서, 상기 세트의 각 숙주 세포는 분리된 핵산들의 세트의 분리된 핵산을 포함하고, 여기서 분리된 핵산들의 세트 (예컨대, 전술한 양상들 중 임의의 이중특이적 항원-결합 분자를 인코드하는 분리된 핵산들 2, 3, 4개 또는 그 이상을 포함하는 세트)는 전술한 양상들 중 임의의 이중특이적 항원-결합 분자를 인코드한다. 일부 구체예들에서, 상기 세트의 각 숙주 세포는 분리된 핵산들의 세트의 분리된 핵산을 포함하는 벡터를 포함하고, 여기서 분리된 핵산들의 세트 (예컨대, 전술한 양상들 중 임의의 이중특이적 항원-결합 분자를 인코드하는 분리된 핵산들 2, 3, 4개 또는 그 이상을 포함하는 세트)는 전술한 양상들 중 임의의 이중특이적 항원-결합 분자를 인코드한다. 일부 구체예들에서, 숙주 세포들의 세트는 포유동물 세포 (예컨대, CHO 세포)를 포함한다. 일부 구체예들에서, 숙주 세포들의 세트는 원핵 세포 (예컨대, 대장균 세포)를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 전술한 양상의 숙주 세포들의 세트를 배양 배지에서 배양하는 것을 포함하는, 전술한 양상들 중 임의의 이중특이적 항원-결합 분자의 제조 방법을 제공한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 상기 이중특이적 항원-결합 분자 를 회수하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 전술한 양상들 중 임의의 이중특이적 항원-결합 분자 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체를 특징으로 한다.
또한 또 다른 양상에서, 본 발명은 전술한 양상들 중 임의의 이중특이적 항원-결합 분자 를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구체예들에서, 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 희석제를 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, 조성물은 약학 조성물이다. 일부 구체예들에서, 조성물은 PD-1 축 결합 길항제 또는 추가 치료제를 추가로 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 약제로서 사용되는, 전술한 양상들 중 어느 하나의 이중특이적 항원-결합 분자를 특징으로 한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, 본원에 기재된 이중특이적 항원-결합 분자는 이를 필요로 하는 대상체에서 세포증식성 질병 (예를 들어, 암) 또는 자가면역 질병의 치료 또는 진행을 지연시키기 위해 사용된다. 일부 구체예들에서, 전술한 양상들 중 임의의 이중특이적 항원-결합 분자는 세포 증식성 질병 (예를 들어, 암, 예를 들어, HER2-양성 암) 또는 자가면역 질병을 갖는 대상체에서 면역 기능을 향상시키기 위해 사용된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 질병의 치료 또는 진행을 지연시키기 위한 약제의 제조에 있어서 전술한 양상들 중 임의의 이중특이적 항원-결합 분자의 용도를 특징으로 한다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 질병을 갖는 대상체에서 면역 기능을 향상시키기 위한 약제의 제조에 있어서 전술한 양상들 중 임의의 이중특이적 항원-결합 분자의 용도를 특징으로 한다. 일부 구체예들에서, 질병은 세포 증식성 질병 (예컨대, 암, 예컨대, HER2-양성 암) 또는 자가면역 질병이다.
또한 또 다른 양상에서, 본 발명은 전술한 양상들 중 임의의 이중특이적 항원-결합 분자를 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 필요로 하는 대상체에서 질병의 치료 또는 이의 진행을 지연시키는 방법을 특징으로 한다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 전술한 양상들 중 임의의 이중특이적 항원-결합 분자를 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 질병을 가진 대상체에서 면역 기능을 향상시키는 방법을 제공한다. 일부 구체예들에서, 질병은 세포 증식성 질병 (예컨대, 암, 예컨대, HER2-양성 암) 또는 자가면역 질병이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 필요로 하는 대상체에서 질병의 치료 또는 이의 진행을 지연시키는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 종양 세포 상의 HER2 발현을 결정하는 단계, 여기서 종양 세포는 세포 당 200,000 이상 복사체의 평균 복제수로 HER2를 발현하고; 및 (b) 전술한 양상들 중 임의의 이중특이적 항원-결합 분자를 대상체에 투여하는 단계. 일부 구체예들에서, 질병은 세포 증식성 질병 (예컨대, 암, 예컨대, HER2-양성 암) 또는 자가면역 질병이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 질병을 갖는 대상체에서 면역 기능을 향상시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 종양 세포 상의 HER2 발현을 결정하는 단계, 여기서 종양 세포는 세포 당 200,000 이상 복사체의 평균 복제수로 HER2를 발현하고; 및 (b) 전술한 양상들 중 임의의 이중특이적 항원-결합 분자를 대상체에 투여하는 단계. 일부 구체예들에서, 질병은 세포 증식성 질병 (예컨대, 암, 예컨대, HER2-양성 암) 또는 자가면역 질병이다.
전술한 양상들 중 임의의 일부 구체예들에서, 암은 유방암, 위암, 결장직장암, 비-소 세포 폐암, 신장암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 간암, 두경부암, 흑색종, 난소암, 중피종, 교모세포종, 자궁내막암, 및 골육종으로 구성된 그룹에서 선택된다. 일부 구체예들에서, 암은 HER2-양성 암 (예를 들어, HER2-양성 유방암, HER2-양성 위암, HER2-양성 결장직장암, HER2-양성 비소 세포 폐암, HER2-양성 신장암, HER2-양성 방광암, HER2-양성 췌장암, HER2-양성 전립선암, HER2-양성 간암, HER2-양성 두경부암, HER2-양성 흑색종, HER2-양성 난소암, HER2-양성 중피종, HER2-양성 교모세포종, HER2-양성 자궁내막암 또는 HER2-양성 골육종)이다.
일부 구체예들에서, HER2-양성 암 (예컨대, HER2-양성 유방암, HER2-양성 위암, HER2-양성 결장직장암, HER2-양성 비소 세포 폐암, HER2-양성 신장암, HER2-양성 방광암, HER2-양성 췌장암, HER2-양성 전립선암, HER2-양성 간암, HER2-양성 두경부암, HER2-양성 흑색종, HER2-양성 난소암, HER2-양성 중피종, HER2-양성 교모세포종, HER2-양성 자궁내막암, 또는 HER2-양성 골육종)은 HER2를 세포 당 200,000 이상 (예컨대, 세포 당 250,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 300,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 400,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 500,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 600,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 700,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 750,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 800,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 900,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 1,000,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 1,200,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 1,500,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 2,000,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 2,500,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 3,000,000 이상의 HER2 복사체, 또는 그 이상, 예컨대, 세포 당 200,000 내지 3,000,000의 HER2 복사체, 세포 당 250,000 내지 2,500,000의 HER2 복사체, 세포 당 300,000 내지 2,000,000의 HER2 복사체, 세포 당 400,000 내지 1,500,000의 HER2 복사체, 또는 세포 당 500,000 내지 1,000,000의 HER2 복사체, 예컨대, 세포 당 200,000 내지 1,000,000의 HER2 복사체 (예컨대, 세포 당 200,000 내지 250,000의 HER2 복사체, 세포 당 250,000 내지 300,000의 HER2 복사체, 세포 당 300,000 내지 400,000의 HER2 복사체, 세포 당 400,000 내지 500,000의 HER2 복사체, 세포 당 500,000 내지 750,000의 HER2 복사체, 또는 세포 당 750,000 내지 1,000,000의 HER2 복사체) 또는 세포 당 1,000,000 내지 3,000,000의 HER2 복사체 (예컨대, 세포 당 1,000,000 내지 1,500,000의 HER2 복사체, 세포 당 1,500,000 내지 2,000,000의 HER2 복사체, 세포 당 2,000,000 내지 2,500,000의 HER2 복사체, 또는 세포 당 2,500,000 내지 3,000,000의 HER2 복사체)의 복제수 (예컨대, 평균 복제수)로 발현하는 종양 세포로 특징된다.
전술한 양상들 중 임의의 일부 구체예들에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg (예컨대, 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 예컨대, 약 1 mg/kg)의 용량으로 대상체에 투여된다.
일부 구체예들에서, PD-1 축 결합 길항제 및/또는 추가 치료제가 대상체에게 투여된다. 일부 구체예들에서, PD-1 축 결합 길항제 또는 추가 치료제는 이중특이적 항원-결합 분자의 투여에 앞서 또는 후속하여 투여된다. 일부 구체예들에서, PD-1 축 결합 길항제 또는 추가 치료제는 이중특이적 항원-결합 분자와 동시에 투여된다. 일부 구체예들에서, PD-1 축 결합 길항제는 PD-L1 결합 길항제 (예컨대, 아테졸리주맙 (MPDL3280A), YW243.55.S70, MDX-1105, MEDI4736 (더발루맙), 및 MSB0010718C (아벨루맙)), PD-1 결합 길항제 (예컨대, MDX-1106 (니볼루맙), MK-3475 (펨브롤리주맙), CT-011 (피딜리주맙), MEDI-0680 (AMP-514), PDR001 (스파르탈리주맙), REGN2810 (세미플리맙), 및 BGB-108), 및 PD-L2 결합 길항제 (예컨대, 항체 또는 면역부착소)로 구성된 그룹에서 선택된다.
일부 구체예들에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 피하, 정맥내, 근육내, 국부, 경구, 경피, 복강내, 안와내, 이식에 의해, 흡입에 의해, 척수강내, 심실내 (intraventricularly), 또는 비강내로 투여된다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 피하 투여된다. 다른 구체예들에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 정맥내 투여된다.
전술한 양상들 중 임의의 일부 구체예들에서, 대상체는 인간이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 다음을 포함하는 키트를 특징으로 한다: (a) 전술한 양상들 중 임의의 이중특이적 항원-결합 분자를 포함하는 조성물; 및 (b) 질병 (예를 들어, 세포 증식성 질병 (예를 들어, 암) 또는 자가면역 질병)의 치료 또는 진행을 지연시키기 위해 상기 조성물을 대상체에게 투여하기 위한 지침을 포함하는 패키지 삽입물. 일부 구체예들에서, 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 희석제를 추가로 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 SKBR3 세포 및 MCF7 세포에 의한 HER2 단백질의 상대적인 발현을 보여주는 면역블롯이다.
도 2A-2F는 다양한 1가 HER2 TDB (IgG TDB) 분자에 의한 SKBR3 세포 (빈 사각형) 및 MCF7 세포 (채워진 점)의 상대적 사멸의 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다. 도 2A는 야생형 4D5 IgG TDB 항체 (트라스투주맙)에 의한 표적 세포 사멸의 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. 도 2B는 4D5 항체 변이체, Y55E.Y102V-TDB에 의한 표적 세포 사멸의 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. 도 2C는 4D5 항체 변이체, Y55E.D98A.F100A.Y102V-IgG TDB에 의한 표적 세포 사멸의 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. 도 2D는 4D5 항체 변이체, D98A.F100A.Y102V-IgG TDB에 의한 표적 세포 사멸의 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. 도 2E는 4D5 항체 변이체, H91A-IgG TDB에 의한 표적 세포 사멸의 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. 도 2F는 4D5 항체 변이체, Y100A-IgG TDB에 의한 표적 세포 사멸의 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 3은 1Fab-IgG TDB 형식의 대표적인 3가 항체의 개략도이다. 항체는 2개의 항-HER2 결합 모이어티를 갖는 2가 아암 및 1개의 항-CD3 결합 모이어티를 갖는 1가 아암을 특징으로 한다.
도 4A는 유세포 분석으로 정량한, SKBR3에 대한 다양한 1Fab-IgG TDB 항체들의 결합을 야생형 4D5 IgG TDB 항체에 대하여 정량하는 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. 채워진 역삼각형은 야생형 4D5 IgG TDB 항체 (트라스투주맙)를 나타내고; 채워진 사각형은 4D5 항체 변이체, H91A-IgG TDB를 나타내고; 채워진 삼각형은 4D5 항체 변이체, D98A.F100A.Y102V-IgG TDB를 나타내고; 빈 역삼각형은 4D5 항체 변이체, Y102V-IgG TDB를 나타내고; 그리고 빈 다이아몬드는 4D5 항체 변이체, Y55E.Y102V-IgG TDB를 나타낸다.
도 4B는 유세포 분석으로 정량한, MCF7에 대한 다양한 1Fab-IgG TDB 항체들의 결합을, 야생형 4D5 IgG TDB 항체에 대하여 정량하는 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. 채워진 역삼각형은 야생형 4D5 IgG TDB 항체 (트라스투주맙)를 나타내고; 채워진 사각형은 4D5 항체 변이체, H91A-IgG TDB를 나타내고; 채워진 삼각형은 4D5 항체 변이체, D98A.F100A.Y102V-IgG TDB를 나타내고; 빈 역삼각형은 4D5 항체 변이체, Y102V-IgG TDB를 나타내고; 그리고 빈 다이아몬드는 4D5 항체 변이체, Y55E.Y102V-IgG TDB를 나타낸다.
도 5A는 시간에 따른 카스파제 3/7 활성으로 정량한, 다양한 1Fab-IgG TDB 항체의 결과로서 SKBR3 세포에서 세포자멸 유도를 야생형 4D5 IgG TDB 항체에 대하여 보여주는 그래프이다. 채워진 점은 야생형 4D5 IgG TDB 항체 (트라스투주맙)를 나타내고; 빈 사각형은 4D5 항체 변이체, H91A-IgG TDB를 나타내고; 채워진 삼각형은 4D5 항체 변이체, D98A.F100A.Y102V-IgG TDB를 나타내고; 빈 삼각형은 4D5 항체 변이체, Y102V-IgG TDB를 나타내고; 그리고 빈 다이아몬드는 4D5 항체 변이체, Y55E.Y102V-IgG TDB를 나타낸다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 5B는 시간에 따른 카스파제 3/7 활성으로 정량한, 다양한 1Fab-IgG TDB 항체의 결과로서 MCF7 세포에서 세포자멸 유도를 야생형 4D5 IgG TDB 항체에 대하여 보여주는 그래프이다. 채워진 점은 야생형 4D5 IgG TDB 항체 (트라스투주맙)를 나타내고; 빈 사각형은 4D5 항체 변이체, H91A-IgG TDB를 나타내고; 채워진 삼각형은 4D5 항체 변이체, D98A.F100A.Y102V-IgG TDB를 나타내고; 빈 삼각형은 4D5 항체 변이체, Y102V-IgG TDB를 나타내고; 그리고 빈 다이아몬드는 4D5 항체 변이체, Y55E.Y102V-IgG TDB를 나타낸다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 6A는 CELLTITER-GLO® 분석법으로 측정한, 50 ng/mL의 다양한 1Fab-IgG TDB 항체들과의 배양에 대한 반응으로 SKBR3 세포들에서의 세포독성을, 야생형 4D5 IgG TDB 항체에 대하여 보여주는 그래프이다. 첫번째 막대 (왼쪽)는 야생형 4D5 TDB 항체 (트라스투주맙)을 나타내고; 두번?? 막대는 4D5 항체 변이체, H91A-IgG TDB를 나타내고; 세번째 막대는 4D5 항체 변이체, D98A.F100A.Y102V-IgG TDB를 나타내고; 네번째 막대는 4D5 항체 변이체, Y102V-IgG TDB를 나타내고; 그리고 다섯번째 막대 (오른쪽)는 4D5 항체 변이체, Y55E.Y102V-IgG TDB를 나타낸다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 6B는 CELLTITER-GLO®분석법으로 측정한, 50 ng/mL의 다양한 1Fab-IgG TDB 항체들과의 배양에 대한 반응으로 MCF7 세포들에서의 세포독성을, 야생형 4D5 IgG TDB 항체에 대하여 보여주는 그래프이다. 첫번째 막대 (왼쪽)는 야생형 4D5 TDB 항체 (트라스투주맙)을 나타내고; 두번?? 막대는 4D5 항체 변이체, H91A-IgG TDB를 나타내고; 세번째 막대는 4D5 항체 변이체, D98A.F100A.Y102V-IgG TDB를 나타내고; 네번째 막대는 4D5 항체 변이체, Y102V-IgG TDB를 나타내고; 그리고 다섯번째 막대 (오른쪽)는 4D5 항체 변이체, Y55E.Y102V-IgG TDB를 나타낸다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 6C는 CELLTITER-GLO®분석법으로 측정한, 50 μg/mL의 다양한 1Fab-IgG TDB 항체들과의 배양에 대한 반응으로 MCF7 세포들에서의 세포독성을, 야생형 4D5 IgG TDB 항체에 대하여 보여주는 그래프이다. 첫번째 막대 (왼쪽)는 야생형 4D5 TDB 항체 (트라스투주맙)을 나타내고; 두번?? 막대는 4D5 항체 변이체, H91A-IgG TDB를 나타내고; 세번째 막대는 4D5 항체 변이체, D98A.F100A.Y102V-IgG TDB를 나타내고; 네번째 막대는 4D5 항체 변이체, Y102V-IgG TDB를 나타내고; 그리고 다섯번째 막대 (오른쪽)는 4D5 항체 변이체, Y55E.Y102V-IgG TDB를 나타낸다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 7A는 유세포 분석으로 정량한, SKBR3 세포에 대한 다양한 1Fab-IgG TDB 항체들의 결합을, 야생형 4D5 IgG TDB 항체 (트라스투주맙; 채워진 삼각형)에 대하여 정량하는 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. 빈 삼각형은 4D5 항체 변이체, Y55E.H91A-1Fab-IgG TDB를 나타내고; 사각형은 4D5 항체 변이체, Y100Aa-1Fab-IgG TDB를 나타내고; 그리고 원은 4D5 항체 변이체, H91A.N30A-1Fab-IgG TDB를 나타낸다.
도 7B는 유세포 분석으로 정량한, MCF7 세포에 대한 다양한 1Fab-IgG TDB 항체들의 결합을, 야생형 4D5 IgG TDB 항체 (트라스투주맙; 채워진 삼각형)에 대하여 정량하는 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. 빈 삼각형은 4D5 항체 변이체, Y55E.H91A-1Fab-IgG TDB를 나타내고; 사각형은 4D5 항체 변이체, Y100Aa-1Fab-IgG TDB를 나타내고; 그리고 원은 4D5 항체 변이체, H91A.N30A-1Fab-IgG TDB를 나타낸다.
도 8은 CELLTITER-GLO®분석법으로 측정한, SKBR3 세포에 대한 다양한 1Fab-IgG TDB 항체의 세포독성을 정량하는 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. 빈 사각형은 4D5 항체 변이체, H91A-1Fab-IgG TDB를 나타내고; 채워진 사각형은 4D5 항체 변이체, Y100Aa-1Fab-IgG TDB를 나타내고; 그리고 원은 4D5 항체 변이체, H91A.N30A-1Fab-IgG TDB를 나타낸다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 9는 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체에 대한 4D5 IgG TDB 항체의 세포독성을 비교하는 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. SKBR3 세포 및 MCF7 세포에서 4D5 IgG TDB 항체에 의해 유도된 세포독성은 각각 채워진 원 및 채워진 사각형으로 표시된다. SKBR3 세포 및 MCF7 세포에서 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체에 의해 유도된 세포독성은 각각 빈 삼각형 및 빈 사각형으로 표시된다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 10은 90개의 유방암 세포주에서 ErbB2 RNA 발현의 RNA-seq 분석 결과를 보여주는 그래프이다. 세포주는 낮은 ErbB2 발현, 중간 ErbB2 발현 및 높은 ErbB2 발현 세포주로 분류되었다.
도 11A는 낮은 ErbB2 발현 세포주 (MDA-MB-436, PC3, MCF7/neo-cl3, MDA-MB-231, LS1034, 및 HT55), 중간 ErbB2 발현 세포주 (MDA-MB-453, MDA-MB-175-VII, JIMT-1, 및 MKN7), 및 높은 Erb2 발현 세포주 (MDA-MB-361, SKBR3, BT474-M1, SK-OV-3, 및 KPL4)에서 50 ng/mL 농도의 4D5 IgG TDB 항체들의 세포독성을 보여주는 그래프이다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 11B는 낮은 ErbB2 발현 세포주 (MDA-MB-436, PC3, MCF7/neo-cl3, MDA-MB-231, LS1034, 및 HT55), 중간 ErbB2 발현 세포주 (MDA-MB-453, MDA-MB-175-VII, JIMT-1, 및 MKN7), 및 높은 Erb2 발현 세포주 (MDA-MB-361, SKBR3, BT474-M1, SK-OV-3, 및 KPL4)에서 50 μg/mL 농도의 4D5 IgG TDB 항체들의 세포독성을 보여주는 그래프이다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 11C는 낮은 ErbB2 발현 세포주 (MDA-MB-436, PC3, MCF7/neo-cl3, MDA-MB-231, LS1034, 및 HT55), 중간 ErbB2 발현 세포주 (MDA-MB-453, MDA-MB-175-VII, JIMT-1, 및 MKN7), 및 높은 Erb2 발현 세포주 (MDA-MB-361, SKBR3, BT474-M1, SK-OV-3, 및 KPL4)와 함께 배양된 인간 CD8+ T 세포의 활성화에 대한 50 ng/mL 농도의 4D5 IgG TDB 항체들의 효과를 보여주는 그래프이다. T 세포 활성화는 CD69 및 CD45의 이중 발현으로 측정되었다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 11D는 도 11A-11C에 나타낸 각각의 세포주에 의한 HER2 단백질 발현을 보여주는 면역블롯이다.
도 12A는 낮은 ErbB2 발현 세포주 (MDA-MB-436, PC3, MCF7/neo-cl3, MDA-MB-231, LS1034, 및 HT55), 중간 ErbB2 발현 세포주 (MDA-MB-453, MDA-MB-175-VII, JIMT-1, 및 MKN7), 및 높은 Erb2 발현 세포주 (MDA-MB-361, SKBR3, BT474-M1, SK-OV-3, 및 KPL4)에서 50 ng/mL 농도의 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체들의 세포독성을 보여주는 그래프이다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 12B는 낮은 ErbB2 발현 세포주 (MDA-MB-436, PC3, MCF7/neo-cl3, MDA-MB-231, LS1034, 및 HT55), 중간 ErbB2 발현 세포주 (MDA-MB-453, MDA-MB-175-VII, JIMT-1, 및 MKN7), 및 높은 Erb2 발현 세포주 (MDA-MB-361, SKBR3, BT474-M1, SK-OV-3, 및 KPL4)에서 50 μg/mL 농도의 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체들의 세포독성을 보여주는 그래프이다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 12C는 낮은 ErbB2 발현 세포주 (MDA-MB-436, PC3, MCF7/neo-cl3, MDA-MB-231, LS1034, 및 HT55), 중간 ErbB2 발현 세포주 (MDA-MB-453, MDA-MB-175-VII, JIMT-1, 및 MKN7), 및 높은 Erb2 발현 세포주 (MDA-MB-361, SKBR3, BT474-M1, SK-OV-3, 및 KPL4)와 함께 배양된 인간 CD8+ T 세포의 활성화에 대한 50 ng/mL 농도의 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체들의 효과를 보여주는 그래프이다. T 세포 활성화는 CD69 및 CD45의 이중 발현으로 측정되었다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 12D는 도 12A-12C에 나타낸 각각의 세포주에 의한 HER2 단백질 발현을 보여주는 면역블롯이다.
도 13은 HBL-100 세포에서 4D5 H91A-IgG TDB 항체 (사각형) 및 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체 (원)의 세포독성을 정량화하는 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 14A는 HBL-100 세포에서 다양한 농도의 4D5 H91A-IgG TDB 항체의 세포 독성을 시간에 따라 정량화하는 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. 채워진 원은 5,000 ng/mL 용량의 4D5 H91A-IgG TDB를 나타내고, 빈 사각형은 500 ng/mL 용량의 4D5 H91A-IgG TDB를 나타내고, 채워진 삼각형은 50 ng/mL 용량의 4D5 H91A-IgG TDB를 나타내고, 빈 역삼각형은 5 ng/mL 용량의 4D5 H91A-IgG TDB를 나타내고, 빈 다이아몬드는 0.5 ng/mL 용량의 4D5 H91A-IgG TDB를 나타내고, 그리고 채워진 다이아몬드는 비처리 대조군을 나타낸다.
도 14B는 HBL-100 세포에서 다양한 농도의 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체의 세포 독성을 시간에 따라 정량화하는 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. 채워진 원은 5,000 ng/mL 용량의 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB를 나타내고, 빈 사각형은 500 ng/mL 용량의 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB를 나타내고, 채워진 삼각형은 50 ng/mL 용량의 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB를 나타내고, 빈 역삼각형은 5 ng/mL 용량의 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB를 나타내고, 빈 다이아몬드는 0.5 ng/mL 용량의 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB를 나타내고, 그리고 채워진 다이아몬드는 비처리 대조군을 나타낸다.
도 15A는 왼쪽에서 오른쪽으로, 증가하는 양의 HER2를 발현시키는 세포주에 대한, 4D5 H91A-IgG TDB 및 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB의 사멸 효과를, 기저 면역블롯 및 막대 그래프로 보여주는 그래프 세트이다.
도 15B는 상대 HER2 발현의 IHC 및 FISH 검출 분석 결과를 보여주는 일련의 현미경 사진이다.
도 15C는 도 15B에서 특성화된 세포들의, 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB에 의한 사멸을 보여주는 그래프이다.
도 16은 MCF7 세포, HT55 세포 및 HER2-증폭된 KPL4 세포에서 HER2 단백질 발현을 보여주는 면역블롯이다.
도 17은 인간 PBMC가 보충된 마우스에서 다양한 용량의 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체 또는 야생형 4D5 TDB 항체를 사용한 치료 과정에 걸친 KPL4 종양 부피를 보여주는 격자 플롯이다. KPL4 종양이 확립된 마우스들에게 0일차에 지시된 용량을 단회 정맥내 투약하였다. 격자의 각 패널은 패널 헤더로 표시한 바와 같이 하나의 용량 그룹을 도시한다. 굵은, 검은색 실선은 각 용량 그룹에 대해 적합된 종양 부피를 나타낸다. 굵은 점선은 히스티딘 완충액 운반체를 받은 대조군에 대하여 적합된 종양 부피를 나타낸다. 빈 원이 있는 점선은 개개 동물들을 나타낸다. 채워진 점이 있는 실선은 연구에서 제거된 동물을 나타낸다. 수평의 회색 점선은 500 mm3의 종양 부피를 표시한다.
도 18은 인간 PBMC가 보충된 마우스에서 다양한 용량의 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체 또는 야생형 4D5 IgG TDB 항체를 사용한 치료 과정에 걸친 HT55 종양 부피를 보여주는 격자 플롯이다. HT55 종양이 확립된 마우스들에게 0일차에 지시된 용량을 단회 정맥내 투약하였다. 격자의 각 패널은 패널 헤더로 표시한 바와 같이 하나의 용량 그룹을 도시한다. 굵은, 검은색 실선은 각 용량 그룹에 대해 적합된 종양 부피를 나타낸다. 굵은 점선은 히스티딘 완충액 운반체를 받은 대조군에 대하여 적합된 종양 부피를 나타낸다. 빈 원이 있는 점선은 개개 동물들을 나타낸다. 채워진 점이 있는 실선은 연구에서 제거된 동물을 나타낸다. 수평의 회색 점선은 500 mm3의 종양 부피를 표시한다.
도 19는 인간 PBMC가 보충된 마우스에서 다양한 용량의 4D5 D98A.F100A.Y102V-1Fab-IgG TDB 항체 또는 야생형 4D5 IgG TDB 항체를 사용한 치료 과정에 걸친 KPL4 종양 부피를 보여주는 격자 플롯이다. KPL4 종양이 확립된 마우스들에게 0일차에 지시된 용량을 단회 정맥내 투약하였다. 격자의 각 패널은 패널 헤더로 표시한 바와 같이 하나의 용량 그룹을 도시한다. 굵은, 검은색 실선은 각 용량 그룹에 대해 적합된 종양 부피를 나타낸다. 굵은 점선은 히스티딘 완충액 운반체를 받은 대조군에 대하여 적합된 종양 부피를 나타낸다. 빈 원이 있는 점선은 개개 동물들을 나타낸다. 채워진 점이 있는 실선은 연구에서 제거된 동물을 나타낸다. 수평의 빨간색 점선은 500 mm3의 종양 부피를 표시한다.
도 20은 SKBR3 세포에서 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체 (채워진 원) 및 4D5 D98A.F100A.Y102V-1Fab-IgG TDB 항체 (빈 사각형)의 세포독성을 정량화하는 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 21A는 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체에 의한 높은 HER2-발현 세포주의 사멸을 나타내는 그래프이다 (n = 20). 높은 HER2-발현 세포주는 Erb2 RNA의 높은 발현을 특징으로 한다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 21B는 4D5 D98A.F100A.Y102V-1Fab-IgG TDB 항체에 의한 높은 HER2-발현 세포주의 사멸을 나타내는 그래프이다 (n = 20). 높은 HER2-발현 세포주는 Erb2 RNA의 높은 발현을 특징으로 한다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 22는 4D5 D98A.F100.Y102V-1Fab-IgG TDB 항체에 의한 높은 HER2-발현 세포주 사멸의 상대적인 효능을 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체에 대하여 보여주는 그래프이다. 데이터는 도 20A 및 20B로부터 도출된다.
도 23A는 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체에 의한 중 HER2-발현 세포주의 사멸을 나타내는 그래프이다 (n = 12). SKBR3 세포의 사멸은 양성 대조군으로 제공된다. 중 HER2-발현 세포주는 Erb2 RNA의 중간 발현을 특징으로 한다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 23B는 4D5 D98A.F100A.Y102V-1Fab-IgG TDB 항체에 의한 중 HER2-발현 세포주의 사멸을 나타내는 그래프이다 (n = 12). SKBR3 세포의 사멸은 양성 대조군으로 제공된다. 중 HER2-발현 세포주는 Erb2 RNA의 중간 발현을 특징으로 한다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 24는 4D5 D98A.F100.Y102V-1Fab-IgG TDB 항체에 의한 중 HER2-발현 세포주 사멸의 상대적인 효능을 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체에 대하여 보여주는 그래프이다. 데이터는 도 22A 및 22B로부터 도출된다.
도 25A는 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체에 의한 낮은 HER2-발현 세포주의 사멸을 나타내는 그래프이다 (n = 12). SKBR3 세포의 사멸은 양성 대조군으로 제공된다. 낮은 HER2-발현 세포주는 Erb2 RNA의 낮은 발현을 특징으로 한다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 25B는 4D5 D98A.F100A.Y102V-1Fab-IgG TDB 항체에 의한 낮은 HER2-발현 세포주의 사멸을 나타내는 그래프이다 (n = 12). SKBR3 세포의 사멸은 양성 대조군으로 제공된다. 낮은 HER2-발현 세포주는 Erb2 RNA의 낮은 발현을 특징으로 한다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 26은 4D5 D98A.F100.Y102V-1Fab-IgG TDB 항체에 의한 낮은 HER2-발현 세포주 사멸의 상대적인 효능을 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체에 대하여 보여주는 그래프이다. 데이터는 도 24A 및 24B로부터 도출된다.
도 27A는 도 27B에서 시험한 2개의 펩티드 연결기의 위치 및 서열을 보여주는 개략도이다. 각각의 펩티드 연결기는 원위 Fab의 불변 중쇄 (CH) 영역의 C-말단을 근위 Fab의 가변 중쇄 (VH) 영역의 N-말단에 융합시킨다. 도 27B에서, DKTHTGGGGSGG (서열 번호: 52)는 빈 사각형으로 나타내고, 그리고 DKTHT (서열 번호: 50)는 채워진 원으로 나타낸다.
도 27B는 DKTHTGGGGSGG 연결기 (빈 사각형)를 갖는 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체의 MCF7 세포에 대한 결합을 정량화하는 용량 반응 곡선을, DKTHT 연결기 (채워진 원)를 갖는 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체에 대해 보여주는 그래프이다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 27C는 DKTHTGGGGSGG 연결기 (빈 사각형)를 갖는 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체에 의한 SKBR3 세포의 사멸을 정량화하는 용량 반응 곡선을, DKTHT 연결기 (채워진 원)를 갖는 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체에 대해 보여주는 그래프이다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 28A는 SKBR3 세포에 의한 pAKTS473 및 pHER3의 발현에 대한 항-HER2-CD3 1Fab-IgG의 효과를 시간에 따라 보여주는 일련의 면역블롯이다.
도 28B는 항-HER2-CD3 1Fab-IgG, 항-HER2-CD3 IgG TDB 및 트라스투주맙 처리에 반응하여 SKBR3 세포의 생존력을 정량화하는 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 29A는 BIACORE®표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정한, 직접 고정된 인간 HER2 (세포외 도메인; Novus Biologicals)에 대한 야생형 4D5 Fab의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이다. 야생형 4D5 Fab 샘플은 3배 희석에서 0.27 nM 내지 200 nm의 농도 범위였다.
도 29B는 BIACORE®표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정한, 직접 고정된 인간 HER2 (세포외 도메인; Novus Biologicals)에 대한 4D5 Y55E.Y102V-Fab의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이다. 4D5 Y55E.Y102V-Fab 샘플은 3배 희석에서 0.27 nM 내지 200 nm의 농도 범위였다.
도 29C는 BIACORE®표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정한, 직접 고정된 인간 HER2 (세포외 도메인; Novus Biologicals)에 대한 4D5 D98A.F100A.Y102V-Fab의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이다. 4D5 D98A.F100A.Y102V-Fab 샘플은 3배 희석에서 0.27 nM 내지 200 nm의 농도 범위였다.
도 29D는 BIACORE®표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정한, 직접 고정된 인간 HER2 (세포외 도메인; Novus Biologicals)에 대한 4D5 H91A-Fab의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이다. 4D5 H91A-Fab 샘플은 3배 희석에서 0.27 nM 내지 200 nm의 농도 범위였다.
도 30A는 BIACORE®표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정한, 직접 고정된 인간 HER2 (세포외 도메인; Novus Biologicals)에 대한 4D5 N30S-Fab의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이다. 4D5 N30S-Fab 샘플은 3배 희석에서 0.27 nM 내지 200 nm의 농도 범위였다.
도 30B는 BIACORE®표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정한, 직접 고정된 인간 HER2 (세포외 도메인; Novus Biologicals)에 대한 4D5 N54E.D98T-Fab의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이다. 4D5 N54E.D98T-Fab 샘플은 3배 희석에서 0.27 nM 내지 200 nm의 농도 범위였다.
도 30C는 BIACORE®표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정한, 직접 고정된 인간 HER2 (세포외 도메인; Novus Biologicals)에 대한 4D5 N30S.N54E.D98T-Fab의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이다. 4D5 N30S.N54E.D98T-Fab 샘플은 3배 희석에서 0.27 nM 내지 200 nm의 농도 범위였다.
도 31A는 BIACORE®표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정한, 직접 고정된 인간 HER2 (세포외 도메인; Novus Biologicals)에 대한 4D5 N30S.Y55E.N54E.D98T.Y102V-Fab의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이다. 4D5 N30S.Y55E.N54E.D98T.Y102V-Fab 샘플은 3배 희석에서 0.27 nM 내지 200 nm의 농도 범위였다.
도 31B는 BIACORE®표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정한, 직접 고정된 인간 HER2 (세포외 도메인; Novus Biologicals)에 대한 4D5 N30S.N54E.D98T.F100A.Y102V-Fab의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이다. 4D5 N30S.N54E.D98T.F100A.Y102V-Fab 샘플은 3배 희석에서 0.27 nM 내지 200 nm의 농도 범위였다.
도 31C는 BIACORE®표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정한, 직접 고정된 인간 HER2 (세포외 도메인; Novus Biologicals)에 대한 4D5 N30S.H91A.N54E.D98T-Fab의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이다. 4D5 N30S.H91A.N54E.D98T-Fab 샘플은 3배 희석에서 0.27 nM 내지 200 nm의 농도 범위였다.
도 32A-32K는 BIACORE®표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정된, 인간 HER2에 대한 4D5 IgG TDB 항체의 결합 동역학을 보여주는 일련의 센서그램이다. 도 32A는 야생형 4D5 IgG TDB의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이고; 도 32B는 4D5 H91A-IgG TDB의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이고; 도 32C는 4D5 Y55E.H91A-IgG TDB의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이고; 도 32D는 4D5 Y55E.D98A.F100A.Y102V-IgG TDB의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이고; 도 32E는 4D5 D98A.F100A.Y102V-IgG TDB의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이고; 도 32F는 4D5 H91A.D98A.F100A.Y102V-IgG TDB의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이고; 도 32G는 4D5 Y55E.H91A.D98A.F100A.Y102V-IgG TDB의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이고; 도 32H는 4D5 Y55E.Y102V-IgG TDB의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이고; 도 32I는 4D5 Y102V-IgG TDB의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이고; 도 32J는 4D5 H91A.Y102V-IgG TDB의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이고; 그리고 도 32K는 4D5 Y55E.H91A.Y102V-IgG TDB의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이다.
도 33A는 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB (로트 1) 항체 (빈 사각형); 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T-1Fab-IgG TDB 항체 (채워진 사각형); 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB (로트 2) 항체 (열린 하향-대면 삼각형); 또는 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체 (채워진 상향-대면 삼각형)에 의한 SKBR3 세포의 사멸을 정량화하는 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 33B는 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB (로트 1) 항체 (빈 사각형); 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T-1Fab-IgG TDB 항체 (채워진 사각형); 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB (로트 2) 항체 (열린 하향-대면 삼각형); 또는 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체 (채워진 상향-대면 삼각형)에 의한 MCF7 세포의 사멸을 정량화하는 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 34A는 유세포 분석으로 측정한, SKBR8 세포들에 대한 다양한 1Fab-IgG TDB 변이체들의 결합을 정량하는 옹량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. 빈 사각형은 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB (로트 1) 항체를 나타내고; 채워진 사각형은 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T-1Fab-IgG TDB 항체를 나타내고; 열린 하향-대면 삼각형은 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB (로트 2) 항체를 나타내고; 그리고 채워진 상향-대면 삼각형은 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체를 나타낸다.
도 34B는 유세포 분석으로 측정한, MCF7 세포들에 대한 다양한 1Fab-IgG TDB 변이체들의 결합을 정량하는 옹량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. 빈 사각형은 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB (로트 1) 항체를 나타내고; 채워진 사각형은 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T-1Fab-IgG TDB 항체를 나타내고; 열린 하향-대면 삼각형은 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB (로트 2) 항체를 나타내고; 그리고 채워진 상향-대면 삼각형은 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체를 나타낸다.
도 35A는 1가 높은 친화도 결합을 가지는 항-HER2-CD3 IgG-TDB의 결합 및 활성을 보여주는 개략도이다.
도 35B는 1가 낮은 친화도 결합을 가지는 항-HER2-CD3 IgG-TDB의 결합 및 활성을 보여주는 개략도이다.
도 35C는 적절한 친화도에서 2가 HER2 결합 (1가 KD 20-50 nM)이 항-HER2-CD3 1Fab-IgG TDB의 결합력으로 인해 HER2-과발현 세포에 대한 높은 결합을 가져옴을 보여주는 개략도이다.
도 36은 HER2 세포외 도메인 (ECD)의 결정 구조를 제공하고 상이한 HER2 항체들이 결합하는 영역들을 강조한다.
도 37은 38E4v1 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB (열린 원)에 의한 SKBR3 표적 세포; 40G5c 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB (채워진 원)에 의한 SKBR3 표적 세포; 38E4v1 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB (빈 사각형)에 의한 MCF7 표적 세포; 그리고 40G5c 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB (닫힌 사각형)에 의한 MCF7 표적 세포의 사멸을 정량하는 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 38A는 HER2 발현 세포들의 존재 및 부재시 시험한, 4D5 H91A 1Fab-IgG TDB 및 4D5 IgG TDB-유도된 HER2 독립 T 세포 활성화의 수준을 보여주는 그래프이다.
도 38B는 2가 항-CD3 OKT3의 존재 및 부재시 시험한, 4D5 H91A 1Fab-IgG TDB 및 4D5 IgG TDB-유도된 HER2 독립 T 세포 활성화의 수준을 보여주는 그래프이다.
도 38C는 H91A 1Fab-IgG TDB 또는 운반체 대조군으로 시노몰구스 원숭이를 투약 후 2일차 및 8일차에 측정한, 염증 (C-반응성 단백질; CRP), T 세포 활성화 (림프구 변연화), 및 간 손상 (알라닌 및 아스파테이트 아미노전달효소; ALT 및 AST)에 대한 혈액 마커를 보여주는 일련의 그래프이다.
도 38D는 20 mg/kg 및 3 mg/kg 용량의 H91A 1Fab-IgG TDB를 투약한 시노몰구스 원숭이로부터 ELISA로 검출한 PK 파라미터를 보여주는 그래프 및 요약 표이다.
도 38E는 제시된 희석을 사용하여 24시간 동안 건강한 공여자 PBMC 및 SKBR3 세포들에 투약 및 처리한 후 7일차 및 14일차에 H91A 1Fab-IgG TDB 시노몰구스 혈청 수준을 보여주는 그래프이다. 새로운 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB의 희석액들 (대조군)을 사용하여 병행 실험들을 실시하였다.
도 39는 4D5 항-HER2 Fab 변이체들의 결합 친화도에 대한 다양한 아미노산 치환의 효과를 보여주는 다이아그램이다.
도 1은 SKBR3 세포 및 MCF7 세포에 의한 HER2 단백질의 상대적인 발현을 보여주는 면역블롯이다.
도 2A-2F는 다양한 1가 HER2 TDB (IgG TDB) 분자에 의한 SKBR3 세포 (빈 사각형) 및 MCF7 세포 (채워진 점)의 상대적 사멸의 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다. 도 2A는 야생형 4D5 IgG TDB 항체 (트라스투주맙)에 의한 표적 세포 사멸의 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. 도 2B는 4D5 항체 변이체, Y55E.Y102V-TDB에 의한 표적 세포 사멸의 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. 도 2C는 4D5 항체 변이체, Y55E.D98A.F100A.Y102V-IgG TDB에 의한 표적 세포 사멸의 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. 도 2D는 4D5 항체 변이체, D98A.F100A.Y102V-IgG TDB에 의한 표적 세포 사멸의 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. 도 2E는 4D5 항체 변이체, H91A-IgG TDB에 의한 표적 세포 사멸의 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. 도 2F는 4D5 항체 변이체, Y100A-IgG TDB에 의한 표적 세포 사멸의 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 3은 1Fab-IgG TDB 형식의 대표적인 3가 항체의 개략도이다. 항체는 2개의 항-HER2 결합 모이어티를 갖는 2가 아암 및 1개의 항-CD3 결합 모이어티를 갖는 1가 아암을 특징으로 한다.
도 4A는 유세포 분석으로 정량한, SKBR3에 대한 다양한 1Fab-IgG TDB 항체들의 결합을 야생형 4D5 IgG TDB 항체에 대하여 정량하는 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. 채워진 역삼각형은 야생형 4D5 IgG TDB 항체 (트라스투주맙)를 나타내고; 채워진 사각형은 4D5 항체 변이체, H91A-IgG TDB를 나타내고; 채워진 삼각형은 4D5 항체 변이체, D98A.F100A.Y102V-IgG TDB를 나타내고; 빈 역삼각형은 4D5 항체 변이체, Y102V-IgG TDB를 나타내고; 그리고 빈 다이아몬드는 4D5 항체 변이체, Y55E.Y102V-IgG TDB를 나타낸다.
도 4B는 유세포 분석으로 정량한, MCF7에 대한 다양한 1Fab-IgG TDB 항체들의 결합을, 야생형 4D5 IgG TDB 항체에 대하여 정량하는 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. 채워진 역삼각형은 야생형 4D5 IgG TDB 항체 (트라스투주맙)를 나타내고; 채워진 사각형은 4D5 항체 변이체, H91A-IgG TDB를 나타내고; 채워진 삼각형은 4D5 항체 변이체, D98A.F100A.Y102V-IgG TDB를 나타내고; 빈 역삼각형은 4D5 항체 변이체, Y102V-IgG TDB를 나타내고; 그리고 빈 다이아몬드는 4D5 항체 변이체, Y55E.Y102V-IgG TDB를 나타낸다.
도 5A는 시간에 따른 카스파제 3/7 활성으로 정량한, 다양한 1Fab-IgG TDB 항체의 결과로서 SKBR3 세포에서 세포자멸 유도를 야생형 4D5 IgG TDB 항체에 대하여 보여주는 그래프이다. 채워진 점은 야생형 4D5 IgG TDB 항체 (트라스투주맙)를 나타내고; 빈 사각형은 4D5 항체 변이체, H91A-IgG TDB를 나타내고; 채워진 삼각형은 4D5 항체 변이체, D98A.F100A.Y102V-IgG TDB를 나타내고; 빈 삼각형은 4D5 항체 변이체, Y102V-IgG TDB를 나타내고; 그리고 빈 다이아몬드는 4D5 항체 변이체, Y55E.Y102V-IgG TDB를 나타낸다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 5B는 시간에 따른 카스파제 3/7 활성으로 정량한, 다양한 1Fab-IgG TDB 항체의 결과로서 MCF7 세포에서 세포자멸 유도를 야생형 4D5 IgG TDB 항체에 대하여 보여주는 그래프이다. 채워진 점은 야생형 4D5 IgG TDB 항체 (트라스투주맙)를 나타내고; 빈 사각형은 4D5 항체 변이체, H91A-IgG TDB를 나타내고; 채워진 삼각형은 4D5 항체 변이체, D98A.F100A.Y102V-IgG TDB를 나타내고; 빈 삼각형은 4D5 항체 변이체, Y102V-IgG TDB를 나타내고; 그리고 빈 다이아몬드는 4D5 항체 변이체, Y55E.Y102V-IgG TDB를 나타낸다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 6A는 CELLTITER-GLO® 분석법으로 측정한, 50 ng/mL의 다양한 1Fab-IgG TDB 항체들과의 배양에 대한 반응으로 SKBR3 세포들에서의 세포독성을, 야생형 4D5 IgG TDB 항체에 대하여 보여주는 그래프이다. 첫번째 막대 (왼쪽)는 야생형 4D5 TDB 항체 (트라스투주맙)을 나타내고; 두번?? 막대는 4D5 항체 변이체, H91A-IgG TDB를 나타내고; 세번째 막대는 4D5 항체 변이체, D98A.F100A.Y102V-IgG TDB를 나타내고; 네번째 막대는 4D5 항체 변이체, Y102V-IgG TDB를 나타내고; 그리고 다섯번째 막대 (오른쪽)는 4D5 항체 변이체, Y55E.Y102V-IgG TDB를 나타낸다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 6B는 CELLTITER-GLO®분석법으로 측정한, 50 ng/mL의 다양한 1Fab-IgG TDB 항체들과의 배양에 대한 반응으로 MCF7 세포들에서의 세포독성을, 야생형 4D5 IgG TDB 항체에 대하여 보여주는 그래프이다. 첫번째 막대 (왼쪽)는 야생형 4D5 TDB 항체 (트라스투주맙)을 나타내고; 두번?? 막대는 4D5 항체 변이체, H91A-IgG TDB를 나타내고; 세번째 막대는 4D5 항체 변이체, D98A.F100A.Y102V-IgG TDB를 나타내고; 네번째 막대는 4D5 항체 변이체, Y102V-IgG TDB를 나타내고; 그리고 다섯번째 막대 (오른쪽)는 4D5 항체 변이체, Y55E.Y102V-IgG TDB를 나타낸다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 6C는 CELLTITER-GLO®분석법으로 측정한, 50 μg/mL의 다양한 1Fab-IgG TDB 항체들과의 배양에 대한 반응으로 MCF7 세포들에서의 세포독성을, 야생형 4D5 IgG TDB 항체에 대하여 보여주는 그래프이다. 첫번째 막대 (왼쪽)는 야생형 4D5 TDB 항체 (트라스투주맙)을 나타내고; 두번?? 막대는 4D5 항체 변이체, H91A-IgG TDB를 나타내고; 세번째 막대는 4D5 항체 변이체, D98A.F100A.Y102V-IgG TDB를 나타내고; 네번째 막대는 4D5 항체 변이체, Y102V-IgG TDB를 나타내고; 그리고 다섯번째 막대 (오른쪽)는 4D5 항체 변이체, Y55E.Y102V-IgG TDB를 나타낸다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 7A는 유세포 분석으로 정량한, SKBR3 세포에 대한 다양한 1Fab-IgG TDB 항체들의 결합을, 야생형 4D5 IgG TDB 항체 (트라스투주맙; 채워진 삼각형)에 대하여 정량하는 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. 빈 삼각형은 4D5 항체 변이체, Y55E.H91A-1Fab-IgG TDB를 나타내고; 사각형은 4D5 항체 변이체, Y100Aa-1Fab-IgG TDB를 나타내고; 그리고 원은 4D5 항체 변이체, H91A.N30A-1Fab-IgG TDB를 나타낸다.
도 7B는 유세포 분석으로 정량한, MCF7 세포에 대한 다양한 1Fab-IgG TDB 항체들의 결합을, 야생형 4D5 IgG TDB 항체 (트라스투주맙; 채워진 삼각형)에 대하여 정량하는 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. 빈 삼각형은 4D5 항체 변이체, Y55E.H91A-1Fab-IgG TDB를 나타내고; 사각형은 4D5 항체 변이체, Y100Aa-1Fab-IgG TDB를 나타내고; 그리고 원은 4D5 항체 변이체, H91A.N30A-1Fab-IgG TDB를 나타낸다.
도 8은 CELLTITER-GLO®분석법으로 측정한, SKBR3 세포에 대한 다양한 1Fab-IgG TDB 항체의 세포독성을 정량하는 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. 빈 사각형은 4D5 항체 변이체, H91A-1Fab-IgG TDB를 나타내고; 채워진 사각형은 4D5 항체 변이체, Y100Aa-1Fab-IgG TDB를 나타내고; 그리고 원은 4D5 항체 변이체, H91A.N30A-1Fab-IgG TDB를 나타낸다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 9는 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체에 대한 4D5 IgG TDB 항체의 세포독성을 비교하는 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. SKBR3 세포 및 MCF7 세포에서 4D5 IgG TDB 항체에 의해 유도된 세포독성은 각각 채워진 원 및 채워진 사각형으로 표시된다. SKBR3 세포 및 MCF7 세포에서 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체에 의해 유도된 세포독성은 각각 빈 삼각형 및 빈 사각형으로 표시된다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 10은 90개의 유방암 세포주에서 ErbB2 RNA 발현의 RNA-seq 분석 결과를 보여주는 그래프이다. 세포주는 낮은 ErbB2 발현, 중간 ErbB2 발현 및 높은 ErbB2 발현 세포주로 분류되었다.
도 11A는 낮은 ErbB2 발현 세포주 (MDA-MB-436, PC3, MCF7/neo-cl3, MDA-MB-231, LS1034, 및 HT55), 중간 ErbB2 발현 세포주 (MDA-MB-453, MDA-MB-175-VII, JIMT-1, 및 MKN7), 및 높은 Erb2 발현 세포주 (MDA-MB-361, SKBR3, BT474-M1, SK-OV-3, 및 KPL4)에서 50 ng/mL 농도의 4D5 IgG TDB 항체들의 세포독성을 보여주는 그래프이다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 11B는 낮은 ErbB2 발현 세포주 (MDA-MB-436, PC3, MCF7/neo-cl3, MDA-MB-231, LS1034, 및 HT55), 중간 ErbB2 발현 세포주 (MDA-MB-453, MDA-MB-175-VII, JIMT-1, 및 MKN7), 및 높은 Erb2 발현 세포주 (MDA-MB-361, SKBR3, BT474-M1, SK-OV-3, 및 KPL4)에서 50 μg/mL 농도의 4D5 IgG TDB 항체들의 세포독성을 보여주는 그래프이다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 11C는 낮은 ErbB2 발현 세포주 (MDA-MB-436, PC3, MCF7/neo-cl3, MDA-MB-231, LS1034, 및 HT55), 중간 ErbB2 발현 세포주 (MDA-MB-453, MDA-MB-175-VII, JIMT-1, 및 MKN7), 및 높은 Erb2 발현 세포주 (MDA-MB-361, SKBR3, BT474-M1, SK-OV-3, 및 KPL4)와 함께 배양된 인간 CD8+ T 세포의 활성화에 대한 50 ng/mL 농도의 4D5 IgG TDB 항체들의 효과를 보여주는 그래프이다. T 세포 활성화는 CD69 및 CD45의 이중 발현으로 측정되었다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 11D는 도 11A-11C에 나타낸 각각의 세포주에 의한 HER2 단백질 발현을 보여주는 면역블롯이다.
도 12A는 낮은 ErbB2 발현 세포주 (MDA-MB-436, PC3, MCF7/neo-cl3, MDA-MB-231, LS1034, 및 HT55), 중간 ErbB2 발현 세포주 (MDA-MB-453, MDA-MB-175-VII, JIMT-1, 및 MKN7), 및 높은 Erb2 발현 세포주 (MDA-MB-361, SKBR3, BT474-M1, SK-OV-3, 및 KPL4)에서 50 ng/mL 농도의 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체들의 세포독성을 보여주는 그래프이다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 12B는 낮은 ErbB2 발현 세포주 (MDA-MB-436, PC3, MCF7/neo-cl3, MDA-MB-231, LS1034, 및 HT55), 중간 ErbB2 발현 세포주 (MDA-MB-453, MDA-MB-175-VII, JIMT-1, 및 MKN7), 및 높은 Erb2 발현 세포주 (MDA-MB-361, SKBR3, BT474-M1, SK-OV-3, 및 KPL4)에서 50 μg/mL 농도의 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체들의 세포독성을 보여주는 그래프이다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 12C는 낮은 ErbB2 발현 세포주 (MDA-MB-436, PC3, MCF7/neo-cl3, MDA-MB-231, LS1034, 및 HT55), 중간 ErbB2 발현 세포주 (MDA-MB-453, MDA-MB-175-VII, JIMT-1, 및 MKN7), 및 높은 Erb2 발현 세포주 (MDA-MB-361, SKBR3, BT474-M1, SK-OV-3, 및 KPL4)와 함께 배양된 인간 CD8+ T 세포의 활성화에 대한 50 ng/mL 농도의 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체들의 효과를 보여주는 그래프이다. T 세포 활성화는 CD69 및 CD45의 이중 발현으로 측정되었다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 12D는 도 12A-12C에 나타낸 각각의 세포주에 의한 HER2 단백질 발현을 보여주는 면역블롯이다.
도 13은 HBL-100 세포에서 4D5 H91A-IgG TDB 항체 (사각형) 및 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체 (원)의 세포독성을 정량화하는 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 14A는 HBL-100 세포에서 다양한 농도의 4D5 H91A-IgG TDB 항체의 세포 독성을 시간에 따라 정량화하는 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. 채워진 원은 5,000 ng/mL 용량의 4D5 H91A-IgG TDB를 나타내고, 빈 사각형은 500 ng/mL 용량의 4D5 H91A-IgG TDB를 나타내고, 채워진 삼각형은 50 ng/mL 용량의 4D5 H91A-IgG TDB를 나타내고, 빈 역삼각형은 5 ng/mL 용량의 4D5 H91A-IgG TDB를 나타내고, 빈 다이아몬드는 0.5 ng/mL 용량의 4D5 H91A-IgG TDB를 나타내고, 그리고 채워진 다이아몬드는 비처리 대조군을 나타낸다.
도 14B는 HBL-100 세포에서 다양한 농도의 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체의 세포 독성을 시간에 따라 정량화하는 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. 채워진 원은 5,000 ng/mL 용량의 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB를 나타내고, 빈 사각형은 500 ng/mL 용량의 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB를 나타내고, 채워진 삼각형은 50 ng/mL 용량의 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB를 나타내고, 빈 역삼각형은 5 ng/mL 용량의 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB를 나타내고, 빈 다이아몬드는 0.5 ng/mL 용량의 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB를 나타내고, 그리고 채워진 다이아몬드는 비처리 대조군을 나타낸다.
도 15A는 왼쪽에서 오른쪽으로, 증가하는 양의 HER2를 발현시키는 세포주에 대한, 4D5 H91A-IgG TDB 및 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB의 사멸 효과를, 기저 면역블롯 및 막대 그래프로 보여주는 그래프 세트이다.
도 15B는 상대 HER2 발현의 IHC 및 FISH 검출 분석 결과를 보여주는 일련의 현미경 사진이다.
도 15C는 도 15B에서 특성화된 세포들의, 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB에 의한 사멸을 보여주는 그래프이다.
도 16은 MCF7 세포, HT55 세포 및 HER2-증폭된 KPL4 세포에서 HER2 단백질 발현을 보여주는 면역블롯이다.
도 17은 인간 PBMC가 보충된 마우스에서 다양한 용량의 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체 또는 야생형 4D5 TDB 항체를 사용한 치료 과정에 걸친 KPL4 종양 부피를 보여주는 격자 플롯이다. KPL4 종양이 확립된 마우스들에게 0일차에 지시된 용량을 단회 정맥내 투약하였다. 격자의 각 패널은 패널 헤더로 표시한 바와 같이 하나의 용량 그룹을 도시한다. 굵은, 검은색 실선은 각 용량 그룹에 대해 적합된 종양 부피를 나타낸다. 굵은 점선은 히스티딘 완충액 운반체를 받은 대조군에 대하여 적합된 종양 부피를 나타낸다. 빈 원이 있는 점선은 개개 동물들을 나타낸다. 채워진 점이 있는 실선은 연구에서 제거된 동물을 나타낸다. 수평의 회색 점선은 500 mm3의 종양 부피를 표시한다.
도 18은 인간 PBMC가 보충된 마우스에서 다양한 용량의 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체 또는 야생형 4D5 IgG TDB 항체를 사용한 치료 과정에 걸친 HT55 종양 부피를 보여주는 격자 플롯이다. HT55 종양이 확립된 마우스들에게 0일차에 지시된 용량을 단회 정맥내 투약하였다. 격자의 각 패널은 패널 헤더로 표시한 바와 같이 하나의 용량 그룹을 도시한다. 굵은, 검은색 실선은 각 용량 그룹에 대해 적합된 종양 부피를 나타낸다. 굵은 점선은 히스티딘 완충액 운반체를 받은 대조군에 대하여 적합된 종양 부피를 나타낸다. 빈 원이 있는 점선은 개개 동물들을 나타낸다. 채워진 점이 있는 실선은 연구에서 제거된 동물을 나타낸다. 수평의 회색 점선은 500 mm3의 종양 부피를 표시한다.
도 19는 인간 PBMC가 보충된 마우스에서 다양한 용량의 4D5 D98A.F100A.Y102V-1Fab-IgG TDB 항체 또는 야생형 4D5 IgG TDB 항체를 사용한 치료 과정에 걸친 KPL4 종양 부피를 보여주는 격자 플롯이다. KPL4 종양이 확립된 마우스들에게 0일차에 지시된 용량을 단회 정맥내 투약하였다. 격자의 각 패널은 패널 헤더로 표시한 바와 같이 하나의 용량 그룹을 도시한다. 굵은, 검은색 실선은 각 용량 그룹에 대해 적합된 종양 부피를 나타낸다. 굵은 점선은 히스티딘 완충액 운반체를 받은 대조군에 대하여 적합된 종양 부피를 나타낸다. 빈 원이 있는 점선은 개개 동물들을 나타낸다. 채워진 점이 있는 실선은 연구에서 제거된 동물을 나타낸다. 수평의 빨간색 점선은 500 mm3의 종양 부피를 표시한다.
도 20은 SKBR3 세포에서 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체 (채워진 원) 및 4D5 D98A.F100A.Y102V-1Fab-IgG TDB 항체 (빈 사각형)의 세포독성을 정량화하는 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 21A는 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체에 의한 높은 HER2-발현 세포주의 사멸을 나타내는 그래프이다 (n = 20). 높은 HER2-발현 세포주는 Erb2 RNA의 높은 발현을 특징으로 한다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 21B는 4D5 D98A.F100A.Y102V-1Fab-IgG TDB 항체에 의한 높은 HER2-발현 세포주의 사멸을 나타내는 그래프이다 (n = 20). 높은 HER2-발현 세포주는 Erb2 RNA의 높은 발현을 특징으로 한다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 22는 4D5 D98A.F100.Y102V-1Fab-IgG TDB 항체에 의한 높은 HER2-발현 세포주 사멸의 상대적인 효능을 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체에 대하여 보여주는 그래프이다. 데이터는 도 20A 및 20B로부터 도출된다.
도 23A는 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체에 의한 중 HER2-발현 세포주의 사멸을 나타내는 그래프이다 (n = 12). SKBR3 세포의 사멸은 양성 대조군으로 제공된다. 중 HER2-발현 세포주는 Erb2 RNA의 중간 발현을 특징으로 한다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 23B는 4D5 D98A.F100A.Y102V-1Fab-IgG TDB 항체에 의한 중 HER2-발현 세포주의 사멸을 나타내는 그래프이다 (n = 12). SKBR3 세포의 사멸은 양성 대조군으로 제공된다. 중 HER2-발현 세포주는 Erb2 RNA의 중간 발현을 특징으로 한다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 24는 4D5 D98A.F100.Y102V-1Fab-IgG TDB 항체에 의한 중 HER2-발현 세포주 사멸의 상대적인 효능을 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체에 대하여 보여주는 그래프이다. 데이터는 도 22A 및 22B로부터 도출된다.
도 25A는 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체에 의한 낮은 HER2-발현 세포주의 사멸을 나타내는 그래프이다 (n = 12). SKBR3 세포의 사멸은 양성 대조군으로 제공된다. 낮은 HER2-발현 세포주는 Erb2 RNA의 낮은 발현을 특징으로 한다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 25B는 4D5 D98A.F100A.Y102V-1Fab-IgG TDB 항체에 의한 낮은 HER2-발현 세포주의 사멸을 나타내는 그래프이다 (n = 12). SKBR3 세포의 사멸은 양성 대조군으로 제공된다. 낮은 HER2-발현 세포주는 Erb2 RNA의 낮은 발현을 특징으로 한다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 26은 4D5 D98A.F100.Y102V-1Fab-IgG TDB 항체에 의한 낮은 HER2-발현 세포주 사멸의 상대적인 효능을 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체에 대하여 보여주는 그래프이다. 데이터는 도 24A 및 24B로부터 도출된다.
도 27A는 도 27B에서 시험한 2개의 펩티드 연결기의 위치 및 서열을 보여주는 개략도이다. 각각의 펩티드 연결기는 원위 Fab의 불변 중쇄 (CH) 영역의 C-말단을 근위 Fab의 가변 중쇄 (VH) 영역의 N-말단에 융합시킨다. 도 27B에서, DKTHTGGGGSGG (서열 번호: 52)는 빈 사각형으로 나타내고, 그리고 DKTHT (서열 번호: 50)는 채워진 원으로 나타낸다.
도 27B는 DKTHTGGGGSGG 연결기 (빈 사각형)를 갖는 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체의 MCF7 세포에 대한 결합을 정량화하는 용량 반응 곡선을, DKTHT 연결기 (채워진 원)를 갖는 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체에 대해 보여주는 그래프이다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 27C는 DKTHTGGGGSGG 연결기 (빈 사각형)를 갖는 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체에 의한 SKBR3 세포의 사멸을 정량화하는 용량 반응 곡선을, DKTHT 연결기 (채워진 원)를 갖는 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체에 대해 보여주는 그래프이다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 28A는 SKBR3 세포에 의한 pAKTS473 및 pHER3의 발현에 대한 항-HER2-CD3 1Fab-IgG의 효과를 시간에 따라 보여주는 일련의 면역블롯이다.
도 28B는 항-HER2-CD3 1Fab-IgG, 항-HER2-CD3 IgG TDB 및 트라스투주맙 처리에 반응하여 SKBR3 세포의 생존력을 정량화하는 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 29A는 BIACORE®표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정한, 직접 고정된 인간 HER2 (세포외 도메인; Novus Biologicals)에 대한 야생형 4D5 Fab의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이다. 야생형 4D5 Fab 샘플은 3배 희석에서 0.27 nM 내지 200 nm의 농도 범위였다.
도 29B는 BIACORE®표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정한, 직접 고정된 인간 HER2 (세포외 도메인; Novus Biologicals)에 대한 4D5 Y55E.Y102V-Fab의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이다. 4D5 Y55E.Y102V-Fab 샘플은 3배 희석에서 0.27 nM 내지 200 nm의 농도 범위였다.
도 29C는 BIACORE®표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정한, 직접 고정된 인간 HER2 (세포외 도메인; Novus Biologicals)에 대한 4D5 D98A.F100A.Y102V-Fab의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이다. 4D5 D98A.F100A.Y102V-Fab 샘플은 3배 희석에서 0.27 nM 내지 200 nm의 농도 범위였다.
도 29D는 BIACORE®표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정한, 직접 고정된 인간 HER2 (세포외 도메인; Novus Biologicals)에 대한 4D5 H91A-Fab의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이다. 4D5 H91A-Fab 샘플은 3배 희석에서 0.27 nM 내지 200 nm의 농도 범위였다.
도 30A는 BIACORE®표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정한, 직접 고정된 인간 HER2 (세포외 도메인; Novus Biologicals)에 대한 4D5 N30S-Fab의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이다. 4D5 N30S-Fab 샘플은 3배 희석에서 0.27 nM 내지 200 nm의 농도 범위였다.
도 30B는 BIACORE®표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정한, 직접 고정된 인간 HER2 (세포외 도메인; Novus Biologicals)에 대한 4D5 N54E.D98T-Fab의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이다. 4D5 N54E.D98T-Fab 샘플은 3배 희석에서 0.27 nM 내지 200 nm의 농도 범위였다.
도 30C는 BIACORE®표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정한, 직접 고정된 인간 HER2 (세포외 도메인; Novus Biologicals)에 대한 4D5 N30S.N54E.D98T-Fab의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이다. 4D5 N30S.N54E.D98T-Fab 샘플은 3배 희석에서 0.27 nM 내지 200 nm의 농도 범위였다.
도 31A는 BIACORE®표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정한, 직접 고정된 인간 HER2 (세포외 도메인; Novus Biologicals)에 대한 4D5 N30S.Y55E.N54E.D98T.Y102V-Fab의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이다. 4D5 N30S.Y55E.N54E.D98T.Y102V-Fab 샘플은 3배 희석에서 0.27 nM 내지 200 nm의 농도 범위였다.
도 31B는 BIACORE®표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정한, 직접 고정된 인간 HER2 (세포외 도메인; Novus Biologicals)에 대한 4D5 N30S.N54E.D98T.F100A.Y102V-Fab의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이다. 4D5 N30S.N54E.D98T.F100A.Y102V-Fab 샘플은 3배 희석에서 0.27 nM 내지 200 nm의 농도 범위였다.
도 31C는 BIACORE®표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정한, 직접 고정된 인간 HER2 (세포외 도메인; Novus Biologicals)에 대한 4D5 N30S.H91A.N54E.D98T-Fab의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이다. 4D5 N30S.H91A.N54E.D98T-Fab 샘플은 3배 희석에서 0.27 nM 내지 200 nm의 농도 범위였다.
도 32A-32K는 BIACORE®표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정된, 인간 HER2에 대한 4D5 IgG TDB 항체의 결합 동역학을 보여주는 일련의 센서그램이다. 도 32A는 야생형 4D5 IgG TDB의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이고; 도 32B는 4D5 H91A-IgG TDB의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이고; 도 32C는 4D5 Y55E.H91A-IgG TDB의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이고; 도 32D는 4D5 Y55E.D98A.F100A.Y102V-IgG TDB의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이고; 도 32E는 4D5 D98A.F100A.Y102V-IgG TDB의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이고; 도 32F는 4D5 H91A.D98A.F100A.Y102V-IgG TDB의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이고; 도 32G는 4D5 Y55E.H91A.D98A.F100A.Y102V-IgG TDB의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이고; 도 32H는 4D5 Y55E.Y102V-IgG TDB의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이고; 도 32I는 4D5 Y102V-IgG TDB의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이고; 도 32J는 4D5 H91A.Y102V-IgG TDB의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이고; 그리고 도 32K는 4D5 Y55E.H91A.Y102V-IgG TDB의 결합 동역학을 보여주는 센서그램이다.
도 33A는 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB (로트 1) 항체 (빈 사각형); 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T-1Fab-IgG TDB 항체 (채워진 사각형); 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB (로트 2) 항체 (열린 하향-대면 삼각형); 또는 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체 (채워진 상향-대면 삼각형)에 의한 SKBR3 세포의 사멸을 정량화하는 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 33B는 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB (로트 1) 항체 (빈 사각형); 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T-1Fab-IgG TDB 항체 (채워진 사각형); 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB (로트 2) 항체 (열린 하향-대면 삼각형); 또는 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체 (채워진 상향-대면 삼각형)에 의한 MCF7 세포의 사멸을 정량화하는 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 34A는 유세포 분석으로 측정한, SKBR8 세포들에 대한 다양한 1Fab-IgG TDB 변이체들의 결합을 정량하는 옹량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. 빈 사각형은 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB (로트 1) 항체를 나타내고; 채워진 사각형은 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T-1Fab-IgG TDB 항체를 나타내고; 열린 하향-대면 삼각형은 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB (로트 2) 항체를 나타내고; 그리고 채워진 상향-대면 삼각형은 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체를 나타낸다.
도 34B는 유세포 분석으로 측정한, MCF7 세포들에 대한 다양한 1Fab-IgG TDB 변이체들의 결합을 정량하는 옹량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. 빈 사각형은 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB (로트 1) 항체를 나타내고; 채워진 사각형은 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T-1Fab-IgG TDB 항체를 나타내고; 열린 하향-대면 삼각형은 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB (로트 2) 항체를 나타내고; 그리고 채워진 상향-대면 삼각형은 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 항체를 나타낸다.
도 35A는 1가 높은 친화도 결합을 가지는 항-HER2-CD3 IgG-TDB의 결합 및 활성을 보여주는 개략도이다.
도 35B는 1가 낮은 친화도 결합을 가지는 항-HER2-CD3 IgG-TDB의 결합 및 활성을 보여주는 개략도이다.
도 35C는 적절한 친화도에서 2가 HER2 결합 (1가 KD 20-50 nM)이 항-HER2-CD3 1Fab-IgG TDB의 결합력으로 인해 HER2-과발현 세포에 대한 높은 결합을 가져옴을 보여주는 개략도이다.
도 36은 HER2 세포외 도메인 (ECD)의 결정 구조를 제공하고 상이한 HER2 항체들이 결합하는 영역들을 강조한다.
도 37은 38E4v1 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB (열린 원)에 의한 SKBR3 표적 세포; 40G5c 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB (채워진 원)에 의한 SKBR3 표적 세포; 38E4v1 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB (빈 사각형)에 의한 MCF7 표적 세포; 그리고 40G5c 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB (닫힌 사각형)에 의한 MCF7 표적 세포의 사멸을 정량하는 용량 반응 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 38A는 HER2 발현 세포들의 존재 및 부재시 시험한, 4D5 H91A 1Fab-IgG TDB 및 4D5 IgG TDB-유도된 HER2 독립 T 세포 활성화의 수준을 보여주는 그래프이다.
도 38B는 2가 항-CD3 OKT3의 존재 및 부재시 시험한, 4D5 H91A 1Fab-IgG TDB 및 4D5 IgG TDB-유도된 HER2 독립 T 세포 활성화의 수준을 보여주는 그래프이다.
도 38C는 H91A 1Fab-IgG TDB 또는 운반체 대조군으로 시노몰구스 원숭이를 투약 후 2일차 및 8일차에 측정한, 염증 (C-반응성 단백질; CRP), T 세포 활성화 (림프구 변연화), 및 간 손상 (알라닌 및 아스파테이트 아미노전달효소; ALT 및 AST)에 대한 혈액 마커를 보여주는 일련의 그래프이다.
도 38D는 20 mg/kg 및 3 mg/kg 용량의 H91A 1Fab-IgG TDB를 투약한 시노몰구스 원숭이로부터 ELISA로 검출한 PK 파라미터를 보여주는 그래프 및 요약 표이다.
도 38E는 제시된 희석을 사용하여 24시간 동안 건강한 공여자 PBMC 및 SKBR3 세포들에 투약 및 처리한 후 7일차 및 14일차에 H91A 1Fab-IgG TDB 시노몰구스 혈청 수준을 보여주는 그래프이다. 새로운 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB의 희석액들 (대조군)을 사용하여 병행 실험들을 실시하였다.
도 39는 4D5 항-HER2 Fab 변이체들의 결합 친화도에 대한 다양한 아미노산 치환의 효과를 보여주는 다이아그램이다.
발명의 구체예들의 상세한 설명
I.
정의
본 명세서에 사용된 용어 "약"은 기술 분야의 숙련된 기술자에게 널리 공지된 바와 같이, 각각의 값에 대한 통상적인 오차 범위를 나타낸다. 본 명세서에서 “약” 값 또는 파라미터 지칭은 그 값 또는 파라미터 자체에 관한 구현예를 포함한다 (그리고 기재한다).
"친화도"는 분자의 단일 결합 부위(예를 들어, 항체)와 이의 결합 짝(예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 강도를 의미한다. 달리 표시되지 않은 한, 본 명세서에 기재된 "결합 친화도"는 결합쌍(예를 들면, 항체 및 항원)의 구성원 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 의미한다. 분자 X의 이의 짝 Y에 대한 친화도는 일반적으로 평형 해리 상수(KD)로 표시될 수 있다. 친화도는 본 명세서에 기재된 것을 포함하여 당해 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 특정한 예시적이고 전형적인 구체예들은 하기에 기재되어 있다.
본원에서 사용된, 용어 “~에 특이적으로 결합하는” 또는 “~에 특이적인”은, 표적 및 항체 간의 결합과 같은 측정가능하고 재현가능한 상호작용을 지칭하며, 이는 생물학적 분자를 비롯한 분자의 이종성 집단의 존재하에서 표적의 존재를 결정한다. 예를 들면, 표적 (에피토프일 수 있음)에 특이적으로 결합하는 항체는 다른 표적에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합력으로, 더욱 쉽게, 및/또는 더 긴 지속시간으로 상기 표적에 결합하는 항체이다. 일 구현예에서, 비관련 표적에 대한 항체의 결합 정도는, 예를 들면, 방사면역검정법(RIA)으로 측정 시, 표적에 대한 항체 결합의 약 10% 미만이다. 특정 구체예에서, 표적에 특이적으로 결합하는 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, 또는 ≤ 0.1 nM의 평형 해리 상수 (KD)를 갖는다. 특정 구체예에서, 항체는 상이한 종으로부터의 단백질 중에서 보존되는 단백질의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 또 다른 구체예에서, 특이적 결합은 배타적 결합을 포함할 수 있지만, 배타적 결합을 필요로 하는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 “항체”는 가장 넓은 의미로 사용되고, 이들이 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한, 비제한적으로 단클론 항체, 다클론 항체, 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 포함하는, 다양한 항체 구조를 포괄한다.
항체 단편은 무손상(intact) 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 부분을 포함하는 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일 쇄 항체 분자 (예: scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
"항원-결합 모이어티"는 표적 에피토프, 항원, 리간드, 또는 수용체에 특이적으로 결합하는 화합물 또는 분자의 일부를 의미한다. 항원-결합 모이어티를 특징으로 하는 분자는 항체 (예를 들어, 단클론, 다클론, 재조합, 인간화 및 키메라 항체), 항체 단편 또는 이의 일부 (예를 들어, Fab 단편, Fab'2, scFv 항체, SMIP, 도메인 항체, 디아바디, 미니바디, scFv-Fc, 아피바디, 나노바디 및 항체의 VH 및/또는 VL 도메인), 수용체, 리간드, 압타머 및 확인된 결합 짝을 갖는 기타 분자를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. "친화도 성숙된" 항체는 변경을 보유하지 않는(변경은 항원에 대한 항체의 친화도를 개선함) 모 항체와 비교하여 하나 이상의 초가변 영역(HVR)에서의 하나 이상의 변경을 갖는 항체를 의미한다.
예를 들어, 이중특이적 항원-결합 분자의 1가 아암과 관련하여 본원에서 사용된 용어 “1가”는 단일 항원-결합 모이어티를 갖는 분자 또는 이의 일부 (예컨대, 항원-결합 분자의 일부, 예컨대, 이중특이적 항원-결합 분자의 2개 아암 중 하나)를 지칭한다. 그러므로, 1가 분자 또는 이의 일부는 정확하게 하나의 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 이중특이적 항체의 2가 아암의 2개 항원-결합 모이어티 중 하나 (예컨대, 1Fab-IgG TDB의 HER2 항원-결합 모이어티들 중 하나)의 “1가 결합 친화도” 또는 “1가 KD”는 1가 형태의 항원-결합 모이어티, 즉, 2개의 상이한 항원들에 특이적으로 결합할 수 있는 이중특이적 항체의 1가 아암으로서 또는 Fab 분자로서의 결합 친화도를 지칭한다.
예를 들어, 이중특이적 항원-결합 분자의 2가 아암과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "2가"는, 정확하게 2개의 항원-결합 모이어티를 가지며 각각이 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 분자 또는 이의 일부 (예컨대, 항원-결합 분자의 일부, 예컨대, 이중특이적 항원-결합 분자의 2개 아암 중 하나)를 지칭한다. 그러므로, 2가 분자 또는 이의 일부는 2개의 항원 또는 동일한 항원 (예컨대, 단일 종양 세포의 표면에서 발현되는 2개의 HER2 항원)상의 2개의 상이한 에피토프들에 특이적으로 결합할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "분화 클러스터" 또는 "CD3"는, 달리 지시가 없는 한, 영장류 (예컨대, 인간) 및 설치류 (예컨대, 마우스 및 랫트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 고유 CD3를 지칭하며, 예를 들어, CD3εCD3γα, 및 CD3β사슬을 포함한다. 이 용어는 "전장"의 비가공 CD3 (예컨대, 비가공 또는 비변형 CD3ε또는 CD3γ뿐만 아니라 세포에서의 가공으로부터 야기되는 임의의 형태의 CD3를 포함한다. 용어는 또한 CD3의 자연 발생 변이체, 예컨대, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. CD3는, 예를 들어, 207개 아미노산 길이의 인간 CD3ε단백질 (NCBI 참조서열 번호 NP_000724), 및 182개 아미노산 길이의 인간 CD3γ단백질 (NCBI 참조서열 번호 NP_000064)을 포함한다.
용어 "항-CD3 항체" 및 "CD3에 결합하는 항체"는 항체가 CD3를 표적하는데 있어서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 하기에 충분한 친화도로 CD3에 결합할 수 있는 항체를 나타낸다. 일 구체예에서, 관련없는, 비-CD3 단백질에 항-CD3 항체의 결합 정도는, 예를 들면, 방사면역검정 (RIA)으로 측정한 CD3에 대한 항체 결합의 약 10% 미만이다. 특정 구체예들에서, CD3에 결합하는 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예컨대, 10-8 M 또는 그 미만, 예컨대, 10-8 M 내지 10-13 M, 예컨대, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (KD)를 갖는다. 특정 구체예들에 있어서, 항-CD3 항체는 상이한 종의 CD3에서 보존되는 CD3의 에피토프에 결합한다.
본원에서 용어 "Fc 영역" 또는 "Fc 도메인"은 호환적으로 사용되어 불변 영역의 최소한 일부분이 포함된 면역글로블린 중쇄의 C-말단 영역을 지칭한다. 상기 용어는 고유 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 중쇄의 Cys226, 또는 Pro230으로부터 카르복실-말단까지 이어진다. 그러나, Fc 영역의 C 말단 리신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 이 용어는 절두된 Fc 영역, 가령, C-말단 절두 (예컨대, Δ절두, 예컨대, Hu, 외, Biotechnol. Prog. 2017, 33: 786-794 및 Jiang, 외, J. Pharm. Sci. 2016, 105: 2066-2072에 기재됨)를 갖는 영역을 포함한다. 명시적으로 다른 언급이 없는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 EU 넘버링 체계, Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에서 설명된 소위 EU 색인에 따른다. 본원에서 사용되는 Fc 도메인의 "소단위"는 이량체 Fc 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩티드 중 하나, 안정한 자가-결합을 할 수 있는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 불변 영역들을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 한 구체예에서, IgG Fc 도메인의 소단위는 IgG CH2 및 IgG CH3 불변 도메인을 포함한다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 의미한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인들로 구성된다: FR1, FR2, FR3, 및 FR4. 따라서, HVR 및 FR 서열들은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 다음의 서열로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 “전장 항체", “무손상 항체", 및 “전체 항체”는 본 명세서에서 호환적으로 사용되며, 고유한 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 또는 본 명세서에서 정의된 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
“인간 항체(human antibody)”는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산된 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-인코딩 서열을 이용하는 비-인간 원천으로부터 유도된 항체의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 보유하는 항체다. 인간 항체의 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 특정하게 제외시킨다. 인간 항체는 파지-디스플레이 라이브러리를 비롯하여 해당 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생성 될 수 있다. Hoogenboom 및 Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks 외, J. Mol. Biol., 222:581 (1991). 또한 인간 단클론 항체의 제조를 위해 Cole 외, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner 외, J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)에 기재된 방법들도 이용가능하다. 또한 van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)도 참고하라. 인간 항체는 항원 시험감염에 반응하여 이러한 항체를 생산하도록 변형되어 있으나, 그 내인성 유전자좌위는 비활성화(disabled)되어 있는 유전자삽입 동물, 예컨대, 면역화된 제노마우스에 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다 (예컨대, XENOMOUSE™기술에 관한 미국 특허 제 6,075,181 및 6,150,584 참고). 또한, 예를 들어, 인간 B-세포 하이브리도마 기술에 의해 생성된 인간 항체들에 관한 Li 외, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)를 참고하라.
"인간 공통 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 공통으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열들은 가변 도메인 서열들의 한 하위그룹으로부터 유래한다. 일반적으로, 서열의 하위그룹은 Kabat 외, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH 공개 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3에 제시된 바와 같은 하위그룹이다. 한 구체예에서, 상기 VL의 경우, 상기 하위그룹은 상기 Kabat 외의 문헌에 제시된 하위그룹 카파 I이다. 한 구체예에서, 상기 VH의 경우, 상기 하위그룹은 상기 Kabat 외의 문헌에 제시된 하위그룹 카파 III이다.
"인간화된" 항체는 비인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 구체예들에 있어서, 인간화된 항체는 실질적으로 최소한 하나의, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함하는데, 이때 HVR들 (가령, CDRs)의 모든 또는 실질적으로 모든 것은 비-인간 항체에 대응하며, FRs의 모든 또는 실질적으로 모든 것은 인간 항체의 것에 대응한다. 인간화된 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유도된 항체 불변 영역의 최소한 일부를 포함할 수 있다. 항체의 "인간화된 형태", 가령, 비-인간 항체는 인간화를 거친 항체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "단클론 항체"는 실질적으로 동질성 항체 집단으로부터 획득된 항체를 말하는데, 가령, 개별 항체는 동일한 집단 및/또는 같은 에피토프에 결합하는 집단을 포함하는데, 다만, 변이체 항체, 가령, 자연 발생적 돌연변이 또는 단클론 항체 제재를 만드는 동안 발생되는 돌연변이를 가진 변이체 항체 가능성이 있으며, 이러한 변이체들은 일반적으로 소량으로 존재한다. 상이한 결정부위(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 통상적으로 포함하는 다클론 항체 제제와 반대로, 단클론 항체 제제의 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정부위에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 "단클론(monoclonal)"은 실질적으로 동질성 항체 집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용될 단클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법 그리고 인간 면역 글로불린 좌위의 전부 또는 일부를 포함하는 유전자삽입 동물을 이용하는 방법들을 비롯한 (그러나 이에 제한되지 않음) 다양한 기술에 의해 제조 될 수 있으며, 이러한 방법 및 단클론 항체를 제조하는 다른 예시적인 방법이 본 명세서에 기재되어 있다.
"고유 항체"는 변하는 구조를 갖는 자연 발생 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들면, 고유 IgG 항체는 이종사량체 당단백질로써, 약 150,000 달톤이며, 2개의 동일한 경쇄와 2개의 동일한 중쇄를 포함하며, 이들은 이황화 결합에 의해 연결되어 있다. N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역(VH), 이어서 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역(VL), 이어서 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 2가지 유형 소위 카파 (κ및 람다 (λ중 하나로 지정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “초가변 영역” 또는 “HVR”은 서열에서 초가변인 (“상보성 결정 영역” 또는 “CDR”) 및/또는 구조적으로 정의된 루프 (“초가변 루프”)를 형성하고 및/또는 항원- 함유 잔기들 (“항원 접촉부”)을 함유하는 항체 가변 도메인의 각 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체들은 6개의 HVR: VH에 3개 (H1, H2, H3), 및 VL에 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. 본 발명의 예시적인 HVR는 다음을 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3)에서 나타나는 초가변 루프 (Chothia 및 Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), 및 95-102 (H3)에서 나타나는 CDR (Kabat 외, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), 및 93-101 (H3)에서 나타나는 항원 접촉부 (MacCallum 외 J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); 및
(d) HVR 아미노산 잔기 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3), 및 94-102 (H3)을 포함하는, (a), (b), 및/또는 (c)의 조합.
달리 언급이 없는 한, HVR 잔기들 및 가변 도메인 내 다른 잔기들 (예컨대, FR 잔기)은 상기 Kabat 외의 문헌에 기재된 바에 따라 본 명세서에서 넘버링된다.
“가변 영역(가변 region)” 또는 “가변 도메인(가변 domain)”은 항체가 항원에 결합하는데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄 도메인을 말한다. 고유 항체의 중쇄와 경쇄 (차례로 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FRs)과 3개의 초가변 영역 (HVR들)을 포함한다. (예컨대, Kindt 외. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 91 페이지 (2007).참고) 단일 VH 또는 VL 도메인은 충분히 항원-결합 특이성을 부여할 수 있다. 더욱이, 특정 항원에 결합하는 항체는 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크린하기 위하여 항원에 결합하는 항체의 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 분리될 수 있다. 예컨대, J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson 외, Nature 352:624-628 (1991)을 참고하라.
“면역접합체”는, 비제한적으로 세포독성제를 포함한, 하나 이상의 이종성 분자(들)에 접합된 항체이다.
“분리된 항체"는 이의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 항체다. 일부 구체예들에 있어서, 항체는 예를 들면, 전기영동의 (예로써, SDS-PAGE, 등전초점조절 (IEF), 모세관전기이동) 또는 크로마토그래프 (예로써, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정되었을 때 95% 또는 99% 순도이상으로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법에 대한 검토는 예로써, Flatman 외, J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)를 참고한다.
기준 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"는 후보 서열의 아미노산 잔기이 기준 폴리펩티드 서열에의 아미노산 잔기와 동일한 아미노산 잔기의 백분율로 정의되는데, 이때 서열을 정렬시킨 후 최대 서열 동일성 백분율을 얻기 위하여 필요하다면 갭을 도입하고, 보존적 치환은 상기 서열의 동일성의 일부분으로 간주되지 않는다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 해당 업계의 기술 범위 내에 있는 다양한 방법으로 구현될 수 있다. 숙련된 기술자는 비교되는 서열의 전체 길이에 대해 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적을 위하여, 아미노산 서열 동일성 % 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2을 이용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에 의해 작성되었으며, 소스 코드(source code)는 미국 저작권청 (Washington D.C., 20559)에 사용자 문서로 제출되어 미국 저작권 등록 번호 TXU510087에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코의 Genentech, Inc.에서 공개적으로 입수할 수 있으며, 소스 코드에서 컴파일 할 수도 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 비롯한 UNIX 운영 체제에서 사용을 위해 컴파일해야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 가변적이지 않다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 경우에, 소정의 아미노산 서열 B에 대한, 이것과, 또는 이에 대항한 소정의 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성(대안적으로 소정의 아미노산 서열 B에 대한, 이것과, 또는 이에 대항한 소정의 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 포함하는 소정의 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있음)은 아래와 같이 계산된다:
분수 X/Y의 100배
이때 X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매치로 기록되는 아미노산 잔기의 수를 말하며, Y는 B의 전체 아미노산 잔기 수가 된다. 아미노산 서열 A의 길이는 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않은 것으로 인정된다. 달리 특정 언급이 없는 한, 본 명세서에서 이용된 모든 아미노산 서열 동일성 % 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 바로 전 단락에서 설명된 바와 같이 수득된다.
본원에서 사용되는 용어 “경향성 고정” (및 이의 문법적 변화형)은 항체의 화학적 안정성을 향상시키기 위해 (예컨대, 탈아미드화 및/또는 이성질화 비율 감소), 예를 들어, 탈아미드화 또는 이성질화되기 쉬운 아미노산 잔기를 비교적 비활성 아미노산 잔기로 대체함으로써 또는 탈아미노화 또는 이성질화되기 쉬운 잔기에 연접한 아미노산을 비교적 비활성인 아미노산 잔기로 대체함으로써 구성되는 아미노산 치환을 지칭한다. 탈아미드화를 감소시키기 위한 경향성 고정의 예들에는 아스파라긴의 세린 또는 글루탐산으로의 치환 (예컨대, N30S 또는 N54E)이 포함된다. 이성질화를 감소시키기 위한 경향성 고정의 예들에는 아스파르트산의 알라닌 또는 트레오닌으로의 치환 (예컨대, D98A 또는 D98T)이 포함된다.
“분리된 핵산"은 항체는 이의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 분리된 핵산은 핵산 분자를 보통 포함하는 세포 안에 있는 핵산 분자를 포함하지만, 상기 핵산 분자는 자연 염색체 위치와는 상이한 염색체 위치에 존재하거나 또는 염색체외부에 존재한다.
“항-CD3 항체를 인코드하는 분리된 핵산”은 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 이의 단편들)을 인코드하는 하나 또는 그 이상의 핵산 분자들을 지칭하며, 단일 벡터 또는 별도의 벡터 안에 있는 이러한 핵산 분자(들), 그리고 숙주 세포내 하나 또는 그 이상의 위치에 존재하는 핵산 분자(들)이 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 “벡터(vector)"는 이것이 결합되는 또다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 말한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구조의 벡터, 뿐만 아니라 이것이 도입된 숙주 세포의 게놈 안에 혼입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터를 본원에서 “발현 벡터(expression vectors)”라고 한다.
용어 "숙주 세포(host cell)", "숙주 세포주(cell line)", 및 "숙주 세포 배양물(culture)"은 호환적으로 이용되며, 외인성 핵산이 도입되어 있는 세포를 지칭하고 이러한 세포들의 후대를 포함한다. 숙주 세포들은 "형질전환체(transformants)"와 "형질전환된(transformed) 세포들"이 포함되는데, 이들은 계대의 수와 무관하게, 1차 형질전환된 세포와 이로부터 유도된 후대를 포함한다. 후대는 핵산 함량에 있어서 부모계 세포와 완벽하게 동일하지는 않고, 돌연변이를 포함할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에 대하여 선별된 또는 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 보유한 돌연변이 후대가 본 명세서에 포함된다.
용어 “패키지 삽입물(package insert)”은 이러한 치료요법적 산물의 사용과 관련된 지시, 용도, 투여량, 투여, 복합 요법, 금기 및/또는 경고에 대한 정보가 포함된 치료요법적 산물의 시판 포장에 관례적으로 포함되는 지침을 칭할 때 이용된다.
용어 “약학 제제 (pharmaceutical formulation)”란 이 조성물 안에 포함된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과가 있도록 하기 위한 형태의 조제물을 지칭하며, 제형이 투여되는 대상에게 수용불가능한 독성을 주는 추가 성분들은 포함하지 않는다.
약학적으로 허용가능한 담체는 활성 성분이외에 약학적 배합물 안에 있는 성분을 말하며, 대상에게 비독성이다. 약학적으로 허용가능한 담체는 완충액, 부형제, 안정화제, 또는 보존제다.
본원에서 사용된, “투여하는 것”은 일정 용량의 화합물 (예컨대, 본 발명의 항-CD3 항체 또는 본 발명의 항-CD3 항체를 인코드하는 핵산) 또는 조성물 (예컨대, 약학 조성물, 예컨대, 본 발명의 항-CD3 항체를 포함하는 약학 조성물)을 대상체에게 제공하는 방법을 의미한다. 본원에 기재된 방법에 사용된 조성물은, 예를 들어, 근육내, 정맥내, 피내, 경피, 동맥내, 복강내, 병변내, 두개내, 동맥내, 전립선내, 흉막내, 기관내, 비강내, 유리체내, 질내, 직장내, 국소적으로, 종양내, 복막내, 피하, 결막하, 방광내, 점막내, 심낭내, 탯줄내, 안구내, 경구, 국소, 국부, 흡입으로, 주사로, 주입으로, 연속 주입으로, 직접적으로 표적 세포들을 약욕시키는 국부화 관류로, 카테터로, 세정으로, 크림으로, 또는 지질 조성물로 투여될 수 있다. 투여 방법은 다양한 인자 (예를 들어, 투여되는 화합물 또는 조성물 및 치료될 상태, 질환 또는 질병의 중증도)에 따라 달라질 수 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, "치료(treatment)" (및 이의 문법적 변화형, 이를 테면 "치료하다(treat)" 또는 "치료하는(treating)")라는 것은 치료될 개체의 자연적인 과정을 변경시키려는 시도에 있어서의 임상적 중재과정을 지칭하며, 예방을 위해 또는 임상적 병리학 과정 동안 실행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과에는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 상기 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질환 진행 속도 감소, 상기 질환 상태의 개선 또는 경감, 그리고 차도 또는 개선된 예후가 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 일부 구체예들에 있어서, 본 발명의 항체는 질환 또는 질병의 발달을 지연 또는 질환의 진행을 느리게 하는데 이용된다.
본원에서 사용된, 질병 또는 질환의 "진행 지연"은 질병 또는 질환 (예컨대, 암 증식성 질병, 예컨대, 암)의 진행을 보류, 방해, 지체, 저지, 안정화, 및/또는 연기하는 것을 지칭한다. 이러한 지연은 질환의 이력 및/또는 치료받는 개체에 따라 시간의 길2가 다양할 수 있다. 해당 분야의 숙련가에게 명백한 바와 같이, 충분한 또는 유의미한 지연은, 사실상, 개체에서 질환이 발병하지 않는다는 점에서, 예방을 포함할 수 있다. 예를 들어, 말기 암, 예컨대 전이의 발병이 지연될 수 있다.
"감소하다" 또는 "억제하다"는 예를 들어, 20% 이상, 50% 이상, 또는 75%, 85%, 90%, 95% 이상의 전체 감소를 유발하는 능력을 의미한다. 특정 구체예에서, 감소하다 또는 억제하다는 항체 Fc 영역에 의해 매개되는 항체의 효과기 기능, 가령, 보체-의존성 세포 독성 (CDC), 항체-의존적 세포 독성 (ADCC) 및 항체-의존성 세포 식균작용 (ADCP).을 비롯한 효과기 기능을 지칭할 수 있다.
"대상체” 또는 “개체”는 포유동물이다. 포유류는 길들여진 동물 (예를 들면, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들면, 인간 및 비-인간 영장류, 가령, 원숭이), 토끼, 그리고 설치류 (예를 들면, 생쥐 및 쥐)를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 특정 구체예들에서, 대상체 또는 개체는 인간이다.
“질병”은, 문제의 질병에 포유동물을 취약하게 만드는 병리 상태를 포함하는 만성 및 급성 질병 또는 질환을 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 치료에서 이익을 얻는 임의의 상태다.
용어 "세포 증식성 질병" 및 "증식성 질병"은 일정 정도의 이상 세포 증식과 관련된 질병을 지칭한다. 한 구체예에서, 상기 세포 증식성 질병은 암이다. 일 구체예에서, 세포 증식성 질병은 종양이다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리적 조건을 지칭하거나 또는 이를 기술한다. 양성 및 악성 암은 이러한 정의에 포함된다. “초기 단계 암” 또는 “초기 단계 종양”은 침습성 또는 전이성이 아니거나 0, 1, 또는 2기 암으로서 분류되는 암을 의미한다. 암의 예는, 유방암, 위암, 결장직장암, 비소 세포 폐암, 비호지킨 림프종 (NHL), B 세포 림프종, B 세포 백혈병, 다발성 골수종, 신장암, 전립선암, 간암, 두경부암, 흑색종, 난소암, 중피종, 교모세포종, 배중심 B-세포 유사 (GCB) 미만성 거대 B 세포 림프종 (DLBCL), 활성화된 B 세포-유사 (ABC) DLBCL, 여포성 림프종 (FL), 맨틀 세포 림프종 (MCL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프성 백혈병 (CLL), 변연부 림프종 (MZL), 소 림프구성 백혈병 (SLL), 림프 모세포성 림프종 (LL), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 (WM), 중추 신경계 림프종 (CNSL), 버킷 림프종 (BL), B 세포 전림프구성 백혈병, 비장 변연부 림프종, 털 세포 백혈병, 비장 림프종/백혈병, 비장 미만성 적색 비수 소 B 세포림프종, 털 세포 백혈병 변이체, α 중쇄 질환, γ중쇄 질환, μ 중쇄 질환, 혈장 세포 골수종, 고립골 형질세포종, 골수외 형질세포종, 점막-관련 림프 조직의 림프절외 변연부 림프종 (MALT 림프종), 림프절 변연부 림프종, 소아 림프절 변연부 림프종, 소아 여포성 림프종, 일차 피부 소포 중심 림프종, T 세포/조직구 우월성 거대 B 세포 림프종, 중추 신경계의 일차 DLBCL, 일차 피부 DLBCL (다리 형), 노인의 엡스타인-바 바이러스 (EBV)-양성 DLBCL, 만성 염증과 관련된 DLBCL, 림프종양 육아종증, 일차 종격동 (흉선) 거대 B 세포 림프종, 혈관내 거대 B 세포 림프종, 역형성 림프종 키나제 (ALK)-양성 거대 B 세포 림프종, 형질모세포 림프종, HHV8-연관 다중심 Castleman 질환에서 유발된 거대 B 세포 림프종, 일차 삼출 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종과 버킷 림프종 사이의 중간체 특징을 가지는 분류할 수 없는 거대 B 세포 림프종, 또는 미만성 거대 B-세포 림프종과 전형적인 호지킨 림프종 사이의 중간체 특징을 가지는 분류할 수 없는 거대 B 세포 림프종을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 구체예들에서, 암은 HER2-양성 암 (예컨대, HER2-양성 유방암 또는 HER2-양성 위암)이다.
용어 “HER2-양성” 암은 정상보다 더 높은 HER2 수준을 갖는 암 세포들을 포함한다. HER2-양성 암의 예로는 HER2-양성 유방 암과 HER2-양성 위 암을 포함한다. 선택적으로, HER2-양성 암은 면역조직화학 (IHC) 점수 2+ 또는 3+을 갖거나 및/또는 ≥2.0의 현장 혼성화 (ISH) 증폭 비율을 가진다.
본원에서 사용되는 용어 “종양”은, 악성 또는 양성이든, 모든 신생물성 세포 성장 및 증식, 그리고 모든 전-암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다. 용어 “암”, “암성”, “세포 증식성 질병”, “증식성 질병” 및 “종양”은 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 상호 배타적이지 않다.
본원에 사용된 용어 "종양 항원"은 종양 세포상에 제시된 항원으로 이해 될 수 있다. 이들 항원들은 세포외 부분과 함께 세포 표면상에 제시될 수 있으며, 이는 종종 해당 분자의 막경유 및 세포질 부분과 조합된다. 이들 항원들은 때때로 종양 세포에 의해서만 제시될 수 있으며 정상 세포에 의해서는 결코 제시될 수 없다. 종양 항원은 종양 세포상에서 독점적으로 발현 될 수 있거나 정상 세포와 비교하여 종양 특이적 돌연변이를 나타낼 수 있다. 이러한 경우, 이들을 종양-특이적 항원이라 한다. 종양 세포 및 정상 세포에 의해 제시되는 종양 항원이 더 흔하며, 이를 종양 관련 항원이라 한다. 이들 종양 관련 항원은 정상 세포와 비교하여 과발현 될 수 있거나, 정상 조직에 비해 덜 치밀한 종양 조직 구조로 인해 종양 세포에서 항체 결합에 접근 가능하다.
화합물, 예를 들어, 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자 또는 이의 조성물 (예컨대, 약학 조성물)의 "유효량"은 원하는 치료 또는 예방 결과, 예컨대, 특정 질병 (예를 들어, 세포 증식성 질병, 예를 들어, 암)의 측정가능한 개선 또는 예방을 구현하는데 필요한 최소량이다. 본원에서 유효량은 환자의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중과 같은 요인들, 그리고 개체에서 원하는 반응을 유도하는 항체의 능력에 따라 달라질 수 있다. 유효량은 또한 치료상 유익한 효과가 치료의 임의의 독성 또는 유해 효과를 능가하는 양이다. 예방적 사용에 있어서, 유익한 또는 원하는 결과는 위험의 제거 또는 감소, 중증도 감소, 또는 질환의 생화학적, 조직학적 및/또는 행동 증상, 질환의 발달 중 나타나는 합병증 및 중간 병리학적 표현형을 비롯한, 질환의 발병 지연과 같은 결과를 포함한다. 치료적 사용에 있어서, 유익한 또는 원하는 결과는 임상 결과, 예컨대 질환에서 비롯되는 하나 이상의 증상 감소, 질환을 앓는 군의 삶의 질 증가, 질환을 치료하는데 필요한 다른 약제의 용량 감소, 예컨대 질환의 표적화, 질환 진행의 지연을 통한 기타 약제의 효과 증강, 및/또는 생존 연장을 포함한다. 암 또는 종양의 경우, 유효량의 약물은 암 세포수 감소; 종양 크기 감소; 말초 기관으로의 암 세포 침윤 억제 (즉, 어느 정도 둔화 또는 바람직하게는 정지); 종양 전이를 억제 (즉, 어느 정도 느리게하고 바람직하게는 정지); 종양 성장을 어느 정도 억제; 및/또는 질병과 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도 경감시키는 효과를 가질 수 있다. 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적 상, 유효량의 약물, 화합물 또는 약학 조성물은 직접 또는 간접적으로 예방 또는 치료 적 치료를 달성하기에 충분한 양이다. 임상적 맥락에서 이해되는 바와 같이, 유효량의 약물, 화합물 또는 약학 조성물은 다른 약물, 화합물 또는 약학 조성물과 함께 조합되어 달성되거나 달성되지 않을 수 있다. 따라서, "유효량"은 하나 이상의 치료제 투여 내용에서 고려될 수 있으며, 그리고 만약 하나 이상의 다른 제제와 함께 바람직한 결과가 달성될 수 있거나 달성되면 단일 제제는 유효량으로 제공되는 것으로 간주될 수 있다.
용어 "PD-1 축 결합 길항제"는, PD-1 신호전달 축 상의 신호전달로부터 유발된, T-세포 기능이상을 제거하기 위하여, PD-1 축 결합 짝과 이의 결합 짝들 중 하나 이상과의 상호작용을 억제하는 분자를 지칭하며, T-세포 기능을 복구되거나 향상시키는 결과를 가져온다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, PD-1 축 결합 길항제는 PD-1 결합 길항제 및 PD-L1 결합 길항제뿐만 아니라 PD-L1과 PD-1 사이의 상호작용 (예를 들면, PD-L2-Fc 융합)을 억제하는 분자를 포함한다.
본원에서 사용되는 “PD-1 결합 길항제”는 PD-1과 이의 하나 또는 그 이상의 결합 짝, 이를 테면, PD-L1 및/또는 PD-L2와의 상호작용으로 인하여 신호전달을 감소, 차단, 억제, 소멸 또는 간섭하는 분자를 지칭한다. 일부 구체예들에 있어서, PD-1 결합 길항제는 PD-1이 이의 결합 짝에 결합하는 것을 억제하는 분자다. 특정 양상에서, 상기 PD-1 결합 길항제는 PD-1이 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하는 것을 저해한다. 예를 들어, PD-1 결합 길항제는 PD-L1 및/또는 PD-L2 와의 PD-1 의 상호작용으로 유발된 신호 형질도입을 감소, 차단, 억제, 폐지 또는 억제하는, 항PD-1 항체 및 이의 항원-결합 단편, 면역접합체, 융합 단백질, 올리고펩티드, 소분자 길항제, 폴리뉴클레오티드 길항제, 및 기타 분자를 포함한다. 한 구체예에서, PD-1 결합 길항제는 기능이상 T-세포에 보다 낮은 기능이상을 부여하기 위하여 T 림프구에서 발현되는 세포 표면 단백질에 의해 또는 이를 통해 그리고 PD-1 또는 PD-L1을 통해 다른 세포에 의해 매개되는 음성 신호를 감소시킨다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 PD-1 결합 길항제는 항-PD-1 항체이다. 특정 양상에서, PD-1 결합 길항제는 본원에 기재된 MDX-1106 (니볼루맙)이다. 또 다른 특정 양상에서, PD-1 결합 길항제는 본원에 기재된 MK-3475 (펨브롤리주맙)이다. 또 다른 특정 양상에서, PD-1 결합 길항제는 본원에 기재된 CT-011 (피딜리주맙)이다. 또 다른 특정 양상에서, PD-1 결합 길항제는 MEDI-0680 (AMP-514)이다. 또 다른 특정 양상에서, PD-1 결합 길항제는 본원에서 기재된 PDR001 (스파르탈리주맙)이다. 또 다른 특정 양상에서, PD-1 결합 길항제는 REGN2810 (세미플리맙)이다. 또 다른 특정 양상에서, PD-1 결합 길항제는 BGB-108이다. 또 다른 특정 양상에서, PD-1 결합 길항제는 본원에 기재된 AMP-224이다.
본원에서 사용되는 “PD-L1 결합 길항제”는 PD-L1과 이의 하나 또는 그 이상의 결합 짝, 이를 테면 PD-1, B7-1과의 상호작용으로 인하여 신호전달을 감소, 차단, 억제, 소멸 및/또는 간섭하는 분자이다. 일부 구체예들에 있어서, PD-L1 결합 길항제는 PD-L1이 이의 결합 짝에 결합하는 것을 억제하는 분자다. 특정 양상에서, 상기 PD-L1 결합 길항제는 PD-L1이 PD-1 및/또는 B7-1에 결합하는 것을 저해한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 PD-L1 결합 길항제들은 PD-L1과 하나 또는 그 이상의 이의 결합 짝, 이를 테면 PD-1, B7-1과의 상호작용으로 인하여 생성되는 신호 전달을 감소, 차단, 억제, 소멸 또는 간섭하는 항-PD-L1 항체 및 이의 항원 결합 단편들, 면역접합체, 융합 단백질, 올리고펩티드, 소분자 길항제, 폴리뉴클레오티드 길항제, 및 기타 분자를 포함한다. 한 구체예에서, PD-L1 결합 길항제는 기능이상 T-세포에 보다 낮은 기능이상을 부여하기 위하여 (예컨대, 항원 인식에 대한 효과기 반응 향상) T 림프구에서 발현되는 세포 표면 단백질에 의해 또는 이를 통해 그리고 PD-1 또는 PD-L1을 통해 다른 세포에 의해 매개되는 음성 신호를 감소시킨다. 일부 구체예들에 있어서, PD-L1 결합 길항제는 항-PD-L1 항체이다. 특정 양상에서, 항-PD-L1 항체는 본원에 기재된 YW243.55.S70이다. 또 다른 특정 양상에서, 항-PD-L1 항체는 본원에 기재된 MDX-1105이다. 또한 또 다른 특정 양상에서, 항-PD-L1 항체는 MPDL3280A로도 공지된, 본원에 기재된 아테졸리주맙 (CAS 등록 번호: 1422185-06-5)이다. 여전히 또다른 특이적 측면에서, 항-PD-L1 항체는 본원에 기재된 MEDI4736 (더발루맙)이다. 한편 또 다른 특정 양상에서, 항-PD-L1 항체는 본원에 기술된 MSB0010718C (아벨루맙)이다.
용어 "프로그램된 사멸 리간드 1" 및 "PD-L1"은 본원에서 고유 서열 PD-L1 폴리펩티드, 폴리펩티드 변이체 (즉, PD-L1 폴리펩티드 변이체) 및 고유 서열 폴리펩티드 및 폴리펩티드 변이체의 단편 (본원에 상세히 정의됨)을 지칭한다. 본원에 기술된 PD-L1 폴리펩티드는 다양한 공급원으로부터, 예를 들면, 인간 조직 유형으로부터 또는 다른 공급원으로부터 분리되거나, 또는 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조될 수 있다.
"고유 서열 PD-L1 폴리펩티드"는, 상응하는 자연 유래 PD-L1 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
"PD-L1 폴리펩티드 변이체," 또는 이의 변이체는 본원에 개시된 바와 같은 임의의 고유 서열 PD-L1 폴리펩티드 서열과 적어도 약 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 PD-L1 폴리펩티드, 일반적으로 활성 PD-L1 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 PD-L1 폴리펩티드 변이체는, 예를 들면, 하나 이상의 아미노산 잔기가 고유 아미노산 서열의 N 또는 C-말단에 부가되거나, 또는 결실된 PD-L1 폴리펩티드를 포함한다. 통상적으로, PD-L1 폴리펩티드 변이체는 본 명세서에서 개시된 고유 서열 PD-L1 폴리펩티드 서열에 적어도 약 80% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다. 통상적으로, PD-L1 폴리펩티드 변이체는, 적어도 약 10 아미노산 길이, 대안적으로 적어도 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 또는 289 아미노산 길이, 또는 그 이상이다. 선택적으로, PD-L1 폴리펩티드 변이체는 고유 PD-L1 폴리펩티드 서열과 비교하여 1 이하의 보존적 아미노산 치환, 대안적으로 고유 PD-L1 폴리펩티드 서열과 비교하여 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 이하의 보존적 아미노산 치환을 가질 것이다.
용어 “PD-L2 결합 길항제”는 PD-2와 이의 하나 또는 그 이상의 결합 짝, 이를 테면 PD-1과의 상호작용으로 인하여 신호전달을 감소, 차단, 억제, 소멸 또는 간섭하는 분자를 지칭한다. 일부 구체예들에 있어서, PD-L2 결합 길항제는 PD-L2가 하나 또는 그 이상의 이의 결합 짝에 결합하는 것을 억제하는 분자다. 특정 양상에 있어서, 상기 PD-L2 결합 길항제는 PD-L2가 PD-1에 결합하는 것을 저해한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 PD-L2 길항제들은 PD-L2와 하나 또는 그 이상의 이의 결합 짝, 이를 테면 PD-1과의 상호작용으로 인하여 생성되는 신호 전달을 감소, 차단, 억제, 소멸 또는 간섭하는 항-PD-L2 항체, 이의 항원-결합 단편들, 면역접합체, 융합 단백질, 올리고펩티드 및 기타 분자를 포함한다. 한 실시양상에서, PD-L2 결합 길항제는 기능장애 T 세포에 보다 낮은 기능장애를 부여하기 위하여 (예를 들어, 항원 인식에 대한 효과기 반응을 향상) PD-L2를 통해 신호전달을 매개하는 T 림프구에서 발현되는 세포 표면 단백질에 의해 또는 이를 통해 매개되는 음성 공자극 신호를 감소시킨다. 일부 구체예들에서, PD-L2 결합 길항제는 면역부착소이다.
II.
조성물
한 양상에서, 본 발명은, 부분적으로, 이중특이적 항원-결합 분자 (예컨대, 이중특이적 항체)에 기초한다. 특정 구체예들에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 제 1 항원 (예를 들어, T 세포 항원, 예를 들어, CD3)에 특이적으로 결합 할 수 있는 1가 아암 및 2개의 추가 항원 (예를 들어, 종양 항원, 예를 들어, 2개의 HER2 항원)에 특이적으로 결합 할 수 있는 2가 아암을 갖는다. 예를 들어, 2가 암은 2개의 항원-결합 모이어티를 포함 할 수 있으며, 각각은 표적 항원 (예를 들어, HER2)에 특이적으로 결합하여 높은 수준의 표적 항원을 발현하는 세포에 대한 이중특이적 항원-결합 분자의 결합력을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자는 예를 들어, 세포 증식성 질병 (예를 들어, 암) 또는 자가면역 질병의 치료 또는 이의 진행을 지연시키거나, 이러한 질병을 갖는 대상체에서 면역 기능을 향상시키는데 유용하다.
본 발명의 1Fab-IgG TDB는 표적 종양 항원을 과발현하는 종양 세포를 높은 역가로 선택적으로 사멸시키는 한편, 소량의 표적 종양 항원을 발현하는 세포, 예를 들어, 정상 또는 건강한 인간 조직의 세포는 남겨둔다. 선택성은 종양 항원을 과발현하는 세포에서 높은 표적 밀도에 대한 2개의 낮은 친화도 항-종양 항원 Fab 아암들의 결합력에 기초한다. 종양 항원 과발현 세포에 대한 증가된 선택성은 TDB의 온-타겟 유해 효과를 완화시킨다. 예를 들어, 표적되는 종양 항원으로서 HER2를 사용시, HER2에 대해 1가의 높은 친화도로 결합하는 항-HER2-IgG TDB는 HER2 과발현 세포 및 낮은 수준의 HER2를 발현하는 세포들 모두에 결합한다. 이러한 TDB의 치료 지수는 높은 HER2 밀도로 인한, HER2 과발현 세포들에서의 보다 높은 활성에 기초한다. 높은 TDB 용량에서, 높은 친화도의 IgG1 HER2-TDB는 낮은 수준의 HER2를 발현하는 세포에 영향을 줄 수 있고 따라서 정상 조직에 대한 비종양 온-타겟 자가면역의 위험이 있다 (도 35A). HER2 결합 아암을 보다 낮은 친화도를 가지도록 조작하면 HER2 과발현 세포 및 낮은 수준의 HER2를 발현하는 세포 모두에서 결합 및 TDB 활성은 낮아지지만, 선택성을 개선하지는 않는다 (도 35B). 적절한 친화도 (1가 KD ~20-50 nM)에서의 2가 HER2 결합은 항-HER2 1Fab-IgG TDB의 결합력으로 인해 HER2-과발현 세포들에 대한 높은 결합을 가져온다. 결합 효과는 높은 HER2 밀도에 의존하므로, 1Fab-IgG TDB는 낮은 수준의 HER2를 발현하는 세포, 예를 들어 정상 또는 건강한 인간 조직의 세포에 결합하지 않는다. 세포 결합은 T 세포 활성을 동원하는 TDB의 능력과 상관관계가 있으므로, 항-HER2 1Fab-IgG TDB는 HER2를 과발현하는 세포들만을 선택적으로 사멸시키고 정상 조직들에 대한 비종양 온-타겟 자가면역을 유도할 위험을 감소시켰다 (도 35C).
예시적 이중특이적 항원-결합 분자
한 양상에서, 본 발명은 1가 아암 및 2가 아암을 가지는 분리된 이중특이적 항원-결합 분자 (예컨대, 이중특이적 항체)를 제공한다. 예를 들어, 한 양상에서, 본 발명은 1가 아암 및 2가 아암을 갖는 이중특이적 항원-결합 분자를 제공하며, 여기서 (a) 1가 아암은 제 1 항원-결합 모이어티를 포함하고, (b) 2가 아암은 제 2 항원-결합 모이어티 및 제 3 항원-결합 모이어티를 포함한다. 일부 구체예들에서, 제 1 항원-결합 보이어티의 C-말단은 제 1 Fc 소단위의 N-말단에 융합되고, 제 3 항원-결합 모이어티의 C-말단은 제 2 항원-결합 모이어티의 N-말단에 융합되고, 제 2 항원-결합 모이어티의 C-말단은 제 2 Fc 소단위의 N-말단에 융합된다. 일부 구체예들에서, 제 1 Fc 소단위는 제 2 Fc 소단위와 결합되어, Fc 도메인을 형성한다. 일부 구체예들에서, 제 1 항원-결합 모이어티는 제 1 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있고, 제 2 항원-결합 모이어티 및 제 3 항원-결합 모이어티는 각각 (예컨대, 제 2 표적 세포 항원 상의 동일한 에피토프에서 또는 상이한 에피토프에서) 제 2 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있다.
제 1 항원-결합 모이어티는 가변 중쇄 (VHA) 영역 및 가변 경쇄 (VLA) 영역을 포함하는 Fab 분자 (FabA) 일 수 있고; 제 2 항원-결합 모이어티는 가변 중쇄 (VHB1) 영역 및 가변 경쇄 (VLB1) 영역을 포함하는 Fab 분자 (FabB1) 일 수 있고; 및/또는 제 3 항원-결합 모이어티는 가변 중쇄 (VHB2) 영역 및 가변 경쇄 (VLB2) 영역을 포함하는 Fab 분자 (FabB2) 일 수 있다. 그러므로, 일부 예들에서, 제 1 항원-결합 모이어티는 VHA 영역 및 VLA 영역을 포함하는 FabA일 수 있고, 제 2 항원-결합 모이어티는 VHB1 영역 및 VLB1 영역을 포함하는 FabB1일 수 있고, 제 3 항원-결합 모이어티는 VHB2 영역 및 VLB2일 수 있다. VHB1 및 VHB2는 95% 이상 서열 동일성 (예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성)을 공유 할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, VLB1 및 VLB2는 95% 이상 서열 동일성 (예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성)을 공유 할 수 있다.
1Fab-IgG 분자는 제 1 항원-결합 모이어티, 제 2 항원-결합 모이어티 및 제 3 항원-결합 모이어티를 갖는 이중특이적 항원-결합 분자를 지칭하며, 여기서 제 1 항원-결합 모이어티는 VHA 영역 및 VLA 영역을 포함하는 FabA이고, 제 2 항원-결합 모이어티는 VHB1 영역 및 VLB1 영역을 포함하는 FabB1이고, 제 3 항원-결합 모이어티는 VHB2 영역 및 VLB2 영역을 포함하는 FabB2이며, VHB1 및 VHB2는 95% 이상의 서열 동일성 (예컨대, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 공유하고, VLB1 및 VLB2는 95% 이상의 서열 동일성 (예컨대, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 공유한다. 1Fab-IgG 분자는 제 1 표적 항원에 결합하는 제 1 항원-결합 모이어티를 포함하는 1가 아암 및 제 2 및 제 3 항원-결합 모이어티를 포함하는 2가 아암을 가지며, 여기서 제 2 및 제 3 항원-결합 분자들 각각은 제 2 표적 세포 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예들에서, 1Fab-IgG 분자는 1가 아암이 T 세포 표면의 항원에 특이적으로 결합하고, 2가 아암의 각각의 항원-결합 모이어티는 제 2 표적 세포 (예를 들어, 종양 세포)의 표면상의 항원에 특이적으로 결합하는, 1Fab-IgG T-세포 의존성 이중특이적 분자 (1Fab-IgG TDB)이다. 표준 2가 IgG 형식 (IgG TDB)을 갖는 TDB와 마찬가지로, 1Fab-IgG TDB는 표적된 항원을 발현하는 세포를 사멸시키기 위해 세포용해 T 세포를 동원한다.
예를 들어, 항-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB는 CD3 (예를 들어, T 세포 표면의 CD3 분자)에 특이적으로 결합하는 1가 아암 및 각각 특이적으로 HER2 (예를 들어, 종양 세포 표면의 HER2 분자)에 결합하는 2개의 항원-결합 모이어티를 갖는 2가 아암을 갖는다. 2가 아암 상의 2개의 항원-결합 모이어티는 동일한 에피토프에 결합할 수 있거나, 또는 2가 아암 상의 각각의 항원-결합 모이어티는 동일한 항원상의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 한 구체예에서, 2가 아암은 4D5와 동일한 에피토프에 결합한다. 한 구체예에서, 2가 아암은 HER2의 도메인 IV에 결합한다. 한 구체예에서, CD3에 특이적인 1가 아암 상의 항원-결합 모이어티는 40G5c Fab이고, HER2에 특이적인 2가 아암 상의 2개의 항원-결합 모이어티 각각은 4D5 Fab의 변이체이다. 본원에 특정 구체예들이 예시된다.
본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자는 고밀도의 항원 (예를 들어, 종양 항원)을 우선적으로 발현하는 세포에 대한 증가된 민감성을 제공 할 수 있으며, 이는 많은 경우에 (예를 들어, T 세포를 낮은 수준의 종양 항원을 발현하는 건강한 세포보다는 종양 세포에 결합하도록 활성화시킴으로써)건강한 조직에 대한 손상을 감소시킨다. 따라서, 일부 구체예들에서, 종양 항원은 (a) 대상체의 종양 세포에서 및 (b) 대상체의 적어도 하나의 비-종양 세포 유형에서 (예를 들어, 종양 세포에서의 발현보다 낮은 밀도로) 발현된다. 일부 구체예들에서, 비-종양 세포 대 종양 세포의 종양 항원 복제수 비율은 1:2 내지 1:1,000,000 (예컨대, 1:3 내지 1:500,000, 1:4 내지 1:100,000, 1:5 내지 1:50,000, 1:6 내지 1:40,000, 1:7 내지 1: 20,000, 1:8 내지 1:10,000, 1:9 내지 1:5,000, 1:10 내지 1:1,000, 1:20 내지 1:500, 1:50 내지 1:400, 또는 1:100 내지 1:200, 예컨대, 1:2 내지 1:10, 1:10 내지 1:20, 1:20 내지 1:50, 1:50 내지 1:100, 1:100 내지 1:200, 1:200 내지 1:300, 1:300 내지 1:400, 1:400 내지 1:500, 1:500 내지 1:600, 1:600 내지 1:700, 1:700 내지 1:800, 1:800 내지 1:900, 1:900 내지 1:1,000, 1:1,000 내지 1:5,000, 1:5,000 내지 1:10,000, 1:10,000 내지 1:50,000, 1:50,000 내지 1:100,000, 1:100,000 내지 1:500,000, 또는 1:500,000 내지 1:1,000,000, 예컨대, 약 1:2, 약 1:3, 약 1:4, 약 1:5, 약 1:6, 약 1:7, 약 1:8, 약 1:9, 약 1:10, 약 1:15, 약 1:20, 약 1:25, 약 1:30, 약 1:35, 약 1:40, 약 1:50, 약 1:60, 약 1:70, 약 1:80, 약 1:90, 약 1:100, 약 1:125, 약 1:150, 약 1:175, 약 1:200, 약 1:300, 약 1:400, 약 1:500, 약 1:1,000, 약 1:10,000, 약 1:100,000, 또는 약 1:1,000,000)이다.
일부 구체예들에서, 비-종양 세포에서의 종양 항원 복제수는 101 내지 106 (예컨대, 101 내지 106, 101 내지 105, 101 내지 104, 101 내지 103, 101 내지 102, 102 내지 106, 102 내지 105, 102 내지 104, 102 내지 103, 103 내지 106, 103 내지 105, 103 내지 104, 104 내지 106, 104 내지 105, 또는 105 내지 106, 예컨대, 약 101, 102, 103, 104, 105, 또는 106) 이다. 일부 구체예들에서, 종양 세포에서 종양 항원 복제수는 102 내지 107 (예컨대, 102 내지 107, 102 내지 106, 102 내지 105, 102 내지 104, 102 내지 103, 103 내지 107, 103 내지 106, 103 내지 105, 103 내지 104, 104 내지 107, 104 내지 106, 104 내지 105, 105 내지 107, 105 내지 106, 또는 106 내지 107, 예컨대, 약 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107) 이다.
일부 구체예들에서, 종양 항원 복제수는 비-종양 세포에서 101 내지 106 그리고 종양 세포에서 102 내지 108 (예컨대, 비-종양 세포에서 102 내지 105 그리고 종양 세포에서 103 내지 107, 비-종양 세포에서 102 내지 105 그리고 종양 세포에서 104 내지 107, 비-종양 세포에서 103 내지 105 그리고 종양 세포에서 105 내지 107, 비-종양 세포에서 103 내지 104 그리고 종양 세포에서 105 내지 106, 또는 비-종양 세포에서 104 내지 105 그리고 종양 세포에서 106 내지 107) 이다.
일부 구체예들에서, 종양 항원 복제수 (예컨대, 평균 종양 항원 복제수, 예컨대, HER2 복제수, 예컨대, 평균 HER2 복제수)는 비-종양 세포에서 101 내지 2.0 × 105 그리고 종양 세포에서 2.0 × 105 이상이다.
본 발명의 항원-결합 분자에 의해 결합되는 종양 세포들은 세포 당 200,000 이상의 복제수 (예컨대, 평균 복제수) (예컨대, 세포 당 250,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 300,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 400,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 500,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 600,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 700,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 750,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 800,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 900,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 1,000,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 1,200,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 1,500,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 2,000,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 2,500,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 3,000,000 이상의 HER2 복사체, 또는 그 이상, 예컨대, 세포 당 200,000 내지 3,000,000의 HER2 복사체, 세포 당 250,000 내지 2,500,000의 HER2 복사체, 세포 당 300,000 내지 2,000,000의 HER2 복사체, 세포 당 400,000 내지 1,500,000의 HER2 복사체, 또는 세포 당 500,000 내지 1,000,000의 HER2 복사체, 예컨대, 세포 당 200,000 내지 1,000,000의 HER2 복사체 (예컨대, 세포 당 200,000 내지 250,000의 HER2 복사체, 세포 당 250,000 내지 300,000의 HER2 복사체, 세포 당 300,000 내지 400,000의 HER2 복사체, 세포 당 400,000 내지 500,000의 HER2 복사체, 세포 당 500,000 내지 750,000의 HER2 복사체, 또는 세포 당 750,000 내지 1,000,000의 HER2 복사체) 또는 세포 당 1,000,000 내지 3,000,000의 HER2 복사체 (예컨대, 세포 당 1,000,000 내지 1,500,000의 HER2 복사체, 세포 당 1,500,000 내지 2,000,000의 HER2 복사체, 세포 당 2,000,000 내지 2,500,000의 HER2 복사체, 또는 세포 당 2,500,000 내지 3,000,000의 HER2 복사체)의 HER2를 발현할 수 있다. 그러므로, 전술한 임의의 HER2 발현 특성들을 가지는 HER2-양성 종양 세포들은 본 발명의 항원-결합 분자의 결합시, HER2 발현이 거의 없는 또는 없는 (예컨대, 세포 당 200,000 미만의 HER2 복사체, 예컨대, 세포 당 0 내지 200,000 HER2 복사체, 세포 당 0 내지 150,000 HER2 복사체, 세포 당 0 내지 100,000 HER2 복사체, 세포 당 0 내지 50,000 HER2 복사체, 세포 당 0 내지 20,000 HER2 복사체, 세포 당 0 내지 10,000 HER2 복사체, 세포 당 0 내지 5,000 HER2 복사체, 또는 세포 당 0 내지 1,000 HER2 복사체) 비-종양 세포에 비해 T 세포에 의해 우선적으로 사멸 (예컨대, 선택적으로 사멸) 될 수 있다.
종양 항원 복제수 (예컨대, 평균 종양 항원 복제수, 예컨대, HER2 복제수, 예컨대, 평균 HER2 복제수)는 해당 분야에 공지되거나 본원에 기재된 임의의 적합한 수단을 사용하여 정량될 수 있다. 예를 들어, HER2 복제수는 유세포 분석에 의한 형광 정량을 사용하여 (예를 들어, 공지의 등가의 가용성 플루오로 크롬 (MESF) 분자의 비드를 사용하여) 정량 할 수 있다.
일부 구체예에서, 제 2 항원-결합 모이어티 및/또는 제 3 항원-결합 모이어티의 1가 결합 친화도 (KD)는 10 nM 내지 100 nM (예를 들어, 20 nM 내지 90 nM, 30 nM 내지 80 nM, 40 nM 내지 60 nM, 예를 들어, 25 nM 내지 55 nM)이다. 한 구체예에서, 제 2 항원-결합 모이어티 및/또는 제 3 항원-결합 모이어티의 1가 결합 친화도 (KD)는 20 nM 내지 50 nM이다. 한 구체예에서, 제 2 항원-결합 모이어티 및 제 3 항원-결합 모이어티의 1가 결합 친화도 (KD)는 20 nM 내지 50 nM이다.
일부 구체예에서, 제 2 항원-결합 모이어티 및/또는 제 3 항원-결합 모이어티의 1가 해리 속도는 10-3/초 내지 10-1/초 (예를 들어, 10-2/초 내지 30-2/초)이다.
일부 구체예들에서, 제 1 표적 항원은 CD3와 같은 활성화 T 세포 항원이다. 다양한 T 세포 항원-결합 모이어티가 해당 분야에 공지되어 있으며 본 발명의 일부로서 사용하기에 적합하다. 예를 들어, 본 발명의 특정 구체예에서, 적합한 제 1 항원-결합 모이어티는, 예를 들어, 미국 공개특허 제 2015/0166661에 기재된 바와 같은 항체 클론 40G5c 또는 이의 단편 및/또는 변이체이며, 상기 문헌은 본원에 참고문헌으로 포함된다. 특정 구체예들에서, 제 1 항원-결합 모이어티는 서열 번호: 1의 HVR-H1, 서열 번호: 2의 HVR-H2, 서열 번호: 3의 HVR-H3, 서열 번호: 4의 HVR-L1, 서열 번호: 5의 HVR-L2, 및 서열 번호: 6의 HVR-L3을 포함하는 항-CD3 Fab (예컨대, 40G5c)이다. 일부 구체예들에서, 제 1 항원-결합 모이어티는 서열 번호: 7의 VH 및 서열 번호: 8의 VL을 포함하는 항-CD3 Fab (예컨대, 40G5c)이다. 40G5c의 아미노산 서열을 또한 표 1에 제공한다.
표 1. 예시적 항체 클론들에 대한 초가변 영역 (HVR) 및 가변 영역 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 아미노산 서열에 상응하는 서열 번호.
일부 구체예들에서, 제 1 항원-결합 모이어티는 인간 CD3 폴리펩티드 또는 시노몰구스 원숭이 (cyno) CD3 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구체예들에서, 인간 CD3 폴리펩티드 또는 cyno CD3 폴리펩티드는 각각 인간 CD3ε폴리펩티드 또는 cyno CD3ε폴리펩티드이다. 일부 구체예들에서, 인간 CD3 폴리펩티드 또는 cyno CD3 폴리펩티드는 각각 인간 CD3γ폴리펩티드 또는 cyno CD3γ폴리펩티드이다. CD3에 결합하는 또 다른 항원-결합 모이어티 (예컨대, Fab 분자)는 해당 분야에 공지이고, 예를 들어, 미국 공개특허 제 2015/0166661에 기재되어 있으며, 본 발명의 일부로서 사용하기에 적합할 수 있다.
일부 구체예들에서, 제 1 항원-결합 모이어티의 1가 KD는 250 nM 이하의 KD로 인간 CD3ε폴리펩티드에 결합한다. 일부 구체예들에서, 항-CD3 항체는 100 nM 이하의 KD로 인간 CD3ε폴리펩티드에 결합한다. 일부 구체예들에서, 항-CD3 항체는 15 nM 이하의 KD로 인간 CD3ε폴리펩티드에 결합한다. 일부 구체예들에서, 항-CD3 항체는 10 nM 이하의 KD로 인간 CD3ε폴리펩티드에 결합한다. 일부 구체예들에서, 항-CD3 항체는 5 nM 이하의 KD로 인간 CD3ε폴리펩티드에 결합한다. 일부 구체예들에서, 제 1 항원-결합 모이어티의 1가 KD는 10 nM 내지 100 nM (예를 들어, 20 nM 내지 90 nM, 20 nM 내지 80 nM, 30 nM 내지 70 nM, 또는 40 nM 내지 60 nM) 이다.
일부 구체예들에서, 제 2 표적 세포 항원은 종양 항원이다.
종양 항원은 HER2 일 수 있다. HER2에 결합하는 적합한 제 2 및/또는 제 3 항원-결합 모이어티는 항체 4D5, 또는 이의 단편 및/또는 변이체이다. 4D5, 및 이의 치환 변이체들의 아미노산 서열은 표 1에 제시되어 있으며, 예를 들어, 미국 공개특허 제 2015/0166661에 기재되어 있고, 이는 본원에 그 전문이 참고문헌으로 포함된다. 한 구체예에서, 제 2 및/또는 제 3 항원-결합 모이어티는 항체 4D5와 동일한 에피토프에 결합한다 (이의 인간화된 형태는 트라스투주맙으로 공지됨 (HERCEPTIN®Genentech, Inc., South San Francisco, CA), Molina, 외, Cancer Research 2001, 61 (12): 4744-4749). 한 구체예에서, 제 2 및 제 3 항원-결합 모이어티는 항체 4D5와 동일한 에피토프에 결합한다.
한 구체예에서, 제 2 및/또는 제 3 항원-결합 모이어티는 항체 2C4와 동일한 에피토프에 결합한다 (이의 인간화된 형태는 페르투주맙으로 공지됨 (PERJETA®Genentech, Inc., South San Francisco, CA), Franklin 외, Cancer Cell 2004, 5: 317-328). 한 구체예에서, 제 2 및 제 3 항원-결합 모이어티는 항체 2C4와 동일한 에피토프에 결합한다.
한 구체예에서, 제 2 및/또는 제 3 항원-결합 모이어티는 항체 7C2와 동일한 에피토프에 결합한다 (미국 특허 제 9,518,118). 한 구체예에서, 제 2 및 제 3 항원-결합 모이어티는 항체 7C2와 동일한 에피토프에 결합한다.
도 36은 HER2 ECD의 결정 구조를 제공하고 상이한 HER2 항체들이 결합하는 영역들을 강조한다. 4D5는 세포막에 가장 가까운 단백질 영역인 HER2의 도메인 IV에서 에피토프에 결합한다. 2C4는 hu4D5가 결합하는 영역으로부터 50 옹스트롬에 존재하는 HER2의 도메인 II에서 에피토프에 결합한다. 7C2는 hu4D5에 의해 결합된 HER2 영역으로부터 100 옹스트롬에 존재하는 HER2의 도메인 I에서 에피토프에 결합한다.
한 구체예에서, 제 2 및/또는 제 3 항원-결합 모이어티는 HER2의 도메인 IV에 결합한다. 한 구체예에서, 제 2 및 제 3 항원-결합 모이어티는 HER2의 도메인 IV에 결합한다. 한 구체예에서, 제 2 및/또는 제 3 항원-결합 모이어티는 HER2의 도메인 II에 결합한다. 한 구체예에서, 제 2 및 제 3 항원-결합 모이어티는 HER2의 도메인 II에 결합한다.
한 구체예에서, 제 2 및/또는 제 3 항원-결합 모이어티는 HER2의 도메인 I에 결합한다. 한 구체예에서, 제 2 및 제 3 항원-결합 모이어티는 HER2의 도메인 I에 결합한다.
한 구체예에서, 제 2 항원-결합 모이어티는 HER2의 도메인 IV에 결합하고 제 3 항원-결합 모이어티는 HER2의 도메인 I에 결합한다.
한 구체예에서, 제 2 항원-결합 모이어티는 HER2의 도메인 IV에 결합하고 제 3 항원-결합 모이어티는 HER2의 도메인 II에 결합한다.
한 구체예에서, 제 2 항원-결합 모이어티는 HER2의 도메인 II에 결합하고 제 3 항원-결합 모이어티는 HER2의 도메인 I에 결합한다.
일부 구체예들에서, 전술한 구체예들 중 어느 하나의 이중특이적 항원-결합 분자는 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함하는 VHA 영역을 특징으로 한다: (a) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는 (c) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. 일부 구체예들에서, VHA 영역은 서열 번호: 7에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 7에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 7에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 7에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 7에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 7에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, VHA 영역은 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLA 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는 (c) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VLA 영역은 서열 번호: 8에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 8에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 8에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 8에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 8에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 8에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, VLA 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-CD3 이중특이적 항원-결합 분자 (예컨대, 항-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB, 예컨대, 40G5c CD3 결합 도메인을 가지는 항-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB)이다.
일부 구체예들에서, VHA은 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLA은 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHA 영역은 서열 번호: 7에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 7에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 7에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 7에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 7에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 7에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; VLA 영역은 서열 번호: 8에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 8에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 8에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 8에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 8에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 8에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VHA 영역은 서열 번호: 7의 아미노산을 포함하고; 그리고 VLA 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-CD3 이중특이적 항원-결합 분자 (예컨대, 항-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB, 예컨대, 40G5c CD3 결합 도메인을 가지는 항-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB)이다.
일부 구체예들에서, VHB1 영역 및/또는 VHB2 영역은 Kabat 넘버링 체계에 따라 N54, D98, F100, 및/또는 Y102 중 1, 2, 3, 또는 4개 잔기 모두에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들면, VH B1 영역 및/또는 VHB2 영역은 Kabat 넘버링 체계에 따라 다음 잔기들: N54E, D98A, D98T, F100A, 및/또는 Y102V 중 1, 2, 3, 4, 또는 5개 모두에서의 아미노산 치환을 특징으로 할 수 있다.
일부 구체예들에서, VLB1 영역 및/또는 VLB2 영역은 Kabat 넘버링 체계에 따라 N30, Y55, 및/또는 H91 중 1, 2, 또는 3개 잔기 모두에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들면, 상기 VLB1 영역 및/또는 VLB2 영역은 다음 잔기들: N30S, Y55E, 및/또는 H91A 중 1, 2, 또는 3개 모두에서의 아미노산 치환을 특징으로 한다.
일부 구체예들에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함하는 VHB1 영역을 특징으로 한다: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는 (c) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 17에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 17에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 17에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 17에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 17에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 17에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는 (c) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 서열 번호: 18에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 18에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 18에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 18에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 18에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 18에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB1은 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB1은 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 17에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 17에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 17에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 17에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 17에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 17에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; VLB1 영역은 서열 번호: 18에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 18에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 18에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 18에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 18에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 18에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, VHB1 영역은 서열 번호: 17의 아미노산을 포함하고; VLB1 영역은 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는 (c) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 17에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 17에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 17에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 17에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 17에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 17에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는 (c) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 서열 번호: 18에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 18에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 18에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 18에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 18에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 18에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB2는 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB2는 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 17에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 17에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 17에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 17에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 17에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 17에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; VLB2 영역은 서열 번호: 18에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 18에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 18에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 18에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 18에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 18에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, VHB2 영역은 서열 번호: 17의 아미노산을 포함하고; VLB2 영역은 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, VLB1 영역 및/또는 VLB2 영역은 H91에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, H91 잔기는 비극성 측쇄를 갖는 아미노산으로 치환된다. 일부 구체예에서, VLB1 영역 및/또는 VLB2 영역은 H91A에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, VLB1 영역 및/또는 VLB2 영역은 Y55에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, Y55 잔기는 산성 측쇄를 갖는 아미노산으로 치환된다. 일부 구체예에서, VLB1 영역 및/또는 VLB2 영역은 Y55E에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, VHB1 영역 및/또는 VHB2 영역은 F100 및/또는 Y102에서 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, F100 잔기 및/또는 Y102 잔기는 비극성 측쇄를 갖는 아미노산으로 치환된다. 일부 구체예에서, VHB1 영역 및/또는 VHB2 영역은 F100A 및/또는 Y102V에서 아미노산 치환을 포함한다.
이중특이적 항원-결합 모이어티들에 관한 일부 구체예에서, VLB1 영역 및/또는 VLB2 영역은 하나 이상의 경향성 고정 잔기 (liability fixed residues), 예를 들어, N30S의 아미노산 치환을 포함하는 하나 이상의 경향성 고정 잔기를 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, VHB1 영역 및/또는 VHB2 영역은 하나 이상의 경향성 고정 잔기, 예컨대, N54E, D98A, 및 D98T로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 하나 이상의 경향성 고정 잔기를 특징으로 할 수 있다.
이중특이적 항원-결합 분자는 제 2 및/또는 제 3 항원-결합 모이어티 (예를 들어, H91A)의 경쇄의 잔기 H91에서 돌연변이를 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함하는 VHB1 영역을 특징으로 한다: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는 (c) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 24에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 24에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 24에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 24에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 24에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 24에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는 (c) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 서열 번호: 27에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 27에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 27에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 27에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 27에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 27에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB1은 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB1은 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 24에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 24에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 24에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 24에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 24에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 24에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; VLB1 영역은 서열 번호: 27에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 27에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 27에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 27에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 27에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 27에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, VHB1 영역은 서열 번호: 24의 아미노산을 포함하고; VLB1 영역은 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는 (c) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 24에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 24에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 24에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 24에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 24에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 24에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는 (c) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 서열 번호: 27에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 27에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 27에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 27에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 27에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 27에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 예들에서, VHB2는 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB2는 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 24에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 24에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 24에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 24에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 24에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 24에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; VLB2 영역은 서열 번호: 27에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 27에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 27에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 27에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 27에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 27에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, VHB2 영역은 서열 번호: 24의 아미노산을 포함하고; VLB2 영역은 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB)이다.
다른 경우에, 이중특이적 항원-결합 분자는 제 2 및/또는 제 3 항원-결합 모이어티의 중쇄의 잔기 D98, F100 및 Y102에서의 돌연변이 (예를 들어, D98A, F100A 및 Y102V)를 특징으로 할 수 있다. 일부 구체예들에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함하는 VHB1 영역을 특징으로 한다: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는 (c) 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 33에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 33에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 33에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 33에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 33에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 33에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는 (c) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 서열 번호: 25에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 25에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 25에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 25에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 25에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 25에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB1은 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB1은 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 33에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 33에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 33에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 33에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 33에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 33에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; VLB1 영역은 서열 번호: 25에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 25에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 25에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 25에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 25에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 25에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, VHB1 영역은 서열 번호: 33의 아미노산을 포함하고; VLB1 영역은 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는 (c) 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 33에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 33에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 33에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 33에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 33에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 33에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는 (c) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 서열 번호: 25에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 25에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 25에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 25에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 25에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 25에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB2는 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB2는 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 33에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 33에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 33에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 33에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 33에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 33에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; VLB2 영역은 서열 번호: 25에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 25에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 25에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 25에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 25에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 25에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, VHB2 영역은 서열 번호: 33의 아미노산을 포함하고; VLB2 영역은 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 4D5 D98A.F100A.Y102V-1Fab-IgG TDB)이다.
다른 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 경쇄의 잔기 Y55 및 H91 및 제 2 및/또는 제 3 항원-결합 모이어티의 중쇄의 잔기 N54 및 D98에서의 돌연변이(예를 들어, Y55E, H91A, N54E 및 D98T)를 특징으로 할 수 있다. 일부 구체예들에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함하는 VHB1 영역을 특징으로 한다: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는 (c) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 41에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 41에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는 (c) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 48에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 48에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB1은 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB1은 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 41에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 41에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; VLB1 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 48에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 48에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, VHB1 영역은 서열 번호: 41의 아미노산을 포함하고; VLB1 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는 (c) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 41에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 41에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는 (c) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 48에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 48에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB2는 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB2는 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 41에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 41에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; VLB2 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 48에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 48에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, VHB2 영역은 서열 번호: 41의 아미노산을 포함하고; VLB2 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T-1Fab-IgG TDB)이다.
다른 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 경쇄의 잔기 Y55 및 H91 및 제 2 및/또는 제 3 항원-결합 모이어티의 중쇄의 잔기 N54, D98, 및 Y102에서의 돌연변이(예를 들어, Y55E, H91A, N54E, D98T, 및 Y102)를 특징으로 할 수 있다. 일부 구체예들에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함하는 VHB1 영역을 특징으로 한다: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는 (c) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 44에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 44에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는 (c) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 48에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 48에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB1은 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB1은 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 44에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 44에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; VLB1 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 48에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 48에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, VHB1 영역은 서열 번호: 41의 아미노산을 포함하고; VLB1 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는 (c) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 44에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 44에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는 (c) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 48에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 48에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB2는 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB2는 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 44에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 44에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; VLB2 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 48에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 48에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 48에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, VHB2 영역은 서열 번호: 44의 아미노산을 포함하고; VLB2 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB)이다.
다른 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 경쇄의 잔기 N30, Y55 및 H91 및 제 2 및/또는 제 3 항원-결합 모이어티의 중쇄의 잔기 N54 및 D98에서의 돌연변이(예를 들어, N30, Y55E, H91A, N54E 및 D98T)를 특징으로 할 수 있다. 일부 구체예들에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함하는 VHB1 영역을 특징으로 한다: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는 (c) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 41에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 41에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는 (c) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 49에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 49에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB1은 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB1은 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 41에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 41에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; VLB1 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 49에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 49에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, VHB1 영역은 서열 번호: 41의 아미노산을 포함하고; VLB1 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는 (c) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 41에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 41에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는 (c) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 49에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 49에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB2는 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB2는 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 41에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 41에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 41에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; VLB2 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 49에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 49에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, VHB2 영역은 서열 번호: 41의 아미노산을 포함하고; VLB2 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 4D5 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T-1Fab-IgG TDB)이다.
다른 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 경쇄의 잔기 N30, Y55 및 H91 및 제 2 및/또는 제 3 항원-결합 모이어티의 중쇄의 잔기 N54, D98, 및 Y102에서의 돌연변이(예를 들어, N30, Y55E, H91A, N54E, D98T, 및 Y102V)를 특징으로 할 수 있다. 일부 구체예들에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함하는 VHB1 영역을 특징으로 한다: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는 (c) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 44에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 44에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는 (c) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 49에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 49에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, VLB1 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB1은 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB1은 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB1 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 44에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 44에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; VLB1 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 49에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 49에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, VHB1 영역은 서열 번호: 44의 아미노산을 포함하고; VLB1 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는 (c) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 44에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 44에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는 (c) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 49에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 49에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, VLB2 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB2는 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB2는 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB2 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 44에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 44에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 44에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; VLB2 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 49에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 49에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 49에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, VHB2 영역은 서열 번호: 44의 아미노산을 포함하고; VLB2 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 4D5 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB)이다.
일부 구체예들에서, VHB1 및/또는 VHB2는 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB1 및/또는 VLB2는 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB1 및/또는 VHB2는 서열 번호: 30에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열 또는 서열 번호: 30의 서열을 포함하고 VLB1 및/또는 VLB2는 서열 번호: 31에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열 또는 서열 번호: 31의 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB1 및/또는 VHB2는 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB1 및/또는 VLB2는 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB1 및/또는 VHB2는 서열 번호: 35에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열 또는 서열 번호: 35의 서열을 포함하고 VLB1 및/또는 VLB2는 서열 번호: 25에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열 또는 서열 번호: 25의 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB1 및/또는 VHB2는 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB1 및/또는 VLB2는 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB1 및/또는 VHB2는 서열 번호: 39에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열 또는 서열 번호: 39의 서열을 포함하고 VLB1 및/또는 VLB2는 서열 번호: 40에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열 또는 서열 번호: 40의 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB1 및/또는 VHB2는 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB1 및/또는 VLB2는 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB1 및/또는 VHB2는 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열 또는 서열 번호: 41의 서열을 포함하고 VLB1 및/또는 VLB2는 서열 번호: 42에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열 또는 서열 번호: 42의 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB1 및/또는 VHB2는 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB1 및/또는 VLB2는 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB1 및/또는 VHB2는 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열 또는 서열 번호: 41의 서열을 포함하고 VLB1 및/또는 VLB2는 서열 번호: 27에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열 또는 서열 번호: 27의 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB1 및/또는 VHB2는 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB1 및/또는 VLB2는 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB1 및/또는 VHB2는 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열 또는 서열 번호: 44의 서열을 포함하고 VLB1 및/또는 VLB2는 서열 번호: 45에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열 또는 서열 번호: 45의 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB1 및/또는 VHB2는 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB1 및/또는 VLB2는 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB1 및/또는 VHB2는 서열 번호: 24에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열 또는 서열 번호: 24의 서열을 포함하고 VLB1 및/또는 VLB2는 서열 번호: 40에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열 또는 서열 번호: 40의 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB1 및/또는 VHB2는 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB1 및/또는 VLB2는 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB1 및/또는 VHB2는 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열 또는 서열 번호: 41의 서열을 포함하고 VLB1 및/또는 VLB2는 서열 번호: 25에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열 또는 서열 번호: 25의 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB1 및/또는 VHB2는 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB1 및/또는 VLB2는 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB1 및/또는 VHB2는 서열 번호: 46에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열 또는 서열 번호: 46의 서열을 포함하고 VLB1 및/또는 VLB2는 서열 번호: 40에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열 또는 서열 번호: 40의 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB1 및/또는 VHB2는 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB1 및/또는 VLB2는 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB1 및/또는 VHB2는 서열 번호: 47에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열 또는 서열 번호: 47의 서열을 포함하고 VLB1 및/또는 VLB2는 서열 번호: 40에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열 또는 서열 번호: 40의 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB1 및/또는 VHB2는 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB1 및/또는 VLB2는 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB1 및/또는 VHB2는 서열 번호: 30에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열 또는 서열 번호: 47의 서열을 포함하고 VLB1 및/또는 VLB2는 서열 번호: 25에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열 또는 서열 번호: 40의 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB1 및/또는 VHB2는 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB1 및/또는 VLB2는 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB1 및/또는 VHB2는 서열 번호: 24에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열 또는 서열 번호: 24의 서열을 포함하고 VLB1 및/또는 VLB2는 서열 번호: 54에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열 또는 서열 번호: 54의 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB1 및/또는 VHB2는 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB1 및/또는 VLB2는 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB1 및/또는 VHB2는 서열 번호: 24에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열 또는 서열 번호: 24의 서열을 포함하고 VLB1 및/또는 VLB2는 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열 또는 서열 번호: 48의 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB1 및/또는 VHB2는 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB1 및/또는 VLB2는 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB1 및/또는 VHB2는 서열 번호: 33에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열 또는 서열 번호: 33의 서열을 포함하고 VLB1 및/또는 VLB2는 서열 번호: 25에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열 또는 서열 번호: 25의 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, VHB1 및/또는 VHB2는 다음 HVR들을 포함하고: (a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; VLB1 및/또는 VLB2는 다음 HVR들을 포함한다: (d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구체예들에서, VHB1 및/또는 VHB2는 서열 번호: 33에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열 또는 서열 번호: 33의 서열을 포함하고 VLB1 및/또는 VLB2는 서열 번호: 31에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열 또는 서열 번호: 31의 서열을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 1가 아암 및 2가 아암을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자를 특징으로 하며, 여기서: (a) 1가 아암은 FabA 의 C-말단이 제 1 Fc 소단위의 N-말단에 융합된 FabA를 포함하고, 그리고 FabA 는 다음 HVR들을 포함하며: (i) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (b) 2가 아암은 FabB2의 C-말단이 FabB1의 N-말단에 융합되고, FabB1의 C-말단이 제 2 Fc 소단위의 N-말단에 융합된 FabB1 및 FabB2를 포함하고, 여기서 FabB1 및 FabB2 각각은 다음 HVR들을 포함하며: (i) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및 (c) 제 1 Fc 소단위는 제 2 Fc 소단위와 결합하여 Fc 도메인을 형성한다. 일부 구체예들에서, (a) FabA는 VHA 영역 및 VLA 영역을 포함하고, 여기서 VHA 영역은 서열 번호: 7에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, VLA 영역은 서열 번호: 8에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; (b) FabB1은 VHB1 영역 및 VLB1 영역을 포함하고, VHB1 영역은 서열 번호: 17에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, VLB1 영역은 서열 번호: 18에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 (c) FabB2는 VHB2 영역 및 VLB2 영역을 포함하고, 여기서 VHB2 영역은 서열 번호: 17에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 18에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, (a) VHA 영역은 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하고, VLA 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하고; (b) VHB1 영역은 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하고 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 (c) VHB2 영역은 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하고, VLB2 영역은 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 1가 아암 및 2가 아암을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자를 제공하며, 여기서: (a) 1가 아암은 FabA 의 C-말단이 제 1 Fc 소단위의 N-말단에 융합된 FabA를 포함하고, 그리고 FabA 는 다음 HVR들을 포함하며: (i) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (b) 2가 아암은 FabB2의 C-말단이 FabB1의 N-말단에 융합되고, FabB1의 C-말단이 제 2 Fc 소단위의 N-말단에 융합된 FabB1 및 FabB2를 포함하고, 여기서 FabB1 및 FabB2 각각은 다음 HVR들을 포함하며: (i) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및 (c) 제 1 Fc 소단위는 제 2 Fc 소단위와 결합하여 Fc 도메인을 형성한다. 일부 구체예들에서, (a) FabA는 VHA 영역 및 VLA 영역을 포함하고, 여기서 VHA 영역은 서열 번호: 7에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, VLA 영역은 서열 번호: 8에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; (b) FabB1은 VHB1 영역 및 VLB1 영역을 포함하고, VHB1 영역은 서열 번호: 24에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, VLB1 영역은 서열 번호: 27에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 (c) FabB2는 VHB2 영역 및 VLB2 영역을 포함하고, 여기서 VHB2 영역은 서열 번호: 24에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 27에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, (a) VHA 영역은 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하고, VLA 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하고; (b) VHB1 영역은 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하고 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 (c) VHB2 영역은 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하고, VLB2 영역은 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함한다.
또한 또 다른 양상에서, 본 발명은 1가 아암 및 2가 아암을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자를 특징으로 하며, 여기서: (a) 1가 아암은 FabA 의 C-말단이 제 1 Fc 소단위의 N-말단에 융합된 FabA를 포함하고, 그리고 FabA 는 다음 HVR들을 포함하며: (i) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (b) 2가 아암은 FabB2의 C-말단이 FabB1의 N-말단에 융합되고, FabB1의 C-말단이 제 2 Fc 소단위의 N-말단에 융합된 FabB1 및 FabB2를 포함하고, 여기서 FabB1 및 FabB2 각각은 다음 HVR들을 포함하며: (i) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및 (c) 제 1 Fc 소단위는 제 2 Fc 소단위와 결합하여 Fc 도메인을 형성한다. 일부 구체예들에서, (a) FabA는 VHA 영역 및 VLA 영역을 포함하고, 여기서 VHA 영역은 서열 번호: 7에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, VLA 영역은 서열 번호: 8에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; (b) FabB1은 VHB1 영역 및 VLB1 영역을 포함하고, VHB1 영역은 서열 번호: 33에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, VLB1 영역은 서열 번호: 25에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 (c) FabB2는 VHB2 영역 및 VLB2 영역을 포함하고, 여기서 VHB2 영역은 서열 번호: 33에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 25에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, (a) VHA 영역은 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하고, VLA 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하고; (b) VHB1 영역은 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하고 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 (c) VHB2 영역은 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하고, VLB2 영역은 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함한다.
또한 또 다른 양상에서, 본 발명은 1가 아암 및 2가 아암을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자를 특징으로 하며, 여기서: (a) 1가 아암은 FabA 의 C-말단이 제 1 Fc 소단위의 N-말단에 융합된 FabA를 포함하고, 그리고 FabA 는 다음 HVR들을 포함하며: (i) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (b) 2가 아암은 FabB2의 C-말단이 FabB1의 N-말단에 융합되고, FabB1의 C-말단이 제 2 Fc 소단위의 N-말단에 융합된 FabB1 및 FabB2를 포함하고, 여기서 FabB1 및 FabB2 각각은 다음 HVR들을 포함하며: (i) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및 (c) 제 1 Fc 소단위는 제 2 Fc 소단위와 결합하여 Fc 도메인을 형성한다. 일부 구체예들에서, (a) FabA는 VHA 영역 및 VLA 영역을 포함하고, 여기서 VHA 영역은 서열 번호: 7에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, VLA 영역은 서열 번호: 8에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; (b) FabB1은 VHB1 영역 및 VLB1 영역을 포함하고, VHB1 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, VLB1 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 (c) FabB2는 VHB2 영역 및 VLB2 영역을 포함하고, 여기서 VHB2 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, (a) VHA 영역은 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하고, VLA 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하고; (b) VHB1 영역은 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하고 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 (c) VHB2 영역은 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하고, VLB2 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함한다.
또한 또 다른 양상에서, 본 발명은 1가 아암 및 2가 아암을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자를 특징으로 하며, 여기서: (a) 1가 아암은 FabA 의 C-말단이 제 1 Fc 소단위의 N-말단에 융합된 FabA를 포함하고, 그리고 FabA 는 다음 HVR들을 포함하며: (i) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (b) 2가 아암은 FabB2의 C-말단이 FabB1의 N-말단에 융합되고, FabB1의 C-말단이 제 2 Fc 소단위의 N-말단에 융합된 FabB1 및 FabB2를 포함하고, 여기서 FabB1 및 FabB2 각각은 다음 HVR들을 포함하며: (i) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및 (c) 제 1 Fc 소단위는 제 2 Fc 소단위와 결합하여 Fc 도메인을 형성한다. 일부 구체예들에서, (a) FabA는 VHA 영역 및 VLA 영역을 포함하고, 여기서 VHA 영역은 서열 번호: 7에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, VLA 영역은 서열 번호: 8에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; (b) FabB1은 VHB1 영역 및 VLB1 영역을 포함하고, VHB1 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, VLB1 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 (c) FabB2는 VHB2 영역 및 VLB2 영역을 포함하고, 여기서 VHB2 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, (a) VHA 영역은 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하고, VLA 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하고; (b) VHB1 영역은 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하고 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 (c) VHB2 영역은 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하고, VLB2 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-CD3/HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예컨대, 항-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB, 예컨대, 40G5c CD3 결합 도메인 및 2개의 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V HER2 결합 도메인을 가지는 항-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB)이다.
또한 또 다른 양상에서, 본 발명은 1가 아암 및 2가 아암을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자를 제공하며, 여기서: (a) 1가 아암은 FabA 의 C-말단이 제 1 Fc 소단위의 N-말단에 융합된 FabA를 포함하고, 그리고 FabA 는 다음 HVR들을 포함하며: (i) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (b) 2가 아암은 FabB2의 C-말단이 FabB1의 N-말단에 융합되고, FabB1의 C-말단이 제 2 Fc 소단위의 N-말단에 융합된 FabB1 및 FabB2를 포함하고, 여기서 FabB1 및 FabB2 각각은 다음 HVR들을 포함하며: (i) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및 (c) 제 1 Fc 소단위는 제 2 Fc 소단위와 결합하여 Fc 도메인을 형성한다. 일부 구체예들에서, (a) FabA는 VHA 영역 및 VLA 영역을 포함하고, 여기서 VHA 영역은 서열 번호: 7에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, VLA 영역은 서열 번호: 8에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; (b) FabB1은 VHB1 영역 및 VLB1 영역을 포함하고, VHB1 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, VLB1 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 (c) FabB2는 VHB2 영역 및 VLB2 영역을 포함하고, 여기서 VHB2 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, (a) VHA 영역은 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하고, VLA 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하고; (b) VHB1 영역은 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하고 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 (c) VHB2 영역은 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하고, VLB2 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-CD3/HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예컨대, 항-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB, 예컨대, 40G5c CD3 결합 도메인 및 2개의 4D5 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T HER2 결합 도메인을 가지는 항-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB)이다.
또한 또 다른 양상에서, 본 발명은 1가 아암 및 2가 아암을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자를 특징으로 하며, 여기서: (a) 1가 아암은 FabA 의 C-말단이 제 1 Fc 소단위의 N-말단에 융합된 FabA를 포함하고, 그리고 FabA 는 다음 HVR들을 포함하며: (i) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (b) 2가 아암은 FabB2의 C-말단이 FabB1의 N-말단에 융합되고, FabB1의 C-말단이 제 2 Fc 소단위의 N-말단에 융합된 FabB1 및 FabB2를 포함하고, 여기서 FabB1 및 FabB2 각각은 다음 HVR들을 포함하며: (i) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (iii) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (iv) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (v) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (vi) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및 (c) 제 1 Fc 소단위는 제 2 Fc 소단위와 결합하여 Fc 도메인을 형성한다. 일부 구체예들에서, (a) FabA는 VHA 영역 및 VLA 영역을 포함하고, 여기서 VHA 영역은 서열 번호: 7에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, VLA 영역은 서열 번호: 8에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; (b) FabB1은 VHB1 영역 및 VLB1 영역을 포함하고, VHB1 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, VLB1 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 (c) FabB2는 VHB2 영역 및 VLB2 영역을 포함하고, 여기서 VHB2 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, (a) VHA 영역은 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하고, VLA 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하고; (b) VHB1 영역은 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하고 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 (c) VHB2 영역은 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하고, VLB2 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 항-CD3/HER2 이중특이적 항원-결합 분자 (예컨대, 항-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB, 예컨대, 40G5c CD3 결합 도메인 및 2개의 4D5 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V HER2 결합 도메인을 가지는 항-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB)이다.
제 2 및 제 3 항원-결합 모이어티를 융합시키는 펩티드 연결기
일부 구체예들에서, 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자는, 제 3 항원-결합 모이어티의 C-말단이 펩티드 연결기에 의해 제 2 항원-결합 모이어티의 N-말단에 융합되는 구조를 특징으로 한다. 펩티드 연결기는 5-20 아미노산 길이 (예를 들어, 5-10, 10-15 또는 15-20, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 아미노산 길이)이다. 일부 구체예들에서, 펩티드 연결기는 가변 중쇄 힌지 영역의 자연 아미노산 서열 (예를 들어, DKTHT; 서열 번호: 50)이다. 대안적으로, 일부 구체예들에서, 펩티드 연결기는 G4SG2 연결기 (서열 번호: 51)를 포함한다. 일부 구체예들에서, 펩티드 연결기는 G4SG2 연결기 및 힌지 영역 (예컨대, 서열 번호: 52)을 포함한다.
G4SG2 연결기가 있거나 없는 제 2 및 제 3 항원-결합 모이어티 중쇄를 포함하는 예시적인 중쇄 폴리펩티드의 아미노산 서열은 표 2에 제공된다.
표 2. G4SG2 연결기를 포함하거나 포함하지 않는 예시적인 1Fab-IgG TDB 분자의 Fc 도메인, 제 2 항원-결합 모이어티 중쇄 영역 및 제 3 항원-결합 모이어티 중쇄 영역을 포함하는 폴리펩티드에 상응하는 서열 번호. 하기에 나타낸 서열은 제 2 및 제 3 항원-결합 모이어티 중쇄를 융합시키는 연결기 펩티드의 일부로서 힌지 서열을 포함한다.
특히, 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자는 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 연결기를 특징으로 할 수 있다. 일부 구체예들에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 55에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 55에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 55에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 55에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 55에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 55에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 예들에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 59에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 59에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 59에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 59에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 59에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 59에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 대안적으로, 항원-결합 분자는 서열 번호: 63에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 63에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 63에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 63에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 63에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 63에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 83에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 83에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 83에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 83에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 83에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 83에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 예들에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 85에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 85에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 85에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 85에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 85에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 85에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 87에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 87에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 87에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 87에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 87에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 87에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 89에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 89에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 89에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 89에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 89에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 89에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
다른 예들에서, 펩티드 연결기는 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함한다. 항원-결합 분자는 서열 번호: 56에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 56에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 56에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 56에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 56에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 56에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 60에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 60에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 60에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 60에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 60에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 60에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 64에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 64에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 64에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 64에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 64에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 64에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 84에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 84에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 84에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 84에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 84에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 84에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 86에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 86에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 86에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 86에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 86에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 86에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 88에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 88에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 88에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 88에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 88에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 88에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 90에 95% 이상 서열 동일성 (예컨대, 서열 번호: 90에 96% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 90에 97% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 90에 98% 이상 서열 동일성, 서열 번호: 90에 99% 이상 서열 동일성, 또는 서열 번호: 90에 100% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
Fc 도메인
본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자는 Fc 도메인을 특징으로 할 수 있다. Fc 도메인은 IgG Fc 도메인 (예를 들어, IgG1 또는 IgG4 Fc 도메인) 일 수있다. 예를 들어, Fc 도메인은 인간 Fc 도메인 일 수 있다. 일부 구체예들에서, Fc 도메인은 Fc 수용체 및/또는 효과기 기능에 대한 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, Fc 수용체 및/또는 효과기 기능에 대한 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환은 L234, L235, 및 P329의 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치에 존재한다 (예컨대, 여기서 제 1 Fc 소단위 및 제 2 Fc 소단위 각각은 L234A, L235A 및 P329G의 아미노산 치환을 포함한다). Fc 수용체는, 예를 들어, Fcγ수용체 일 수 있다. 따라서, 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자는 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 감소시키도록 구성 될 수 있다.
일부 예들에서, Fc 도메인은 제 1 Fc 소단위와 제 2 Fc 소단위의 결합을 촉진시키도록 구성된 변형을 포함한다. 이중특이적 항체의 “놉-인-홀 (Knob-in-hole)” 조작을 이용하여 놉을 함유하는 제 1 아암 및 제 1 아암의 놉이 내부에 결합할 수 있는 홀을 함유하는 제 2 아암을 생성할 수 있다. 본 발명의 다중특이적 항체의 놉은 한 구체예에서 1가 아암 (예를 들어, 항-CD3 아암) 일 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 다중특이적 항체의 놉은 2가 아암 (예를 들어, 항-종양 아암) 일 수 있다. 본 발명의 다중특이적 항체의 홀은 한 구체예에서 1가 아암 (예를 들어, 항-CD3 아암) 일 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 다중특이적 항체의 홀은 2가 아암 (예를 들어, 항-종양 아암) 일 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 면역글로불린 크로스오버 (Fab 도메인 교환 또는 CrossMab 포맷으로도 알려져 있음) 기술을 사용하여 조작 될 수 있다 (예를 들어, WO 2009/080253; Schaefer 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108: 11187-11192 (2011) 참고). 이중특이적 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위하여 정전기 조향 효과를 조작함으로써 (WO 2009/089004A1); 둘 이상의 항체 또는 단편을 가교시킴으로써 (예를 들어, 미국 특허 제 4,676,980 및 Brennan 외,Science, 229: 81 (1985) 참조); 또는 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체를 생산 (예를 들어, Kostelny 외, J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992) 참조)함으로써 제조될 수도 있다.
제 2 Fc 소단위의 CH3 도메인 내 아미노산 잔기가 보다 큰 측쇄 부피를 가지는 아미노산 잔기로 대체되어 제 2 Fc 소단위의 CH3 도메인 내부에 돌기 (예컨대, 놉)를 생성할 수 있고, 이는 제 1 Fc 소단위의 CH3 도메인 내부 공동 (예컨대, 홀)에 위치가능하며, 제 1 Fc 소단위의 CH3 도메인 내 아미노산 잔기는 보다 작은 측쇄 부피를 가지는 아미노산 잔기로 대체되어, 제 1 Fc 소단위의 CH3 도메인 내부에 공동 (예컨대, 홀)을 생성할 수 있고, 이 공동 내부에 제 2 Fc 소단위의 CH3 도메인 내부의 돌기 (예컨대, 놉)가 이 공동 내부에 위치가능하다. 일부 구체예들에서, 제 2 Fc 소단위의 CH3 도메인은 T366의 아미노산 치환을 포함하고, 제 1 Fc 소단위의 CH3 도메인은 T366, L368, 및/또는 Y407 중 1, 2, 또는 3개 모두에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예들에서, 제 2 Fc 소단위의 CH3 도메인은 T366W의 아미노산 치환을 포함하고, 제 1 Fc 소단위의 CH3 도메인은 T366S, L368A, 및/또는 Y407V 중 1, 2, 또는 3개 모두의 아미노산 치환을 포함한다.
본원에 열거된 임의의 예들에서 사용하기 위한 이러한 이중특이적 항원-결합 분자 또는 본원에 기재된 다른 항체는 하기 섹션 1-6에 기재된 임의의 특징들을, 단독으로 또는 조합하여 가질 수 있음이 명백히 간주된다.
1.
항체 친화도
특정 예들에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예컨대, 10-8 M 또는 그 미만, 예컨대, 10-8 M 내지 10-13 M, 예컨대, 10-9 M 내지 10-13 M)의 평형 해리 상수 (KD)를 가진다.
한 예에서, KD는 방사표지된 항원 결합 검정(RIA)에 의해 측정된다. 한 예에서, RIA는 관심 항체의 Fab 형태 및 이의 항원을 이용하여 수행된다. 예를 들면, 항원에 대한 Fabs의 용액 결합 친화도는 일련의 역가들의 비표지 항원의 존재하에서 최소 농도의 (125I)-표지된 항원으로 Fab를 평형화시킨 다음, 항-Fab 항체-피복된 플레이트와 결합된 항원을 포집함으로써 측정된다 (예컨대, Chen 외, J. Mol. Biol. 293:865-881(1999) 참고). 검정에 대한 조건을 확립하기 위해, MICROTITER®멀티웰 플레이트(Thermo Scientific)를 50 mM 탄산나트륨(pH 9.6) 중에서의 μg/ml의 포획 항-Fab 항체(Cappel Labs)로 밤새 코팅하고, 후속하여 실온 (약 23℃에서 2시간 내지 5시간 동안 PBS 중의 2%(w/v) 소 혈청 알부민으로 차단하였다. 비-흡착성 플레이트 (Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원은 관심 Fab의 연속 희석물과 혼합된다 (예로써, Presta 외, Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)에서의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치). 관심 Fab는 그 다음 하룻밤 동안 배양되고; 그러나, 평형에 확실하게 이를 수 있도록 더 오랜 기간(예로써, 약 65 시간) 동안 배양이 지속될 수 있다. 그 이후, 상기 혼합물은 실온 배양 (예로써, 1 시간 동안)을 위하여 포획 플레이트로 이전된다. 이후, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중의 0.1% 폴리소르베이트 20(TWEEN-20®으로 8회 세척한다. 플레이트가 건조되어 있을 경우, 150 μl/웰의 발광제 (scintillant; MICROSCINT-20™Packard)를 첨가하고, 플레이트를 10분간 TOPCOUNT™감마 카운터 (Packard) 상에서 계수하였다. 경쟁적 결합 분석에 사용하기 위하여 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각 Fab 농도가 선택된다.
또 다른 경우에 따르면, KD는 BIACORE®표면 플라스몬 공명 검정을 사용하여 측정된다. 예를 들면, BIACORE®또는 BIACORE®(BIACORE®을 사용한 검정은 25℃에서 고정화된 항원 CM5 칩으로 ~10 반응 단위(RU)로 수행한다. 한 예에서, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIACORE®Inc.)은 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화된다. 항원은 pH 4.8, 10 mM 아세트산 나트륨으로 5 μg/ml (~0.2 μM)까지 희석된 후, 5 μl/분의 유속으로 주사되어 약 10 반응 단위 (RU)의 커플링된 단백질에 도달한다. 항원 주사 후, 1 M 에탄올아민을 주사하여 비-반응 그룹을 차단한다. 동역학 측정을 위하여, Fab의 2-배 연속 희석물 (0.78 nM 내지 500 nM)은 25°C에서, 약 25 μl/분의 유속으로 0.05% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20TM) 계면활성제가 있는 PBS (PBST)에서 주사된다. 결합과 해리 센서그램을 동시에 피팅함으로써, 단순 일대일 Langmuir 결합 모델 (BIACORE®Evaluation Software 버전 3.2)을 이용하여 결합 속도 (kon)와 해리 속도 (koff)가 산출된다. 평형 해리 상수 (KD)는 비율 koff/kon로 산출된다. 예를 들면, Chen 외, J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999) 참고. 상기 표면 플라스몬 공명 분석에 의한 결합 속도(on-rate)가 106 M-1s-1를 초과한다면, 그 다음 분광계, 이를 테면 정지-유동(stop-flow) 장착된 분광광도계 (Aviv Instruments) 또는 교반 큐벳(stirred cuvette)이 있는 8000-일련의 SLM-AMINCO TM 분광광도계(ThermoSpectronic)에서 측정되었을 때, 항원 농도를 증가시킨 상태하에서, pH 7.2의 PBS에서의 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25°C 형광 방출 강도 (여기(excitation)= 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드-대역)을 측정하는 형광 ??칭 기술을 이용하여 결합이 결정될 수 있다.
2.
항체 단편
특정 예에서, 본원에 제공된 이중특이적 항원-결합 분자는 하나 이상의 항체 단편을 포함한다. 항체 단편들은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, 및 scFv 단편들, 그리고 하기에서 설명된 다른 단편들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 항체 단편들에 대한 검토는 Hudson 외, Nat. Med. 9:129-134 (2003)을 참고한다. scFv 단편들의 검토는 예로써, Pluckth
n, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); WO 93/16185; 그리고 미국 특허 제 5,571,894 및 5,587,458을 또한 참고한다. 구난(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고, 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 단편들의 논의는 미국 특허 제 5,869,046을 참고한다.
다이아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 가진 항체 단편들이다. 예를 들면, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson 외, Nat. Med. 9:129-134 (2003); 그리고 Hollinger 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)을 참고하라. 트리아바디(Triabodies) 및 테트라바디(tetrabodies)는 또한 Hudson 외. Nat. Med. 9:129-134 (2003)에 설명되어 있다.
단일-도메인 항체는 이 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부분 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부분이 포함된 항체 단편들이다. 특정 예들에 있어서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체다 (Domantis, Inc., Waltham, MA; 예로써, 미국 특허 제 6,248,516 B1).
항체 단편은 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 이에는 손상되지 않은 항체의 단백질분해 절단뿐만 아니라, 본 명세서에서 기재된 바와 같이, 재조합 숙주 세포(가령, 대장균 (E. coli) 또는 파지)에 의해 생산된 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
3.
키메라 및 인간화 항체
특정 예들에서, 본 발명에서 제공되는 이중특이적 항원-결합 분자는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는 예로써, 미국 특허 제 4,816,567; 그리고 Morrison 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))에서 설명된다. 일 예에서, 키메라 항체는 비인간 가변 영역(예를 들어, 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼 또는 비인간 영장류, 예컨대, 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 한 추가 예에서, 키메라 항체는 클래스 또는 서브클래스가 부모 항체의 클래스로부터 변화되어 있는 “클래스 전환된” 항체이다. 키메라 항체는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 예들에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 인간화되어 인간에 대한 면역원성이 감소되지만, 모체 비-인간 항체의 특이성 및 친화도는 유지된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 하나 또는 그 이상의 가변적 도메인을 포함하는데, HVR들, 예로써, CDRs, (또는 이의 부분들)는 비-인간 항체로부터 유도되고, FRs (또는 이의 부분들)은 인간 항체 서열로부터 유도된다. 인간화된 항체는 임의선택적으로 인간 불변 영역의 최소한 일부분을 또한 포함할 것이다. 일부 예들에 있어서, 인간화된 항체에서 일부 FR 잔기는 비-인간 항체 (예로써, HVR 잔기가 유도된 항체)의 대응 잔기로 대체되어, 예로써, 항체 특이성 또는 친화도가 복원 또는 개선된다.
인간화된 항체 및 이를 만드는 방법들은 예로써, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)에서 볼 수 있고, 그리고 예로써, Riechmann 외, Nature 332:323-329 (1988); Queen 외, Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); 미국 특허 제 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; Kashmiri 외, Methods 36:25-34 (2005) (특이성 결정 영역 (SDR) 접목을 설명); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (“재표면화(resurfacing)”을 설명); Dall'Acqua 외, Methods 36:43-60 (2005) (“FR 셔플링(shuffling)”을 설명); 그리고 Osbourn 외, Methods36:61-68 (2005) 및 Klimka 외, Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (FR 셔플링에 대한 “유도된 선별” 방법 설명)에서 추가 설명된다.
인간화에 이용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 다음을 포함하나, 이에 국한되지 않는다: “베스트-피트(best-fit)” 방법을 이용하여 선별된 프레임워크 영역 (예로써, Sims 외, J. Immunol. 151:2296 (1993) 참고); 경쇄 또는 중쇄 가변적 영역의 특정 하위 집단의 인간항체의 콘센수스 서열로부터 유도된 프레임워크영역 (예로써, Carter 외, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 그리고 Presta 외, J. Immunol., 151:2623 (1993) 참고); 인간 성숙 (체세포 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식계열 프레임워크 영역 (예로써, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) 참고); 그리고 FR 라이브러리 스크리닝으로부터 유도된 프레임워크 영역(예로써, Baca 외, J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok 외, J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996) 참고).
4.
인간 항체
특정 예들에서, 본 발명에서 제공되는 이중특이적 항원-결합 분자는 인간 항체이다. 인간 항체는 해당 분야에 공지된 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 인간 항체는 전반적으로 van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)에서 설명된다.
항원 시험감염(challenge)에 반응하여, 무손상 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 가진 무손상 항체를 만들기 위하여 변형된 유전자삽입 동물에 면역원을 주사함으로써, 인간 항체를 만들 수 있다. 이러한 동물은 통상적으로, 내인성 면역글로불린 유전자 좌위를 대체하거나, 염색체외 존재하거나 무작위로 동물의 염색체에 통합된, 인간 면역글로불린 유전자 좌위의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 유전자삽입 마우스에서 상기 내생적 면역글로불린 좌위는 일반적으로 비활성화 되어있다. 유전자삽입 동물로부터 인간 항체를 획득하는 방법은 Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)을 참고하라. 또한, 예로써, 미국 특허 제 6,075,181 및 6,150,584에서는 XENOMOUSETM 기술을 설명하고; 미국 특허 제 5,770,429에서는 HUMAB® 기술을 설명하고; 미국 특허 제 7,041,870에서는 K-M MOUSE®기술을 설명하고, 그리고 미국 공개특허출원 US 2007/0061900에서는 VELOCIMOUSE® 기술을 설명한다). 그러한 동물에 의해 생성된 손상되지 않은 항체로부터 얻은 인간 가변 영역은 예를 들어 상이한 인간 불변 영역과 결합시킴으로써 추가로 변형 될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법들에 의해 만들어질 수 있다. 인간 단클론 항체를 만들기 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 설명된 바 있다. (예컨대, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur 외, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner 외, J. Immunol., 147: 86 (1991)참고) 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통하여 생성된 인간 항체가 Li 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)에서 설명된다. 추가 방법들은 예를 들면, 미국 특허 제 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터 단클론 인간 IgM 항체의 생산을 설명) 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (인간-인간 하이브리도마를 설명)에서 설명된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (Trioma technology)은 Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)에서 또한 설명된다.
인간 항체는 또한 인간-유도된 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선별된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 분리시킴으로써 생성될 수 있다. 이러한 가변 도메인 서열은 그 다음 원하는 인간 불변 도메인에 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선별하기 위한 기술은 하기에서 설명된다.
5.
라이브러리-유도된 항체들
본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자들은 바람직한 활성 또는 활성들을 가진 항체에 대한 복합 라이브러리를 스크리닝함으로써 분리될 수 있다. 예를 들면, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 바람직한 결합 특징들을 보유하는 항체에 대하여 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법들이 해당 분야에 공지되어 있다. 이러한 방법들은 예로써, Hoogenboom 외, in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien 외, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)에서 설명되며, 그리고 예로써, McCafferty 외, Nature 348:552-554; Clackson 외, Nature 352: 624-628 (1991); Marks 외, J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu 외, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee 외, J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 그리고 Lee 외, J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)에서 추가 설명된다.
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레파토리는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 별도로 클론되고, 그 다음 파지 라이브러리에 무작위로 재조합된 다음, Winter 외, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)에서 설명된 바와 같이, 항원-결합 파지에 대하여 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 단일-쇄 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편의 항체 단편을 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 제작할 필요없이 면역원에 대한 높은-친화도 항체를 제공한다. 대안으로, Griffiths 외, EMBO J, 12: 725-734 (1993)에서 설명된 바와 같이 전혀 면역화되지 않은 광범위한 비-자기 및 자기 항원에 대한 항체의 단일 출처를 제공하기 위해 (가령, 인간으로부터) 나이브(naive) 레퍼토리가 클론될 수 있다. 끝으로, 순수 라이브러리는 줄기 세포로부터 재배치되지 않은 V- 유전자 단편을 클로닝하고, 고도로 가변적인 CDR3 영역을 인코딩하고, 시험 관내에서 재배열을 수행하기 위하여 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여, 합성에 의해 만들어 질 수 있다(Hoogenboom and Winter J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)). 인간 항체 파지 라이브러리를 설명하는 특허 간행물은 예를 들면: 미국 특허 제 5,750,373, 및 미국 공개특허 출원 제 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, 및 2009/0002360를 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 분리된 항체들 또는 항체 단편들은 본 명세서의 인간 항체 또는 인간 항체 단편들로 간주된다.
6. 항원-결합 분자 변이체
특정 예들에서, 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자들의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들면, 항체의 상기 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 성질들을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체들은 상기 항체를 인코드하는 뉴클레오티드 서열 내부에 적절한 변형을 도입시킴으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 만들어질 수 있다. 이러한 변형은 예를 들면, 상기 항체의 아미노산 서열로부터의 잔기 결실, 및/또는 이들 아미노산 서열 내부로의 잔기 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 만일 최종 구조체가 바람직한 특징, 예를 들어, 항원-결합을 보유한다면, 최종 구조체에 도달하기 위한 임의의 결실, 삽입, 및 치환의 조합이 이루어질 수 있다.
특정 구체예들에서, 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자는 정확한 중쇄/경쇄 페어링을 용이하게 하기 위하여 VH/VL 영역 및/또는 CH1/CL 영역에 하나 이상의 변형들을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자는 이중특이적 항원-결합 분자의 두 아암의 이종이량체화를 촉진하기 위해 Fc 영역에서 하나 이상의 변형을 포함한다. VH/VL 영역, CH1/CL 영역 및/또는 FC 영역에서의 이러한 변형은 국제 특허공개 번호 WO 2016/172485에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
A.치환, 삽입, 및 결실 변이체
특정 경우에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항원-결합 모이어티 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위에는 HVR들 및 FRs가 포함된다. 보존적 치환들을 표 3에서 “바람직한 치환”이라는 제목으로 나타낸다. 더 많은 실질적인 변화가 표 3의 “예시적 치환"이라는 제목하에 제시되며, 이는 아미노산 측쇄 클래스를 참고하여 이하에서 추가로 설명된다. 아미노산 치환들은 바람직한 활성, 예를 들면, 유지된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)에 대하여 스크린된 관심 항체 및 생성물 안으로 도입될 수 있다.
표 3. 예시적 및 바람직한 아미노산 치환
아미노산은 다음과 같이 공통적인 측쇄 성질들에 따라 그룹화될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro; 또는
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존성 치환들은 이들 클래스 중 하나의 구성원을 또 다른 클래스로 교환하게 할 것이다.
치환성 변이체의 한 가지 유형은 부모 항체의 하나 또는 그 이상의 초가변적 영역 잔기의 치환 (예컨대, 인간화된 또는 인간 항체)과 관련된다. 일반적으로, 추가 연구를 위하여 선별된 생성된 변이체(들)은 부모 항체와 비교하였을 때, 특정 생물학적 성질들의 변형(예컨대, 개선), (예컨대, 증가된 친화도 및/또는 감소된 면역원성)을 가지거나 및/또는 부모 항체의 특정 생물학적 성질들을 실질적으로 보유할 것이다. 예시적인 치환성 변이체는 친화성 성숙 항체이며, 이는 편의상 예컨대, 파지 디스플레이-기반의 친화성 성숙 기술, 가령, 본 명세서에 기재된 것들을 이용하여 생성될 수 있다. 간략하게 설명하자면, 하나 또는 그 이상의 HVR 잔기는 돌연변이되며, 변이체 항체는 파지 상에서 디스플레이되며, 그리고 특정 생물학적 활성 (예컨대, 결합 친화도)에 대하여 스크리닝된다.
변경 (예컨대, 치환들)은 예컨대, 항체 친화도를 개선하기 위해 HVR들에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR에서 "핫스팟(hotspot)", 즉, 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이 되는 코돈에 의해 인코드되는 잔기 (즉, Chowdhury Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), 및/또는 항원을 접촉하는 잔기들에서 생성될 수 있고, 생성된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화도에 대하여 시험된다. 제 2 라이브러리를 구축하고, 재선별함에 의한 친화도 성숙은 예컨대, Hoogenboom 외. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien 외, ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))에서 설명되어 있다. 친화도 성숙의 일부 예들에 있어서, 다양성은 다양한 방법들 중 임의의 방법에 의해 성숙을 위해 선택된 가변 유전자들에 도입된다(예컨대, 오류-발생(error-prone) PCR, 사슬 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이생성). 이어서 제 2 라이브러리가 생성된다. 이어서, 이 라이브러리를 스크리닝하여, 원하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 동정한다. 다양성을 도입하는 또다른 방법은 HVR-지시된 접근법을 포함하는데, 이때 몇개 HVR 잔기 (가령, 한번에 4-6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관여하는 HVR 잔기는 예컨대, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 이용하여 특이적으로 동정될 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3이 특히 종종 표적이 된다.
특정 예들에 있어서, 치환, 삽입, 또는 결손은 이러한 변경으로 이 항체가 항원에 결합하는 능력이 실질적으로 감소되지 않는 한, 하나 또는 그 이상의 HVR들에 발생될 수 있다. 예를 들면, 결합 친화력을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예컨대, 본 명세서에서 제공된 보존적 치환)이 HVR들에 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 예를 들어, HVR의 항원-접촉 잔기의 외부에 있을 수 있다. 상기에서 제시된 변이체 VH 및 VL의 특정 예들에 있어서, 각 HVR은 변경되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이상의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이유발의 표적이 될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역을 식별하기 위한 유용한 방법은 Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085에서 설명된 바와 같은 “알라닌 스캐닝 돌연변이유발”이라고 불린다. 이 방법에서, 표적 잔기 또는 표적 잔기들의 그룹 (예컨대, 하전된 잔기, 가령 Arg, Asp, His, Lys, 및 Glu)이 식별되고, 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예컨대, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어, 항원과 항체의 상호작용이 영향을 받았는지를 판단한다. 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 나타내는 상기 아미노산 위치에 추가 치환이 도입될 수 있다. 대안으로, 또는 추가로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 이용하여 항체와 항원 간의 접촉점을 동정한다. 이러한 접촉 잔기와 이웃 잔기는 치환의 후보로서 표적되거나, 또는 제거될 수 있다. 변이체들이 원하는 성질을 보유하는지를 판단하기 위하여 이 변이체들이 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 한 개 잔기에서 수백 또는 그 이상의 잔기가 함유된 폴리펩티드 범위, 뿐만 아니라 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입이 포함된 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 상기 항체 분자의 다른 삽입 변이체들은 효소 (예컨대, ADEPT의 경우)에 항체의 N- 또는 C-말단의 융합 또는 상기 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 항체의 N- 또는 C-말단의 융합을 포함한다.
B.당화 변이체
특정 예에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 항체가 당화되는 정도를 증가 또는 감소시키도록 변경 될 수 있다. 본 발명의 항체의 당화 부위의 추가 또는 결실은 하나 또는 그 이상의 당화 부위가 만들어지거나 또는 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편의상 실행될 수 있다.
항원-결합 분자가 Fc 영역을 포함할 때, 이것에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 포유류 세포들에 의해 만들어지는 고유 항체는 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-링키지에 의해 일반적으로 부착된 분지화된, 이촉각성(biantennary) 올리고사카라이드를 전형적으로 포함한다. 예컨대, Wright 외 TIBTECH 15:26-32 (1997) 참고. 상기 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예로써, 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산, 뿐만 아니라 상기 이촉각성 올리고사카라이드 구조의 "줄기(stem)"에 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 예들에서, 특정한 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 본 발명의 항체의 올리고사카라이드의 변형이 이루어질 수 있다.
한 예에서, Fc 영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 부족한 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들면, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%가 될 수 있다. 푸코스의 양은 예를 들면, WO 2008/077546에서 설명된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광분석에 의해 측정하여, Asn 297에 부착된 모든 당구조 (예컨대, 복합체, 하이브리드 및 높은 만노스 구조)의 합에 대한, Asn297에서 당 사슬 내부의 평균 푸코스 양을 계산함으로써 결정된다. Asn297은 Fc 영역에서 대략 위치 297 (Fc 영역 잔기의 EU 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; Asn297은 항체에서 소수의 서열 변이로 인하여 위치 297의 상류 또는 하류의 약 ± 3의 아미노산, 가령, 위치 294와 300 사이에 또한 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화는 개선된 ADCC 기능을 보유할 수 있다. 예를 들면, 미국 공개특허 US 2003/0157108 및 US 2004/0093621 참고. “데푸코실화된(defucosylated)” 또는 “푸코스-결핍(fucose-deficient)” 항체 변이체에 관련된 간행물의 예에는 다음이 포함된다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki 외 J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki 외 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). 탈푸코실화된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예로는 단백질 푸코실화 결핍 Lec13 CHO 세포들 (Ripka 외, Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); 미국 특허출원 번호 2003/0157108 A1; 그리고 WO 2004/056312 A1, Adams 외, 특히 실시예 11), 그리고 녹아웃 세포주, 이를 테면 알파-1,6-퓨코실전이효소 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포들 (예로써, Yamane-Ohnuki 외, Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. 외, Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 그리고 WO2003/085107 참고)을 포함한다.
예컨대, 항체의 Fc 영역의 이촉각성 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 양분되어 있는, 양분된 올리고사카라이드를 가진 항원-결합 분자 변이체들이 추가로 제공된다. 이러한 항체 변이체는 푸코실화 감소 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 변이체들의 예들은 예로써, WO 2003/011878; 미국 특허 제 6,602,684; 그리고 US 2005/0123546에서 설명된다. Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드에서 최소한 한 개의 갈락토스 잔기를 가진 항체 변이체들이 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체들은 개선된 CDC 기능을 보유할 수 있다. 이러한 항체 변이체들은 예로써, WO 1997/30087; WO 1998/58964; 그리고 WO 1999/22764에서 설명된다.
C.
Fc 영역 변이체
특정 예들에 있어서, 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형이 본 발명의 항체의 Fc 영역 안으로 도입되고, 이로 인하여 Fc 영역 변이체가 만들어질 수 있다. 상기 Fc 영역 변이체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형(예컨대, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예컨대, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 모든 효과기 기능은 아니지만 일부 효과기 기능을 지니는 항체 변이체를 고려하며, 이는 생체내 항체 반감기가 중요하지만 특정 효과기 기능(예컨대 보체 및 ADCC)은 불필요하거나 해로운 용도에 대해 상기 항체 변이체를 바람직한 후보로 만든다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 분석을 실행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들면, Fc 수용체 (FcR) 결합 분석을 실행하여, 상기 항체는 Fcγ결합 (이로 인하여 ADCC 활성이 결여될 가능성이 있음)은 없지만, 여전히 FcRn 결합 능력은 유지하고 있다는 것을 확인할 수 있다. ADCC를 매개하는 일차 세포, NK 세포는 오직 Fcγ만을 발현시키고, 반면 단핵구는 FcγFcγ및 Fcγ를 발현시킨다. 조혈 세포들에서 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)의 페이지 464의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 비제한적 실시예는 미국 특허 제 5,500,362 (예컨대, Hellstrom, I. 외. Proc. Natl Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) 참고) 및 Hellstrom, I 외, Proc. Natl Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 미국 특허 제 5,821,337 (Bruggemann, M. 외, J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987) 참고)에 설명되어 있다. 대안으로, 비-방사능활성 분석 방법들이 이용될 수 있다 (예를 들면, 유동 세포측정을 위한 ACTI™비-방사능활성 세포독성 분석 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); 그리고 CYTOTOX 96® 비-방사능활성 세포독성 분석 (Promega, Madison, WI) 참고). 이러한 분석에 유용한 효과기 세포들은 말초 혈액 단핵 세포들 (PBMC) 및 자연 살해 (NK) 세포들을 포함한다. 대안으로, 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은, 예컨대, Clynes 외. Proc. Natl Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)에서 공개된 바와 같은 동물 모델에서 생체내에서 평가될 수 있다. 상기 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 이로 인하여 CDC 활성이 결여된다는 것을 확인하기 위하여 C1q 결합 분석이 또한 실행될 수 있다. 예로써, WO 2006/029879와 WO 2005/100402에서 C1q 및 C3c 결합 ELISA 참고. 보체 활성화를 평가하기 위하여, CDC 분석이 실행될 수 있다(예를 들면, Gazzano-Santoro 외, J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. 외, Blood. 101:1045-1052 (2003); 그리고 Cragg, 외, Blood. 103:2738-2743 (2004) 참고). 또한 FcRn 결합과 생체내 제거/반감기 결정은 해당 분야에 공지된 방법들을 이용하여 또한 실시될 수 있다 (예컨대, Petkova 외. Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006) 참고).
감소된 효과기 기능를 가진 항체들은 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 또는 그 이상의 치환을 가진 것들을 포함한다 (미국 특허 제 6,737,056 및 8,219,149). 이러한 Fc 돌연변이체들은 잔기 265 및 297의 잔기가 알라닌으로 치환된 소위 “DANA” Fc 돌연변이체를 포함하는, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327중 2개 또는 그 이상에서 치환을 가진 Fc 돌연변이체를 포함한다 (미국 특허 제 7,332,581 및 8,219,149).
FcRs에 대한 결합이 개선된 또는 감소된 특정 항체 변이체들이 설명된다. (가령, 미국 특허 제 6,737,056; WO 2004/056312, and Shields 외, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001). 참고)
특정 예들에 있어서, 항체 변이체는 ADCC를 개선시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환들, 예로써, Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334 (잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 가진 Fc 영역을 포함한다.
일부 예들에 있어서, Fc 영역 안에 예로써, 미국 특허 제 6,194,551, WO 99/51642, 및 Idusogie 외, J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)에서 설명된 바와 같이, 변경된 (가령, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 초래하는 변형이 만들어진다.
태아로 모계 IgGs의 전달을 담당하는, 반감기가 증가되고 신생아의 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 결합이 개선된 항체들 (Guyer 외, J. Immunol. 117:587 (1976) 그리고 Kim 외, J. Immunol. 24:249 (1994))은 US2005/0014934A1 (Hinton 외)에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 하나 또는 그 이상의 치환들을 가진 Fc 영역을 내부에 포함한다. 이러한 Fc 변이체들은 Fc 영역 잔기의 하나 또는 그 이상에서 치환을 가진 것들을 포함한다: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434, 예로써, Fc 영역 잔기 434의 치환 (미국 특허 제 7,371,826).
Fc 영역 변이체들의 다른 예들에 관련된 Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); 미국 특허 제 5,648,260; 미국 특허 제 5,624,821; 그리고 WO 94/29351 참고.
D.
시스테인 조작된 항체 변이체
특정 예들에 있어서, 항체의 하나 또는 그 이상의 잔기가 시스테인 잔기으로 대체된, 시스테인 조작된 항체, 가령, "thioMAbs"를 만드는 것이 바람직할 수 있다. 특정 예들에서, 상기 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 나타난다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올기는 이 상체의 접근가능한 부위에 위치하게 되고, 다른 모이어티, 가령, 하기에서 설명되는 약물 모이어티 또는 연결기-약물 모이어티에 이 항체가 접합되어 면역접합체가 생성될 수 있다. 특정 예들에 있어서, 임의의 하나 또는 그 이상의 다음 잔기는 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (Kabat 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 그리고 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는 예를 들면, 미국 특허 제 7,521,541에서 설명된 것과 같이 생성될 수 있다.
E.
항체 유도체
특정 예들에 있어서, 본 발명에서 제공되는 항체는 해당 분야에 공지되어 있고, 쉽게 입수할 수 있는 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 상기 항체의 유도체화에 적합한 모이어티들은 수용성 중합체들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 수 가용성 중합체의 비-제한적인 예로는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 코중합체, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1, 3-디옥소란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레 무수물 코중합체, 폴리아미노산 (호모중합체 또는 무작위 코중합체), 그리고 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 호모중합체, 프로리프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 코-중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (예로써, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 이의 혼합물을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서의 안정성으로 인하여 제조에 있어 장점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지형 또는 비-분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 다양할 수 있으며, 하나 이상의 중합체가 부착되는 경우, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 이용된 중합체의 수 및/또는 유형은 개선되는 항체의 특정 성질들 또는 기능들, 상기 항체 유도체가 특정 조건하에서 치료에 이용되는지의 여부를 포함하는 고려사항들에 근거하여 결정될 수 있다.
또 다른 예에서, 방사선에 노출시켜 선별적으로 가열될 수 있는 항체와 비단백질성 모이어티의 접합체들이 제공된다. 한 예에서, 상기 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브다 (Kam 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). 방사능은 임의의 파장일 수 있으며, 정상 세포들에게 해를 주지 않지만, 그러나 상기 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포들은 사멸되는 온도에서 비단백질성 모이어티에 열을 가하는 파장이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
F. 면역접합체
본 발명은 또한 화학요법제 또는 약물과 같은 하나 이상의 세포독성제에 접합된 이중특이적 항원-결합 분자, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 이의 단편), 또는 방사성 동위 원소를 포함하는 면역 접합체를 제공한다.
한 예에서, 면역접합체는 항체-약물 접합체 (ADC)이며, 이때 항체는 메이탄시노이드 (미국 특허 제 5,208,020, 5,416,064 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1 참고); 아우리스태틴 이를 테면, 모노메틸아우리스태틴 약물 모이어티 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF) (미국 특허 제 5,635,483, 5,780,588, 및 7,498,298); 도라스태틴; 칼리체아미신 또는 이의 유도체 (미국 특허 제 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 및 5,877,296; Hinman 외, Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); 그리고 Lode 외, Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); 안트라사이클린 이를 테면, 다우노마이신 또는 독소루비신 (Kratz 외, Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey 외, Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov 외, Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik 외, Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King 외, J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); 그리고 미국 특허 제 6,630,579 참고); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산, 이를 테면, 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀, 및 오르타탁셀; 트리코테센; 그리고 CC1065를 포함하나, 이에 국한되지 않는 하나 또는 그 이상의 약물에 접합된다.
또 다른 경우에서, 면역접합체는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, (슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래) 외독소 A 쇄, 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모덱신 A 쇄, 알파-사르신, 유동(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 미국 자리공(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센을 포함하지만 이에 제한되지 않는 효소 활성 독소 또는 이의 단편에 접합된 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 면역접합체는 방사성 원자에 접합되어 방사성접합체를 형성하는 본원에서 기술하는 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성접합체의 생산을 위해 사용가능하다. 실시예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 상기 방사성접합체가 탐지용으로 이용될 때, 이것은 신티그래피 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들면 tc99m 또는 I123, 또는 핵 자기 공명 (NMR) 영상화 (또는 자기 공명 영상화, MRI로도 공지됨)를 위한 회전 라벨, 이를 테면, 다시 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 플루오린-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 또한 함유할 수 있다.
항체와 세포독성 물질의 접합체는 다양한 이중기능성 단백질 커플링 물질, 이를 테면, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이중기능성 유도체들 (이를 테면, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (이를 테면, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (이를 테면, 글루타알데히드), 비스-아지도 화합물 (이를 테면, 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체들 (이를 테면, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (이를 테면, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플로린 화합물 (이를 테면, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 이용하여 만들어질 수 있다. 예를 들면, 리신 면역독소는 Vitetta 외, Science 238:1098 (1987)에서 기술된 바와 같이 준비될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-아이소싸이오시아나토벤질-3-메틸다이에틸렌 트라이아민펜타아세틱 애시드 (MX-DTPA)은 항체에 방사성뉴클레오티드를 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트제이다. WO94/11026 참고. 상기 연결기는 세포 안에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 연결기"일 수 있다. 예를 들면, 산-불안정 연결기, 펩티다아제-민감성 연결기, 광 불안정 연결기, 다이메틸 연결기 또는 다이설파이드-함유 연결기 (Chari 외, Cancer Res. 52:127-131 (1992); 미국 특허 제 5,208,020)가 이용될 수 있다.
본원의 면역접합체 또는 ADC는, 상업적으로 이용가능한 (예컨대, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A), BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 설포-SMPB, 그리고 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트)를 비롯한 교차-결합 시약들 (그러나 이에 제한되는 것은 아님)을 사용하여 준비되는 접합체들을 명확히 고려하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
III.
재조합 방법 및 조성물
본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자는 예를 들어, 미국 특허 제 4,816,567 및 미국 공개특허 제 2013/0078249에 기재된 바와 같은 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 제조 될 수 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 한 구체예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항원-결합 분자를 인코드하는 분리된 핵산 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드)이 제공된다. 이러한 핵산은 상기 이중특이적 항원-결합 분자의 VL이 포함된 아미노산 서열 및/또는 VH가 포함된 아미노산 서열 (예컨대, 이중특이적 항원-결합 분자의 경쇄 및/또는 중쇄)을 인코드할 수 있다. 추가 구체예에 있어서, 이러한 핵산이 포함된 하나 또는 그 이상의 벡터 (예로써, 발현 벡터)가 제공된다.
본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자를 인코드하는 폴리뉴클레오티드는 단일 폴리뉴클레오티드 분자 또는 공발현된 다중 (예를 들어, 2개 이상의) 폴리 뉴클레오티드로 발현될 수 있다. 공발현된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 폴리펩티드는 예를 들어 이황화 결합 또는 다른 수단을 통해 결합하여 기능성 이중특이적 항원-결합 분자를 형성 할 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 모이어티의 경쇄 부분은 항원 결합 모이어티의 중쇄 부분, Fc 도메인 소단위 및 임의로 다른 항원 결합 모이어티를 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자의 일부분과 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드 될 수 있다. 공발현 될 때, 중쇄 폴리펩티드는 경쇄 폴리펩티드와 결합하여 항원 결합 모이어티를 형성 할 것이다. 또 다른 예에서, 2개의 Fc 도메인 소단위 중 하나 및 선택적으로 하나 이상의 항원-결합 모이어티를 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자의 일부분은 2개의 Fc 도메인 소단위 중 다른 하나 및 선택적으로 항원 결합 모이어티를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 일부분과 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드될 수 있다. 공발현 될 때, Fc 도메인 소단위들은 결합되어 Fc 도메인을 형성할 것이다.
특정 구체예에서, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드는 제 1 및 제 2 항원-결합 모이어티 및 2개의 소단위로 이루어진 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자의 단편을 인코드한다. 한 구체예에서, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드는 제 1 항원 결합 모이어티 및 Fc 도메인의 소단위를 인코드한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드는 제 2 항원 결합 모이어티의 중쇄 및 Fc 도메인의 소단위를 인코드한다. 보다 구체적인 구체예에서, 분리된 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 인코드하고, 여기서 Fab 중쇄는 Fc 도메인 소단위와 C-말단 펩티드 결합을 공유한다. 또한 또 다른 구체예에서, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드는 제 3 항원-결합 모이어티의 중쇄, 제 2 항원 결합 모이어티의 중쇄 및 Fc 도메인의 소단위를 인코드한다. 일부 구체예들에서, 제 2 및 제 3 항원-결합 모이어티의 경쇄는 공발현되고 중쇄 영역과 결합하여 Fab 도메인을 형성한다.
추가 구체예에 있어서, 이러한 핵산이 포함된 숙주 세포가 제공된다. 이러한 하나의 구체예에서, 숙주 세포는 다음을 포함한다 (예컨대, 다음에 의해 형질전환된다): (1) 이중특이적 항원-결합 분자의 적어도 하나의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 이중특이적 항원-결합 분자의 적어도 하나의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코드하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 이중특이적 항원-결합 분자의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 인코드하는 핵산을 포함하는 제 1 벡터 및 이중특이적 항원-결합 분자의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코드하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터. 한 구체예에서, 상기 숙주 세포는 진핵, 예컨대 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프구 세포이다. 한 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자를 만드는 방법이 제공되는데, 이때 상기 방법은 상기에서 제공된, 상기 이중특이적 항원-결합 분자를 인코드하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 상기 항체의 발현에 적합한 조건하에서 배양하는 단계, 그리고 선택적으로 상기 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
이중특이적 항원-결합 분자의 재조합 생산을 위하여, 예로써 상기에서 기술된 이중특이적 항원-결합 분자를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 분리하고, 숙주 세포 안에서 추가 클로닝 및/또는 숙주 세포 내부에서의 발현을 위하여 하나 또는 그 이상의 벡터 안으로 삽입된다. 이러한 핵산은 통상적인 과정 (예컨대, 상기 이중특이적 항원-결합 분자의 중쇄 및 경쇄를 인코드하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여)을 이용하여 분리 및 시퀀싱될 수 있다.
이중특이적 항원-결합 분자-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본 명세서에서 설명된 원핵 또는 진핵 세포들을 포함한다. 예를 들면, 특히 당화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우, 박테리아에서 항체가 만들어질 수 있다. 박테리아에서 항체 단편들 및 폴리펩티드 발현과 관련하여 예컨대, 미국 특허 제 5,648,237, 5,789,199, 및 5,840,523호를 참고하라. (대장균(E. coli)에서 항체 단편들의 발현을 설명하는 Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254 또한 참고) 발현 후, 상기 항체는 박테리아 세포 페이스트로부터 가용성 분획으로 분리되며, 추가 정제될 수 있다.
IV.
약학 제제
본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자의 치료 제제는 원하는 순도를 갖는 이중특이적 항원-결합 분자를 동결건조 제제 또는 수용액 형태의 임의의 약학상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 저장용으로 제조된다. 제제에 관한 일반적인 정보에 관하여, 예컨대, Gilman 외 (eds.) The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press, 1990; A. Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Co., Pennsylvania, 1990; Avis 외 (eds.) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, New York, 1993; Lieberman 외 (eds.) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, New York, 1990; Lieberman 외 (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, New York, 1990; 및 Walters (ed.) Dermatological and Transdermal Formulations (Drugs and the Pharmaceutical Sciences), Vol 119, Marcel Dekker, 2002를 참고하라.
허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제는 이용된 투여량 및 농도에서 수용체에 비독성이며, 완충액, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 주기로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당류, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 짝이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물(예를 들면, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 TWEEN™PLURONICS™또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 포함된다.
본원의 제제는 또한 하나 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 화합물을 함유 할 수 있다. 이러한 약제의 유형 및 유효량은 예를 들어 제제에 존재하는 길항제의 양 및 유형, 및 대상체의 임상 파라미터에 따라 달라진다.
또한 활성 성분은 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에서 각각 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합, 예를 들어 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 의해 준비된 마이크로캡슐 또는 마크로에멀젼 (macroemulsions)안에 포집될 수 있다. 이러한 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에 기재되어 있다.
서방형 제재가 제조될 수 있다. 서방형 제재의 적합한 예들에는 상기 길항제를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 이러한 매트릭스는 성형된 제품 형태, 예컨대 필름, 또는 마이크로캡슐 형태로 존재한다. 서방형 매트릭스의 예는 폴리에스터, 하이드로겔 (예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락타이드 (미국 특허 제 3,773,919), L-글루탐산과 γ에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 가령, LUPRON DEPOT™(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사용 마이크로구), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시 부티르산을 포함한다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 무균이어야 한다. 이는 무균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 구현될 수 있다.
V.
치료 방법
본원에 기재된 임의의 치료 방법에서 본 발명의 임의의 이중특이적 항원-결합 분자 (예를 들어, 제 1 항원에 특이적으로 결합 할 수 있는 1가 아암 및 2개의 제 2 항원에 특이적으로 결합 할 수 있는 2가 아암을 갖는 이중특이적 항원 결합 분자) 또는 이의 조성물이 사용될 수 있다.
한 양상에서, 약제로 사용하기 위한 이중특이적 항원-결합 분자 가 제공된다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, 본원에 기재된 이중특이적 항원-결합 분자는 이를 필요로 하는 대상체에서 세포증식성 질병 (예를 들어, 암) 또는 자가면역 질병의 치료 또는 진행을 지연시키기 위해 사용된다. 일부 구체예들에서, 전술한 양상들 중 임의의 이중특이적 항원-결합 분자는 세포 증식성 질병 (예를 들어, 암) 또는 자가면역 질병을 갖는 대상체에서 면역 기능을 향상시키기 위해 사용된다. 특정 구체예들에서, 본 발명은 효과기 세포 (예컨대, T 세포, 예컨대, CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포)를 활성화, 효과기 세포 집단을 확장 (증가), 표적 세포들의 집단 (예컨대, 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자에 의해 인식되는 제 2 표적 세포 항원을 발현시키는 세포들의 집단)을 감소, 및/또는 표적 세포 (예컨대, 표적 종양 세포)를 사멸하기 위한 유효량의 이중특이적 항원-결합 분자를 개체에 투여하는 것을 포함하는, 세포 증식성 질병 또는 자가면역 질병이 있는 개체에서 면역 기능을 향상시키는 방법에 사용하기 위한 이중특이적 항원-결합 분자를 제공한다.
본 발명은 세포 증식성 질병 (예를 들어, 암) 또는 자가면역 질병과 같은 질병의 치료 또는 진행을 지연시키기 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자의 용도를 특징으로 한다. 추가 구체예에서, 약제는 세포증식성 질병 또는 자가면역 질병이 있는 개체에게 유효량의 약제를 투여하는 것을 포함하는 , 세포 증식성 질병 또는 자가면역 질병을 치료하는 방법에서의 용도에 관한 것이다. 이러한 한 구체예에서, 상기 방법은 예를 들어, 아래에 기재된 바와 같은 유효량의 적어도 하나의 추가 치료제를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 한 추가 구체예에서, 약제는 효과기 세포 (예컨대, T 세포, 예컨대, CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포)를 활성화, 효과기 세포 집단을 확장 (증가), 표적 세포들의 집단을 감소 (예컨대, 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자 에 의해 인식되는 제 2 표적 세포 항원을 발현하는 세포들의 집단), 및/또는 표적 세포 (예컨대, 표적 종양 세포)를 사멸하기 위한 것이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 전술한 양상들 중 임의의 이중특이적 항원-결합 분자를 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 필요로 하는 대상체에서 질병의 치료 또는 이의 진행을 지연시키는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 이러한 세포 증식성 질병 또는 자가면역 질병이 있는 대상체에게 유효량의 이중특이적 항원-결합 분자 (예컨대, 항-CD3 1가 아암 및 항-종양 세포 항원 2가 아암을 가지는 이중특이적 항원-결합 분자)를 투여하는 것을 포함한다. 이러한 한 구체예에서, 상기 방법은 예를 들어, 아래에 기재된 바와 같은 유효량의 적어도 하나의 추가 치료제를 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 전술한 양상들 중 임의의 이중특이적 항원-결합 분자 (예컨대, 항-CD3 1가 아암 및 항-종양 세포 항원 2가 아암을 가지는 이중특이적 항원-결합 분자)를 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 질병을 가진 대상체에서 면역 기능을 향상시키는 방법을 제공한다. 일부 구체예들에서, 질병은 세포 증식성 질병 (예컨대, 암) 또는 자가면역 질병이다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 효과기 세포 (예컨대, T 세포, 예컨대, CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포)를 활성화, 효과기 세포 집단을 확장 (증가), 표적 세포들의 집단 (예컨대, 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자에 의해 인식되는 제 2 표적 세포 항원을 발현시키는 세포들의 집단)을 감소, 및/또는 표적 세포 (예컨대, 표적 종양 세포)를 사멸시키기 위하여 유효량의 이중특이적 항원-결합 분자를 투여하는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 제공되는 이중특이적 항원-결합 분자, 이의 조성물, 및 이의 사용 방법들은, 암, 유방암, 위암, 결장직장암, 비소 세포 폐암, 비호지킨 림프종 (NHL), B 세포 림프종, B 세포 백혈병, 다발성 골수종, 신장암, 전립선암, 간암, 두경부암, 흑색종, 난소암, 중피종, 교모세포종, 배중심 B-세포 유사 (GCB) 미만성 거대 B 세포 림프종 (DLBCL), 활성화된 B 세포-유사 (ABC) DLBCL, 여포성 림프종 (FL), 맨틀 세포 림프종 (MCL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프성 백혈병 (CLL), 변연부 림프종 (MZL), 소 림프구성 백혈병 (SLL), 림프 모세포성 림프종 (LL), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 (WM), 중추 신경계 림프종 (CNSL), 버킷 림프종 (BL), B 세포 전림프구성 백혈병, 비장 변연부 림프종, 털 세포 백혈병, 비장 림프종/백혈병, 비장 미만성 적색 비수 소 B 세포림프종, 털 세포 백혈병 변이체, α 중쇄 질환, γ중쇄 질환, μ 중쇄 질환, 혈장 세포 골수종, 고립골 형질세포종, 골수외 형질세포종, 점막-관련 림프 조직의 림프절외 변연부 림프종 (MALT 림프종), 림프절 변연부 림프종, 소아 림프절 변연부 림프종, 소아 여포성 림프종, 일차 피부 소포 중심 림프종, T 세포/조직구 우월성 거대 B 세포 림프종, 중추 신경계의 일차 DLBCL, 일차 피부 DLBCL (다리 형), 노인의 엡스타인-바 바이러스 (EBV)-양성 DLBCL, 만성 염증과 관련된 DLBCL, 림프종양 육아종증, 일차 종격동 (흉선) 거대 B 세포 림프종, 혈관내 거대 B 세포 림프종, 역형성 림프종 키나제 (ALK)-양성 거대 B 세포 림프종, 형질모세포 림프종, HHV8-연관 다중심 Castleman 질환에서 유발된 거대 B 세포 림프종, 일차 삼출 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종과 버킷 림프종 사이의 중간체 특징을 가지는 분류할 수 없는 거대 B 세포 림프종, 또는 미만성 거대 B-세포 림프종과 전형적인 호지킨 림프종 사이의 중간체 특징을 가지는 분류할 수 없는 거대 B 세포 림프종의 치료를 위해 사용된다. 일부 구체예들에서, 본원에서 제공되는 이중특이적 항원-결합 분자, 이의 조성물, 및 이의 사용 방법은, HER2-양성 암 (예컨대, HER2-양성 유방암 또는 HER2-양성 위암)의 치료를 위해 사용된다.
본 발명은 추가로 하나 이상의 추가 치료제 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상의 추가 치료제)와 함께 병행하여 또는 복합 요법의 일부로서 이중특이적 항원-결합 분자의 투여를 포함하는 복합 요법을 제공한다. 한 구체예에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 BCL-2 억제제 (예컨대, GDC-0199/ABT-199), 레날리도마이드 (REVLIMID®PI3K-델타 억제제 (가령, 이데랄리십 (ZYDELIG®효현제, 예컨대, 활성화 공-자극성 분자에 대해 지시된 효현제 항체, 예컨대, CD40, CD226, CD28, OX40 (예컨대, AgonOX), GITR, CD137 (또한 TNFRSF9, 4-1BB, 또는 ILA로도 공지), CD27 (예컨대, CDX-1127), HVEM, 또는 CD127, 길항제, 예컨대, 억제성 공-자극성 분자에 대해 지시된 길항제 항체, 예컨대, CTLA-4 (또한 CD152로도 공지), PD-1, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3, B7-H3, B7-H4, IDO (예컨대, 1-메틸-D-트립토판 (또한 1-D-MT로도 공지)), TIGIT, MICA/B, GITR (예컨대, TRX518) 또는 아르기나제, 이필리무맙 (또한 MDX-010, MDX-101, 또는 YERVOY®로도 공지), 트레멜리무맙 (또한 티실리무맙 또는 CP-675,206으로도 공지, 우렐루맙 (또한 BMS-663513로도 공지), MGA271, TGF-β에 대해 지시된 길항제, 예컨대, 메텔리무맙 (또한 CAT-192로도 공지), 프레졸리무맙 (또한 GC1008로도 공지), LY2157299k, 및 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 T 세포 (예컨대, 세포독성 T 세포)의 입양 전달, 예컨대, 우세-음성 TGF-β 수용체, 예컨대, 우세-음성 TGF-β 유형 II 수용체를 포함하는 T 세포의 입양 전달에서 선택된 하나 이상의 생물학적 조절물질과 공투여된다.
한 특정 구체예에서, 생물학적 조절물질은 PD-1 축 결합 길항제이다. 일부 구체예들에서, PD-1 축 결합 길항제 또는 추가 치료제는 이중특이적 항원-결합 분자의 투여에 앞서 또는 후속하여 투여된다. 일부 구체예들에서, PD-1 축 결합 길항제 또는 추가 치료제는 이중특이적 항원-결합 분자와 동시에 투여된다. 일부 구체예들에서, PD-1 축 결합 길항제는 PD-L1 결합 길항제 (예컨대, 아테졸리주맙 (MPDL3280A), YW243.55.S70, MDX-1105, MEDI4736 (더발루맙), 및 MSB0010718C (아벨루맙)), PD-1 결합 길항제 (예컨대, MDX-1106 (니볼루맙), MK-3475 (펨브롤리주맙), CT-011 (피딜리주맙), MEDI-0680 (AMP-514), PDR001 (스파르탈리주맙), REGN2810 (세미플리맙), 및 BGB-108), 및 PD-L2 결합 길항제 (예컨대, 항체 또는 면역부착소)로 구성된 그룹에서 선택된다.
추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자는 하나 이상의 화학 치료제와 (예를 들어, 세포 증식성 질병, 예를 들어, 암이 있는 대상체를 치료하는 방법의 일부로서) 공투여 될 수 있다.
추가 양상에서, 본 발명은 HER2-양성 암의 치료 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 HER2-양성 암을 갖는 개체에게 유효량의 본 발명의 이중 특이적 항원-결합 분자, 예컨대, 2가 항-HER2 아암 및 1가 항-CD3 아암을 갖는 1Fab-IgG TDB 분자를 투여하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 항-HER2 아암은 환자에게 유효량으로 투여 될 때 허용되는 독성 프로파일을 갖는다. 한 구체예에서, 허용되는 독성 프로파일을 갖는 1Fab-IgG TDB 분자의 항-CD3 아암은 낮은 친화도의 항-CD3 항원-결합 모이어티이다. 한 구체예에서, 허용되는 독성 프로파일을 갖는 1Fab-IgG TDB의 항-CD3 항원-결합 모이어티는 40G5c이다.
특정 구체예에서, HER2-양성 암은 HER2-양성 유방암 또는 HER2-양성 위암이다. HER2-양성 암 (예컨대, HER2-양성 유방암 또는 HER2-양성 위암)은 세포 당 200,000 이상의 복제수 (예컨대, 평균 복제수) (예컨대, 세포 당 250,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 300,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 400,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 500,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 600,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 700,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 750,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 800,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 900,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 1,000,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 1,200,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 1,500,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 2,000,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 2,500,000 이상의 HER2 복사체, 세포 당 3,000,000 이상의 HER2 복사체, 또는 그 이상, 예컨대, 세포 당 200,000 내지 2,000,000의 HER2 복사체, 세포 당 300,000 내지 1,500,000의 HER2 복사체, 세포 당 400,000 내지 1,200,000의 HER2 복사체, 또는 세포 당 500,000 내지 1,000,000의 HER2 복사체, 예컨대, 세포 당 200,000 내지 1,000,000의 HER2 복사체 (예컨대, 세포 당 200,000 내지 250,000의 HER2 복사체, 세포 당 250,000 내지 300,000의 HER2 복사체, 세포 당 300,000 내지 400,000의 HER2 복사체, 세포 당 400,000 내지 500,000의 HER2 복사체, 세포 당 500,000 내지 750,000의 HER2 복사체, 또는 세포 당 750,000 내지 1,000,000의 HER2 복사체) 또는 세포 당 1,000,000 내지 3,000,000의 HER2 복사체 (예컨대, 세포 당 1,000,000 내지 1,500,000의 HER2 복사체, 세포 당 1,200,000 내지 2,000,000의 HER2 복사체, 세포 당 1,500,000 내지 2,500,000의 HER2 복사체, 또는 세포 당 2,000,000 내지 3,000,000의 HER2 복사체)의 HER2를 발현하는 종양 세포들로 특징될 수 있다.
한 구체예에서, 항-HER2 이중특이적 항원-결합 분자는 HER 경로를 표적으로하는 하나 이상의 추가 치료제와 공투여된다. 한 구체예에서, HER 경로를 표적으로 하는 치료제는 EGFR 억제제, HER2 억제제, HER3 억제제 및/또는 HER4 억제제로부터 선택된다. 한 구체예에서, HER2 TDB (예를 들어, 1Fab-IgG TDB)는 트라스투주맙 (HERCEPTIN®T-DM1 (KADCYLA®및 페르투주맙 (PERJETA®으로부터 선택된 하나 이상의 추가 치료제와 공투여된다. 한 구체예에서, 항-HER2/CD3 이중특이적 항원-결합 분자는 트라스투주맙과 공투여된다. 한 구체예에서, 항-HER2/CD3 이중특이적 항원-결합 분자는 T-DM1과 공투여된다. 한 구체예에서, 항-HER2/CD3 이중특이적 항원-결합 분자는 페르투주맙과 공투여된다. 한 구체예에서, 항-HER2/CD3 이중특이적 항원-결합 분자는 트라스투주맙 및 페르투주맙과 공투여된다. 한 구체예에서, 항-HER2/CD3 이중특이적 항원-결합 분자는 T-DM1 및 페르투주맙과 공투여된다.
상기의 이러한 복합 치료요법은 복합된 투여(두 가지 또는 그 이상의 치료요법적 물질이 동일한 또는 별도 제재 안에 함유됨), 및 별도 투여를 포함하고, 이 경우, 상기 본 발명의 이중특이적 항체-결합 분자의 투여는 추가적인 치료요법적 물질 및/또는 물질의 투여 이전, 동시 및/또는 이후에 일어난다. 일 구현예에서, 항-CD3 항체의 투여 및 추가 치료제의 투여는 약 1달 이내, 또는 약 1주, 2주 또는 3주 이내, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일 이내에 발생한다.
본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자 (및/또는 임의의 추가 치료제)는 피하, 정맥내, 근육내, 국소, 경구, 경피, 복강내, 안와내, 이식, 흡입, 척수내, 심실내 또는 비강내를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여 될 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예들에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 피하 투여된다. 다른 구체예들에서, 이중특이적 항원-결합 분자는 정맥내 투여된다. 일부 구체예들에서, 피하 주사에 의해 투여되는 이중특이적 항원-결합 분자는 정맥 주사에 의해 투여되는 동일한 이중특이적 항원-결합 분자보다 환자에서 독성 반응을 덜 나타낸다. 투약은 부분적으로 투여가 잠시 동안인지 또는 만성적인지에 따라, 예를 들면, 주사, 이를 테면, 정맥 또는 피하 주사에 의한 것일 수 있다. 다양한 시점에 걸쳐 단일 또는 다중 투여, 일시 (bolus) 투여, 그리고 펄스 주입을 포함하는 다양한 투여 일정이 고려된다.
본 발명의 항체는 양호한 의학적 수행과 합치하는 양상으로 제형화, 투약, 및 투여된다. 이러한 내용에서 고려되는 인자들은 치료될 특정 질병, 치료되는 특정 포유류, 개별 대상체의 임상적 상태, 질병의 원인, 물질의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 그리고 의료 전문인에게 공지된 다른 인자들을 포함한다. 이중특이적 항원-결합 분자는 반드시 그럴 필요는 없지만, 선택적으로 하나 이상의 질병을 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되는 물질들과 함께 제제화된다. 이러한 다른 물질들의 유효량은 제제에 존재하는 항체 또는 면역접합체의 양, 질병 또는 치료의 유형, 그리고 상기에서 논의된 다른 인자들에 따라 달라진다. 이들은 일반적으로 본원에서 설명된 바와 같은 투여 경로로 동일한 투여량으로 이용되거나, 또는 본 명세서에서 논의된 투여량의 약 1 내지 99%, 또는 실험적으로 임상적으로 적절한 것으로 판단된 임의의 투여량 및 임의의 경로로 이용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위하여, (단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료적 제제와 조합하여 사용된 경우) 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자의 적절한 투여량은 치료 질환의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 이중특이적 항원-결합 분자가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는지 여부, 이전의 요법, 이중특이적 항원-결합 분자에 대한 환자의 임상 이력 및 반응, 그리고 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. 상기 이중특이적 항원-결합 분자는 한 번에 또는 일련의 치료일정에 걸쳐 환자에게 적절하게 투여된다.
일반적인 경우에서, 인간에게 투여되는 이중특이적 항원-결합 분자의 치료적 유효량은, 1회 이상의 투여 여부에 따라 환자 체중당 약 0.01 내지 약 100 mg/kg의 범위일 것이다. 일부 구체예들에서, 사용되는 이중특이적 항원-결합 분자는, 예를 들어, 일일 약 0.01 내지 약 45 mg/kg, 약 0.01 내지 약 40 mg/kg, 약 0.01 내지 약 35 mg/kg, 약 0.01 내지 약 30 mg/kg, 약 0.01 내지 약 25 mg/kg, 약 0.01 내지 약 20 mg/kg, 약 0.01 내지 약 15 mg/kg, 약 0.01 내지 약 10 mg/kg, 약 0.01 내지 약 5 mg/kg, 또는 약 0.01 내지 약 1 mg/kg로 투여된다. 한 구체예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항원-결합 분자는 21-일 주기 중 1일차에 약 100mg, 약 200mg, 약 300mg, 약 400mg, 약 500mg, 약 600mg, 약 700mg, 약 800mg, 약 900mg, 약 1000mg, 약 1100mg, 약 1200mg, 약 1300mg 또는 약 1400mg의 용량으로 인간에게 투여된다. 상기 용량은 단일 용량 또는 다중 용량 (예를 들면, 2 또는 3회 용량)으로, 예컨대 주입(infusion)으로 투여될 수 있다. 수일 또는 보다 장기에 걸친 반복된 투여를 위하여, 상태에 따라, 치료는 일반적으로 질환 증세가 바람직하게 억제될 때 까지 지속될 것이다. 상기 항체 또는 면역접합체의 한 가지 예시적인 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위 일 것이다. 따라서, 약 0.5mg/kg, 2.0mg/kg, 4.0mg/kg 또는 10mg/kg (또는 이의 임의의 조합)의 하나 이상의 용량이 대상체에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들면, 매주 또는 3주 마다 투여될 수 있다 (예를 들면 상기 환자는 약 2 내지 약 20, 또는 예를 들면 약 6회 용량의 항-CD3 항체를 제공받는다). 초기에는 보다 높은 부하 용량, 후속하여 보다 낮은 하나 이상의 용량이 투여될 수 있다. 이 요법의 진행은 통상적인 기술 및 분석에 의해 용이하게 모니터된다. 전술한 양상들 중 임의의 본 발명의 일부 구체예들에서, 대상체, 환자, 또는 개체는 인간이다.
VI.
키트
본원에 기재된 하나 이상의 조성물 (예컨대, 하나 이상의 본원에 기재된 이중특이적 항원-결합 분자 및 약학상 허용되는 담체를 포함하는 조성물) 및 질병 (예컨대, 세포 증식성 질병 (예컨대, 암, 유방암, 위암, 결장직장암, 비소 세포 폐암, 비호지킨 림프종 (NHL), B 세포 림프종, B 세포 백혈병, 다발성 골수종, 신장암, 전립선암, 간암, 두경부암, 흑색종, 난소암, 중피종, 교모세포종, 배중심 B-세포 유사 (GCB) 미만성 거대 B 세포 림프종 (DLBCL), 활성화된 B 세포-유사 (ABC) DLBCL, 여포성 림프종 (FL), 맨틀 세포 림프종 (MCL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프성 백혈병 (CLL), 변연부 림프종 (MZL), 소 림프구성 백혈병 (SLL), 림프 모세포성 림프종 (LL), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 (WM), 중추 신경계 림프종 (CNSL), 버킷 림프종 (BL), B 세포 전림프구성 백혈병, 비장 변연부 림프종, 털 세포 백혈병, 비장 림프종/백혈병, 비장 미만성 적색 비수 소 B 세포림프종, 털 세포 백혈병 변이체, α 중쇄 질환, γ중쇄 질환, μ 중쇄 질환, 혈장 세포 골수종, 고립골 형질세포종, 골수외 형질세포종, 점막-관련 림프 조직의 림프절외 변연부 림프종 (MALT 림프종), 림프절 변연부 림프종, 소아 림프절 변연부 림프종, 소아 여포성 림프종, 일차 피부 소포 중심 림프종, T 세포/조직구 우월성 거대 B 세포 림프종, 중추 신경계의 일차 DLBCL, 일차 피부 DLBCL (다리 형), 노인의 엡스타인-바 바이러스 (EBV)-양성 DLBCL, 만성 염증과 관련된 DLBCL, 림프종양 육아종증, 일차 종격동 (흉선) 거대 B 세포 림프종, 혈관내 거대 B 세포 림프종, 역형성 림프종 키나제 (ALK)-양성 거대 B 세포 림프종, 형질모세포 림프종, HHV8-연관 다중심 Castleman 질환에서 유발된 거대 B 세포 림프종, 일차 삼출 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종과 버킷 림프종 사이의 중간체 특징을 가지는 분류할 수 없는 거대 B 세포 림프종, 또는 미만성 거대 B-세포 림프종과 전형적인 호지킨 림프종 사이의 중간체 특징을 가지는 분류할 수 없는 거대 B 세포 림프종))의 치료 또는 진행 지연을 위해 대상체에 조성물을 투여하는 것에 관한 패키지 삽입물을 포함하는 키트가 제공된다. 일부 구체예들에서, 암은 HER2-양성 암 (예컨대, HER2-양성 유방암 또는 HER2-양성 위암)이다. 추가로 또는 대안적으로, 키트는 자가면역 질병의 치료 또는 진행을 지연시키기 위해 조성물을 대상체에게 투여하는 것에 관한 패키지 삽입물을 포함 할 수 있다.
실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예들이다. 다양한 다른 실시예가 전술한 일반적인 설명에 따라 실시될 수 있는 것으로 이해된다.
실시예 1. 재료 및 방법
유전자 합성
Fab
항-HER2 Fab의 변이체 (4D5-8; Carter 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992, 89: 4285-4289)를 인코드하는 유전자들은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인들의 유전자 합성에 의해 수득되었다. 항-HER2.4D5 Fab 및 변이체들은 Expi293TTM 세포에서 30 mL 스케일로 제조되었으며 항-Flag 친화도 수지를 사용하여 배치에서 정제되었다. 3x PBS 세척 단계 후, Fab를 50 mM 인산 (pH 3.0)으로 용리시키고, 20x PBS (pH 11.0)로 중화시키고 여과하였다. 모든 Fab는 ≥95% 순도이고 질량분석법으로 확인되었다.
IgG TDB & 1Fab-IgG TDB
놉 (항-HER2.N297G.knob (4D5-8 및 변이체);Kelley and O'Connell, Biochemistry 1993, 32: 6828-6835) 및 홀 (항-CD3.N297G.hole (40G5c, 달리 지정되지 않은 한)) 반-항체는 전술한 바와 같이 생성되었다 (Dillon 외, MAbs 2017, 9: 213-230). 1Fab-IgG TDB 구조체들의 경우, 항-HER2 Fab (E1-T225)의 코딩 영역은 항-HER2.knob 서열의 코딩 영역 바로 앞에 있으며 이들 사이에 G4SGG 연결기가 있거나 없이 합성되었다.
1Fab-IgG TDB의 루시페라제 융합
루시페라제 (AAG54095.1) K18-D185에 대한 성숙 단백질 서열을 항-HER2.hu4D5 경쇄에 C-말단에 융합시켰다. 루시페라제 경쇄 융합이 있거나 없는 항-HER2.hu4D5 Fab는 BIACORE®T200 (GE Healthcare) 및 하기 기재된 방법을 사용하여 HER2와 유사한 결합 동역학을 생성하였다.
항체 발현 및 정제
IgG TDB, 1Fab-IgG TDB, 및 1Fab-IgG TDB 루시페라제 융합들을 다음과 같이 생성하였다. 반-항체 항-HER2.hu4D5.knob 및 변이체 그리고 항-CD3.40G5c.hole을 ≥1L 스케일로 CHO 세포들에서 생성하고 MAbSelect SuRe (GE Healthcare)로 정제하였다. 반-항체로부터의 이중특이적 IgG TDB, 1Fab-IgG TDB, 또는 1Fab-IgG TDB 루시페라제 융합 어셈블리는 Junttila 외, Cancer Res. 2014, 74: 5561-5571; Spiess 외, Nat. Biotechnol. 2013, 31: 753-758에 기재된 바와 같이 수행되었다.
HER2 웨스턴 블롯 분석
세포 신호전달 기술 용해 완충액을 사용하여 세포 용해물을 생성하였다. BCA 분석 시약 (Pierce 카탈로그 번호 23228 및 23224)을 사용하여 단백질을 정량하였다. 40 μg 단백질을 SDS-PAGE 겔에 부하하높은 HER2 항체 (Dako 카탈로그 번호 A0485)를 검출에 사용하였다.
면역조직화학 (IHC)
HER2에 대한 면역조직화학은 항-Her-2/neu (Ventana Medical Systems, 클론 4B5, Tuscan, AZ) 토끼 단클론 1차 항체를 사용하여 5 μm 포르말린-고정 파라핀 포매 조직 샘플 및 조직 마이크로어레이 (TMA) 샘플에서 Ventana DAB 감지 기능이 있는 Ventana Ultraview-Benchmark 시스템을 사용하여 수행되었다. 염색 결과를 ASCO-CAP 권장 임상 HER2 점수화 지침을 사용하여 0, 1+, 2+, 또는 3+로 점수화하였다.
형광 인시튜 혼성화 (FISH)
프로브
상업적으로 이용가능한, FDA 승인 HER2 FISH 프로브 (PathVysion, Abbott Molecular)가 세포주 TMA 분석을 위해 Core Diagnostics에 의해 사용되었다. PathVysion HER-2 DNA 프로브 칵테일은 2개의 표지된 DNA 프로브들로 구성된다. 전체 HER2 유전자에 걸친 LSI HER2 프로브는 SpectrumOrange에서 표지된다. CEP17 프로브를 SpectrumGreen에서 표지하고 염색체 17의 동원체에 위치한 알파 위성 DNA에 혼성화시킨다 (17p11.1-q11.1). CEP17 프로브를 포함시키면 HER2 유전자의 상대적 복제수를 결정할 수 있다.
검정
TMA 블록으로부터 5-μm 두께의 FFPE 섹션들을 변형에 관해 전술한 바와 같이 FISH 분석하였다. 56º에서 밤새 배양한 후, 슬라이드들을 각 5분 동안 3회 CitroSolv 세척에서 탈-파라핀화시키고, 알콜로 2회 세척하여 탈수시키고 공기 건조시켰다. 이어서, FFPE 섹션들을 전처리 시약 (Abbott Molecular, IL)에서 80º에서 30분 동안 배양한 다음, Protease II (Abbott Molecular, IL)로 처리한 후, 물 그리고 일련의 에탄올로 추가 세척하였다. 이어서, 건조된 슬라이드들을 프로브로 76℃에서 6분 동안 공변성시키고 37℃에서 밤새 혼성화하였다 (ThermoBrite; Abbott Molecular). 혼성화 후 세척 및 카운터-염색을 전술한 것과 유사한 방식으로 수행하였다.
컴퓨터-구동 이미징 시스템 (BioView Duet, BioView Ltd.)이 장착된 형광 현미경을 사용하여 상기 섹션들을 관찰하였다. 각 샘플로부터 최소 50개의 비-중첩 종양 세포들을 HER2 및 CEP17 혼성화 신호들에 대하여 열거하였다. 현재 HER2 점수화 기준 및 지침을 사용하여 슬라이드 분석하였다. 세포주가 2 이하의 HER2-대-CEP17 비율 또는 2 미만의 HER2-대-CEP17 비율의 세포들에서 핵 당 6 보다 큰 평균 HER2 복제수를 가졌다면, 세포주는 FISH-양성으로 간주되었다. HER2-대-CEP17 비율이 2 미만이고 평균 HER2 복제수가 핵당 4 미만의 신호인 샘플은 음성으로 간주되었으며 HER2-대-CEP17 비율이 2 미만이고 평균 HER2 복제수가 핵당 4-6의 신호인 샘플은 의심스러운 것으로 간주되었다.
세포 HER2 결합 분석
1Fab-IgGs의 루시페라제 융합들의 세포 결합 - 직접 결합 분석:
세포들을 (SKBR3: 웰 당 40,000개, MCF7: 웰 당 200,000개) 96 편평-바닥 백색 무균 조직 배양 처리 플레이트 (Thermo Scientific; 카탈로그 번호136101)에 도말하고 밤새 부착되게 하였다. 이어서 세포들을 결합 완충액 (PBS + 3% BSA + 0.05% 아지드화 나트륨; pH 7.2)으로 세척하고, 결합 완충액 중에서의 다양한 농도 (0.002 nM - 100 nM)의 TDB 루시페라제 융합 단백질을 각 웰에 첨가하였다. 이후 플레이트들을 4°C에서 4시간 동안 배양하고 후속하여 결합 완충액으로 3회 세척하였다. 최종 세척 후, 20 μl의 결합 완충액 함유 50 μl 루시페라제 기질 (New England Biolab, 카탈로그 번호E3300L)을 각 웰에 첨가하였다. Perkin Elmer Envision 플레이트 판독기에서 발광값들을 판독하였다. 항체의 결합 친화도를 결정하기 위해 GraphPad Prism 모델의, “One Site-Specific Binding”을 사용하여 결합 데이터를 적합하였다.
1Fab-IgGs의 루시페라제 융합들의 세포 결합 - 경쟁 결합 분석:
상기와 같이 세포들을 도말하고 세척하였다. 경쟁적 결합을 측정하기 위하여, 고정 농도의 TDB 루시페라제 융합 단백질 (15 nM 4D5-WT 또는 50 nM 4D5-H91A)을 결합 완충액 중에서 증가하는 농도의 TDB (0.007 nM-400 nM)와 혼합하여 상기 세포들에 첨가하였다. 상기와 같이 플레이트들을 4°C에서 4시간 동안 배양하고, 세척하고, 그리고 판독하였다. 항체의 결합 친화도를 결정하기 위해 GraphPad Prism 모델의 “One Site-Fit Ki”를 사용하여 결합 데이터를 적합하였다.
유세포 분석의 세포 결합
MCF7 및 SKBR3 세포들을 50 μL의 FACS 완충액 (1% BSA, PBS 중 2 mM EDTA)에서 96-웰 U 바닥 플레이트에 웰 당 100,000개 세포들로 도말하였다. 시험 품목들을 50 μg/mL 또는 10 μg/mL에서 시작하여 FACS 완충액에서 1:5로 연속 희석하였으며 얼음에서 세포들과 함께 30분 동안 배양하였다. 세포들을 FACS 완충액으로 2회 세척하고 FACS 완충액에서 100 μL Alexa 647 염소 항-인간 IgG, Fcγ단편 (Jackson ImmunoResearch No. 109-606-098)에 1:200 희석으로 재현탁시키고, 얼음에서 30분 동안 배양하였다. 세포들을 프로피듐 아이오다이드 (PI; eBioscience #00-6990-50) 함유 100 μL FACS 완충액에 1:100 희석으로 재현탁시키고 BD FACSCaliber에서 분석하였다.
혈액 세포 분획화
말초 혈액 단핵세포 (PBMC)들을 건강한 지원자들의 혈액으로부터 림프구 분리 배지 (MP Biomedicals)를 사용하여 분리하였다. PBMC로부터 인간 CD8+ 분리 키트 (Miltenyi Biotec No. 130-094-156)를 사용하여 CD8+ 세포들을 음성 선별로 추출하였다.
T 세포 활성화
유세포 분석 세포 염색을 위한 모든 항체들은 BD Biosciences (San Jose, CA)로부터 수득하였다. 인간 PBMC 및 표적 세포들 (10:1 비율)을 편평-바닥 96 웰 플레이트 (BD)에서 24시간 동안 시험 품목의 존재하에서 배양하였다. 배양 후, 세포들을 새로운 V-바닥 96 웰 플레이트로 옮겼다. 세포들을 항-CD8-FITC, 항-CD69-PE, 및 항-CD25-APC로 염색하였다. CD69 및 CD25 표면 발현을 CD8+ T 세포 상에서 유세포 분석으로 검출하였다. CD8+CD69+CD25+의 백분율을 T 세포 활성화로서 기록하였다. HER2-독립 T 세포 활성화를 결정하기 위하여, Jurkat-이중 NF-κΒ리포터 세포들 (Invivogen 카탈로그번호 jktd-isnf)을 37° C에서 TDB 또는 OKT CD3 항체와 함께 24 시간 동안 배양하였다. 10 μL의 상청액을 각 웰로부터 제거하여 백색, 투명 바닥 96 웰 플레이트에 첨가하였다. 100 μL의 Quantiluc 용액 (Invivogen)을 수확된 상청액에 첨가하고 플레이트를 Perkin Elmer Envision 플레이트 판독기에서 판독 하였다.
시험관내 세포자멸
표적 세포들을 배양 배지에서 웰당 10,000 개의 세포로 투명 바닥 96 블랙 웰 플레이트 (Corning No. 3904)에 도말하고 37 ℃5% CO2 배양기에 밤새 두었다. 시험 품목, 50,000개의 정제된 CD8+ 세포, 및 Caspase 3/7 시약 (Essen No. 4440)의 1:1000 희석액을 사전-도말한 세포에 첨가하고 Incucyte zoom에 넣었다. 40 시간에 걸쳐 4시간마다 이미지를 수집하고 mm2 당 세포사멸 발생수에 대해 분석하였다.
세포 생존력
세포들을 10% FBS, 페니실린 (100 U/mL), 스트렙타비딘 (100 μg/mL) 및 L-글루타메이트 (0.2 mM)가 보충된 RPMI에 합류시까지 성장시켰다. 세포들을 PBS 기반 세포 해리 배지로 해리하고, 블랙, 투명 바닥 96-웰 플레이트에 웰당 10,000개 세포 밀도로 도말하였다. 4일차에, 배지를 버리고, 플레이트들을 PBS로 2회 세척하였다. 100 μL CELLTITER-GLO®발광 세포 생존력 시약 (Promega 카탈로그 번호 G7570)을 첨가하고 지침에 기재된 바와 같이 플레이트를 발광 측정기에서 판독하였다.
유방암 세포 증식
CD8+ 세포들을 효과기로서 3:1 효과기:표적 비율로 사용하였다. 유방암 세포 증식/생존력을 CELLTITER-GLO®발광 세포 생존력 검사 (Promega)를 사용하여 탐지하였다. 분석을 위해, 웰 당 15 x 103개의 세포들을 96-웰 플레이트에 도말하고 처리 전 세포 부착을 위해 밤새 배양하였다.
시험관내 효능
암컷 NOD 중증 복합면역결핍 감마 (NOD scid gamma, NSG) 마우스들을 The Jackson Laboratory로부터 수득하였다. 인간 PBMC를 마우스에서 효과기 세포들로서 사용하였다. PBMC를 림프구 분리 배지 (MP Biomedical, LLC, Ohio, Salon, Ohio)를 사용하여 건강한 공여자의 혈액으로부터 정제하고 -80℃에서 동결보존하였다. 마우스로 옮기기 전에 PBMC를 해동하고 37 ℃5% CO2에서 10% FBS 함유 RPMI 배지에서 밤새 배양하였다. PBMC들을 100 μL 부피의 Hank 평형 염 용액 (HBSS) 완충액에서 마우스 당 10 × 106개 세포 농도로 종양 세포 접종 1일 후에 마우스에 복강내 접종하였다. HER2 증폭된 유방암 치료에서 효능을 평가하기 위해, HBSS/MATRIGEL®에서 3 × 106 KPL-4 종양 세포를 우측 흉부 유선 지방 패드에서 피하 투여를 통해 동물에게 접종하였다. 낮은 HER2-발현 종양의 치료에서 활성을 평가하기 위해, HBSS에서 5 × 106 개 HT55 종양 세포를 동물에게 피하 접종하였다. 도면 범례에 나타낸 바와 같이 0일차에 단일 용량 치료를 정맥내 투여하였다.
시노몰구스 원숭이 안전성 및 약동학 (PK) 연구
11마리의 암컷 시노몰구스 원숭이 (Macaca fascicularis; 투약 시작시 24-60 월령 및 2-5 kg의 연령 및 체중)들을 무작위로 3개 그룹에 할당하였다. 동물에게 운반체 대조군 (N=3) 또는 3 mg/kg의 항-HER2-CD3 4D4-H91A 1Fab-IgG TDB (N=3), 또는 20 mg/kg의 TDB (N=5)를 2 mL/kg/시간 부피로 1-시간 정맥내 주입을 통해 제공하였다. 동물들을 임의의 이상 및 통증이나 스트레스 징후에 대해 매일 2회 모니터하였다. 추가 평가변수들에는 음식 소비, 체중, 신체 검사, 체온, 호흡률 및 심박수가 포함되었다.
PK 분석
약동학을 평가하기 위해 시노몰구스 원숭이 혈액을 연구 전반에 걸쳐 다양한 시점에서 수집하였다. 혈액을 실온에서 30분 이상 동안 응집하도록 두었다. 시료들을 수집 1시간 이내에 2-8° C에서 약 1500-2000 x g로 원심분리하였다. 혈청은 분석을 위해 선적 될 때까지 -60℃내지 -80℃에서 보관된 상태로 수집되었다. 혈청 PK 시료들을 GRIP ELISA로 분석하였다 (Yang 외, Journal of Immunological Methods 2008, 335: 8-20). 혈청 농도-시간 프로파일들을 사용하여 비-구획 분석 (WinNonlin, version 5.2.1; Pharsight Corporation, Mountain View, CA)을 이용해 다음과 같은 PK 파라미터들을 추정하였다: 혈청 농도-시간 곡선 (AUC) 하 면적으로 정의되는 총 약물 노출, 항체 제거 (CL), 및 관찰된 최대 혈청 농도 (C최대). 각 동물을 별도로 분석하였으며, 각 투약 그룹에 대한 결과들을 평균 ± 표준 편차 (SD)로 요약하였다.
임상 병리학
혈액을 응고 시험을 위해 항응고제 시트르산 나트륨을 또는 혈액학 시험을 위해 칼륨 EDTA를 함유하는 시험관들에 투약전 단계 동안 그리고 연구일 2 및 8일차에 최소한 2번 수집하였다.
BIACORE®
항-HER2 Fabs 또는 항-HER2/CD3 T 세포 의존성 이중특이적 (TDB) 항체들의 결합 동역학을 BIACORE®T200 또는 8K 기기 (GE Healthcare)에서 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정하였다. 모든 동역학 실험들은 37˚에서 30 μL/분의 유속으로, 10 mM HEPES, pH 7.2, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20, 및 1 mM EDTA의 러닝 완충액 (HBS-EP 완충액)을 사용하여 수행되었다. 인간 HER2 세포외 도메인 (ECD; Sino Biologicals 10004-H08H 또는 Novus Biologicals NBP1-94702) 또는 시노몰구스 원숭이 HER2 ECD를 아민계 커플링을 통해 CM5 센서 칩에 고정시켰다. 인간 HER2 ECD의 경우, 0.27 내지 200 nM 범위의 일련의 3-배 농도 항-HER2 Fabs 또는 TDB를 사용하여 결합을 분석하였다. 시노몰구스 원숭이 HER2 ECD의 경우, 87.8 내지 1000 nM 범위의 일련의 1.5-배 농도 항-HER2 Fabs를 사용하여 결합을 분석하였다. HER2의 결합을 위한 센서그램들을 주사 시간 180초, 이후 해리 시간 300초, 그리고 50 mM HCl에 의한 표면 재생성을 사용하여 기록하였다. 항체에 대한 항원 결합에 대해 관찰된 모든 센서그램은 시노몰구스 원숭이 HER2에 결합하는 4D5 Fab 변이체를 제외하고, 1:1 Langmuir 결합을 사용하여 분석하였으며, 이는 동역학 및 결합 상수를 계산하기 위해 정상 상태 결합 모델을 사용하였다. 시노몰구스 원숭이 HER2에 대한 약한 친화도를 측정하려면 높은 Fab 농도가 필요하므로, 완충 효과를 방지하고 정확한 측정을 보장하기 위해 실험 전에 모든 Fab 변이체를 HBS-EP 완충액으로 완충액 교환하였다. 모든 4D5 변이체들의 질량을 질량 분광분석법으로 확인하였다.
실시예 2. 항-HER2/CD3 IgG TDB의 HER2 친화도는 사멸 활성에 직접적인 효과를 가지지만, HER2-과발현 세포들에 대한 선택성에 대해서는 그렇지 않다.
각 결합 아암에 대하여 1가인 항-HER2/CD3 이중특이적 항체는 HER2-증폭된 시험관내 및 생체내 유방암 모델에서 강력한 활성을 가지는 것으로 밝혀진 바 있다. 그러나, 이러한 IgG TDB 형태는 또한 정상 HER2-양성 인간 상피 세포와 유사하게 낮은 수준의 HER2를 발현하는 세포주들에 대하여 낮은 수준의 활성을 보유한다. 종양외 온-타겟 활성의 위험을 최소화하고 이에 따라 HER2 표적화 TDB의 치료 지수를 증가시키기 위해 항-HER2/CD3 TDB의 HER2 증폭된 세포에 대한 선택성을 증가시키는 것이 바람직하다. 먼저, HER2 증폭된 세포에 대한 IgG TDB의 선택성에 대한 HER2 친화도의 영향을 조사하였다. 0.3 내지 213 nM 범위의 1가 결합 친화도를 가지는 항-HER2 4D5의 다수의 변이체들이 Fabs로서 (표 4) 생성되었다. 모든 변이체들에 있어서, 친화도 감소의 주요 구동인자는 해리 속도 (kd)의 증가 (즉, 보다 빠름)인 반면, 결합 속도 (ka)는 변화되지 않고 유지되었다.
표 4. 4D5 변이체의 1가 결합 친화도
1차 선택성 시험을 위해, SKBR3 및 MCF7을 모델 세포주로 사용하였다. SKBR3은 HER2-증폭된 유방암 세포주인 반면, MCF7은 배양된 심근 세포와 같은 비 암성 세포에서 탐지된 수준(Junttila 외 Cancer Res. 74(19): 5561-5571, 2014)과 유사한, 낮은 수준의 HER2를 발현하는 유방암 세포주이다 (도 1). SKBR3 및 MCF7 세포들에서 HER2의 세포막 복제수는 각각 세포 당 2×106개 그리고 세포 당 1.5×104개로 보고된 바 있다 (Aguilar 외 Oncogene 18(44): 6050-6062, 1999). HER2 결합 친화도 감소는 SKBR3 및 MCF7 세포주 모두에 대한 항-HER2 IgG TDB의 사멸 활성을 점진적으로 감소시켰다 (도 2A-2F). 사멸 활성은 HER2에 대해 49 nM 이상의 친화도를 가지는 IgG TDB를 사용하여 실제적으로 제거되었다. SKBR3 및 MCF7 세포들에서 유사한 활성 수준의 감소가 관찰되었다. 요약하면, 1가 HER2 친화도는 항-HER2/CD3 IgG TDB의 활성에 중요한 역할을 하지만 HER2-과발현 세포들에 대한 선택성에는 영향을 미치지 않았다.
실시예 3. HER2 과발현 세포들에 대한 선택성에 대한 2가 낮은 친화도 HER2 결합의 효과 특성화
2가 HER2 결합 및 1가 CD3 결합을 가지는 항체들 (1Fab-IgG TDB 형태)을 1가 4D5 친화도 변이체들에 기초하여 제작하였다 (도 3). 1Fab-IgG TDBs를 SKBR3 세포들 (도 4A 및 7A) 그리고 MCF7 세포들 (도 4B 및 7B)에 대한 세포 결합에 관해 그리고 SKBR3 및 MCF7 세포들의 세포자멸 (도 5A 및 5B) 및 사멸 (도 6A-6C 및 8) 능력에 관해 시험하였다. 다수의 4D5 1Fab-IgG TDB 변이체는 야생형 4D5에 기초한 1가의 높은 친화도 HER2 아암을 갖는 대조군 IgG TDB와 비교하여 SKBR3 및 MCF7 세포에 유사한 결합을 나타냈다 (트라스투주맙;도 4A 및 4B). Y55E.H91A, Y100aA, 또는 N30A.H91A 치환 (각각 172, 213, 및 353 nM의 1가 KD)은 1가 높은-친화도 HER2 IgG TDB 형태와 비교하여 1Fab-IgG TDB 형태에서 세포 결합을 실질적으로 감소시켰다 (도 7A 및 7B). 결합 저하는 SKBR3 세포 사멸의 실질적 감소를 반영하였다 (도 8). 1Fab-IgG TDB 형태에서 Y102V 및 Y55E.Y102V 치환 (각각 0.3 및 2.6 nM의 1가 KD)은 대조군 IgG TDB와 비교하여 SKBR3 및 MCF7 세포주 모두에 대한 유사한 결합을 가져왔다 (도 4A 및 4B). 세포 결합과 일관되게, Y102V 및 Y55E.Y102V 1Fab-IgG TDB 변이체들은 낮은 HER2-발현 MCF7 세포들의 사멸에 있어서 실질적인 효능을 나타내었으며, 이는 이들 변형들이 HER2 과발현 세포들에 대한 선택성을 개선시키지 않음을 제시하는 것이다 (도 5A, 5B, 6B, 및 6C).
2개의 4D5 변이체, D98A.F100A.Y102V 및 H91A (각각 23 및 49 nM의 1가 KD)는, SKBR3 세포들에 대한 높은 세포 결합을 유지하였던 반면, MCF7 세포들에 대해서는 최소 결합만을 나타내었다 (도 4A, 4B, 5A, 및 5B). 이러한 세포 결합은 사멸 활성에 반영되었다. 특히, D98A.F100A.Y102V 및 H91A 1Fab-IgG TDB 변이체들은 SKBR3 세포들의 강력한 세포자멸 및 사멸을 유도하였으나 매우 고 농도 (50 ng/mL 내지 50 μg/mL)에도 불구하고 낮은 HER2-발현 MCF7 세포들의 사멸을 매개할 수 없었다. 1가의 높은 HER2 친화도의 HER2-IgG TDB 시험관내 활성은 ~10 ng/mL 농도에서 포화되는 것으로 보고된 바 있다 (Junttila 외 Cancer Res. 74(19): 5561-5571, 2014). 이들 결과는 기존의 항체와 비교하여 1Fab-IgG TDB의 향상된 결합력이 HER2-과발현 세포들에 대한 선택성을 향상시킬 수 있음을 제시하는 것이다. 선택성이 증가된 1가 친화도 (KD)에 관한 윈도우는 Fabs로 측정시 20-50 nM 범위였다. 보다 작은 친화도 감소는 선택성을 개선하지 않으며 보다 큰 친화도 감소는 TDB의 효능을 유의하게 손상시킨다.
실시예 4. HER2 과발현 세포들에 대한 1Fab-IgG TDB 형태의 향상된 선택성 특성화
4D5의 H91A-1Fab-IgG TDB 변이체를 선택하여 시험관내 활성을 추가로 분석하였다. 용량 반응 연구는 SKBR3에 대한 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB 활성이 1가의 높은 HER2-친화도 IgG TDB와 비교시 거의 동일하였음을 입증하였다 (도 9; 각각 EC50 6.9 및 6.3 pM). IgG TDB와 대조적으로, 어떠한 용량 수준의 1Fab-IgG TDB에 대하여도 MCF7 세포들에 대한 활성이 관찰되지 않았다 (도 9). 90 개 유방암 세포주들을 임의로 고 (>400의 백만개 맵핑된 리드 당 전사체 길이 킬로베이스 당 정규화 리드 (nRPKM)), 중 (50-400 nRPKM), 및 저 (<50 nRPKM)로 나누었다. HER2-RNA 발현에 기초한 HER2-발현 세포들은 Klijn 2015에 보고되어있다 (도 10; Klijn 외 Nat. Biotechnol. 33(3): 306-312, 2015). 선택성 연구들은 가변적인 HER2 발현 수준들에 따라 15개 세포주로 확장되었다. 고 용량 수준 (50 ng/mL)에서, 1가의 높은 HER2 친화도 IgG TDB에 대해 T 세포 활성화와 HER2 발현 사이에 명확한 상관관계는 관찰되지 않았다 (도 11A-11D). 현저히 대조적으로, H91A 친화도 변이체 1Fab-IgG TDB를 시험하였을 때 T 세포 활성화는 최고 HER2 발현 수준을 갖는 세포주에서만 유도되었다 (도 12A-12D). 유사하게, 표적 세포 사멸은 1Fab-IgG TDB 분자를 갖는 높은 HER2-발현 세포주에 제한되었던 반면, 높은 HER2 친화도 IgG TDB는 고 용량 수준에서 사용될 때 낮은 HER2-발현 세포의 사멸을 유도함에 있어서 광범위하게 활성이었다 (도 11A-11D 및 12A-12D). 50 ng/mL 용량의 대조군 IgG TDB는 낮은 HER2-발현 세포의 T 세포 활성화 및 사멸을 유도한 반면, 50 μg/ml 1Fab-IgG TDB는 낮은 HER2-발현 세포의 생존력에 영향을 미치지 않았다. 그러므로, 대조군 IgG TDB와 비교하여, HER2에 대한 1Fab-IgG TDB 분자의 선택성 개선은 ≥1000-배인 것으로 계산되었다.
폐, 피부, 및 유방 조직들로부터 유래한 인간 비-암 세포주에서 상기 활성을 추가로 시험하였다. 시험한 모든 비-암성 세포들에서 유세포 분석으로 낮은 수준의 HER2 발현이 확인되었다. 표 5는 이들 세포들 그리고 IgG TDBs 및 1Fab-IgG TDB의 결합의 특성화를 보여준다.
표 5. 낮은 HER2-발현 인간 비-암 세포들에 대한 결합.
H91A 친화도 변이체 1Fab-IgG TDB는 농도 ≤ 5 μg/mL에서 8개의 시험 세포들에 대해 세포자멸 활성이 없음을 나타내었다. HBL-100 세포들과 함께 배양된 1Fab-IgG TDB와 IgG TDB 간의 용량-반응 곡선들의 대표적인 비교는 H91A-1Fab-IgG TDB와 대조적으로 H91A-IgG TDB가 낮은 HER2-발현 HBL-100 세포들을 강력하게 사멸하였음을 보여준다 (도 13). 동역학 분석으로 HBL-100 사멸에 대한 시간에 따른 H91A-IgG TDB의 용량-의존성이 확인되었으며 추가로 H91A-1Fab-IgG TDB-유도 사멸은 70 시간의 과정에 걸쳐 최소임이 증명된다 (도 14A 및 14B). 이들 결과는 높은 HER2-발현 세포주들의 사멸에 있어서 1Fab-IgG TDB의 시험관내 효능이 1가 높은 HER2-친화도 IgG TDB와 유사함을 증명한다. 그러나, 1Fab-IgG TDB는 시험된 임의의 낮은 HER2-발현 세포주들에 대해 탐지가능한 활성이 없었으며, 이는 이것이 HER2-과발현 세포들에 선택적임을 제시하는 것이다.
이어서 H91A 친화도 변이체 1Fab-IgG TDB의 활성에 필요한 HER2 발현 수준의 역치를 조사하였다. 1Fab-IgG TDB를 다양한 HER2 발현 프로파일의 13개 표적 세포주들과 함께 배양 시, 세포 당 200,000보다 큰 HER2 분자들의 복제수의 HER2를 발현시키는 표적 세포들에서 사멸이 관찰되었다 (도 15A). 특히, HER2 RNA ≥ 489 nRPKM를 발현하는 모든 세포주들 (즉, 복제수 ≥ 290,579의 HER2를 발현하는 세포주들)에서 강력한 사멸 활성이 탐지되었다. HER2 RNA ≤ 260 nRPKM을 발현시킨 모든 세포주들 (즉, 복제수 ≤ 146,208의 HER2를 발현하는 세포주들)에서 최소 활성이 탐지되었다. 각 세포주에 대한 HER2 복제수를 Quantum-Alexa647 MESF 비드를 사용하는 FACS로 정량하고, 결과를 아래 표 6에 요약한다.
표 6. 1Fab-IgG TDB 사멸에 대해 시험된 다양한 세포주들의 HER2 복제수
임상적으로 검증되고 환자 선택에 사용되는 HER2 진단 시험들에 대해 이 활성을 추가로 벤치마크하였다. 20개의 세포 시험된 세포주들 중에서, 실질적인 사멸 활성은 H91A 친화도 변이체 1Fab-IgG TDB를 사용하여 IHC 3+, FISH+ 세포주들에서만 나타났다 (도 15B 및 15C).
실시예 5. HER2 과발현 종양들에 대한 1Fab-IgG TDB의 생체내 선택성 평가
H91A 친화도 변이체 1Fab-IgG TDB의 생체내 활성을 평가하였다. 인간 PBMC를 보충한 NSG 마우스에 MCF7 세포와 유사한 수준의 HER2를 발현하는HER2-증폭된 KPL4 종양 또는 HT55 종양을 이식하였다 (도 16). H91A-1Fab-IgG TDB는 단일 0.5-5 mg/kg 용량에 반응하여 용량 퇴행을 유도하였으며 (도 17), 반면 1가 높은 HER2 친화도 IgG TDB는 0.05 mg/kg 용량에서 퇴행을 유도하였는데, 이는 1Fab-IgG TDB가 생체내 활성이 약 10-배 더 작음을 나타낸다. 시험관내 결과에 기초하여 예상할 때, HT55 종양 치료에서 보다 작은 활성이 탐지되었다 (도 18). 1가 높은 HER2 친화도 IgG TDB는 단일 0.1 mg/kg 용량에서 HT55 종양 퇴행을 유도하였다. H91A-1Fab-IgG TDB는 ≤ 50 mg/kg 용량에서 HT55 종양 치료에 있어 어떠한 항-종양 활성도 보이지 않았다. 이들 결과는 두 분자가 HER2 증폭된 종양의 치료에 매우 강력하며 HER2 증폭된 암에서 HER2 발현 수준에 기초하여 긍정적인 치료 지수에 대한 뒷받침을 제공함을 증명하였다. H91A-1Fab-IgG TDB HER2 TDB는 정상, 낮은 수준의 HER2 (예컨대, 정상 인간 조직과 유사한)를 발현하는 종양들에 비해 HER2 증폭된 종양에 대하여 ≥ 100-배 생체내 선택성을 나타내었다.
실시예 6. 선택성 향상을 위한 HER2 친화도 조정
HER2-과발현 세포들에 대한 최대 선택성을 구현하는 최적 친화도를 확인하기 위해 1Fab-IgG TDB 형태에서 개선된 선택성을 나타내었던 2개의 4D5 변이체, D98A.F100A.Y102V 및 H91A (각각 23 및 49 nM의 1가 KD)를 선택하여 특성화 확장하였다. SKBR3 세포들에 대한 시험관내 용량 반응 분석에서, D98A.F100A.Y102V 및 H91A 변이체들은 거의 동일한 활성을 나타내었다 (도 20). 두 분자들 모두 HER2 증폭된 KPL4 종양 이종이식편들의 치료에 있어서 0.5 mg/kg 용량에서 강력한 항-종양 활성을 나타내었다 (도 17 및 19). 고농도 (50 ng/mL)의 1Fab-IgG TDB 변이체, H91A-1FabIg (도 21A, 23A 및 25A), 및 D98A.F100A.Y102V로 고, 중 또는 낮은 수준의 HER2를 발현하는 다수의 세포주를 처리함으로써 시험관내 활성 분석을 확장시켰다 (도 21B, 23B 및 25B). 세포주들의 반응은 일반적으로 두 분자와 유사했다. 그러나, D98A.F100A.Y102V 변이체의 효능이 H91A 변이체에 비해 더 높은 명확한 경향이 관찰되었다 (도 22, 24 및 26). 이러한 경향은 낮은 HER2-발현 세포에서 탐지가능하였으므로, 49 nM의 1가 KD로 HER2에 결합하는 4D5 HVR에서의 H91A 치환이 HER2-과발현 세포에 대한 최대 선택성을 초래하였다고 결정되었다.
실시예 7. 연결기 서열 길이의 효과 특성화
중쇄 2가 HER2 결합 및 활성에 있어서 항-HER2 Fabs를 융합시키는 연결기 서열의 길이 효과를 정량하기 위해, 2개 연결기 서열들을 시험하였다 (도 27A). 앞선 실험들에서 모든 1Fab-IgG TDB 분자들은 내부에 원위 Fab의 상부 IgG1 힌지로부터 유래한 자연 DKTHT 서열 (서열 번호: 50), 이어서 GGGGSGG 확장부 (서열 번호: 51)를 포함하는 확장된 연결기 서열 (DKTHTGGGGSGG, 서열 번호: 52)을 포함하였다. 확장된 연결기 서열을 자연 DKTHT 서열 (서열 번호: 50)의 연결기를 가지는 1Fab-IgG TDB 분자와 비교하였다. H91A-1Fab-IgG TDB를 사용하여 연결기들의 영향을 시험하였다. SKBR3 또는 MCF7 세포들에 대한 결합에 있어서 차이가 관찰되지 않았다 (도 27B 및 27C). SKBR3 사멸에서 시험관내 용량 반응, 그리고 보다 광범위한 세포주 활성 스크린은 변이체들 간에 거의 동일한 활성을 나타내었다. 확장된 연결기와 비교하여 자연 연결기 변이체는 KPL4 및 HT55 종양 이종이식편들의 치료에서 유사하게 수행하였다. 이들 데이터는 HER2에 대해 23 nM 내지49 nM KD 범위의 1가 친화도를 가지는 항-HER2 1Fab-IgG TDB는 바람직한 활성 프로파일들을 나타냄을 제시한다. 이들 연구에서, HER2-과발현 세포들에 대한 최대 활성은 H91A 4D5 변이체를 사용하여 도달되었다 (KD 49 nM).
실시예 8. 트라스투주맙의 T 세포-독립성 항-신호전달 효과는 HER2에 대한 2가 낮은 친화도 결합을 가지는 1Fab-IgG TDB 분자에서 약화된다
HER2 증폭된 암 세포에서 과발현된 HER2에 대한 트라스투주맙의 결합은 비조절은 HER2-HER3 복합체에 의해 개시되는 항시적인 리간드 독립적 PI3K 신호전달을 강력하게 간섭한다 (Junttila 외 Cancer Res. 74(19): 5561-5571, 2014). 1Fab-IgG TDB 분자는 HER2에 2가 형태로 결합한다. 1Fab-IgG TDB와 함께 배양한 SKBR3 세포의 시험관내 처리는 pAKT의 일시적 비내구성 감소를 가져왔으며, HER3 인산화에는 탐지가능한 효과가 없었다 (도 28A). 또한, 1가 높은 HER2 친화도 IgG TDB도, 2가 낮은 HER2 친화도 1Fab-IgG TDB도, SKBR3 세포들의 증식/생존력에 실질적으로 영향을 주지 않았다 (도 28B). 요약하면, HER2에 대한 2가 낮은 친화도 결합은 HER2-증폭된 세포들의 증식을 억제하지 않는다.
실시예 9. 4D5 항체 변이체들을 경향성 고정 변이체들과 조합
4D5 항체 친화도 변이체들의 안정성을 향상시키기 위하여, 경향성 고정들을 도입하였다. 탈아미드화를 감소시키기 위해, 4D5 경쇄 잔기 N30을 세린 잔기 (N30S)로 치환하고, 4D5 중쇄 잔기 N54를 글루탐산 잔기 (N54E)로 치환하였다. 이성질화를 감소시키기 위해, 4D5 중쇄 잔기 D98을 알라닌 잔기 (D98A) 및/또는 트레오닌 잔기 (D98T)로 치환하였다. 야생형 4D5 Fab 및 이의 친화도 변이체들 (4D5 Y55E.Y102V-Fab, 4D5 D98A.F100A.Y102V-Fab, 및 4D5 H91A-Fab; 도 29A-29D); 경향성 고정 변이체들 (4D5 N30S-Fab, 4D5 N54E.D98T-Fab, 및 N30S.N54E.D98T-Fab; 도 30A-30C); 및 경향성 고정들을 가진 친화도 변이체들 (4D5 N30S.Y55E.N54E.D98T.Y102V-Fab, 4D5 N30S.N54E.D98A.F100A.Y102V-Fab, 및 4D5 H91A.N30S.N54E.D98T-Fab; 도 31A-31C)의 결합 친화도를 BIACORE®로 정량하였다.
경향성 고정들을 가진 4D5 친화도 변이체들을 생성하고 특성화하였다. 각 4D5 Fab 변이체의 분자량 (MW; 달톤)을 질량 분광분석법으로 측정하고 응집도를 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)로 정량하였다. 결과를 아래 표 7에 나타낸다. 관찰값과 예측값 사이에서 관찰된 MW 차이는 C-말단 리신 클리핑과 관련이 있다.
표 7. 질량 분광분석법 및 SEC 실험 결과.
4D5 친화도 변이체들의 변이체들은 1가 4D5 아암을 항-CD3 아암 (40G5c N297G)과 결합시킴으로써 IgG TDB 항체 형태로 되었다 (예컨대, 미국 공개특허 제 2015/095392 참고, 이는 그 전문이 참고문헌으로 본원에 포함됨). 항체들을 인간 HER2에 대한 결합에 관하여 BIACORE®로 시험하였다. 결과를 도 32A-32K에 나타내고 아래 표 8에 요약한다.
표 8. 인간 HER2에 대한 4D5 IgG TDB 항체의 결합 특성.
H91A.D98T.F100A.Y102V-IgG TDB, Y55E.H91A.D98A.F100A.Y102V-IgG TDB, 또는 Y55E.H91A.Y102V-IgG TDB 변이체들에서는 결합이 전혀 탐지되지 않았다. 일반적으로, 보다 낮은 KD 값 (보다 강한 결합 친화도)은 대부분 보다 저속의 해리-속도와 관련이 있었다. IgG TDB 형태에서, Fab 형태에 비해 약 2-배 더 약한 친화도가 관찰되었다 (표 9 및 10). 그러나, 4D5 변이체의 KD를 4D5 야생형의 KD로 나눈 KD 비율이 사용되는 경우, 결과는 IgG TDB 또는 Fab 형태의 H91A 변이체에 대하여 비교적 일관적인 100-200 값이다.
표 9. 인간 HER2에 대해 경향성 고정된 4D5 Fab 분자의 결합 특성.
Fab 형태의 4D5 변이체들의 패널을 생성하여 IgG TDB (표 9) 또는 1Fab-IgG TDB 형태 (표 10)에서의 스크리닝을 위한 친화도 범위를 얻었다. 친화도 및 동역학은 H91A 변이체에서 가장 바람직하였으므로, 이 변이체에서 가능한 분자 경향성들의 제거가 수행되었다. 경향성들은 HVR-L1에서 경쇄 위치 N(30)T 및 HVR-H2에서 중쇄 위치 N(54)G 및 HVR-H3에서 D(98)G를 포함하였다. 목적은 가능한 D(98)G 이성질화 및 가능한 N(30)T 및 N(54)G 탈아미드화를 방지하는 것이었다. 초기에는 합리적인 고안을 사용하여 변형을 선별했다. 그러나, 약한 친화도 변이체를 높은 친화도 변이체와 조합하는 것은 예측 친화도를 산출하지 않았고, 심지어 2개 또는 3개의 변이체의 조합도 도 38에 도시된 바와 같이 예측할 수 없는 결과를 산출하였다. 예를 들어, Y55E는 전형적으로 친화도를 3.5- 내지 20-배 약화시켰으나, 한 사례에서 적은 친화도 증가를 산출하였다. H91A는 친화도를 91 내지 163-배 약화시켰으며 Y102V는 친화도를 증가시키거나 친화도를 변화시키지 않았다. 그러므로, 분자 경향성을 고정시키기 위하여 N30S.N54E.D98A/T를 사용하여 작은 매트릭스를 시험하였다. N30S는 HVR-L1에서 가능한 탈아미드화를 방지하기 위해 사용되었으며 친화도에 거의 내지 전혀 영향을 주지 않았다. N54E.D98T는 친화도를 0.07 nM까지 증가시켰으므로, 약 50 nM의 KD에 도달하기 위하여 친화도 약화 돌연변이들이 필요하였다. 경향성 고정들에 더하여, 친화도 돌연변이들 Y55E, H91A, 및/또는 Y102V의 사용을 통해, H91A에 대한 유사한 동역학을 가지는 2개의 변이체들이 확인되었다 (표 10). 4D5 N30S.Y55E.H91A.HC-N54E.D98T-Fab는 3개 모든 경향성에서의 고정을 특징으로 하는 반면, 4D5 Y55E.H91A.HC-N54E.D98T.Y102V-Fab는 2개의 경향성 고정 잔기를 특징으로 하며, 두 가지 모두 약 50 nM의 KD를 가진다. 또 다른 변이체, 4D5 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-Fab는 일관되게 약간 더 빠른 해리 속도를 나타내었으며 70 nM의 KD를 가졌다.
표 10. 인간 HER2에 대해 경향성 고정된 4D5 Fab 분자의 결합 특성.
표 11에서 보는 바와 같이, 야생형 4D5 Fab의 시노몰구스 원숭이 HER2에 대한 1가 친화도 (3.3 nM)는 인간 HER2에 대한 것 (0.3 nM) 보다 대략 10배 더 약했다. 4D5 H91A-Fab 친화도 변이체 및 경향성 고정된 변이체들은 시노몰구스 원숭이 HER2에 대해 300 nM 보다 큰 1가 친화도를 보인다 (표 12). 그러나, 시노몰구스 HER2 단백질에 대한 시노몰구스 원숭이 변이체 4D5 H91A-Fab 및 4D5 야생형의 KD 비율은 대략 100-200이었으며, 이는 인간 형태에서 관찰된 것과 유사한 범위에 속한다.
표 11. 시노몰구스 원숭이 HER2에 대한 경향성 고정된 4D5 Fab 분자들의 결합 특성.
실시예 10. 4D5 경향성 고정된 친화도 변이체들의 특성화
추가 특성화를 위해 몇 가지 4D5 경향성 고정된 친화도 변이체들을 선택하였다. Y55E.H91A.N54E.D98T 및 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V 변이체들을 자연 (짧은) 연결기 (힌지; DKTHT)를 가지는 1Fab-IgG TDB 항체 형태로 만들고 SKBR3 (도 33A) 또는 MCF7 (도 33B) 표적 세포들의 사멸을 정량하기 위한 용량 반응 분석에서 H91A-1Fab-IgG TDB와 비교하였다. 각 웰에 1.5 × 104 SKBR3 또는 MCF7 표적 세포들을 씨딩하고 1:3 효과기:표적 비율로 PMBC-유래 CD8+ 효과기 세포들과 함께 공배양하였다. 결과를 아래 표 12에 요약한다.
표 12. 선택된 4D5 1Fab-IgG TDB 변이체들에 의한 SKBR3 표적 세포 사멸
또한 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T-1Fab-IgG TDB 및 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V 항체의 SKBR3 세포 (도 34A) 및 MCF7 세포 (도 34B)에 대한 결합을 유세포 분석으로 특성화하였다. 일반적으로, 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB는 SKBR3 세포 및 MCF7 세포에 대한 결합 및 세포독성과 관련하여 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB와 유사하였다.
실시예 11. 세포 결합 친화도
세포 기반 친화도에 대한 2가 HER2 관여, 또는 결합력의 기여를 보다 상세히 이해하기 위해, SKBR3, MCF7, 및 MCF7과 비등한 수준의 시노몰구스 원숭이 HER2를 발현하도록 형질감염된 세포들에 대한 4D5-WT 1Fab-IgG TDB 및 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB 분자들의 겉보기 친화도 (apparent affinity)를 결정하였다 (표 13). 1가 Fab로서 4D5와 친화도 약화된 4D5-H91A 변이체 사이의 164-배 차이에도 불구하고, 직접 세포 결합 또는 경쟁 결합 분석으로 측정시 SKBR3 세포에 대한 1Fab-IgG 분자들의 세포-기반 결합 친화도는 비등하였다. SKBR3 세포에서 발현된 HER2에 대한 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB의 겉보기 친화도는 1.5-5 nM 범위였으며, 이는 BIACORE®로 측정한 이의 1가 Fab 친화도에 비해 ~10-배 더 높다. 이러한 결과는 낮은 1가 Fab 친화도가 세포의 맥락에서 HER2에 대한 2가 결합에 의해 매개되는 결합력에 의해 보상될 수 있음을 제시한다. 대조적으로, 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB는 MCF7 또는 cyno HER2-발현 세포들에 대해 실질적인 결합을 나타내지 않았으며 (직접 세포 결합에서 두 가지 모두에 대해 KD >100 nM 그리고 경쟁 결합에서 결합이 탐지되지 않았음), 이는 이들 세포들에서의 보다 낮은 HER2 복제수가 2가 HER2 관여에 충분하지 않음을 제시한다. 결과를 표 13에 요약한다.
표 13. 시노몰구스 원숭이 HER2에 대한 1Fab-IgG TDB의 결합 친화도.
TDB-매개된 표적 세포 사멸에 대한 CD3 결합 친화도의 효과를 또한 평가하였다. 낮은-친화도 40G5c 항-CD3 아암을 가지는 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB (“40G5c 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB”; CD3 KD ~50 nM)를 높은-친화도 38E4v1 항-CD3 아암을 가지는 유사 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB (“38E4v1 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB”; CD3 KD ~1 nM)와 비교하였다. 높은-HER2-발현 표적 세포주 SKBR3을 사용한 시험관내 세포 사멸 분석에서, 40G5c 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB는 표적 세포 사멸에서 38E4v1 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB와 유사한 효능을 나타냈다 (도 37). 대조적으로, 낮은-HER2-발현 표적 세포주 MCF7을 사용한 유사 분석에서, 38E4v1 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB는 매우 적은 세포 사멸 능력을 나타내었던 40G5c 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB 보다 표적 세포 사멸에서 실질적으로 더 강력하였다. 아래 표 14에 요약된 이들 결과는 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB가 높은 수준의 HER2를 발현하는 세포를 선택적으로 사멸시키는 능력을 낮은 항-CD3 결합이 현저히 향상 시킨다는 것을 보여준다.
표 14. 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB-매개된 표적 세포 사멸에 대한 CD3 결합 친화도의 효과
실시예 12. 고 용량의 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB는 HER2-독립 T 세포를 활성화시키지 않는다
Fcγ결합은 Fc-영역에서의 N297G 치환에 의해 TDB들에서 약화되었다. TDB가 고 농도에서 표적-독립성 T 세포 활성화를 유도하지 않음을 확인하기 위하여, Jurkat 리포터 세포주를 사용하였다 (도 38A). HER2 발현 세포들의 존재하에서 리포터 세포들이 TDB로 자극되었을 때 강력한 신호가 탐지되었다. HER2의 부재시 4D5-WT IgG TDB도 4D5 H91A 1Fab-IgG TDB도 T 세포들을 활성화시키지 않았다. 높은 수준의 TDB를 인간 PBMC에 스파이크하였다 (도 38B). 2가 항-CD3 (OKT-3)는 ≥ 10 ng/ml 농도에서 T 세포 활성화를 유도하였던 반면, 100 μg/ml 농도에서는 T 세포 활성화가 탐지되지 않았는데, 이는 TDB 형태가 고 농도에서 HER2-독립성 T 세포 활성화를 유도하지 않음을 나타낸다.
실시예 13. 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB는 제한된 약리학적 활성을 가지며 시노몰구스 원숭이에서 내약성이 우수하다
시노몰구스 원숭이 (cyno) 조직들은 인간 정상 조직들과 유사하게 낮은 수준의 HER2를 발현한다. 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB는 낮은-내지-중간 수준의 cyno-HER2를 발현하는 세포들에 실질적으로 결합하지 않거나 이러한 세포들의 세포자멸을 유도하지 않는다 (표 13). 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB의 내약성을 시험하기 위해, 시노몰구스 원숭이에서 단일 용량 내약성 연구를 설계하여 약력학적 활성 (PD) 및 약동학 (PK)을 연구하였다. 암컷 원숭이들에게 3 mg/kg (N=3) 및 20 mg/kg (N=5) 용량 수준을 저속 정맥내 주입으로 투약하였다. 내약성/PK/PD 판독값에는 임상 관찰, 임상 화학, 혈액학, 사이토카인 및 PK가 포함되었다. 조직병리학은 분석에 포함되지 않았다. 임상 관찰 (체중, 심박수, 온도, 호흡률)에서 시험 품목 관련 변화는 탐지되지 않거나 최소로 탐지되었다. 전형적인 TDB-관련 약리학 및 임상 병리학 반응들 (Bargou 외, Science 2008, 321: 974-977; Lutterbuese 외, Proc. Nat. Acad. Sci. 2010, 107(28): 12605-12610)은 놀랍게도 없었다 (도 38C). C-반응성 단백질 (CRP; 급성기 반응물이자 염증의 표지) 수준은 배경 수준으로 유지되었다. 높은 TDB 용량에도 불구하고 림프구 변연화, 간 효소 (알라닌 및 아스파르테이트 아미노전달효소; ALT 및 AST)의 상승 또는 말초 혈액 사이토카인의 상승은 탐지되지 않았다. 종합하면, 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB는 고 용량 수준에서 내약성이 우수하며 cyno에서 제한된 약리학적 활성을 나타냈다.
TDB 노출은 시험된 용량 수준 및 PK 특성 두 가지 모두에 대해 정상인 것으로 확인되었다 (도 38D). 노출은 거의 용량-비례적이었으며 최종 평가 시점 (14일차)까지 유지되었다. TDB가 cyno에서 불활성화되지 않음을 확인하기 위해, 20 mg/kg의 TDB 투약 후 7일 및 14일차에 수확된 시료들로부터 혈청 분취량을 회수하고, 건강한 공여자 인간 T 세포를 사용하여 시험관내 SKBR3 세포의 사멸을 매개하기 위해 혈청 희석액을 사용하였다 (도 38E). 희석되지 않은 시료들에서 측정된 TDB 혈청 농도는 7일 및 14일차 시료 각각에 대해 193 및 65 μg/mL이었다. 투약 후 14일차 혈청의 100-배 희석액은, 높은 (1 μg/ml) 농도의 새로운 TDB를 사용한 병행 사멸 분석에서 도달된, 전형적으로 활성을 포화시키기에 충분한 최대 활성과 비교시, 유사한 수준의 SKBR3 사멸을 유도하였다. 종합하면, 이 데이터는 정상 cyno 조직에서 낮은 HER2 발현은 낮은 수준의 HER2를 발현하는 정상 조직에 대한 T 세포 활성화 또는 비종양 T 세포 활성을 촉발시키기에 충분하지 않음을 제시한다.
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Gly
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
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Asp Ser Tyr Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr
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<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 4
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 5
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 6
Thr Gln Ser Phe Ile Leu Arg Thr
1 5
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<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asp Ser Tyr Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<220>
<223> Synthetic Construct
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Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
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35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
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Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<223> Synthetic Construct
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
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Ala Arg Asp Ser Tyr Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
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Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
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<220>
<223> Synthetic Construct
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
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Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gln
85 90 95
Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<223> Synthetic Construct
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Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Xaa Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Xaa Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Xaa Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 17
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
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Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic Construct
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<220>
<223> Synthetic Construct
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Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 22
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic Construct
<400> 23
Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 107
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<211> 9
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 26
Gln Gln Ala Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
1 5
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<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 27
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 28
Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Val
1 5 10
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 29
Ser Ala Ser Phe Leu Glu Ser
1 5
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<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 31
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 31
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 32
Trp Gly Gly Ala Gly Ala Tyr Ala Met Asp Val
1 5 10
<210> 33
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 33
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Ala Gly Ala Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 34
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 34
Trp Gly Gly Thr Gly Ala Tyr Ala Met Asp Val
1 5 10
<210> 35
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 35
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
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Arg Ile Tyr Pro Thr Glu Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 37
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 37
Trp Gly Gly Thr Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 38
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 38
Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
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<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 39
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Glu Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ser Arg Trp Gly Gly Thr Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 40
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 40
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<210> 41
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
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Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Glu Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ser Arg Trp Gly Gly Thr Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Thr Thr Pro Pro
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 43
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 43
Trp Gly Gly Thr Gly Phe Tyr Ala Met Asp Val
1 5 10
<210> 44
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 44
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Arg Trp Gly Gly Thr Gly Phe Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 45
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<210> 46
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
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Claims (237)
- 일가 아암 및 이가 아암을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자, 여기서:
(a) 일가 아암은 제 1 항원-결합 모이어티를 포함하고, 여기서 제 1 항원-결합 모이어티의 C-말단은 제 1 Fc 소단위의 N-말단에 융합되고;
(b) 이가 아암은 제 2 항원-결합 모이어티 및 제 3 항원-결합 모이어티를 포함하고, 여기서 제 3 항원-결합 모이어티의 C-말단은 제 2 항원-결합 모이어티의 N-말단에 융합되고, 제 2 항원-결합 모이어티의 C-말단은 제 2 Fc 소단위의 N-말단에 융합되고; 및
(c) 제 1 Fc 소단위는 제 2 Fc 소단위와 결합되어, Fc 도메인을 형성하고,
여기서 제 1 항원-결합 모이어티는 CD3에 특이적으로 결합 할 수 있고, 제 2 항원-결합 모이어티 및 제 3 항원-결합 모이어티는 각각 HER2에 특이적으로 결합 할 수 있음. - 청구항 1에 있어서, 제 2 및 제 3 항원-결합 모이어티가 HER2의 도메인 IV에 결합함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 1 또는 2에 있어서, 제 2 항원-결합 모이어티 및 제 3 항원-결합 모이어티 각각의 1가 결합 친화도 (KD)는 10 nM 내지 100 nM임을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 3에 있어서, 제 2 항원-결합 모이어티 및 제 3 항원-결합 모이어티 각각의 1가 KD는 20 nM 내지 50 nM임을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 1-4 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 항원-결합 모이어티 및/또는 제 3 항원-결합 모이어티의 1가 해리 속도는 10-3/초 내지 10-1/초임을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 5에 있어서, 제 2 항원-결합 모이어티 및 제 3 항원-결합 모이어티 각각의 1가 해리 속도는 10-2/초 내지 30-2/초임을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 1-6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 항원-결합 모이어티의 1가 KD는 10 nM 내지 100 nM임을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 7에 있어서, 제 1 항원-결합 모이어티의 1가 KD는 20 nM 내지 80 nM임을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 8에 있어서, 제 1 항원-결합 모이어티의 1가 KD는 40 nM 내지 60 nM임을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 1-9 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 항원-결합 모이어티의 1가 KD는 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정된, Fab 형식의 제 2 항원-결합 모이어티의 KD이고, 제 3 항원-결합 모이어티의 1가 KD는 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정된, Fab 형식의 제 3 항원-결합 모이어티의 KD임을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 1-10 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 항원-결합 모이어티는 가변 중쇄 (VHA) 영역 및 가변 경쇄 (VLA) 영역을 포함하는 Fab 분자 (FabA)임을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 1-11 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 항원-결합 모이어티는 가변 중쇄 (VHB1) 영역 및 가변 경쇄 (VLB1) 영역을 포함하는 Fab 분자 (FabB1)이고 및/또는 제 3 항원-결합 모이어티는 가변 중쇄 (VHB2) 영역 및 가변 경쇄 (VLB2) 영역을 포함하는 Fab 분자 (FabB2)임을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12에 있어서, 제 1 항원-결합 모이어티는 VHA 영역 및 VLA 영역을 포함하는 FabA이고, 제 2 항원-결합 모이어티는 VHB1 영역 및 VLB1 영역을 포함하는 FabB1이고, 제 3 항원-결합 모이어티는 VHB2 영역 및 VLB2 영역을 포함하는 FabB2임을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-13 중 어느 한 항에 있어서, (a) VHB1 및 VHB2는 95% 이상의 서열 동일성을 공유하거나; (b) VLB1 및 VLB2는 95% 이상의 서열 동일성을 공유하거나; 또는 (c) VHB1 및 VHB2는 95% 이상의 서열 동일성을 공유하고 VLB1 및 VLB2는 95% 이상의 서열 동일성을 공유함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-14 중 어느 한 항에 있어서, VHB1 영역 및/또는 VHB2 영역은 카밧 넘버링 체계에 따라 N54, D98, F100, 및/또는 Y102 중 1, 2, 3, 또는 4개 잔기 모두에서 아미노산 치환을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 15에 있어서, 상기 VHB1 영역 및/또는 VHB2 영역은 카밧 넘버링 체계에 따라 다음 잔기들: N54E, D98A, D98T, F100A, 및/또는 Y102V 중 1, 2, 3, 4, 또는 5개 모두에서 아미노산 치환을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-15 중 어느 한 항에 있어서, VLB1 영역 및/또는 VLB2 영역은 카밧 넘버링 체계에 따라 N30, Y55, 및/또는 H91 중 1, 2, 또는 3개 잔기 모두에서 아미노산 치환을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 17에 있어서, 상기 VLB1 영역 및/또는 VLB2 영역은 다음 잔기들: N30S, Y55E, 및/또는 H91A 중 1, 2, 또는 3개 모두에서 아미노산 치환을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-18 중 어느 한 항에 있어서, VHB1 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(b) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 또는
(c) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. - 청구항 12-19 중 어느 한 항에 있어서, VHB1 영역은 서열 번호: 24에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 20에 있어서, VHB1 영역은 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-21 중 어느 한 항에 있어서, VLB1 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(b) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는
(c) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. - 청구항 12-22 중 어느 한 항에 있어서, VLB1 영역은 서열 번호: 27에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 23에 있어서, VLB1 영역은 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-24 중 어느 한 항에 있어서, VHB1 영역은 다음 HVR들을 포함하고:
(a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(b) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
(c) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
그리고 VLB1은 다음 HVR들을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(e) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(f) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. - 청구항 12-25 중 어느 한 항에 있어서, VHB1 영역은 서열 번호: 24에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 27에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 26에 있어서, VHB1 영역은 서열 번호: 24의 아미노산을 포함하고, 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-27 중 어느 한 항에 있어서, VLB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(b) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는
(c) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. - 청구항 12-28 중 어느 한 항에 있어서, VHB2 영역은 서열 번호: 24에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 29에 있어서, VHB2 영역은 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-30 중 어느 한 항에 있어서, VLB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(b) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는
(c) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. - 청구항 12-31 중 어느 한 항에 있어서, VLB2 영역은 서열 번호: 27에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 32에 있어서, VLB2 영역은 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-33 중 어느 한 항에 있어서, VHB2 영역은 다음 HVR들을 포함하고:
(a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(b) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
(c) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
그리고 VLB2는 다음 HVR들을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(e) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(f) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. - 청구항 12-34 중 어느 한 항에 있어서, VHB2 영역은 서열 번호: 24에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 27에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 35에 있어서, VHB2 영역은 서열 번호: 24의 아미노산을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-36 중 어느 한 항에 있어서, VLB1 영역 및/또는 VLB2 영역은 하나 이상의 경향성 고정 잔기들 (liability fixed residues)을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 37에 있어서, 하나 이상의 경향성 고정 잔기들은 N30S의 아미노산 치환을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-38 중 어느 한 항에 있어서, VHB1 영역 및/또는 VHB2 영역은 하나 이상의 경향성 고정 잔기들을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 39에 있어서, 하나 이상의 경향성 고정 잔기들은 N54E, D98A, 및 D98T로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 아미노산 치환들을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-18 중 어느 한 항에 있어서, VHB1 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(b) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는
(c) 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. - 청구항 12-18 또는 41 중 어느 한 항에 있어서, VHB1 영역은 서열 번호: 33에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 42에 있어서, VHB1 영역은 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-18 또는 41-43 중 어느 한 항에 있어서, VLB1 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(b) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는
(c) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. - 청구항 12-18 또는 41-44 중 어느 한 항에 있어서, VLB1 영역은 서열 번호: 25에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 45에 있어서, VLB1 영역은 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-18 또는 41-46 중 어느 한 항에 있어서, VHB1 영역은 다음 HVR들을 포함하고:
(a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(b) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
(c) 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
그리고 VLB1은 다음 HVR들을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(e) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(f) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. - 청구항 12-18 또는 41-47 중 어느 한 항에 있어서, VHB1 영역은 서열 번호: 33에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 25에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 48에 있어서, VHB1 영역은 서열 번호: 33의 아미노산을 포함하고, 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-18 또는 41-49 중 어느 한 항에 있어서, VHB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(b) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는
(c) 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. - 청구항 12-18 또는 41-50 중 어느 한 항에 있어서, VHB2 영역은 서열 번호: 33에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 51에 있어서, VHB2 영역은 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-18 또는 41-52 중 어느 한 항에 있어서, VLB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(b) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는
(c) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. - 청구항 12-18 또는 41-53 중 어느 한 항에 있어서, VLB2 영역은 서열 번호: 25에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 54에 있어서, VLB2 영역은 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-18 또는 41-55 중 어느 한 항에 있어서, VHB2 영역은 다음 HVR들을 포함하고:
(a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(b) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
(c) 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
그리고 VLB2는 다음 HVR들을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(e) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(f) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. - 청구항 12-18 또는 41-56 중 어느 한 항에 있어서, VHB2 영역은 서열 번호: 33에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 25에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 57에 있어서, VHB2 영역은 서열 번호: 33의 아미노산을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-18 중 어느 한 항에 있어서, VHB1 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 또는
(c) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. - 청구항 12-18 또는 59 중 어느 한 항에 있어서, VHB1 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 60에 있어서, VHB1 영역은 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-18 또는 59-61 중 어느 한 항에 있어서, VLB1 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(b) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 또는
(c) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. - 청구항 12-18 또는 59-62 중 어느 한 항에 있어서, VLB1 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 63에 있어서, VLB1 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-18 또는 59-64 중 어느 한 항에 있어서, VHB1 영역은 다음 HVR들을 포함하고:
(a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
(c) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
그리고 VLB1은 다음 HVR들을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(e) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(f) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. - 청구항 12-18 또는 59-65 중 어느 한 항에 있어서, VHB1 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 66에 있어서, VHB1 영역은 서열 번호: 41의 아미노산을 포함하고, 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-18 또는 59-67 중 어느 한 항에 있어서, VHB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 또는
(c) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. - 청구항 12-18 또는 59-68 중 어느 한 항에 있어서, VHB2 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 69에 있어서, VHB2 영역은 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-18 또는 59-70 중 어느 한 항에 있어서, VLB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(b) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 또는
(c) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. - 청구항 12-18 또는 59-71 중 어느 한 항에 있어서, VLB2 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 72에 있어서, VLB2 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-17 또는 59-73 중 어느 한 항에 있어서, VHB2 영역은 다음 HVR들을 포함하고:
(a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
(c) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
그리고 VLB2는 다음 HVR들을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(e) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(f) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. - 청구항 12-18 또는 59-74 중 어느 한 항에 있어서, VHB2 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 75에 있어서, VHB2 영역은 서열 번호: 41의 아미노산을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-18 중 어느 한 항에 있어서, VHB1 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는
(c) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. - 청구항 12-18 또는 77 중 어느 한 항에 있어서, VHB1 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 78에 있어서, VHB1 영역은 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-18 또는 77-79 중 어느 한 항에 있어서, VLB1 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(b) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는
(c) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. - 청구항 12-18 또는 77-80 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 항원-결합 모이어티의 VL 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 81에 있어서, VLB1 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-18 또는 77-82 중 어느 한 항에 있어서, VHB1 영역은 다음 HVR들을 포함하고:
(a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
(c) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
그리고 VLB1은 다음 HVR들을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(e) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(f) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. - 청구항 12-18 또는 77-83 중 어느 한 항에 있어서, VHB1 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 84에 있어서, VHB1 영역은 서열 번호: 44의 아미노산을 포함하고, 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-18 또는 77-85 중 어느 한 항에 있어서, VHB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는
(c) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. - 청구항 12-18 또는 77-86 중 어느 한 항에 있어서, VHB2 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 87에 있어서, VHB2 영역은 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-18 또는 77-88 중 어느 한 항에 있어서, VLB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(b) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는
(c) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. - 청구항 12-18 또는 77-89 중 어느 한 항에 있어서, VLB2 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 90에 있어서, VLB2 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-18 또는 77-91 중 어느 한 항에 있어서, VHB2 영역은 다음 HVR들을 포함하고:
(a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
(c) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
그리고 VLB2는 다음 HVR들을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(e) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(f) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. - 청구항 12-18 또는 77-92 중 어느 한 항에 있어서, VHB2 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 93에 있어서, VHB2 영역은 서열 번호: 44의 아미노산을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-18 중 어느 한 항에 있어서, VHB1 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는
(c) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. - 청구항 12-18 또는 95 중 어느 한 항에 있어서, VHB1 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 96에 있어서, VHB1 영역은 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-18 또는 95-97 중 어느 한 항에 있어서, VLB1 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(b) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는
(c) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. - 청구항 12-18 또는 95-98 중 어느 한 항에 있어서, VLB1 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 99에 있어서, VLB1 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-18 또는 95-100 중 어느 한 항에 있어서, VHB1 영역은 다음 HVR들을 포함하고:
(a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
(c) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
그리고 VLB1은 다음 HVR들을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(d) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(e) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(f) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. - 청구항 12-18 또는 95-101 중 어느 한 항에 있어서, VHB1 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 102에 있어서, VHB1 영역은 서열 번호: 41의 아미노산을 포함하고, 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-18 또는 95-103 중 어느 한 항에 있어서, VHB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는
(c) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. - 청구항 12-18 또는 95-104 중 어느 한 항에 있어서, VHB2 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 105에 있어서, VHB2 영역은 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-18 또는 95-106 중 어느 한 항에 있어서, VLB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(b) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는
(c) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. - 청구항 12-18 또는 95-107 중 어느 한 항에 있어서, VLB2 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 108에 있어서, VLB2 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-18 또는 95-109 중 어느 한 항에 있어서, VHB2 영역은 다음 HVR들을 포함하고:
(a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
(c) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
그리고 VLB2는 다음 HVR들을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(d) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(e) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(f) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. - 청구항 12-18 또는 95-110 중 어느 한 항에 있어서, VHB2 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 111에 있어서, VHB2 영역은 서열 번호: 41의 아미노산을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-18 중 어느 한 항에 있어서, VHB1 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는
(c) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. - 청구항 12-18 또는 113 중 어느 한 항에 있어서, VHB1 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 114에 있어서, VHB1 영역은 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-18 또는 113-115 중 어느 한 항에 있어서, VLB1 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(b) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는
(c) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. - 청구항 12-18 또는 113-116 중 어느 한 항에 있어서, VLB1 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 117에 있어서, VLB1 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-18 또는 113-118 중 어느 한 항에 있어서, VHB1 영역은 다음 HVR들을 포함하고:
(a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
(c) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
그리고 VLB1은 다음 HVR들을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(d) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(e) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(f) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. - 청구항 12-18 또는 113-119 중 어느 한 항에 있어서, VHB1 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 120에 있어서, VHB1 영역은 서열 번호: 44의 아미노산을 포함하고, 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-18 또는 113-121 중 어느 한 항에 있어서, VHB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 또는
(c) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. - 청구항 12-18 또는 113-122 중 어느 한 항에 있어서, VHB2 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 123에 있어서, VHB2 영역은 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-18 또는 113-124 중 어느 한 항에 있어서, VLB2 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(b) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는
(c) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. - 청구항 12-18 또는 113-125 중 어느 한 항에 있어서, VLB2 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 126에 있어서, VLB2 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 12-18 또는 113-127 중 어느 한 항에 있어서, VHB2 영역은 다음 HVR들을 포함하고:
(a) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
(c) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
그리고 VLB2는 다음 HVR들을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(d) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(e) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(f) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. - 청구항 12-18 또는 113-128 중 어느 한 항에 있어서, VHB2 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 129에 있어서, VHB2 영역은 서열 번호: 41의 아미노산을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 11-130 중 어느 한 항에 있어서, VHA 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(b) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 또는
(c) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3. - 청구항 11-131 중 어느 한 항에 있어서, VHA 영역은 서열 번호: 7에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 132에 있어서, VHA 영역은 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 11-133 중 어느 한 항에 있어서, VLA 영역은 다음 HVR들 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(b) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 또는
(c) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. - 청구항 11-134 중 어느 한 항에 있어서, VLA 영역은 서열 번호: 8에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 135에 있어서, VLA 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 11-136 중 어느 한 항에 있어서, VHA 영역은 다음 HVR들을 포함하고:
(a) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(b) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및
(c) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
그리고 VLA는 다음 HVR들을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자:
(d) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(e) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(f) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. - 청구항 11-137 중 어느 한 항에 있어서, VHA 영역은 서열 번호: 7에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLA 영역은 서열 번호: 8에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 138에 있어서, VHA 영역은 서열 번호: 7의 아미노산을 포함하고, 그리고 VLA 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 일가 아암 및 이가 아암을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자, 여기서:
(a) 일가 아암은 FabA를 포함하고, 여기서 FabA의 C-말단은 제 1 Fc 소단위의 N-말단에 융합되고, FabA는 다음 HVR을 포함하고:
(i) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(ii) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
(iii) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
(iv) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(v) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(vi) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
(b) 이가 아암은 FabB1 및 FabB2를 포함하고, 여기서 FabB2의 C-말단은 FabB1의 N-말단에 융합되고 FabB1의 C-말단은 제 2 Fc 소단위의 N-말단에 융합되고, FabB1 및 FabB2 각각은 다음 HVR을 포함하고:
(i) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(ii) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
(iii) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
(iv) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(v) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(vi) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및
(c) 제 1 Fc 소단위는 제 2 Fc 소단위와 결합되어, Fc 도메인을 형성함. - 청구항 140에 있어서, 다음을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) FabA는 VHA 영역 및 VLA 영역을 포함하고, VHA 영역은 서열 번호: 7에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLA 영역은 서열 번호: 8에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고;
(b) FabB1는 VHB1 영역 및 VLB1 영역을 포함하고, VHB1 영역은 서열 번호: 24에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 27에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(c) FabB2는 VHB2 영역 및 VLB2 영역을 포함하고, VHB2 영역은 서열 번호: 24에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 27에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함. - 청구항 141에 있어서, 다음을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) VHA 영역은 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLA 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하고;
(b) VHB1 영역은 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하고; 및
(c) VHB2 영역은 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함함. - 일가 아암 및 이가 아암을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자, 여기서:
(a) 일가 아암은 FabA를 포함하고, 여기서 FabA의 C-말단은 제 1 Fc 소단위의 N-말단에 융합되고, FabA는 다음 HVR을 포함하고:
(i) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(ii) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
(iii) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
(iv) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(v) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(vi) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
(b) 이가 아암은 FabB1 및 FabB2를 포함하고, 여기서 FabB2의 C-말단은 FabB1의 N-말단에 융합되고 FabB1의 C-말단은 제 2 Fc 소단위의 N-말단에 융합되고, FabB1 및 FabB2 각각은 다음 HVR을 포함하고:
(i) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(ii) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
(iii) 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
(iv) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(v) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(vi) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및
(c) 제 1 Fc 소단위는 제 2 Fc 소단위와 결합되어, Fc 도메인을 형성함. - 청구항 143에 있어서, 다음을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) FabA는 VHA 영역 및 VLA 영역을 포함하고, VHA 영역은 서열 번호: 7에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLA 영역은 서열 번호: 8에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고;
(b) FabB1는 VHB1 영역 및 VLB1 영역을 포함하고, VHB1 영역은 서열 번호: 33에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 25에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(c) FabB2는 VHB2 영역 및 VLB2 영역을 포함하고, VHB2 영역은 서열 번호: 33에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 25에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함. - 청구항 144에 있어서, 다음을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) VHA 영역은 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLA 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하고;
(b) VHB1 영역은 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하고; 및
(c) VHB2 영역은 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함함. - 일가 아암 및 이가 아암을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자, 여기서:
(a) 일가 아암은 FabA를 포함하고, 여기서 FabA의 C-말단은 제 1 Fc 소단위의 N-말단에 융합되고, FabA는 다음 HVR을 포함하고:
(i) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(ii) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
(iii) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
(iv) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(v) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(vi) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
(b) 이가 아암은 FabB1 및 FabB2를 포함하고, 여기서 FabB2의 C-말단은 FabB1의 N-말단에 융합되고 FabB1의 C-말단은 제 2 Fc 소단위의 N-말단에 융합되고, FabB1 및 FabB2 각각은 다음 HVR을 포함하고:
(i) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(ii) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
(iii) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
(iv) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(v) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(vi) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및
(c) 제 1 Fc 소단위는 제 2 Fc 소단위와 결합되어, Fc 도메인을 형성함. - 청구항 146에 있어서, 다음을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) FabA는 VHA 영역 및 VLA 영역을 포함하고, VHA 영역은 서열 번호: 7에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLA 영역은 서열 번호: 8에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고;
(b) FabB1는 VHB1 영역 및 VLB1 영역을 포함하고, VHB1 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(c) FabB2는 VHB2 영역 및 VLB2 영역을 포함하고, VHB2 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함. - 청구항 147에 있어서, 다음을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) VHA 영역은 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLA 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하고;
(b) VHB1 영역은 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하고; 및
(c) VHB2 영역은 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함함. - 일가 아암 및 이가 아암을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자, 여기서:
(a) 일가 아암은 FabA를 포함하고, 여기서 FabA의 C-말단은 제 1 Fc 소단위의 N-말단에 융합되고, FabA는 다음 HVR을 포함하고:
(i) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(ii) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
(iii) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
(iv) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(v) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(vi) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
(b) 이가 아암은 FabB1 및 FabB2를 포함하고, 여기서 FabB2의 C-말단은 FabB1의 N-말단에 융합되고 FabB1의 C-말단은 제 2 Fc 소단위의 N-말단에 융합되고, FabB1 및 FabB2 각각은 다음 HVR을 포함하고:
(i) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(ii) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
(iii) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
(iv) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(v) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(vi) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및
(c) 제 1 Fc 소단위는 제 2 Fc 소단위와 결합되어, Fc 도메인을 형성함. - 청구항 149에 있어서, 다음을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) FabA는 VHA 영역 및 VLA 영역을 포함하고, VHA 영역은 서열 번호: 7에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLA 영역은 서열 번호: 8에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고;
(b) FabB1는 VHB1 영역 및 VLB1 영역을 포함하고, VHB1 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(c) FabB2는 VHB2 영역 및 VLB2 영역을 포함하고, VHB2 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 48에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함. - 청구항 150에 있어서, 다음을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) VHA 영역은 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLA 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하고;
(b) VHB1 영역은 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하고; 및
(c) VHB2 영역은 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함함. - 일가 아암 및 이가 아암을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자, 여기서:
(a) 일가 아암은 FabA를 포함하고, 여기서 FabA의 C-말단은 제 1 Fc 소단위의 N-말단에 융합되고, FabA는 다음 HVR을 포함하고:
(i) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(ii) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
(iii) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
(iv) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(v) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(vi) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
(b) 이가 아암은 FabB1 및 FabB2를 포함하고, 여기서 FabB2의 C-말단은 FabB1의 N-말단에 융합되고 FabB1의 C-말단은 제 2 Fc 소단위의 N-말단에 융합되고, FabB1 및 FabB2 각각은 다음 HVR을 포함하고:
(i) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(ii) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
(iii) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
(iv) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(v) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(vi) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및
(c) 제 1 Fc 소단위는 제 2 Fc 소단위와 결합되어, Fc 도메인을 형성함. - 청구항 152에 있어서, 다음을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) FabA는 VHA 영역 및 VLA 영역을 포함하고, VHA 영역은 서열 번호: 7에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLA 영역은 서열 번호: 8에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고;
(b) FabB1는 VHB1 영역 및 VLB1 영역을 포함하고, VHB1 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(c) FabB2는 VHB2 영역 및 VLB2 영역을 포함하고, VHB2 영역은 서열 번호: 41에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함. - 청구항 153에 있어서, 다음을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) VHA 영역은 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLA 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하고;
(b) VHB1 영역은 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함하고; 및
(c) VHB2 영역은 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함함. - 일가 아암 및 이가 아암을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자, 여기서:
(a) 일가 아암은 FabA를 포함하고, 여기서 FabA의 C-말단은 제 1 Fc 소단위의 N-말단에 융합되고, FabA는 다음 HVR을 포함하고:
(i) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(ii) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
(iii) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
(iv) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(v) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(vi) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
(b) 이가 아암은 FabB1 및 FabB2를 포함하고, 여기서 FabB2의 C-말단은 FabB1의 N-말단에 융합되고 FabB1의 C-말단은 제 2 Fc 소단위의 N-말단에 융합되고, FabB1 및 FabB2 각각은 다음 HVR을 포함하고:
(i) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
(ii) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
(iii) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
(iv) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
(v) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
(vi) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및
(c) 제 1 Fc 소단위는 제 2 Fc 소단위와 결합되어, Fc 도메인을 형성함. - 청구항 155에 있어서, 다음을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) FabA는 VHA 영역 및 VLA 영역을 포함하고, VHA 영역은 서열 번호: 7에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLA 영역은 서열 번호: 8에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고;
(b) FabB1는 VHB1 영역 및 VLB1 영역을 포함하고, VHB1 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 및
(c) FabB2는 VHB2 영역 및 VLB2 영역을 포함하고, VHB2 영역은 서열 번호: 44에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 49에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함. - 청구항 156에 있어서, 다음을 특징으로 하는 이중특이적 항원-결합 분자:
(a) VHA 영역은 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLA 영역은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하고;
(b) VHB1 영역은 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB1 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함하고; 및
(c) VHB2 영역은 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 VLB2 영역은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함함. - 청구항 1-157 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인은 IgG Fc 도메인임을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 158에 있어서, IgG Fc 도메인은 IgG1 또는 IgG4 Fc 도메인임을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 1-159 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인은 인간 Fc 도메인임을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 1-160 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인은 Fc 수용체 및/또는 효과기 기능에 대한 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 161에 있어서, Fc 수용체 및/또는 효과기 기능에 대한 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환은 N297에 존재함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 162에 있어서, 제 1 Fc 소단위 및 제 2 Fc 소단위 각각은 N297G의 아미노산 치환을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 161-163 중 어느 한 항에 있어서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체임을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 161-164 중 어느 한 항에 있어서, 효과기 기능은 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)임을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 1-165 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인은 제 1 Fc 소단위와 제 2 Fc 소단위의 결합을 촉진시키도록 구성된 변형을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 166에 있어서, 제 2 Fc 소단위의 CH3 도메인 내 아미노산 잔기가 보다 큰 측쇄 부피를 가지는 아미노산 잔기로 대체되어 제 2 Fc 소단위의 CH3 도메인 내부에 돌기를 생성하고, 이는 제 1 Fc 소단위의 CH3 도메인 내부 공동에 위치가능하며, 제 1 Fc 소단위의 CH3 도메인 내 아미노산 잔기는 보다 작은 측쇄 부피를 가지는 아미노산 잔기로 대체되어, 제 1 Fc 소단위의 CH3 도메인 내부에 공동을 생성하고, 이 공동 내부에 제 2 Fc 소단위의 CH3 도메인 내부의 돌기가 이 공동 내부에 위치가능함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 167에 있어서, 제 2 Fc 소단위의 CH3 도메인은 T366의 아미노산 치환을 포함하고, 제 1 Fc 소단위의 CH3 도메인은 T366, L368, 및/또는 Y407 중 1, 2, 또는 3개 모두에서 아미노산 치환을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 168에 있어서, 제 2 Fc 소단위의 CH3 도메인은 T366W의 아미노산 치환을 포함하고, 제 1 Fc 소단위의 CH3 도메인은 T366S, L368A, 및/또는 Y407V 중 1, 2, 또는 3개 모두의 아미노산 치환을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 1-169 중 어느 한 항에 있어서, 제 3 항원-결합 모이어티의 C-말단은 펩티드 링커에 의해 제 2 항원-결합 모이어티의 N-말단에 융합됨을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 170에 있어서, 펩티드 링커는 5 내지 20 아미노산 길이임을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 171에 있어서, 펩티드 링커는 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 172에 있어서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 53에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 173에 있어서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 57, 61, 81, 83, 85, 및 87 중 어느 하나에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 174에 있어서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 57, 61, 81, 83, 85, 및 87 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 175에 있어서, 펩티드 링커는 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 176에 있어서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 56에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 177에 있어서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 58, 62, 82, 84, 86, 및 88 중 어느 하나에 95% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 178에 있어서, 항원-결합 분자는 서열 번호: 58, 62, 82, 84, 86, 및 88 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 1-179 중 어느 한 항의 이중특이적 항원-결합 분자를 인코드하는 단리된 핵산.
- 청구항 180의 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
- 청구항 180의 단리된 핵산 또는 청구항 181의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 청구항 182에 있어서, 숙주 세포는 포유동물 세포임을 특징으로 하는, 숙주 세포.
- 청구항 183에 있어서, 상기 포유동물 세포는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포임을 특징으로 하는, 숙주 세포.
- 청구항 184에 있어서, 숙주 세포는 원핵 세포임을 특징으로 하는, 숙주 세포.
- 청구항 185에 있어서, 원핵 세포는 대장균 세포임을 특징으로 하는, 숙주 세포.
- 청구항 182-186 중 어느 한 항의 숙주 세포를 배양 배지에서 배양하는 것을 포함하는 청구항 1-179 중 어느 한 항의 이중특이적 항원-결합 분자 제조 방법.
- 청구항 187에 있어서, 상기 방법은 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 상기 이중특이적 항원-결합 분자 를 회수하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 청구항 1-179 중 어느 한 항의 이중특이적 항원-결합 분자를 인코드하는 단리된 핵산들의 세트.
- 각 벡터가 청구항 189의 단리된 핵산들의 세트의 단리된 핵산을 포함하는, 벡터들의 세트.
- 각 숙주 세포가 청구항 189의 단리된 핵산들의 세트의 단리된 핵산 또는 청구항 190의 벡터들의 세트의 벡터를 포함하는, 숙주 세포들의 세트.
- 청구항 191에 있어서, 숙주 세포는 포유동물 세포를 포함함을 특징으로 하는, 숙주 세포들의 세트.
- 청구항 192에 있어서, 포유동물 세포는 CHO 세포임을 특징으로 하는, 숙주 세포들의 세트.
- 청구항 191에 있어서, 숙주 세포는 원핵 세포를 포함함을 특징으로 하는, 숙주 세포들의 세트.
- 청구항 194에 있어서, 원핵 세포는 대장균 세포임을 특징으로 하는, 숙주 세포들의 세트.
- 청구항 191-195 중 어느 한 항의 숙주 세포들의 세트를 배양 배지에서 배양하는 것을 포함하는 청구항 1-179 중 어느 한 항의 이중특이적 항원-결합 분자의 제조 방법.
- 청구항 196에 있어서, 상기 방법은 숙주 세포들의 세트 또는 배양 배지로부터 상기 이중특이적 항원-결합 분자 를 회수하는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 1-179 중 어느 한 항의 이중특이적 항원-결합 분자 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체.
- 청구항 1-179 중 어느 한 항의 이중특이적 항원-결합 분자 를 포함하는 조성물.
- 청구항 199에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 희석제를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 조성물.
- 청구항 199 또는 200에 있어서, 조성물은 약학 조성물임을 특징으로 하는, 조성물.
- 청구항 199-201 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 PD-1 축 결합 길항제 또는 추가 치료제를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 조성물.
- 청구항 1-179 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용됨을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 1-179 중 어느 한 항에 있어서, 필요로 하는 대상체에서 HER2-양성 암을 치료 또는 이의 진행을 지연함에 사용됨을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 1-179 중 어느 한 항에 있어서, HER2-양성 암 대상체의 면역 기능을 향상시킴에 사용됨을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 205에 있어서, HER2-양성 암은 유방암, 위암, 결장직장암, 비-소 세포 폐암, 신장암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 간암, 두경부암, 흑색종, 난소암, 중피종, 교모세포종, 자궁내막암, 및 골육종으로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- 청구항 204-206 중 어느 한 항에 있어서, HER2-양성 암은 세포 당 200,000 이상 복사체의 평균 복제수로 HER2를 발현하는 종양 세포로 특징되는, 이중특이적 항원-결합 분자.
- HER2-양성 암을 치료 또는 이의 진행을 지연하기 위한 약제의 제조에 있어서의, 청구항 1-179 중 어느 한 항의 이중특이적 항원-결합 분자의 용도.
- HER2-양성 암 대상체에서 면역 기능을 향상시키기 위한 약제의 제조에 있어서의, 청구항 1-179 중 어느 한 항의 이중특이적 항원-결합 분자의 용도.
- 청구항 208 또는 209에 있어서, HER2-양성 암은 유방암, 위암, 결장직장암, 비-소 세포 폐암, 신장암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 간암, 두경부암, 흑색종, 난소암, 중피종, 교모세포종, 자궁내막암, 및 골육종으로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는, 용도.
- 청구항 208-210 중 어느 한 항에 있어서, HER2-양성 암은 세포 당 200,000 이상 복사체의 평균 복제수로 HER2를 발현하는 종양 세포로 특징되는, 용도.
- 청구항 1-179 중 어느 한 항의 이중특이적 항원-결합 분자를 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 필요로 하는 대상체에서 HER2-양성 암을 치료 또는 이의 진행을 지연시키는 방법.
- 청구항 1-179 중 어느 한 항의 이중특이적 항원-결합 분자를 대상체에 투여하는 것을 포함하는, HER2-양성 암 대상체에서 면역 기능을 향상시키는 방법.
- 청구항 212 또는 213에 있어서, HER2-양성 암은 유방암, 위암, 결장직장암, 비-소 세포 폐암, 신장암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 간암, 두경부암, 흑색종, 난소암, 중피종, 교모세포종, 자궁내막암, 및 골육종으로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 212-214 중 어느 한 항에 있어서, HER2-양성 암은 세포 당 200,000 이상 복사체의 평균 복제수로 HER2를 발현하는 종양 세포로 특징되는, 방법.
- 다음 단계를 포함하는, 필요로 하는 대상체에서 HER2-양성 암을 치료 또는 이의 진행을 지연시키는 방법:
(a) 종양 세포 상의 HER2 발현을 결정하는 단계, 여기서 종양 세포는 세포 당 200,000 이상 복사체의 평균 복제수로 HER2를 발현하고; 그리고
(b) 청구항 1-179 중 어느 한 항의 이중특이적 항원-결합 분자를 대상체에 투여하는 단계. - 다음 단계를 포함하는, HER2-양성 암 대상체에서 면역 기능을 향상시키는 방법:
(a) 종양 세포 상의 HER2 발현을 결정하는 단계, 여기서 종양 세포는 세포 당 200,000 이상 복사체의 평균 복제수로 HER2를 발현하고; 그리고
(b) 청구항 1-179 중 어느 한 항의 이중특이적 항원-결합 분자를 대상체에 투여하는 단계. - 청구항 216 또는 217에 있어서, HER2-양성 암은 유방암, 위암, 결장직장암, 비-소 세포 폐암, 신장암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 간암, 두경부암, 흑색종, 난소암, 중피종, 교모세포종, 자궁내막암, 및 골육종으로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 212-218 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항원-결합 분자는 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 용량으로 대상체에 투여됨을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 219에 있어서, 이중특이적 항원-결합 분자는 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 용량으로 대상체에 투여됨을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 220에 있어서, 이중특이적 항원-결합 분자는 약 1 mg/kg 용량으로 대상체에 투여됨을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 212-221 중 어느 한 항에 있어서, PD-1 축 결합 길항제 및/또는 추가 치료제를 대상체에 투여하는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 222에 있어서, PD-1 축 결합 길항제 또는 추가 치료제는 이중특이적 항원-결합 분자의 투여에 앞서 또는 후속하여 투여됨을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 222에 있어서, PD-1 축 결합 길항제 또는 추가 치료제는 이중특이적 항원-결합 분자와 동시에 투여됨을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 212-224 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PD-1 축 결합 길항제는 PD-L1 결합 길항제, PD-1 결합 길항제, 및 PD-L2 결합 길항제로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 225에 있어서, 상기 PD-1 축 결합 길항제는 PD-L1 결합 길항제임을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 226에 있어서, PD-L1 결합 길항제는 MPDL3280A (아테졸리주맙), YW243.55.S70, MDX-1105, MEDI4736 (더발루맙), 및 MSB0010718C (아벨루맙)으로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 225에 있어서, PD-1 축 결합 길항제는 PD-1 결합 길항제임을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 228에 있어서, PD-1 결합 길항제는 MDX-1106 (니볼루맙), MK-3475 (펨브롤리주맙), MEDI-0680 (AMP-514), PDR001 (스파르탈리주맙), REGN2810 (세미플리맙), 및 BGB-108로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 225에 있어서, 상기 PD-1 축 결합 길항제는 PD-L2 결합 길항제임을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 230에 있어서, PD-L2 결합 길항제는 항체 또는 면역부착소임을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 212-231 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항원-결합 분자는 피하, 정맥내, 근육내, 국부, 경구, 경피, 복강내, 안와내, 이식에 의해, 흡입에 의해, 척수강내, 심실내 (intraventricularly), 또는 비강내로 투여됨을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 232에 있어서, 이중특이적 항원-결합 분자는 피하 투여됨을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 232에 있어서, 이중특이적 항원-결합 분자는 정맥내 투여됨을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 212-234 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간임을 특징으로 하는, 방법.
- 다음을 포함하는 키트:
(a) 청구항 199-202 중 어느 한 항의 조성물; 및
(b) HER2-양성 암을 치료 또는 이의 진행을 지연시키기 위해 대상체에 상기 조성물을 투여하기 위한 지침을 포함하는 패키지 삽입물. - 청구항 236에 있어서, HER2-양성 암은 세포 당 200,000 이상 복사체의 평균 복제수로 HER2를 발현하는 종양 세포로 특징되는, 키트.
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