KR20150122203A - T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일반적으로 T 세포 활성화 및 구체적 표적 세포로의 방향 전환을 위한 신규 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 제조하는 방법, 및 질환의 치료에 이들 이중특이적 항원 결합 분자를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자{BISPECIFIC T CELL ACTIVATING ANTIGEN BINDING MOLECULES}
본 발명은 일반적으로 T 세포를 활성화시키는 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 제조하는 방법, 및 질환의 치료에 있어서 이들 이중특이적 항원 결합 분자를 사용하는 방법에 관한 것이다.
개별 세포 또는 구체적 세포 유형의 선택적 파괴는 종종 다양한 임상적 환경에서 바람직하다. 예를 들면, 건강한 세포 및 조직을 온전하고 손상되지 않은 상태로 남기면서 종양 세포를 특이적으로 파괴하는 것이 암 치료의 일차 목적이다.
이것을 달성하는 흥미로운 방법은 종양에 대한 면역 반응을 유도함으로써 면역 효과기(effector) 세포, 예컨대, 자연 살해(NK) 세포 또는 세포독성 T 림프구(CTL) 공격을 유발하고 종양 세포를 파괴하는 것이다. CTL은 면역 시스템의 가장 강력한 효과기 세포를 구성하지만, 이들은 통상적인 치료 항체의 Fc 도메인에 의해 매개되는 효과기 기작에 의해 활성화될 수 없다.
이와 관련하여, 한 "아암(arm)"으로 표적 세포 상의 표면 항원에 결합하고 제2 "아암"으로 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 활성화 불변 성분에 결합하도록 설계된 이중특이적 항체가 최근에 관심을 끌고 있다. 이러한 항체와 이의 표적 둘다의 동시적인 결합은 표적 세포와 T 세포 사이의 일시적인 상호작용을 발생시켜, 임의의 세포독성 T 세포의 활성화 및 표적 세포의 후속 용해를 야기할 것이다. 따라서, 면역 반응은 표적 세포로 방향 전환되고, CTL의 일반적인 MHC-제한된 활성화와 관련될 표적 세포에 의한 펩티드 항원 제시 또는 T 세포의 특이성과 무관하다. 이와 관련하여, 표적 세포가 이중특이적 항체를 CTL에 제시할 때, 즉 면역학적 시냅시스가 모방될 때에만 CTL이 활성화된다는 것은 매우 중요하다. 표적 세포의 효율적인 용해를 이끌어내기 위해 림프구 예비컨디셔닝(preconditioning) 또는 보조자극을 요구하지 않는 이중특이적 항체가 특히 바람직하다.
여러 이중특이적 항체 포맷이 개발되었고, T 세포-매개된 면역치료에 대한 이들의 적합성이 연구되었다. 이들 중에서 소위 BiTE(이중특이적 T 세포 개입유발자(engager)) 분자는 매우 잘 특징규명되어 있고 이미 임상에서 일부 가능성을 보여주었다(문헌[Nagorsen and Bauerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)]에서 검토됨). BiTE는 2개의 scFv 분자가 유연성 연결자에 의해 융합되어 있는 탠덤(tandem) scFv 분자이다. T 세포 개입에 대해 평가되는 추가적 이중특이적 포맷은 다이아바디(문헌[Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996)]) 및 이의 유도체, 예컨대, 탠덤 다이아바디(문헌[Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-66 (1999)])를 포함한다. 보다 최근의 개발은 다이아바디 포맷에 근거하지만 추가적 안정화를 위한 C-말단 다이설파이드 가교를 특징으로 하는 소위 DART(이중 친화성 재표적화) 분자이다(문헌[Moore et al., Blood 117, 4542-51 (2011)]). 전체 하이브리드 마우스/래트 IgG 분자이고 현재 임상 시험에서 평가되고 있는 소위 트라이오맙(triomab)은 보다 큰 크기의 포맷을 대표한다(문헌[Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)]에서 검토됨).
개발되고 있는 다양한 포맷은 면역치료에서 T 세포 방향 전환 및 활성화에 기인하는 큰 잠재력을 보여준다. 그러나, 그에 적합한 이중특이적 항체를 발생시키는 작업은 결코 쉽지 않고 항체의 효능, 독성, 적용가능성 및 제조가능성과 관련되어 충족되어야 하는 다수의 과제를 수반한다.
작은 구축물, 예컨대, BiTE 분자는 효과기와 표적 세포를 효율적으로 가교결합시킬 수 있지만 매우 짧은 혈청 반감기를 가지므로, 연속 주입에 의해 환자에게 투여될 것을 필요로 한다. 다른 한편으로, IgG-유사 포맷은 긴 반감기라는 큰 이점을 갖지만 IgG 분자에 내재하는 천연 효과기 기능과 관련된 독성을 갖는다. 이들의 면역원성 잠재력은 성공적인 치료제 개발에 있어서 IgG-유사 이중특이적 항체, 특히 비인간 포맷의 또다른 불리한 특징을 구성한다. 마지막으로, 이중특이적 항체의 일반적인 개발에 있어서 주요 과제는 이중특이적 항체 구축물을 임상적으로 충분한 양 및 순도로 제조하는 것인데, 이는 정확히 조립된 구축물의 수율을 감소시키고 원하는 이중특이적 항체를 분리하기 어려울 수 있는 다수의 비기능성 부생성물을 초래하는, 공발현(co-expression)시 상이한 특이성의 항체 중쇄와 경쇄의 미스페어링(mispairing) 때문이다.
T 세포-매개된 면역치료를 위해 현재 사용가능한 이중특이적 항체와 관련된 어려움 및 단점이 존재하는 한, 이러한 분자의 신규 개선된 포맷에 대한 필요성이 남아있다. 본 발명은 낮은 독성 및 유리한 약동학적 성질과 함께 우수한 효능 및 제조가능성을 겸비하는, T 세포 활성화 및 방향 전환을 위해 설계된 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
제1 양태에서, 제1 항원 결합 모이어티 및 제2 항원 결합 모이어티, 및 안정한 결합을 형성할 수 있는 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛으로 구성된 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자로서, 상기 제1 항원 결합 모이어티 및 제2 항원 결합 모이어티 중 하나가 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고, 나머지 하나가 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고; 상기 제1 항원 결합 모이어티가 (a) Fab 경쇄와 Fab 중쇄가 펩티드 연결자에 의해 연결되어 있는 단일 쇄 Fab 분자, 또는 (b) Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교환되어 있는 교차 Fab 분자인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
특정 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이하의 항원 결합 모이어티는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 존재한다(즉, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 활성화 T 세포 항원에 대한 1가 결합을 제공함). 특정 실시양태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 교차 Fab 분자이다. 보다 더 특정한 실시양태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 불변 영역이 교환되어 있는 교차 Fab 분자이다.
일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 제1 항원 결합 모이어티 및 제2 항원 결합 모이어티는 임의적으로 펩티드 연결자를 통해 서로 융합되어 있다. 하나의 이러한 실시양태에서, 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있다. 또다른 이러한 실시양태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있다. 또다른 이러한 실시양태에서, 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 경쇄의 C-말단에서 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄의 N-말단에 융합되어 있다. 제1 항원 결합 모이어티가 교차 Fab 분자이고, (i) 제2 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있거나 (ii) 제1 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C-말단에서 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있는 실시양태에서, 추가적으로 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 및 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄는 임의적으로 펩티드 연결자를 통해 서로 융합될 수 있다.
한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 서브유닛 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다. 또다른 실시양태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 서브유닛 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다.
한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 제1 항원 결합 모이어티 및 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 각각 융합되어 있다.
특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제3 항원 결합 모이어티를 포함한다. 하나의 이러한 실시양태에서, 제3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 서브유닛 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다. 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 항원 결합 분자의 제2 결합 모이어티 및 제3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 각각 융합되어 있고, 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있다. 또다른 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 항원 결합 분자의 제1 항원 결합 모이어티 및 제3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 각각 융합되어 있고, 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 구성성분은 직접 또는 적합한 펩티드 연결자를 통해 융합될 수 있다. 한 실시양태에서, 제2 결합 모이어티, 제3 항원 결합 모이어티 및 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 일부이다.
특정 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인이다. 특정 실시양태에서, Fc 도메인은 인간 IgG4 Fc 도메인이다.
특정 실시양태에서, Fc 도메인은 제1 Fc 도메인 서브유닛 및 제2 Fc 도메인 서브유닛의 결합을 촉진시키는 변경을 포함한다. 구체적인 이러한 실시양태에서, Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기는 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환됨으로써, 돌출부(protuberance)를 제2 서브유닛의 CH3 도메인 내의 캐비티(cavity)에 위치할 수 있는 제1 서브유닛의 CH3 도메인 내에서 발생시키고, Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기는 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환됨으로써, 캐비티를 제1 서브유닛의 CH3 도메인 내의 돌출부가 위치할 수 있는 제2 서브유닛의 CH3 도메인 내에서 발생시킨다.
특정 실시양태에서, Fc 도메인은 천연 IgG4 Fc 도메인에 비해 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 조작되지 않은 Fc 도메인과 비교하여 Fc 도메인은 조작되어 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 갖는다. 한 실시양태에서, Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 Fc 도메인 내의 하나 이상의 아미노산 치환은 L235, S228 및 P329(카바트(Kabat) 넘버링)의 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 존재한다. 한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 아미노산 치환 L235E 및 S228P(SPLE)를 포함한다. 한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 아미노산 치환 L235E, S228P 및 P329G를 포함한다.
한 실시양태에서, Fc 수용체에 대한 결합은 감소되고, 이러한 Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 한 실시양태에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 한 실시양태에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체 이다. 구체적 실시양태에서, Fc 수용체는 인간 FcγRIIa, FcγRI 및/또는 FcγRIIIa이다. 한 실시양태에서, 효과기 기능은 항체 의존적 세포-매개된 세포독성(ADCC)이다.
특정 실시양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자가 결합할 수 있는 활성화 T 세포 항원은 CD3이다. 다른 실시양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자가 결합할 수 있는 표적 세포 항원은 종양 세포 항원이다. 한 실시양태에서, 표적 세포 항원은 흑색종 관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP), 표피 성장인자 수용체(EGFR), 암배아 항원(CEA), 섬유모세포 활성화 단백질(FAP), CD19, CD20 및 CD33으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또다른 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 항원 결합 모이어티, MCSP에 결합할 수 있는 제2 항원 결합 모이어티, 및 IgG4 Fc 도메인을 포함한다. 하나의 이러한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 서열번호 278, 319, 369 및 370의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 278, 319, 371 및 372의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 또다른 양태에 따라, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 또한, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드를 포함한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 백터, 및 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 특히 포유동물 세포이다.
또다른 양태에서, a) T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건하에 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 b) T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 제조 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 추가로 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 약학 조성물의 사용 방법을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 약학 조성물을 제공한다. 한 양태에서, 질환의 치료가 필요한 개체를 치료하기 위한 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 약학 조성물이 제공된다. 구체적 실시양태에서, 질환은 암이다.
또한, 질환의 치료가 필요한 개체의 질환의 치료를 위한 약제를 제조하기 위한 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 용도; 뿐만 아니라 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 약학적으로 허용되는 형태로 포함하는 조성물의 치료 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 구체적 실시양태에서. 질환은 암이다. 임의의 상기 실시양태에서, 개체는 바람직하게 포유동물, 특히 인간이다.
또한, 본 발명은 T 세포, 특히 세포독성 T 세포의 존재하에 표적 세포를 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 접촉시키는 단계를 포함하는, 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법을 제공한다.
도 1a 및 1b는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 예시적 입체구조를 보여준다. (A)는 "1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab" 분자의 실례를 보여주고, (B)는 "도립된 1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab" 분자의 실례를 보여준다. "1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab" 분자에서, T 세포 표적화 Fab의 경쇄는 연결자에 의해 중쇄에 융합되어 있는 반면, "도립된 1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab" 분자는 종양 표적화 Fab에서 연결자를 갖는다. (C)는 "2+1 IgG scFab" 분자의 실례를 보여준다. (D)는 "1+1 IgG scFab" 분자의 실례를 보여준다. (E)는 "1+1 IgG 교차fab" 분자의 실례를 보여준다. (F)는 "2+1 IgG 교차fab" 분자의 실례를 보여준다. (G)는 교차fab 및 Fab 구성성분을 교대로 갖는 ("도립된") "2+1 IgG 교차fab" 분자의 실례를 보여준다. (H)는 "1+1 IgG 교차fab 경쇄(LC) 융합체" 분자의 실례를 보여준다. (I)는 "1+1 교차Mab" 분자의 실례를 보여준다. (J)는 "2+1 IgG 교차fab, 연결된 경쇄" 분자의 실례를 보여준다. (K)는 "1+1 IgG 교차fab, 연결된 경쇄" 분자의 실례를 보여준다. (L)은 "도립된 2+1 IgG 교차fab, 연결된 경쇄" 분자의 실례를 보여준다. (M)은 "도립된 1+1 IgG 교차fab, 연결된 경쇄" 분자의 실례를 보여준다. 흑색 점: 이종이량체화를 촉진하는 Fc 도메인 내의 임의적 변경.
도 2는 비환원된(A) 및 환원된(B) "1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab"(항-MCSP/항-huCD3)(서열번호 1, 3 및 5 참조), 및 비환원된(C) 및 환원된(D) "도립된 1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab"(항-MCSP/항-huCD3)(서열번호 7, 9 및 11 참조)의 SDS-PAGE(4 내지 12% 비스/트리스, 누페이지 인비트로겐(NuPage Invitrogen), 쿠마시(Coomassie) 염색됨)를 보여준다.
도 3은 "1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab"(항-MCSP/항-huCD3)(서열번호 1, 3 및 5 참조)(A) 및 "도립된 1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab"(항-MCSP/항-huCD3)(서열번호 7, 9 및 11 참조)(B)의 분석 크기 배제 크로마토그래피(수퍼덱스 200 10/300 GL 지이 헬쓰케어(GE Healthcare); 2 mM MOPS(pH 7.3), 150 mM NaCl, 0.02%(w/v) NaCl; 주입된 50 ㎍ 샘플)를 보여준다.
도 4는 비환원된(A) 및 환원된(B) "1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab"(항-EGFR/항-huCD3)(서열번호 43, 45 및 57 참조), 및 비환원된(C) 및 환원된(D) "도립된 1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab"(항-EGFR/항-huCD3)(서열번호 11, 49 및 51 참조)의 SDS-PAGE(4 내지 12% 비스/트리스, 누페이지 인비트로겐, 쿠마시 염색됨)를 보여준다.
도 5는 "1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab"(항-EGFR/항-huCD3)(서열번호 43, 45 및 47 참조)(A) 및 "도립된 1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab"(항-EGFR/항-huCD3)(서열번호 11, 49 및 51 참조)(B)의 분석 크기 배제 크로마토그래피(수퍼덱스 200 10/300 GL 지이 헬쓰케어; 2 mM MOPS(pH 7.3), 150 mM NaCl, 0.02%(w/v) NaCl; 주입된 50 ㎍ 샘플)를 보여준다.
도 6의 (A) 및 (B)는 비환원된(A) 및 환원된(B) "도립된 1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab"(항-FAP/항-huCD3)(서열번호 11, 51 및 55 참조)의 SDS-PAGE(4 내지 12% 비스/트리스, 누페이지 인비트로겐, 쿠마시 염색됨)를 보여준다. (C)는 "도립된 1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab"(항-FAP/항-huCD3)의 분석 크기 배제 크로마토그래피(수퍼덱스 200 10/300 GL 지이 헬쓰케어; 2 mM MOPS(pH 7.3), 150 mM NaCl, 0.02%(w/v) NaCl; 주입된 50 ㎍ 샘플)를 보여준다.
도 7은 (A) 비환원된(레인 2) 및 환원된(레인 3) "2+1 IgG scFab, P329G LALA"(항-MCSP/항-huCD3)(서열번호 5, 21 및 23 참조); (B) 비환원된(레인 2) 및 환원된(레인 3) "2+1 IgG scFab, LALA"(항-MCSP/항-huCD3)(서열번호 5, 17 및 19 참조); (C) 비환원된(레인 2) 및 환원된(레인 3) "2+1 IgG scFab, wt"(항-MCSP/항-huCD3)(서열번호 5, 13 및 15 참조); 및 (D) 비환원된(레인 2) 및 환원된(레인 3) "2+1 IgG scFab, P329G LALA N297D"(항-MCSP/항-huCD3)(서열번호 5, 25 및 27 참조)의 SDS-PAGE(4 내지 12% 비스/트리스, 누페이지 인비트로겐, 쿠마시 염색됨)를 보여준다.
도 8a 및 8b는 (A) "2+1 IgG scFab, P329G LALA"(항-MCSP/항-huCD3)(서열번호 5, 21 및 23 참조); (B) "2+1 IgG scFab, LALA"(항-MCSP/항-huCD3)(서열번호 5, 17 및 19 참조); (C) "2+1 IgG scFab, wt"(항-MCSP/항-huCD3)(서열번호 5, 13 및 15 참조); 및 (D) "2+1 IgG scFab, P329G LALA N297D"(항-MCSP/항-huCD3)(서열번호 5, 25 및 27 참조)의 분석 크기 배제 크로마토그래피(수퍼덱스 200 10/300 GL 지이 헬쓰케어; 2 mM MOPS(pH 7.3), 150 mM NaCl, 0.02%(w/v) NaCl; 주입된 50 ㎍ 샘플)를 보여준다.
도 9의 (A) 및 (B)는 비환원된(A) 및 환원된(B) "2+1 IgG scFab, P329G LALA"(항-EGFR/항-huCD3)(서열번호 45, 47 및 53 참조)의 SDS-PAGE(4 내지 12% 비스/트리스, 누페이지 인비트로겐, 쿠마시 염색됨)를 보여준다. (C)는 "2+1 IgG scFab, P329G LALA"(항-EGFR/항-huCD3)의 분석 크기 배제 크로마토그래피(수퍼덱스 200 10/300 GL 지이 헬쓰케어; 2 mM MOPS(pH 7.3), 150 mM NaCl, 0.02%(w/v) NaCl; 주입된 50 ㎍ 샘플)를 보여준다.
도 10의 (A) 및 (B)는 비환원된(A) 및 환원된(B) "2+1 IgG scFab, P329G LALA"(항-FAP/항-huCD3)(서열번호 57, 59 및 61 참조)의 SDS-PAGE(4 내지 12% 비스/트리스, 누페이지 인비트로겐, 쿠마시 염색됨)를 보여준다. (C)는 "2+1 IgG scFab, P329G LALA"(항-FAP/항-huCD3)의 분석 크기 배제 크로마토그래피(수퍼덱스 200 10/300 GL 지이 헬쓰케어; 2 mM MOPS(pH 7.3), 150 mM NaCl, 0.02%(w/v) NaCl; 주입된 50 ㎍ 샘플)를 보여준다.
도 11의 (A) 및 (B)는 비환원된(A) 및 환원된(B) "1+1 IgG 교차fab, Fc(홀(hole)) P329G LALA/Fc(놉(knob)) wt"(항-MCSP/항-huCD3)(서열번호 5, 29, 31 및 33 참조)의 SDS-PAGE(4 내지 12% 트리스-아세테이트(A) 또는 4 내지 12% 비스/트리스(B), 누페이지 인비트로겐, 쿠마시 염색됨)를 보여준다. (C)는 "1+1 IgG 교차fab, Fc(홀) P329G LALA/Fc(놉) wt"(항-MCSP/항-huCD3)의 분석 크기 배제 크로마토그래피(수퍼덱스 200 10/300 GL 지이 헬쓰케어; 2 mM MOPS(pH 7.3), 150 mM NaCl, 0.02%(w/v) NaCl; 주입된 50 ㎍ 샘플)를 보여준다.
도 12의 (A) 및 (B)는 비환원된(A) 및 환원된(B) "2+1 IgG 교차fab"(항-MCSP/항-huCD3)(서열번호 3, 5, 29 및 33 참조)의 SDS-PAGE(4 내지 12% 비스/트리스, 누페이지 인비트로겐, 쿠마시 염색됨)를 보여준다. (C)는 "2+1 IgG 교차fab"(항-MCSP/항-huCD3)의 분석 크기 배제 크로마토그래피(수퍼덱스 200 10/300 GL 지이 헬쓰케어; 2 mM MOPS(pH 7.3), 150 mM NaCl, 0.02%(w/v) NaCl; 주입된 50 ㎍ 샘플)를 보여준다.
도 13의 (A) 및 (B)는 비환원된(A) 및 환원된(B) "2+1 IgG 교차fab"(항-MCSP/항-cyCD3)(서열번호 3, 5, 35 및 37 참조)의 SDS-PAGE(4 내지 12% 비스/트리스, 누페이지 인비트로겐, 쿠마시 염색됨)를 보여준다. (C)는 "2+1 IgG 교차fab"(항-MCSP/항-cyCD3)의 분석 크기 배제 크로마토그래피(수퍼덱스 200 10/300 GL 지이 헬쓰케어; 2 mM MOPS(pH 7.3), 150 mM NaCl, 0.02%(w/v) NaCl; 주입된 50 ㎍ 샘플)를 보여준다.
도 14의 (A) 및 (B)는 비환원된(A) 및 환원된(B) "도립된 2+1 IgG 교차fab"(항-CEA/항-huCD3)(서열번호 33, 63, 65 및 67 참조)의 SDS-PAGE(4 내지 12% 비스/트리스, 누페이지 인비트로겐, 쿠마시 염색됨)를 보여준다. (C)는 "도립된 2+1 IgG 교차fab"(항-CEA/항-huCD3)의 분석 크기 배제 크로마토그래피(수퍼덱스 200 10/300 GL 지이 헬쓰케어; 2 mM MOPS(pH 7.3), 150 mM NaCl, 0.02%(w/v) NaCl; 주입된 50 ㎍ 샘플)를 보여준다.
도 15의 (A)는 "(scFv)2-Fc" 및 "(dsscFv)2-Fc"(항-MCSP(LC007)/항-huCD3(V9))의 열적 안정성을 보여준다. 0.05℃/분의 속도로 25℃부터 75℃까지 온도를 상승시키면서 동적 광 산란을 측정하였다. 흑색 곡선: "(scFv)2-Fc"; 회색 곡선: "(dsscFv)2-Fc". (B)는 "2+1 IgG scFab"(서열번호 5, 21 및 23 참조) 및 "2+1 IgG 교차fab"(항-MCSP/항-huCD3)(서열번호 3, 5, 29 및 33 참조)의 열적 안정성을 보여준다. 0.05℃/분의 속도로 25℃부터 75℃까지 온도를 상승시키면서 동적 광 산란을 측정하였다. 흑색 곡선: "2+1 IgG scFab"; 회색 곡선: "2+1 IgG 교차fab".
도 16의 A는 다양한 Fc 돌연변이체와 인간 FcγRIIIa의 상호작용을 결정하기 위한 비아코어(Biacore) 분석 설정을 보여주고, B는 T 세포 이중특이적 구축물과 종양 표적 및 인간 CD3γ(G4S)5CD3ε-AcTev-Fc(놉)-Avi/Fc(홀)의 동시적인 결합을 위한 비아코어 분석 설정을 보여준다.
도 17은 T 세포 이중특이적 구축물과 인간 MCSP의 D3 도메인 및 인간 CD3γ(G4S)5CD3ε-AcTev-Fc(놉)-Avi/Fc(홀)의 동시적인 결합을 보여준다. (A) "2+1 IgG 교차fab"(서열번호 3, 5, 29 및 33 참조), 및 (B) "2+1 IgG scFab"(서열번호 5, 21 및 23 참조).
도 18a 및 18b는 T 세포 이중특이적 구축물과 인간 EGFR 및 인간 CD3γ(G4S)5CD3ε-AcTev-Fc(놉)-Avi/Fc(홀)의 동시적인 결합을 보여준다. (A) "2+1 IgG scFab"(서열번호 45, 47 및 53 참조), (B) "1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab"(서열번호 43, 45 및 47 참조), (C) "도립된 1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab"(서열번호 11, 49 및 51 참조), (D) "1+1 IgG scFab"(서열번호 47, 53 및 213 참조).
도 19는 FACS에 의해 측정된, "(scFv)2" 분자(50 nM)와 주르카트(Jurkat) 세포 상에서 발현된 CD3(A) 또는 Colo-38 세포 상에서 발현된 MCSP(B)의 결합을 보여준다. 처리되지 않은 세포 및 이차 항체만으로 염색된 세포와 비교된 평균 형광 강도가 도시되어 있다.
도 20은 FACS에 의해 측정된, "2+1 IgG scFab, LALA"(서열번호 5, 17 및 19 참조) 구축물(50 nM)과 주르카트 세포 상에서 발현된 CD3(A) 또는 Colo-38 세포 상에서 발현된 MCSP의 결합을 보여준다. (표시된 바와 같이) 기준물 항-CD3 IgG로 처리된 세포, 처리되지 않은 세포 및 이차 항체만으로 염색된 세포와 비교된 평균 형광 강도가 도시되어 있다.
도 21a 및 21b는 FACS에 의해 측정된, "1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab"(서열번호 1, 3 및 5 참조) 구축물 및 "도립된 1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab"(서열번호 7, 9 및 11 참조) 구축물(50 nM)과 주르카트 세포 상에서 발현된 CD3(도 21a) 또는 Colo-38 세포 상에서 발현된 MCSP(도 21b)의 결합을 보여준다. (표시된 바와 같이) 기준물 항-CD3 또는 항-MCSP IgG로 처리된 세포, 처리되지 않은 세포 및 이차 항체만으로 염색된 세포와 비교된 평균 형광 강도가 도시되어 있다.
도 22는 FACS에 의해 측정된, "2+1 IgG scFab, LALA"(서열번호 5, 17 및 19 참조) 이중특이적 구축물 및 상응하는 항-MCSP IgG와 Colo-38 세포 상의 MCSP의 용량 의존적 결합을 보여준다.
도 23a 및 23b는 표시된 바와 같이(PBMC 대 종양 세포의 E:T 비 = 10:1), Colo-38 종양 표적 세포의 존재 또는 부재하에 1 nM의 "2+1 IgG scFab, LALA"(서열번호 5, 17 및 19 참조) 또는 "(scFv)2" CD3-MCSP 이중특이적 구축물과 함께 항온처리된 후 인간 T 세포 상의 상이한 활성화 마커의 표면 발현 수준을 보여준다. 각각 15시간 또는 24시간 항온처리 후 CD8+ T 세포 상의 초기 활성화 마커 CD69(도 23a) 또는 후기 활성화 마커 CD25(도 23b)의 발현 수준이 도시되어 있다.
도 24a 및 24b는 표시된 바와 같이(E:T 비 = 5:1), Colo-38 종양 표적 세포의 존재 또는 부재하에 1 nM의 "2+1 IgG scFab, LALA"(서열번호 5, 17 및 19 참조) 또는 "(scFv)2" CD3-MCSP 이중특이적 구축물과 함께 항온처리된 후 인간 T 세포 상의 후기 활성화 마커 CD25의 표면 발현 수준을 보여준다. 5일 항온처리 후 CD8+ T 세포(도 24a) 또는 CD4+ T 세포(도 24b) 상의 후 활성화 마커 CD25의 발현 수준이 도시되어 있다.
도 25는 인간 MCSP-발현 MV-3 종양 표적 세포(E:T 비 = 3:1)의 존재 또는 부재하에 지시된 농도의 "2+1 IgG 교차fab" 이중특이적 구축물(사이노몰구스(사이노몰구스) CD3 및 인간 MCSP를 표적화함; 서열번호 3, 5, 35 및 37 참조)과 함께 43시간 동안 항온처리된 후 2마리 상이한 동물(사이노 네스토르(Nestor), 사이노 노부(Nobu))로부터 수득된 사이노몰구스 CD8+ T 세포 상의 후기 활성화 마커 CD25의 표면 발현 수준을 보여준다. 대조군으로서, 기준 IgG(항-사이노몰구스 CD3 IgG, 항-인간 MCSP IgG) 또는 비생리학적 자극제 PHA-M이 사용되었다.
도 26은 U87MG 종양 세포(E:T 비 = 5:1)의 존재하에 "2+1 IgG scFab, LALA" CD3-MCSP 이중특이적 구축물(서열번호 5, 17 및 19 참조)에 의해 18.5시간 동안 활성화된 인간 범(pan) T 세포에 의해 분비된 IFN-γ 수준을 보여준다. 대조군으로서, 상응하는 항-CD3 및 항-MCSP IgG가 투여되었다.
도 27은 인간 범 T 세포(E:T 비 = 5:1)와 함께 공배양되고 상이한 농도의 "2+1 IgG scFab"(서열번호 5, 21 및 23 참조), "2+1 IgG 교차fab"(서열번호 3, 5, 29 및 33 참조) 및 "(scFv)2" 이중특이적 분자 및 상응하는 IgG로 20시간 동안 활성화되었을 때 MDA-MB-435 종양 세포의 사멸(LDH 방출에 의해 측정됨)을 보여준다.
도 28은 인간 범 T 세포(E:T 비 = 5:1)와 함께 공배양되고 상이한 농도의 이중특이적 구축물 및 상응하는 IgG로 20시간 동안 활성화되었을 때 MDA-MB-435 종양 세포의 사멸(LDH 방출에 의해 측정됨)을 보여준다. 그들의 Fc 도메인에서 상이한 (야생형 Fc 도메인(서열번호 5, 13 및 15 참조), 또는 (NK) 효과기 세포 기능을 제거하도록 돌연변이된 Fc 도메인(P329G LALA(서열번호 5, 21 및 23 참조), P329G LALA N297D(서열번호 5, 25 및 27 참조))을 갖는) "2+1 IgG scFab" 구축물과 "2+1 IgG 교차fab"(서열번호 3, 5, 29 및 33 참조) 구축물이 비교되었다.
도 29는 인간 범 T 세포(E:T 비 = 5:1)와 함께 공배양되고 CD3-MCSP 이중특이적 "2+1 IgG scFab, LALA"(서열번호 5, 17 및 19 참조) 구축물, "(scFv)2" 분자 또는 상응하는 IgG로 18.5시간 동안 처리된 Colo-38 종양 세포의 사멸(LDH 방출에 의해 측정됨)을 보여준다.
도 30은 인간 범 T 세포(E:T 비 = 5:1)와 함께 공배양되고 CD3-MCSP 이중특이적 "2+1 IgG scFab, LALA"(서열번호 5, 17 및 19 참조) 구축물, "(scFv)2" 분자 또는 상응하는 IgG로 18시간 동안 처리된 Colo-38 종양 세포의 사멸(LDH 방출에 의해 측정됨)을 보여준다.
도 31은 인간 범 T 세포(E:T 비 = 5:1)와 함께 공배양되고 상이한 농도의 CD3-MCSP 이중특이적 "2+1 IgG scFab, LALA"(서열번호 5, 17 및 19 참조) 구축물, "(scFv)2" 분자 또는 상응하는 IgG로 23.5시간 동안 활성화되었을 때 MDA-MB-435 종양 세포의 사멸(LDH 방출에 의해 측정됨)을 보여준다.
도 32는 인간 범 T 세포(E:T 비 = 5:1)와 함께 공배양되고 상이한 농도의 CD3-MCSP 이중특이적 "1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab"(서열번호 1, 3 및 5 참조), "도립된 1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab"(서열번호 7, 9 및 11 참조), "(scFv)2" 구축물 또는 상응하는 IgG로 19시간 동안 활성화되었을 때 Colo-38 종양 세포의 사멸(LDH 방출에 의해 측정됨)을 보여준다.
도 33은 인간 범 T 세포(E:T 비 = 5:1)와 함께 공배양되고 "1+1 IgG scFab" CD3-MCSP 이중특이적 구축물(서열번호 5, 21 및 213 참조) 또는 "(scFv)2" 분자로 20시간 동안 처리된 Colo-38 종양 세포의 사멸(LDH 방출에 의해 측정됨)을 보여준다.
도 34는 인간 범 T 세포(E:T 비 = 5:1)와 함께 공배양되고 상이한 농도의 이중특이적 구축물 또는 상응하는 IgG로 21시간 동안 활성화되었을 때 MDA-MB-435 종양 세포의 사멸(LDH 방출에 의해 측정됨)을 보여준다. CD3-MCSP 이중특이적 "2+1 IgG 교차fab"(서열번호 3, 5, 29 및 33 참조) 및 "1+1 IgG 교차fab"(서열번호 5, 29, 31 및 33 참조) 구축물, "(scFv)2" 분자 및 상응하는 IgG가 비교되었다.
도 35는 135 ng/㎖ 또는 1.35 ng/㎖의 "2+1 IgG 교차fab" CD3-MCSP 이중특이적 구축물(서열번호 3, 5, 29 및 33 참조)(E:T 비 = 25:1)에 의한 인간 T 세포의 활성화에 의해 유도된 상이한 표적 세포(표시된 바와 같이, MCSP 양성 Colo-38 종양 표적 세포, 골수 또는 지방 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기 세포, 또는 태반으로부터 유래된 주위세포(pericyte))의 사멸(LDH 방출에 의해 측정됨)을 보여준다.
도 36a 및 36b는 인간 PBMC 및 상이한 CD3-MCSP 이중특이적 구축물("2+1 IgG scFab, LALA"(서열번호 5, 17 및 19 참조) 및 "(scFv)2") 또는 당조작된 항-MCSP IgG (GlycoMab)와 함께 공배양되었을 때 21시간의 밤샘 항온처리 후 측정된, Colo-38 종양 표적 세포의 사멸(LDH 방출에 의해 측정됨)을 보여준다. 효과기 대 표적 세포 비는 25:1로 고정되었거나(도 36a) 도시된 바와 같이 변경되었다(도 36b). PBMC는 새로운 혈액(도 36a) 또는 버피 코트(도 36b)로부터 단리되었다.
도 37은 사이노몰구스 CD3 및 인간 MCSP(서열번호 3, 5, 35 및 37 참조)를 표적화하는 "2+1 IgG 교차fab" 구축물의 시간 의존적 세포독성 효과를 보여준다. 일차 사이노몰구스 PBMC(E:T 비 = 3:1)와 함께 24시간 또는 43시간 동안 공배양되었을 때 인간 MCSP-발현 MV-3 세포로부터의 LDH 방출이 도시되어 있다. 대조군으로서, 기준 IgG(항-사이노 CD3 IgG 및 항-인간 MCSP IgG)를 동일한 몰 농도로 사용하였다. PHA-M은 (비생리학적) T 세포 활성화에 대한 대조군으로서 사용되었다.
도 38은 인간 PBMC(E:T 비 = 10:1)와 함께 공배양되고 상이한 CD3-MCSP 이중특이적 구축물("2+1 IgG 교차fab"(서열번호 3, 5, 29 및 33 참조) 및 "(scFv)2")로 약 26시간 동안 처리된 huMCSP 양성 MV-3 흑색종 세포의 사멸(LDH 방출에 의해 측정됨)을 보여준다.
도 39는 인간 범 T 세포(E:T 비 = 5:1)와 함께 공배양되고 상이한 CD3-EGFR 이중특이적 구축물("2+1 IgG scFab"(서열번호 45, 47 및 53 참조), "1+1 IgG scFab"(서열번호 47, 53 및 213 참조) 및 "(scFv)2") 또는 기준 IgG로 18시간 동안 처리된 EGFR 양성 LS-174T 종양 세포의 사멸(LDH 방출에 의해 측정됨)을 보여준다.
도 40은 인간 범 T 세포(E:T 비 = 5:1)와 함께 공배양되고 상이한 CD3-EGFR 이중특이적 구축물("1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab"(서열번호 43, 45 및 47 참조), "도립된 1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab"(서열번호 11, 49 및 51 참조), "1+1 IgG scFab"(서열번호 47, 53 및 213 참조) 및 "(scFv)2") 또는 기준 IgG로 21시간 동안 처리된 EGFR 양성 LS-174T 종양 세포의 사멸(LDH 방출에 의해 측정됨)을 보여준다.
도 41a 및 41b는 인간 범 T 세포(도 41a) 또는 인간 무자극 T 세포(도 41b)와 함께 공배양되고 상이한 CD3-EGFR 이중특이적 구축물("1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab"(서열번호 43, 45 및 47 참조), "도립된 1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab"(서열번호 11, 49 및 51 참조) 및 "(scFv)2") 또는 기준 IgG로 16시간 동안 처리된 EGFR 양성 LS-174T 종양 세포의 사멸(LDH 방출에 의해 측정됨)을 보여준다. 효과기 대 표적 세포 비는 5:1이었다.
도 42는 인간 범 T 세포(E:T 비 = 5:1)와 함께 공배양되고 상이한 CD3-FAP 이중특이적 구축물("도립된 1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab"(서열번호 11, 51 및 55 참조), "1+1 IgG scFab"(서열번호 57, 61 및 213 참조), "2+1 IgG scFab"(서열번호 57, 59 및 61 참조) 및 "(scFv)2")로 약 18시간 동안 처리된 FAP 양성 GM05389 섬유모세포의 사멸(LDH 방출에 의해 측정됨)을 보여준다.
도 43a 및 43b는 표적 세포의 존재(도 43a) 또는 부재(도 43b)하에 상이한 CD3-MCSP 이중특이적 구축물("2+1 IgG scFab, LALA"(서열번호 5, 17 및 19 참조) 및 "(scFv)2") 또는 상응하는 대조군 IgG로 6시간 동안 처리된 CD8+ T 세포에서 CD107a/b의 발현 수준 및 퍼포린(perforin) 수준의 유세포계수(Flow cytrometric) 분석을 보여준다. 인간 범 T 세포를 Colo-38 종양 표적 세포의 존재 또는 부재하에 5:1의 효과기 대 표적 비로 9.43 nM의 상이한 분자와 함께 항온처리하였다. 1시간의 항온처리 후 모넨신(Monensin)을 첨가하여 단백질 수송을 방해함으로써 세포내 단백질 수준을 증가시켰다. 게이트(gate)가 도시된 바와 같이 모든 CD107a/b 양성, 퍼포린 양성 또는 이중 양성 세포에 대해 설정되었다.
도 44a 및 44b는 Colo-38 종양 표적 세포의 존재 또는 부재하에 5:1의 효과기 대 표적 세포 비로 1 nM의 상이한 CD3-MCSP 이중특이적 구축물("2+1 IgG scFab, LALA"(서열번호 5, 17 및 19 참조) 또는 "(scFv)2") 또는 상응하는 대조군 IgG와 함께 항온처리되었을 때 CD8+(도 44a) 또는 CD4+(도 44b) 인간 T 세포의 상대적 증식을 보여준다. CFSE로 표지된 인간 범 T 세포를 FACS로 특징규명하였다. 비증식 세포 주변에 게이트를 설정하고 기준물로서의 전체 측정된 세포 수에 비해 상대적인 이 게이트의 세포 수를 사용함으로써 상대적 증식 수준을 측정하였다.
도 45a 및 45b는 Colo-38 종양 세포의 존재(도 45a) 또는 부재(도 45b)하에 1 nM의 상이한 CD3-MCSP 이중특이적 구축물("2+1 IgG scFab, LALA"(서열번호 5, 17 및 19 참조) 또는 "(scFv)2") 또는 상응하는 대조군 IgG로 24시간 동안 처리된 후 인간 PBMC의 상청액에서 측정된 상이한 사이토카인의 수준을 보여준다. 효과기 대 표적 세포 비는 10:1이었다.
도 46a 내지 46d는 Colo-38 종양 세포의 존재(도 46a 및 46b) 또는 부재(도 46c 및 46d)하에 1 nM의 상이한 CD3-MCSP 이중특이적 구축물("2+1 IgG scFab", "2+1 IgG 교차fab"(서열번호 3, 5, 29 및 33 참조) 또는 "(scFv)2") 또는 상응하는 대조군 IgG로 24시간 동안 처리된 후 전혈의 상청액에서 측정된 상이한 사이토카인의 수준을 보여준다. 상기 이중특이적 구축물 중에서 야생형 Fc 도메인(서열번호 5, 13, 15 참조) 또는 (NK) 효과기 세포 기능을 제거하도록 돌연변이된 Fc 도메인(LALA(서열번호 5, 17 및 19 참조), P329G LALA(서열번호 5, 2 및 23 참조) 및 P329G LALA N297D(서열번호 5, 25 및 27 참조))을 갖는 상이한 "2+1 IgG scFab" 구축물이 존재하였다.
도 47은 CE-SDS 분석을 보여준다. 2+1 IgG 교차fab, 연결된 경쇄(서열번호 3, 5, 29 및 179 참조)의 SDS-PAGE로서 나타낸 전기영동도(electropherogram)(레인 1: 환원, 레인 2: 비환원).
도 48은 2+1 IgG 교차fab, 연결된 경쇄(서열번호 3, 5, 29 및 179 참조)(최종 생성물)의 분석 크기 배제 크로마토그래피를 보여준다. 20 ㎍의 샘플이 주입되었다.
도 49는 인간 PBMC(E:T 비 = 10:1)와 함께 공배양되고 상이한 CD3-MCSP 이중특이적 구축물("2+1 IgG 교차fab"(서열번호 3, 5, 29 및 33 참조) 및 "2+1 IgG 교차fab, 연결된 LC"(서열번호 3, 5, 29 및 179 참조))로 약 44시간 동안 처리되었을 때 MCSP 양성 MV-3 종양 세포의 사멸(LDH 방출에 의해 측정됨)을 보여준다. 인간 PBMC는 건강한 지원자의 새로운 혈액으로부터 단리되었다.
도 50은 인간 PBMC(E:T 비 = 10:1)와 함께 공배양되고 상이한 CD3-MCSP 이중특이적 구축물("2+1 IgG 교차fab"(서열번호 3, 5, 29 및 33 참조) 및 "2+1 IgG 교차fab, 연결된 LC"(서열번호 3, 5, 29 및 179 참조))로 약 22시간 동안 처리되었을 때 MCSP 양성 Colo-38 종양 세포의 사멸(LDH 방출에 의해 측정됨)을 보여준다. 인간 PBMC는 건강한 지원자의 새로운 혈액으로부터 단리되었다.
도 51은 인간 PBMC(E:T 비 = 10:1)와 함께 공배양되고 상이한 CD3-MCSP 이중특이적 구축물("2+1 IgG 교차fab"(서열번호 3, 5, 29 및 33 참조) 및 "2+1 IgG 교차fab, 연결된 LC"(서열번호 3, 5, 29 및 179 참조))로 약 22시간 동안 처리되었을 때 MCSP 양성 Colo-38 종양 세포의 사멸(LDH 방출에 의해 측정됨)을 보여준다. 인간 PBMC는 건강한 지원자의 새로운 혈액으로부터 단리되었다.
도 52는 인간 PBMC(E:T 비 = 10:1)와 함께 공배양되고 상이한 CD3-MCSP 이중특이적 구축물("2+1 IgG 교차fab"(서열번호 3, 5, 29 및 33 참조) 및 "2+1 IgG 교차fab, 연결된 LC"(서열번호 3, 5, 29 및 179 참조))로 약 22시간 동안 처리되었을 때 MCSP 양성 WM266-4 세포의 사멸(LDH 방출에 의해 측정됨)을 보여준다. 인간 PBMC는 건강한 지원자의 새로운 혈액으로부터 단리되었다.
도 53a 및 53b는 인간 MCSP-발현 Colo-38 종양 표적 세포(E:T 비 = 10:1)의 존재 또는 부재하에 10 nM, 80 pM 또는 3 pM의 상이한 CD3-MCSP 이중특이적 구축물("2+1 IgG 교차fab"(서열번호 3, 5, 29 및 33 참조) 및 "2+1 IgG 교차fab, 연결된 LC"(서열번호 3, 5, 29 및 179 참조))과 함께 22시간 동안 항온처리된 후 인간 CD8+ T 세포 상의 초기 활성화 마커 CD69(도 53a) 및 후기 활성화 마커 CD25(도 53b)의 표면 발현 수준을 보여준다.
도 54a 내지 54f는 CE-SDS 분석을 보여준다. (A): 1+1 IgG 교차fab; VL/VH 교환(LC007/V9)(서열번호 5, 29, 33 및 181 참조)의 SDS-PAGE로서 나타낸 전기영동도: a) 비환원, b) 환원. (B): 1+1 교차Mab; CL/CH1 교환(LC007/V9)(서열번호 5, 23, 183 및 185 참조)의 SDS-PAGE로서 나타낸 전기영동도: a) 환원, b) 비환원. (C): 도립된 2+1 IgG 교차fab; CL/CH1 교환(LC007/V9)(서열번호 5, 23, 183 및 187 참조)의 SDS-PAGE로서 나타낸 전기영동도: a) 환원, b) 비환원. (D): 2+1 IgG 교차fab; VL/VH 교환(M4-3 ML2/V9)(서열번호 33, 189, 191 및 193 참조)의 SDS-PAGE로서 나타낸 전기영동도: a) 환원, b) 비환원. (E): 2+1 IgG 교차fab; CL/CH1 교환(M4-3 ML2/V9)(서열번호 183, 189, 193 및 195 참조)의 SDS-PAGE로서 나타낸 전기영동도: a) 환원, b) 비환원. (F): 도립된 2+1 IgG 교차fab; CL/CH1 교환(CH1A1A/V9)(서열번호 65, 67, 183 및 197 참조)의 SDS-PAGE로서 나타낸 전기영동도: a) 환원, b) 비환원. (G): 2+1 IgG 교차fab; CL/CH1 교환(M4-3 ML2/H2C)(서열번호 189, 193, 199 및 201 참조)의 SDS-PAGE로서 나타낸 전기영동도: a) 환원, b) 비환원. (H): 도립된 2+1 IgG 교차fab; CL/CH1 교환(431/26/V9)(서열번호 183, 203, 205 및 207 참조)의 SDS-PAGE로서 나타낸 전기영동도: a) 환원, b) 비환원. (I): "2+1 IgG 교차fab 경쇄 융합체"(CH1A1A/V9)(서열번호 183, 209, 211 및 213 참조)의 SDS-PAGE로서 나타낸 전기영동도: a) 환원, b) 비환원. (J): "2+1 IgG 교차fab"(항-MCSP/항-huCD3)(서열번호 5, 23, 215 및 217 참조)의 SDS-PAGE(4 내지 12% 비스/트리스, 누페이지 인비트로겐, 쿠마시 염색됨), 비환원(좌측) 및 환원(우측). (K): "도립된 2+1 IgG 교차fab"(항-MCSP/항-huCD3)(서열번호 5, 23, 215 및 219 참조)의 SDS-PAGE로서 나타낸 전기영동도: a) 환원, b) 비환원. (L): "1+1 IgG 교차fab"(항-CD33/항-huCD3)(서열번호 33, 213, 221 및 223 참조)의 SDS-PAGE(4 내지 12% 비스/트리스, 누페이지 인비트로겐, 쿠마시 염색됨), 환원(좌측) 및 비환원(우측). (M): "2+1 IgG 교차fab"(항-CD33/항-huCD3)(서열번호 33, 221, 223 및 225 참조)의 SDS-PAGE(4 내지 12% 비스/트리스, 누페이지 인비트로겐, 쿠마시 염색됨), 환원(좌측) 및 비환원(우측). (N): "2+1 IgG 교차fab"(항-CD20/항-huCD3)(서열번호 33, 227, 229 및 231 참조)의 SDS-PAGE(4 내지 12% 비스/트리스, 누페이지 인비트로겐, 쿠마시 염색됨), 비환원.
도 55a 및 55b는 FACS에 의해 결정된, 이중특이적 구축물(CEA/CD3 "도립된 2+1 IgG 교차fab(VL/VH)"(서열번호 33, 63, 65 및 67 참조) 및 "도립된 2+1 IgG 교차fab(CL/CH1)"(서열번호 65, 67, 183, 197 참조))과 주르카트 세포에 의해 발현된 인간 CD3(도 55a) 또는 LS-174T 세포에 의해 발현된 인간 CEA(도 55b)의 결합을 보여준다. 대조군으로서, 등가 최대 농도의 기준 IgG, 및 표지된 이차 항체(염소 항-인간 FITC-접합된 어피니퓨어(AffiniPure) F(ab')2 단편, Fcγ 단편 특이적, 잭슨 이뮤노 리서치 랩(Jackson Immuno Research Lab) # 109-096-098)로 인한 배경 염색도 평가되었다.
도 56a 및 56b는 FACS에 의해 결정된, 이중특이적 구축물(MCSP/CD3 "2+1 IgG 교차fab"(서열번호 3, 5, 29 및 33 참조) 및 "도립된 2+1 IgG 교차fab"(서열번호 5, 23, 183 및 187 참조))과 주르카트 세포에 의해 발현된 인간 CD3(도 56a) 또는 WM266-4 종양 세포에 의해 발현된 인간 MCSP(도 56b)의 결합을 보여준다.
도 57a 및 57b는 FACS에 의해 결정된, "1+1 IgG 교차fab 경쇄 융합체"(서열번호 183, 209, 211 및 213 참조)와 주르카트 세포에 의해 발현된 인간 CD3(도 57a) 또는 LS-174T 세포에 의해 발현된 인간 CEA(도 57b)의 결합을 보여준다.
도 58a 및 58b는 FACS에 의해 결정된, "2+1 IgG 교차fab"(서열번호 5, 23, 215 및 217 참조) 구축물 및 "도립된 2+1 IgG 교차fab"(서열번호 5, 23, 215 및 219 참조) 구축물과 주르카트 세포에 의해 발현된 인간 CD3(도 58a) 또는 WM266-4 종양 세포에 의해 발현된 인간 MCSP(도 58b)의 결합을 보여준다.
도 59a 및 59b는 지시된 농도의 CD3/MCSP "1+1 교차Mab"(서열번호 5, 23, 183 및 185 참조) 구축물, "1+1 IgG 교차fab"(서열번호 5, 29, 33 및 181 참조) 구축물 및 "2+1 IgG 교차fab"(서열번호 3, 5, 29 및 33 참조) 구축물과 함께 24시간 동안 항온처리된 후 인간 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 상의 초기 활성화 마커 CD69(도 59a) 또는 후기 활성화 마커 CD25(도 59b)의 표면 발현 수준을 보여준다. 상기 분석은 표시된 바와 같이 MV-3 표적 세포의 존재 또는 부재하에 수행되었다.
도 60a 및 60b는 사이노몰구스 PBMC(E:T 비 = 3:1, CD3+ 수로 표준화됨)와 함께 공배양되고 "2+1 IgG 교차fab"(서열번호 5, 23, 215 및 217 참조) 및 "도립된 2+1 IgG 교차fab"(서열번호 5, 23, 215 및 219 참조)로 약 41시간 동안 처리되었을 때 huMCSP 양성 MV-3 종양 세포의 존재 또는 부재하에 2마리 상이한 시아노몰구스 원숭이(도 60a 및 60b)의 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 상의 초기 활성화 마커 CD25의 표면 발현 수준을 보여준다.
도 61a 및 61b는 인간 PBMC(E:T 비 = 10:1)와 함께 공배양되고 상이한 농도의 "도립된 2+1 IgG 교차fab(VL/VH)"(서열번호 33, 63, 65 및 67 참조) 대 "도립된 2+1 IgG 교차fab(CL/CH1)"(서열번호 65, 67, 183 및 197 참조) 구축물에 의해 28시간 동안 활성화되었을 때 MKN-45(도 61a) 또는 LS-174T(도 61b) 종양 세포의 사멸(LDH 방출에 의해 측정됨)을 보여준다.
도 62는 인간 PBMC(E:T 비 = 10:1)와 함께 공배양되고 상이한 농도의 "2+1 IgG 교차fab(VL/VH)"(서열번호 33, 189, 191 및 193 참조) 대 "2+1 IgG 교차fab(CL/CH1)"(서열번호 183, 189, 193 및 195 참조) 구축물에 의해 26시간 동안 활성화되었을 때 WM266-4 종양 세포의 사멸(LDH 방출에 의해 측정됨)을 보여준다.
도 63은 인간 PBMC(E:T 비 = 10:1)와 함께 공배양되고 상이한 농도의 "2+1 IgG 교차fab(VH/VL)"(서열번호 33, 189, 191 및 193 참조) 대 "2+1 IgG 교차fab(CL/CH1)"(서열번호 183, 189, 193 및 195 참조) 구축물에 의해 27시간 동안 활성화되었을 때 MV-3 종양 세포의 사멸(LDH 방출에 의해 측정됨)을 보여준다.
도 64a 및 64b는 표시된 바와 같이, 인간 PBMC(E:T 비 = 10:1)와 함께 공배양되고 상이한 농도의 "2+1 IgG 교차fab"(서열번호 3, 5, 29 및 33 참조), "1+1 교차Mab"(서열번호 5, 23, 183 및 185 참조) 및 "1+1 IgG 교차fab"(서열번호 5, 29, 33 및 181 참조)에 의해 21시간 동안 활성화되었을 때 인간 MCSP 양성 WM266-4(도 64a) 또는 MV-3(도 64b) 종양 세포의 사멸(LDH 방출에 의해 측정됨)을 보여준다.
도 65a 및 65b는 인간 PBMC(E:T 비 = 10:1)와 함께 공배양되고 상이한 농도의 "1+1 IgG 교차fab LC 융합체"(서열번호 183, 209, 211 및 213 참조)에 의해 28시간 동안 활성화되었을 때 MKN-45(도 65a) 또는 LS-174T(도 65b) 종양 세포의 사멸(LDH 방출에 의해 측정됨)을 보여준다.
도 66은 인간 PBMC(E:T 비 = 10:1)와 함께 공배양되고 상이한 농도의 "1+1 IgG 교차fab LC 융합체"(서열번호 183, 209, 211 및 213 참조) 대 표적화되지 않은 "2+1 IgG 교차fab" 기준물에 의해 24시간 동안 활성화되었을 때 MC38-huCEA 종양 세포의 사멸(LDH 방출에 의해 측정됨)을 보여준다.
도 67a 및 67b는 인간 PBMC(E:T 비 = 10:1)와 함께 공배양되고 "2+1 IgG 교차fab(V9)"(서열번호 3, 5, 29 및 33 참조) 구축물, "도립된 2+1 IgG 교차fab(V9)" (서열번호 5, 23, 183 및 187 참조) 구축물, "2+1 IgG 교차fab(항-CD3)"(서열번호 5, 23, 215 및 217 참조) 구축물 및 "도립된 2+1 IgG 교차fab(항-CD3)"(서열번호 5, 23, 215 및 219 참조) 구축물로 처리되었을 때 인간 MCSP 양성 MV-3(도 67a) 또는 WM266-4(도 67b) 종양 세포의 사멸(LDH 방출에 의해 측정됨)을 보여준다.
도 68은 비성숙된 모 클론(M4-3 ML2)과 비교한 친화성 성숙된 항-MCSP 클론의 정렬을 보여준다.
도 69는 MCSP TCB(도립된 2+1 교차fab-IgG P329G LALA) 분자의 계략도를 보여준다.
도 70은 MCSP TCB(도립된 2+1 교차fab-IgG P329G LALA, 서열번호 278, 319, 320 및 321)의 CE-SDS 분석을 보여준다. MCSP TCB의 SDS-PAGE로서 나타낸 전기영동도: A) 비환원, B) 환원.
도 71은 CEA TCB(도립된 2+1 교차fab-IgG P329G LALA) 분자의 계략도를 보여준다.
도 72는 CEA TCB(도립된 2+1 교차fab-IgG P329G LALA, 서열번호 288, 322, 323 및 324) 분자의 CE-SDS 분석을 보여준다. CEA TCB의 SDS-Page로서 나타낸 전기영동도: A) 비환원, B) 환원.
도 73은 A375 세포(MCSP+)(A) 및 주르카트(CD3+ 세포)(B)에 대한 MCSP TCB(서열번호 278, 319, 320 및 321)의 결합을 보여준다. "표적화되지 않은 TCB": CD3에 결합하나 제2 항원(서열번호 325, 326, 327 및 328)에는 결합하지 않는 이중특이적 항체.
도 74a 및 74b는 MCSP TCB 항체(서열번호 278, 319, 320 및 321) A375(높은 MCSP)(A), MV-3(중간 MCSP)(B), HCT-116(낮은 MCSP)(C) 및 LS180(MCSP 음성)(D) 표적 세포(E:T = 10:1, 효과기 인간 PBMC, 24시간의 항온처리 시간)에 의해 유도된 T 세포 사멸을 보여준다. "표적화되지 않은 TCB": CD3에 결합하나 제2 항원(서열번호 325, 326, 327 및 328)에는 결합하지 않는 이중특이적 항체.
도 75a 및 75b는 MCSP TCB 항체(서열번호 278, 319, 320 및 321)에 의해 유도된 MV3 흑색종 세포의 T 세포-매개된 사멸(E:T = 10:1, 24시간 항온처리) 후의 인간 CD8+(A, B) 및 CD4+(C, D) T 세포에 대한 CD25 및 CD69의 상향조절을 보여준다. "표적화되지 않은 TCB": CD3에 결합하나 제2 항원(서열번호 325, 326, 327 및 328)에는 결합하지 않는 이중특이적 항체.
도 76a 및 76b는 MCSP TCB 항체(서열번호 278, 319, 320 및 321)에 의해 유도된 MV3 흑색종 세포의 T 세포-매개된 사멸(E:T = 10:1, 24시간 항온처리) 후에 인간 PBMC에 의한 IL-2(A), IFN-γ(B), TNFα(C), IL-4(D), IL-10(E) 및 그랜자임(Granzyme) B(F)의 분비를 보여준다. "표적화되지 않은 TCB": CD3에 결합하나 제2 항원(서열번호 325, 326, 327 및 328)에는 결합하지 않는 이중특이적 항체.
도 77은 CEA-발현 A549 폐 선암종 세포(A) 및 CD3-발현 불멸성 인간 및 사이노몰구스 T 림프구주(각각 주르카트(B) 및 HSC-F(C))에 대한 CEA TCB (서열번호 288, 322, 323 및 324)의 결합을 보여준다.
도 78a 및 78b는 HPAFII(높은 CEA)(A, E), BxPC-3(중간 CEA)(B, F), ASPC-1(낮은 CEA)(C, G) 및 HCT-116 세포(CEA 음성)(D, H)의 CEA TCB(서열번호 288, 322, 323 및 324)에 의해 유도된 T 세포 사멸을 보여준다. E:T = 10:1, 효과기 인간 PBMC, 24시간(A 내지 D) 또는 48시간(E 내지 H)의 항온처리 시간. "표적화되지 않은 TCB": CD3에 결합하나 제2 항원(서열번호 325, 326, 327 및 328)에는 결합하지 않는 이중특이적 항체.
도 79a 및 79b는 CEA TCB(서열번호 288, 322, 323 및 324)에 의해 유도된 HPAFII(높은 CEA)(A, E), BxPC-3(중간 CEA)(B, F), ASPC-1(낮은 CEA) (C, G) 및 HCT-116 세포(CEA 음성)(D, H)의 T 세포-매개된 사멸 5일 후에 인간 CD8+ 및 CD4+ T 세포 증식(A 내지 D) 및 인간 CD8+ 및 CD4+ T 세포에 대한 CD25의 상향조절(E 내지 H)을 보여준다. "DP47 TCB": CD3에 결합하나 제2 항원(서열번호 325, 326, 327 및 328)에는 결합하지 않는 이중특이적 항체.
도 80a및 80b는 CEA TCB(서열번호 288, 322, 323 및 324)에 의해 유도된 MKN45 종양 세포의 T 세포-매개된 사멸(E:T = 10:1, 48시간 항온처리) 후에 IFN-γ(A), TNFα(B), 그랜자임 B(C), IL-2(D), IL-6(E) 및 IL-1 (F)의 분비를 보여준다. "표적화되지 않은 TCB": CD3에 결합하나 제2 항원(서열번호 325, 326, 327 및 328)에는 결합하지 않는 이중특이적 항체.
도 81은 CEA TCB 및 sCEA와 함께 항온처리 24시간(A) 또는 48시간(B) 후에 검출된, 증가하는 농도의 shed CEA(sCEA)의 존재하에 CEA TCB(서열번호 288, 322, 323 및 324)에 의해 유도된 CEA-발현 LS180 종양 표적 세포의 T 세포-매개된 사멸을 보여준다.
도 82는 CEA TCB(서열번호 288, 322, 323 및 324) 및 효과기 세포로서 인간 PBMC(A, C) 또는 사이노몰구스 PBMC(B, D)와 함께 항온처리 21시간(A, B) 및 40시간(C, D) 후에 평가된 발현 인간 CEA(A549-hCEA)에 대한 A549(폐 선암종) 세포의 T 세포-매개된 사멸을 보여준다.
도 83a, 83b 및 83c는 0.8 nM(도 83a), 4 nM(도 83b) 및 20 nM(도 83c)에서 CEA TCB(서열번호 288, 322, 323 및 324)에 의해 유도된 CEA-발현 인간 대장암 세포주의 T 세포-매개된 사멸을 보여준다. 도 83d는 (D) 20 nM의 CEA TCB에서 CEA 발현과 특이적 용해(%) 사이의 상관관계 및 (E) CEA 발현과 CEA TCB EC50 사이의 상관관계를 보여준다.
도 84a 및 84b는 인간 PBMC와 공그래프팅된 LS174T-fluc2 인간 결장 암종(E:T 비 5:1)에서 CEA TCB(서열번호 288, 322, 323 및 324)의 생체내 항-종양 효능을 보여준다. 결과는 상이한 연구 군에서 캘리퍼(A 및 C) 및 생물발광(총 플럭스, B 및 D)에 의해 측정된 12마리의 마우스의 종양 부피의 평균 및 SEM을 보여준다. (A, B) 제1일에 이른 처리를 개시함, (C, D) 제7일에 지연된 처리를 개시함. MCSP TCB(서열번호 278, 319, 320 및 321)를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 85는 인간 PBMC와 공그래프팅된 LS174T-fluc2 인간 결장 암종(E:T 비 1:1)에서 CEA TCB(서열번호 288, 322, 323 및 324)의 생체내 항-종양 효능을 보여준다. 결과는 상이한 연구 군에서 캘리퍼(A) 및 생물발광(총 플럭스, B)에 의해 측정된 10마리의 마우스의 종양 부피이 평균 및 SEM을 보여준다. MCSP TCB(서열번호 278, 319, 320 및 321)를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 86은 면역성 huCD3ε/huCEA 형질전환 마우스의 Panco2-huCEA 오쏘토픽(orthotopic) 종양 모델에서 마우스화된 CEA TCB의 생체내 효능을 보여준다.
도 87은 CEA TCB의 열적 안정성을 보여준다. 0.05℃/분으로 25℃에서 75℃로 증가하는 온도에서 측정된 동적 광 산란. 중복해서 한 것을 회색으로 나타냈다.
도 88은 MCSP TCB의 열적 안정성을 보여준다. 0.05℃/분으로 25℃에서 75℃로 증가하는 온도에서 측정된 동적 광 산란. 중복해서 한 것을 회색 선으로 나타냈다.
도 89a는 (A) A375(높은 MCSP), (B) MV-3(중간 MCSP) 및 (C) HCT-116(낮은 MCSP) 종양 표적 세포의 MCSP TCB(서열번호 278, 319, 320 및 321) 및 MCSP 1+1 교차Mab TCB 항체에 의해 유도된 T 세포-매개된 사멸을 보여준다. 도 89a의 (D)는 LS180(MCSP 음성 종양 세포주)을 음성 대조군으로 사용하였다. 종양 세포 사멸을, 표적 세포를 항체 및 효과기 세포(인간 PBMC)와 함께 항온처리 24시간(도 89a의 A 내지 D) 및 48시간(도 89b의 E 내지 H) 후에 평가하였다.
도 90a 및 90b는 MCSP TCB(서열번호 278, 319, 320 및 321) 및 MCSP 1+1 교차Mab TCB 항체에 의해 매개되는 MCSP-발현 종양 세포(A375(A 내지 D) 및 MV-3(E 내지 H))의 T 세포 사멸 후에 CD8+ 및 CD4+ T 세포에 대한 CD25 및 CD69 상향조절을 보여준다.
도 91은 비결합 항체로서 DP47 GS 및 항-CD3 항체로서 인간화된 CH2527을 함유하는 DP47 GS TCB(2+1 교차fab-IgG P329G LALA 도립된 = "표적화되지 않은 TCB" 서열번호 325, 326, 327 및 328)의 CE-SDS 분석을 보여준다. DP47 GS TCB의 SDS-PAGE로서 나타낸 전기영동도: A) 비환원, B) 환원.
도 92는 MCSP TCB hIgG4 S228P/L325E 분자의 계락도를 보여준다.
도 93은 MCSP TCB hIgG4 S228P/L325E 분자(서열번호 278, 319, 369 및 370)의 CE-SDS 분석을 보여준다. MCSP TCB hIgG4 S228P/L325E의 SDS-PAGE로서 나타낸 전기 영동도: (A) 비환원, (B) 환원.
도 94는 MV-3 세포(MCSP+; EC50 = 2029 pM)(A) 및 주르카트(CD3+)(B)에 대한 MCSP TCB hIgG4 S228P/L325E(서열번호 278, 319, 369 및 370)의 결합을 보여준다.
도 95는 24시간(EC50 = 14.9 pM)(A) 및 48시간(EC50 = 0.24 pM)(B)의 항온처리 시간으로 MV-3 표적 세포의 MCSP TCB hIgG4 S228P/L325E(서열번호 278, 319, 369 및 370)에 의해 유도된 T 세포 사멸을 보여준다(E:T = 10:1, 효과기 인간 PBMC).
정의
하기에서 달리 정의되어 있지 않은 한, 용어는 당분야에서 일반적으로 사용되는 바와 같이 본원에서 사용된다.
본원에서 사용된 용어 "항원 결합 분자"는 그의 가장 넓은 의미에서 항원성 결정인자에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 항원 결합 분자의 예는 면역글로불린 및 이의 유도체, 예를 들면, 단편이다.
용어 "이중특이적"은 항원 결합 분자가 2개 이상의 상이한 항원성 결정인자에 특이적으로 결합할 수 있다는 것을 의미한다. 전형적으로, 이중특이적 항원 결합 분자는 2개의 항원 결합 부위를 포함하고, 상기 부위 각각은 상이한 항원성 결정인자에 대해 특이적이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자는 2개의 항원성 결정인자, 특히 2개의 상이한 세포 상에서 발현된 2개의 항원성 결정인자에 동시적으로 결합할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "가(valent)"는 항원 결합 분자에 특정된 수의 항원 결합 부위가 존재한다는 것을 표시한다. 따라서, 용어 "항원에 대한 1가 결합"은 항원에 대해 특이적인 하나의(및 하나 이하의) 항원 결합 부위가 항원 결합 분자에 존재한다는 것을 표시한다.
"항원 결합 부위"는 항원과의 상호작용을 제공하는 항원 결합 분자의 부위, 즉 하나 이상의 아미노산 잔기를 지칭한다. 예를 들면, 항체의 항원 결합 부위는 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 잔기를 포함한다. 천연 면역글로불린 분자는 전형적으로 2개의 항원 결합 부위를 갖고, Fab 분자는 전형적으로 단일 항원 결합 부위를 갖는다.
본원에서 사용된 용어 "항원 결합 모이어티"는 항원성 결정인자에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 분자를 지칭한다. 한 실시양태에서, 항원 결합 모이어티는 그 자신에 부착된 물질(예를 들면, 제2 항원 결합 모이어티)이 표적 부위, 예를 들면, 항원성 결정인자를 보유하는 특정 유형의 종양 세포 또는 종양 간질(stroma)로 향하게 할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 항원 결합 모이어티는 그의 표적 항원, 예를 들면, T 세포 수용체 복합체 항원을 통해 신호전달을 활성화시킬 수 있다. 항원 결합 모이어티는 본원에 더 정의된 바와 같은 항체 및 이의 단편을 포함한다. 특정 항원 결합 모이어티는 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 항원 결합 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 모이어티는 본원에 더 정의되어 있고 당분야에서 공지되어 있는 바와 같은 항체 불변 영역을 포함할 수 있다. 유용한 중쇄 불변 영역은 하기 5종의 동종형 중 임의의 동종형을 포함한다: α, δ, ε, γ 및 μ. 유용한 경쇄 불변 영역은 하기 2종의 동종형 중 임의의 동종형을 포함한다: κ 및 λ.
본원에서 사용된 용어 "항원성 결정인자"는 "항원" 및 "에피토프"와 동의어이고, 항원 결합 모이어티가 결합하여 항원 결합 모이어티-항원 복합체를 형성하는 폴리펩티드 거대분자 상의 부위(예를 들면, 아미노산의 연속 스트레치 또는 비연속 아미노산의 상이한 영역으로 구성된 입체구조적 배열)를 지칭한다. 유용한 항원성 결정인자는 예를 들면, 종양 세포의 표면 상에, 바이러스-감염된 세포의 표면 상에, 다른 병든 세포의 표면 상에, 면역 세포의 표면 상에, 혈액 혈청 내에 자유롭게 및/또는 세포외 매트릭스(ECM) 내에서 발견될 수 있다. 달리 표시되어 있지 않는 한, 본원에서 항원으로서 지칭된 단백질(예를 들면, MCSP, FAP, CEA, EGFR, CD33, CD3)은 포유동물, 예컨대, 영장류(예를 들면, 인간) 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)를 포함하는 임의의 척추동물 공급원으로부터 유래된 임의의 천연 형태 단백질일 수 있다. 특정 실시양태에서, 항원은 인간 단백질이다. 본원에서 특정 단백질이 언급되는 경우, 상기 용어는 "전장" 비프로세싱된 단백질뿐만 아니라 세포에서의 프로세싱으로부터 발생되는 임의의 형태의 단백질도 포괄한다. 상기 용어는 단백질의 천연 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체도 포괄한다. 항원으로서 유용한 예시적 인간 단백질은 하기 단백질을 포함하나 이들로 한정되지 않는다: 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4(CSPG4)로도 공지된 흑색종 관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP)(유니프롯(UniProt) 번호 Q6UVK1(버전 70), NCBI RefSeq 번호 NP_001888.2); 세프라제(Seprase)로도 공지된 섬유모세포 활성화 단백질(FAP)(유니프롯 번호 Q12884, Q86Z29, Q99998, NCBI 수탁번호 NP_004451); 암배아 항원 관련 세포 부착 분자 5(CEACAM5)로도 공지된 암배아 항원 (CEA)(유니프롯 번호 P06731(버전 119), NCBI RefSeq 번호 NP_004354.2); gp67 또는 Siglec-3으로도 공지된 CD33(유니프롯 번호 P20138, NCBI 수탁번호. NP_001076087, NP_001171079); ErbB-1 또는 Her1로도 공지된 표피 성장인자 수용체(EGFR)(유니프롯 번호 P0053, NCBI 수탁번호. NP_958439, NP_958440); 및 CD3, 특히 CD3의 엡실론 서브유닛(유니프롯 번호 P07766(버전 130) 참조, NCBI RefSeq 번호 NP_000724.1, 인간 서열의 경우 서열번호 265; 또는 유니프롯 번호 Q95LI5(버전 49), NCBI 유전자은행 번호 BAB71849.1, 사이노몰구스[필리핀 원숭이(Macaca fascicularis) 서열]의 경우 서열번호 266). 특정 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 상이한 종의 활성화 T 세포 항원 또는 표적 항원 사이에 보존되어 있는 활성화 T 세포 항원 또는 표적 세포 항원의 에피토프에 결합한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 CD3 및 CEA(CEACAM5)에 결합하나, CEACAM1 또는 CEACAM6에는 결합하지 않는다.
"특이적 결합"은 결합이 항원에 대해 선택적이고 원치 않거나 비특이적인 상호작용으로부터 구별될 수 있다는 것을 의미한다. 특이적 항원성 결정인자에 결합하는 항원 결합 모이어티의 능력은 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA) 또는 당업자에게 알려진 다른 기법, 예를 들면, (비아코어 기계 상에서 분석되는) 표면 플라스몬 공명(SPR) 기법(문헌[Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)]) 및 전통적인 결합 분석(문헌[Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)])을 통해 측정될 수 있다. 한 실시양태에서, 항원 결합 모이어티와 관련없는 단백질의 결합 정도는 예를 들면, SPR에 의해 측정되었을 때 항원 결합 모이어티와 항원의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, 항원에 결합하는 항원 결합 모이어티, 또는 상기 항원 결합 모이어티를 포함하는 항원 결합 분자는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM(예를 들면, 10-8 M 이하, 예를 들면, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(KD)를 갖는다.
"친화성"은 분자의 단일 결합 부위(예를 들면, 수용체)와 그의 결합 파트너(예를 들면, 리간드) 사이의 비공유 상호작용의 총 합계의 강도를 지칭한다. 달리 표시되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원(예를 들면, 항원 결합 모이어티와 항원, 또는 수용체와 그의 리간드) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화성을 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로 해리 속도 상수 및 결합 속도 상수(각각 koff 및 kon)의 비인 해리 상수(KD)로 표시될 수 있다. 따라서, 상기 속도 상수의 비가 동일하게 유지되는 한, 동등한 친화성은 상이한 속도 상수를 포함할 수 있다. 친화성은 본원에 기재된 방법을 포함하는, 당분야에서 공지된 잘 확립된 방법에 의해 측정될 수 있다. 친화성을 측정하는 특정 방법은 표면 플라스몬 공명(SPR)이다.
"감소된 결합", 예를 들면, Fc 수용체에 대한 감소된 결합은 예를 들면, SPR에 의해 측정시 각각의 상호작용에 대한 친화성의 감소를 지칭한다. 명료함을 위해, 상기 용어는 0(또는 분석 방법의 검출 한계 미만), 즉 상호작용의 완전한 제거까지의 친화성의 감소도 포함한다. 대조적으로, "증가된 결합"은 각각의 상호작용에 대한 결합 친화성의 증가를 지칭한다.
본원에서 사용된 "활성화 T 세포 항원"은 항원 결합 분자와의 상호작용 시 T 세포 활성화를 유도할 수 있는, T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 표면 상에서 발현된 항원성 결정인자를 지칭한다. 구체적으로, 항원 결합 분자와 활성화 T 세포 항원의 상호작용은 T 세포 수용체 복합체의 신호전달 캐스케이드를 유발함으로써 T 세포 활성화를 유도할 수 있다. 특정 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원은 CD3이다.
본원에서 사용된 "T 세포 활성화"는 증식, 분화, 사이토카인 분비, 세포독성 효과기 분자 방출, 세포독성 활성, 및 활성화 마커의 발현으로부터 선택된, T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 하나 이상의 세포 반응을 지칭한다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 T 세포 활성화를 유도할 수 있다. T 세포 활성화를 측정하기에 적합한 분석은 본원에 기재된 바와 같이 당분야에서 공지되어 있다.
본원에서 사용된 "표적 세포 항원"은 표적 세포, 예를 들면, 종양 내의 세포, 예컨대, 암세포 또는 종양 간질의 세포의 표면 상에서 제시된 항원성 결정인자를 지칭한다.
본원에서 항원 결합 모이어티 등과 관련하여 사용된 용어 "제1" 및 "제2"는 하나 초과의 각각의 유형의 모이어티가 존재할 때 구별의 편리함을 위해 사용된다. 달리 명시되어 있지 않은 한, 이들 용어의 사용은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 특정 순서 또는 배향을 부여하기 위한 것이 아니다.
"Fab 분자"는 면역글로불린의 중쇄의 VH 및 CH1 도메인("Fab 중쇄") 및 경쇄의 VL 및 CL 도메인("Fab 경쇄")으로 구성된 단백질을 지칭한다.
"융합된"은 구성성분(예를 들면, Fab 분자 및 Fc 도메인 서브유닛)이 직접 또는 하나 이상의 펩티드 연결자를 통해 펩티드 결합에 의해 연결되어 있다는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "단일 쇄"는 펩티드 결합에 의해 선형으로 연결된 아미노산 단량체를 포함하는 분자를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 모이어티 중 하나는 단일 쇄 Fab 분자, 즉 Fab 경쇄와 Fab 중쇄가 펩티드 연결자에 의해 연결되어 단일 펩티드 쇄를 형성하는 Fab 분자이다. 이러한 특정 실시양태에서, Fab 경쇄의 C-말단은 단일 쇄 Fab 분자에서 Fab 중쇄의 N-말단에 연결되어 있다.
"교차" Fab 분자("교차fab"로도 지칭됨)는 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환되어 있는 Fab 분자를 의미한다(즉, 교차 Fab 분자는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역으로 구성된 펩티드 쇄, 및 중쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역으로 구성된 펩티드 쇄를 포함한다). 명료함을 위해, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역이 교환되어 있는 교차 Fab 분자에서 중쇄 불변 영역을 포함하는 펩티드 쇄는 본원에서 교차 Fab 분자의 "중쇄"로서 지칭된다. 대조적으로, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 불변 영역이 교환되어 있는 교차 Fab 분자에서 중쇄 가변 영역을 포함하는 펩티드 쇄는 본원에서 교차 Fab 분자의 "중쇄"로서 지칭된다.
용어 "면역글로불린 분자"는 천연 항체의 구조를 갖는 단백질을 지칭한다. 예를 들면, IgG 부류의 면역글로불린은 다이설파이드 결합된 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N-말단부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 또는 중쇄 가변 도메인으로도 지칭되는 가변 영역(VH)에 이어서 중쇄 불변 영역으로도 지칭되는 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 지칭되는 가변 영역(VL)에 이어서 경쇄 불변 영역으로도 지칭되는 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 면역글로불린의 중쇄는 α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG) 또는 μ(IgM)로 지칭되는 5종의 유형 중 하나로 배정될 수 있고, 이들 유형 중 일부는 하위유형, 예를 들면, γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4), α1(IgA1) 및 α2(IgA2)로 더 나누어질 수 있다. 면역글로불린의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 근거하여 카파(κ) 및 람다(λ)로 지칭되는 2종의 유형 중 하나로 배정될 수 있다. 면역글로불린은 본질적으로 면역글로불린 힌지(hinge) 영역을 통해 연결된 2개의 Fab 분자 및 1개의 Fc 도메인으로 구성된다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 원하는 항원 결합 활성을 나타내는 한, 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 항체 단편을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 항체 구조물을 포괄한다.
"항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는, 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예에는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 다이아바디, 선형 항체, 단일 쇄 항체 분자(예를 들면, scFv), 및 단일 도메인 항체가 포함되나 이들로 한정되지 않는다. 일부 항체 단편의 검토를 위해서는 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편의 검토를 위해서는 예를 들면, 문헌[Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조하고, WO 93/16185 및 미국 특허 제5,571,894호 및 제5,587,458호도 참조한다. 살비지(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의를 위해서는 미국 특허 제5,869,046호를 참조한다. 다이아바디는 2가일 수 있거나 이중특이적일 수 있는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들면, 유럽 특허 제404,097호; WO 1993/01161; 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]; 및 문헌[Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)]을 참조한다. 또한, 트라이아바디 및 테트라바디가 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]에 기재되어 있다. 단일 도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부, 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 인간 단일 도메인 항체(도맨티스 인코포페이티드(Domantis, Inc., 미국 매사추세츠주 왈탐 소재); 예를 들면, 미국 특허 제 6,248,516 B1호 참조)이다. 항체 단편은 본원에 기재된 바와 같이 온전한 항체의 단백질용해성 분해 및 재조합 숙주 세포(예를 들면, 이. 콜라이(E. coli) 또는 파지)에 의한 제조를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 기법에 의해 제조될 수 있다.
용어 "항원 결합 도메인"은 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 항원의 일부 또는 전부에 상보적인 영역을 포함하는 항체의 일부를 지칭한다. 항원 결합 도메인은 예를 들면, 하나 이상의 항체 가변 도메인(항체 가변 영역으로도 지칭됨)에 의해 제공될 수 있다. 특히, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체와 항원의 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄(각각 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 이때 각각의 도메인은 4개의 보존된 골격 영역(FR) 및 3개의 초가변 영역(HVR)을 포함한다. 예를 들면, 문헌[Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)]을 참조한다. 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열 면에서 초가변성을 갖고/갖거나 구조적으로 정의된 루프("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역 각각을 지칭한다. 일반적으로, 천연 4쇄 항체는 6개의 HVR(VH 내의 3개 HVR(H1, H2 및 H3) 및 VL 내의 3개 HVR(L1, L2 및 L3))을 포함한다. HVR은 일반적으로 초가변 루프 및/또는 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 잔기를 포함하고, 이때 후자는 가장 높은 서열 가변성을 갖고/갖거나 항원 인식에 관여한다. VH 내의 CDR1을 제외하고, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. 초가변 영역(HVR)은 "상보성 결정 영역"(CDR)으로도 지칭되고, 이들 용어는 항원 결합 영역을 형성하는 가변 영역의 일부를 언급하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이 특정 영역은 문헌[Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983)] 및 [Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987)]에 기재되어 있고, 이때 정의는 서로에 대해 비교되었을 때 아미노산 잔기의 중첩 또는 서브세트를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 이의 변이체의 CDR을 지칭하기 위한 어느 한 정의의 적용은 본원에서 정의되고 사용된 용어의 범위 내에 있기 위한 것이다. 상기 인용된 참고문헌 각각에 의해 정의된 CDR을 구성하는 적절한 아미노산 잔기는 비교로서 하기 표 1에 기재되어 있다. 특정 CDR을 구성하는 정확한 잔기 수는 상기 CDR의 서열 및 크기에 따라 달라질 것이다. 당업자는 항체의 가변 영역 아미노산 서열이 주어졌을 때 어떤 잔기가 특정 CDR을 구성하는 지를 상용적으로 결정할 수 있다.
[표 1]
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또한, 카바트 등의 문헌은 임의의 항체에 적용될 수 있는 가변 영역 서열에 대한 넘버링 시스템을 정의하였다. 당업자는 서열 자체 이외의 임의의 실험 데이터에 의존하지 않으면서 이 "카바트 넘버링" 시스템을 임의의 가변 영역 서열에 명확히 배정할 수 있다. 본원에서 사용된 "카바트 넘버링"은 문헌[Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "서열 of Proteins of Immunological Interest" (1983)]에 기재된 넘버링 시스템을 지칭한다. 달리 특정되어 있지 않은 한, 항체 가변 영역 내의 특정 아미노산 잔기 위치의 넘버링에 대한 언급은 카바트 넘버링 시스템에 따른다.
서열목록의 폴리펩티드 서열은 카바트 넘버링 시스템에 따라 넘버링되어 있지 않다. 그러나, 서열목록의 서열의 넘버링을 카바트 넘버링으로 전환시키는 것은 당분야에서 통상의 기술 범위 내에 있다.
"골격" 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 하기 4개의 FR 도메인으로 구성된다: FR1, FR2, FR3 및 FR4. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 하기 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
항체 또는 면역글로불린의 "부류"는 그의 중쇄에 의해 보유된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 하기 5종의 주요 부류, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 일부는 하위부류(동종형), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 나누어질 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭된다.
본원에서 용어 "Fc 도메인" 또는 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. IgG 중쇄의 Fc 영역의 경계가 약간 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로 Cys226 또는 Pro230부터 중쇄의 카복시-말단까지 걸쳐 있는 것으로 정의된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 라이신(Lys447)은 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 특정되어 있지 않은 한, Fc 영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같이 EU 지수로도 지칭되는 EU 넘버링 시스템에 따른다. 본원에서 사용된 Fc 도메인의 "서브유닛"은 안정한 자가 결합을 형성할 수 있는, 이량체 Fc 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩티드 중 하나, 즉 면역글로불린 중쇄의 C-말단 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들면, IgG Fc 도메인의 서브유닛은 IgG CH2 및 IgG CH3 불변 도메인을 포함한다.
"Fc 도메인의 제1 서브유닛과 제2 서브유닛의 결합을 촉진하는 변경"은 Fc 도메인 서브유닛을 포함하는 폴리펩티드와 동일한 폴리펩티드가 결합하여 동종이량체를 형성하는 것을 감소시키거나 방해하는, Fc 도메인 서브유닛의 펩티드 골격 조작 또는 번역 후 변경이다. 본원에서 사용된 결합을 촉진하는 변경은 특히 원하는 2개의 Fc 도메인 서브유닛(즉, Fc 도메인의 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛) 각각이 결합하도록 만들어진 별도의 변경을 포함하고, 이때 상기 변경은 상기 2개의 Fc 도메인 서브유닛의 결합을 촉진하도록 서로 상보적이다. 예를 들면, 결합을 촉진하는 변경은 Fc 도메인 서브유닛의 결합을 각각 입체적으로 또는 정전기적으로 유리하게 만들도록 상기 Fc 도메인 서브유닛 중 하나 또는 둘다의 구조 또는 전하를 변경시킬 수 있다. 따라서, (이종)이량체화는 서브유닛(예를 들면, 항원 결합 모이어티) 각각에 융합된 추가적 구성성분이 동일하지 않다는 의미에서 동일하지 않을, 제1 Fc 도메인 서브유닛을 포함하는 폴리펩티드와 제2 Fc 도메인 서브유닛을 포함하는 폴리펩티드 사이에 일어난다. 일부 실시양태에서, 결합을 촉진하는 변경은 Fc 도메인에서 아미노산 돌연변이, 특히 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 결합을 촉진하는 변경은 Fc 도메인의 2개 서브유닛 각각에서 별도의 아미노산 돌연변이, 특히 아미노산 치환을 포함한다.
용어 "효과기 기능"은 항체 동종형에 따라 달라지는, 항체의 Fc 영역에 기인할 수 있는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 효과기 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, 항체 의존적 세포-매개된 세포독성(ADCC), 항체 의존적 세포 식균작용(ADCP), 사이토카인 분비, 항원 제시 세포에 의한 면역 복합체-매개된 항원 섭취, 세포 표면 수용체(예를 들면, B 세포 수용체)의 하향조절 및 B 세포 활성화를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "조작하다", "조작된" 및 "조작하는"은 천연 또는 재조합 폴리펩티드 또는 이의 단편의 임의의 펩티드 골격 조작 또는 번역 후 변경을 포함하는 것으로 간주된다. 조작은 아미노산 서열, 글리코실화 패턴 또는 개별 아미노산의 측쇄 기의 변경뿐만 아니라 이들 방법의 조합도 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "아미노산 돌연변이"는 아미노산 치환, 결실, 삽입 및 변경을 포괄하기 위한 것이다. 최종 구축물이 원하는 특성, 예를 들면, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 또는 또다른 펩티드에 대한 증가된 결합을 보유하는 한, 최종 구축물에 도달하기 위해 치환, 결실, 삽입 및 변경의 임의의 조합을 만들 수 있다. 아미노산 서열 결실 및 삽입은 아미노산의 아미노-말단 및/또는 카복시-말단 결실 및 삽입을 포함한다. 특정 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 예를 들면, Fc 영역의 결합 특성을 변경시키기 위한 목적으로, 비보존적 아미노산 치환, 즉 한 아미노산을 상이한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또다른 아미노산으로 치환시키는 것이 특히 바람직하다. 아미노산 치환은 비천연 아미노산에 의한 치환 또는 20종의 표준 아미노산의 천연 아미노산 유도체(예를 들면, 4-하이드록시프롤린, 3-메틸히스티딘, 오르니틴, 호모세린, 5-하이드록시라이신)에 의한 치환을 포함한다. 당분야에서 주지된 유전적 또는 화학적 방법을 사용하여 아미노산 돌연변이를 발생시킬 수 있다. 유전적 방법은 부위-지정된 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 아미노산의 측쇄 기를 유전적 조작 이외의 방법, 예컨대, 화학적 변경으로 변경시키는 방법도 유용할 수 있다고 생각된다. 동일한 아미노산 돌연변이를 표시하기 위해 다양한 표기가 본원에서 사용될 수 있다. 예를 들면, Fc 도메인의 위치 329에서 프롤린을 글리신으로 치환시키는 것은 329G, G329, G329, P329G 또는 Pro329Gly로서 표시될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "폴리펩티드"는 아미드 결합(펩티드 결합으로도 공지됨)에 의해 선형으로 연결된 단량체(아미노산)로 구성된 분자를 지칭한다. 용어 "폴리펩티드"는 2개 이상의 아미노산으로 구성된 임의의 쇄를 지칭하고, 구체적 길이의 생성물을 지칭하지 않는다. 따라서, 2개 이상의 아미노산으로 구성된 쇄를 지칭하기 위해 사용되는 펩티드, 다이펩티드, 트라이펩티드, 올리고펩티드, "단백질", "아미노산 쇄" 또는 임의의 다른 용어가 "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩티드"는 이들 용어 중 임의의 용어 대신에 또는 이러한 용어와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 또한, 용어 "폴리펩티드"는 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질용해성 절단, 또는 비천연 아미노산에 의한 변경을 포함하나 이들로 한정되지 않는 폴리펩티드의 발현 후 변경의 생성물을 지칭하기 위한 것이다. 폴리펩티드는 천연 생물학적 공급원으로부터 유래될 수 있거나 재조합 기술에 의해 제조될 수 있지만, 반드시 표기된 핵산 서열로부터 번역되지는 않는다. 폴리펩티드는 화학적 합성을 포함하는 임의의 방식으로 발생될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 크기는 약 3개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 200개 이상, 500개 이상, 1,000개 이상 또는 2,000개 이상의 아미노산일 수 있다. 폴리펩티드는 정의된 3차원적 구조를 가질 수 있지만 반드시 이러한 구조를 갖지는 않는다. 정의된 3차원적 구조를 갖는 폴리펩티드는 접혀진(folded) 폴리펩티드로서 지칭되고, 정의된 3차원적 구조를 보유하지 않는 폴리펩티드는 오히려 다수의 상이한 입체구조를 채택할 수 있고 접혀지지 않은(unfolded) 폴리펩티드로서 지칭된다.
"단리된" 폴리펩티드 또는 변이체, 또는 이의 유도체는 그의 천연 환경에서 존재하지 않는 폴리펩티드를 의미하기 위한 것이다. 특정한 수준의 정제가 요구되지는 않는다. 예를 들면, 단리된 폴리펩티드는 그의 천연 상태 또는 천연 환경으로부터 분리될 수 있다. 재조합적으로 제조된 폴리펩티드 및 숙주 세포에서 발현된 단백질은 임의의 적합한 기법에 의해 분리되거나, 분획화되거나, 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 천연 또는 재조합 폴리펩티드처럼 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다.
기준 폴리펩티드 서열에 대하여 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은 서열을 정렬하고 필요하다면 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입하고 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않은 후 기준 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 당분야의 기술 내에 있는 다양한 방식, 예를 들면, 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 사용함으로써 결정될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 결정하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 서열 정렬을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상 % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2의 사용을 통해 발생된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 만들어졌고, 소스 코드는 미국 저작권 협회(U.S. Copyright Office, 미국 워싱톤 디씨 20559 소재)에 사용자 문서로 출원되었고, 상기 미국 저작권 협회에서 상기 코드는 미국 저작권 등록 번호 TXU510087하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코 소재)로부터 공개적으로 입수될 수 있거나 상기 소스 코드로부터 편집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하는 UNIX 작동 시스템 상에서 사용을 위해 편집되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고 변경되지 않는다. ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 경우, 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성(또는, 주어진 아미노산 서열 B에 대한 특정 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있음)은 다음과 같이 계산된다:
100 × (X/Y)
여기서, X는 A 및 B의 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2 정렬에서 상기 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 일치(match)로서 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에 존재하는 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동등하지 않은 경우, B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 동등하지 않을 것임이 인식될 것이다. 달리 구체적으로 명시되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램의 사용을 통해 바로 이전 단락에 기재된 바와 같이 수득된다.
용어 "폴리펩티드"는 단리된 핵산 분자 또는 구축물, 예를 들면, 메신저 RNA(mRNA), 바이러스로부터 유래된 RNA 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 통상적인 포스포다이에스터 결합 또는 비통상적인 결합(예를 들면, 아미드 결합, 예컨대, 펩티드 핵산(PNA)에서 발견되는 결합)을 포함할 수 있다. 용어 "핵산 분자"는 폴리뉴클레오티드에 존재하는 임의의 하나 이상의 핵산 분절, 예를 들면, DNA 또는 RNA 단편을 지칭한다.
"단리된" 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드는 그의 천연 환경으로부터 분리되어 있는 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 의미하기 위한 것이다. 예를 들면, 벡터에 함유된 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 추가적 예에는 이종 숙주 세포 내에서 유지된 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 용액 중의 (부분적으로 또는 실질적으로) 정제된 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 분자를 통상적으로 함유하지 않는 세포 내에 함유된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하지만, 폴리뉴클레오티드 분자는 염색체 외부에 존재하거나 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다. 단리된 RNA 분자는 본 발명의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체뿐만 아니라, 양성 및 음성 가닥 형태 및 이중 가닥 형태도 포함한다. 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 합성 제조된 이러한 분자를 추가로 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 조절 요소, 예컨대, 프로모터, 리보좀 결합 부위 또는 전사 종결요소일 수 있거나 이러한 조절 요소를 포함할 수 있다.
본 발명의 기준 뉴클레오티드 서열과 예를 들면 95% 이상 "동일한" 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기준 뉴클레오티드 서열의 각각 100개 뉴클레오티드 당 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 점을 제외하고 상기 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 기준 서열과 동일하다는 것을 의미한다. 다시 말해, 기준 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위해, 기준 서열에서 5% 이하의 뉴클레오티드가 결실될 수 있거나 또다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있거나, 기준 서열 내의 총 뉴클레오티드의 5% 이하를 차지하는 다수의 뉴클레오티드가 기준 서열 내로 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이들 변경은 기준 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 일어날 수 있거나, 이들 말단 위치 사이의 임의의 위치에서 일어날 수 있거나, 기준 서열 내의 잔기 사이에 개별적으로 산재되어 있을 수 있거나, 기준 서열 내에서 하나 이상의 인접한 군으로 산재되어 있을 수 있다. 실질적인 문제로서, 임의의 특정 폴리뉴클레오티드 서열이 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 지를, 공지된 컴퓨터 프로그램, 예컨대, 폴리펩티드에 대해 상기 논의된 프로그램(예를 들면, ALIGN-2)을 사용하여 통상적으로 결정할 수 있다.
용어 "발현 카세트"는 표적 세포에서 특정 핵산의 전사를 허용하는 일련의 특정된 핵산 요소와 함께 재조합적으로 또는 합성적으로 발생된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 재조합 발현 카세트는 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 플라스티드 DNA, 바이러스 또는 핵산 단편 내로 삽입될 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분은 다른 서열 중에서 전사될 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 발현 카세트는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 "발현 구축물"과 동의어이고, 표적 세포 내로 도입되어 표적 세포에서 그 자신과 작동가능하게 연결된 특정 유전자의 발현을 지시하는 데에 사용되는 DNA 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자가 복제 핵산 구조물로서의 벡터뿐만 아니라 그 자신이 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 삽입된 벡터도 포함한다. 본 발명의 발현 벡터는 발현 카세트를 포함한다. 발현 벡터는 다량의 안정한 mRNA의 전사를 가능하게 한다. 발현 벡터가 표적 세포 내부에 존재하면, 유전자에 의해 암호화된 리보핵산 분자 또는 단백질이 세포 전사 및/또는 번역 기구에 의해 제조된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되고, 외래 핵산이 도입되어 있는 세포(이러한 세포의 자손을 포함함)를 지칭한다. 숙주 세포는 일차 형질전환된 세포 및 계대배양의 수와 관계없이 이로부터 유래된 자손을 포함하는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함한다. 자손은 핵산 함량 면에서 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있으나 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래의 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선별된 기능 또는 생물학적 활성과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 여기에 포함된다. 숙주 세포는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 발생시키는 데에 사용될 수 있는 임의의 유형의 세포 시스템이다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예를 들면, 배양된 포유동물 세포, 예컨대, CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 효모 세포, 곤충 세포 및 식물 세포를 포함할 뿐만 아니라, 형질전환 동물, 형질전환 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포도 포함한다.
"활성화 Fc 수용체"는 항체의 Fc 도메인의 개입 후 효과기 기능을 수행하도록 수용체 보유 세포를 자극하는 신호전달 사건을 이끌어내는 Fc 수용체이다. 인간 활성화 Fc 수용체는 FcγRIIIa(CD16a), FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32) 및 FcαRI(CD89)를 포함한다.
항체 의존적 세포-매개된 세포독성(ADCC)은 면역 효과기 세포에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 용해를 유발하는 면역 기작이다. 표적 세포는 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 이의 유도체가 일반적으로 Fc 영역의 N-말단에 위치하는 단백질 부분을 통해 특이적으로 결합하는 세포이다. 본원에서 사용된 용어 "감소된 ADCC"는 상기 정의된 ADCC의 기작에 의해 표적 세포를 둘러싸는 매질 중의 항체의 주어진 농도에서 주어진 시간 이내에 용해되는 표적 세포 수의 감소, 및/또는 ADCC의 기작에 의해 주어진 시간 이내에 주어진 수의 표적 세포의 용해를 달성하는 데에 요구되는, 표적 세포를 둘러싸는 매질 중의 항체의 농도의 증가로서 정의된다. ADCC의 감소는 동일한 표준 제조, 정제, 제형화 및 저장 방법(당업자에게 공지되어 있음)을 사용하였을 때 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 제조되되, 조작되지 않은 동일한 항체에 의해 매개된 ADCC에 비해 상대적인 감소이다. 예를 들면, ADCC를 감소시키는 아미노산 치환을 그의 Fc 도메인 내에 포함하는 항체에 의해 매개된 ADCC의 감소는 Fc 도메인 내에 이 아미노산 치환을 갖지 않는 동일한 항체에 의해 매개된 ADCC에 비해 상대적인 감소이다. ADCC를 측정하기에 적합한 분석은 당분야에서 주지되어 있다(예를 들면, WO 2006/082515 또는 WO 2012/130831 참조).
제제의 "유효량"은 이 제제가 투여되는 세포 또는 조직에서 생리학적 변화를 발생시키기 위해 필요한 양을 지칭한다.
제제, 예를 들면, 약학 조성물의 "치료 유효량"은 필요한 시간 동안 필요한 용량에서 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기에 효과적인 양을 지칭한다. 치료 유효량의 제제는 예를 들면, 질환의 불리한 효과를 제거하거나, 감소시키거나, 지연시키거나, 최소화하거나 방지한다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축(예를 들면, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들면, 인간 및 비인간 영장류, 예컨대, 원숭이), 토끼 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 구체적으로, 개체 또는 대상체는 인간이다.
용어 "약학 조성물"은 내부에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이게 하는 형태로 존재하고 제제가 투여될 대상체에게 허용되지 않는 독성을 나타내는 추가적 구성성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
용어 "약학적으로 허용되는 담체"는 활성 성분 이외에 대상체에게 독성을 나타내지 않는 약학 조성물 중의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 방부제를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
본원에서 사용된 "치료"(및 이의 문법적 어미변화, 예컨대, "치료하다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개체에서의 질환의 자연 경과를 변경시키기 위한 시도에서의 임상 시술을 지칭하고, 예방을 위해 또는 임상 병리의 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이의 예방, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 호전 또는 경감, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 질환의 발달을 지연시키거나 질환의 진행을 늦추기 위해 사용된다.
용어 "포장 삽입물"은 치료 제품의 상업적 포장물 내에 통상적으로 포함되는 설명서로서, 증상, 용법, 용량, 투여, 병용 치료, 사용금지사유, 및/또는 이러한 치료 제품의 사용에 관한 경고에 대한 정보를 함유하는 설명서를 지칭하기 위해 사용된다.
실시양태의 상세한 설명
제1 양태에서, 본 발명은 제1 항원 결합 모이어티 및 제2 항원 결합 모이어티, 및 안정한 결합을 형성할 수 있는 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛으로 구성된 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하되, 상기 제1 항원 결합 모이어티 및 제2 항원 결합 모이어티 중 하나가 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고, 나머지 하나가 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고; 상기 제1 항원 결합 모이어티는
(a) Fab 경쇄와 Fab 중쇄가 펩티드 연결자에 의해 연결되어 있는 단일 쇄 Fab 분자, 또는
(b) Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교환되어 있는 교차 Fab 분자이다.
일부 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원은 CD3이다.
특정 실시양태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 270, 서열번호 271 및 서열번호 272로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 274, 서열번호 275 및 서열번호 276으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이다.
한 실시양태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 269, 서열번호 298 및 서열번호 299로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 273 및 서열번호 297로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이다.
한 실시양태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 269의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 273의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이다.
구체적 실시양태에서, 제2 항원 결합 모이어티는 CEA에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 290, 서열번호 291 및 서열번호 292로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 294, 서열번호 295 및 서열번호 296으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
또다른 구체적인 실시양태에서, 제2 항원 결합 모이어티는 CEA에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 289의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 293의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또다른 구체적인 실시양태에서, 제2 항원 결합 모이어티는 MCSP에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 280, 서열번호 281, 서열번호 282, 서열번호 301, 서열번호 303, 서열번호 304 및 서열번호 306으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 284, 서열번호 285, 서열번호 286, 서열번호 310, 서열번호 311, 서열번호 314, 서열번호 315 및 서열번호 316으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
또다른 구체적인 실시양태에서, 제2 항원 결합 모이어티는 MCSP에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 280, 서열번호 281 및 서열번호 282로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 284, 서열번호 285 및 서열번호 286으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
또다른 구체적인 실시양태에서, 제2 항원 결합 모이어티는 MCSP에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 279, 서열번호 300, 서열번호 302, 서열번호 305 및 서열번호 307로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 283, 서열번호 309, 서열번호 312, 서열번호 313 및 서열번호 317로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또다른 구체적인 실시양태에서, 제2 항원 결합 모이어티는 MCSP에 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 279의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 283의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(i) 서열번호 270, 서열번호 271 및 서열번호 272로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 274, 서열번호 275 및 서열번호 276으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; 및
(ii) 서열번호 290, 서열번호 291 및 서열번호 292로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 294, 서열번호 295 및 서열번호 296으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제2 항원 결합 모이어티
를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(i) 서열번호 269의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 273의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; 및
(ii) 서열번호 289의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 293의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제2 항원 결합 모이어티
를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(i) 서열번호 270, 서열번호 271 및 서열번호 272로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 274, 서열번호 275 및 서열번호 276으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; 및
(ii) 서열번호 280, 서열번호 281 및 서열번호 282로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 284, 서열번호 285 및 서열번호 286으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는, MCSP에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제2 항원 결합 모이어티
를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(i) 서열번호 269의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 273의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티; 및
(ii) 서열번호 279의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 283의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, MCSP에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제2 항원 결합 모이어티
를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
특정 실시양태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교환되어 있는 교차 Fab 분자이다. 보다 더 특정한 실시양태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 불변 영역이 교환되어 있는 교차 Fab 분자이다.
한 실시양태에서, 제2 항원 결합 모이어티는 통상적 Fab 분자이다.
추가적 구체적인 실시양태에서, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이하의 항원 결합 모이어티가 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 존재한다(즉, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 CD3에 대한 1가 결합을 제공한다).
한 실시양태에서, 본 발명은
(i), 서열번호 270의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 271의 중쇄 CDR 2, 서열번호 272의 중쇄 CDR 3, 서열번호 274의 경쇄 CDR 1, 서열번호 275의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 276의 경쇄 CDR 3을 포함하는, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티로서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역 둘 중 하나가, 특히 불변 영역이 교차되어 있는 교차 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티;
(ii) 서열번호 290의 중쇄 CDR 1, 서열번호 291의 중쇄 CDR 2, 서열번호 292의 중쇄 CDR 3, 서열번호 294의 경쇄 CDR 1, 서열번호 295의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 296의 경쇄 CDR3을 포함하는, 각각 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제2 항원 결합 모이어티 및 제3 항원 결합 모이어티; 및
(iii) 안정한 결합을 형성할 수 있는 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛으로 구성된 IgG4 Fc 도메인
을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(i) 서열번호 269의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 273의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티로서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역 둘 중 하나가, 특히 불변 영역이 교환되어 있는 교차 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티;
(ii) 서열번호 289의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 293의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 각각 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제2 항원 결합 모이어티 및 제3 항원 결합 모이어티; 및
(iii) 안정한 결합을 형성할 수 있는 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛으로 구성된 IgG4 Fc 도메인
을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(i) 서열번호 270의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 271의 중쇄 CDR 2, 서열번호 272의 중쇄 CDR 3, 서열번호 274의 경쇄 CDR 1, 서열번호 275의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 276의 경쇄 CDR 3을 포함하는, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티로서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역 둘 중 하나가, 특히 불변 영역이 교환되어 있는 교차 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티;
(ii) 서열번호 280의 중쇄 CDR 1, 서열번호 281의 중쇄 CDR 2, 서열번호 282의 중쇄 CDR 3, 서열번호 284의 경쇄 CDR 1, 서열번호 285의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 286의 경쇄 CDR3을 포함하는, 각각 MCSP에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제2 항원 결합 모이어티 및 제3 항원 결합 모이어티; 및
(iii) 안정한 결합을 형성할 수 있는 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛으로 구성된 IgG4 Fc 도메인
을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
(i) 서열번호 269의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 273의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티로서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역 둘 중 하나가, 특히 불변 영역이 교환되어 있는 교차 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티;
(ii) 서열번호 279의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 283의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 각각 MCSP에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자 분자인 제2 항원 결합 모이어티 및 제3 항원 결합 모이어티; 및
(iii) 안정한 결합을 형성할 수 있는 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛으로 구성된 IgG4 Fc 도메인
을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
상기 4개의 실시양태 중 임의의 것에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에서, 바람직하게 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있고, 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 IgG4 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있고, 제3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 IgG4 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다.
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 포맷
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 성분은 다양한 배열로 서로 융합될 수 있다. 예시적 배열은 도 1에 도시되어 있다.
일부 실시양태에서, 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 서브유닛 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다.
이러한 특정 실시양태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있다. 구체적인 이러한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 본질적으로 제1 항원 결합 모이어티, 제2 항원 결합 모이어티, 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결자로 구성되되, 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있고, 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 서브유닛 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다. 보다 더 구체적인 실시양태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 단일 쇄 Fab 분자이다. 또는, 특정 실시양태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 교차 Fab 분자이다. 임의적으로, 제1 항원 결합 모이어티가 교차 Fab 분자인 경우, 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄와 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄는 추가로 서로 융합될 수 있다.
대안적인 이러한 실시양태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 서브유닛 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다. 구체적인 이러한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 본질적으로 제1 항원 결합 모이어티, 제2 항원 결합 모이어티, 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결자로 구성되되, 제1 항원 결합 모이어티 및 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 각각 융합되어 있다. 보다 더 구체적인 실시양태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 단일 쇄 Fab 분자이다. 또는, 구체적인 실시양태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 교차 Fab 분자이다.
또다른 이러한 실시양태에서, 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 경쇄의 C-말단에서 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄의 N-말단에 융합되어 있다. 구체적인 이러한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 본질적으로 제1 항원 결합 모이어티, 제2 항원 결합 모이어티, 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결자로 구성되고, 이때 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 경쇄의 N-말단에서 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄의 C-말단에 융합되어 있고, 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 서브유닛 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다. 보다 더 구체적인 실시양태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 교차 Fab 분자이다.
다른 실시양태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 서브유닛 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다.
구체적인 이러한 실시양태에서, 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있다. 구체적인 이러한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 본질적으로 제1 항원 결합 모이어티, 제2 항원 결합 모이어티, 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결자로 구성되고, 이때 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있고, 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 서브유닛 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다. 보다 더 구체적인 실시양태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 교차 Fab 분자이다. 임의적으로, 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄와 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄는 추가로 서로 융합될 수 있다.
특히 이들 실시양태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 다른 실시양태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있다.
항원 결합 모이어티는 Fc 도메인에 융합될 수 있거나, 직접 또는 하나 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2 내지 20개의 아미노산을 포함하는 펩티드 연결자를 통해 서로 융합될 수 있다. 펩티드 연결자는 당분야에서 공지되어 있고 본원에 기재된 바와 같다. 적합한 비면역원성 펩티드 연결자는 예를 들면, (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 연결자를 포함한다. "n"은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4의 수이다. 제1 항원 결합 모이어티 및 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄를 서로 융합시키는 데에 특히 적합한 펩티드 연결자는 (G4S)2이다. 제1 항원 결합 모이어티 및 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄를 연결하는 데에 적합한 예시적 펩티드 연결자는 EPKSC(D)-(G4S)2(서열번호 150 및 151)이다. 추가로, 연결자는 면역글로불린 힌지 영역(의 일부)을 포함할 수 있다. 특히, 항원 결합 모이어티가 Fc 도메인 서브유닛의 N-말단에 융합되는 경우, 추가적 펩티드 연결자를 사용하거나 사용하지 않고 면역글로불린 힌지 영역 또는 이의 일부를 통해 상기 항원 결합 모이어티를 융합시킬 수 있다.
특히, 고친화성 항원 결합 모이어티의 결합 후 표적 세포 항원의 내재화가 예상되는 경우, (예를 들면, 도 1a 및 1b의 A, B, D, E, H, I, K 또는 M에 나타낸 바와 같이) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단일 항원 결합 모이어티를 갖는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 유용하다. 이러한 경우, 표적 세포 항원에 대해 특이적인 하나 초과의 항원 결합 모이어티의 존재는 표적 세포 항원의 내재화를 향상시킴으로써 그의 사용가능성을 감소시킬 수 있다.
그러나, 많은 다른 경우에서, 예를 들면, 표적 부위로의 표적화를 최적화하거나 표적 세포 항원의 가교결합을 가능하게 하기 위해 표적 세포 항원에 대해 특이적인 2개 이상의 항원 결합 모이어티를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 갖는 것이 유리할 것이다(도 1a 및 1b의 C, F, G, J 또는 L에 나타낸 예 참조).
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제3 항원 결합 모이어티를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 제3 항원 결합 모이어티는 제1 항원 결합 모이어티 또는 제2 항원 결합 모이어티에 의해 결합되는 표적 세포 항원과 동일한 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있고, 제2 항원 결합 모이어티 및 제3 항원 결합 모이어티는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있다.
한 실시양태에서, 제3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 서브유닛 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다. 특정 실시양태에서, 제2 항원 결합 모이어티 및 제3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 각각 융합되어 있고, 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있다. 이러한 한 실시양태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 단일 쇄 Fab 분자이다. 이러한 특정 실시양태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 교차 Fab 분자이다. 임의적으로, 제1 항원 결합 모이어티가 교차 Fab 분자인 경우, 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄와 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄는 추가로 서로 융합될 수 있다.
제2 항원 결합 모이어티 및 제3 항원 결합 모이어티는 직접 또는 펩티드 연결자를 통해 Fc 도메인에 융합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제2 항원 결합 모이어티 및 제3 항원 결합 모이어티는 면역글로불린 힌지 영역을 통해 Fc 도메인에 각각 융합되어 있다. 구체적인 실시양태에서, 면역글로불린 힌지 영역은 인간 IgG1 힌지 영역이다. 한 실시양태에서, 제2 항원 결합 모이어티, 제3 항원 결합 모이어티 및 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 일부이다. 특정 실시양태에서, 면역글로불린 분자는 IgG 부류 면역글로불린이다. 보다 더 특정한 실시양태에서, 면역글로불린은 IgG1 하위부류 면역글로불린이다. 또다른 실시양태에서, 면역글로불린은 IgG4 하위부류 면역글로불린이다. 추가적 특정 실시양태에서, 면역글로불린은 인간 면역글로불린이다. 다른 실시양태에서, 면역글로불린은 키메라 면역글로불린 또는 인간화된 면역글로불린이다. 한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 본질적으로 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자, 및 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티로 구성되고, 이때 상기 항원 결합 모이어티는 임의적으로 펩티드 연결자를 통해 면역글로불린 중쇄 중 하나의 N-말단에 융합된 단일 쇄 Fab 분자 또는 교차 Fab 분자, 특히 교차 Fab 분자이다.
대안적인 실시양태에서, 제1 항원 결합 모이어티 및 제3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 각각 융합되어 있고, 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있다. 구체적인 이러한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 본질적으로 제1 항원 결합 모이어티, 제2 항원 결합 모이어티, 제3 항원 결합 모이어티, 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결자로 구성되고, 이때 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있고, 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있고, 제3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있다. 이러한 특정 실시양태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 교차 Fab 분자이다. 임의적으로, 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄와 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄는 추가로 서로 융합될 수 있다.
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 중 일부에서, 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄와 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄는 임의적으로 연결자 펩티드를 통해 서로 융합되어 있다. 제1 항원 결합 모이어티 및 제2 항원 결합 모이어티의 배열에 따라, 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄는 그의 C-말단에서 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄의 N-말단에 융합될 수 있거나, 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄는 그의 C-말단에서 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄의 N-말단에 융합될 수 있다. 제1 항원 결합 모이어티 및 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄의 융합은 불일치된 Fab 중쇄 및 경쇄의 미스페어링을 더 감소시키고, 또한, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 중 일부의 발현을 위해 필요한 플라스미드의 수를 감소시킨다.
특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제1 Fab 경쇄가 펩티드 연결자와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 펩티드 연결자가 제1 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 제1 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL-CL-연결자-VH-CH1-CH2-CH2(-CH4)); 및 제2 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL-CL)를 추가로 포함하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 예를 들면, 다이설파이드 결합에 의해 공유연결되어 있다.
일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제1 Fab 경쇄가 펩티드 연결자와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 펩티드 연결자가 제1 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 제1 Fab 중쇄가 제2 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 제2 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL-CL-연결자-VH-CH1-VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다. 이들 실시양태 중 하나에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL-CL)를 추가로 포함한다. 이들 실시양태에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 (i) Fc 도메인 서브유닛 폴리펩티드(CH2-CH3(-CH4)), 또는 (ii) 제3 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)) 및 제3 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL-CL)를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 예를 들면, 다이설파이드 결합에 의해 공유연결되어 있다.
특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제1 Fab 경쇄 가변 영역이 제1 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역으로 치환되어 있는 교차 Fab 중쇄), 상기 제1 Fab 중쇄 불변 영역이 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL-CH1-CH2-CH3(-CH4)); 및 제2 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 Fab 중쇄 가변 영역이 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH-CL) 및 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL-CL)를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 예를 들면, 다이설파이드 결합에 의해 공유연결되어 있다.
대안적인 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제1 Fab 중쇄 가변 영역이 제1 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 중쇄 불변 영역이 경쇄 불변 영역으로 치환되어 있는 교차 Fab 중쇄), 상기 제1 Fab 경쇄 불변 영역이 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH-CL-CH2-CH3(-CH4)); 및 제2 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 Fab 경쇄 가변 영역이 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL-CH1), 및 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL-CL)를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 예를 들면, 다이설파이드 결합에 의해 공유연결되어 있다.
일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제1 Fab 경쇄 가변 영역이 제1 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역으로 치환되어 있는 교차 Fab 중쇄), 상기 제1 Fab 중쇄 불변 영역이 제2 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 제2 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL-CH1-VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다. 다른 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제1 Fab 중쇄 가변 영역이 제1 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 중쇄 불변 영역이 경쇄 불변 영역으로 치환되어 있는 교차 Fab 중쇄), 상기 제1 Fab 경쇄 불변 영역이 제2 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 제2 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH-CL-VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다. 또다른 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 중쇄가 제1 Fab 경쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 제1 Fab 경쇄 가변 영역이 제1 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역으로 치환되어 있는 교차 Fab 중쇄), 상기 제1 Fab 중쇄 불변 영역이 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH-CH1-VL-CH1-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다. 다른 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 중쇄가 제1 Fab 중쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 제1 Fab 중쇄 가변 영역이 제1 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 중쇄 불변 영역이 경쇄 불변 영역으로 치환되어 있는 교차 Fab 중쇄), 상기 제1 Fab 경쇄 불변 영역이 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH-CH1-VH-CL-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다.
이들 실시양태 중 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 Fab 중쇄 가변 영역이 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 교차 Fab 경쇄 폴리펩티드(VH-CL), 및 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL-CL)를 추가로 포함한다. 이들 실시양태 중 다른 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 Fab 경쇄 가변 영역이 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 교차 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL-CH1), 및 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL-CL)를 추가로 포함한다. 이들 실시양태 중 또다른 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 Fab 경쇄 가변 영역이 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 Fab 중쇄 불변 영역이 Fab 경쇄 폴리펩티드와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL-CH1-VL-CL); Fab 중쇄 가변 영역이 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 Fab 경쇄 불변 영역이 Fab 경쇄 폴리펩티드와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH-CL-VL-CL); Fab 경쇄 폴리펩티드가 Fab 경쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 Fab 경쇄 가변 영역이 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL-CL-VL-CH1); 또는 Fab 경쇄 폴리펩티드가 Fab 중쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 Fab 중쇄 가변 영역이 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL-CL-VH-CL)를 추가로 포함한다.
이들 실시양태에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 (i) Fc 도메인 서브유닛 폴리펩티드(CH2-CH3(-CH4)), 또는 (ii) 제3 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)) 및 제3 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL-CL)를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 예를 들면, 다이설파이드 결합에 의해 공유연결되어 있다.
한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 경쇄가 제1 Fab 경쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 제1 Fab 경쇄 가변 영역이 제1 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는(즉, 경쇄 불변 영역이 중쇄 불변 영역으로 치환되어 있는 교차 Fab 경쇄) 폴리펩티드(VL-CL-VL-CH1); 제2 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)); 및 제1 Fab 중쇄 가변 영역이 제1 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH-CL)를 포함한다. 또다른 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 경쇄가 제1 Fab 중쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 제1 Fab 중쇄 가변 영역이 제1 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는(즉, 경쇄 가변 영역이 중쇄 가변 영역으로 치환되어 있는 교차 Fab 경쇄) 폴리펩티드(VL-CL-VH-CL); 제2 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)); 및 제1 Fab 경쇄 가변 영역이 제1 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL-CH1)를 포함한다. 이들 실시양태에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 (i) Fc 도메인 서브유닛 폴리펩티드(CH2-CH3(-CH4)), 또는 (ii) 제3 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)) 및 제3 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL-CL)를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 예를 들면, 다이설파이드 결합에 의해 공유연결되어 있다.
상기 실시양태 중 임의의 실시양태에 따라, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 구성성분(예를 들면, 항원 결합 모이어티, Fc 도메인)은 직접적으로 융합될 수 있거나, 본원에 기재되어 있거나 당분야에서 공지되어 있는 다양한 연결자, 특히 하나 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2개 내지 20개의 아미노산을 포함하는 펩티드 연결자를 통해 융합될 수 있다. 적합한 비면역원성 펩티드 연결자는 예를 들면, (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 연결자를 포함하고, 이때 n은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4의 수이다.
Fc 도메인
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 중쇄 도메인을 포함하는 한 쌍의 폴리펩티드 쇄로 구성된다. 예를 들면, 면역글로불린 G(IgG) 분자의 Fc 도메인은 이량체이고, 이들의 각각의 서브유닛은 CH2 IgG 중쇄 불변 도메인 및 CH3 IgG 중쇄 불변 도메인을 포함한다. Fc 도메인의 2개 서브유닛은 서로 안정한 결합을 형성할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 하나 이하의 Fc 도메인을 포함한다.
본 발명에 따른 한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 IgG Fc 도메인이다. 특정 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 인간 IgG1 Fc 영역의 예시적 서열은 서열번호 149로 제시된다.
또다른 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인이다. 한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 S228(카바트 넘버링)에서 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 S228P를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 이 아미노산 치환은 IgG4 항체의 생체내 Fab 아암 교환을 감소시킨다(문헌[Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)] 참조). 추가적 특정 실시양태에서, Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다. 또다른 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 L235(카바트 넘버링)에서의 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 L235E를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 또다른 실시양태에서, Fc 도메인은 아미노산 치환 S228P 및 L235E(SPLE) 둘 다를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 또다른 실시양태에서, Fc 도메인은 아미노산 치환 P329G(카바트 넘버링)를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 또다른 실시양태에서, Fc 도메인은 아미노산 치환 S228P, L235E 및 P329G를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다.
이종이량체화를 촉진하는 Fc 도메인 변경
본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 Fc 도메인의 2개 서브유닛 중 하나 또는 다른 하나에 융합된 상이한 항원 결합 모이어티를 포함하므로, 상기 Fc 도메인의 2개 서브유닛은 전형적으로 2개의 동일하지 않은 폴리펩티드 쇄에 포함되어 있다. 이들 폴리펩티드의 재조합 공발현 및 후속 이량체화는 상기 2개의 폴리펩티드의 여러 가능한 조합을 유발한다. 따라서, 재조합 제조에 있어서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 수율 및 순도를 개선하기 위해, 원하는 폴리펩티드의 결합을 촉진하는 변경을 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인 내에 도입하는 것이 유리할 것이다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 Fc 도메인의 제1 서브유닛과 제2 서브유닛의 결합을 촉진하는 변경을 포함한다. 인간 IgG Fc 도메인의 2개 서브유닛 사이의 가장 광범위한 단백질-단백질 상호작용의 부위는 Fc 도메인의 CH3 도메인에 존재한다. 따라서, 한 실시양태에서, 상기 변경은 Fc 도메인의 CH3 도메인에 존재한다.
구체적 실시양태에서, 상기 변경은 Fc 도메인의 2개 서브유닛 중 하나에서 "놉" 변경을 포함하고 Fc 도메인의 2개 서브유닛 중 나머지 하나에서 "홀" 변경을 포함하는 소위 "놉-인투-홀(knob-into-hole)" 변경이다.
놉-인투-홀 기술은 예를 들면, 미국 특허 제5,731,168호, 미국 특허 제7,695,936호, 문헌[Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)] 및 [Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)]에 기재되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은 돌출부를 캐비티에 위치시켜 이종이량체 형성을 촉진하고 동종이량체 형성을 방해할 수 있도록 돌출부("놉")를 제1 폴리펩티드의 계면에서 도입하고 상응하는 캐비티("홀")를 제2 폴리펩티드의 계면에서 도입하는 단계를 포함한다. 돌출부는 제1 폴리펩티드의 계면의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄(예를 들면, 티로신 또는 트립토판)로 치환됨으로써 구축된다. 상기 돌출부와 동일하거나 유사한 크기의 상쇄 캐비티는 큰 아미노산 측쇄가 보다 작은 아미노산 측쇄(예를 들면, 알라닌 또는 쓰레오닌)로 치환됨으로써 제2 폴리펩티드의 계면에서 생성된다.
따라서, 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기가 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환됨으로써, 돌출부가 제2 서브유닛의 CH3 도메인 내의 캐비티에 위치할 수 있는 제1 서브유닛의 CH3 도메인 내에서 발생되고, Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기가 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환됨으로써, 캐비티가 제1 서브유닛의 CH3 도메인 내의 돌출부가 위치할 수 있는 제2 서브유닛의 CH3 도메인 내에서 발생된다.
돌출부 및 캐비티는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 변경시킴으로써, 예를 들면, 부위 특이적 돌연변이유발 또는 펩티드 합성에 의해 만들어질 수 있다.
구체적 실시양태에서, Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인에서 위치 366의 쓰레오닌 잔기는 트립토판 잔기로 치환되고(T366W), Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인에서 위치 407의 티로신 잔기는 발린 잔기로 치환된다(Y407V). 한 실시양태에서, Fc 도메인의 제2 서브유닛에서 추가로 위치 366의 쓰레오닌 잔기는 세린 잔기로 치환되고(T366S) 위치 368의 류신 잔기는 알라닌 잔기로 치환된다(L368A).
추가적 실시양태에서, Fc 도메인의 제1 서브유닛에서 추가로 위치 354의 세린 잔기는 시스테인 잔기로 치환되고(S354C), Fc 도메인의 제2 서브유닛에서 추가로 위치 349의 티로신 잔기는 시스테인 잔기로 치환된다(Y349C). 이들 2개의 시스테인 잔기의 도입은 Fc 도메인의 2개 서브유닛 사이에서 이량체를 더 안정화시키는 다이설파이드 가교의 형성을 야기한다(문헌[Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)]).
특정 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원에 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티는 ("놉" 변경을 포함하는) Fc 도메인의 제1 서브유닛에 (임의적으로 표적 세포 항원에 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 통해) 융합되어 있다. 이론에 구애받지 않고, 활성화 T 세포 항원에 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티와 Fc 도메인의 놉 함유 서브유닛의 융합은 활성화 T 세포 항원에 결합할 수 있는 2개의 항원 결합 모이어티를 포함하는 항원 결합 분자의 발생을 (더) 최소화할 것이다(2개의 놉 함유 폴리펩티드의 입체적 충돌).
대안적인 실시양태에서, Fc 도메인의 제1 서브유닛과 제2 서브유닛의 결합을 촉진하는 변경은 예를 들면, WO 2009/089004에 기재된 바와 같이 정전기 조종(steering) 효과를 매개하는 변경을 포함한다. 일반적으로, 이 방법은 동종이량체 형성이 정전기적으로 불리하게 되지만 이종이량체화가 정전기적으로 유리하게 되도록 2개의 Fc 도메인 서브유닛의 계면에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 하전된 아미노산 잔기로 치환시키는 단계를 포함한다.
Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 Fc 도메인 변경
Fc 도메인은 표적 조직에서의 우수한 축적 및 유리한 조직-혈액 분포 비에 기여하는 긴 혈청 반감기를 포함하는 유리한 약동학적 성질을 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 부여한다. 그러나, 동시에 상기 Fc 도메인은 바람직한 항원 보유 세포로의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 표적화보다는 오히려 Fc 수용체를 발현하는 세포로의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 원치 않는 표적화를 유발할 수 있다. 더욱이, Fc 수용체 신호전달 경로의 공활성화(co-activation)는 항원 결합 분자의 T 세포 활성화 성질 및 긴 반감기와 함께 사이토카인 수용체의 과도한 활성화 및 전신 투여 시 심각한 부작용을 초래하는 사이토카인 방출을 유발할 수 있다. T 세포 이외의 (Fc 수용체 보유) 면역 세포의 활성화는 예를 들면, NK 세포에 의한 T 세포의 잠재적 파괴로 인해 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 효능조차도 더 감소시킬 수 있다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 천연 IgG1 Fc 도메인에 비해 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 한 이러한 실시양태에서, Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)은 천연 IgG1 Fc 도메인(또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)에 비해 Fc 수용체에 대한 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 보다 바람직하게는 10% 미만, 가장 바람직하게는 5% 미만의 결합 친화성, 및/또는 천연 IgG1 Fc 도메인(또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)에 비해 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 보다 바람직하게는 10% 미만, 가장 바람직하게는 5% 미만의 효과기 기능을 나타낸다. 한 실시양태에서, Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)은 실질적으로 Fc 수용체에 결합하지 않고/않거나 효과기 기능을 유도하지 않는다. 특정 실시양태에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 한 실시양태에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 한 실시양태에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 구체적인 실시양태에서, Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 보다 구체적으로 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 구체적으로 인간 FcγRIIIa이다. 한 실시양태에서, 효과기 기능은 CDC, ADCC, ADCP 및 사이토카인 분비로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효과기 기능이다. 특정 실시양태에서, 효과기 기능은 ADCC이다. 한 실시양태에서, Fc 도메인은 천연 IgG1 Fc 도메인에 비해 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 실질적으로 유사한 결합 친화성을 나타낸다. Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)이 FcRn에 대한 천연 IgG1 Fc 도메인(또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)의 결합 친화성의 약 70% 초과, 구체적으로 약 80% 초과, 보다 구체적으로 약 90% 초과의 결합 친화성을 나타내는 경우 FcRn에 대한 실질적으로 유사한 결합이 달성된다.
특정 실시양태에서, Fc 도메인은 조작되지 않은 Fc 도메인에 비해 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된다. 구체적인 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 전형적으로, 동일한 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc 도메인의 2개 서브유닛 각각에 존재한다. 한 실시양태에서, 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성을 감소시킨다. 한 실시양태에서, 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성을 2배 이상, 5배 이상 또는 10배 이상만큼 감소시킨다. Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성을 감소시키는 하나 초과의 아미노산 돌연변이가 존재하는 실시양태에서, 이들 아미노산 돌연변이의 조합은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성을 10배 이상, 20배 이상 또는 심지어 50배 이상만큼 감소시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 조작된 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 조작되지 않은 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 비해 Fc 수용체에 대한 20% 미만, 특히 10% 미만, 보다 특히 5% 미만의 결합 친화성을 나타낸다. 특정 실시양태에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 일부 실시양태에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 일부 실시양태에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 구체적인 실시양태에서, Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 보다 구체적으로 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 구체적으로 인간 FcγRIIIa이다. 바람직하게는, 이들 수용체 각각에 대한 결합이 감소된다. 일부 실시양태에서, 보체 구성성분에 대한 결합 친화성, 구체적으로 C1q에 대한 결합 친화성도 감소된다. 한 실시양태에서, 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합 친화성은 감소되지 않는다. Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)이 FcRn에 대한 조작되지 않은 형태의 Fc 도메인(또는 상기 조작되지 않은 형태의 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)의 결합 친화성의 약 70% 초과의 결합 친화성을 나타내는 경우 FcRn에 대한 실질적으로 유사한 결합, 즉 상기 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성의 보존이 달성된다. Fc 도메인, 또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 이러한 친화성의 약 80% 초과, 심지어 약 90% 초과의 결합 친화성을 나타낼 수 있다. 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 조작되지 않은 Fc 도메인에 비해 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된다. 감소된 효과기 기능은 하기 효과기 기능 중 하나 이상의 효과기 기능을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다: 감소된 보체 의존적 세포독성(CDC), 감소된 항체 의존적 세포-매개된 세포독성(ADCC), 감소된 항체 의존적 세포 식균작용(ADCP), 감소된 사이토카인 분비, 항원 제시 세포에 의한 감소된 면역 복합체-매개된 항원 흡수, NK 세포에 대한 감소된 결합, 대식세포에 대한 감소된 결합, 단핵세포에 대한 감소된 결합, 다형핵세포에 대한 감소된 결합, 아폽토시스를 유도하는 감소된 직접적인 신호전달, 표적-결합된 항체의 감소된 가교결합, 감소된 수지상 세포 성숙, 및 감소된 T 세포 프라이밍(priming). 한 실시양태에서, 감소된 효과기 기능은 감소된 CDC, 감소된 ADCC, 감소된 ADCP 및 감소된 사이토카인 분비로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효과기 기능이다. 특정 실시양태에서, 감소된 효과기 기능은 감소된 ADCC이다. 한 실시양태에서, 감소된 ADCC는 조작되지 않은 Fc 도메인(또는 조작되지 않은 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)에 의해 유도된 ADCC의 20% 미만이다.
한 실시양태에서, Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 한 실시양태에서, Fc 도메인은 E233, L234, L235, N297, P331 및 P329로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 보다 구체적인 실시양태에서, Fc 도메인은 L234, L235 및 P329로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A 및 L235A를 포함한다. 한 이러한 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 P329에서 아미노산 치환을 포함한다. 보다 구체적인 실시양태에서, 아미노산 치환은 P329A 또는 P329G, 특히 P329G이다. 한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 P329에서 아미노산 치환을 포함하고 E233, L234, L235, N297 및 P331로부터 선택된 위치에서 추가적 아미노산 치환을 포함한다. 보다 구체적인 실시양태에서, 추가적 아미노산 치환은 E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D 또는 P331S이다. 특정 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 P329, L234 및 L235에서 아미노산 치환을 포함한다. 보다 특정한 실시양태에서, Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G("P329G LALA")를 포함한다. 한 이러한 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 아미노산 치환의 "P329G LALA" 조합은 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 WO 2012/13083에 기재된 바와 같이 인간 IgG1 Fc 도메인의 Fcγ 수용체 결합을 거의 완전히 제거한다. 또한, WO 2012/130831은 이러한 돌연변이체 Fc 도메인을 제조하는 방법 및 그의 성질, 예컨대, Fc 수용체 결합 또는 효과기 기능을 결정하는 방법을 기재한다.
IgG4 항체는 IgG1 항체에 비해 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인, 특히 인간 IgG4 Fc 도메인이다. 한 실시양태에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 S228에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 S228P를 포함한다. Fc 수용체에 대한 그의 결합 친화성 및/또는 그의 효과기 기능을 더 감소시키기 위해, 한 실시양태에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 L235에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 L235E를 포함한다. 또다른 실시양태에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 P329에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 P329G를 포함한다. 특정 실시양태에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 S228, L235 및 P329에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 S228P, L235E 및 P329G를 포함한다. 이러한 IgG4 Fc 도메인 돌연변이체 및 이들의 Fcγ 수용체 결합 성질은 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 WO 2012/130831에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 천연 IgG1 Fc 도메인에 비해 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타내는 Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A, L235A 및 임의적으로 P329G를 포함하는 인간 IgG1 Fc 도메인, 또는 아미노산 치환 S228P, L235E 및 임의적으로 P329G를 포함하는 인간 IgG4 Fc 도메인이다.
특정 실시양태에서, Fc 도메인의 N-글리코실화는 제거되어 있다. 하나의 이러한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 N297에서 아미노산 돌연변이, 특히 아스파라긴을 알라닌(N297A) 또는 아스파르트산(N297D)으로 치환시키는 아미노산 치환을 포함한다.
전술되어 있고 WO 2012/130831에도 기재된 Fc 도메인 이외에, 감소된 Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 갖는 Fc 도메인은 Fc 도메인 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 도메인도 포함한다(미국 특허 제6,737,056호). 이러한 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297이 알라닌으로 치환된 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함하는, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상의 아미노산 위치에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다(미국 특허 제7,332,581호).
돌연변이체 Fc 도메인은 당분야에서 주지되어 있는 유전적 또는 화학적 방법을 사용한 아미노산 결실, 치환, 삽입 또는 변경에 의해 제조될 수 있다. 유전적 방법은 암호화 DNA 서열의 부위 특이적 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 정확한 뉴클레오티드 변화는 예를 들면, 서열분석에 의해 검증될 수 있다.
Fc 수용체에 대한 결합은 예를 들면, ELISA에 의해, 또는 표준 기계, 예컨대, 비아코어 기계(지이 헬쓰케어)를 사용한 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 용이하게 결정될 수 있고, Fc 수용체는 예컨대, 재조합 발현에 의해 수득될 수 있다. 적합한 이러한 결합 분석은 본원에 기재되어 있다. 대안적으로, 특정 Fc 수용체를 발현하는 것으로 공지된 세포주, 예컨대, FcγIIIa 수용체를 발현하는 인간 NK 세포를 사용하여 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인, 또는 Fc 도메인을 포함하는 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 결합 친화성을 평가할 수 있다.
Fc 도메인, 또는 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 효과기 기능은 당분야에서 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. ADCC를 측정하기에 적합한 분석은 본원에 기재되어 있다. 관심 있는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 다른 예는 미국 특허 제5,500,362호, 문헌[Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)], [Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985), 미국 특허 제5,821,337호 및 문헌[Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)]에 기재되어 있다. 대안적으로, 비방사성 분석 방법이 사용될 수 있다(예를 들면, 유세포계수를 위한 ACTI(상표) 비방사성 세포독성 분석(셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.), 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재), 및 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비방사성 세포독성 분석(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 참조). 이러한 분석을 위한 유용한 효과기 세포는 말초혈 단핵세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 있는 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들면, 동물 모델, 예컨대, 문헌[Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)]에 개시된 동물 모델에서 평가될 수 있다.
일부 실시양태에서, Fc 도메인과 보체 구성성분, 특히 C1q의 결합이 감소된다. 따라서, Fc 도메인이 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작되어 있는 일부 실시양태에서, 상기 감소된 효과기 기능은 감소된 CDC를 포함한다. C1q 결합 분석은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 C1q에 결합할 수 있음으로써 CDC 활성을 갖는 지를 결정하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들면, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에 기재된 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 분석을 수행할 수 있다(예를 들면, 문헌[Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996)], [Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003)] 및 [Cragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)] 참조).
항원 결합 모이어티
본 발명의 항원 결합 분자는 이중특이적이다(즉, 상기 분자는 2개의 상이한 항원성 결정인자에 특이적으로 결합할 수 있는 2개 이상의 항원 결합 모이어티를 포함한다). 본 발명에 따라, 항원 결합 모이어티는 Fab 분자(즉, 가변 영역 및 불변 영역을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄로 구성된 항원 결합 도메인)이다. 한 실시양태에서, 상기 Fab 분자는 인간 Fab 분자이다. 또다른 실시양태에서, 상기 Fab 분자는 인간화된 Fab 분자이다. 또다른 실시양태에서, 상기 Fab 분자는 인간 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 포함한다.
항원 결합 모이어티 중 하나 이상은 단일 쇄 Fab 분자 또는 교차 Fab 분자이다. 이러한 변경은 상이한 Fab 분자의 중쇄와 경쇄의 미스페어링을 방해함으로써 재조합 제조에 있어서 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 수율 및 순도를 개선한다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 유용한 특정 단일 쇄 Fab 분자에서, Fab 경쇄의 C-말단은 펩티드 연결자에 의해 Fab 중쇄의 N-말단에 연결된다. 펩티드 연결자는 Fab 중쇄 및 경쇄의 정렬이 기능성 항원 결합 모이어티를 형성하게 한다. Fab 중쇄와 경쇄를 연결하는 데에 적합한 펩티드 연결자는 예를 들면, (G4S)6-GG(서열번호 152) 또는 (SG3)2-(SEG3)4-(SG3)-SG(서열번호 153)를 포함한다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 유용한 특정 교차 Fab 분자에서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 불변 영역은 교환되어 있다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 유용한 또다른 교차 Fab 분자에서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역은 교환되어 있다.
본 발명에 따른 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원, 특히 종양 세포 항원, 및 활성화 T 세포 항원에 동시적으로 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원 및 활성화 T 세포 항원에 동시적으로 결합함으로써 T 세포와 표적 세포를 가교결합시킬 수 있다. 보다 구체적인 실시양태에서, 이러한 동시적인 결합은 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 야기한다. 한 실시양태에서, 이러한 동시적인 결합은 T 세포의 활성화를 야기한다. 다른 실시양태에서, 이러한 동시적인 결합은 증식, 분화, 사이토카인 분비, 세포독성 효과기 분자 방출, 세포독성 활성 및 활성화 마커의 발현으로 이루어진 군으로부터 선택된, T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 세포 반응을 야기한다. 한 실시양태에서, 표적 세포 항원에 대한 동시적인 결합의 부재하에 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자와 활성화 T 세포 항원의 결합은 T 세포 활성화를 야기하지 않는다.
한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 T 세포의 세포독성 활성을 표적 세포로 방향 전환시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 방향 전환은 표적 세포에 의한 MHC-매개된 펩티드 항원 제시 및/또는 T 세포의 특이성과 무관하다.
특히, 본 발명의 실시양태 중 임의의 실시양태에 따른 T 세포는 세포독성 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포, 특히 CD8+ T 세포이다.
활성화 T 세포 항원 결합 모이어티
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 (본원에서 "활성화 T 세포 항원 결합 모이어티"로도 지칭되는) 활성화 T 세포 항원에 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이하의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 활성화 T 세포 항원에 대한 1가 결합을 제공한다. 활성화 T 세포 항원 결합 모이어티는 통상적인 Fab 분자 또는 변경된 Fab 분자, 즉 단일 쇄 또는 교차 Fab 분자일 수 있다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 포함된 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 초과의 항원 결합 모이어티가 존재하는 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티는 바람직하게는 변경된 Fab 분자이다.
특정 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원은 CD3, 특히 인간 CD3(서열번호 265) 또는 사이노몰구스 CD3(서열번호 266), 가장 특히 인간 CD3이다. 특정 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원 결합 모이어티는 인간 및 사이노몰구스 CD3에 대한 교차반응성을 나타낸다(즉, 인간 및 사이노몰구스 CD3에 특이적으로 결합한다). 일부 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원은 CD3의 엡실론 서브유닛이다.
한 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원 결합 모어어티는 CD3의 에피토프에 대한 결합에 대해 단일클론 항체 H2C(WO 2008/119567에 기재됨)와 경쟁할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원 결합 모이어티는 CD3의 에피토프에 대한 결합에 대해 단일클론 항체 V9(문헌[Rodrigues et al., Int J Cancer Suppl 7, 45-50 (1992)] 및 미국 특허 제6,054,297호에 기재됨)와 경쟁할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원 결합 모이어티는 CD3의 에피토프에 대한 결합에 대해 단일클론 항체 FN18(문헌[Nooij et al., Eur J Immunol 19, 981-984 (1986)]에 기재됨)과 경쟁할 수 있다. 특정 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원 결합 모이어티는 CD3의 에피토프에 대한 결합에 대해 단일클론 항체 SP34(문헌[Pessano et al., EMBO J 4, 337-340 (1985)]에 기재됨)와 경쟁할 수 있다. 한 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원 결합 모이어티는 단일클론 항체 SP34에 의해 결합되는 CD3의 에피토프와 동일한 CD3의 에피토프에 결합한다. 한 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원 결합 모이어티는 서열번호 163의 중쇄 CDR1, 서열번호 165의 중쇄 CDR2, 서열번호 167의 중쇄 CDR3, 서열번호 171의 경쇄 CDR1, 서열번호 173의 경쇄 CDR2 및 서열번호 175의 경쇄 CDR3을 포함한다. 추가적 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원 결합 모이어티는 서열번호 169와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 177과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원 결합 모이어티는 서열번호 249의 중쇄 CDR1, 서열번호 251의 중쇄 CDR2, 서열번호 253의 중쇄 CDR3, 서열번호 257의 경쇄 CDR1, 서열번호 259의 경쇄 CDR2 및 서열번호 261의 경쇄 CDR3을 포함한다. 한 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원 결합 모이어티는 CD3의 에피토프에 대한 결합에 대해 서열번호 249의 중쇄 CDR1, 서열번호 251의 중쇄 CDR2, 서열번호 253의 중쇄 CDR3, 서열번호 257의 경쇄 CDR1, 서열번호 259의 경쇄 CDR2 및 서열번호 261의 경쇄 CDR3을 포함하는 항원 결합 모이어티와 경쟁할 수 있다. 한 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원 결합 모이어티는 서열번호 249의 중쇄 CDR1, 서열번호 251의 중쇄 CDR2, 서열번호 253의 중쇄 CDR3, 서열번호 257의 경쇄 CDR1, 서열번호 259의 경쇄 CDR2 및 서열번호 261의 경쇄 CDR3을 포함하는 항원 결합 모이어티에 의해 결합되는 CD3의 에피토프와 동일한 CD3의 에피토프에 결합한다. 추가적 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원 결합 모이어티는 서열번호 255와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 263과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원 결합 모이어티는 CD3의 에피토프에 대한 결합에 대해 서열번호 255의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 263의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항원 결합 모이어티와 경쟁할 수 있다. 한 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원 결합 모이어티는 서열번호 255의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 263의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항원 결합 모이어티에 의해 결합되는 CD3의 에피토프와 동일한 CD3의 에피토프에 결합한다. 또다른 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원 결합 모이어티는 서열번호 255의 중쇄 가변 영역 서열의 인간화된 버전 및 서열번호 263의 경쇄 가변 영역 서열의 인간화된 버전을 포함한다. 한 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원 결합 모이어티는 서열번호 249의 중쇄 CDR1, 서열번호 251의 중쇄 CDR2, 서열번호 253의 중쇄 CDR3, 서열번호 257의 경쇄 CDR1, 서열번호 259의 경쇄 CDR2, 서열번호 261의 경쇄 CDR3, 및 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 골격 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, CD3 항원 결합 모이어티는 서열번호 270, 서열번호 271 및 서열번호 272로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 274, 서열번호 275 및 서열번호 276으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
한 실시양태에서, CD3 항원 결합 모이어티는 서열번호 270의 중쇄 CDR1, 서열번호 271의 중쇄 CDR2, 서열번호 272의 중쇄 CDR3, 서열번호 274의 경쇄 CDR1, 서열번호 275의 경쇄 CDR2 및 서열번호 276의 경쇄 CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, CD3 항원 결합 모이어티는 서열번호 269, 서열번호 298 및 서열번호 299로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 273 및 서열번호 297로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, CD3 항원 결합 모이어티는 서열번호 269, 서열번호 298 및 서열번호 299로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 273 및 서열번호 297로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, CD3 항원 결합 모이어티는 서열번호 269의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 273의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, CD3 항원 결합 모이어티는 서열번호 269의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 273의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, CD3 항원 결합 모이어티는 서열번호 269와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 273과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
표적 세포 항원 결합 모이어티
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 (본원에서 "표적 세포 항원 결합 모이어티"로도 지칭되는) 표적 세포 항원에 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원에 결합할 수 있는 2개의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 이러한 특정 실시양태에서, 이들 항원 결합 모이어티 각각은 동일한 항원성 결정인자에 특이적으로 결합한다. 한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원에 결합할 수 있는 2개 이하의 항원 결합 모이어티를 포함한다.
표적 세포 항원 결합 모이어티는 일반적으로 구체적 항원성 결정인자에 결합하고 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 표적 부위, 예를 들면, 항원성 결정인자를 보유하는 특정 유형의 종양 세포로 향하게 할 수 있는 Fab 분자이다.
특정 실시양태에서, 표적 세포 항원 결합 모이어티는 병리학적 상태와 관련된 항원, 예컨대, 종양 세포 또는 바이러스-감염된 세포 상에 제시된 항원으로 향한다. 적합한 항원은 세포 표면 항원, 예를 들면, 세포 표면 수용체(그러나, 이것으로 한정되지 않음)이다. 특정 실시양태에서, 항원은 인간 항원이다. 구체적인 실시양태에서, 표적 세포 항원은 섬유모세포 활성화 단백질(FAP), 흑색종 관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP), 표피 성장인자 수용체(EGFR), 암배아 항원(CEA), CD19, CD20 및 CD33으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 흑색종 관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP)에 대해 특이적인 하나 이상의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 MCSP의 에피토프에 대한 결합에 대해 단일클론 항체 LC007(서열번호 75 및 83, 및 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 유럽 특허출원 제11178393.2호 참조)과 경쟁할 수 있는 하나 이상, 전형적으로 2개 이상의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 한 실시양태에서, MCSP에 대해 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 69의 중쇄 CDR1, 서열번호 71의 중쇄 CDR2, 서열번호 73의 중쇄 CDR3, 서열번호 77의 경쇄 CDR1, 서열번호 79의 경쇄 CDR2 및 서열번호 81의 경쇄 CDR3을 포함한다. 추가적 실시양태에서, MCSP에 대해 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 75와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 83과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 MCSP의 에피토프에 대한 결합에 대해 단일클론 항체 M4-3 ML2(서열번호 239 및 247, 및 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 유럽 특허출원 제11178393.2호 참조)와 경쟁할 수 있는 하나 이상, 전형적으로 2개 이상의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 한 실시양태에서, MCSP에 대해 특이적인 항원 결합 모이어티는 단일클론 항체 M4-3 ML2에 의해 결합되는 MCSP의 에피토프와 동일한 MCSP의 에피토프에 결합한다. 한 실시양태에서, MCSP에 대해 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 233의 중쇄 CDR1, 서열번호 235의 중쇄 CDR2, 서열번호 237의 중쇄 CDR3, 서열번호 241의 경쇄 CDR1, 서열번호 243의 경쇄 CDR2 및 서열번호 245의 경쇄 CDR3을 포함한다. 추가적 실시양태에서, MCSP에 대해 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 239와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%, 특히 약 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 247과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%, 특히 적어도 약 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, MCSP에 대해 특이적인 항원 결합 모이어티는 단일클론 항체 M4-3 ML2(서열번호 239 및 247)의 친화성 성숙된 버전의 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, MCSP에 특이적인 항원 결합 모이어티는 ≤ 5 x 10-9 M , ≤ 2 x 10-9 M , ≤ 1 x 10-9 M , ≤ 5 x 10-10 M, ≤ 2 x 10-9 M, ≤ 1 x 10-10 M , ≤ 5 x 10-11 M, ≤ 1 x 10-11 M , ≤ 5 x 10-12 M, ≤ 1 x 10-12 M, 또는 그 미만의 KD로 MCSP에 결합한다. 한 실시양태에서, MCSP에 특이적인 항원 결합 모이어티는 항-MCSP 항체 M4-3/ML2에 비하여 적어도 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배 또는 그 초과의 증가된 친화성을 갖는다.
한 실시양태에서, MCSP에 대해 특이적인 항원 결합 모이어티는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개, 특히 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 239의 중쇄 가변 영역 서열; 및 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개, 특히 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 247의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. MCSP, 특히 인간 MCSP에 대한 결합이 보존되는 한, 가변 영역 서열 내의 임의의 아미노산 잔기가 CDR 영역 내의 아미노산 잔기를 포함하는 상이한 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직한 변이체는 비치환된 가변 영역 서열을 포함하는 항원 결합 모이어티의 결합 친화성과 적어도 동등한(또는 더 강한) MCSP에 대한 결합 친화성을 갖는 변이체이다.
한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 1의 폴리펩티드 서열, 서열번호 3의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 5의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다. 추가적 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 7의 폴리펩티드 서열, 서열번호 9의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 11의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다. 또다른 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 13의 폴리펩티드 서열, 서열번호 15의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 5의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다. 또다른 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 17의 폴리펩티드 서열, 서열번호 19의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 5의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다. 또다른 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 21의 폴리펩티드 서열, 서열번호 23의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 5의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다. 또다른 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 25의 폴리펩티드 서열, 서열번호 27의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 5의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다. 또다른 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 29의 폴리펩티드 서열, 서열번호 31의 폴리펩티드 서열, 서열번호 33의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 5의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다. 또다른 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 29의 폴리펩티드 서열, 서열번호 3의 폴리펩티드 서열, 서열번호 33의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 5의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다. 또다른 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 35의 폴리펩티드 서열, 서열번호 3의 폴리펩티드 서열, 서열번호 37의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 5의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다. 또다른 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 39의 폴리펩티드 서열, 서열번호 3의 폴리펩티드 서열, 서열번호 41의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 5의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다. 또다른 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 29의 폴리펩티드 서열, 서열번호 3의 폴리펩티드 서열, 서열번호 5의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 179의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 5의 폴리펩티드 서열, 서열번호 29의 폴리펩티드 서열, 서열번호 33의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 181의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 5의 폴리펩티드 서열, 서열번호 23의 폴리펩티드 서열, 서열번호 183의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 185의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 5의 폴리펩티드 서열, 서열번호 23의 폴리펩티드 서열, 서열번호 183의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 187의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 33의 폴리펩티드 서열, 서열번호 189의 폴리펩티드 서열, 서열번호 191의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 193의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 183의 폴리펩티드 서열, 서열번호 189의 폴리펩티드 서열, 서열번호 193의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 195의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 189의 폴리펩티드 서열, 서열번호 193의 폴리펩티드 서열, 서열번호 199의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 201의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 5의 폴리펩티드 서열, 서열번호 23의 폴리펩티드 서열, 서열번호 215의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 217의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 5의 폴리펩티드 서열, 서열번호 23의 폴리펩티드 서열, 서열번호 215의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 219의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다.
한 실시양태에서, MCSP에 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 280, 서열번호 281, 서열번호 282, 서열번호 301, 서열번호 303, 서열번호 304 및 서열번호 306으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 284, 서열번호 285, 서열번호 286, 서열번호 310, 서열번호 311, 서열번호 314, 서열번호 315 및 서열번호 316으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
한 실시양태에서, MCSP에 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 280, 서열번호 281 및 서열번호 282로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 284, 서열번호 285 및 서열번호 286으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
한 실시양태에서, MCSP에 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 280의 중쇄 CDR1, 서열번호 281의 중쇄 CDR2, 서열번호 282의 중쇄 CDR3, 서열번호 284의 경쇄 CDR1, 서열번호 285의 경쇄 CDR2 및 서열번호 286의 경쇄 CDR3을 포함한다.
추가적 실시양태에서, MCSP에 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 279, 서열번호 300, 서열번호 302, 서열번호 305 및 서열번호 307로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 283, 서열번호 309, 서열번호 312, 서열번호 313 및 서열번호 317로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
추가적 실시양태에서, MCSP에 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 279, 서열번호 300, 서열번호 302, 서열번호 305 및 서열번호 307로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 283, 서열번호 309, 서열번호 312, 서열번호 313 및 서열번호 317로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, MCSP에 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 279의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 283의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, MCSP에 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 279의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 283의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
추가적 실시양태에서, MCSP에 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 279의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 283의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다.
한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 278과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열번호 319와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열번호 320과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 및 서열번호 321과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 278과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열번호 319와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열번호 369와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 및 서열번호 370과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 278과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열번호 319와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열번호 371과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 및 서열번호 372와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
구체적인 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 70, 서열번호 72, 서열번호 74, 서열번호 76, 서열번호 78, 서열번호 80, 서열번호 82, 서열번호 84, 서열번호 234, 서열번호 236, 서열번호 238, 서열번호 240, 서열번호 242, 서열번호 244, 서열번호 246, 서열번호 248, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 180, 서열번호 182, 서열번호 184, 서열번호 186, 서열번호 188, 서열번호 190, 서열번호 192, 서열번호 194, 서열번호 196, 서열번호 200, 서열번호 202, 서열번호 216, 서열번호 218 및 서열번호 220으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표피 성장인자 수용체(EGFR)에 대해 특이적인 하나 이상의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 또다른 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 EGFR의 에피토프에 대한 결합에 대해 단일클론 항체 GA201과 경쟁할 수 있는 하나 이상, 전형적으로 2개 이상의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 WO 2006/082515를 참조한다. 한 실시양태에서, EGFR에 대해 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 85의 중쇄 CDR1, 서열번호 87의 중쇄 CDR2, 서열번호 89의 중쇄 CDR3, 서열번호 93의 경쇄 CDR1, 서열번호 95의 경쇄 CDR2 및 서열번호 97의 경쇄 CDR3을 포함한다. 추가적 실시양태에서, EGFR에 대해 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 91과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 99와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다.
또다른 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 43의 폴리펩티드 서열, 서열번호 45의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 47의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다. 추가적 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 49의 폴리펩티드 서열, 서열번호 51의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 11의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다. 또다른 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 53의 폴리펩티드 서열, 서열번호 45의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 47의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다.
구체적인 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 86, 서열번호 88, 서열번호 90, 서열번호 92, 서열번호 94, 서열번호 96, 서열번호 98, 서열번호 100, 서열번호 44, 서열번호 46, 서열번호 48, 서열번호 50, 서열번호 52, 서열번호 54 및 서열번호 12로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 섬유모세포 활성화 단백질(FAP)에 대해 특이적인 하나 이상의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 또다른 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 FAP의 에피토프에 대한 결합에 대해 단일클론 항체 3F2와 경쟁할 수 있는 하나 이상, 전형적으로 2개 이상의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 WO 2012/020006을 참조한다. 한 실시양태에서, FAP에 대해 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 101의 중쇄 CDR1, 서열번호 103의 중쇄 CDR2, 서열번호 105의 중쇄 CDR3, 서열번호 109의 경쇄 CDR1, 서열번호 111의 경쇄 CDR2 및 서열번호 113의 경쇄 CDR3을 포함한다. 추가적 실시양태에서, FAP에 대해 특이적인 항원 결합 모이어티는 서얼변호 107과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 115와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다.
또다른 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 55의 폴리펩티드 서열, 서열번호 51의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 11의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다. 추가적 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 57의 폴리펩티드 서열, 서열번호 59의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 61의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다.
구체적인 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 102, 서열번호 104, 서열번호 106, 서열번호 108, 서열번호 110, 서열번호 112, 서열번호 114, 서열번호 116, 서열번호 56, 서열번호 58, 서열번호 60, 서열번호 62, 서열번호 52 및 서열번호 12로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 암배아 항원(CEA)에 대해 특이적인 하나 이상의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 CEA의 에피토프에 대한 결합에 대해 단일클론 항체 BW431/26(유럽 특허 제160 897호 및 문헌[Bosslet et al., Int J Cancer 36, 75-84 (1985)]에 기재됨)과 경쟁할 수 있는 하나 이상, 전형적으로 2개 이상의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 CEA의 에피토프에 대한 결합에 대해 단일클론 항체 CH1A1A(서열번호 123 및 131 참조)와 경쟁할 수 있는 하나 이상, 전형적으로 2개 이상의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 WO 2011/023787을 참조한다. 한 실시양태에서, CEA에 대해 특이적인 항원 결합 모이어티는 단일클론 항체 CH1A1A에 의해 결합되는 CEA의 에피토프와 동일한 CEA의 에피토프에 결합한다. 한 실시양태에서, CEA에 대해 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 117의 중쇄 CDR1, 서열번호 119의 중쇄 CDR2, 서열번호 121의 중쇄 CDR3, 서열번호 125의 경쇄 CDR1, 서열번호 127의 경쇄 CDR2 및 서열번호 129의 경쇄 CDR3을 포함한다. 추가적 실시양태에서, CEA에 대해 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 123과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%, 특히 적어도 약 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 131과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%, 특히 적어도 약 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, CEA에 대해 특이적인 항원 결합 모이어티는 단일클론 항체 CH1A1A의 친화성 성숙된 버전의 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, CEA에 대해 특이적인 항원 결합 모이어티는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개, 특히 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 123의 중쇄 가변 영역 서열; 및 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개, 특히 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 131의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. CEA, 특히 인간 CEA에 대한 결합이 보존되는 한, 가변 영역 서열 내의 임의의 아미노산 잔기는 CDR 영역 내의 아미노산 잔기를 포함하는 상이한 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직한 변이체는 비치환된 가변 영역 서열을 포함하는 항원 결합 모이어티의 결합 친화성과 적어도 동등한(또는 더 강한) CEA에 대한 결합 친화성을 갖는 변이체이다.
한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 63의 폴리펩티드 서열, 서열번호 65의 폴리펩티드 서열, 서열번호 67의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 33의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 65의 폴리펩티드 서열, 서열번호 67의 폴리펩티드 서열, 서열번호 183의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 197의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 183의 폴리펩티드 서열, 서열번호 203의 폴리펩티드 서열, 서열번호 205의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 207의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 183의 폴리펩티드 서열, 서열번호 209의 폴리펩티드 서열, 서열번호 211의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 213의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다.
구체적인 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 118, 서열번호 120, 서열번호 122, 서열번호 124, 서열번호 126, 서열번호 128, 서열번호 130, 서열번호 132, 서열번호 64, 서열번호 66, 서열번호 68, 서열번호 34, 서열번호 184, 서열번호 198, 서열번호 204, 서열번호 206, 서열번호 208, 서열번호 210, 서열번호 212 및 서열번호 214로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, CEA에 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 290, 서열번호 291 및 서열번호 292로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 294, 서열번호 295 및 서열번호 296으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
한 실시양태에서, CEA에 특이적인 항원 결합 모이어티는서열번호 290의 중쇄 CDR1, 서열번호 291의 중쇄 CDR2, 서열번호 292의 중쇄 CDR3, 서열번호 294의 경쇄 CDR1, 서열번호 295의 경쇄 CDR2 및 서열번호 296의 경쇄 CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, CEA에 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 289의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 293의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, CEA에 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 289의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 293의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
추가적 실시양태에서, CEA에 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 289의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 293의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다.
한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 288과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열번호 322와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열번호 323과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 및 서열번호 324와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 CD33에 대해 특이적인 하나 이상의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 한 실시양태에서, CD33에 대해 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 133의 중쇄 CDR1, 서열번호 135의 중쇄 CDR2, 서열번호 137의 중쇄 CDR3, 서열번호 141의 경쇄 CDR1, 서열번호 143의 경쇄 CDR2 및 서열번호 145의 경쇄 CDR3을 포함한다. 추가적 실시양태에서, CD33에 대해 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 139와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 147과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다.
한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 33의 폴리펩티드 서열, 서열번호 213의 폴리펩티드 서열, 서열번호 221의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 223의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 33의 폴리펩티드 서열, 서열번호 221의 폴리펩티드 서열, 서열번호 223의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 225의 폴리펩티드 서열, 또는 기능성을 보유하는 이들의 변이체를 포함한다.
구체적인 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 134, 서열번호 136, 서열번호 138, 서열번호 140, 서열번호 142, 서열번호 144, 서열번호 146, 서열번호 148, 서열번호 34, 서열번호 214, 서열번호 222, 서열번호 224 및 서열번호 226으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열을 포함한다.
폴리뉴클레오티드
본 발명은 본원에 기재된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 단편은 항원 결합 단편이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 373 및 374에 기재된 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드(이의 기능성 단편 또는 변이체를 포함함)를 포함한다.
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 전체 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 단일 폴리뉴클레오티드로서 발현될 수 있거나 공발현되는 다수(예를 들면, 2개 이상)의 폴리뉴클레오티드로서 발현될 수 있다. 공발현되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드는 예를 들면, 다이설파이드 결합 또는 다른 수단을 통해 결합하여 기능성 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 형성할 수 있다. 예를 들면, 항원 결합 모이어티의 경쇄 부분은 항원 결합 모이어티의 중쇄 부분, Fc 도메인 서브유닛 및 임의적으로 또다른 항원 결합 모이어티(의 일부)를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 일부로부터 분리된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다. 공발현되는 경우, 중쇄 폴리펩티드는 경쇄 폴리펩티드와 결합하여 항원 결합 모이어티를 형성할 것이다. 또다른 예에서, 2개의 Fc 도메인 서브유닛 중 하나 및 임의적으로 하나 이상의 항원 결합 모이어티(의 일부)를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 일부는 상기 2개의 Fc 도메인 서브유닛 중 나머지 하나 및 임의적으로 항원 결합 모이어티(의 일부)를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 일부로부터 분리된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다. 공발현되는 경우, Fc 도메인 서브유닛은 결합하여 Fc 도메인을 형성할 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 제1 항원 결합 모이어티, 제2 항원 결합 모이어티, 및 2개의 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 단편을 암호화하고, 이때 제1 항원 결합 모이어티는 단일 쇄 Fab 분자이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 제1 항원 결합 모이어티 및 Fc 도메인의 서브유닛을 암호화한다. 보다 구체적인 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 단일 쇄 Fab 분자가 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 암호화한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 제2 항원 결합 모이어티의 중쇄 및 Fc 도메인의 서브유닛을 암호화한다. 보다 구체적인 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 암호화한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 제1 항원 결합 모이어티, 제2 항원 결합 모이어티의 중쇄 및 Fc 도메인의 서브유닛을 암호화한다. 보다 구체적인 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 단일 쇄 Fab 분자가 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 암호화한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 제1 항원 결합 모이어티, 제2 항원 결합 모이어티, 및 2개의 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 단편을 암호화하고, 이때 제1 항원 결합 모이어티는 교차 Fab 분자이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 제1 항원 결합 모이어티의 중쇄 및 Fc 도메인의 서브유닛을 암호화한다. 보다 구체적인 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 Fab 경쇄 가변 영역이 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 Fab 중쇄 불변 영역이 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 암호화한다. 또다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 Fab 중쇄 가변 영역이 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 Fab 경쇄 불변 영역이 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 암호화한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 제2 항원 결합 모이어티의 중쇄 및 Fc 도메인의 서브유닛을 암호화한다. 보다 구체적인 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 암호화한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 제1 항원 결합 모이어티의 중쇄, 제2 항원 결합 모이어티의 중쇄 및 Fc 도메인의 서브유닛을 암호화한다. 보다 구체적인 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 Fab 경쇄 가변 영역이 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 Fab 중쇄 불변 영역이 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 암호화한다. 또다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 Fab 중쇄 가변 영역이 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 Fab 경쇄 불변 영역이 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 암호화한다. 또다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 Fab 중쇄가 Fab 경쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 Fab 경쇄 가변 영역이 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 Fab 중쇄 불변 영역이 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 암호화한다. 또다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 Fab 중쇄가 Fab 중쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 Fab 중쇄 가변 영역이 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 Fab 경쇄 불변 영역이 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 암호화한다.
추가적 실시양태에서, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 제3 항원 결합 모이어티의 중쇄 및 Fc 도메인의 서브유닛을 암호화한다. 보다 구체적인 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 암호화한다.
추가적 실시양태에서, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 항원 결합 모이어티의 경쇄를 암호화한다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 Fab 경쇄 가변 영역이 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 암호화한다. 또다른 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 Fab 중쇄 가변 영역이 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 암호화한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 제1 항원 결합 모이어티의 경쇄 및 제2 항원 결합 모이어티의 경쇄를 암호화한다. 보다 구체적인 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 Fab 중쇄 가변 영역이 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 Fab 경쇄 불변 영역이 Fab 경쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 암호화한다. 또다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 Fab 경쇄가 Fab 중쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 Fab 중쇄 가변 영역이 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 암호화한다. 또다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 Fab 경쇄 가변 영역이 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 Fab 중쇄 불변 영역이 Fab 경쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 암호화한다. 또다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 Fab 경쇄가 Fab 경쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 상기 Fab 경쇄 가변 영역이 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 암호화한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 서열번호 75, 83, 91, 99, 107, 115, 123, 131, 139, 147, 169, 177, 239, 247, 255 및 263에 나타낸 가변 영역 서열을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229 및 231에 나타낸 폴리펩티드 서열을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 뉴클레오티드로서, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262 또는 264에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262 또는 264에 나타낸 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 서열번호 75, 83, 91, 99, 107, 115, 123, 131, 139, 147, 169, 177, 239, 247, 255 또는 263에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 가변 영역 서열을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229 또는 231에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호 75, 83, 91, 99, 107, 115, 123, 131, 139, 147, 169, 177, 239, 247, 255 또는 263의 가변 영역 서열을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포괄한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 서열번호 269, 273, 279, 283, 289, 293, 297, 298, 299, 300, 302, 305, 307, 309, 312, 313 또는 317에 나타낸 가변 영역 서열을 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 서열번호 288, 322, 323, 324, 278, 319, 320, 321, 369, 370, 371 또는 372에 나타낸 폴리펩티드 서열인 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또다른 실시양태에서, 또한, 본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 서열번호 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 364, 364, 373 또는 374에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 서열번호 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 373 또는 374에 나타낸 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 서열번호 269, 273, 279, 283, 289, 293, 297, 298, 299, 300, 302, 305, 307, 309, 312, 313 또는 317의 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 가변 영역 서열을 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 서열번호 288, 322, 323, 324, 278, 319, 320, 321, 369, 370, 371 또는 372의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호 269, 273, 279, 283, 289, 293, 297, 298, 299, 300, 302, 305, 307, 309, 312, 313 또는 317의 가변 영역 서열을 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포괄한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호 288, 322, 323, 324, 278, 319, 320 또는 321의 폴리펩티드 서열을 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포괄한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호 278, 319, 369 또는 370의 폴리펩티드 서열을 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포괄한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호 278, 319, 371 또는 372의 폴리펩티드 서열을 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포괄한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 364, 364, 373 또는 374의 폴리펩티드 서열을 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포괄한다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 메신저 RNA(mRNA) 형태의 RNA이다. 본 발명의 RNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
재조합 방법
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 예를 들면, 고체 상태 펩티드 합성(예를 들면, 메리필드(Merrifield) 고체상 합성) 또는 재조합 제조에 의해 수득될 수 있다. 재조합 제조를 위해, 예를 들면, 전술된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(단편)를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 단리하고 숙주 세포에서의 추가적 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입한다. 통상적인 절차를 사용하여 이러한 폴리뉴클레오티드를 용이하게 단리하고 서열분석할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상을 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터가 제공된다. 당업자에게 주지된 방법을 사용하여 적절한 전사/번역 조절 신호와 함께 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(단편)의 암호화 서열을 함유하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이들 방법은 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 재조합/유전적 재조합을 포함한다. 예를 들면, 문헌[Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)] 및 [Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)]에 기재된 기법을 참조한다. 발현 벡터는 플라스미드 또는 바이러스의 일부일 수 있거나 핵산 단편일 수 있다. 발현 벡터는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(단편)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(즉, 암호화 영역)가 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 조절 요소와 작동가능하게 연결된 상태로 클로닝되어 있는 발현 카세트를 포함한다. 본원에서 사용된 "암호화 영역"은 아미노산으로 번역되는 코돈들로 구성된 핵산의 일부이다. "정지 코돈"(TAG, TGA 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지 않지만, 암호화 영역의 일부인 것으로 간주될 수 있지만, 존재하는 경우 임의의 플랭킹 서열, 예를 들면, 프로모터, 리보좀 결합 부위, 전사 종결요소, 인트론, 5' 및 3' 비번역 영역 등은 암호화 영역의 일부가 아니다. 2개 이상의 암호화 영역은 단일 폴리뉴클레오티드 구축물 내에, 예를 들면, 단일 벡터 상에 존재할 수 있거나 별도의 폴리뉴클레오티드 구축물 내에, 예를 들면, 별도의 (상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 더욱이, 임의의 벡터는 단일 암호화 영역을 함유할 수 있거나 2개 이상의 암호화 영역을 포함할 수 있다(예를 들면, 본 발명의 벡터는 단백질용해성 절단을 통해 번역 후에 또는 번역과 동시에 최종 단백질로 분리되는 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화할 수 있다). 또한, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(단편), 또는 이의 변이체 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 융합되거나 융합되지 않은 이종 암호화 영역을 암호화할 수 있다. 이종 암호화 영역은 전문화된 요소 또는 모티프, 예컨대, 분비 신호 펩티드 또는 이종 기능성 도메인을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 작동가능한 연결은 유전자 생성물, 예를 들면, 폴리펩티드에 대한 암호화 영역이 조절 서열의 영향 또는 조절하에 유전자 생성물이 발현되게 하는 방식으로 하나 이상의 조절 서열과 연결되어 있는 경우이다. 2개의 DNA 단편(예컨대, 폴리펩티드 암호화 영역 및 이와 연결된 프로모터)은 프로모터 기능의 유도가 원하는 유전자 생성물을 암호화하는 mRNA의 전사를 야기하는 경우 및 상기 2개의 DNA 단편 사이의 연결의 성질이 유전자 생성물의 발현을 지시하는 발현 조절 서열의 능력을 방해하지 않거나 전사되는 DNA 주형의 능력을 방해하지 않는 경우 "작동가능하게 연결"되어 있다. 따라서, 프로모터 영역은 이 프로모터가 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 전사에 영향을 미칠 수 있는 경우 상기 핵산과 작동가능하게 연결되어 있을 것이다. 프로모터는 예정된 세포에서만 DNA의 실질적인 전사를 지시하는 세포 특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외의 다른 전사 조절 요소, 예를 들면, 인핸서, 오퍼레이터, 리프레서 및 전사 종결 신호는 세포 특이적 전사를 지시하도록 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결될 수 있다. 적합한 프로모터 및 다른 전사 조절 영역은 본원에 개시되어 있다. 다양한 전사 조절 영역이 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 척추동물 세포에서 기능하는 전사 조절 영역, 예컨대, 사이토메갈로바이러스(예를 들면, 인트론-A와 함께 즉시 초기 프로모터), 원숭이 바이러스 40(예를 들면, 초기 프로모터) 및 레트로바이러스(예를 들면, 라우스 육종 바이러스)의 프로모터 및 인핸서 분절(그러나, 이들로 한정되지 않음)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 다른 전사 조절 영역은 척추동물 유전자, 예컨대, 액틴, 열 충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 α-글로빈으로부터 유래된 전사 조절 영역뿐만 아니라, 진핵 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 다른 서열도 포함한다. 추가적 적합한 전사 조절 영역은 조직 특이적 프로모터 및 인핸서뿐만 아니라 유도성 프로모터(예를 들면, 테트라사이클린 유도성 프로모터)도 포함한다. 유사하게, 다양한 번역 조절 요소들이 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지되어 있다. 이들은 리보좀 결합 부위, 번역 개시 및 종결 코돈, 및 바이러스 시스템으로부터 유래된 요소(특히, CITE 서열로도 지칭되는 내부 리보좀 도입 부위 또는 IRES)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 발현 카세트는 다른 특징, 예컨대, 복제기점 및/또는 염색체 삽입 요소, 예컨대, 레트로바이러스 긴 말단 반복부(LTR), 또는 아데노 관련 바이러스(AAV) 도립 말단 반복부(ITR)도 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 핵산 암호화 영역은 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 분비를 지시하는 분비 또는 신호 펩티드를 암호화하는 추가적 암호화 서열과 연결될 수 있다. 예를 들면, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 분비를 원하는 경우, 신호 서열을 암호화하는 DNA를 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산의 상류에 배치할 수 있다. 신호 가설에 따르면, 포유동물 세포에 의해 분비된 단백질은 일단 성장하는 단백질 쇄가 조면 소포체(rough endoplasmic reticulum)를 횡단하여 이출되기 시작하면 성숙 단백질로부터 절단되는 신호 펩티드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 당분야에서 통상의 기술을 가진 자는 척추동물 세포에 의해 분비된 폴리펩티드가 일반적으로 이 폴리펩티드의 N-말단에 융합된 신호 펩티드를 갖고, 상기 신호 펩티드는 상기 폴리펩티드의 분비된 또는 "성숙" 형태를 생성하기 위해 번역된 폴리펩티드로부터 절단된다는 것을 인식하고 있다. 일부 실시양태에서, 천연 신호 펩티드, 예를 들면, 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩티드, 또는 그 자신과 작동가능하게 연결된 폴리펩티드의 분비를 지시하는 능력을 보유하는 상기 서열의 기능성 유도체가 사용된다. 대안적으로, 이종 포유동물 신호 펩티드 또는 이의 기능성 유도체가 사용될 수 있다. 예를 들면, 야생형 리더 서열은 인간 조직 플라스미노겐 활성화제(TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다제의 리더 서열로 치환될 수 있다. 분비 신호 펩티드의 예시적 아미노산 서열 및 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 154 내지 162에 제공되어 있다.
추가적 정제를 용이하게 하기 위해 또는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 표지하는 것을 보조하기 위해 사용될 수 있는 짧은 단백질 서열(예를 들면, 히스티딘 태그)을 암호화하는 DNA가 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(단편) 암호화 폴리뉴클레오티드의 내부 또는 말단에 포함될 수 있다.
추가적 실시양태에서, 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 상기 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 폴리뉴클레오티드 및 벡터 각각과 관련하여 본원에 기재된 특징 중 임의의 특징을 단독으로 또는 조합으로 포함할 수 있다. 한 이러한 실시양태에서, 숙주 세포는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(의 일부)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다(예를 들면, 이러한 벡터로 형질전환되어 있거나 형질감염되어 있다). 본원에서 사용된 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 발생시키기 위해 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포 시스템을 지칭한다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 발현을 복제하고 뒷받침하기에 적합한 숙주 세포는 당분야에서 주지되어 있다. 이러한 세포를 적절한 경우 특정 발현 벡터로 형질감염시킬 수 있거나 형질도입할 수 있고, 임상 적용에 충분한 양의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 수득하기 위해 다량의 벡터 함유 세포를 대규모 발효기 시딩용으로 성장시킬 수 있다. 적합한 숙주 세포는 원핵 미생물, 예컨대, 이. 콜라이 또는 다양한 진핵 세포, 예컨대, 중국 햄스터 난소 세포(CHO), 곤충 세포 등을 포함한다. 예를 들면, 특히 글리코실화가 필요하지 않은 경우 폴리펩티드를 세균에서 제조할 수 있다. 발현 후, 상기 폴리펩티드를 가용성 분획으로 세균 세포 페이스트로부터 단리할 수 있고 더 정제할 수 있다. 원핵생물 이외에, 진핵 미생물, 예컨대, 글리코실화 경로가 "인간화"되어 있어 부분적으로 또는 전체적으로 인간 글리코실화 패턴을 갖는 폴리펩티드의 생성을 야기하는 진균 및 효모 균주를 포함하는 사상 진균 또는 효모가 폴리펩티드 암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 문헌[Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)] 및 [Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)]을 참조한다. (글리코실화된) 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터도 유래된다. 무척추동물 세포의 예에는 식물 세포 및 곤충 세포가 포함된다. 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스 균주가 동정되어 있다. 식물 세포 배양물도 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들면, (형질전환 식물에서 항체를 제조하기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES: 상표) 기술을 기술하는) 미국 특허 제5,959,177호, 제6,040,498호, 제6,420,548호, 제7,125,978호 및 제6,417,429호를 참조한다. 척추동물 세포도 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 현탁액 중에서 성장하도록 적응된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7), 인간 배아 신장 세포주(예를 들면, 문헌[Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)]에 기재된 293 또는 293T 세포), 새끼 햄스터 신장 세포(BHK), 마우스 세르톨리 세포(예를 들면, 문헌[Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)]에 기재된 TM4 세포), 원숭이 신장 세포(CV1), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76), 인간 자궁경부암종 세포(HELA), 개 신장 세포(MDCK), 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A), 인간 폐 세포(W138), 인간 간 세포(Hep G2), 마우스 유선 종양 세포(MMT 060562), TRI 세포(예를 들면, 문헌[Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)]에 기재됨), MRC 5 세포 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 dhfr- CHO 세포(문헌[Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)])를 포함하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 골수종 세포주, 예컨대, YO, NS0, P3X63 및 Sp2/0를 포함한다. 단백질 제조에 적합한 일부 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해서는 예를 들면, 문헌[Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예를 들면, 포유동물 배양된 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 세균 세포 및 식물 세포뿐만 아니라, 형질전환 동물, 형질전환 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포도 포함한다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 예컨대, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 배아 신장(HEK) 세포 또는 림프계 세포(예를 들면, Y0, NS0, Sp20 세포)이다.
이들 시스템에서 외래 유전자를 발현하기 위한 표준 기술은 당분야에서 공지되어 있다. 항원 결합 도메인, 예컨대, 항체의 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포는 나머지 항체 쇄도 발현하여 발현된 생성물이 중쇄 및 경쇄 둘다를 갖는 항체이도록 조작될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제조하는 방법으로서, 본원에서 제공된 바와 같은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건하에 배양하는 단계, 및 상기 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 회수하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 구성성분은 서로 유전적으로 융합되어 있다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 그의 구성성분이 직접적으로 또는 연결자 서열을 통해 간접적으로 서로 융합되도록 설계될 수 있다. 상기 연결자의 조성 및 길이는 당분야에서 주지된 방법에 따라 결정될 수 있고 효능에 대해 시험될 수 있다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 상이한 성분 사이의 연결자 서열의 예는 본원에 제공된 서열에서 발견된다. 필요에 따라, 융합체의 개별 구성성분을 분리하기 위한 절단 부위, 예를 들면, 엔도펩티다제 인식 서열을 도입하도록 추가적 서열도 포함될 수 있다.
특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 하나 이상의 항원 결합 모이어티는 항원성 결정인자에 결합할 수 있는 하나 이상의 항체 가변 영역을 포함한다. 가변 영역은 천연 또는 비천연 항체 또는 이의 단편의 일부를 형성할 수 있고 이러한 천연 또는 비천연 항체 또는 이의 단편으로부터 유래될 수 있다. 다중클론 항체 및 단일클론 항체를 제조하는 방법은 당분야에서 주지되어 있다(예를 들면, 문헌[Harlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988] 참조). 비천연 항체는 고체상 펩티드 합성의 사용을 통해 구축될 수 있거나, (예를 들면, 미국 특허 제4,186,567호에 기재된 바와 같이) 재조합적으로 제조될 수 있거나, 예를 들면, 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하는 조합 라이브러리의 스크리닝에 의해 수득될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제5,969,108호(McCafferty) 참조).
임의의 동물 종의 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 영역이 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 사용될 수 있다. 본 발명에서 유용한 비한정적 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 영역은 뮤린, 영장류 또는 인간으로부터 유래될 수 있다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 인간에 사용되기 위한 것인 경우, 키메라 형태의 항체가 사용될 수 있고, 이때 항체의 불변 영역은 인간으로부터 유래된다. 인간화된 또는 전체 인간 형태의 항체도 당분야에서 주지된 방법에 따라 제조될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제5,565,332호(Winter) 참조). 인간화는 (a) 중요한 골격 잔기(예를 들면, 우수한 항원 결합 친화성 또는 항체 기능을 보유하는 데에 있어서 중요한 골격 잔기)를 보유하거나 보유하지 않으면서 비인간(예를 들면, 공여자 항체) CDR을 인간(예를 들면, 수용자 항체) 골격 및 불변 영역에 그래프팅하는 방법, (b) 비인간 특이성 결정 영역(SDR 또는 a-CDR: 항체-항원 상호작용에 중요한 잔기)을 인간 골격 및 불변 영역에 그래프팅하는 방법, 또는 (c) 전체 비인간 가변 도메인을 이식하되, 표면 잔기의 치환을 통해 이들을 인간 유사 구획으로 "은폐"시키는 방법을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 인간화된 항체 및 이를 제조하는 방법은 예를 들면, 문헌[Almagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008)]에서 검토되어 있고, 예를 들면, 하기 문헌에 더 기재되어 있다: 문헌[Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988)]; [Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989)]; 미국 특허 제5,821,337호, 제7,527,791호, 제6,982,321호 및 제7,087,409호; 문헌[Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986)]; 문헌[Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984)]; [Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988)]; [Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994)]; [Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005)](SDR(a-CDR) 그래프팅이 기재됨); [Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991)]("재표면화"가 기재됨); [Dall'Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005)]("FR 셔플링"이 기재됨); 및 [Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) and Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000)](FR 셔플링에 대한 "유도 선택" 방법이 기재됨). 당분야에서 공지된 다양한 기법을 사용하여 인간 항체 및 인간 가변 영역을 제조할 수 있다. 인간 항체는 문헌[van Dijk and van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001)] 및 [Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008)]에 일반적으로 기재되어 있다. 인간 가변 영역은 하이브리도마 방법에 의해 제조된 인간 단일클론 항체의 일부를 형성할 수 있고 이러한 인간 단일클론 항체로부터 유래될 수 있다(예를 들면, 문헌[Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)] 참조). 또한, 인간 항체 및 인간 가변 영역은 항원 챌린지에 반응하여 온전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 온전한 항체를 생성하도록 변경된 형질전환 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다(예를 들면, 문헌[Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)] 참조). 또한, 인간 항체 및 인간 가변 영역은 인간으로부터 유래된 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 영역 서열을 단리함으로써 발생될 수 있다(예를 들면, 문헌[Hoogenboom et al., in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)], [McCafferty et al., Nature 348, 552-554] 및 [Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)] 참조). 파지는 전형적으로 단일 쇄 Fv(scFv) 단편 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 디스플레이한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에서 유용한 항원 결합 모이어티는 예를 들면, 전체 내용이 본원에 참고로 도입되는 미국 특허출원 공개 제2004/0132066호에 개시된 방법에 따라 향상된 결합 친화성을 갖도록 조작된다. 특정 항원성 결정인자에 결합하는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 능력은 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA) 또는 당업자에게 공지된 다른 기법, 예를 들면, (비아코어 T100 시스템 상에서 분석되는) 표면 플라스몬 공명 기법(문헌[Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)]) 및 전통적인 결합 분석(문헌[Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)])를 통해 측정될 수 있다. 경쟁 분석을 사용하여 특정 항원에 대한 결합에 대해 기준 항체와 경쟁하는 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 도메인, 예를 들면, CD3에 대한 결합에 대해 V9 항체와 경쟁하는 항체를 확인할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이러한 경쟁 항체는 기준 항체에 의해 결합되는 에피토프와 동일한 에피토프(예를 들면, 선형 또는 입체구조형 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 맵핑하는 상세한 예시적 방법은 문헌[Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)]에 제공되어 있다. 예시적 경쟁 분석에서, 고정된 항원(예를 들면, CD3)은 이 항원에 결합하는 제1 표지된 항체(예를 들면, V9 항체) 및 상기 항원에 대한 결합에 대해 제1 항체와 경쟁하는 그의 능력을 시험받는 제2 비표지된 항체를 포함하는 용액에서 항온처리된다. 제2 항체는 하이브리도마 상청액에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정된 항원은 제1 표지된 항체를 포함하되 제2 비표지된 항체를 포함하지 않는 용액에서 항온처리된다. 제1 항체와 항원의 결합을 허용하는 조건하에 항온처리된 후, 과량의 비결합된 항체가 제거되고, 고정된 항원과 연결된 표지의 양이 측정된다. 고정된 항원과 연결된 표지의 양이 대조군 샘플에 비해 상대적으로 시험 샘플에서 실질적으로 감소되는 경우, 이것은 제2 항체가 상기 항원에 대한 결합에 대해 제1 항체와 경쟁한다는 것을 표시한다. 문헌[Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)]을 참조한다.
본원에 기재된 바와 같이 제조된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 당분야에서 공지된 기법, 예컨대, 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등에 의해 정제될 수 있다. 특정 단백질의 정제에 사용되는 실제 조건은 부분적으로 순 전하, 소수성, 친수성 등과 같은 인자에 의해 좌우될 것이고 당업자에게 자명할 것이다. 친화성 크로마토그래피 정제의 경우, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 결합하는 항체, 리간드, 수용체 또는 항원이 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 친화성 크로마토그래피 정제를 위해, 단백질 A 또는 단백질 G를 갖는 매트릭스가 사용될 수 있다. 본질적으로 실시예에 기재된 바와 같이 순차적 단백질 A 또는 G 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 단리할 수 있다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 순도는 겔 전기영동, 고압 액체 크로마토그래피 등을 포함하는 주지된 다양한 분석 방법 중 임의의 분석 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 실시예에 기재된 바와 같이 발현된 중쇄 융합 단백질은 환원 SDS-PAGE에 의해 입증된 바와 같이 온전하고 적절하게 조립되어 있는 것으로 밝혀졌다(예를 들면, 도 2 참조). 3개의 밴드가 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 경쇄, 중쇄 및 중쇄/경쇄 융합 단백질의 예측된 분자량에 상응하는 약 Mr 25,000, Mr 50,000 및 Mr 75,000에서 해상되었다.
분석
본원에 제공된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 당분야에서 공지된 다양한 분석에 의해 그들의 물리적/화학적 성질 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인될 수 있거나, 스크리닝될 수 있거나 특징규명될 수 있다.
친화성 분석
Fc 수용체 또는 표적 항원에 대한 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 친화성은 표준 기계, 예컨대, 비아코어 기계(지이 헬쓰케어)를 사용한 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 실시예에 기재된 방법에 따라 결정될 수 있고, 수용체 또는 표적 단백질은 예컨대, 재조합 발현에 의해 수득될 수 있다. 대안적으로, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자와 상이한 수용체 또는 표적 항원의 결합은 특정 수용체 또는 표적 항원을 발현하는 세포주를 사용함으로써 예를 들면, 유세포계수(FACS)에 의해 평가될 수 있다. 결합 친화성을 측정하는 구체적인 예증적 및 예시적 실시양태는 하기 설명 및 하기 실시예에 기재되어 있다.
한 실시양태에 따라, 25℃에서 비아코어(등록상표) T100 기계(지이 헬쓰케어)를 사용하여 표면 플라스몬 공명으로 KD를 측정한다.
Fc 부분과 Fc 수용체 사이의 상호작용을 분석하기 위해, His 태그가 부착된 재조합 Fc 수용체를 CM5 칩 상에 고정된 항-펜타 His 항체(퀴아젠(Qiagen))로 포획하고, 이중특이적 구축물을 분석물로서 사용한다. 요약하건대, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, 지이 헬쓰케어)을 공급자의 설명서에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)로 활성화시킨다. 약 6,500 반응 유닛(RU)의 커플링된 단백질을 달성하기 위해 5 ㎕/분의 유속으로 주입하기 전에 항-펜타 His 항체를 10 mM 나트륨 아세테이트(pH 5.0)로 40 ㎍/㎖까지 희석한다. 리간드의 주입 후, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응된 기를 차단한다. 그 후, Fc 수용체를 4 또는 10 nM에서 60초 동안 포획한다. 동역학적 측정을 위해, HBS-EP(지이 헬쓰케어, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 계면활성제 P20, pH 7.4) 중의 이중특이적 구축물의 4배 연속 희석물(500 내지 4000 nM의 범위)을 25℃에서 30 ㎕/분의 유속으로 120초 동안 주입한다.
표적 항원에 대한 친화성을 결정하기 위해, 이중특이적 구축물을 항-펜타 His 항체에 대해 기재된 바와 같이 활성화된 CM5-센서 칩 표면 상에 고정된 항-인간 Fab 특이적 항체(지이 헬쓰케어)로 포획한다. 커플링된 단백질의 최종 양은 약 12000 RU이다. 이중특이적 구축물을 300 nM에서 90초 동안 포획한다. 표적 항원을 250 내지 1000 nM의 농도 범위에서 30 ㎕/의 유속으로 180초 동안 유동 셀에 통과시킨다. 해리를 180초 동안 모니터링한다.
기준 유동 셀에 대해 수득된 반응을 차감함으로써 벌크 굴절률 차이를 보정한다. 정상 상태 반응을 사용하여 랭뮤어(Langmuir) 결합 등온선의 비선형 곡선 피팅으로 해리 상수 KD를 유도하였다. 결합 센서그램 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함으로써 단순 1-대-1 랭뮤어 결합 모델(비아코어(등록상표) T100 평가 소프트웨어 버전 1.1.1)을 사용하여 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)를 계산한다. 평형 해리 상수(KD)를 비 koff/kon로서 계산한다. 예를 들면, 문헌[Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999)]을 참조한다.
활성 분석
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 생물학적 활성은 실시예에 기재된 바와 같이 다양한 분석에 의해 측정될 수 있다. 생물학적 활성은 예를 들면, T 세포의 증식의 유도, T 세포에서의 신호전달의 유도, T 세포에서의 활성화 마커 발현의 유도, T 세포에 의한 사이토카인 분비의 유도, 표적 세포, 예컨대, 종양 세포의 용해의 유도, 및 종양 퇴행의 유도 및/또는 생존의 개선을 포함할 수 있다.
조성물, 제형 및 투여 경로
추가적 양태에서, 본 발명은 예를 들면, 하기 치료 방법 중 임의의 치료 방법에서 사용되는, 본원에 제공된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 중 임의의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 약학 조성물은 본원에 제공된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 중 임의의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 약학 조성물은 예를 들면, 후술된 바와 같이 본원에 제공된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 중 임의의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 하나 이상의 추가적 치료제를 포함한다.
또한, 생체내 투여에 적합한 형태로 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제조하는 방법으로서, (a) 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 수득하는 단계, 및 (b) 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체로 제형화함으로써 생체내 투여를 위한 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 제제를 제형화하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체에 용해되거나 분산된 치료 유효량의 하나 이상의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함한다. 어구 "약학적 또는 약학적으로 허용되는"은 사용된 용량 및 농도에서 수용자에게 일반적으로 독성을 나타내지 않는, 즉 적절한 경우 동물, 예컨대, 인간에게 투여되었을 때 불리한, 알레르기 또는 다른 원치 않는 반응을 발생시키지 않는 분자 물질 및 조성물을 지칭한다. 하나 이상의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 임의적으로 추가적 활성 성분을 함유하는 약학 조성물의 제조는 본원에 참고로 도입되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990]에 의해 예시된 바와 같이 본 개시내용에 비추어 볼 때 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 더욱이, 동물(예를 들면, 인간) 투여의 경우, 제제는 FDA 생물학적 표준 관청 또는 다른 국가의 상응하는 정부기관에 의해 요구되는 멸균성, 발열원성, 일반적인 안전성 및 순도 표준을 충족시켜야 한다는 것을 이해할 것이다. 바람직한 조성물은 동결건조된 제형 또는 수용액이다. 본원에서 사용된 "약학적으로 허용되는 담체"는 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지되어 있는 바와 같이(예를 들면, 본원에 참고로 도입되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329] 참조) 임의의 모든 용매, 완충제, 분산 매질, 코팅제, 계면활성제, 항산화제, 방부제(예를 들면, 항균제, 항진균제), 등장제, 흡수 지연제, 염, 단백질, 약물, 약물 안정화제, 중합체, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 풍미제, 안료, 이와 유사한 물질 및 이들의 조합물을 포함한다. 임의의 통상적인 담체가 활성 성분과 상용불가능한 경우를 제외하고, 치료 또는 약학 조성물에서의 상기 담체의 사용이 고려된다.
조성물은 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 투여될 지, 및 주사로서 이러한 투여 경로를 위해 멸균될 필요가 있는 지에 따라 상이한 유형의 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(및 임의의 추가적 치료제)는 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지되어 있는 바와 같이(예를 들면, 본원에 참고로 도입되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990] 참조) 흡입(예를 들면, 에어로졸 흡입), 주사, 주입, 연속 주입, 직접적으로, 카테터를 통해 또는 세척을 통해 표적 세포를 세척하는 국소화된 관류, 크림, 지질 조성물(예를 들면, 리포좀) 또는 다른 방법, 또는 상기 방법의 임의의 조합에 의해 정맥내, 피내, 동맥내, 복강내, 병변내, 두개내, 관절내, 전립선내, 비장내, 신장내, 흉막내, 경막내, 비내, 유리체내, 질내, 직장내, 종양내, 근육내, 피하, 결막하, 소포내, 점막, 심장주위내, 배꼽내, 안구내, 경구, 국부 또는 국소 투여될 수 있다. 비경구 투여, 특히 정맥내 주사가 폴리펩티드 분자, 예컨대, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 투여하기 위해 가장 통상적으로 사용된다.
비경구 조성물은 주사, 예를 들면, 피하, 피내, 병변내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 경막내 또는 복강내 주사에 의한 투여용으로 설계된 비경구 조성물을 포함한다. 주사의 경우, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 수용액, 바람직하게는 생리학적으로 상용가능한 완충제, 예컨대, 행크(Hank) 용액, 링거(Ringer) 용액 또는 생리학적 식염수 완충제에서 제형화될 수 있다. 용액은 제형화제, 예컨대, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들면, 발열원 무함유 멸균수로 재구성될 분말 형태로 존재할 수 있다. 멸균 주사 용액은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 요구된 양으로 필요에 따라 하기 나열된 다양한 다른 성분들과 함께 적절한 용매 내로 도입함으로써 제조된다. 멸균성은 예를 들면, 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분들을 염기성 분산 매질 및/또는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 도입함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액, 현탁액 또는 유화액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 및 임의의 추가적 원하는 성분으로 구성된 분말을 이의 미리 멸균-여과된 액체 매질로부터 생성하는 진공 건조 또는 동결 건조 기법이다. 상기 액체 매질은 필요한 경우 적절하게 완충되어야 하고, 액체 희석제는 먼저 주사 전에 충분한 식염수 또는 당에 의해 등장성을 갖게 되어야 한다. 조성물은 제조 및 저장 조건하에 안정해야 하고 미생물, 예컨대, 세균 및 진균의 오염 작용으로부터 보존되어야 한다. 내독소 오염은 안전한 수준, 예를 들면, 단백질 1 mg 당 0.5 ng 미만에서 최소한으로 유지되어야 한다는 것을 인식할 것이다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체는 하기 담체를 포함하나 이들로 한정되지 않는다: 완충제, 예컨대, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제(예컨대, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 모노사카라이드, 다이사카라이드 및 다른 탄수화물; 킬레이팅제, 예컨대, EDTA; 당, 예컨대, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예컨대, 나트륨; 금속 착물(예를 들면, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG). 수성 주사 현탁액은 이 현탁액의 점도를 증가시키는 화합물, 예컨대, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 소르비톨, 덱스트란 등을 함유할 수 있다. 임의적으로, 상기 현탁액은 적합한 안정화제, 또는 화합물의 가용성을 증가시켜 고도로 농축된 용액의 제조를 가능하게 하는 물질도 함유할 수 있다. 추가로, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 유성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 지방유, 예컨대, 참깨유, 또는 합성 지방산 에스터, 예컨대, 에틸 클레에이트 또는 트라이글리세라이드, 또는 리포좀을 포함한다.
활성 성분은 예를 들면, 코아세르베이션 기법 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들면, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 중의 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이러한 기법은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed. Mack Printing Company, 1990)]에 개시되어 있다. 지속 방출 제제가 제조될 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예에는 폴리펩티드를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 상기 매트릭스는 성형된 제품, 예를 들면, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태로 존재한다. 특정 실시양태에서, 흡수를 지연하는 물질, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴 또는 이들의 조합물을 조성물에서 사용함으로써 주사가능한 조성물의 연장된 흡수를 달성할 수 있다.
전술된 조성물 이외에, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 데포 제제로서 제형화될 수도 있다. 이러한 장기 작용 제형은 (예를 들면, 피하 또는 근육내) 이식 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들면, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 적합한 중합체성 또는 소수성 물질(예를 들면, 허용되는 오일 중의 에멀젼으로서) 또는 이온 교환 수지로 제형화될 수 있거나, 약한 가용성을 나타내는 유도체, 예를 들면, 약한 가용성을 나타내는 염으로서 제형화될 수 있다.
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 약학 조성물을 통상적인 혼합, 용해, 유화, 캡슐화, 포획 또는 동결건조 과정으로 제조할 수 있다. 단백질을 약학적으로 사용될 수 있는 제제로 프로세싱하는 것을 용이하게 하는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용하여 통상적인 방식으로 약학 조성물을 제형화할 수 있다. 적절한 제형화는 선택된 투여 경로에 의해 좌우된다.
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 자유 산 또는 염기, 중성 또는 염 형태로 조성물로 제형화할 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은 자유 산 또는 염기의 생물학적 활성을 실질적으로 보유하는 염이다. 이들은 산 부가 염, 예를 들면, 단백질성 조성물의 자유 아미노 기에 의해 형성된 염, 또는 무기 산, 예컨대, 염산 또는 인산, 또는 유기산, 예컨대, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 또는 만델산에 의해 형성된 염을 포함한다. 자유 카복시 기에 의해 형성된 염도 무기 염기, 예컨대, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화철; 또는 유기 염기, 예컨대, 이소프로필아민, 트라이메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인으로부터 유도될 수 있다. 약학적 염은 수성 및 다른 양성자성 용매에서 상응하는 자유 염기 형태보다 더 높은 가용성을 나타내는 경향을 갖는다.
치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 중 임의의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 치료 방법에서 사용될 수 있다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 예를 들면, 암의 치료에 면역치료제로서 사용될 수 있다.
치료 방법에서 사용하기 위해, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 우수한 의학적 관행과 일치하는 방식으로 제형화되고 복용되고 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려할 인자는 치료될 구체적인 장애, 치료될 구체적인 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 상기 장애의 원인, 약제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의사에게 공지된 다른 인자를 포함한다.
한 양태에서, 약제로서 사용되는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 추가적 양태에서, 질환의 치료에 사용되는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 특정 실시양태에서, 치료 방법에서 사용되는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 한 실시양태에서, 본 발명은 질환의 치료를 필요로 하는 개체에서 질환의 치료에 사용되는 본원에 기재된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 질환을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법에서 사용되는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 특정부 실시양태에서, 치료되는 질환은 증식 장애이다. 특정 실시양태에서, 상기 질환은 암이다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 치료되는 질환이 암인 경우 치료 유효량의 하나 이상의 추가적 치료제, 예를 들면, 항암제를 상기 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가적 실시양태에서, 본 발명은 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 데에 사용되는, 본원에 기재된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 개체에게 투여하여 표적 세포의 용해를 유도하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법에서 사용되는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 상기 실시양태 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간이다.
추가적 양태에서, 본 발명은 약제의 제작 또는 제조에 있어서 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 약제는 질환의 치료를 필요로 하는 개체에서 질환의 치료를 위한 약제이다. 추가적 실시양태에서, 약제는 치료 유효량의 약제를 질환을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 질환의 치료 방법에서 사용되는 약제이다. 특정 실시양태에서, 치료되는 질환은 증식 장애이다. 특정 실시양태에서, 상기 질환은 암이다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 치료되는 질환이 암인 경우 치료 유효량의 하나 이상의 추가적 치료제, 예를 들면, 항암제를 상기 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가적 실시양태에서, 약제는 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하기 위한 약제이다. 추가적 실시양태에서, 약제는 유효량의 약제를 개체에게 투여하여 표적 세포의 용해를 유도하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법에서 사용되는 약제이다. 상기 실시양태 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있다.
추가적 양태에서, 본 발명은 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 치료 유효량의 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 이러한 질환을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 약학적으로 허용되는 형태로 포함하는 조성물을 상기 개체에게 투여한다. 특정 실시양태에서, 치료되는 질환은 증식 장애이다. 특정 실시양태에서, 상기 질환은 암이다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 치료되는 질환이 암인 경우 치료 유효량의 하나 이상의 추가적 치료제, 예를 들면, 항암제를 상기 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 실시양태 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있다.
추가적 양태에서, 본 발명은 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 T 세포, 특히 세포독성 T 세포의 존재하에 표적 세포를 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자와 접촉시키는 단계를 포함한다. 추가적 양태에서, 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법이 제공된다. 한 이러한 실시양태에서, 상기 방법은 유효량의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 개체에게 투여하여 표적 세포의 용해를 유도하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, "개체"는 인간이다.
특정 실시양태에서, 치료되는 질환은 증식 장애, 특히 암이다. 암의 비한정적 예에는 방광암, 뇌암, 두경부암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 결장암, 결장직장암, 직장암, 위암, 전립선암, 혈액암, 피부암, 편평세포암종, 골암 및 신장암이 포함된다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 사용하여 치료할 수 있는 다른 세포 증식 장애는 복부, 골, 유방, 소화 시스템, 간, 췌장, 복막, 내분비선(부신, 부갑상선, 뇌하수체, 정소, 난소, 흉선, 갑상선), 눈, 두경부, 신경계(중추 및 말초), 림프계, 골반, 피부, 연조직, 비장, 흉부 영역 및 비뇨생식계에 위치하는 신생물을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 전구암성 병태 또는 병변, 및 암 전이도 포함된다. 특정 실시양태에서, 암은 신장세포암, 피부암, 폐암, 결장직장암, 유방암, 뇌암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 당업자는 많은 경우에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 치유를 제공할 수 없지만 부분적인 이익만을 제공할 수 있다는 것을 용이하게 인식한다. 일부 실시양태에서, 일부 이익을 갖는 생리학적 변화도 치료적으로 유리한 것으로 간주된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 생리학적 변화를 제공하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 양은 "유효량" 또는 "치료 유효량"으로서 간주된다. 치료를 필요로 하는 대상체, 환자 또는 개체는 전형적으로 포유동물, 보다 구체적으로 인간이다.
일부 실시양태에서, 유효량의 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 세포에게 투여된다. 다른 실시양태에서, 치료 유효량의 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 질환의 치료를 위해 개체에게 투여된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, (단독으로 사용되거나 하나 이상의 다른 추가적 치료제와 함께 사용될 때) 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 적절한 용량은 치료되는 질환의 유형, 투여 경로, 환자의 체중, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 유형, 질환의 중증도 및 경과, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 예방 목적으로 투여되는 지 아니면 치료 목적으로 투여되는 지, 선행 또는 병행 치료 시술, 환자의 임상 병력 및 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 의해 좌우될 것이다. 투여를 담당하는 의사는 어떠한 경우에서든 개별 대상체를 위한 조성물 중의 활성 성분의 농도 및 적절한 용량을 결정할 것이다. 단회 투여 또는 다양한 시점에 걸친 다회 투여, 볼루스 투여 및 펄스 주입을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 투약 일정이 본원에서 고려된다.
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적절하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg(예를 들면, 0.1 내지 10 mg/kg)의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 예를 들면, 1회 이상의 분리 투여에 의해 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여될 초기 후보 용량일 수 있다. 한 전형적인 1일 용량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상일 것이다. 수일 또는 이보다 오랜 시간에 걸친 반복된 투여의 경우, 병태에 따라 치료는 일반적으로 질환 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 지속될 것이다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 한 예시적 용량은 약 0.005 내지 약 10 mg/kg의 범위 내에 있을 것이다. 다른 비한정적 예에서, 용량은 투여 당 약 1 ㎍/kg 체중, 약 5 ㎍/kg 체중, 약 10 ㎍/kg 체중, 약 50 ㎍/kg 체중, 약 100 ㎍/kg 체중, 약 200 ㎍/kg 체중, 약 350 ㎍/kg 체중, 약 500 ㎍/kg 체중, 약 1 mg/kg 체중, 약 5 mg/kg 체중, 약 10 mg/kg 체중, 약 50 mg/kg 체중, 약 100 mg/kg 체중, 약 200 mg/kg 체중, 약 350 mg/kg 체중 또는 약 500 내지 약 1000 mg/kg 체중 또는 그 이상, 및 상기 범위 내에서 유도될 수 있는 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본원에서 나열된 수치로부터 유도될 수 있는 범위의 비한정적 예에서, 상기 기재된 수치에 근거하여 약 5 내지 약 100 mg/kg 체중, 약 5 ㎍/kg 체중 내지 약 500 mg/kg 체중의 범위 등이 투여될 수 있다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 5.0 mg/kg 또는 10 mg/kg(또는 이들의 임의의 조합)의 1회 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 (예를 들면, 환자가 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들면, 약 6회 용량의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공받도록) 간헐적으로, 예를 들면, 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다. 초기 보다 높은 적재 용량에 이어서 1회 이상의 보다 낮은 용량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투약 요법이 유용할 수 있다. 이 치료의 진행은 통상적인 기법 및 분석에 의해 용이하게 모니터링된다.
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 일반적으로 의도된 목적을 달성하기에 효과적인 양으로 사용될 것이다. 질환 상태를 치료하거나 예방하기 위해 사용되는 경우, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 약학 조성물은 치료 유효량으로 투여되거나 적용된다. 치료 유효량의 결정은 특히 본원에 제공된 상세한 개시내용에 비추어 볼 때 당업자의 능력 내에 있다.
전신 투여의 경우, 치료 유효 용량을 먼저 시험관내 분석, 예컨대, 세포 배양 분석로부터 추정할 수 있다. 그 다음, 용량을 동물 모델에서 공식화하여 세포 배양에서 결정된 IC50을 포함하는 순환 농도 범위를 달성할 수 있다. 이러한 정보를 사용하여 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정할 수 있다.
당분야에서 주지된 기법을 사용하여 생체내 데이터, 예를 들면, 동물 모델로부터 초기 용량을 추정할 수도 있다. 당분야에서 통상의 기술을 가진 자는 동물 데이터에 근거하여 인간에게의 투여를 용이하게 최적화할 수 있다.
치료 효과를 유지하기에 충분한 혈장 수준의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하기 위해 투약 용량 및 간격을 개별적으로 조절할 수 있다. 주사에 의한 투여를 위한 일반적인 환자 용량은 약 0.1 내지 50 mg/kg/일, 전형적으로 약 0.5 내지 1 mg/kg/일이다. 매일 다회 용량을 투여함으로써 치료 유효 혈장 수준을 달성할 수 있다. 혈장 중의 수준은 예를 들면, HPLC에 의해 측정될 수 있다.
국소 투여 또는 선택 흡수의 경우, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 유효 국소 농도는 혈장 농도와 관련되지 않을 수 있다. 당업자는 과도한 실험없이 치료 유효 국소 용량을 최적화할 수 있을 것이다.
본원에 기재된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 치료 유효 용량은 일반적으로 실질적인 독성을 야기하지 않으면서 치료 이익을 제공할 것이다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 독성 및 치료 효과는 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약학 절차에 의해 결정될 수 있다. 세포 배양 분석 및 동물 연구를 사용하여 LD50(집단의 50%에게 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 결정할 수 있다. 독성과 치료 효과 사이의 용량 비는 비 LD50/ED50로서 표현될 수 있는 치료 지수이다. 큰 치료 지수를 나타내는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 바람직하다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 높은 치료 지수를 나타낸다. 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간에서 사용되기에 적합한 용량 범위를 공식화하는 데에 사용될 수 있다. 상기 용량은 바람직하게는 거의 또는 전혀 독성을 나타내지 않으면서 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있다. 상기 용량은 다양한 인자, 예를 들면, 사용되는 투약 제형, 사용되는 투여 경로, 대상체의 상태 등에 따라 이 범위 내에서 달라질 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 용량은 환자의 상태를 고려하여 개별 의사에 의해 선택될 수 있다(예를 들면, 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 문헌[Fingl et al., 1975, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1] 참조).
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자로 치료된 환자의 주치의는 독성, 장기 기능장애 등으로 인해 투여를 종결하거나, 중단하거나 조절하는 방법 및 시기를 알 것이다. 대조적으로, 주치의는 임상 반응이 적절하지 않은 경우(방해 독성) 치료를 보다 높은 수준까지 조절하는 것도 알 것이다. 관심 있는 장애의 관리에 있어서 투여되는 용량의 크기는 치료되는 병태의 중증도, 투여 경로 등에 따라 달라질 것이다. 상기 병태의 중증도는 예를 들면, 부분적으로 표준 예후 평가 방법에 의해 평가될 수 있다. 추가로, 용량 및 아마도 용량 빈도도 개별 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 달라질 것이다.
다른 제제 및 처리
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 치료에서 하나 이상의 다른 제제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 하나 이상의 추가적 치료제와 공투여될 수 있다. 용어 "치료제"는 이러한 치료를 필요로 하는 개체에서 증상 또는 질환을 치료하기 위해 투여되는 임의의 제제를 포괄한다. 이러한 추가적 치료제는 치료되는 구체적인 증상에 적합한 임의의 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 상보적인 활성을 갖는 임의의 활성 성분을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가적 치료제는 면역조절제, 세포증식정지제, 세포 부착의 억제제, 세포독성제, 세포 아폽토시스의 활성화제, 또는 아폽토시스 유도제에 대한 세포의 민감성을 증가시키는 제제이다. 특정 실시양태에서, 추가적 치료제는 항암제, 예를 들면, 마이크로튜불 파괴제, 항대사물질, 토포이소머라제(topoisomerase) 억제제, DNA 인터칼레이터, 알킬화제, 호르몬 치료, 키나제(kinase) 억제제, 수용체 길항제, 종양 세포 아폽토시스의 활성화제 또는 항혈관신생제이다.
이러한 다른 제제는 적절하게는 의도된 목적에 효과적인 양으로 함께 존재한다. 이러한 다른 약제의 유효량은 사용되는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 인자에 의해 좌우된다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 일반적으로 본원에 기재된 용량 및 투여 경로와 동일한 용량 및 투여 경로로 사용되거나, 본원에 기재된 용량의 1 내지 99%의 용량으로 사용되거나, 적절한 용량 및 경로로서 실험적으로/임상적으로 결정된 임의의 용량 및 임의의 경로로 사용된다.
상기 언급된 이러한 병용 치료는 병용 투여(2종 이상의 치료제가 동일한 또는 분리된 조성물에 포함되는 경우), 및 분리 투여를 포괄하고, 어느 경우에서든 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 투여는 추가적 치료제 및/또는 보조제의 투여 전에, 동시에 및/또는 후에 일어날 수 있다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 방사선치료와 함께 사용될 수도 있다.
제품의 제조
본 발명의 또다른 양태에서, 전술된 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 상기 제품은 용기; 및 용기 상에 존재하거나 용기와 연결되어 있는 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등을 포함한다. 상기 용기는 다양한 물질, 예컨대, 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 그 자체로 존재하거나 병태의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또다른 조성물과 조합되어 있는 조성물을 보유하고, 멸균 출입구를 가질 수 있다(예를 들면, 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 천공될 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 중의 하나 이상의 활성 물질은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자이다. 상기 표지 또는 포장 삽입물은 상기 조성물이 선택된 병태의 치료에 사용된다는 것을 표시한다. 나아가, 제품은 (a) 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 조성물을 그 내부에 함유하는 제1 용기; 및 (b) 추가적 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함하는 조성물을 그 내부에 함유하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이 실시양태에서 제품은 상기 조성물이 특정 병태의 치료에 사용될 수 있다는 것을 표시하는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제품은 약학적으로 허용되는 완충제, 예컨대, 정균성 주사용수(BWFI), 포스페이트 완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2(또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제품은 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하는, 상업적 관점 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 상기 제공된 일반적인 설명을 고려할 때, 다양한 다른 실시양태가 실시될 수 있다는 것을 이해한다.
일반적인 방법
재조합 DNA 기법
문헌[Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 기재된 바와 같이 표준 방법을 사용하여 DNA를 조작하였다. 분자 생물학적 시약을 제조자의 설명서에 따라 사용하였다. 인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 대한 일반적인 정보는 문헌[Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., NIH Publication No. 91-3242]에 제공되어 있다.
DNA 서열분석
DNA 서열을 이중 가닥 서열분석으로 결정하였다.
유전자 합성
필요에 따라, 적절한 주형을 사용하여 PCR로 원하는 유전자 절편을 발생시켰거나 진아트 아게(Geneart AG, 독일 레겐스부르그 소재)가 자동화된 유전자 합성으로 합성 올리고뉴클레오티드 및 PCR 생성물로부터 원하는 유전자 절편을 합성하였다. 정확한 유전자 서열이 입수될 수 없는 경우, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 가장 유사한 상동체의 서열에 근거하여 설계하였고, 유전자를 적절한 조직으로부터 유래된 RNA로부터 RT-PCR로 단리하였다. 단일 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease) 절단 부위에 의해 플랭킹된 유전자 절편을 표준 클로닝/서열분석 벡터 내로 클로닝하였다. 플라스미드 DNA를 형질전환된 세균으로부터 정제하였고, 농도를 UV 분광법으로 결정하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 서열분석으로 확인하였다. 각각의 발현 벡터 내로의 서브클로닝을 허용하기에 적합한 제한 부위를 갖도록 유전자 절편을 설계하였다. 진핵 세포에서의 분비를 위해 단백질을 표적화하는 리더 펩티드를 암호화하는 5'-말단 DNA 서열을 갖도록 모든 구축물을 설계하였다. 서열번호 154 내지 162는 예시적 리더 펩티드 및 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다.
PBMC 로부터의 일차 인간 범 T 세포의 단리
지역 혈액 은행으로부터 수득된 농축된 림프구 제제(버피 코트) 또는 건강한 인간 공여자로부터 수득된 새로운 혈액으로부터 히스토페이크(Histopaque) 밀도 원심분리로 말초혈 단핵세포(PBMC)를 제조하였다. 요약하건대, 혈액을 멸균 PBS로 희석하고 히스토페이크 구배(시그마(Sigma), H8889) 위에 조심스럽게 층을 형성하였다. 실온에서 450 x g(제동 스위치 차단)에서 30분 동안 원심분리한 후, PBMC-함유 계면상 위에 있는 혈장의 일부를 따라 버렸다. PBMC를 새로운 50 ㎖ 팔콘 튜브에 옮기고 튜브를 PBS로 50 ㎖의 총 부피까지 충전시켰다. 혼합물을 실온에서 400 x g(제동 스위치 작동)에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 따라 버리고 PBMC 펠렛을 멸균 PBS로 2회 세척하였다(4℃ 및 350 x g에서 10분 동안 원심분리하는 단계). 생성된 PBMC 집단을 기계적으로 계수하고(ViCell), 분석이 시작될 때까지 항온처리기 내에서 37℃ 및 5% CO2에서 10% FCS 및 1% L-알라닐-L-글루타민(바이오크롬(Biochrom), K0302)을 함유하는 RPMI1640 배지에 저장하였다.
범 T 세포 단리 키트 II(밀테니이 바이오텍(Miltenyi Biotec), #130-091-156)를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 PBMC로부터의 T 세포 농축을 수행하였다. 요약하건대, 세포 펠렛을 1 x 107개 세포 당 40 ㎕ 찬 완충제(0.5% BSA 및 2 mM EDTA를 갖는 PBS, 멸균 여과됨)로 희석하고 4℃에서 1 x 107개 세포 당 10 ㎕ 바이오틴-항체 칵테일과 함께 10분 동안 항온처리하였다. 1 x 107개 세포 당 30 ㎕ 찬 완충제 및 20 ㎕ 항-바이오틴 자성 비드를 첨가하고, 혼합물을 4℃에서 다시 15분 동안 항온처리하였다. 현재 부피의 10배 내지 20배를 첨가한 후 300 x g에서 10분 동안 원심분리 단계를 수행하여 세포를 세척하였다. 최대 1 x 108개 세포를 500 ㎕ 완충제에 재현탁화하였다. LS 컬럼(밀테니이 바이오텍, #130-042-401)을 제조자의 설명서에 따라 사용하여 비표지된 인간 범 T 세포의 자성 분리를 수행하였다. 수득된 T 세포 집단을 기계적으로 계수하고(ViCell), 분석이 시작될 때까지(24시간 이내) 항온처리기 내에서 37℃ 및 5% CO2에서 AIM-V 배지에 저장하였다.
PBMC 로부터의 일차 인간 무자극 T 세포의 단리
지역 혈액 은행으로부터 수득된 농축된 림프구 제제(버피 코트) 또는 건강한 인간 공여자로부터 수득된 새로운 혈액으로부터 히스토페이크 밀도 원심분리로 말초혈 단핵세포(PBMC)를 제조하였다. 밀테니이 바이오텍의 무자극 CD8+ T 세포 단리 키트(#130-093-244)를 제조자의 설명서에 따라 사용하되 CD8+ T 세포의 마지막 단리 단계를 생략함으로써 PBMC로부터의 T 세포 농축을 수행하였다(일차 인간 범 T 세포의 단리에 대한 설명 또한 참조).
비장세포로부터의 뮤린 범 T 세포의 단리
비장을 C57BL/6 마우스로부터 단리하고, MACS 완충제(PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA)를 함유하는 GentleMACS C-튜브(밀테니이 바이오텍, #130-093-237)에 옮기고 제조자의 설명서에 따라 GentleMACS 분리기로 분리하여 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 세포 현탁액을 예비분리 필터에 통과시켜 잔존하는 분리되지 않은 조직 입자를 제거하였다. 400 x g 및 4℃에서 4분 동안 원심분리한 후, ACK 용해 완충제를 첨가하여 적혈구 세포를 용해시켰다(실온에서 5분 동안 항온처리). 잔존하는 세포를 MACS 완충제로 2회 세척하고 계수하고 뮤린 범 T 세포의 단리를 위해 사용하였다. 밀테니이 바이오텍의 범 T 세포 단리 키트(#130-090-861)를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 음성(자성) 선택을 수행하였다. 수득된 T 세포 집단을 기계적으로 계수하고(ViCell) 계수하고 추가적 분석을 위해 즉시 사용하였다.
헤파린 처리된 혈액으로부터의 일차 사이노몰구스 PBMC 의 단리
건강한 사이노몰구스 공여자로부터 수득된 새로운 혈액으로부터 밀도 구배로 말초혈 단핵세포(PBMC)를 다음과 같이 제조하였다: 헤파린 처리된 혈액을 멸균 PBS로 1:3까지 희석하고 림포프렙(Lymphoprep) 배지(액손 랩(Axon Lab) #1114545)를 멸균 PBS로 90%까지 희석하였다. 1 부피의 희석된 밀도 구배에 걸쳐 2 부피의 희석된 혈액이 층을 형성하였고, PBMC 분획을 실온에서 제동없이 520 x g에서 30분 동안 원심분리하여 분리하였다. PBMC 밴드를 새로운 50 ㎖ 팔콘 튜브에 옮기고 400 x g 및 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 멸균 PBS로 세척하였다. 1회 저속 원심분리를 수행하여 혈소판을 제거하였고(150 x g 및 4℃에서 15분), 생성된 PBMC 집단을 기계적으로 계수하고(ViCell) 추가적 분석을 위해 즉시 사용하였다.
표적 세포
MCSP 표적화 이중특이적 항원 결합 분자의 평가를 위해, 하기 종양 세포주를 사용하였다: 악성 흑색종의 전이 부위로부터 유래되었고 높은 수준의 인간 MCSP를 발현하는 인간 흑색종 세포주 WM266-4(ATCC #CRL-1676); 중간 수준의 인간 MCSP를 발현하는 인간 흑색종 세포주 MV-3(라드바우드 대학 니히메겐 메디칼 센터(Radboud University Nijmegen Medical Centre)로부터 제공받음); 높은 수준의 MCSP를 발현하는 인간 악성 흑색종(일차 종양) 세포주 A375(ECACC #88113005); MCSP를 발현하지 않는 인간 결장 암종 세포주 HCT-116(ATCC #CCL-247); 및 MCSP를 발현하지 않는 인간 백인 결장 선암종 세포주 LS180 (ECACC #87021202).
CEA 표적화 이중특이적 항원 결합 분자의 평가를 위해 하기 종양 세포주를 사용하였다:매우 높은 수준의 인간 CEA를 발현하는 인간 위암 세포주 MKN45(DSMZ #ACC 409);높은 수준의 인간 CEA를 발현하는 인간 췌장 선암종 세포주 HPAF-II(로슈 누틀리(Roche Nutley)로부터 제공받음); 중간 수준의 인간 CEA를 발현하는 인간 일차 췌장 선암종 세포주 BxPC-3(ECACC #93120816); 중간 수준의 인간 CEA를 발현하는 인간 여성 백인 결장 선암종 세포주 LS-174T (ECACC #87060401); 낮은 수준의 인간 CEA를 발현하는 인간 췌장 선암종 세포주 ASPC-1(ECACC #96020930); (매우) 낮은 수준의 인간 CEA를 발현하는 인간 상피 췌장 암종 세포주 Panc-1(ATCC #CRL-1469); CEA를 발현하지 않는 인간 결장 암종 세포주 HCT-116(ATCC #CCL-247); 내부에서 안정하게 형질감염되어 인간 CEA를 발현하는 인간 선암성 치조 기저 상피 세포주 A549-huCEA; 내부에서 조작되어 인간 CEA를 안정하게 발현하는 안정하게 뮤린 결장 암종 세포주 MC38-huCEA.
또한, 인간 T 세포 백혈병 세포주 주르카트(ATCC #TIB-152)를 사용하여 상이한 이중특이적 구축물과 세포 상의 인간 CD3의 결합을 평가하였다.
실시예 1
이중특이적 항원 결합 분자의 제조, 정제 및 특징규명
중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 각각의 수용자 포유동물 발현 벡터 내로 미리 삽입된 불변 중쇄 또는 불변 경쇄와 인 프레임(in frame)으로 서브클로닝하였다. MPSV 프로모터로 항체 발현을 유도하였고, 합성 폴리A 신호 서열을 CDS의 3'-말단에 위치시켰다. 추가로, 각각의 벡터는 EBV OriP 서열을 함유하였다.
HEK293 EBNA 세포를 포유동물 발현 벡터로 공형질감염시켜 분자를 제조하였다. 칼슘 포스페이트 방법을 사용하여 기하급수적으로 성장하는 HEK293 EBNA 세포를 형질감염시켰다. 대안적으로, 현탁액에서 성장하는 HEK293 EBNA 세포를 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 형질감염시켰다. "1개 아암/도립된 1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab" 구축물의 제조를 위해, 세포를 1:1:1 비("벡터 중쇄":"벡터 경쇄":"벡터 중쇄-scFab")로 상응하는 발현 벡터로 형질감염시켰다. "2+1 IgG scFab" 구축물의 제조를 위해, 세포를 1:2:1 비("벡터 중쇄":"벡터 경쇄":"벡터 중쇄-scFab")로 상응하는 발현 벡터로 형질감염시켰다. "1+1 IgG 교차fab" 구축물의 제조를 위해, 세포를 1:1:1:1 비("벡터 제2 중쇄":"벡터 제1 경쇄":"벡터 경쇄 교차fab":"벡터 제1 중쇄-중쇄 교차fab")로 상응하는 발현 벡터로 형질감염시켰다. "2+1 IgG 교차fab" 구축물의 제조를 위해, 세포를 1:2:1:1 비("벡터 제2 중쇄":"벡터 경쇄":"벡터 제1 중쇄-중쇄 교차fab":"벡터 경쇄 교차fab")로 상응하는 발현 벡터로 형질감염시켰다. "2+1 IgG 교차fab, 연결된 경쇄" 구축물의 제조를 위해, 세포를 1:1:1:1 비("벡터 중쇄":"벡터 경쇄":"벡터 중쇄(교차fab-Fab-Fc)":"벡터 연결된 경쇄")로 상응하는 발현 벡터로 형질감염시켰다. "1+1 교차Mab" 구축물의 제조를 위해, 세포를 1:1:1:1 비("벡터 제1 중쇄":"벡터 제2 중쇄":"벡터 제1 경쇄":"벡터 제2 경쇄")로 상응하는 발현 벡터로 형질감염시켰다. "1+1 IgG 교차fab 경쇄 융합체" 구축물의 제조를 위해, 세포를 1:1:1:1 비("벡터 제1 중쇄":"벡터 제2 중쇄":"벡터 경쇄 교차fab":"벡터 제2 경쇄")로 상응하는 발현 벡터로 형질감염시켰다.
칼슘 포스페이트를 사용하는 형질감염을 위해, 10%(v/v) FCS로 보충된 DMEM 배양 배지를 사용하여 세포를 T-플라스크에서 부착 단일층 배양물로서 성장시켰고, 이들이 50 내지 80% 전면성장률에 도달하였을 때 형질감염시켰다. T150 플라스크의 형질감염을 위해, FCS(최종 10%(v/v))로 보충된 DMEM 배양 배지(25 ㎖)에서 형질감염시키기 24시간 전에 15 x 106개 세포를 시딩하고, 세포를 37℃에서 5% CO2 대기를 갖는 항온처리기 내에서 밤새 넣어두었다. 형질감염될 각각의 T150 플라스크를 위해, 상응하는 비로 나누어진 94 ㎍ 총 플라스미드 벡터 DNA, 최종 부피 469 ㎕의 물 및 469 ㎕의 1 M CaCl2 용액을 혼합함으로써 DNA, CaCl2 및 물로 구성된 용액을 제조하였다. 이 용액에 50 mM HEPES(938 ㎕), 280 mM NaCl 및 1.5 mM Na2HPO4 용액(pH 7.05)을 첨가하고 10초 동안 즉시 혼합하고 실온에서 20초 동안 방치하였다. 현탁액을 2%(v/v) FCS로 보충된 DMEM(10 ㎖)으로 희석하고 기존 배지 대신에 T150에 첨가하였다. 그 후, 추가적 형질감염 배지(13 ㎖)를 첨가하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 약 17 내지 20시간 동안 항온처리한 후, 배지를 DMEM(25 ㎖; 10% FCS)으로 교체하였다. 컨디셔닝된 배양 배지를 210 x g에서 15분 동안 원심분리하여 배지 교체로부터 약 7일 후 모으고, 멸균 여과하고(0.22 ㎛ 필터), 0.01%(w/v)의 최종 농도까지 나트륨 아자이드로 보충하고, 4℃에서 유지하였다.
폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하는 형질감염을 위해, HEK293 EBNA 세포를 혈청-미함유 CD CHO 배양 배지에서 현탁 배양하였다. 500 ㎖ 진탕 플라스크에서의 제조를 위해, 4 x 108개의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24시간 전에 시딩하였다. 형질감염을 위해, 세포를 210 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 미리 가온된 CD CHO 배지(20 ㎖)로 교체하였다. 발현 벡터를 CD CHO 배지(20 ㎖)에서 200 ㎍ DNA의 최종 양까지 혼합하였다. PEI(540 ㎕)를 첨가한 후, 혼합물을 15초 동안 와류시킨 후, 실온에서 10분 동안 항온처리하였다. 그 후, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고 500 ㎖ 진탕 플라스크에 옮기고 5% CO2 대기를 갖는 항온처리기 내에서 37℃에서 3시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 시간 후, F17 배지(160 ㎖)를 첨가하고, 세포를 24시간 동안 배양하였다. 형질감염으로부터 1일 후, 1 mM 발프로산 및 7% 피드(Feed) 1(론자(Lonza))을 첨가하였다. 7일 동안 배양한 후, 정제를 위해 상청액을 210 x g에서 15분 동안 원심분리하여 모으고, 용액을 멸균 여과하고(0.22 ㎛ 필터), 0.01%(w/v)의 최종 농도까지 나트륨 아자이드로 보충하고, 4℃에서 유지하였다.
분비된 단백질을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 이어서 크기 배제 크로마토그래피 단계로 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다.
친화성 크로마토그래피를 위해, 상청액을 20 mM 나트륨 포스페이트 및 20 mM 나트륨 시트레이트(25 ㎖, pH 7.5), 또는 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트 및 0.5 M 염화나트륨(40 ㎖, pH 7.5)으로 평형화된 하이트랩(HiTrap) 단백질 A HP 컬럼(CV = 5 ㎖, 지이 헬쓰케어) 상에 적재하였다. 10 이상의 컬럼 부피의 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트 및 0.5 M 염화나트륨(pH 7.5)으로 세척한 후, 6 컬럼 부피의 10 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트 및 0.5 M 염화나트륨(pH 5.45)을 사용한 추가적 세척 단계를 수행하여 미결합된 단백질을 제거하였다. 그 후, 컬럼을 10 mM MES 및 100 mM 염화나트륨(20 ㎖, pH 5.0)으로 세척하고, 표적 단백질을 6 컬럼 부피의 20 mM 나트륨 시트레이트, 100 mM 염화나트륨 및 100 mM 글리신(pH 3.0)으로 용출하였다. 대안적으로, 20 컬럼 부피의 20 mM 나트륨 시트레이트 및 0.5 M 염화나트륨(pH 7.5) 내지 20 mM 나트륨 시트레이트 및 0.5 M 염화나트륨(pH 2.5)에 걸친 구배를 사용하여 표적 단백질을 용출하였다. 1/10의 0.5 M 나트륨 포스페이트(pH 8)를 첨가하여 단백질 용액을 중화하였다. 표적 단백질을 농축하고 여과한 후에, 25 mM 칼륨 포스페이트, 125 mM 염화나트륨 및 100 mM 글리신 용액(pH 6.7)으로 평형화된 하이로드 수퍼덱스(HiLoad Superdex) 200 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 적재하였다. 1+1 IgG 교차fab의 정제를 위해, 컬럼을 20 mM 히스티딘 및 140 mM 염화나트륨 용액(pH 6.0)으로 평형화시켰다.
아미노산 서열에 근거하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를 결정하였다. 누페이지(등록상표) 프리-캐스트 겔 시스템(인비트로겐, 미국 소재)을 제조자의 설명서(4 내지 12% 트라이스-아세테이트 겔 또는 4 내지 12% 비스-트라이스)에 따라 사용하여 환원제(5 mM 1,4-다이티오트레이톨)의 존재 및 부재하에 SDS-PAGE를 수행하고 쿠마시(인비트로겐의 심플블루(SimpleBlue: 상표) 세이프스테인(SafeStain))로 염색하여 이중특이적 구축물의 순도 및 분자량을 분석하였다. 대안적으로, 캘리퍼 랩칩(Caliper LabChip) GXII 시스템(캘리퍼 라이프사이언스(Caliper Lifescience))을 제조자의 설명서에 따라 사용하여 환원제의 존재 및 부재하에 CE-SDS 분석을 수행하여 분자의 순도 및 분자량을 분석하였다. 25℃에서 2 mM MOPS, 150 mM NaCl 및 0.02%(w/v) NaN3(pH 7.3) 런닝 완충제에서 수퍼덱스 200 10/300GL 분석 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(지이 헬쓰케어)을 사용하여 단백질 샘플의 응집체 함량을 분석하였다. 대안적으로, 25℃에서 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드 및 0.02%(w/v) NaN3(pH 6.7) 런닝 완충제에서 TSKgel G3000 SW XL 분석 크기 배제 컬럼(토소(Tosoh))을 사용하여 항체 샘플의 응집체 함량을 분석하였다.
도 2 내지 14는 SDS-PAGE 및 분석 크기 배제 크로마토그래피의 결과를 보여주고, 표 2A는 상이한 이중특이적 구축물의 제조의 수율, 단백질 A 후 응집체 함량 및 최종 단량체 함량을 보여준다.
도 47은 항-CD3/항-MCSP 이중특이적 "2+1 IgG 교차fab, 연결된 경쇄" 구축물(서열번호 3, 5, 29 및 179 참조)의 CE-SDS 분석의 결과를 보여준다. 분석을 위해 2 ㎍의 샘플을 사용하였다. 도 48은 최종 생성물(주입된 20 ㎍ 샘플)의 분석 크기 배제 크로마토그래피의 결과를 보여준다.
도 54는 다양한 구축물의 CE-SDS 및 SDS-PAGE 분석의 결과를 보여주고, 표 2A는 상이한 이중특이적 구축물의 제조의 수율, 단백질 A 후 응집체 함량 및 최종 단량체 함량을 보여준다.
[표 2A]
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
대조군으로서, 이중특이적 항원 결합 분자를 종래기술의 탠덤 scFv 포맷("(scFv)2")으로 발생시켰고 탠덤 scFv를 Fc 도메인에 융합시켜("(scFv)2-Fc") 발생시켰다. 상기 분자를 HEK293-EBNA 세포에서 제조하고 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자에 대해 전술된 바와 유사한 방식으로 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 이어서 크기 배제 크로마토그래피 단계로 정제하였다. 높은 응집체 형성으로 인해, 높은 단량체 함량으로 단백질을 수득하기 위해서는 하이로드 수퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어)으로부터 용출되고 농축된 샘플을 20 mM 히스티딘 및 140 mM 염화나트륨(pH 6.7)으로 평형화된 수퍼덱스 10/300 GL 컬럼(지이 헬쓰케어)에 적용함으로써 샘플의 일부를 더 정제하여야 했다. 그 후, 단백질 농도, 순도 및 분자량, 및 응집체 함량을 전술된 바와 같이 결정하였다.
대조군 분자에 대한 수율, 제1 정제 단계 후 응집체 함량, 및 최종 단량체 함량은 표 2B에 제시되어 있다. 제1 정제 단계 후 응집체 함량의 비교(단백질 A)는 "(scFv)2-Fc" 및 다이설파이드 가교-안정화된 "(dsscFv)2-Fc" 분자에 비해 IgG 교차fab 및 IgG scFab 구축물의 더 우수한 안정성을 암시한다.
[표 2B]
Figure pct00005
단백질의 열적 안정성을 동적 광 산란(DLS)으로 모니터링하였다. 1 mg/㎖의 단백질 농도를 갖는 여과된 단백질 샘플(30 g)을 다이나프로(Dynapro) 플레이트 판독기(와이어트 테크놀로지 코포레이션(Wyatt Technology Corporation); 미국 소재)에 중복하여 적용하였다. 반경 및 총 산란 강도를 수집하면서 0.05℃/분의 속도로 온도를 25℃부터 75℃까지 상승시켰다. 결과는 도 15 및 표 2C에 제시되어 있다. "(scFv)2-Fc"(항-MCSP/항-huCD3) 분자의 경우, 2개의 응집점이 49℃ 및 68℃에서 관찰되었다. "(dsscFv)2-Fc" 구축물은 도입된 다이설파이드 가교의 결과로서 증가된 응집 온도(57℃)를 갖는다(도 15의 A, 표 2C). "2+1 IgG scFab" 구축물 및 "2+1 IgG 교차fab" 구축물 둘다가 60℃보다 더 높은 온도에서 응집하는데, 이것은 "(scFv)2-Fc" 및 "(dsscFv)2-Fc" 포맷에 비해 더 우수한 그들의 열적 안정성을 입증한다(도 15의 B, 표 2C).
[표 2C]
Figure pct00006
실시예 2
Fc 수용체 및 표적 항원 결합의 표면 플라스몬 공명 분석
방법
25℃에서 런닝 완충제로서 HBS-EP(0.01 M HEPES(pH 7.4), 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, 비아코어, 독일 프라이부르크 소재)를 사용하는 비아코어 T100 상에서 모든 표면 플라스몬 공명(SPR) 실험을 수행허였다.
상이한 Fc 변이체의 FcR 결합의 분석
분석 설정은 도 16의 A에 제시되어 있다. 상이한 Fc 변이체와 인간 FcγRIIIa-V158 및 뮤린 FcγRIV의 상호작용을 분석하기 위해, 표준 아민 커플링 키트(비아코어, 독일 프라이부르크 소재)를 사용하여 pH 5.0에서 CM5 칩 상에서 약 6,500 공명 유닛(RU)의 항-펜타 His 항체(퀴아젠)의 직접적인 커플링을 수행하였다. HuFcγRIIIa-V158-K6H6 및 muFcγRIV-aviHis-바이오틴을 각각 4 nM 및 10 nM에서 60초 동안 포획하였다.
상이한 Fc 돌연변이를 갖는 구축물을 30 ㎕/분의 유속으로 1000 nM의 농도로 120초 동안 유동 셀에 통과시켰다. 해리를 220초 동안 모니터링하였다. 기준 유동 셀에서 수득된 반응을 차감하여 벌크 굴절률 차이를 보정하였다. 따라서, Fc 변이체는 고정된 항-펜타 His 항체를 갖되 HuFcγRIIIa-V158-K6H6 또는 muFcγRIV-aviHis-바이오틴보다는 HBS-EP가 주입된 표면 상에서 유동하였다. 500 내지 4000 nM의 농도 범위를 사용하여 인간 FcγRIIIa-V158 및 뮤린 FcγRIV에 대한 야생형 Fc의 친화성을 결정하였다.
정상 상태 반응을 사용하여 랭뮤어 결합 등온선의 비선형 곡선 피팅으로 해리 상수 KD를 유도하였다. 수치 적분으로 1:1 랭뮤어 결합에 대한 속도 방정식을 피팅하기 위해 비아코어 T100 평가 소프트웨어(vAA, 비아코어 아베(Biacore AB), 스웨덴 웁살라 소재)를 사용하여 동역학적 상수를 유도하였다.
결과
Fc 변이체와 인간 FcγRIIIa 및 뮤린 FcγRIV의 상호작용을 표면 플라스몬 공명으로 모니터링하였다. 포획된 huFcγRIIIa-V158-K6H6 및 muFcγRIV-aviHis-바이오틴에 대한 결합은 야생형(wt) Fc 도메인을 갖는 구축물에 비해 모든 분석된 Fc 돌연변이체들의 경우 유의하게 감소하였다
인간 Fcγ 수용체에 대한 최저 결합을 갖는 Fc 돌연변이체는 P329G L234A L235A (LALA) 및 P329G LALA N297D이었다. LALA 돌연변이 단독은 huFcγRIIIa-V158-K6H6에 대한 결합을 제거하기에 충분하지 않았다. LALA 돌연변이만을 보유하는 Fc 변이체는 인간 FcγRIIIa에 대한 2.100 nM의 잔류 결합 친화성을 갖진 반면, wt Fc는 600 nM의 친화성으로 인간 FcγRIIIa 수용체에 결합하였다(표 3). 단일 농도를 사용하여 두 KD 값을 1:1 결합 모델로 유도하였다.
wt Fc의 경우 인간 FcγRIIIa-V158 및 뮤린 FcγRIV에 대한 친화성만을 분석할 수 있었다. KD 값을 표 3에 나열하였다. 모든 분석된 Fc 돌연변이체의 경우 뮤린 FcγRIV에 대한 결합이 거의 완전히 제거되었다.
[표 3]
Figure pct00007
종양 항원 및 CD3 에 대한 동시적인 결합의 분석
표준 커플링 절차를 사용하여 센서 칩 SA 상에서 1650 공명 유닛(RU)의 MCSP의 바이오티닐화된 D3 도메인을 직접적으로 커플링시킴으로써 T 세포 이중특이적 구축물과 종양 항원 및 인간 CD3ε의 동시적인 결합의 분석을 수행하였다. 표준 아미노 커플링 절차를 사용하여 인간 EGFR을 고정시켰다. 8000 RU가 pH 5.5에서 CM5 센서 칩 상에 고정되었다. 분석 설정은 도 16의 B에 제시되어 있다.
상이한 T 세포 이중특이적 구축물을 200 nM에서 60초 동안 포획하였다. 그 후, 인간 CD3γ(G4S)5CD3ε-AcTev-Fc(놉)-Avi/Fc(홀)을 2000 nM의 농도 및 40 ㎕/분의 유속으로 60초 동안 통과시켰다. 재조합 CD3ε이 포획된 T 세포 이중특이적 구축물없이 MCSP 또는 EGFR의 고정된 D3 도메인을 갖는 표면 상에서 유동하는 기준 유동 셀 상에서 수득된 반응을 차감함으로써 벌크 굴절률 차이를 보정하였다.
결과
종양 항원 및 인간 CD3ε에 대한 동시적인 결합을 표면 플라스몬 공명으로 분석하였다(도 17, 18a 및 18b). 모든 구축물이 종양 항원 및 CD3에 동시적으로 결합할 수 있었다. 대다수의 구축물의 경우, 인간 CD3ε의 주입 후 결합 수준(RU)은 구축물 단독의 주입 후 달성된 결합 수준보다 더 높았는데, 이것은 종양 항원 및 인간 CD3ε 둘다가 구축물에 결합되었다는 것을 반영한다.
실시예 3
세포 상의 각각의 표적 항원에 대한 이중특이적 구축물의 결합
상이한 이중특이적 구축물과 주르카트 세포(ATCC #TIB-152) 상의 CD3 및 표적 세포 상의 각각의 종양 항원의 결합을 FACS로 결정하였다. 요약하건대, 세포를 채취하여 계수하고 생존력에 대해 조사하였다. (0.1% BSA를 함유하는 PBS 중의) 웰 당 0.15 x 106 내지 0.2 x 106개 세포(90 ㎕)를 환저 96-웰 플레이트에 플레이팅하고 4℃에서 지시된 농도의 이중특이적 구축물 및 상응하는 IgG 대조군(10 ㎕)과 함께 30분 동안 항온처리하였다. 보다 우수한 비교를 위해, 모든 구축물 및 IgG 대조군을 동일한 몰 농도로 표준화하였다. 항온처리 후, 세포를 원심분리하고(5분, 350 x g), 0.1% BSA를 함유하는 PBS(150 ㎕)로 세척하고, 재현탁화하고 4℃에서 12 ㎕/웰의 FITC-접합된 또는 PE-접합된 이차 항체와 함께 추가적 30분 동안 항온처리하였다. FACS 캔토(Canto)II(소프트웨어 FACS 디바)를 사용하여 결합된 구축물을 검출하였다. FITC-접합된 항-His 항체(루세르나(Lucerna), #RHIS-45F-Z)를 사용하여 "(scFv)2" 분자를 검출하였다. 모든 다른 분자의 경우, FITC-접합된 또는 PE-접합된 어피니퓨어 F(ab')2 단편(염소 항-인간 IgG Fcγ 단편 특이적)(잭슨 이뮤노 리서치 랩, 각각 # 109-096-098/작업 용액 1:20, 또는 #109-116-170/작업 용액 1:80)을 사용하였다. 0.1% BSA를 함유하는 120 ㎕/웰의 PBS를 첨가하고 350 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 세척하였다. 0.1% BSA를 함유하는 150 ㎕/웰의 PBS를 사용하여 제2 세척 단계를 수행하였다. 달리 표시되어 있지 않은 한, 세포를 어둠 속에 4℃에서 100 ㎕/웰의 고정 완충제(BD #554655)로 고정시키고, 400 x g에서 6분 동안 원심분리하고, 샘플을 FACS 캔토II로 측정할 때까지 0.1% BSA를 함유하는 200 ㎕/웰의 PBS에서 보관하였다. 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어를 사용하여 EC50 값을 계산하였다.
제1 실험에서, 인간 MCSP 및 인간 CD3을 표적화하는 상이한 이중특이적 구축물을 인간 T 세포 백혈병 세포인 주르카트 상에서 발현된 인간 CD3, 또는 Colo-38 인간 흑색종 세포 상에서 발현된 인간 MCSP에 대한 결합에 대해 유세포계수로 분석하였다.
결과는 이중특이적 분자, 대조군 IgG 또는 이차 항체 단독과 함께 항온처리된 세포 또는 처리되지 않은 상태로 남겨진 세포의 평균 형광 강도를 보여주는 도 19 내지 21에 제시되어 있다. 도 19에 나타낸 바와 같이, "(scFv)2" 분자의 두 항원 결합 모이어티, 즉 CD3(도 19의 A) 및 MCSP(도 19의 B)에 대한 명확한 결합 신호가 대조군 샘플에 비해 관찰하였다.
"2+1 IgG scFab" 분자(서열번호 5, 17 및 19)는 Colo-38 세포 상의 huMCSP에 대한 우수한 결합을 보여준다(도 20의 A). CD3 모이어티는 기준 항-인간 CD3 IgG보다 약간 더 우수하게 CD3에 결합한다(도 20의 B).
도 21a에 도시된 바와 같이, 2개의 "1+1" 구축물은 세포 상의 인간 CD3에 대한 필적할만한 결합 신호를 보여준다. 기준 항-인간 CD3 IgG는 약간 더 약한 신호를 제공하였다. 추가로, 시험된 두 구축물("1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab"(서열번호 1, 3 및 5) 및 "도립된 1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab"(서열번호 7, 9 및 11))은 세포 상의 인간 MCSP에 대한 필적할만한 결합을 보여준다(도 21b). 기준 항-인간 MCSP IgG를 사용하여 수득한 결합 신호는 약간 더 약하였다.
또다른 실험에서, 정제된 "2+1 IgG scFab" 이중특이적 구축물(서열번호 5, 17 및 19) 및 상응하는 항-인간 MCSP IgG를 Colo-38 인간 흑색종 세포 상의 인간 MCSP에 대한 용량 의존적 결합에 대해 유세포계수로 분석하여, 상기 이중특이적 구축물이 그의 "아암" 중 하나 또는 둘다를 통해 MCSP에 결합하는 지를 결정하였다. 도 22에 도시된 바와 같이, "2+1 IgG scFab" 구축물은 MCSP IgG와 동일한 결합 패턴을 보여준다.
또다른 실험에서, 교차fab 단편에서 VL/VH 교환(서열번호 33, 63, 65 및 67 참조) 또는 CL/CH1 교환(서열번호 66, 67, 183 및 197 참조)을 갖는 CD3/CEA "도립된 2+1 IgG 교차fab" 이중특이적 구축물과 주르카트 세포에 의해 발현된 인간 CD3 또는 LS-174T 세포에 의해 발현된 인간 CEA의 결합을 평가하였다. 대조군으로서, 상응하는 IgG의 등가 최대 농도 및 표지된 이차 항체(염소 항-인간 FITC-접합된 어피니퓨어 F(ab')2 단편, Fcγ 단편 특이적, 잭슨 이뮤노 리서치 랩 # 109-096-098)로 인한 배경 염색도 평가하였다. 도 55a 및 55b에 나타낸 바와 같이, 두 구축물은 인간 CEA에 대한 우수한 결합뿐만 아니라 세포 상의 인간 CD3에 대한 우수한 결합도 보여준다. "도립된 2+1 IgG 교차fab(VL/VH)" 구축물 및 "도립된 2+1 IgG 교차fab(CL/CH1)" 구축물에 대한 계산된 EC50 값은 각각 4.6 및 3.9 nM(CD3), 및 9.3 및 6.7 nM(CEA)이었다.
또다른 실험에서, CD3/MCSP "2+1 IgG 교차fab"(서열번호 3, 5, 29 및 33 참조) 구축물 및 "도립된 2+1 IgG 교차fab"(서열번호 5, 23, 183 및 187 참조) 구축물과 주르카트 세포에 의해 발현된 인간 CD3 또는 WM266-4 세포에 의해 발현된 인간 MCSP의 결합을 평가하였다. 도 56a 및 56b는 두 구축물과 세포 상의 MCSP의 결합이 필적할만하게 우수하였지만, "도립된" 구축물과 CD3의 결합이 다른 구축물에 비해 감소되었다는 것을 보여준다. "도립된 2+1 IgG 교차fab" 구축물 및 "2+1 IgG 교차fab" 구축물에 대한 계산된 EC50 값은 각각 6.1 및 1.66 nM(CD3), 및 0.57 및 0.95 nM(MCSP)이었다.
추가적 실험에서, "1+1 IgG 교차fab 경쇄(LC) 융합체" 구축물(서열번호 183, 209, 211 및 213)과 주르카트 세포에 의해 발현된 인간 CD3 및 LS-174T 세포에 의해 발현된 인간 CEA의 결합을 결정하였다. 대조군으로서, 상응하는 항-CD3 및 항-CEA IgG의 등가 최대 농도 및 표지된 이차 항체(염소 항-인간 FITC-접합된 어피니퓨어 F(ab')2 단편, Fcγ 단편 특이적, 잭슨 이뮤노 리서치 랩 # 109-096-098)로 인한 배경 염색도 평가하였다. 도 57a 및 57b에 도시된 바와 같이, "1+1 IgG 교차fab LC 융합체"와 CEA의 결합은 크게 감소된 것으로 보이는 반면, CD3에 대한 결합은 적어도 기준 IgG에 필적할만하였다.
최종 실험에서, "2+1 IgG 교차fab"(서열번호 5, 23, 215 및 217) 구축물 및 "도립된 2+1 IgG 교차fab"(서열번호 5, 23, 215 및 219) 구축물과 주르카트 세포에 의해 발현된 인간 CD3 및 WM266-4 종양 세포에 의해 발현된 인간 MCSP의 결합을 결정하였다. 도 58a 및 58b에 도시된 바와 같이, 인간 CD3에 대한 결합은 다른 구축물에 비해 "도립된 2+1 IgG 교차fab"의 경우 감소되었지만, 인간 MCSP에 대한 결합은 필적할만하게 우수하였다. "2+1 IgG 교차fab" 구축물 및 "도립된 2+1 IgG 교차fab" 구축물에 대한 계산된 EC50 값은 각각 10.3 및 32.0 nM(CD3), 및 3.1 및 3.4 nM(MCSP)이었다.
실시예 4
이중특이적 구축물의 개입 시 일차 인간 T 세포 상의 표면 활성화 마커의 FACS 분석
정제된 huMCSP-huCD3 표적화 이중특이적 "2+1 IgG scFab"(서열번호 5, 17 및 19) 및 "(scFv)2" 분자를, 인간 MCSP 발현 종양 세포의 존재하에 CD8+ T 세포 상의 초기 표면 활성화 마커 CD69 또는 후기 활성화 마커 CD25를 상향조절하는 그들의 잠재력에 대해 유세포계수로 시험하였다.
요약하건대, MCSP 양성 Colo-38 세포를 세포 해리 완충제로 채취하여 계수하고 생존력에 대해 조사하였다. 세포를 AIM-V 배지에서 0.3 x 106(생존)개 세포/㎖로 조절하고, 웰 당 100 ㎕의 이 세포 현탁액을 (표시된 바와 같이) 환저 96-웰 플레이트 내에 피펫팅하였다. (희석된) 이중특이적 구축물(50 ㎕)을 세포 함유 웰에 첨가하여 1 nM의 최종 농도를 수득하였다. 인간 PBMC 효과기 세포를 건강한 공여자의 새로운 혈액으로부터 단리하고 AIM-V 배지에서 6 x 106(생존)개 세포/㎖로 조절하였다. 분석 플레이트(상기 참조)의 웰 당 50 ㎕의 이 세포 현탁액을 첨가하여 10:1의 최종 E:T 비를 수득하였다. 이중특이적 구축물이 종양 항원 huMCSP를 발현하는 표적 세포의 존재하에서만 T 세포를 활성화시킬 수 있는 지를 분석하기 위해, 1 nM의 각각의 이중특이적 분자뿐만 아니라 PBMC도 함유하되 표적 세포를 함유하지 않는 웰을 포함시켰다.
37℃ 및 5% CO2에서 15시간(CD69) 또는 24시간(CD25) 동안 항온처리한 후, 세포를 원심분리하고(5분, 350 x g) 0.1% BSA를 함유하는 150 ㎕/웰의 PBS로 2회 세척하였다. CD8(마우스 IgG1,κ; 클론 HIT8a; BD #555635), CD69(마우스 IgG1; 클론 L78; BD #340560) 및 CD25(마우스 IgG1,κ; 클론 M-A251; BD #555434)에 대한 표면 염색을 공급자의 제안에 따라 4℃에서 30분 동안 수행하였다. 세포를 0.1% BSA를 함유하는 150 ㎕/웰의 PBS로 2회 세척하고, 100 ㎕/웰의 고정 완충제(BD #554655)를 사용하여 4℃에서 15분 동안 고정시켰다. 원심분리 후, 세포를 0.1% BSA를 함유하는 200 ㎕/웰의 PBS에 재현탁화하고 FACS 캔토II 기계(소프트웨어 FACS 디바)를 사용하여 분석하였다.
도 23a 및 23b는 각각 15시간 또는 24시간 동안 항온처리한 후 CD8+ T 세포 상의 초기 활성화 마커 CD69(도 23a) 또는 후기 활성화 마커 CD25(도 23b)의 발현 수준을 도시한다. 두 구축물은 표적 세포의 존재하에서만 두 활성화 마커의 상향조절을 유도한다. "(scFv)2" 분자는 이 분석에서 "2+1 IgG scFab" 구축물보다 약간 더 높은 활성을 나타내는 듯하다.
정제된 huMCSP-huCD3 표적화 이중특이적 "2+1 IgG scFab" 분자 및 "(scFv)2" 분자를, 인간 MCSP 발현 종양 세포의 존재하에 CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포 상의 후기 활성화 마커 CD25를 상향조절하는 그들의 잠재력에 대해 유세포계수로 더 시험하였다. 5:1의 E:T 비에서 인간 범 T 효과기 세포를 사용하고 5일의 항온처리 시간을 사용하여 실험 절차를 전술된 바와 수행하였다.
도 24a 및 24b는 두 구축물이 표적 세포의 존재하에서만 CD8+(도 24a) T 세포 및 CD4+(도 24b) T 세포 상의 CD25의 상향조절을 유도한다는 것을 보여준다. "2+1 IgG scFab" 구축물은 이 분석에서 "(scFv)2" 분자에 비해 CD25의 상향조절을 덜 유도하는 듯하다. 일반적으로, CD25의 상향조절은 CD4+ T 세포 상에서보다 CD8+ T 세포 상에서 더 현저하다.
또다른 실험에서, 정제된 "2+1 IgG 교차fab" 표적화 사이노몰구스 CD3 및 인간 MCSP(서열번호 3, 5, 35 및 37)를, 종양 표적 세포의 존재하에 CD8+ T 세포 상의 표면 활성화 마커 CD25를 상향조절하는 그의 잠재력에 대해 분석하였다. 요약하건대, 인간 MCSP를 발현하는 MV-3 종양 표적 세포를 세포 해리 완충제로 채취하여 세척하고, 2% FCS 및 1% 글루타맥스(GlutaMax)를 함유하는 DMEM에 재현탁화하였다. 웰 당 30,000개 세포를 환저 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 각각의 항체 희석물을 지시된 농도로 첨가하였다(도 25). 이중특이적 구축물 및 상이한 IgG 대조군을 동일한 몰 농도로 조절하였다. 2마리의 건강한 동물의 혈액으로부터 단리된 사이노몰구스 PBMC 효과기 세포를 첨가하여 3:1의 최종 E:T 비를 수득하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 43시간 동안 항온처리한 후, 세포를 350 x g에서 5분 동안 원심분리하고 0.1% BSA를 함유하는 PBS로 2회 세척하였다. CD8(밀테니이 바이오텍, #130-080-601) 및 CD25(BD #557138)에 대한 표면 염색을 공급자의 제안에 따라 수행하였다. 세포를 0.1% BSA를 함유하는 150 ㎕/웰의 PBS로 2회 세척하고 100 ㎕/웰의 고정 완충제(BD #554655)를 사용하여 4℃에서 15분 동안 고정시켰다. 원심분리 후, 샘플을 0.1% BSA를 함유하는 200 ㎕/웰의 PBS에 재현탁화하고 FACS 캔토II 기계(소프트웨어 FACS 디바)를 사용하여 분석하였다.
도 25에 도시된 바와 같이, 상기 이중특이적 구축물은 표적 세포의 존재하에서만 CD8+ T 세포 상의 CD25의 농도 의존적 상향조절을 유도한다. 항-사이노 CD3 IgG(클론 FN-18)도 교차결합되지 않으면서 CD8+ T 세포 상의 CD25의 상향조절을 유도할 수 있다(사이노 네스토르를 사용하여 수득한 데이터 참조). (표적 세포의 부재하에) 최대 농도의 상기 이중특이적 구축물에 의한 사이노 T 세포의 과다활성화는 없었다.
또다른 실험에서, CD3-MCSP "2+1 IgG 교차fab, 연결된 경쇄"(서열번호 3, 5, 29 및 179 참조)를, 종양 표적 세포의 존재하에 CD8+ T 세포 상의 초기 활성화 마커 CD69 또는 후기 활성화 마커 CD25를 상향조절하는 그의 잠재력에 대해 CD3-MCSP "2+1 IgG 교차fab"(서열번호 3, 5, 29 및 33 참조)와 비교하였다. 일차 인간 PBMC(전술된 바와 같이 단리됨)를 MCSP 양성 Colo-38 표적 세포의 존재 또는 부재하에 적어도 22시간 동안 지시된 농도의 이중특이적 구축물과 함께 항온처리하였다. 요약하건대, 웰 당 0.3 x 106개 일차 인간 PBMC를, MCSP 양성 표적 세포(또는 배지)를 함유하는 평저 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 최종 효과기 대 표적 세포(E:T) 비는 10:1이었다. 상기 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 지시된 농도의 이중특이적 구축물 및 대조군과 함께 표시된 항온처리 시간 동안 항온처리하였다. CD8, 및 CD69 또는 CD25에 대해 효과기 세포를 염색하고 FACS 캔토II로 분석하였다.
도 53a 및 53b는 이 실험의 결과를 보여준다. (연결된 경쇄를 갖거나 갖지 않는) 2개의 2+1 IgG 교차fab 분자 사이에 CD69 상향조절(도 53a) 또는 CD25 상향조절(도 53b)에 대해 검출된 유의한 차이는 없었다.
또다른 실험에서, CD3/MCSP "2+1 IgG 교차fab"(서열번호 3, 5, 29 및 33 참조) 구축물 및 "1+1 IgG 교차fab"(서열번호 5, 29, 33 및 181 참조) 구축물을, 종양 표적 세포의 존재하에 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포 상의 CD69 또는 CD25를 상향조절하는 그들의 잠재력에 대해 "1+1 교차Mab"(서열번호 5, 23, 183 및 185 참조) 구축물과 비교하였다. 이 분석을, 24시간의 항온처리 시간을 사용하여 인간 MCSP-발현 MV-3 종양 세포의 존재 또는 부재하에 전술된 바와 같이 수행하였다.
도 59a 및 59b에 나타낸 바와 같이, "1+1 IgG 교차fab" 구축물 및 "2+1 IgG 교차fab" 구축물은 "1+1 교차Mab" 분자보다 활성화 마커의 더 현저한 상향조절을 유도하였다.
최종 실험에서, CD3/MCSP "2+1 IgG 교차fab"(서열번호 5, 23, 215 및 217 참조) 구축물 및 "도립된 2+1 IgG 교차fab"(서열번호 5, 23, 215 및 219 참조) 구축물을, 종양 표적 세포의 존재하에 2마리 상이한 사이노몰구스 원숭이들로부터 수득된 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포 상의 CD25를 상향조절하는 그들의 잠재력에 대해 평가하였다. 이 분석을, 3:1의 E:T 비 및 약 41시간의 항온처리 시간을 사용하여 인간 MCSP-발현 MV-3 종양 세포의 존재 또는 부재하에 전술된 바와 같이 수행하였다.
도 60a 및 60b에 나타낸 바와 같이, 두 구축물은 2개 포맷들 사이의 유의한 차이를 갖지 않으면서 농도 의존적 방식으로 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 상의 CD25를 상향조절할 수 있었다. 항체 및 표적 세포를 갖지 않는 대조군 샘플은 항체를 갖되 표적을 갖지 않는 샘플에 필적할만한 신호를 제공하였다(데이터는 제시되지 않음).
실시예 5
CD3 이중특이적 구축물을 사용하여 인간 범 T 세포의 활성화 시 인터페론-γ 분비
인간 MCSP 및 인간 CD3을 표적화하는 정제된 "2+1 IgG scFab"(서열번호 5, 17 및 19)를, 인간 MCSP 양성 U-87MG 세포의 존재하에 T 세포 활성화(상청액 내로의 인간 인터페론(IFN)-γ의 방출에 의해 측정됨)를 유도하는 그의 잠재력에 대해 분석하였다. 대조군으로서, 동일한 몰 농도로 조절된 항-인간 MCSP IgG 및 항-인간 CD3 IgG를 사용하였다. 요약하건대, huMCSP-발현 U-87MG 아교모세포종 성상세포종 표적 세포(ECACC 89081402)를 세포 해리 완충제로 채취하여 세척하고 AIM-V 배지(인비트로겐, #12055-091)에 재현탁화하였다. 웰 당 20,000개 세포를 환저 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 각각의 항체 희석물을 첨가하여 1 nM의 최종 농도를 수득하였다. 버피 코트로부터 단리된 인간 범 T 효과기 세포를 첨가하여 5:1의 최종 E:T 비를 수득하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 18.5시간 동안 밤새 항온처리한 후, 분석 플레이트를 350 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 새로운 96-웰 플레이트 내로 옮겼다. 상청액 중의 인간 IFN-γ 수준을 제조자의 설명서에 따라 ELISA로 측정하였다(벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)의 BD OptEIA 인간 IFN-γ ELISA 키트 II, #550612).
도 26에 도시된 바와 같이, 기준 IgG는 IFN-γ 분비의 유도를 전혀 보여주지 않거나 약하게 보여준 반면, "2+1 IgG scFab" 구축물은 IFN-γ를 분비하도록 인간 T 세포를 활성화시킬 수 있다.
실시예 6
T 세포 상의 CD3 및 종양 세포 상의 MCSP 또는 EGFR 를 표적화하는 가교결합된 이중특이적 구축물에 의해 매개된 방향 전환된 T 세포 세포독성( LDH 방출 분석)
첫 번째 일련의 실험에서, CD3 및 MCSP를 표적화하는 이중특이적 구축물을, 항원 결합 모이어티와 세포 상의 그들의 각각의 표적 항원의 결합을 통한 구축물의 가교결합 시 종양 표적 세포의 T 세포-매개된 아폽토시스를 유도하는 그들의 잠재력에 대해 분석하였다(도 27 내지 38).
한 실험에서, 인간 CD3 및 인간 MCSP를 표적화하는 정제된 "2+1 IgG scFab"(서열번호 5, 21 및 23) 구축물 및 "2+1 IgG 교차fab"(서열번호 3, 5, 29 및 33) 구축물과 상응하는 "(scFv)2" 분자를 비교하였다. 요약하건대, huMCSP-발현 MDA-MB-435 인간 흑색종 표적 세포를 세포 해리 완충제로 채취하여 세척하고 AIM-V 배지(인비트로겐, #12055-091)에 재현탁화하였다. 웰 당 30,000개 세포를 환저 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 구축물의 각각의 희석물을 지시된 농도로 첨가하였다. 모든 구축물 및 상응하는 대조군 IgG들을 동일한 몰 농도로 조절하였다. 인간 범 T 효과기 세포를 첨가하여 5:1의 최종 E:T 비를 수득하였다. 인간 범 T 세포의 활성화를 위한 양성 대조군으로서, 1 ㎍/㎖ PHA-M(시그마 #L8902; 넝쿨 강낭콩으로부터 단리된 이소렉틴의 혼합물)을 사용하였다. 표준화를 위해, 표적 세포를 최종 농도의 1% 트라이톤 X-100과 함께 항온처리함으로써 표적 세포의 최대 용해(= 100%)를 결정하였다. 최소 용해(= 0%)는 임의의 구축물 또는 항체없이 효과기 세포와 함께 항온처리된 표적 세포를 의미한다. 37℃ 및 5% CO2에서 20시간 동안 밤새 항온처리한 후, LDH 검출 키트(로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science), #11 644 793 001)를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 상청액 내로의 아폽토시스/괴사 표적 세포의 LDH 방출을 측정하였다.
도 27에 도시된 바와 같이, 두 "2+1" 구축물은 "(scFv)2" 분자에 필적할만한 표적 세포의 아폽토시스를 유도한다.
또한, Fc 도메인에서 상이한 정제된 "2+1 IgG 교차fab"(서열번호 3, 5, 29 및 33) 구축물 및 "2+1 IgG scFab" 구축물뿐만 아니라 "(scFv)2" 분자도 비교하였다. Fc 도메인 내의 상이한 돌연변이들(표시된 바와 같이, L234A+L235A(LALA), P329G 및/또는 N297D)은 야생형(wt) Fc 도메인을 함유하는 구축물에 의해 유도된 (NK) 효과기 세포 기능을 감소시키거나 제거한다. 실험 절차는 전술된 바와 같았다.
도 28은 모든 구축물이 "(scFv)2" 분자에 필적할만한 표적 세포의 아폽토시스를 유도한다는 것을 보여준다.
도 29는 종양 표적 세포의 T 세포-매개된 아폽토시스를 유도하는 잠재력에 대해 정제된 "2+1 IgG scFab"(서열번호 5, 17 및 19)와 "(scFv)2" 분자를 비교한 결과를 보여준다. 5:1의 E:T 비로 huMCSP-발현 Colo-38 인간 흑색종 표적 세포를 사용하고 18.5시간의 밤샘 항온처리를 사용하여 실험 절차를 전술된 바와 같이 수행하였다. 상기 도면에 도시된 바와 같이, "2+1 IgG scFab" 구축물은 "(scFv)2" 분자에 필적할만한 세포독성 활성을 보여준다.
유사하게, 도 30은 5:1의 E:T 비로 huMCSP-발현 Colo-38 인간 흑색종 표적 세포를 사용하고 18시간의 항온처리 시간을 사용하였을 때 정제된 "2+1 IgG scFab" 구축물(서열번호 5, 17 및 19)과 "(scFv)2" 분자를 비교한 결과를 보여준다. 상기 도면에 도시된 바와 같이, "2+1 IgG scFab" 구축물은 "(scFv)2" 분자에 필적할만한 세포독성 활성을 보여준다.
도 31은 5:1의 E:T 비로 huMCSP-발현 MDA-MB-435 인간 흑색종 표적 세포를 사용하고 23.5시간의 밤샘 항온처리를 사용하였을 때 정제된 "2+1 IgG scFab" 구축물(서열번호 5, 17 및 19)과 "(scFv)2" 분자를 비교한 결과를 보여준다. 상기 도면에 도시된 바와 같이, 상기 구축물은 "(scFv)2" 분자에 필적할만하게 표적 세포의 아폽토시스를 유도한다. "2+1 IgG scFab" 구축물은 가장 높은 농도에서 감소된 효능을 보여준다.
또한, 두 표적, 즉 인간 CD3 및 인간 MCSP에 대한 1가 구축물인 상이한 이중특이적 구축물 및 상응하는 "(scFv)2" 분자를, T 세포-매개된 아폽토시스를 유도하는 그들의 잠재력에 대해 분석하였다. 도 32는 5:1의 E:T 비로 huMCSP-발현 Colo-38 인간 흑색종 표적 세포를 사용하고 19시간의 항온처리 시간을 사용하였을 때 "1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab"(서열번호 1, 3 및 5) 구축물 및 "도립된 1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab"(서열번호 7, 9 및 11) 구축물에 대한 결과를 보여준다. 상기 도면에 도시된 바와 같이, 두 "1+1" 구축물은 "(scFv)2" 분자보다 더 낮은 활성을 나타내고, 이 분석에서 "1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab" 분자는 "도립된 1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab" 분자보다 더 우수하다.
도 33은 5:1의 E:T 비로 huMCSP-발현 Colo-38 인간 흑색종 표적 세포를 사용하고 20시간의 항온처리 시간을 사용하였을 때 "1+1 IgG scFab"(서열번호 5, 21 및 213) 구축물에 대한 결과를 보여준다. 상기 도면에 도시된 바와 같이, "1+1 IgG scFab" 구축물은 "(scFv)2" 분자보다 더 낮은 세포독성을 나타낸다.
추가적 실험에서, 정제된 "2+1 IgG 교차fab"(서열번호 3, 5, 29 및 33), "1+1 IgG 교차fab"(서열번호 5, 29, 31 및 33) 및 "(scFv)2" 분자를, 세포 상의 두 표적 항원들, 즉 CD3 및 MCSP의 결합을 통한 구축물의 가교결합 시 종양 표적 세포의 T 세포-매개된 아폽토시스를 유도하는 그들의 잠재력에 대해 분석하였다. huMCSP-발현 MDA-MB-435 인간 흑색종 세포를 표적 세포로서 사용하였고, E:T 비는 5:1이었고, 항온처리 시간은 20시간이었다. 결과는 도 34에 제시되어 있다. "2+1 IgG 교차fab" 구축물은 "(scFv)2" 분자에 필적할만하게 표적 세포의 아폽토시스를 유도한다. 1가 "IgG 교차fab" 포맷과 2가 "IgG 교차fab" 포맷의 비교는 2가 "IgG 교차fab" 포맷이 훨씬 더 강력하다는 것을 명확히 보여준다.
또다른 실험에서, 정제된 "2+1 IgG 교차fab"(서열번호 3, 5, 29 및 33) 구축물을, 상이한 (종양) 표적 세포의 T 세포-매개된 아폽토시스를 유도하는 그의 잠재력에 대해 분석하였다. 요약하건대, 표시된 바와 같이 MCSP 양성 Colo-38 종양 표적 세포, 중간엽 줄기세포(골수로부터 유래됨, 론자 #PT-2501 또는 지방 조직으로부터 유래됨, 인비트로겐 #R7788-115) 또는 주위세포(태반으로부터 유래됨; 프로모셀 #C-12980)를 세포 해리 완충제로 채취하여 세척하고 AIM-V 배지(인비트로겐, #12055-091)에 재현탁화하였다. 웰 당 30,000개 세포를 환저 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 각각의 항체 희석물을 지시된 농도로 첨가하였다. 건강한 공여자의 새로운 혈액으로부터 단리된 인간 PBMC 효과기 세포를 첨가하여 25:1의 최종 E:T 비를 수득하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 4시간 동안 항온처리한 후, LDH 검출 키트(로슈 어플라이드 사이언스, #11 644 793 001)를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 상청액 내로의 아폽토시스/괴사 표적 세포의 LDH 방출을 측정하였다.
도 35에 도시된 바와 같이, 유의한 T 세포-매개된 세포독성이 Colo-38 세포에서만 관찰될 수 있었다. 이 결과는 유의한 수준의 MCSP를 발현하는 Colo-38 세포와 일치하는 반면, 중간엽 줄기 세포 및 주위세포는 MCSP를 매우 약하게만 발현한다.
정제된 "2+1 IgG scFab"(서열번호 5, 17 및 19) 구축물 및 "(scFv)2" 분자를, Fc 도메인 내에서 감소된 비율의 푸코실화된 N-글리칸을 갖는 당조작된 항-인간 MCSP IgG 항체(MCSP GlycoMab)와 비교하였다. 이 실험을 위해, huMCSP-발현 Colo-38 인간 흑색종 표적 세포 및 인간 PBMC 효과기 세포를 25:1의 고정된 E:T 비(도 36a) 또는 20:1 내지 1:10의 상이한 E:T 비(도 36b)로 사용하였다. 상이한 분자를 도 36a에 지시된 농도 또는 1667 pM의 고정된 농도(도 36b)로 사용하였다. 21시간의 항온처리 후 판독을 수행하였다. 도 36a 및 36b에 도시된 바와 같이, 두 이중특이적 구축물은 MSCP GlycoMab보다 더 높은 효능을 보여준다.
또다른 실험에서, 사이노몰구스 CD3 및 인간 MCSP를 표적화하는 정제된 "2+1 IgG 교차fab"(서열번호 3, 5, 35 및 37)를 분석하였다. 요약하건대, 인간 MCSP-발현 MV-3 종양 표적 세포를 세포 해리 완충제로 채취하여 세척하고, 2% FCS 및 1% 글루타맥스를 함유하는 DMEM에 재현탁화하였다. 웰 당 30,000개 세포를 환저 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 구축물 또는 기준 IgG의 각각의 희석물을 지시된 농도로 첨가하였다. 이중특이적 구축물 및 상이한 IgG 대조군들을 동일한 몰 농도로 조절하였다. 건강한 사이노몰구스의 혈액으로부터 단리된 사이노몰구스 PBMC 효과기 세포를 첨가하여 3:1의 최종 E:T 비를 수득하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 또는 43시간 동안 항온처리한 후, LDH 검출 키트(로슈 어플라이드 사이언스, #11 644 793 001)를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 상청액 내로의 아폽토시스/괴사 표적 세포의 LDH 방출을 측정하였다.
도 37에 도시된 바와 같이, 상기 이중특이적 구축물은 표적 세포로부터 농도 의존적 LDH 방출을 유도한다. 이 효과는 24시간 후보다 43시간 후에 더 강하다. 항-사이노 CD3 IgG(클론 FN-18)도 교차결합되지 않으면서 표적 세포의 LDH 방출을 유도할 수 있다.
도 38은 10:1의 E:T 비로 표적 세포로서 MCSP-발현 인간 흑색종 세포주(MV-3) 및 효과기 세포로서 인간 PBMC를 사용하고 26시간의 항온처리 시간을 사용하였을 때 정제된 "2+1 IgG 교차fab"(서열번호 3, 5, 29 및 33) 구축물과 "(scFv)2" 구축물을 비교한 결과를 보여준다. 상기 도면에 도시된 바와 같이, "2+1 IgG 교차fab" 구축물은 EC50의 관점에서 "(scFv)2" 분자보다 더 강력하다.
두 번째 일련의 실험에서, CD3 및 EGFR을 표적화하는 이중특이적 구축물을, 항원 결합 모이어티와 세포 상의 그들의 각각의 표적 항원의 결합을 통한 상기 구축물의 가교결합 시 종양 표적 세포의 T 세포-매개된 아폽토시스를 유도하는 그들의 잠재력에 대해 분석하였다(도 39 내지 41).
한 실험에서, CD3 및 EGFR을 표적화하는 정제된 "2+1 IgG scFab"(서열번호 45, 47 및 53) 구축물 및 "1+1 IgG scFab"(서열번호 47, 53 및 213) 구축물과, 상응하는 "(scFv)2" 분자를 비교하였다. 요약하건대, 인간 EGFR-발현 LS-174T 종양 표적 세포를 트립신으로 채취하여 세척하고 AIM-V 배지(인비트로겐 # 12055-091)에 재현탁화하였다. 웰 당 30,000개 세포를 환저 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 각각의 항체 희석물을 지시된 농도로 첨가하였다. 모든 구축물 및 대조군들을 동일한 몰 농도로 조절하였다. 인간 범 T 효과기 세포를 첨가하여 5:1의 최종 E:T 비를 수득하였다. 인간 범 T 세포의 활성화에 대한 양성 대조군으로서, 1 ㎍/㎖ PHA-M(시그마 #L8902)을 사용하였다. 표준화를 위해, 표적 세포를 최종 농도의 1% 트라이톤 X-100과 함께 항온처리하여 표적 세포의 최대 용해(= 100%)를 결정하였다. 최소 용해(= 0%)는 임의의 구축물 또는 항체없이 효과기 세포와 함께 항온처리된 표적 세포를 의미한다. 37℃ 및 5% CO2에서 18시간 동안 밤새 항온처리한 후, LDH 검출 키트(로슈 어플라이드 사이언스, #11 644 793 001)를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 상청액 내로의 아폽토시스/괴사 표적 세포의 LDH 방출을 측정하였다.
도 39에 도시된 바와 같이, "2+1 IgG scFab" 구축물은 "(scFv)2" 분자에 필적할만한 세포독성 활성을 보여준 반면, "1+1 IgG scFab" 구축물은 보다 낮은 활성을 보여준다.
또다른 실험에서, 정제된 "1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab"(서열번호 43, 45 및 47), "도립된 1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab"(서열번호 11, 49 및 51), "1+1 IgG scFab"(서열번호 47, 53 및 213), 및 "(scFv)2" 분자를 비교하였다. 21시간의 항온처리 시간을 제외하고 실험 조건은 전술된 바와 같았다.
도 40에 도시된 바와 같이, "1+1 IgG scFab" 구축물은 이 분석에서 "(scFv)2" 분자보다 약간 더 낮은 세포독성 활성을 보여준다. "(도립된) 1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab" 구축물은 "(scFv)2" 분자보다 명확히 더 낮은 활성을 보여준다.
추가적 실험에서, 정제된 "1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab"(서열번호 43, 45 및 47) 구축물 및 "도립된 1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab"(서열번호 11, 49 및 51) 구축물과 "(scFv)2" 분자를 비교하였다. 이 실험에서 항온처리 시간은 16시간이었고, 결과는 도 41a 및 41b에 도시되어 있다. 인간 범 T 세포와 함께 항온처리되었을 때, "(도립된) 1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab" 구축들은 "(scFv)2" 분자보다 더 낮은 활성을 보여주지만, 표적 세포로부터 LDH의 농도 의존적 방출을 보여준다(도 41a). LS-174T 종양 세포와 PBMC로부터 단리된 무자극 T 세포의 공배양 시, 상기 구축들은 기본 활성만을 가졌다(이 중에서 가장 높은 활성을 나타내는 것은 "(scFv)2" 분자임)(도 41b).
추가적 실험에서, CD3 및 섬유모세포 활성화 단백질(FAP)을 표적화하는 정제된 "도립된 1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab"(서열번호 11, 51 및 55), "1+1 IgG scFab"(서열번호 57, 61 및 213) 및 "2+1 IgG scFab"(서열번호 57, 59 및 61), 및 상응하는 "(scFv)2" 분자를, 두 표적화 모이어티와 세포 상의 그들의 각각의 표적 항원의 결합을 통한 구축물의 가교결합 시 인간 FAP-발현 섬유모세포 GM05389 세포의 T 세포-매개된 아폽토시스를 유도하는 그들의 잠재력에 대해 분석하였다. 요약하건대, 인간 GM05389 표적 세포를 전날 트립신으로 채취하여 세척하고 AIM-V 배지(인비트로겐 # 12055-091)에 재현탁화하였다. 웰 당 30,000개 세포를 환저 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 항온처리하여 세포가 회수되고 부착되게 하였다. 다음 날, 세포를 원심분리하고 상청액을 따라 버리고, 새로운 배지뿐만 아니라 구축물 또는 기준 IgG의 각각의 희석물을 지시된 농도로 첨가하였다. 모든 구축들 및 대조군들을 동일한 몰 농도로 조절하였다. 인간 범 T 효과기 세포를 첨가하여 5:1의 최종 E:T 비를 수득하였다. 인간 범 T 세포의 활성화에 대한 양성 대조군으로서, 5 ㎍/㎖ PHA-M(시그마 #L8902)을 사용하였다. 표준화를 위해, 표적 세포를 최종 농도의 1% 트라이톤 X-100과 함께 항온처리하여 표적 세포의 최대 용해(= 100%)를 결정하였다. 최소 용해(= 0%)는 임의의 구축물 또는 항체없이 효과기 세포와 함께 항온처리된 표적 세포를 의미한다. 37℃ 및 5% CO2에서 18시간 동안 밤새 추가적 항온처리한 후, LDH 검출 키트(로슈 어플라이드 사이언스, #11 644 793 001)를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 상청액 내로의 아폽토시스/괴사 표적 세포의 LDH 방출을 측정하였다.
도 42에 도시된 바와 같이, "2+1 IgG scFab" 구축물은 EC50 값의 관점에서 "(scFv)2" 분자에 필적할만한 세포독성 활성을 보여준다. "도립된 1개 아암을 갖는 1+1 IgG scFab" 구축물은 이 분석에서 시험된 다른 구축물보다 더 낮은 활성을 보여준다.
또다른 실험 세트에서, CD3/MCSP "2+1 IgG 교차fab, 연결된 경쇄"(서열번호 3, 5, 29 및 179 참조)를 CD3/MCSP "2+1 IgG 교차fab"(서열번호 3, 5, 29 및 33 참조)와 비교하였다. 요약하건대, 표적 세포(인간 Colo-38, 인간 MV-3 또는 WM266-4 흑색종 세포)를 분석 당일 세포 해리 완충제로 (또는 분석을 시작하기 전날 트립신으로) 채취하여 세척하고 적절한 세포 배양 배지(2% FCS 및 1% 글루타맥스를 포함하는 RPMI1640)에 재현탁화하였다. 웰 당 20,000개 내지 30,000개 세포를 평저 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 각각의 항체 희석물을 표시된 바와 같이 (삼중으로) 첨가하였다. 효과기 세포로서 PBMC를 첨가하여 10:1의 최종 효과기-대-표적 세포(E:T) 비를 수득하였다. 모든 구축물 및 대조군들을 동일한 몰 농도로 조절하였고, 항온처리 시간은 22시간이었다. LDH 방출의 검출 및 표준화를 전술된 바와 같이 수행하였다.
도 49 내지 52는 MV-3 흑색종 세포(도 49), Colo-38 세포(도 50 및 51) 또는 WM266-4 세포(도 52)를 사용하여 수행한 4개 분석의 결과를 보여준다. 도 49에 나타낸 바와 같이, 연결된 경쇄를 갖는 구축물은 MV-3 세포를 표적 세포로서 사용하는 분석에서 연결된 경쇄를 갖지 않는 구축물에 비해 덜 강력하였다. 도 50 및 51에 나타낸 바와 같이, 연결된 경쇄를 갖는 구축물은 높은 MCSP를 발현하는 Colo-38 세포를 표적 세포로서 사용하는 분석에서 연결된 경쇄를 갖지 않는 구축물에 비해 더 강력하였다. 최종적으로, 도 52에 나타낸 바와 같이, 높은 MCSP를 발현하는 WM266-4 세포를 표적 세포로서 사용하였을 때 상기 2개 구축들 사이에 유의한 차이가 없었다.
또다른 실험에서, 교차fab 단편에서 V 영역(VL/VH, 서열번호 33, 63, 65 및 67 참조) 또는 C 영역(CL/CH1, 서열번호 65, 67, 183 및 197 참조)이 교환된 2개의 CEA 표적화 "도립된 2+1 IgG 교차fab" 구축물을 비교하였다. 인간 PBMC를 효과기 세포로서 사용하고 인간 CEA-발현 표적 세포를 사용하여 분석을 전술된 바와 같이 수행하였다. 표적 세포(MKN-45 또는 LS-174T 종양 세포)를 트립신-EDTA(루바이오사이언시스(LuBiosciences) #25300-096)로 채취하여 세척하고, 1% 글루타맥스(루바이오사이언시스 #35050087) 및 2% FCS를 포함하는 RPMI1640(인비트로겐 #42404042)에 재현탁화하였다. 웰 당 30,000개 세포를 환저 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 이중특이적 구축물을 지시된 농도로 첨가하였다. 모든 구축물 및 대조군들을 동일한 몰 농도로 조절하였다. 인간 PBMC 효과기 세포를 첨가하여 10:1의 최종 E:T 비를 수득하였고, 항온처리 시간은 28시간이었다. 그래프패드 프리즘 5 소프트웨어를 사용하여 EC50 값을 계산하였다.
도 61a 및 61b에 나타낸 바와 같이, CL/CH1 교환을 갖는 구축물은 두 표적 세포주들에 대해 VL/VH 교환을 갖는 구축물보다 약간 더 우수한 활성을 보여준다. CL/CH1 교환 구축물 및 VL/VH 교환 구축물에 대한 계산된 EC50 값은 MKN-45 세포의 경우 각각 115 pM 및 243 pM이었고 LS-174T 세포의 경우 각각 673 pM 및 955 pM이었다.
유사하게, 교차fab 단편에서 V 영역(VL/VH, 서열번호 33, 189, 191 및 193 참조) 또는 C 영역(CL/CH1, 서열번호 183, 189, 193 및 195 참조)이 교환된 2개의 MCSP 표적화 "2+1 IgG 교차fab" 구축물을 비교하였다. 인간 PBMC를 효과기 세포로서 사용하고 인간 MCSP-발현 표적 세포를 사용하여 분석을 전술된 바와 같이 수행하였다. 표적 세포(WM266-4)를 세포 해리 완충제(루바이오사이언시스 #13151014)로 채취하여 세척하고, 1% 글루타맥스(루바이오사이언시스 #35050087) 및 2% FCS를 포함하는 RPMI1640(인비트로겐 #42404042)에 재현탁화하였다. 웰 당 30,000개 세포를 환저 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 구축물을 지시된 농도로 첨가하였다. 모든 구축물 및 대조군들을 동일한 몰 농도로 조절하였다. 인간 PBMC 효과기 세포를 첨가하여 10:1의 최종 E:T 비를 수득하였고, 항온처리 시간은 26시간이었다. 그래프패드 프리즘 5 소프트웨어를 사용하여 EC50 값을 계산하였다.
도 62에 도시된 바와 같이, 상기 2개의 구축물은 필적할만한 활성을 보여주고, 이때 CL/CH1 교환을 갖는 구축물은 약간 더 낮은 EC50 값을 갖는다(VL/VH 교환 구축물에 대한 EC50 값은 16.8 pM임에 비해, CL/CH1 교환 구축물에 대한 EC50 값은 12.9 pM임).
도 63은 인간 MCSP-발현 MV-3 표적 세포를 사용하여 수행한 유사한 분석의 결과를 보여준다. 또한, 두 구축물은 필적할만한 활성을 보여주는데, 이때 CL/CH1 교환을 갖는 구축물은 약간 더 낮은 EC50 값을 갖는다(VL/VH 교환 구축물에 대한 EC50 값은 약 82.2 pM임에 비해, CL/CH1 교환 구축물에 대한 EC50 값은 약 11.7 pM임). 사멸 곡선이 화합물의 높은 농도에서 정체기에 도달하지 않았기 때문에 정확한 EC50 값을 계산할 수 없었다.
추가적 실험에서, CD3/MCSP "2+1 IgG 교차fab"(서열번호 3, 5, 29 및 33 참조) 구축물 및 "1+1 IgG 교차fab"(서열번호 5, 29, 33 및 181 참조) 구축물을 CD3/MCSP "1+1 교차Mab"(서열번호 5, 23, 183 및 185 참조)와 비교하였다. 효과기 세포로서의 인간 PBMC 및 WM266-4 또는 MV-3 표적 세포(E:T 비 = 10:1)를 사용하고 21시간의 항온처리 시간을 사용하여 분석을 전술된 바와 같이 수행하였다.
도 64a 및 64b에 나타낸 바와 같이, "2+1 IgG 교차fab" 구축물은 이 분석에서 가장 강력한 분자이고, 그 다음 "1+1 IgG 교차fab" 및 "1+1 교차Mab"가 강력하다. 이 순위는 높은 MCSP를 발현하는 WM266-4 세포에 비해 중간 수준의 MCSP를 발현하는 MV-3 세포의 경우 훨씬 더 현저하다. "2+1 IgG 교차fab", "1+1 IgG 교차fab" 및 "1+1 교차Mab"에 대한 계산된 EC50 값은 MV-3 세포의 경우 각각 9.2 pM, 40.9 pM 및 88.4 pM이었고 WM266-4 세포의 경우 각각 33.1 pM, 28.4 pM 및 53.9 pM이었다.
추가적 실험에서, 10:1의 E:T 비로 MKN-45 또는 LS-174T 종양 표적 세포 및 인간 PBMC 효과기 세포를 사용하고 28시간의 항온처리 시간을 사용하여 상이한 농도의 "1+1 IgG 교차fab LC 융합체" 구축물(서열번호 183, 209, 211 및 213)을 시험하였다. 도 65a 및 65b에 나타낸 바와 같이, "1+1 IgG 교차fab LC 융합체" 구축물은 213 pM의 계산된 EC50으로 MKN-45 표적 세포의 아폽토시스를 유도한 반면, LS-174T 세포를 사용한 경우 계산된 EC50은 1.56 nM인데, 이것은 일정 시간 이내에 상기 이중특이적 구축물의 효능에 대한 상이한 종양 항원 발현 수준의 영향을 보여준다.
또다른 실험에서, "1+1 IgG 교차fab LC 융합체" 구축물(서열번호 183, 209, 211 및 213)을 비표적화된 "2+1 IgG 교차fab" 분자와 비교하였다. MC38-huCEA 종양 세포 및 인간 PBMC(E:T 비 = 10:1), 및 24시간의 항온처리 시간을 사용하였다. 도 66에 나타낸 바와 같이, "1+1 IgG 교차fab LC 융합체" 구축물은 약 3.2 nM의 계산된 EC50 값으로 농도 의존적 방식으로 표적 세포의 아폽토시스를 유도하였다. 대조적으로, 비표적화된 "2+1 IgG 교차fab"는 가장 높은 농도에서만 표적 세포의 항원 독립적 T 세포-매개된 사멸을 보여주었다.
최종 실험에서, 인간 MCSP 양성 MV-3 또는 WM266-4 종양 세포 및 인간 PBMC(E:T 비 = 10:1), 및 약 24시간의 항온처리 시간을 사용하여 "2+1 IgG 교차fab (V9)"(서열번호 3, 5, 29 및 33), "도립된 2+1 IgG 교차fab(V9)"(서열번호 5, 23, 183 및 187), "2+1 IgG 교차fab(항-CD3)"(서열번호 5, 23, 215 및 217), 및 "도립된 2+1 IgG 교차fab(항-CD3)"(서열번호 5, 23, 215 및 219)를 비교하였다. 도 67a 및 67b에 도시된 바와 같이, "도립된 2+1 IgG 교차fab" 구축물의 T 세포-매개된 사멸은 두 CD3 결합제들에 대해 "2+1 IgG 교차fab" 구축물에 의해 유도된 T 세포-매개된 사멸보다 약간 더 강하거나 적어도 동등한 것으로 보인다. 계산된 EC50 값은 다음과 같았다:
Figure pct00008
실시예 7
CD107a /b 분석
인간 MCSP 및 인간 CD3 둘다를 표적화하는 정제된 "2+1 IgG scFab" 구축물(서열번호 5, 17 및 19) 및 "(scFv)2" 분자를, 인간 MCSP-발현 종양 세포의 존재 또는 부재하에 CD107a 및 세포내 퍼포린 수준을 상향조절하는 그들의 잠재력에 대해 유세포계수로 시험하였다..
요약하건대, 제1일에 웰 당 30,000개 Colo-38 종양 표적 세포를 환저 96-웰 플레이트에 플레이팅하고 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 항온처리하여 상기 세포가 부착되게 하였다. 전술된 바와 같이, 제1일 또는 제2일에 일차 인간 범 T 세포를 버피 코트로부터 단리하였다.
제2일에, 웰 당 0.15 x 106개 효과기 세포를 첨가하여 5:1의 최종 E:T 비를 수득하였다. FITC-접합된 CD107a/b 항체뿐만 아니라 상이한 이중특이적 구축물들 및 대조군들도 첨가하였다. 상이한 이중특이적 분자 및 항체를 동일한 몰 농도로 조절하여 9.43 nM의 최종 농도를 수득하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 1시간 동안 항온처리 단계를 수행한 후, 모넨신을 첨가하여 분비를 억제하였을 뿐만 아니라 엔도좀 및 라이소좀 내부의 pH도 중화시켰다. 5시간의 추가적 항온처리 시간 후, 세포를 4℃에서 표면 CD8 발현에 대해 30분 동안 염색하였다. 세포를 염색 완충제(PBS/0.1% BSA)로 세척하고, BD 골지 스탑(Golgi Stop)(비디 바이오사이언시스(BD Biosciences) #554715)과 함께 BD 사이토픽스/사이토펌(Cytofix/Cytoperm) 플러스 키트를 사용하여 20분 동안 고정시키고 투과가능한 상태로 만들었다. 1 x BD 펌(Perm)/세척 완충제를 사용하여 세포를 2회 세척하고, 퍼포린에 대한 세포내 염색을 4℃에서 30분 동안 수행하였다. 1 x BD 펌/세척 완충제를 사용한 최종 세척 단계 후, 세포를 PBS/0.1% BSA에 재현탁화하고 FACS 캔토II 상에서 분석하였다(모든 항체들은 비디 바이오사이언시스 또는 바이오레전드(BioLegend)로부터 구입하였음).
표시된 바와 같이, 모든 CD107a/b 양성, 퍼포린 양성 또는 이중 양성 세포에 대해 게이트를 설정하였다(도 43a 및 43b). "2+1 IgG scFab" 구축물은 표적 세포의 존재하에서만 T 세포를 활성화시키고 CD107a/b 및 세포내 퍼포린 수준을 상향조절한 반면(도 43a), "(scFv)2" 분자는 표적 세포의 부재하에서도 T 세포의 활성화의 (약한) 유도를 보여준다(도 43b). 2가 기준 항-CD3 IgG는 "(scFv)2" 분자 또는 다른 이중특이적 구축물에 비해 더 낮은 수준의 활성화를 야기한다.
실시예 8
증식 분석
인간 CD3 및 인간 MCSP를 표적화하는 정제된 "2+1 IgG scFab"(서열번호 5, 17 및 19) 및 "(scFv)2" 분자를, 인간 MCSP-발현 종양 세포의 존재 및 부재하에 CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 증식을 유도하는 그들의 잠재력에 대해 유세포계수로 시험하였다.
요약하건대, 새로 단리된 인간 범 T 세포를 가온된 PBS 중에 ㎖ 당 1 x 106개 세포의 농도로 조절하고 실온에서 1 μM CFSE로 10분 동안 염색하였다. 10% FCS 및 1% 글루타맥스를 함유하는 RPMI1640 배지를 첨가하여 염색 부피를 2배로 증가시켰다. 실온에서 추가적 20분 동안 항온처리한 후, 세포를 미리 가온된 배지로 3회 세척하여 잔류 CFSE를 제거하였다. MCSP 양성 Colo-38 세포를 세포 해리 완충제로 채취하여 계수하고 생존력에 대해 조사하였다. 세포를 AIM-V 배지 중에 ㎖ 당 0.2 x 106(생존)개 세포의 농도로 조절하고, 웰 당 100 ㎕의 이 세포 현탁액을 환저 96-웰 플레이트에 (표시된 바와 같이) 피펫팅하였다. (희석된) 이중특이적 구축물(50 ㎕)을 세포 함유 웰에 첨가하여 1 nM의 최종 농도를 수득하였다. CFSE-염색된 인간 범 T 효과기 세포를 AIM-V 배지 중에 ㎖ 당 2 x 106(생존)개 세포의 농도로 조절하였다. 분석 플레이트(상기 참조)의 웰 당 50 ㎕의 이 세포 현탁액을 첨가하여 5:1의 최종 E:T 비를 수득하였다. 이중특이적 구축물이 종양 항원 huMCSP를 발현하는 표적 세포의 존재하에서만 T 세포를 활성화시킬 수 있는 지를 분석하기 위해, 1 nM의 각각의 이중특이적 분자 및 PBMC를 함유하되 표적 세포를 함유하지 않는 웰을 포함시켰다. 37℃ 및 5% CO2에서 5일 동안 항온처리한 후, 세포를 원심분리하고(5분, 350 x g), 0.1% BSA를 포함하는 150 ㎕/웰의 PBS로 2회 세척하였다. CD8(마우스 IgG1,κ; 클론 HIT8a; BD #555635), CD4(마우스 IgG1,κ; 클론 RPA-T4; BD #560649) 또는 CD25(마우스 IgG1,κ; 클론 M-A251; BD #555434)에 대한 표면 염색을 공급자의 제안에 따라 4℃에서 30분 동안 수행하였다. 세포를, 0.1% BSA를 함유하는 150 ㎕/웰의 PBS로 2회 세척하고, 0.1% BSA를 함유하는 200 ㎕/웰의 PBS에 재현탁화하고, FACS 캔토II 기계(소프트웨어 FACS 디바)를 사용하여 분석하였다. 비증식 세포 주변에 게이트를 설정하고 기준물로서 사용된 전체 측정된 세포 수에 비해 상대적인 이 게이트의 세포 수를 사용함으로써 상대적인 증식 수준을 결정하였다.
도 44a 및 44b는 모든 구축물들이 표적 세포의 존재하에서만 CD8+ T 세포(도 44a) 또는 CD4+ T 세포(도 44b)의 증식을 (scFv)2" 분자에 필적할만하게 유도한다는 것을 보여준다. 일반적으로, 활성화된 CD8+ T 세포는 이 분석에서 활성화된 CD4+ T 세포보다 더 많이 증식한다.
실시예 9
사이토카인 방출 분석
인간 MCSP 및 인간 CD3을 표적화하는 정제된 "2+1 IgG scFab" 구축물(서열번호 5, 17 및 19) 및 "(scFv)2" 분자를, 종양 표적 세포의 존재 또는 부재하에 사이토카인의 T 세포-매개된 드 노보(de novo) 분비를 유도하는 그들의 능력에 대해 분석하였다.
요약하건대, 인간 PBMC를 버피 코트로부터 단리하고, 웰 당 0.3 x 106개 세포를 환저 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 인간 MCSP를 발현하는 Colo-38 종양 표적 세포를 첨가하여 10:1의 최종 E:T 비를 수득하였다. 이중특이적 구축물 및 IgG 대조군을 1 nM 최종 농도로 첨가하고, 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 항온처리하였다. 다음 날, 세포를 350 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 후속 분석을 위해 상청액을 새로운 딥웰 96-웰 플레이트 내로 옮겼다. 인간 Th1/Th2 사이토카인 키트 II(BD #551809)를 사용하여 FACS 캔토II에 대한 제조자의 설명서에 따라 CBA 분석을 수행하였다.
도 45a 및 45b는 상청액에서 측정된 상이한 사이토카인의 수준을 보여준다. 표적 세포의 존재하에 T 세포 활성화 시 분비된 주요 사이토카인은 IFN-γ이다. "(scFv)2" 분자는 "2+1 IgG scFab" 구축물보다 약간 더 높은 수준의 IFN-γ를 유도한다. 인간 TNF에 대해 동일한 경향이 발견되었지만, 이 사이토카인의 전체 수준은 IFN-γ에 비해 훨씬 더 낮았다. 표적 세포의 존재(또는 부재)하에 T 세포의 활성화 시 Th2 사이토카인(IL-10 및 IL-4)의 유의한 분비는 없었다. Colo-38 표적 세포의 부재하에, TNF 분비의 매우 약한 유도만이 관찰되었는데, 이것은 "(scFv)2" 분자로 처리된 샘플에서 가장 높았다.
두 번째 실험에서, 인간 MCSP 및 인간 CD3을 표적화하는 하기 정제된 이중특이적 구축물들을 분석하였다: "2+1 IgG 교차fab" 구축물(서열번호 3, 5, 29 및 33), "(scFv)2" 분자, 및 야생형 또는 돌연변이된(표시된 바와 같이, LALA, P329G 및/또는 N297D) Fc 도메인을 포함하는 상이한 "2+1 IgG scFab" 분자. 요약하건대, 건강한 공여자로부터 수득된 전혈을 웰 당 280 ㎕씩 딥웰 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 인간 MCSP를 발현하는 30,000개 Colo-38 종양 표적 세포뿐만 아니라 상이한 이중특이적 구축물 및 IgG 대조군도 1 nM 최종 농도로 첨가하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 항온처리한 후, 350 x g에서 5분 동안 원심분리하였다. 후속 분석을 위해 상청액을 새로운 딥웰 96-웰 플레이트 내로 옮겼다. 하기 CBA 플렉스 세트(Flex Set)의 조합물을 사용하여 FACS 캔토II에 대한 제조자의 설명서에 따라 CBA 분석을 수행하였다: 인간 그랜자임 B(BD #560304), 인간 IFN-γ 플렉스 세트(BD #558269), 인간 TNF 플렉스 세트(BD #558273), 인간 IL-10 플렉스 세트(BD #558274), 인간 IL-6 플렉스 세트(BD #558276), 인간 IL-4 플렉스 세트(BD #558272) 및 인간 IL-2 플렉스 세트(BD #558270).
도 46a 내지 46d는 상청액에서 측정된 상이한 사이토카인의 수준을 보여준다. Colo-38 종양 세포의 존재하에 분비된 주요 사이토카인은 IL-6에 이어서 IFN-γ이었다. 또한, 그랜자임 B의 수준도 표적 세포의 존재하에 T 세포의 활성화 시 크게 증가하였다. 일반적으로, "(scFv)2" 분자는 표적 세포의 존재하에 보다 높은 수준의 사이토카인 분비를 유도하였다(도 46a 및 46b). 표적 세포의 존재(또는 부재)하에 T 세포의 활성화 시 Th2 사이토카인(IL-10 및 IL-4)의 유의한 분비는 없었다.
이 분석에서, 표적 세포의 부재하에 조차도 상이한 "2+1 IgG scFab" 구축물에 의해 유도된 IFN-γ의 약한 분비가 있었다(도 46c 및 46d). 이들 조건들하에, 야생형 또는 돌연변이된 Fc 도메인을 갖는 "2+1 IgG scFab" 구축물들 사이에 유의한 차이가 관찰될 수 없었다.
실시예 10
항- MCSP 항체 M4 -3/ ML2 의 친화성 성숙
친화성 성숙을 올리고뉴클레오티드-유도 돌연변이유발 절차를 통해 수행하였다. 이를 위해, 후겐붐(Hoogenboom)에 의해 기재된 것과 유사하게(문헌[Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res. 1991, 19, 4133-4137]) 중쇄 변이체 M4-3 및 경쇄 변이체 ML2를 파지미드 벡터에 클로닝하였다. 무작위화할 잔기를 먼저 종래의 상동성 모델링을 통해 상기 항체의 3D 모델을 생성한 후에 중쇄 및 경쇄의 상보적 결정 영역(CDR)의 용매 접근가능한 잔기를 확인함으로써 확인하였다. 표 4에 나타낸 트라이뉴클레오티드 합성을 기초로 한 무작위화된 올리고뉴클레오티드를 엘라 바이오테크(Ella Biotech, 독일 뮌헨 소재)로부터 구매하였다. 3개의 독립적 서브라이브러리를 종래의 PCR을 통해 생성하고 CDR-H1과 CDR-H2를 함께 또는 CDR-L1과 CDR-L2를 함께 무작위화에 포함시켰다. CDR-L3을 별개의 접근법으로 무작위화하였다. 이들 라이브러리의 DNA 단편을 제한 다이제스트 및 결찰을 통해 파아지미드에 클로닝한 후에 TG1 박테리아에 전기 천공하였다.
라이브러리 선택
이에 따라 생성된 항체 변이체를 각각의 입자내에 패키징된 M13의 유전자 III 생성물과 융합체로서 사상파지 입자로부터 1가 방식으로 디스플레이하였다. 이어서, 파지-디스플레이된 변이체를 이들의 생물학적 활성(본원에서는 결합 친화성)에 대해 스크리닝하고, 하나 이상의 개선된 활성을 갖는 후보자를 추가적 개발을 위해 사용하였다. 파지 디스플레이 라이브러리의 제조 방법은 문헌[Lee et al., J. Mol. Biol. (2004) 340, 1073-1093]에서 찾아볼 수 있다.
모든 친화성 성숙 라이브러리 선택을 하기 절차에 따라 용액 중에서 수행하였다: 1. 각각의 친화성 성숙 라이브러리의 약 1012개의 파지미드를 0.5시간 동안 1 ml의 총 부피까지 100 nM 바이오틴일화된 hu-MCSP(D3 도메인)-avi-his(서열번호 376)에 결합시켰다; 2. 5.4 × 107 스트렙타비딘 코팅된 자성 비드를 첨가함으로써 10분 동안 바이오틴일화된 hu-MCSP(D3 도메인)-avi-his 및 특이적으로 결합된 파지 입자를 포획하였다; 3. 5-10x 1 ml PBS/트윈(Tween)-20 및 5-10x 1 ml PBS를 사용하여 비드를 세척하였다; 4. 1 ml 100 mM TEA(트라이에틸아민)를 첨가함으로써 10 분 동안 파지 입자를 용출하고 500 μl 1 M 트리스/HCl(pH 7.4)을 첨가함으로써 중화시켰다; 5. 기하급수적으로 성장하는 이. 콜라이 TG1 박테리아를 재감염시키고, 보조파지 VCSM13으로 감염시키고, 후속 선택 라운드에서 사용할 파지미드 입자를 후속 PEG/NaCl 침전시켰다. 3 내지 5 라운드에 걸쳐 일정하거나 감소하는(10-7 M에서 2 x 10-9 M로 감소) 항원 농도를 사용하여 선택을 수행하였다. 제2 라운드에서, 스트렙타비딘 비드 대신에 뉴트라비딘 플레이트를 사용하여 항원-파지 복합체의 포획을 수행하였다. 특이적 결합제를 ELISA에 의해 하기와 같이 확인하였다: 웰 당 100 μl의 10 nM 바이오틴일화된 hu-MCSP(D3 도메인)-avi-his를 뉴트라비딘 플레이트 상에 코팅하였다. Fab-함유 박테리아 상청액을 첨가하고, 결합 Fab를 항-Flag/HRP 이차 항체를 사용하여 플래그-태그를 통해 검출하였다. ELISA 양성 클론을 96-웰 포맷에서 가용성 Fab 단편으로서 박테리아 발현시키고, 상청액을 프로테온(ProteOn) XPR36(바이오라드(BioRad))을 사용하여 SPR-분석에 의해 동역학 스크리닝 실험하였다. 가장 높은 친화성 상수를 갖는 클론-발현 Fab를 확인하고, 상응하는 파지미드를 서열화하였다.
[표 4]
Figure pct00009
Figure pct00010
도 68은 비성숙된 모 클론(M4-3 ML2)과 비교한 친화성 성숙된 항-MCSP 클론의 정렬을 보여준다. 중쇄 무작위화를 CDR1 및 CDR2에서만 수행하였다. 경쇄 무작위화를 CDR1 및 CDR2, 및 독립적으로 CDR3에서 수행하였다.
선택 동안, 골격의 몇몇 돌연변이, 예컨대 클론 G3에서 F71Y 또는 클론 E10에서 Y87H가 발생하였다.
인간 IgG 1 의 제조 및 정제
친화성 성숙된 변이체의 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 각각 수용자 포유동물 발현 벡터 내로 미리 삽입된 불변 중쇄 또는 불변 경쇄와 인 프레임으로 서브클로닝하였다. 항체 발현을 MPSV 프로모터로 유도하였고 합성 폴리A 신호 서열은 CDS의 3'-말단에 위치시켰다. 또한, 각각의 벡터는 EBV OriP 서열을 함유하였다.
분자를 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 HEK293-EBNA 세포를 포유동물 발현 벡터로 공형질감염시켜 제조하였다. 세포를 상응하는 발현 벡터로 1:1 비로 형질감염시켰다. 형질감염을 위해, HEK293 EBNA 세포를 CD CHO 배양 배지에서 혈청-미함유 현탁액에서 배양하였다. 제조를 위해 500 ml 진탕 플라스크에서, 4×108개의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24시간 이전에 시딩하였다. 형질감염 세포를 5분 동안 210 x g에서 원심분리하고, 상청액을 미리 가온된 20 ml CD CHO 배지로 대체하였다. 발현 벡터를 20 ml CD CHO 배지에서 혼합하여 200 μg의 최종 양의 DNA를 수득하였다. 540 μl PEI 용액을 첨가한 후에, 혼합물을 15초 동안 와류시킨 후에, 10분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이후, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고 500 ml 진탕 플라스크에 옮기고 5% CO2 대기를 갖는 항온기에서 37℃에서에서 3시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 시간 후에, 160 ml F17 배지를 첨가하고, 세포를 24시간 동안 배양하였다. 형질감염 1일 후에, 1 mM 발프로산 및 7% 피드 1(론자)을 첨가하였다. 7일 후에, 배양 상청액을 정제를 위해 210 x g에서 15분 동안 원심분리함으로써 수집하고, 용액을 멸균 여과(0.22 μm 필터)하고, 0.01%(w/v)의 최종 농도의 나트륨 아지드를 첨가하고, 4℃에서 유지하였다.
분비된 단백질을 세포 배양 상청액으로부터 단백질 A를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 상청액을 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트 및 0.5 M 나트륨 클로라이드(40 ml, pH 7.5)로 평형화된 하이트랩 단백질 A HP 컬럼(CV=5 mL, 지이 헬쓰케어) 상에 적재하였다. 미결합된 단백질을 10 컬럼 이상의 부피의 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트 및 0.5 M 나트륨 클로라이드(pH 7.5)로 세척하여 제거하였다. 표적 단백질을 20 mM 나트륨 시트레이트 및 0.5 M 나트륨 클로라이드(pH 7.5)로부터 20 mM 나트륨 시트레이트 및 0.5 M 나트륨 클로라이드(pH 2.5)로 20 컬럼 부피에 걸친 구배 동안 용출하였다. 단백질 용액을 1/10의 0.5 M 나트륨 포스페이트(pH 8)를 첨가하여 중화시켰다. 표적 단백질을 농축하고 여과한 후에, 20 mM 히스티딘 및 140 mM 나트륨 클로라이드의 용액(pH 6.0)으로 평형화된 하이로드 수퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 적재하였다.
정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 아미노산 서열에 근거하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 결정하였다. 분자의 순도 및 분자량을 환원제의 존재 및 부재하에 CE-SDS 분석에 의해 분석하였다. 캘리퍼 랩칩 GXII 시스템(캘리퍼 라이프 사이언시즈)을 제조자의 설명서에 따라 사용하였다. 2 ㎍의 샘플을 분석에 사용하였다. 25℃에서 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02 % (w/v) NaN3(pH 6.7) 런닝 완충제에서 TSKgel G3000 SW XL 분석 크기 배재 컬럼(토소)을 사용하여 항체 샘플의 응집체 함량을 분석하였다.
[표 5]
Figure pct00011
친화성 결정
프로테온 분석
CM5 칩 상의 아민 커플링, 및 박테리아 상청액 또는 정제된 Fab 제제로부터 후속 포획에 의해 고정된 항-인간 F(ab')2 단편 특이적 포획 항체(잭슨 이뮤노리서치 #109-005-006)를 사용하여 25℃에서 프로테온 XPR36 기계(바이오라드)를 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 KD를 측정하였다. 요악하건데, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, 지이 헬쓰케어)을 공급자의 설명서에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)로 활성화하였다. 항-인간 F(ab')2 단편 특이적 포획 항체를 10 mM 나트륨 아세테이트(pH 5.0)로 50 μg/ml로 희석한 후에, 10 μl/분의 유속으로 주입하여 대략 10.000 반응 유닛(RU)의 커플링된 포획 항체를 달성하였다. 포획 항체의 주입 후에, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응 기를 차단하였다. 동역학 측정을 위해, 박테리아 상청액 또는 정제된 Fab로부터의 Fab를 10 μl/분의 유속으로 300초 동안 주입하고 포획 베이스라인 안정화를 위해 300초의 해리를 수행하였다. 포획 수준은 100 내지 500 RU 범위이었다. 후속 단계에서, 인간 MCSP(D3 도메인)-avi-his 분해물을 25℃에서 50 μl/분의 유속으로 단일 농도 또는 HBS-EP+(지이 헬쓰케어, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 계면활성제 P20, pH 7.4)에 희석된 일련의 농도(100 nM 내지 250 pM 범위의 클론 친화성에 따름)로 주입하였다. 센서칩의 표면을 글리신(pH 1.5)을 30초 동안 90 μl/분으로 주입한 후에 NaOH를 20초 동안 동일한 유속으로 주입하여 재생시켰다. 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)를 단순 1-대-1 랭뮤어 결합 모델(프로테온 XPR36 평가 소프트웨어 또는 스크러버 소프트웨어(바이오로직))을 사용하여 결합 및 해리 센어그램을 동시에 피팅함으로써 계산하였다. 평형 해리 상수(KD)를 비 koff/kon으로서 계산하였다. 이 데이터를 모 항체에 대한 친화성 성숙된 변이체의 비교 결합친화성을 결정하는 데 사용하였다. 하기 표 6A는 이들 분석으로부터 생성된 데이터를 보여준다.
인간 IgG1 포맷으로의 전환을 위해 경쇄에 대해 G3, E10, C5를 중쇄에 대해 D6, A7, B7, B8, C1을 선택하였다. 경쇄의 CDR1 및 CDR2는 CDR3과 독립적으로 무작위화되기 때문에, 수득된 CDR을 IgG 전환 동안 합하였다.
IgG 포맷에서, 친화성을 인간 MCSP 항원(서열번호 376) 및 사이노몰구스 동족체(서열번호 375)에 대하여 다시 측정하였다.
사용된 방법은 단지 포유동물 생성물로부터 정제된 IgG를 사용하는 Fab 단편에 대해 기재된 것과 유사하였다.
[표 6A]
Figure pct00012
비아코어 T200 을 사용하는 표면 플라스몬 공명( SPR )에 의한 친화성 결정
친화성 성숙된 IgG의 친화성 및 결합활성을 결정하는 표면 플라스몬 공명(SPR) 실험을 런닝 완충제로서 HBS-EP(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, 비아코어, 독일 프라이부르크 소재)를 사용하여 25℃에서 비아코어 T200 상에 수행하였다.
인간 및 사이노몰구스 MCSP D3에 대한 상이한 항-MCSP IgG의 상호작용의 결합활성을 분석하기 위해, 항-펜타 His 항체(퀴아젠)의 약 9,500 공명 유닛(RU)의 직접 커플링을 표준 아민 커플링 키트(비아코어, 독일 프라이부르크 소재)를 사용하여 pH 5.0에서 CM5 칩 상에서 수행하였다. 항원을 60초 동안 30 nM에서 10 μl/분으로 각각 포획하였다. IgG를 유동 셀을 통해 280초 동안 0.0064 내지 100 nM의 농도로 30 μl/분의 유속으로 통과시켰다. 해리를 180초 동안 모니터링하였다. 벌크 굴절률 차이를 기준 유동 셀에 대해 수득된 반응을 차감함으로써 보정하였다. 이때, IgG는 인간 MCSP D3 또는 사이노몰구스 MCSP D3 보다는 HBS-EP가 주입된, 고정된 항-펜타 His 항체를 갖는 표면 상에서 유동하였다.
친화성 측정을 위해, IgG를 고정된 항-인간 Fc를 갖는 CM5 센서칩 표면 상에 포획하였다. 포획 IgG를 표준 아민 커플링 키트(비아코어, 독일 프라이부르크 소재)를 사용하여 pH 5.0에서 약 9,500 공명 유닛(RU)의 직접 고정화에 의해 센서칩 표면에 커플링하였다. IgG를 25초 동안 10 nM에서 30 μl/분으로 포획하였다. 인간 및 사이노몰구스 MCSP D3을 유동 셀을 통해 120초 동안 2 내지 500 nM의 농도로 30 μl/분의 유속으로 통과시켰다. 해리를 60초 동안 모니터링하였다. 166 및 500 nM 농도에 대한 결합 및 해리를 각각 1200 및 600초 동안 모니터링하였다. 벌크 굴절률 차이를 기준 유동 셀에 대해 수득된 반응을 차감함으로써 보정하였다. 이때, 항원은 항-MCSP IgG보다는 HBS-EP가 주입된, 고정된 항-펜타 His 항체를 갖는 표면 상에서 유동하였다.
수치 적분에 의해 1:1 랭뮤어 결합에 대한 속도 방적식을 피팅하는 비아코어 T200 평가 소프트웨어(vAA, 비아코어 아베, 스웨덴 웁살라 소재)를 사용하여 동역학적 상수를 유도하였다.
인간 및 사이노몰구스 MCSP D3에 대한 보다 높은 친화성을 비아코어 T200을 사용하여 표면 플라스몬 공명 측정에 의해 확인하였다. 또한, 결합활성 측정은 2가 결합의 3배 이하의 증가를 보여주었다(표 6B).
[표 6B]
Figure pct00013
실시예 11
항- MCSP 항체로서 M4 -3( C1 ) ML2 ( G3 ) 및 항- CD3 항체로서 인간화된 CH2527 을 함유하는 MCSP TCB ( 도립된 2+1 교차fab- IgG P329G LALA )의 제조
중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 각각 수용자 포유동물 발현 벡터에 미리 삽입된 불변 중쇄 또는 불변 경쇄와 인 프레임으로 서브클로닝하였다. 항체 발현을 MPSV 프로모터에 의해 유도하고 CDS의 3' 말단에 합성 폴리A 신호 서열을 위치시켰다. 또한, 각각의 벡터는 EBV OriP 서열을 함유하였다.
분자를 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 포유동물 발현 벡터로 HEK293-EBNA 세포를 공형질감염시킴으로써 제조하였다. 세포를 상응하는 발현 벡터로 1:2:1:1 비("벡터 중쇄 Fc(홀)":"벡터 경쇄":"벡터 경쇄 교차fab":"벡터 중쇄 Fc(놉)-Fab교차fab")로 형질감염시켰다.
형질감염을 위해, HEK293 EBNA 세포를 CD CHO 배양 배지에서 혈청-미함유 현탁액에서 배양하였다. 제조를 위해 500 ml 진탕 플라스크에서, 4×108개의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24시간 이전에 시딩하였다. 형질감염 세포를 5분 동안 210 x g에서 원심분리하고, 상청액을 미리 가온된 20 ml CD CHO 배지로 대체하였다. 발현 벡터를 20 ml CD CHO 배지에서 혼합하여 200 μg의 최종 양의 DNA를 수득하였다. 540 μl PEI 용액을 첨가한 후에, 혼합물을 15초 동안 와류시킨 후에, 10분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이후, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고 500 ml 진탕 플라스크에 옮기고 5% CO2 대기를 갖는 항온기에서 37℃에서 3시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 시간 후에, 160 ml F17 배지를 첨가하고, 세포를 24시간 동안 배양하였다. 형질감염 1일 후에, 1 mM 발프로산 및 7% 피드 1(론자)을 첨가하였다. 7일 후에, 배양 상청액을 정제를 위해 210 x g에서 15분 동안 원심분리함으로써 수집하고, 용액을 멸균 여과(0.22 μm 필터)하고, 0.01%(w/v)의 최종 농도의 나트륨 아지드를 첨가하고, 4℃에서 유지하였다.
분비된 단백질을 세포 배양 상청액으로부터 단백질 A를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 상청액을 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트 및 0.5 M 나트륨 클로라이드(40 ml, pH 7.5)로 평형화된 하이트랩 단백질 A HP 컬럼(CV=5 mL, 지이 헬쓰케어) 상에 적재하였다. 미결합된 단백질을 10 컬럼 이상의 부피의 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트 및 0.5 M 나트륨 클로라이드(pH 7.5)로 세척함으로써 제거하였다. 표적 단백질을 20 mM 나트륨 시트레이트 및 0.5 M 나트륨 클로라이드(pH 7.5)로부터 20 mM 나트륨 시트레이트 및 0.5 M 나트륨 클로라이드(pH 2.5)로 20 컬럼 부피에 걸친 구배 동안 용출하였다. 단백질 용액을 1/10의 0.5 M 나트륨 포스페이트(pH 8)를 첨가하여 중화시켰다. 표적 단백질을 농축하고 여과한 후에, 20 mM 히스티딘 및 140 mM 나트륨 클로라이드의 용액(pH 6.0)으로 평형화된 하이로드 수퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 적재하였다.
정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 아미노산 서열에 근거하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 결정하였다.
분자의 순도 및 분자량을 환원제의 존재 및 부재하에 CE-SDS 분석에 의해 분석하였다. 캘리퍼 랩칩 GXII 시스템(캘리퍼 라이프 사이언시즈)을 제조자의 설명서에 따라 사용하였다. 2 μg 샘플을 분석에 사용하였다.
25℃에서 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02 % (w/v) NaN3(pH 6.7) 런닝 완충제에서 TSKgel G3000 SW XL 분석 크기 배재 컬럼(토소)을 사용하여 항체 샘플의 응집체 함량을 분석하였다.
[표 7A]
Figure pct00014
도 69는 MCSP TCB(도립된 2+1 교차fab-IgG P329G LALA) 분자의 계략도를 보여준다.
도 70 및 표 7B는 MCSP TCB(2+1 교차fab-IgG P329G LALA 도립된) 분자(서열번호 278, 319, 320 및 321)의 CE-SDS 분석을 보여준다.
[표 7B]
Figure pct00015
실시예 12
항- CEA 항체로서 CH1A1A 98/99 2F1 및 항- CD3 항체로서 인간화된 CH2527 을 함유하는 CEA TCB ( 도립된 2+1 교차fab- IgG P329G LALA )의 제조
중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 각각 수용자 포유동물 발현 벡터에 미리 삽입된 불변 중쇄 또는 불변 경쇄와 인 프레임으로 서브클로닝하였다. 항체 발현을 MPSV 프로모터에 의해 유도하고 CDS의 3' 말단에 합성 폴리A 신호 서열을 위치시켰다. 또한, 각각의 벡터는 EBV OriP 서열을 함유하였다.
분자를 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 포유동물 발현 벡터로 HEK293-EBNA 세포를 공형질감염시킴으로써 제조하였다. 세포를 상응하는 발현 벡터로 1:2:1:1 비("벡터 중쇄 Fc(홀)":"벡터 경쇄":"벡터 경쇄 교차fab":"벡터 중쇄 Fc(놉)-Fab교차fab")로 형질감염시켰다.
형질감염을 위해, HEK293 EBNA 세포를 CD CHO 배양 배지에서 혈청-미함유 현탁액에서 배양하였다. 제조를 위해 500 ml 진탕 플라스크에서, 4×108개의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24시간 이전에 시딩하였다. 형질감염을 위해, 세포를 5분 동안 210 x g에서 원심분리하고, 상청액을 미리 가온된 20 ml CD CHO 배지로 대체하였다. 발현 벡터를 20 ml CD CHO 배지에서 혼합하여 200 μg의 최종 양의 DNA를 수득하였다. 540 μl PEI 용액을 첨가한 후에, 혼합물을 15초 동안 와류시킨 후에, 10분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이후, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고 500 ml 진탕 플라스크에 옮기고 3시간 동안 37℃까지 5% CO2 대기를 갖는 항온기에서 항온처리하였다. 항온처리 시간 후에, 160 ml F17 배지를 첨가하고, 세포를 24시간 동안 배양하였다. 형질감염 1일 후에, 1 mM 발프로산 및 7% 피드 1(론자)을 첨가하였다. 7일 후에, 배양 상청액을 정제를 위해 210 x g에서 15분 동안 원심분리함으로써 수집하고, 용액을 멸균 여과(0.22 μm 필터)하고, 0.01%(w/v)의 최종 농도의 나트륨 아지드를 첨가하고, 4℃에서 유지하였다.
분비된 단백질을 세포 배양 상청액으로부터 단백질 A를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 상청액을 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트 및 0.5 M 나트륨 클로라이드(40 ml, pH 7.5)로 평형화된 하이트랩 단백질 A HP 컬럼(CV=5 mL, 지이 헬쓰케어) 상에 적재하였다. 미결합된 단백질을 10 컬럼 이상의 부피의 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트 및 0.5 M 나트륨 클로라이드(pH 7.5)로 세척함으로써 제거하였다. 표적 단백질을 20 mM 나트륨 시트레이트 및 0.5 M 나트륨 클로라이드(pH 7.5)로부터 20 mM 나트륨 시트레이트 및 0.5 M 나트륨 클로라이드(pH 2.5)로 20 컬럼 부피에 걸친 구배 동안 용출하였다. 단백질 용액을 1/10의 0.5 M 나트륨 포스페이트(pH 8)를 첨가하여 중화시켰다. 표적 단백질을 농축하고 여과한 후에, 20 mM 히스티딘 및 140 mM 나트륨 클로라이드의 용액(pH 6.0)으로 평형화된 하이로드 수퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 적재하였다.
정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 아미노산 서열에 근거하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 결정하였다.
분자의 순도 및 분자량을 환원제의 존재 및 부재하에 CE-SDS 분석에 의해 분석하였다. 캘리퍼 랩칩 GXII 시스템(캘리퍼 라이프사이언시즈)을 제조자의 설명서에 따라 사용하였다. 2 μg 샘플을 분석에 사용하였다.
항체 샘플의 응집체 함량을 25℃에서 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02% (w/v) NaN3 런닝 완충제(pH 6.7)에서 TSKgel G3000 SW XL 분석 크기 배재 컬럼(토소)을 사용하여 분석하였다.
[표 8]
Figure pct00016
도 71은 CEA TCB(도립된 2+1 교차fab-IgG P329G LALA) 분자의 계략도를 보여준다.
도 72 및 표 9는 CEA TCB(도립된 2+1 교차fab-IgG P329G LALA) 분자(서열번호 288, 322, 323 및 324)의 CE-SDS 분석을 보여준다.
[표 9]
Figure pct00017
대안적 정제 방법에서, CEA TCB를 채취되고 정화된 발효 상청액으로부터 단백질 A 친화성 크로마토그래피(Mab셀렉트 수레(MabSelect SuRe))에 의해 포획하였다. 이어서, 단백질 A 용출액을 양이온 교환 크로마토그래피(포로스(Poros) 50 HS)한 후에, 분별하고 SE-HPLC 및 모세관 전기이동으로 분석하였다. 분획을 함유하는 생성물을 풀링하고 실온에서 결합-용출(bind-elute) 모드로 소수성 상호작용 크로마토그래피(부틸-세파로스 4FF)하였다. 이어서, 이로부터 수득한 용출액을 분별하고 SE-HPLC 및 모세관 전기이동으로 분석하였다. 분획을 함유하는 생성물을 풀링한 후에, 플로우-쓰루(flow-through) 모드로 음이온 교환 로마토그래피(Q-세파로스 FF)를 수행하였다. 이 정제법을 사용하여 수득된 물질은 98% 초과의 단량체 함량을 가졌다.
실시예 13
MCSP - 및 CD3 -발현 세포에 대한 MCSP TCB 의 결합
MCSP TCB의 결합을 MCSP-발현 인간 악성 흑색종 세포주(A375) 및 CD3-발현 불멸성 T 림프구주(주르카트)에 대해 시험하였다. 요약하건데, 세포를 채취하고 계수하고 생존력에 대해 조사하고 FACS 완충제(100 μl PBS 0.1% BSA)에 2 x 106 세포/ml으로 재현탁화하였다. 100 μl 세포 현탁액(0.2 x 106 세포 함유)을 환저 96-웰 플레이트에 30분 동안 4℃에서 증가하는 농도의 MCSP TCB(2.6 pM 내지 200 nM)와 함께 항온처리하고 찬 PBS 0.1% BSA로 2회 세척하고 추가적 30분 동안 4℃에서 PE-접합된 어피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG Fcγ 단편 특이적 이차 항체(잭슨 이뮤노 리서치 랩 PE #109-116-170)와 함께 재항온처리하고 찬 PBS 0.1% BSA로 2회 세척하고 살아있는 DAPI 음성 세포를 게이팅(gating)함으로써 FACS 캔토II(소프트웨어 FACS 디바)를 사용하여 즉시 분석하였다. 결합 곡선을 그래프패드프리즘5를 사용하여 수득하였다(도 73의 A, A375 세포에 대한 결합, EC50 = 3381 pM; 도 73의 B, 주르카트 세포에 대한 결합).
실시예 14
MCSP TCB 항체에 의해 유도된 T 세포 사멸
MCSP TCB 항체에 의해 매개된 T 세포 사멸을 상이한 발현 수준의 MCSP의 종양 세포주 발현의 판넬(A375 = MCSP 높음, MV-3 = MSCP 배지, HCT-116 = MCSP 낮음, LS180 = MCSP 음성)을 사용하여 평가하였다. 요약하건데, 표적 세포를 트립신/EDTA로 채취하고 세척하고 평저 96-웰 플레이트를 사용하여 25,000 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 세포를 방치하여 밤새 부착시켰다. 말초혈 단핵세포(PBMC)를 건강한 인간 공여자로부터 수득한 농축된 림프구 제제(버피 코트)의 히스토페이크 밀도 원심분리에 의해 제조하였다. 새로운 혈액을 멸균 PBS로 희석하고 히스토페이크 구배(시그마, #H8889) 위에 층을 형성하였다. 원심분리(450 x g, 30분, 실온) 후에, PBMC-함유 계면상 위의 플라즈마를 버리고, PBMC를 새로운 팔콘 튜브 내로 옮긴 후에, 50 ml의 PBS로 충전하였다. 혼합물을 원심분리(400 x g, 10분, 실온)하고, 상청액을 버리고, PBMC 펠렛을 멸균 PBS(원심분리 단계 350 x g, 10분)로 2회 세척하였다. 생성된 PBMC 집단을 기계적으로 계수하고(ViCell) 추가적 사용까지(24시간 이하) 세포 항온기에서 37℃ 및 5% CO2에서 10% FCS 및 1% L-알라닐-L-글루타민(바이오크롬, K0302)을 함유하는 RPMI1640 배지에 저장하였다. 사멸 분석을 위해, 항체를 지시된 농도(1 pM 내지 10 nM, 삼중)로 첨가하였다. PBMC를 10:1의 최종 효과기 대 표적(E:T) 비로 표적 세포에 첨가하였다. 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 항온처리 후에, 아폽토시스/괴사 세포에 의해 세포 상청액에 방출된 LDH의 정량화에 의해(LDH 검출 키트, 로슈 어플라이드 사이언스, #11 644 793 001) 표적 세포 사멸을 평가하였다. 표적 세포의 최대 용해(= 100%)를 1% 트리톤 X-100으로 표적 세포를 항온처리함으로써 달성하였다. 최소 용해(= 0%)는 이중특이적 구축물없이 효과기 세포와 공항온처리된 표적 세포를 지칭한다. 결과는 MCSP TCB가 MCSP 음성 세포주의 사멸이 없는 MCSP 양성 표적 세포주의 강하고 표적 특이적인 사멸을 유도함을 보여준다(도 74a 및 74b의 A 내지 D). 그래프패드 프리즘5를 사용하여 계산된, 사멸 분석에 관련된 EC50 값은 표 10에 제시되어 있다.
[표 10]
Figure pct00018
실시예 15
MCSP TCB 항체에 의해 유도된 MCSP -발현 종양 세포의 T 세포 사멸 후에, CD8 + 및 CD4 + 효과기 세포에 대한 CD25 및 CD69 상향조절
MCSP TCB 항체에 의해 매개된 MCSP-발현 MV-3 종양 세포의 T 세포 사멸 후에 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 활성화를 T 세포 활성화 마커 CD25(후기 활성화 마커) 및 CD69(초기 활성화 마커)를 인식하는 항체를 사용하여 FACS 분석에 의해 평가하였다. 항체 및 사멸 분석 조건은 동일한 항체 농도 범위(1 pM 내지 10 nM, 삼중), 10:1의 E:T 비 및 24시간의 항온처리 시간을 사용하여 근본적으로 상기에 기재된 바와 같았다(실시예 14).
항온처리 후에, PBMC를 환저 96-웰 플레이트에 옮기고 350 x g에서 5분 동안 원심분리하고 0.1% BSA를 함유하는 PBS로 2회 세척하였다. CD8(FITC 항-인간 CD8, BD # 555634), CD4(PECy7 항-인간 CD4, BD # 557852), CD69(PE 항-인간 CD69, 바이오레전드 #310906) 및 CD25(APC 항-인간 CD25, BD #555434)에 대한 표면 염색을 공급자의 설명서에 따라 수행하였다. 세포를 0.1% BSA를 함유하는 150 μl/웰 PBS로 2회 세척하고, 100 μl/웰 고정 완충제(BD #554655)를 사용하여 15분 동안 4℃에서 고정시켰다. 원심분리 후에, 샘플을 DAPI를 함유하는 200 μl/웰 PBS 0.1% BSA에 재현탁화하여 FACS 측정을 위해 죽을 세포를 제외시켰다. 샘플을 BD FACS 포르테사(Fortessa)에서 분석하였다. 결과는 사멸 후에 MCSP TCB가 CD8+ T 세포(도 75a의 A 및 B) 및 CD4+ T 세포(도 75b의 C 및 D)에 대한 활성화 마커의 강하고 표적 특이적인 상향조절을 유도하는 것을 보여준다.
실시예 16
MCSP TCB 항체에 의해 유도된 MCSP -발현 종양 세포의 T 세포-사멸 후에 인간 효과기 세포에 의한 사이토카인 분비
MCSP TCB 항체에 의해 유도된 MCSP-발현 MV-3 종양 세포의 T 세포 사멸 후에 인간 PBMC의 사이토카인 분비는 사멸 분석 후에 세포 상청액의 FACS 분석에 의해 평가되었다.
동일한 항체를 사용하고, 사멸 분석을 10:1의 E:T 비 및 24시간의 항온처리 시간을 사용하여, 근본적으로 상기에 기재된 바와 같이 수행하였다(실시예 14 및 15).
항온처리 시간의 말에, 플레이트를 5분 동안 350 x g에서 원심분리하고, 상청액을 새로운 96-웰 플레이트에 옮기고 후속 분석까지 -20℃에서 저장하였다. 세포 상청액에 분비된 그랜자임 B, TNFα, IFN-γ, IL-2, IL-4 및 IL-10을 FACS 캔토II에 대한 제조자의 설명서에 따라 BD CBA 인간 가용성 단백질 플렉스 세트(Flex Set)를 사용하여 검출하였다. 하기 키트를 사용하였다: BD CBA 인간 그랜자임 B BD CBA 인간 그랜자임 B 플렉스 세트 #BD 560304; BD CBA 인간 TNF 플렉스 세트 #BD 558273; BD CBA 인간 IFN-γ 플렉스 세트 #BD 558269; BD CBA 인간 IL-2 플렉스 세트 #BD 558270; BD CBA 인간 IL-4 플렉스 세트 #BD 558272; BD CBA 인간 IL-10 플렉스 세트 #BD 558274.
결과는 사멸시 MCSP TCB가 IL-2, IFN-γ, TNFα, 그랜자임 B 및 IL-10(IL-4는 아님)의 분비를 유도함을 보여준다(도 76a 및 76b의 A 내지 F).
종합해보면, 이들 실시예는 MCSP CD3 이중특이적 항체가
- MCSP 양성 A375 세포에 대한 양호한 결합을 보여주고;
- MCSP 양성 표적 세포주의 강하고 표적 특이적인 사멸을 유도하고 MCSP 음성 세포주의 사멸을 유도하지 않고;
- 사멸 후 CD8+ 및 CD4+ T 세포에 대한 활성화 마커(CD25, CD69)의 강하고 표적 특이적인 상향조절을 유도하고;
- 사멸시 IL-2, IFN-γ, TNFα, 그랜자임 B 및 IL-10(IL-4는 아님)의 분비를 유도함
을 보여준다.
실시예17
CEA - 및 C D3 -발현 세포에 대한 CEA TCB 의 결합
CEA TCB의 결합을 형질감염된 CEA-발현 폐 선암종 세포(A549-huCEA) 및 CD3-발현 불멸성 인간 및 사이노몰구스 T 림프구주(각각 주르카트 및 HSC-F)에 대해 시험하였다. 표적화되지 않은 TCB(서열번호325, 326, 327 및 328; 실시예 33 참조)를 대조군으로서 사용하였다. 요약하건데, 세포를 채취하고 계수하고 생존력에 대해 조사하고 FACS 완충제(100 μl PBS 0.1% BSA)에 2 x 106 세포/ml으로 재현탁화하였다. 100 μl 세포 현탁액(0.2 x 106 세포 함유)을 환저 96-웰 플레이트에서 30분 동안 4℃에서 증가하는 농도의 CEA TCB(61 pM 내지 1000 nM)와 함께 항온처리하고, 찬 PBS 0.1% BSA로 2회 세척하고, 추가적 30분 동안 4℃에서 FITC-접합된 어피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG F(ab')2 단편 특이적 이차 항체(잭슨 이뮤노 리서치 랩 FITC #109-096-097)와 함께 재항온처리하고, 찬 PBS 0.1% BSA로 2회 세척하고, 살아 있는 PI 음성 세포를 게이팅함으로써 FACS 캔토II 또는 포르테사(소프트웨어 FACS 디바)를 사용하여 FACS에 의해 즉시 분석하였다. 그래프패드프리즘5를 사용하여 결합 곡선을 수득하였다(도 77의 A, A549 세포에 대한 결합(EC50 6.6 nM); 도 77의 B, 주르카트 세포에 대한 결합; 도 77의 C, HSC-F 세포에 대한 결합).
실시예 18
CEA TCB 항체에 의해 유도된 CEA -발현 종양 표적 세포의 T 세포- 매개된 사멸
CEA TCB 항체에 의해 유도된 표적 세포의 T 세포-매개된 사멸을 HPAFII(높은 CEA), BxPC-3(중간 CEA) 및 ASPC-1(낮은 CEA) 인간 종양 세포에 대해 평가하였다. HCT-116(CEA 음성 종양 세포주) 및 표적화되지 않은 TCB를 음성 대조군으로 사용하였다. 인간 PBMC를 효과기로 사용하고, 이중특이적 항체와 함께 항온처리 24시간 및 48시간 후에 사멸을 검출하였다. 요약하건데, 표적 세포를 트립신/EDTA로 채취하고 세척하고 평저 96-웰 플레이트를 사용하여 25,000 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 세포를 방치하여 밤새 부착시켰다. 말초혈 단핵세포(PBMC)를 건강한 인간 공여자로부터 수득한 농축된 림프구 제제(버피 코트)의 히스토페이크 밀도 원심분리에 의해 제조하였다. 새로운 혈액을 멸균 PBS로 희석하고 히스토페이크 구배(시그마, #H8889) 위에 층을 형성하였다. 원심분리(450 x g, 30분, 실온) 후에, PBMC-함유 계면상 위의 플라즈마를 버리고, PBMC를 새로운 팔콘 튜브 내로 옮긴 후에, 50 ml의 PBS로 충전하였다. 혼합물을 원심분리(400 x g, 10분, 실온)하고, 상청액을 버리고, PBMC 펠렛을 멸균 PBS(원심분리 단계 350 x g, 10분)로 2회 세척하였다. 생성된 PBMC 집단을 기계적으로 계수하고(ViCell) 추가적 사용까지(24시간 이하) 세포 항온기(37℃, 5% CO2)에서 10% FCS 및 1% L-알라닐-L-글루타민(바이오크롬, K0302)을 함유하는 RPMI1640 배지에 유지하였다. 사멸 분석을 위해, 항체를 지시된 농도(6 pM 내지 100 nM의 범위, 삼중)로 첨가하였다. PBMC를 10:1의 최종 E:T 비로 표적 세포에 첨가하였다. 항온처리 표적 24시간 및 48시간 후에, 세포 사멸을 아폽토시스/괴사 세포에 의해 세포 상청액에 방출된 LDH(락테이트 탈수소 효소)의 정량화(LDH 검출 키트, 로슈 어플라이드 사이언스, #11 644 793 001)에 의해 평가하였다. 표적 세포의 최대 용해(= 100%)를 1% 트리톤 X-100으로 표적 세포를 항온처리함으로써 달성하였다. 최소 용해(= 0%)는 이중특이적 항체없이 효과기 세포로 공형질감염된 표적 세포를 지칭한다. 결과는 CEA TCB가 CEA 양성 표적 세포의 강하고 표적 특이적인 사멸을 유도함을 보여준다(도 78a 및 78b의 A 내지 H). 그래프패드프리즘5를 사용하여 계산된, 사멸에 관련된 EC50 값은 표 11에 제시되어 있다.
[표 11]
Figure pct00019
실시예 19
CEA -발현 종양 표적의 세포의 CEA TCB - 매개된 사멸 5일 후 T 세포 증식 및 활성화
HPAFII(높은 CEA), BxPC-3(중간 CEA) 및 ASPC-1(낮은 CEA) 세포에 대해 평가된 CEA-발현 종양 표적 세포의 CEA TCB-매개된 사멸 5일 후 T 세포 증식 및 활성화를 검출하였다. HCT-116(CEA 음성 종양 세포주) 및 표적화되지 않은 TCB를 음성 대조군으로 사용하였다. 증식 분석에 대한 실험적 조건은 실시예 18에 기재된 것과 유사하였으나, 단 10,000개의 표적 세포를 96-평저 웰 플레이트의 웰 마다 플레이팅하였다. T 세포 증식을 평가하기 위해, 새롭게-단리된 PBMC를 CFSE(시그마 #21888)를 사용하여 표지하였다. 요약하건데, CFSE 모용액을 희석하여 100 μM의 작용 용액을 수득하였다. 90 x 106 PBMC 세포를 90 ml의 미리 가온된 PBS에 재현탁화하고 90 μl의 CFSE 작용 용액으로 보충하였다. 세포를 즉시 혼합하고 15분 동안 37℃에서에서 항온처리하였다. 10 ml의 미리 가온된 FCS를 세포에 첨가하여 반응을 중단시켰다. 세포를 10분 동안 400 g에서 원심분리하고 50 ml 배지에 재현탁화하고 30분 동안 37℃에서 항온처리하였다. 항온처리 후에, 세포를 따뜻한 배지로 1회 세척하고 계수하고 배지에 재현탁화하고 사멸 분석을 위해 표적 세포에 첨가하고 10:1의 E:T에서 세포 증식 및 활성화의 후속 측정하였다. CD4 및 CD8 양성 T 세포에 대한 사멸 5일 후 CFSE 염료 희석의 정량화에 의해 증식을 평가하였다. CD25 발현을 항-인간 CD25 항체를 사용하여 동일한 T 세포 서브세트에 대해 평가하였다. 요약하건데, 원심분리(400 x g 4분 동안) 후에, 세포를 재현탁화하고 FACS 완충제로 세척하고 25 μl의 희석된 CD4/CD8/CD25 항체 믹스로 30분 동안 4℃에서 항온처리하였다(APC/Cy7 항-인간 CD4 #317418, APC 항-인간 CD8 #301014, PE/Cy7 항-인간 CD25 #302612). 이어서, 세포를 3회 세척하여 미결합 항체를 제거하고 프로피디움 요오다이드(PI)를 함유하는 200 μl FACS 완충제에 최종적으로 재현탁화하여 FACS 측정을 위해 죽은 세포를 제외시켰다. 형광을 BD FACS 캔토II를 사용하여 측정하였다. 결과는 CEA TCB가 CD25 활성화 마커의 상향조절에 의해 검출된 바와 같이 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 강하고 표적 특이적인 증식(도 79a의 A 내지 D) 및 이들의 활성화(도 79b의 E 내지 H)를 유도함을 보여준다.
실시예 20
CEA TCB 에 의해 유도된 CEA -발현 종양 세포의 T 세포- 매개된 사멸 후 인간 효과기 세포에 의한 사이토카인 분비
CEA TCB에 의해 유도된 CEA-발현 MKN45 종양 세포의 T 세포-매개된 사멸 후 인간 PBMC에 의한 사이토카인 분비를 사멸 48시간 후에 세포 상청액의 FACS 분석(CBA 키트)에 의해 평가하였다.
실험적 조건은 실시예 18에 기재된 것과 동일하였다. 항온처리 시간의 말에, 플레이트를 5분 동안 350 x g에서 원심분리하고, 상청액을 새로운 96-웰 플레이트에 옮기고 후속 분석까지 -20℃에서 저장하였다. 세포 상청액에 분비된 (A) IFN-γ, (B) TNFα, (C) 그랜자임 B, (D) IL-2, (E) IL-6 및 (F) IL-10을 FACS 캔토II에 대한 제조자의 설명서에 따라 BD CBA 인간 가용성 단백질 플렉스 세트를 사용하여 검출하였다. 하기 키트를 사용하였다: BD CBA 인간 IL-2 BD 플렉스 세트 #BD 558270; BD CBA 인간 그랜자임 B BD 플렉스 세트 #BD 560304; BD CBA 인간 TNF 플렉스 세트 #BD 558273; BD CBA 인간 IFN-γ 플렉스 세트 #BD 558269; BD CBA 인간 IL-4 플렉스 세트 #BD 558272; BD CBA 인간 IL-10 플렉스 세트 #BD 558274.
결과는 CEA TCB-매개된 사멸(표적화되지 않은 TCB 대조군에 의해 매개된 사멸은 아님)이 IFN-γ, TNFα, 그랜자임 B, IL-2, IL-6 및 IL-10의 분비를 유도함을 보여준다(도 80a 및 80b의 A 내지 F).
실시예 21
증가하는 농도의 shed CEA ( sCEA )의 존재하에 표적 세포의 T 세포- 매개된 사멸
증가하는 농도의 shed CEA(sCEA 2.5 ng/ml 내지 5 μg/ml)의 존재하에 CEA TCB 항체에 의해 유도된 CEA-발현 종양 표적 세포(LS180)의 T 세포-매개된 사멸을 평가하였다. 인간 PBMC를 효과기 세포로 사용하고, 이중특이적 항체 및 sCEA와 함께 항온처리 24시간 및 48시간 후에 사멸을 검출하였다. 요약하건데, 표적 세포를 트립신/EDTA로 채취하고 세척하고 평저 96-웰 플레이트를 사용하여 25,000 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 세포를 방치하여 밤새 부착시켰다. 말초혈 단핵세포(PBMC)를 건강한 인간 공여자로부터 수득한 농축된 림프구 제제(버피 코트)의 히스토페이크 밀도 원심분리에 의해 제조하였다. 새로운 혈액을 멸균 PBS로 희석하고 히스토페이크 구배(시그마, #H8889) 위에 층을 형성하였다. 원심분리(450 x g, 30분, 실온) 후에, PBMC-함유 계면상 위의 플라즈마를 버리고, PBMC를 새로운 팔콘 튜브 내로 옮긴 후에, 50 ml의 PBS로 충전하였다. 혼합물을 원심분리(400 x g, 10분, 실온)하고, 상청액을 버리고, PBMC 펠렛을 멸균 PBS(원심분리 단계 350 x g, 10분)로 2회 세척하였다. 생성된 PBMC 집단을 기계적으로 계수하고(ViCell) 추가적 사용까지(24시간 이하) 세포 항온기(37℃, 5% CO2)에서 10% FCS 및 1% L-알라닐-L-글루타민(바이오크롬, K0302)을 함유하는 RPMI1640 배지에 유지하였다. 사멸 분석을 위해, CEA TCB 항체를 1 nM의 고정된 농도로 사용하고, sCEA를 2.5 ng 내지 5 μg/ml 범위의 농도로 실험에 첨가하였다. PBMC를 10:1의 최종 E:T 비로 표적 세포에 첨가하였다. 항온처리 표적 24시간 및 48시간 후에, 세포 사멸을 아폽토시스/괴사 세포에 의한 세포 상청액에 방출된 LDH(락테이트 탈수소 효소)의 정량화(LDH 검출 키트, 로슈 어플라이드 사이언스, #11 644 793 001)에 의해 평가하였다. 표적 세포의 최대 용해(= 100%)를 1% 트리톤 X-100으로 표적 세포를 항온처리함으로써 달성하였다. 최소 용해(= 0%)는 이중특이적 항체없이 효과기 세포로 공형질감염된 표적 세포를 지칭한다. sCEA의 부재하에 CEA TCB에 의해 매개된 사멸을 100%로 설정하고, 증가하는 농도의 sCEA의 존재하에 수득된 사멸을 그에 대해 표준화하였다. 결과는 sCEA가 CEA-발현 표적 세포의 CEA TCB-매개된 사멸에 대해 단지 작은 영향을 가짐을 보여준다(도 81의 A 및 B). 0.2 μg/ml의 sCEA까지는 T 세포 사멸에 대한 효과없음이 검출되었다. 0.2 μg/ml 초과의 sCEA 농도는 전체 사멸에 대한 단지 작은 영향(10 내지 50% 감소)을 가졌다.
실시예 22
효과기 세포로서 인간 및 사이노몰구스 PBMC 를 사용하는 표적 세포의 T 세포-매개된 사멸
CEA TCB 항체 및 효과기 세포로서 인간 PBMC 또는 사이노몰구스 PBMC와 함께 항온처리 21시간 및 40시간 후에 평가된 과발현 인간 CEA(A549-hCEA)에 대한 A549(폐 선암종) 세포의 T 세포-매개된 사멸을 평가하였다. 요약하건데, 표적 세포를 트립신/EDTA로 채취하고 세척하고 평저 96-웰 플레이트를 사용하여 25,000 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 세포를 방치하여 몇 시간 동안 부착시켰다. 말초혈 단핵세포(PBMC)를 건강한 인간 공여자 또는 건강한 사이노몰구스 원숭이로부터 수득한 농축된 림프구 제제(버피 코트)의 히스토페이크 밀도 원심분리에 의해 제조하였다. 후자의 경우, 90% 히스토페이크-PBS 밀도 구배를 사용하였다. 새로운 혈액을 멸균 PBS로 희석하고 히스토페이크 구배(시그마, #H8889) 위에 층을 형성하였다. 원심분리(인간 PBMC에 대해 450 x g, 30분, 실온, 또는 사이노몰구스 PBMC에 대해 520 x g, 30분, 실온) 후에, PBMC-함유 계면상 위의 플라즈마를 버리고, PBMC를 새로운 팔콘 튜브 내로 옮긴 후에, 50 ml의 PBS로 충전하였다. 혼합물을 원심분리(400 x g, 10분, 실온)하고, 상청액을 버리고, PBMC 펠렛을 멸균 PBS(원심분리 단계 350 x g, 10분)로 2회 세척하였다. 사이노몰구스 PBMC의 제조를 위해, 추가적 저속의 원심분리 단계를 150 x g에서 15분 동안 수행하였다. 생성된 PBMC 집단을 기계적으로 계수하고(ViCell) 추가적 사용까지(4시간 이하) 10% FCS 및 1% L-알라닐-L-글루타민을 함유하는 RPMI1640 배지(바이오크롬, K0302)에서 세포 항온기(37℃, 5% CO2)에서 유지하였다. 사멸 분석을 위해, 항체를 지시된 농도(6 pM 내지 100 nM의 범위, 삼중)로 첨가하였다. PBMC를 10:1의 최종 E:T 비로 표적 세포에 첨가하였다. 아폽토시스/괴사 세포에 의해 세포 상청액에 방출된 LDH(락테이트 탈수소 효소)의 정량화(LDH 검출 키트, 로슈 어플라이드 사이언스, #11 644 793 001)에 의해 항온처리 21시간 및 40시간 후에 표적 세포 사멸을 평가하였다. 표적 세포의 최대 용해(= 100%)를 1% 트리톤 X-100으로 표적 세포를 항온처리함으로써 달성하였다. 최소 용해(= 0%)는 이중특이적 항체없이 효과기 세포로 공형질감염된 표적 세포를 지칭한다. 결과는 CEA TCB가 인간(도 82의 A 및 C) 및 사이노몰구스(도 82의 B 및 D) 효과기 세포(PBMC) 둘다를 사용하여 CEA 양성 표적 세포의 표적 특이적 사멸을 매개함을 보여준다. 그래프패드프리즘5를 사용하여 계산된, 40시간의 사멸에 관련된 EC50 값은 인간 PBMC에 대해 306 pM이고 사이노몰구스 PBMC에 대해 102 pM이었다.
실시예 23
CEA TCB 항체에 의해 유도된 CEA -발현 인간 대장암 세포주의 T 세포- 매개된 사멸
0.8 nM, 4 nM 및 20 nM에서 인간 PBMC 및 CEA TCB 항체와 함께 항온처리 48시간 후에 CEA-발현 인간 대장암 세포주의 T 세포-매개된 사멸을 평가하였다. 요약하건데, PBMC를 건강한 단일 공여자로부터 수득한 백혈구 콘(cone)으로부터 단리하였다. 세포를 PBS로 희석하고(1:10) 50 mL 팔콘 튜브에서 림포프렙 상에 층을 형성하였다. 원심분리(1800 rpm, 25분 동안) 후에, PBMC 층을 계면으로부터 빼내고 4회 PBS로 세척하였다. PBMC를 계수하고 제어된 속도의 냉동 조건하에 40 x 106 세포/mL로 FCS 중 10% DMSO에서 냉동시키고 추가적 사용까지 액체 질소에 저장하였다. T 세포 사멸 분석을 위해, 종양 세포를 냉동된 저장품으로부터 96-웰 플레이트에 직접 플레이팅하였다.
세포를 신속히 가온하고 미리 가온된 배지에 즉시 옮기고 원심분리하고 완전한 배지(DMEM, 시스코브즈(Iscoves) 또는 RPMI-1640, 모두 10% FCS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충됨)에 재현탁화하고 2.5 x 104 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 이어서, 플레이트를 37℃에서 가습된 10% CO2 항온기에서 항온처리하고, 배지를 다음날 100 μL의 RPMI 2% FCS 및 1% 글루타민 및 50 μL의 CEA TCB로 대체하였다(6.4 내지 20000 pM 범위의 최종 농도, 1:5 적정 단계, 각각의 조건에 대해 이중의 웰). 새롭게 녹은 PBMC를 분석을 위해 사용하고(분석 개시 2시간 이내에 냉동된 바이알로부터 녹음), 50 μL(3 x 105)를 각각의 웰에 첨가하여 10:1의 효과기:표적(E:T) 비를 제공하였다. 트리톤 X100(50 μL, 4%)을 150 μL의 표적 세포에 첨가하여 최대 방출 값을 수득하였다. 플레이트를 37℃에서 48시간 동안 항온처리하고, 사멸 활성을 제조자의 설명서에 따라 락토스 탈수소화효소 세포독성 검출 키트(로슈)를 사용하여 결정하였다. 특이적 세포 용해의 백분율을 하기 수학식과 같이 계산하였다:
[샘플 방출 - 자발적 방출] / [최대 방출 - 자발적 방출] x 100
도 83a, 83b 및 83c는 CEA 발현(퀴피키트(QIFIKIT)를 사용하여 정량화된 수용체 복제 개수, 하기 참조)과 31개의 대장암 세포주에 대한 사멸률(%)(x 축 상에 열거됨)의 상관관계를 보여준다. 도 83d의 D는 20 nM의 CEA TCB에서 CEA 발현과 특이적 용해(%)의 상관관계(스피어만(Spearman) 상관관계 = 0.7289, p < 0.0001, n = 31)를 보여주고, 이는 높은 CEA 수용체 복제 개수(>50,000)를 나타내는 종양 세포가 CEA TCB에 의해 효율적으로 용해되는 반면에, 낮은 CEA 수용체 복제 개수(<10,000)를 나타내는 세포의 클러스터는 동일한 실험 조건하에 CEA TCB에 의해 용해되지 않음을 지시한다. 도 83d의 E는 CEA 발현과 CEA TCB의 EC50의 상관관계를 보여준다. 상관관계는 통계적으로 유의하지 않지만(스피어만 상관관계 = -0.3994, p = 0.1006, R2 = 0.1358), 그래프는 분명하게 높은 CEA 수용체 복제 개수를 나타내는 종양 세포주에 대한 보다 양호한 CEA TCB 효능의 패턴(즉, 보다 낮은 EC50 값)을 보여준다.
암 세포주에 대한 CEA 표면 발현의 분석을 위해, 퀴피키트(다코사이토메이션(DakoCytomation), 덴마크 글로스트럽 소재)를 형광 신호의 눈금 매기고 하나의 세포 당 결합 부위의 수를 결정하는 데 사용하였다. 세포를 얼음 상에 30분 동안 마우스 항-인간 CEACAM5 단일클론 항체(0.5 μg, 5 x 105 세포, 클론: CI-P83-1, sc-23928, 산타 크루즈(Santa Cruz))와 함께 항온처리하고 PBS1X-BSA 0.1%로 2회 세척한 후에 45분까지 퀴피키트와 함께 제공된 폴리클론 플루오레세인 이소티오시아네이트-접합체 염소 항-마우스 항체와 함께 항온처리하였다. 죽은 세포를 4',6-다이아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 염색을 사용하여 분석으로부터 제외시켰다. 샘플을 사이안(CyAn, 상표) ADP 분석기(베크만 쿨터(Beckman Coulter)) 상에 분석하였다. 서밋(Summit) 4.3 소프트웨어를 사용한 데이터 분석 후에, 모든 평균 형광 강도(MFI)를 수득하였다. 이들 MFI를 검량 곡선(퀴피키트 눈금 비드)으로부터 수득된 방정식을 사용하여 세포주에 대한 항체 결합 부위의 비례수(결과에 대한 CEA 복제 개수로 지칭)를 결정하는 데 사용하였다.
T 세포 사멸 분석 및 CEA 표면 발현 정량화에 사용된 대장암 세포주를 저온 유리병으로부터 시딩하였다. 냉동된 저장품을 유지하는 데 사용된 방법은 문헌[Bracht et al. (2010), Br J Cancer 103, 340-346]에 기재되어 있다.
실시예 24
인간 PBMC 와 공그래프팅된 LS174T - fluc2 인간 결장 암종(5:1의 E:T 비)에서 CEA TCB 의 생체내 항-종양 효능
NOG(NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull) 마우스(n=12)에 PBS 중의 인간 PBMC와 미리 혼합된 1x106 LS174T-fluc2 세포(5:1의 E:T 비)를 100 μl의 총 부피로 피하 주입하였다(5:1의 E:T 비). LS174T-fluc2 세포를 조작하여 루시퍼라제를 발현하고, 이는 생물발광(BLI)에 의해 비침입성의 매우 민감한 방법으로 종양 진행의 모니터링을 가능하게 하였다. 이른 처리 효과 및 지연된 처리 효과를 평가하기 위해, 종양 세포/PBMC 피하 공그래프팅 후 제1일(이른 처리) 또는 제7일(지연된 처리)에 개시하여 0.5 또는 2.5 mg/kg의 CEA TCB를 마우스에게 1주일에 2회 정맥내 주입하였다. 대조군으로서, CEA TCB과 동일한 포맷을 갖는 2.5 mg/kg의 대조군 TCB를 마우스의 한 군에 1주일에 2회 정맥내 주입하고(이 경우, LS174T-fluc2 세포가 MCSP를 발현하지 않기 때문에 MCSP TCB가 표적화되지 않은 대조군으로 제공됨), 추가적 대조군은 제1일에 PBS(비히클)만을 수용하였다. 종양 부피를 디지털 캘리퍼로 1주일에 1회 측정하였다. 또한, 마우스에 D-루시페린을 1주일에 1회 복강내 주입하고, 살아있는 종양 세포의 생물발광 방출을 IVIS 스펙트럼(펄킨 엘머(Perkin Elmer))으로 측정하였다. 연구 종결의 날에 해당하는 종양 세포 접종 후 19일까지 처리가 투여되었다. 실험의 결과를 도 84a 및 84b의 A 내지 D에 제시하였다. 결과는 상이한 연구 군((도 84a의 A 및 B) 이른 처리, (84b의 C 및 D) 지연된 처리)에서 캘리퍼(A 및 C) 및 생물발광(총 플럭스, B 및 D)에 의해 측정된 12마리의 마우스의 종양 부피로부터의 평균 및 SEM을 보여준다.
실시예 25
인간 PBMC 와 공그래프팅된 LS174T - fluc2 인간 결장 암종(1:1의 E:T 비)에서 CEA TCB 의 생체내 항-종양 효능
NOG(NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull) 마우스(n=10)에 PBS 중의 인간 PBMC와 미리 혼합된 1x106 LS174T-fluc2 세포(실시예 24 참조)를 100 μl의 총 부피로 피하 주입하였다(1:1의 E:T 비). 이른 처리 효과 및 지연된 처리 효과를 평가하기 위해, 종양 세포 접종 후 제1일(이른 처리) 또는 제7일(지연된 처리)에 개시하여 2.5 mg/kg의 CEA TCB를 마우스에게 1주일에 2회 정맥내 주입하였다. 대조군으로서, CEA TCB과 동일한 포맷을 갖는 2.5 mg/kg의 MCSP TCB를 마우스의 한 군에 1주일에 2회 정맥내 주입하고(또한 실시예 24 참조), 추가적 대조군은 제1일에 PBS(비히클)만을 수용하였다. 종양 부피를 디지털 캘리퍼로 1주일에 1회 측정하였다. 또한, 마우스에 D-루시페린을 1주일에 1회 복강내 주입하고, 살아있는 종양 세포의 생물발광 방출을 IVIS 스펙트럼(펄킨 엘머)으로 측정하였다. 연구 종결의 날에 해당하는 종양 세포 접종 후 23일까지 처리가 투여되었다. 실험의 결과를 도 85에 제시하였다. 결과는 상이한 연구 군(n=10)에서 캘리퍼(도 85의 A) 및 생물발광(도 85의 B)에 의해 측정된 종양 부피의 평균 및 SEM을 보여준다.
실시예 26
면역성 huCD3 ε/ huCEA 형질전환 마우스의 Panco2 - huCEA 오쏘토픽 종양 모델에서 마우스화된 CEA TCB 의 생체내 효능
huCD3ε/huCEA 형질전환 마우스(n=10)에 PBS 중의 2 x 105 Panco2-huCEA 세포를 10 μl의 총 부피로 췌장내 주입하였다. 뮤린 세포가 CEA를 발현하지 않기 때문에, 뮤린 췌장 암종 세포주 Panco2를 조작하여 CEA TCB에 대한 표적 항원으로서 인간 CEA를 과발현시켰다. 마우스에 0.5 mg/kg의 마우스화된 CEA TCB 또는 대조군으로서 PBS(비히클)를 1주일에 2회 정맥내 주입하고, 생존을 모니터링하였다. 동물을 임상적 증상 및 역효과의 검출에 대해 매일 제어하였다. 동물에 대한 종결 기준은 식별가능한 질병: 지저분한 털, 아치형 등, 호흡 문제, 손상된 운동 능력이다. 전체 생존으로서 결과를 도 86에 제시하였다. 결과는 시간 지점 마다 생존한 동물의 백분율을 보여준다. PBS 대조군에 대한 처리군의 유의도를 2개의 스튜던트 t 검정(p=0.078)을 사용하여 비교하였다.
실시예 27
표면 플라스몬 공명( SPR )에 의한 CEA 및 CD3 에 대한 CEA TCB 의 친화성
표면 플라스몬 공명(SPR) 실험을 25℃에서 비아코어 T100 상에 런닝 완충제로서 HBS-EP(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, 비아코어, 독일 프라이부르크 소재)를 사용하여 수행하였다.
친화성 측정을 위해, CEA TCB를 고정된 항-인간 Fab(지이 헬쓰케어 #28-9583-25)를 갖는 CM5 센서칩 표면 상에 포획하였다. 포획 IgG를 표준 아민 커플링 키트(비아코어, 독일 프라이부르크 소재)를 사용하여 pH 5.0에서 약 10,000 공명 유닛(RU)의 직접 고정에 의해 센서칩 표면에 커플링하였다.
인간 CD3ε stalk-Fc(놉)-Avi/CD3δ-stalk-Fc(홀)(각각 서열번호 378 및 379)에 대한 상호작용을 분석하기 위해, CEA TCB를 30 초 동안 50 nM에서 10 μl/분으로 포획하였다. CD3ε/CD3δ를 유동 셀을 통해 360초 동안 0.68 내지 500 nM의 농도로 30 μl/분의 유속으로 통과시켰다. 해리를 360초 동안 모니터링하였다.
CEA TCB와 재조합 종양 표적 항원 인간 NABA-avi-his(C-말단 avi 6his tag를 갖는 인간 CEACAM1의 N, A1 및 A2 도메인으로 둘러싸인 인간 CEA의 B3 도메인(CEACAM5) 함유; 서열번호 377 참조)의 상호작용의 KD 값을 TCB 분자를 40초 동안 10 μl/분으로 포착함으로써 결정하였다. 항원은 240초 동안 0.68 내지 500 nM 범위의 농도로 30 μl/분의 유속으로 유동 셀 위를 유동하였다. 해리를 240초 동안 측정하였다.
벌크 굴절률 차이를 기준 유동 셀에 대해 수득된 반응을 차감함으로써 보정하였다. 이때, 항원은 CEA보다는 HBS-EP가 주입된, 고정된 항-인간 Fab 항체를 갖는 표면 상에서 유동하였다.
수치 적분으로 1:1 랭뮤어 결합에 대한 속도 방정식을 피팅하기 위해 비아코어 T200 평가 소프트웨어(vAA, 비아코어 아베, 스웨덴 웁살라 소재)를 사용하여 동역학적 상수를 유도하였다. 상호작용의 반감기(t1 /2)를 하기 수학식을 사용하여 계산하였다:
t1 /2 = ln2/koff
CEA TCB는 인간 NABA에 대해 62 nM 및 인간 CD3ε/CD3δ에 대해 75.3 nM의 nM-범위의 KD 값으로 종양 표적 및 CD3ε/CD3δ에 결합하였다. NABA에 대한 1가 결합의 반감기는 5.3분이었고, CD3ε/CD3δ에 대한 결합의 반감기는 5.7분이었다. 동역학적 값을 하기 표 12에 요약하여 나타냈다.
[표 12]
Figure pct00020
실시예 28
표면 플라스몬 공명( SPR )에 의한 MCSP 및 CD3 에 대한 MSCP TCB 의 친화성
표면 플라스몬 공명(SPR) 실험을 25℃에서 비아코어 T100상에 런닝 완충제로서 HBS-EP(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, 비아코어, 독일 프라이부르크 소재)를 사용하여 수행하였다.
친화성 측정을 위해, MCSP TCB를 고정된 항-인간 Fab를 갖는 CM5 센서칩 표면(지이 헬쓰케어 #28-9583-25) 상에 포획하였다. 포획 IgG를 표준 아민 커플링 키트(비아코어, 독일 프라이부르크 소재)를 사용하여 pH 5.0에서 약 7,500 공명 유닛(RU)의 직접 고정에 의해 센서칩 표면에 커플링하였다. MCSP TCB를 60초 동안 30 nM에서 10 μl/분으로 포획하였다. 인간 및 사이노몰구스 MCSP D3(각각 서열번호 376 및 375 참조)을 유동 셀을 통해 90초 동안 0.024 내지 50 nM 농도에서 30 μl/분의 유속으로 통과시켰다. 인간 및 사이노몰구스 CD3ε stalk-Fc(놉)-Avi/CD3δ-stalk-Fc(홀)에 대한 농도 범위는 1.17 내지 600 nM이었다. 뮤린 MCSP(서열번호 380)와의 상호작용이 약할 것이라고 예상되었기 때문에, 이들 항원에 대한 농도를 3.9 내지 500 nM로 선택하였다. 모든 상호작용에 대한 해리를 120초 동안 모니터링하였다. 벌크 굴절률 차이를 기준 유동 셀에 대해 수득된 반응을 차감함으로써 보정하였다. 이때, 항원은 MCSP TCB보다는 HBS-EP가 주입된, 고정된 항-인간 Fab 항체를 갖는 표면 상에서 유동하였다.
수치 적분으로 1:1 랭뮤어 결합에 대한 속도 방정식을 피팅하기 위해 비아코어 T200 평가 소프트웨어(vAA, 비아코어 아베, 스웨덴 웁살라 소재)를 사용하여 동역학적 상수를 유도하였다. MCSP TCB와 뮤린 MCSP D3에 대한 상호작용을 정상 상태에서 결정하였다. 상호작용의 반감기(t1 /2)를 하기 수학식을 사용하여 계산하였다:
t1 /2 = ln2/koff
MCSP TCB는 인간 항원에 대해 0.15 nM 및 사이노몰구스 항원에 대해 0.12 nM의 pM-범위의 KD 값으로 종양 표적에 결합하였다. 재조합 CD3ε/CD3δ는 78 nM(인간) 및 104 nM(사이노몰구스)의 KD로 MCSP TCB에 의해 결합하였다. 1가 결합의 반감기는 종양 표적에 대해 260분 이하이었고, CD3ε/CD3δ에 대해 2.9분이었다. 친화성 성숙시, MCSP 항체는 재조합 뮤린 MCSP D3에 대한 일부 결합을 수득하였다. 이들 상호작용에 대한 KD 값은 mM 범위(1.6 mM)이었다. 동역학적 값을 하기 표 13에 요약하여 나타냈다.
[표 13]
Figure pct00021
실시예 29
CEA TCB 의 열적 안정성
CEA TCB의 열적 안정성을 동적 광 산란(DLS)에 의해 모니터링하였다. 0.5 mg/ml의 단백질 농도를 갖는 30 μg의 여과된 단백질 샘플을 다이나프로 플레이트 판독기(와이어트 테크놀로지 코포레이션, 미국 소재)에 중복하여 적용하였다. 반경 및 총 산란 강도를 수집하면서 온도를 0.05℃/분으로 25℃에서 75℃로 증가시켰다.
결과를 도 87에 제시하였다. CEA TCB의 응집 온도를 55℃에서 측정하였다.
실시예 30
MCSP TCB 의 열적 안정성
MCSP TCB의 열적 안정성을 동적 광 산란(DLS)에 의해 모니터링하였다. 0.5 mg/ml의 단백질 농도를 갖는 30 μg의 여과된 단백질 샘플을 다이나프로 플레이트 판독기(와이어트 테크놀로지 코포레이션, 미국 소재)에 중복하여 적용하였다. 반경 및 총 산란 강도를 수집하면서 온도를 0.05℃/분으로 25℃에서 75℃로 증가시켰다.
결과를 도 88에 제시하였다. MCSP TCB의 응집 온도를 55℃에서 측정하였다.
실시예 31
MCSP TCB 및 MCSP 1+1 교차Mab 항체에 의해 유도된 MCSP -발현 종양 표적 세포의 T 세포- 매개된 사멸
MCSP TCB 및 MCSP 1+1 교차Mab TCB(도 1a의 D에 제시된 분자 포맷을 갖는, MCSP TCB와 동일한 CD3 및 MCSP 결합 서열을 갖는 T 세포 활성화 이중특이적 항체) 항체에 의해 유도된 표적 세포의 T 세포-매개된 사멸을 A375(높은 MCSP), MV-3(중간 MCSP) 및 HCT-116(낮은 MCSP) 종양 표적 세포에 대해 평가하였다. LS180(MCSP 음성 종양 세포주)을 음성 대조군으로 사용하였다. 종양 세포 사멸을 항체 및 효과기 세포(인간 PBMC)와 함께 항온처리 24시간 및 48시간 후에 평가하였다. 요약하건데, 표적 세포를 트립신/EDTA로 채취하고 세척하고 평저 96-웰 플레이트를 사용하여 25,000 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 세포를 방치하여 밤새 부착시켰다. 말초혈 단핵세포(PBMC)를 건강한 인간 공여자로부터 수득한 농축된 림프구 제제(버피 코트)의 히스토페이크 밀도 원심분리에 의해 제조하였다. 새로운 혈액을 멸균 PBS로 희석하고 히스토페이크 구배(시그마, #H8889) 위에 층을 형성하였다. 원심분리(450 x g, 30분, 실온) 후에, PBMC-함유 계면상 위의 플라즈마를 버리고, PBMC를 새로운 팔콘 튜브 내로 옮긴 후에, 50 ml의 PBS로 충전하였다. 혼합물을 원심분리(400 x g, 10분, 실온)하고, 상청액을 버리고, PBMC 펠렛을 멸균 PBS(원심분리 단계 350 x g, 10분)로 2회 세척하였다. 생성된 PBMC 집단을 기계적으로 계수하고(ViCell) 추가적 사용까지(24시간 이하) 세포 항온기(37℃, 5% CO2)에서 10% FCS 및 1% L-알라닐-L-글루타민(바이오크롬, K0302)을 함유하는 RPMI1640 배지에 유지하였다. 사멸 분석을 위해, 항체를 지시된 농도(0.01 pM 내지 10 nM 범위, 삼중)로 첨가하였다. PBMC를 10:1의 최종 E:T 비로 표적 세포에 첨가하였다. 항온처리 표적 24시간 및 48시간 후에, 세포 사멸을 아폽토시스/괴사 세포에 의한 세포 상청액에 방출된 LDH(락테이트 탈수소 효소)의 정량화(LDH 검출 키트, 로슈 어플라이드 사이언스, #11 644 793 001)에 의해 평가하였다. 표적 세포의 최대 용해(= 100%)를 1% 트리톤 X-100으로 표적 세포를 항온처리함으로써 달성하였다. 최소 용해(= 0%)는 이중특이적 항체없이 효과기 세포로 공형질감염된 표적 세포를 지칭한다. 결과는 둘다의 시간 지점에서 모든 종양 표적 세포에 대해 MCSP 양성 표적 세포의 보다 강한 사멸을 유도하기 때문에 MCSP TCB 항체가 MCSP 1+1 교차Mab TCB보다 보다 효능있음을 보여준다(도 89a 및 89b의 A 내지 H). 그래프패드프리즘5를 사용하여 계산된, 사멸 분석에 관련된 EC50 값은 표 14에 제시되어 있다.
[표 14]
Figure pct00022
실시예 32
MCSP TCB 및 MCSP 1+1 교차Mab 항체에 의해 유도된 MCSP -발현 종양 세포의 T 세포- 매개된 사멸 후 CD8 + 및 CD4 + 효과기 세포에 대한 CD25 및 CD69 상향조절
MCSP TCB 및 MCSP 1+1 교차Mab 항체에 의해 매개된 MCSP-발현 종양 세포(A375 및 MV-3)의 T 세포 사멸 후 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 활성화를 T 세포 활성화 마커 CD25(후기 활성화 마커) 및 CD69(초기 활성화 마커)를 인식하는 항체를 사용하여 FACS 분석에 의해 평가하였다. 항체 및 사멸 분석 조건은 동일한 항체 농도 범위(0.01 pM 내지 10 nM, 삼중), 10:1의 E:T 비 및 48시간의 항온처리 시간을 사용하여 근본적으로 상기에 기재된 바와 같았다(실시예 31).
항온처리 후에, PBMC를 환저 96-웰 플레이트에 옮기고 350 x g에서 5분 동안 원심분리하고 0.1% BSA를 함유하는 PBS로 2회 세척하였다. CD8(FITC 항-인간 CD8, BD #555634), CD4(PECy7 항-인간 CD4, BD #557852), CD69(PE 항-인간 CD69, Biolegend #310906) 및 CD25(APC 항-인간 CD25, BD #555434)에 대한 표면 염색을 공급자의 설명서에 따라 수행하였다. 세포를 0.1% BSA를 함유하는 150 μl/웰 PBS로 2회 세척하고, 100 μl/웰 고정 완충제(BD #554655)를 사용하여 15분 동안 4℃에서 고정시켰다. 원심분리 후에, 샘플을 DAPI를 함유하는 200 μl/웰 PBS 0.1% BSA에 재현탁화하여 FACS 측정을 위해 죽을 세포를 제외시켰다. 샘플을 BD FACS 포르테사에서 분석하였다. 결과는 사멸 후 MCSP TCB가 CD8+ T 세포(도 90a의 A 및 B(A375 세포의 경우) 및 도 90b의 E 및 F(MV-3 세포의 경우)) 및 CD4+ T 세포(도 90a의 C 및 D(A375 세포의 경우) 및 도 90b의 G 및 H(MV-3 세포의 경우))에 대한 활성화 마커(CD25, CD69)의 강하고 표적 특이적인 상향 조절을 유도함을 보여준다. 사멸 결과에 대해 말하자면, T 세포의 활성화는 MCSP 1+1 교차Mab보다 MCSP TCB를 사용하였을 때 보다 강하였다.
실시예 33
비결합 항체로서 DP47 GS 및 항- CD3 항체로서 인간화된 CH2527 을 함유하는 DP47 GS TCB ( 도립된 2+1 교차fab- IgG P329G LALA = " 표적화되지 않은 TCB" )의 제조
"표적화되지 않은 TCB"를 상기 실험에서 대조군으로서 사용하였다. 이중특이적 항체는 CD3ε에 결합하나 임의의 다른 항원에는 결합하지 않았고, 이에 따라 임의의 표적 세포에 가교결합할 수 없었다(그리고 후속적으로 임의의 사멸을 유도할 수 없었다). 따라서, 이를 분석에서 음성 대조군으로 사용하여 비특이적 T 세포 활성화를 모니터링하였다.
중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 각각 수용자 포유동물 발현 벡터에 미리 삽입된 불변 중쇄 또는 불변 경쇄와 인 프레임으로 서브클로닝하였다. 항체 발현을 MPSV 프로모터에 의해 유도하고 CDS의 3' 말단에 합성 폴리A 신호 서열을 위치시켰다. 또한, 각각의 벡터는 EBV OriP 서열을 함유하였다.
분자를 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 포유동물 발현 벡터로 HEK293-EBNA 세포를 공형질감염시킴으로써 제조하였다. 세포를 상응하는 발현 벡터로 1:2:1:1 비("벡터 중쇄 Fc(홀)":"벡터 경쇄":"벡터 경쇄 교차fab":"벡터 중쇄 Fc(놉)-Fab교차fab")로 형질감염시켰다.
형질감염을 위해, HEK293 EBNA 세포를 CD CHO 배양 배지에서 혈청-미함유 현탁액에서 배양하였다. 제조를 위해 500 ml 진탕 플라스크에서, 4×108개의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24시간 이전에 시딩하였다. 형질감염을 위해, 세포를 5분 동안 210 x g에서 원심분리하고, 상청액을 미리 가온된 20 ml CD CHO 배지로 대체하였다. 발현 벡터를 20 ml CD CHO 배지에서 혼합하여 200 μg의 최종 양의 DNA를 수득하였다. 540 μl PEI 용액을 첨가한 후에, 혼합물을 15초 동안 와류시킨 후에, 10분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이후, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고 500 ml 진탕 플라스크에 옮기고 5% CO2 대기를 갖는 항온기에서 37℃에서에서 3시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 시간 후에, 160 ml F17 배지를 첨가하고, 세포를 24시간 동안 배양하였다. 형질감염 1일 후에, 1 mM 발프로산 및 7% 피드 1(론자)을 첨가하였다. 7일 후에, 배양 상청액을 정제를 위해 210 x g에서 15분 동안 원심분리함으로써 수집하고, 용액을 멸균 여과(0.22 μm 필터)하고, 0.01%(w/v)의 최종 농도의 나트륨 아지드를 첨가하고, 4℃에서 유지하였다.
분비된 단백질을 세포 배양 상청액으로부터 단백질 A를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 상청액을 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트 및 0.5 M 나트륨 클로라이드(40 ml, pH 7.5)로 평형화된 하이트랩 단백질 A HP 컬럼(CV=5 mL, 지이 헬쓰케어) 상에 적재하였다. 미결합된 단백질을 10 컬럼 이상의 부피의 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트 및 0.5 M 나트륨 클로라이드(pH 7.5)로 세척함으로써 제거하였다. 표적 단백질을 20 mM 나트륨 시트레이트 및 0.5 M 나트륨 클로라이드(pH 7.5)로부터 20 mM 나트륨 시트레이트 및 0.5 M 나트륨 클로라이드(pH 2.5)로 20 컬럼 부피에 걸친 구배 동안 용출하였다. 단백질 용액을 1/10의 0.5 M 나트륨 포스페이트(pH 8)를 첨가하여 중화시켰다. 표적 단백질을 농축하고 여과한 후에, 20 mM 히스티딘 및 140 mM 나트륨 클로라이드의 용액(pH 6.0)으로 평형화된 하이로드 수퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 적재하였다.
정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 아미노산 서열에 근거하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 결정하였다.
분자의 순도 및 분자량을 환원제의 존재 및 부재하에 CE-SDS 분석에 의해 분석하였다. 캘리퍼 랩칩 GXII 시스템(캘리퍼 라이프 사이언시즈)을 제조자의 설명서에 따라 사용하였다. 2 μg 샘플을 분석에 사용하였다.
25℃에서 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02 % (w/v) NaN3(pH 6.7) 런닝 완충제에서 TSKgel G3000 SW XL 분석 크기 배재 컬럼(토소)을 사용하여 항체 샘플의 응집체 함량을 분석하였다.
[표 15]
Figure pct00023
도 91 및 표 16은 비결합 항체로서 DP47 GS 및 항-CD3 항체로서 인간화된 CH2527을 함유하는 DP47 GS TCB(도립된 2+1 교차fab-IgG P329G LALA)의 CE-SDS 분석을 보여준다(서열번호325, 326, 327 및 328).
[표 16]
Figure pct00024
실시예 34
항- MCSP 항체로서 M4 -3( C1 ) ML2 ( G3 ) 및 항- CD3 항체로서 인간화된 CH2527 을 함유하는 놉- 인투 -홀 MCSP TCB hIgG 4 S228P / L325E 의 제조
돌연변이 S228P 및 L325E(SPLE)를 함유하는 인간 IgG4 Fc 영역을 갖는 놉-인투-홀 TCB를 구축화하였다. 이러한 TCB는 항-MCSP 항체로서 M4-3(C1) ML2(G3) 및 항-CD3 항체로서 인간화된 CH2527을 가졌다.
중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 각각 수용자 포유동물 발현 벡터에 미리 삽입된 불변 중쇄 또는 불변 경쇄와 인 프레임으로 서브클로닝하였다. 항체 발현을 MPSV 프로모터에 의해 유도하고 CDS의 3' 말단에 합성 폴리A 신호 서열을 위치시켰다. 또한, 각각의 벡터는 EBV OriP 서열을 함유하였다.
분자를 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 포유동물 발현 벡터로 HEK293-EBNA 세포를 공형질감염시킴으로써 제조하였다. 세포를 상응하는 발현 벡터로 1:1:2:1 비("벡터 중쇄 Fc(홀)":"벡터 경쇄 교차fab":"벡터 경쇄":"벡터 중쇄 Fc(놉) Fab교차fab")비로 형질감염시켰다.
형질감염을 위해, HEK293 EBNA 세포를 CD CHO 배양 배지에서 혈청-미함유 현탁액에서 배양하였다. 제조를 위해 500 ml 진탕 플라스크에서, 4×108개의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24시간 이전에 시딩하였다. 형질감염을 위해, 세포를 5분 동안 210 x g에서 원심분리하고, 상청액을 미리 가온된 20 ml CD CHO 배지로 대체하였다. 발현 벡터를 20 ml CD CHO 배지에서 혼합하여 200 μg의 최종 양의 DNA를 수득하였다. 540 μl PEI 용액을 첨가한 후에, 혼합물을 15초 동안 와류시킨 후에, 10분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이후, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고 500 ml 진탕 플라스크에 옮기고 3시간 동안 37℃에서 5% CO2 대기를 갖는 항온기에서 항온처리하였다. 항온처리 시간 후에, 160 ml F17 배지를 첨가하고, 세포를 24시간 동안 배양하였다. 형질감염 1일 후에, 1 mM 발프로산 및 7% 피드 1(론자)을 첨가하였다. 7일 후에, 배양 상청액을 정제를 위해 210 x g에서 15분 동안 원심분리함으로써 수집하고, 용액을 멸균 여과(0.22 μm 필터)하고, 0.01%(w/v)의 최종 농도의 나트륨 아지드를 첨가하고, 4℃에서 유지하였다.
분비된 단백질을 세포 배양 상청액으로부터 단백질 A를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 상청액을 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드 및 0.01%(v/v) 트윈-20(36 ml, pH 7.5)과 평형화된 포로스(등록상표) Mab캡쳐(MabCapture, 상표)A 관류 크로마토그래피(등록상표)미디어(CV=4 mL, 어플라이드 바이오시스템즈)로 패킹된 4 ml 컬럼 상에 적재하였다. 미결합된 단백질을 10 컬럼 이상의 부피의 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드 및 0.01%(v/v) 트윈-20(pH 7.5)으로 세척함으로써 제거하였다. 표적 단백질을 20 mM 나트륨 시트레이트 및 0.5 M 나트륨 클로라이드(pH 7.5)에서 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드 및 0.01%(v/v) 트윈-20(pH 2.5)으로 20 컬럼 부피에 걸친 구배 동안 용출하였다. 단백질 용액을 1/10의 0.5 M 나트륨 포스페이트(pH 8)를 첨가하여 중화시켰다. 표적 단백질을 농축하고 여과한 후에 20 mM 히스티딘, 140 mM 나트륨 클로라이드, 0.01%(v/v) 트윈-20 용액(pH 6.0)으로 평형화된 하이로드 수퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 적재하였다.
정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 아미노산 서열에 근거하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 결정하였다. 분자의 순도 및 분자량을 환원제의 존재 및 부재하에 CE-SDS 분석에 의해 분석하였다. 캘리퍼 랩칩 GXII 시스템(캘리퍼 라이프 사이언시즈)을 제조자의 설명서에 따라 사용하였다. 2 μg 샘플을 분석에 사용하였다. 항체 샘플의 응집체 함량을 25℃에서 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02%(w/v) NaN3 런닝 완충제(pH 6.7)에서 TSKgel G3000 SW XL 분석 크기 배재 컬럼(토소)을 사용하여 분석하였다.
놉-인투-홀 및 SPLE 돌연변이를 갖는 Fc를 지니는 인간 IgG4는 양호한 품질 및 높은 수율을 갖는 이종이량체 T 세포 이중특이적 분자를 생성하는 데 사용될 수 있다. hIgG1 놉-인투-홀 P329G LALA를 기반으로 하는 이중특이적 T 세포와 비교하여, 표 17에 나타낸 바와 같이 보다 높은 수율 및 제1 정제 단계 후 낮은 응집체 함량을 반영하였을 때 이들 분자는 보다 안정한 것으로 보였다.
[표 17]
Figure pct00025
도 92는 MCSP TCB hIgG4 S228P/L325E(서열번호 278, 319, 369 및 370) 분자의 계략도를 보여준다.
[표 18]
Figure pct00026
도 93 및 표 18은 MCSP TCB hIgG4 S228P/L325E 분자(서열번호 278, 319, 369 및 370)의 CE-SDS 분석을 보여준다.
실시예 35
MCSP - 및 CD3 -발현 세포에 대한 MCSP TCB hIgG 4 S228P / L325E 의 결합
MCSP TCB hIgG4 S228P/L325E의 결합을 MCSP-발현 인간 흑색종 세포주(MV-3) 및 CD3-발현 불멸성 T 림프구주(주르카트)에 대해 시험하였다. 요약하건데, 세포를 채취하고 계수하고 생존력에 대해 조사하고 2 x 106 세포/ml로 FACS 완충제(PBS 0.1% BSA)에 재현탁화하였다. 100 μl의 세포 현탁액(0.2 x 106 세포 함유)을 환저 96-웰 플레이트에서 30분 동안 4℃에서 증가하는 농도의 hIgG4 SPLE TCB(3 pM 내지 200 nM)와 함께 항온처리하고 찬 PBS 0.1% BSA로 2회 세척하고 추가적 30분 동안 4℃에서 PE-접합된 어피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG Fcγ 단편 특이적 이차 항체(잭슨 이뮤노 리서치 랩 PE #109-116-170)로 재현탁화하고 찬 PBS 0.1% BSA로 2회 세척하고 FACS 캔토II(소프트웨어 FACS 디바)를 사용하여 FACS에 의해 즉시 분석하였다. 결합 곡선을 그래프패드프리즘5를 사용하여 수득하였다(도 94의 A, MV-3 세포에 대한 결합, EC50 = 2029 pM; 도 94의 B, 주르카트 세포에 대한 결합).
실시예 36
MCSP TCB hIgG 4 S228P / L325E 에 의해 유도된 T 세포 사멸
MCSP TCB hIgG4 S228P/L325E에 의해 매개된 T 세포 사멸을 MCSP-발현 인간 흑색종 종양 세포(MV-3) 및 인간 PBMC와 함께 항온처리 24시간 및 48시간에 평가하였다. 요약하건데, 표적 세포를 트립신/EDTA로 채취하고 세척하고 평저 96-웰 플레이트를 사용하여 25,000 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 세포를 방치하여 밤새 부착시켰다. 말초혈 단핵세포(PBMC)를 건강한 인간 공여자로부터 수득한 농축된 림프구 제제(버피 코트)의 히스토페이크 밀도 원심분리에 의해 제조하였다. 새로운 혈액을 멸균 PBS로 희석하고 히스토페이크 구배(시그마, #H8889) 위에 층을 형성하였다. 원심분리(450 x g, 30분, 실온) 후에, PBMC-함유 계면상 위의 플라즈마를 버리고, PBMC를 새로운 팔콘 튜브 내로 옮긴 후에, 50 ml의 PBS로 충전하였다. 혼합물을 원심분리(400 x g, 10분, 실온)하고, 상청액을 버리고, PBMC 펠렛을 멸균 PBS(원심분리 단계 350 x g, 10분)로 2회 세척하였다. 생성된 PBMC 집단을 기계적으로 계수하고(ViCell) 추가적 사용까지(24시간 이하) 37℃에서 5% CO2 세포 항온기에서 10% FCS 및 1% L-알라닐-L-글루타민을 함유하는 RPMI1640 배지(바이오크롬, K0302)에 저장하였다. 사멸 분석을 위해, 항체를 지시된 농도(0.02 pM 내지 20 nM 범위, 삼중)로 첨가하였다. PBMC를 10:1의 최종 E:T 비로 표적 세포에 첨가하였다. 표적 세포 사멸을 37℃, 5% CO2에서 항온처리 24시간 및 48시간 후 아폽토시스/괴사 세포에 의해 세포 상청액에 방출된 LDH의 정량화(LDH 검출 키트, 로슈 어플라이드 사이언스, #11 644 793 001)에 의해 평가하였다. 표적 세포의 최대 용해(= 100%)를 1% 트리톤 X-100으로 표적 세포를 항온처리함으로써 달성하였다. 최소 용해(= 0%)는 이중특이적 구축물없이 효과기 세포와 공항온처리된 표적 세포를 지칭한다. 결과는 hIgG4 SPLE TCB가 MCSP 양성 표적 세포주의 강하고 표적 특이적인 사멸을 유도함을 보여준다(도 95의 A 및 B). 그래프패드프리즘5를 사용하여 계산된, 사멸 분석에 관련된 EC50 값을 표 19에 나타내었다.
[표 19]
Figure pct00027
실시예 37
항- MCSP 항체로서 M4 -3( C1 ) ML2 ( G3 ) 및 항- CD3 항체로서 인간화된 CH2527 을 함유하는 놉- 인투 -홀 MCSP TCB hIgG 4 S228P / L325E P329GLALA 의 제조
돌연변이 S228P 및 L325E(SPLE) 및 P329G LALA를 함유하는 인간 IgG4 Fc 영역을 갖는 놉-인투-홀 TCB를 구축화하였다. 이러한 TCB는 항-MCSP 항체로서 M4-3(C1) ML2(G3) 및 항-CD3 항체로서 인간화된 CH2527을 가졌다.
중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역을 각각의 수용자 포유동물 발현 벡터에 미리 삽입된 불변 중쇄 또는 불변 경쇄와 인 프레임으로 서브클로닝하였다. 항체 발현은 MPSV 프로모터에 의해 유도되고 CDS의 3' 말단에 합성 폴리A 신호 서열을 위치시켰다. 또한, 각각의 벡터는 EBV OriP 서열을 함유하였다.
분자를 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 포유동물 발현 벡터로 HEK293-EBNA 세포를 공형질감염시켜 제조하였다. 세포를 상응하는 발현 벡터로 1:1:2:1 비("벡터 중쇄 Fc(홀)":"벡터 경쇄 교차fab":"벡터 경쇄":"벡터 중쇄 Fc(놉) Fab교차fab")로 형질감염시켰다.
형질감염을 위해, HEK293 EBNA 세포를 CD CHO 배양 배지에서 혈청-미함유 현탁액에 배양하였다. 제조를 위해, 500 ml 진탕 플라스크에서, 4×108개의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24시간 전에 시딩하였다. 형질감염을 위해, 세포를 5분 동안 210 x g에서 원심분리하고, 상청액을 미리 가온된 20 ml CD CHO 배지로 대체하였다. 발현 벡터를 20 ml CD CHO 배지에 혼합하여 200 μg의 최종 양의 DNA를 수득하였다. 540 μl PEI 용액의 첨가 후에, 혼합물을 15초 동안 와류시킨 후에, 10분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이후, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고 500 ml 진탕 플라스크에 옮기고 동안 37℃까지 5% CO2 대기를 갖는 항온기에서 항온처리하였다. 항온처리 시간 후, 160 ml F17 배지를 첨가하고, 세포를 24시간 동안 배양하였다. 형질감염 1일 후, 1 mM 발프로산 및 7% 피드 1(론자)를 첨가하였다. 7일 후, 배양 상청액을 정제를 위해 15분 동안 210 x g에서 원심분리에 의해 수집하고, 용액을 멸균 여과(0.22 μm 필터)하고, 나트륨 아지드를 0.01 %(w/v)의 최종 농도로 첨가하고 4℃에서 유지하였다.
분비된 단백질을 단백질 A를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 상청액을 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드 및 0.01%(v/v) 트윈-20(36 ml, pH 7.5)로 평형화된 포로스(등록상표) Mab캡쳐(상표)A 관류 크로마토그래피(등록상표)미디어(CV=4 mL, 어플라이드 바이오시스템)로 패킹된 4 ml 컬럼 상에 적재하였다. 미결합된 단백질을 10 컬럼 이상의 부피의 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드 및 0.01%(v/v) 트윈-20(pH 7.5)으로 세척함으로써 제거하였다. 표적 단백질을 20 mM 나트륨 시트레이트 및 0.5 M 나트륨 클로라이드(pH 7.5)에서 20 mM 나트륨 시트레이트, 0.5 M 나트륨 클로라이드 및 0.01%(v/v) 트윈-20(pH 2.5)으로 20 컬럼 부피에 걸친 구배 동안 용출하였다. 단백질 용액을 1/10의 0.5 M 나트륨 포스페이트(pH 8)를 첨가함으로써 중화시켰다. 표적 단백질을 농축하고 여과한 후에, 20 mM 히스티딘, 140 mM 나트륨 클로라이드 및 0.01%(v/v) 트윈-20 용액(pH 6.0)으로 평형화된 하이로드 수퍼덱스 200 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 적재하였다.
정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를 아미노산 서열에 근거하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 280 nm에서 광학 밀도(OD) 측정함으로써 결정하였다. 분자의 순도 및 분자량을 환원제의 존재 및 부재하에 CE-SDS 분석에 의해 분석하였다. 캘리퍼 랩칩 GXII 시스템(캘리퍼 라이프사이언스)을 제조자의 설명서에 따라 사용하였다. 2 μg 샘플을 분석에 사용하였다. 항체 샘플의 응집체 함량을 25℃에서 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02 %(w/v) NaN3 런닝 완충제(pH 6.7)에서 TSKgel G3000 SW XL 분석 크기 배재 컬럼(토소)을 사용하여 분석하였다.
실시예 38
MCSP - 및 CD3 -발현 세포에 대한 MCSP TCB hIgG 4 S228P / L325E P329G 의 결합
MCSP TCB hIgG4 S228P/L325E P329G의 결합을 MCSP-발현 인간 흑색종 세포주(MV-3) 및 CD3-발현 불멸성 T 림프구주(주르카트)에 대해 시험하였다. 요약하건데, 세포를 채취하고 계수하고 생존력에 대해 조사하고 2 x 106 세포/ml로 FACS 완충제(PBS 0.1% BSA)에 재현탁화하였다. 100 μl의 세포 현탁액(0.2 x 106 세포 함유)을 환저 96-웰 플레이트에 30분 동안 4℃에서 증가하는 농도의 hIgG4 SPLE PG TCB(3 pM 내지 200 nM)와 함께 항온처리하고 찬 PBS 0.1% BSA로 2회 세척하고, 추가적 30분 동안 4℃에서 PE-접합된 어피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG Fcγ 단편 특이적 이차 항체(잭슨 이뮤노 리서치 랩 PE #109-116-170)와 함께 재항온처리하고 찬 PBS 0.1% BSA로 2회 세척하고 FACS 캔토II(소프트웨어 FACS 디바)를 사용하여 FACS에 의해 즉시 분석하였다. 그래프패드프리즘5를 사용하여 결합 곡선을 수득하였다.
실시예 39
MCSP TCB hIgG 4 S228P / L325E P329G 에 의해 유도된 T 세포 사멸
MCSP TCB hIgG4 S228P/L325E에 의해 매개된 T 세포 사멸을 항온처리 24시간 및 48시간에 MCSP-발현 인간 흑색종 종양 세포(MV-3) 및 인간 PBMC를 사용하여 평가하였다. 요약하건데, 표적 세포를 트립신/EDTA로 채취하고 세척하고 평저 96-웰 플레이트를 사용하여 25,000 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 세포를 방치하여 밤새 부착하였다. 말초혈 단핵세포(PBMC)를 건강한 인간 공여자로부터 수득한 농축된 림프구 제제(버피 코트)의 히스토페이크 밀도 원심분리에 의해 제조하였다. 새로운 혈액을 멸균 PBS로 희석하고 히스토페이크 구배(시그마, #H8889) 위에 층을 형성하였다. 원심분리(450 x g, 30분, 실온) 후에, 플라즈마를 PBMC-함유 계면상 위의 혈청을 버리고, PBMC를 새로운 팔콘 튜브로 옮긴 후에, 50 ml의 PBS로 충전하였다. 혼합물을 원심분리(400 x g, 10분, 실온)하고, 상청액을 버리고, PBMC 펠렛을 멸균 PBS(원심분리 단계 350 x g, 10분)로 2회 세척하였다. 생성된 PBMC 집단을 기계적으로 계수하고(ViCell) 추가적 사용까지(24시간 이하) 세포 항온기에서 37℃ 및 5% CO2에서 10% FCS 및 1% L-알라닐-L-글루타민(바이오크롬, K0302)을 함유하는 RPMI1640 배지에 저장하였다. 사멸 분석을 위해, 항체를 지시된 농도(0.02 pM 내지 20 nM 범위, 삼중)로 첨가하였다. PBMC를 10:1의 최종 E:T 비로 표적 세포에 첨가하였다. 표적 세포 사멸을 37℃, 5% CO2에서 항온처리 24시간 및 48시간 후에 아폽토시스/괴사 세포에 의해 세포 상청액에 방출된 LDH의 정량화(LDH 검출 키트, 로슈 어플라이드 사이언스, #11 644 793 001)에 의해 평가하였다. 표적 세포의 최대 용해(= 100%)를 1% 트리톤 X-100로 표적 세포를 항온처리함으로써 달성하였다. 최소 용해(= 0%)는 이중특이적 구축물없이 효과기 세포와 공항온처리된 표적 세포를 지칭한다.
서열번호 371 및 372는 IgG4 SPLE PG 중쇄에 관한 것이고, 서열번호 278 및 319는 경쇄에 관한 것이다.
상기 발명이 명확한 이해를 목적으로 예증 및 예시에 의해 다소 상세히 기재되어 있지만, 상기 설명 및 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것으로서 해석되어서는 안 된다. 본원에서 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 전체적으로 명확히 참고로 도입된다.
SEQUENCE LISTING <110> Roche Glycart AG <120> Bispecific T cell activating antigen binding molecules <130> 31466 <140> PCT/EP2014/053489 <141> 2014-02-24 <150> EP 13156673.9 <151> 2013-02-26 <160> 380 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 700 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V9 (scFab)-Fc(hole) P329G LALA <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 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gcgccagaag cggctactac ggcgacagcg actggtactt cgacgtgtgg 1080 ggccagggca cactggtcac cgtgtccagc gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc 1140 ctggcaccct cctccaagag cacctctggg ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag 1200 gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg 1260 cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc 1320 gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc tacatctgca acgtgaatca caagcccagc 1380 aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca 1440 ccgtgcccag cacctgaagc tgcaggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 1500 aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 1560 cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 1620 aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 1680 gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 1740 ctcggcgccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1800 gtgtgcaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctctcgtgc 1860 gcagtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1920 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctcgtg 1980 agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 2040 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 2100 tga 2103 <210> 3 <211> 442 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC007 (VH-CH1)-Fc(knob) P329G LALA <400> 3 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 100 105 110 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 115 120 125 Ser Thr Ser Gly 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gggctgcctg 420 gtgaaggact acttccccga gcctgtgaca gtgagctgga acagcggagc cctgaccagc 480 ggcgtgcaca ccttccccgc cgtgctccag agcagcggcc tgtacagcct gagcagcgtg 540 gtgacagtgc ccagcagcag cctgggcacc aagacctaca cctgtaacgt ggaccacaag 600 cccagcaaca ccaaggtgga caagcgggtg gagagcaagt acggccctcc ctgccccccc 660 tgccctgccc ctgagttcga gggcggacct agcgtgttcc tgttcccccc caagcctaag 720 gacaccctga tgatcagcag aacccccgag gtgacctgtg tggtggtgga tgtgagccag 780 gaggaccctg aggtccagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca caatgccaag 840 accaagccca gggaggagca gttcaatagc acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg 900 ctgcaccagg attggctgaa cggcaaggaa tacaagtgta aggtgtccaa caagggcctg 960 cctagcagca tcgagaaaac catcagcaag gccaagggcc agcccagaga accccaggtg 1020 tgcaccctgc cccctagcca ggaagagatg accaagaacc aggtgtccct gagctgtgcg 1080 gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaacgg ccagcctgag 1140 aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg gacagcgatg gcagcttctt cctggtcagc 1200 aggctgaccg tggacaagag cagatggcag gagggcaacg tctttagctg ctccgtgatg 1260 cacgaggccc tgcacaatca ctacacccag aagagcctga gcctgtccct gggcaag 1317 <210> 375 <211> 643 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 375 Leu Ser Leu Glu Gly Ser Arg Thr Leu Thr Val Cys Pro Gly Ser Val 1 5 10 15 Gln Pro Leu Ser Ser Gln Thr Leu Arg Ala Ser Ser Ser Ala Gly Thr 20 25 30 Asp Pro Gln Leu Leu Leu Tyr Arg Val Val Arg Gly Pro Gln Leu Gly 35 40 45 Arg Leu Phe His Ala Gln Gln Asp Ser Thr Gly Glu Ala Leu Val Asn 50 55 60 Phe Thr Gln Ala Glu Val Tyr Ala Gly Asn Ile Leu Tyr Glu His Glu 65 70 75 80 Met Pro Thr Glu Pro Phe Trp Glu Ala His Asp Thr Leu Glu Leu Gln 85 90 95 Leu Ser Ser Pro Pro Ala Arg Asp Val Ala Ala Thr Leu Ala Val Ala 100 105 110 Val Ser Phe Glu Ala Ala Cys Pro Gln Arg Pro Ser His Leu Trp Lys 115 120 125 Asn Lys Gly Leu Trp Val Pro Glu Gly Gln Arg Ala Lys Ile Thr Met 130 135 140 Ala Ala Leu Asp Ala Ser Asn Leu Leu Ala Ser Val Pro Ser Pro Gln 145 150 155 160 Arg Leu Glu His Asp Val Leu Phe Gln Val Thr Gln Phe Pro Ser Arg 165 170 175 Gly Gln Leu Leu Val Ser Glu Glu Pro Leu His Ala Gly Gln Pro His 180 185 190 Phe Leu Gln Ser Gln Leu Ala Ala Gly Gln Leu Val Tyr Ala His Gly 195 200 205 Gly Gly Gly Thr Gln Gln Asp Gly Phe His Phe Arg Ala His Leu Gln 210 215 220 Gly Pro Ala Gly Ala Thr Val Ala Gly Pro Gln Thr Ser Glu Ala Phe 225 230 235 240 Ala Ile Thr Val Arg Asp Val Asn Glu Arg Pro Pro Gln Pro Gln Ala 245 250 255 Ser Val Pro Leu Arg Ile Thr Arg Gly Ser Arg Ala Pro Ile Ser Arg 260 265 270 Ala Gln Leu Ser Val Val Asp Pro Asp Ser Ala Pro Gly Glu Ile Glu 275 280 285 Tyr Glu Val Gln Arg Ala Pro His Asn Gly Phe Leu Ser Leu Val Gly 290 295 300 Gly Gly Pro Gly Pro Val Thr His Phe Thr Gln Ala Asp Val Asp Ser 305 310 315 320 Gly Arg Leu Ala Phe Val Ala Asn Gly Ser Ser Val Ala Gly Val Phe 325 330 335 Gln Leu Ser Met Ser Asp Gly Ala Ser Pro Pro Leu Pro Met Ser Leu 340 345 350 Ala Val Asp Ile Leu Pro Ser Ala Ile Glu Val Gln Leu Gln Ala Pro 355 360 365 Leu Glu Val Pro Gln Ala Leu Gly Arg Ser Ser Leu Ser Gln Gln Gln 370 375 380 Leu Arg Val Val Ser Asp Arg Glu Glu Pro Glu Ala Ala Tyr Arg Leu 385 390 395 400 Ile Gln Gly Pro Lys Tyr Gly His Leu Leu Val Gly Gly Arg Pro Ala 405 410 415 Ser Ala Phe Ser Gln Leu Gln Ile Asp Gln Gly Glu Val Val Phe Ala 420 425 430 Phe Thr Asn Phe Ser Ser Ser His Asp His Phe Arg Val Leu Ala Leu 435 440 445 Ala Arg Gly Val Asn Ala Ser Ala Val Val Asn Ile Thr Val Arg Ala 450 455 460 Leu Leu His Val Trp Ala Gly Gly Pro Trp Pro Gln Gly Ala Thr Leu 465 470 475 480 Arg Leu Asp Pro Thr Ile Leu Asp Ala Gly Glu Leu Ala Asn Arg Thr 485 490 495 Gly Ser Val Pro His Phe Arg Leu Leu Glu Gly Pro Arg His Gly Arg 500 505 510 Val Val Arg Val Pro Arg Ala Arg Thr Glu Pro Gly Gly Ser Gln Leu 515 520 525 Val Glu Gln Phe Thr Gln Gln Asp Leu Glu Asp Gly Arg Leu Gly Leu 530 535 540 Glu Val Gly Arg Pro Glu Gly Arg Ala Pro Ser Pro Thr Gly Asp Ser 545 550 555 560 Leu Thr Leu Glu Leu Trp Ala Gln Gly Val Pro Pro Ala Val Ala Ser 565 570 575 Leu Asp Phe Ala Thr Glu Pro Tyr Asn Ala Ala Arg Pro Tyr Ser Val 580 585 590 Ala Leu Leu Ser Val Pro Glu Ala Thr Arg Met Glu Ala Gly Lys Pro 595 600 605 Glu Ser Ser Thr Pro Thr Gly Glu Pro Gly Pro Met Ala Ser Ser Pro 610 615 620 Val Pro Ala Val Ala Lys Gly Gly Phe Leu Gly Phe Leu Glu Ala Asn 625 630 635 640 Met Phe Ser <210> 376 <211> 643 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 376 Leu Ser Leu Lys Gly Ser Gln Thr Leu Thr Val Cys Pro Gly Ser Val 1 5 10 15 Gln Pro Leu Ser Ser Gln Thr Leu Arg Ala Ser Ser Ser Ala Gly Thr 20 25 30 Asp Pro Gln Leu Leu Leu Tyr Arg Val Val Arg Gly Pro Gln Leu Gly 35 40 45 Arg Leu Phe His Ala Gln Gln Asp Ser Thr Gly Glu Ala Leu Val Asn 50 55 60 Phe Thr Gln Ala Glu Val Tyr Ala Gly Asn Ile Leu Tyr Glu His Glu 65 70 75 80 Met Pro Pro Glu Pro Phe Trp Glu Ala His Asp Thr Leu Glu Leu Gln 85 90 95 Leu Ser Ser Pro Pro Ala Arg Asp Val Ala Ala Thr Leu Ala Val Ala 100 105 110 Val Ser Phe Glu Ala Ala Cys Pro Gln His Pro Ser His Leu Trp Lys 115 120 125 Asn Lys Gly Leu Trp Val Pro Glu Gly Gln Arg Ala Arg Ile Thr Val 130 135 140 Ala Ala Leu Asp Ala Ser Asn Leu Leu Ala Ser Val Pro Ser Pro Gln 145 150 155 160 Arg Ser Glu His Asp Val Leu Phe Gln Val Thr Gln Phe Pro Ser Arg 165 170 175 Gly Gln Leu Leu Val Ser Glu Glu Pro Leu His Ala Gly Gln Pro His 180 185 190 Phe Leu Gln Ser Gln Leu Ala Ala Gly Gln Leu Val Tyr Ala His Gly 195 200 205 Gly Gly Gly Thr Gln Gln Asp Gly Phe His Phe Arg Ala His Leu Gln 210 215 220 Gly Pro Ala Gly Ala Ser Val Ala Gly Pro Gln Thr Ser Glu Ala Phe 225 230 235 240 Ala Ile Thr Val Arg Asp Val Asn Glu Arg Pro Pro Gln Pro Gln Ala 245 250 255 Ser Val Pro Leu Arg Leu Thr Arg Gly Ser Arg Ala Pro Ile Ser Arg 260 265 270 Ala Gln Leu Ser Val Val Asp Pro Asp Ser Ala Pro Gly Glu Ile Glu 275 280 285 Tyr Glu Val Gln Arg Ala Pro His Asn Gly Phe Leu Ser Leu Val Gly 290 295 300 Gly Gly Leu Gly Pro Val Thr Arg Phe Thr Gln Ala Asp Val Asp Ser 305 310 315 320 Gly Arg Leu Ala Phe Val Ala Asn Gly Ser Ser Val Ala Gly Ile Phe 325 330 335 Gln Leu Ser Met Ser Asp Gly Ala Ser Pro Pro Leu Pro Met Ser Leu 340 345 350 Ala Val Asp Ile Leu Pro Ser Ala Ile Glu Val Gln Leu Arg Ala Pro 355 360 365 Leu Glu Val Pro Gln Ala Leu Gly Arg Ser Ser Leu Ser Gln Gln Gln 370 375 380 Leu Arg Val Val Ser Asp Arg Glu Glu Pro Glu Ala Ala Tyr Arg Leu 385 390 395 400 Ile Gln Gly Pro Gln Tyr Gly His Leu Leu Val Gly Gly Arg Pro Thr 405 410 415 Ser Ala Phe Ser Gln Phe Gln Ile Asp Gln Gly Glu Val Val Phe Ala 420 425 430 Phe Thr Asn Phe Ser Ser Ser His Asp His Phe Arg Val Leu Ala Leu 435 440 445 Ala Arg Gly Val Asn Ala Ser Ala Val Val Asn Val Thr Val Arg Ala 450 455 460 Leu Leu His Val Trp Ala Gly Gly Pro Trp Pro Gln Gly Ala Thr Leu 465 470 475 480 Arg Leu Asp Pro Thr Val Leu Asp Ala Gly Glu Leu Ala Asn Arg Thr 485 490 495 Gly Ser Val Pro Arg Phe Arg Leu Leu Glu Gly Pro Arg His Gly Arg 500 505 510 Val Val Arg Val Pro Arg Ala Arg Thr Glu Pro Gly Gly Ser Gln Leu 515 520 525 Val Glu Gln Phe Thr Gln Gln Asp Leu Glu Asp Gly Arg Leu Gly Leu 530 535 540 Glu Val Gly Arg Pro Glu Gly Arg Ala Pro Gly Pro Ala Gly Asp Ser 545 550 555 560 Leu Thr Leu Glu Leu Trp Ala Gln Gly Val Pro Pro Ala Val Ala Ser 565 570 575 Leu Asp Phe Ala Thr Glu Pro Tyr Asn Ala Ala Arg Pro Tyr Ser Val 580 585 590 Ala Leu Leu Ser Val Pro Glu Ala Ala Arg Thr Glu Ala Gly Lys Pro 595 600 605 Glu Ser Ser Thr Pro Thr Gly Glu Pro Gly Pro Met Ala Ser Ser Pro 610 615 620 Glu Pro Ala Val Ala Lys Gly Gly Phe Leu Ser Phe Leu Glu Ala Asn 625 630 635 640 Met Phe Ser <210> 377 <211> 428 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NABA-avi-his <400> 377 Gln Leu Thr Thr Glu Ser Met Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly Lys Glu 1 5 10 15 Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln Gln Leu Phe Gly Tyr Ser 20 25 30 Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Val Gly Tyr 35 40 45 Ala Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Asn Ser Gly Arg 50 55 60 Glu Thr Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Val Thr Gln 65 70 75 80 Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu Gln Val Ile Lys Ser Asp Leu Val 85 90 95 Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe His Val Tyr Pro Glu Leu Pro Lys 100 105 110 Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Asp Lys Asp Ala 115 120 125 Met Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Thr Thr Tyr Leu Trp 130 135 140 Trp Ile Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser 145 150 155 160 Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr Arg Asn Asp Thr 165 170 175 Gly Pro Tyr Glu Cys Glu Ile Gln Asn Pro Val Ser Ala Asn Arg Ser 180 185 190 Asp Pro Val Thr Leu Asn Val Thr Tyr Gly Pro Asp Thr Pro Thr Ile 195 200 205 Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu Ser 210 215 220 Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln Tyr Ser Trp Arg Ile Asn 225 230 235 240 Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu Phe Ile Ala Lys Ile Thr 245 250 255 Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe Val Ser Asn Leu Ala Thr 260 265 270 Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile Thr Val Ser Ala Leu Ser 275 280 285 Pro Val Val Ala Lys Pro Gln Ile Lys Ala Ser Lys Thr Thr Val Thr 290 295 300 Gly Asp Lys Asp Ser Val Asn Leu Thr Cys Ser Thr Asn Asp Thr Gly 305 310 315 320 Ile Ser Ile Arg Trp Phe Phe Lys Asn Gln Ser Leu Pro Ser Ser Glu 325 330 335 Arg Met Lys Leu Ser Gln Gly Asn Ile Thr Leu Ser Ile Asn Pro Val 340 345 350 Lys Arg Glu Asp Ala Gly Thr Tyr Trp Cys Glu Val Phe Asn Pro Ile 355 360 365 Ser Lys Asn Gln Ser Asp Pro Ile Met Leu Asn Val Asn Tyr Asn Ala 370 375 380 Leu Pro Gln Glu Asn Leu Ile Asn Val Asp Leu Glu Val Leu Phe Gln 385 390 395 400 Gly Pro Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu 405 410 415 Trp His Glu Ala Arg Ala His His His His His His 420 425 <210> 378 <211> 360 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3e stalk-Fc(knob)-Avi <400> 378 Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys 1 5 10 15 Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro 20 25 30 Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp 35 40 45 Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys 50 55 60 Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg 65 70 75 80 Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg 85 90 95 Val Ser Glu Asn Cys Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser 100 105 110 Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 115 120 125 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 130 135 140 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 145 150 155 160 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 165 170 175 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 180 185 190 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 195 200 205 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 210 215 220 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 225 230 235 240 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys 245 250 255 Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 260 265 270 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 275 280 285 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 290 295 300 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 305 310 315 320 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 325 330 335 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu 340 345 350 Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 355 360 <210> 379 <211> 325 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3d stalk-Fc(hole) <400> 379 Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg Val Phe Val Asn Cys 1 5 10 15 Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val Gly Thr Leu Leu Ser 20 25 30 Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile Leu Asp Pro Arg Gly 35 40 45 Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys Asp Lys Glu Ser Thr 50 55 60 Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Arg Ser Glu Gln Leu Tyr Phe Gln 65 70 75 80 Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 85 90 95 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 100 105 110 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 115 120 125 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 130 135 140 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 145 150 155 160 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 165 170 175 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 180 185 190 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 195 200 205 Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 210 215 220 Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 225 230 235 240 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 245 250 255 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr 260 265 270 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 275 280 285 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 290 295 300 Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys 305 310 315 320 Ile Glu Trp His Glu 325 <210> 380 <211> 658 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 380 Leu Ser Leu Glu Gly Thr Arg Lys Leu Thr Val Cys Pro Glu Ser Val 1 5 10 15 Gln Pro Leu Ser Ser Gln Ser Leu Ser Ala Ser Ser Ser Thr Gly Ala 20 25 30 Asp Pro Arg His Leu Leu Tyr Arg Val Val Arg Gly Pro Gln Leu Gly 35 40 45 Arg Leu Leu His Ala Gln Gln Gly Ser Ala Glu Glu Val Leu Val Asn 50 55 60 Phe Thr Gln Ala Glu Val Asn Ala Gly Asn Ile Leu Tyr Glu His Glu 65 70 75 80 Met Ser Ser Glu Pro Phe Trp Glu Ala His Asp Thr Ile Gly Leu Leu 85 90 95 Leu Ser Ser Pro Pro Ala Arg Asp Leu Ala Ala Thr Leu Ala Val Met 100 105 110 Val Ser Phe Asp Ala Ala Cys Pro Gln Arg Pro Ser Arg Leu Trp Lys 115 120 125 Asn Lys Gly Leu Trp Val Pro Glu Gly Gln Arg Ala Lys Ile Thr Val 130 135 140 Ala Ala Leu Asp Ala Ala Asn Leu Leu Ala Ser Val Pro Ala Ser Gln 145 150 155 160 Arg Ser Arg His Asp Val Leu Phe Gln Val Thr Gln Phe Pro Thr Arg 165 170 175 Gly Gln Leu Leu Val Ser Glu Glu Pro Leu His Ala Arg Arg Pro Tyr 180 185 190 Phe Leu Gln Ser Glu Leu Ala Ala Gly Gln Leu Val Tyr Ala His Gly 195 200 205 Gly Gly Gly Thr Gln Gln Asp Gly Phe Arg Phe Arg Ala His Leu Gln 210 215 220 Gly Pro Thr Gly Thr Ser Val Ala Gly Pro Gln Thr Ser Glu Ala Phe 225 230 235 240 Val Ile Thr Val Arg Asp Val Asn Glu Arg Pro Pro Gln Pro Gln Ala 245 250 255 Ser Ile Pro Leu Arg Val Thr Arg Gly Ser Arg Ala Pro Val Ser Arg 260 265 270 Ala Gln Leu Ser Val Val Asp Pro Asp Ser Ala Pro Gly Glu Ile Glu 275 280 285 Tyr Glu Val Gln Arg Ala Pro His Asn Gly Phe Leu Ser Leu Ala Gly 290 295 300 Asp Asn Thr Gly Pro Val Thr His Phe Thr Gln Ala Asp Val Asp Ala 305 310 315 320 Gly Arg Leu Ala Phe Val Ala Asn Gly Ser Ser Val Ala Gly Val Phe 325 330 335 Gln Leu Ser Met Ser Asp Gly Ala Ser Pro Pro Ile Pro Met Ser Leu 340 345 350 Ala Val Asp Val Leu Pro Ser Thr Ile Glu Val Gln Leu Arg Ala Pro 355 360 365 Leu Glu Val Pro Gln Ala Leu Gly Arg Thr Ser Leu Ser Arg Gln Gln 370 375 380 Leu Gln Val Ile Ser Asp Arg Glu Glu Pro Asp Val Ala Tyr Arg Leu 385 390 395 400 Thr Gln Gly Pro Leu Tyr Gly Gln Leu Leu Val Gly Gly Gln Pro Ala 405 410 415 Ser Ala Phe Ser Gln Leu Gln Val Asp Gln Gly Asp Val Val Phe Val 420 425 430 Phe Thr Asn Phe Ser Ser Ser Gln Asp His Phe Lys Val Val Ala Leu 435 440 445 Ala Arg Gly Val Asn Ala Ser Ala Thr Val Asn Val Thr Val Gln Ala 450 455 460 Leu Leu His Val Trp Ala Gly Gly Pro Trp Pro Gln Gly Thr Thr Leu 465 470 475 480 Arg Leu Asp Pro Thr Val Leu Asp Ala Ser Glu Leu Ala Asn Arg Thr 485 490 495 Gly Ser Met Pro His Phe Arg Leu Leu Ala Gly Pro Arg Tyr Gly Arg 500 505 510 Val Val Arg Val Ser Gln Gly Arg Thr Glu Ser Arg Ser Asn Gln Leu 515 520 525 Val Glu His Phe Thr Gln Arg Asp Leu Glu Glu Gly Gln Leu Gly Leu 530 535 540 Glu Val Gly Lys Pro Glu Gly Arg Ser Thr Gly Pro Ala Gly Asp Arg 545 550 555 560 Leu Thr Leu Glu Leu Trp Ala Lys Gly Val Pro Pro Ala Val Ala Leu 565 570 575 Leu Asp Phe Ala Thr Glu Pro Tyr His Ala Ala Lys Ser Tyr Ser Val 580 585 590 Ala Leu Leu Ser Val Pro Glu Ala Val Arg Thr Glu Thr Glu Lys Pro 595 600 605 Gly Arg Ser Val Pro Thr Gly Gln Pro Gly Gln Ala Ala Ser Ser Pro 610 615 620 Val Pro Thr Ala Ala Lys Gly Gly Val Asp Gly Leu Asn Asp Ile Phe 625 630 635 640 Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Ala Arg Ala His His His His 645 650 655 His His

Claims (54)

  1. 제1 항원 결합 모이어티 및 제2 항원 결합 모이어티, 및 안정한 결합을 형성할 수 있는 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛으로 구성된 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자로서,
    상기 제1 항원 결합 모이어티 및 제2 항원 결합 모이어티 중 하나가 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고, 나머지 하나가 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자이고,
    상기 제1 항원 결합 모이어티가
    (a) Fab 경쇄와 Fab 중쇄가 펩티드 연결자에 의해 연결되어 있는 단일 쇄 Fab 분자, 또는
    (b) Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역이 교환되어 있는 교차 Fab 분자
    인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이하의 항원 결합 모이어티를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    제1 항원 결합 모이어티 및 제2 항원 결합 모이어티가 임의적으로 펩티드 연결자를 통해 서로 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C-말단에서 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    제1 항원 결합 모이어티가 교차 Fab 분자이고, 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 및 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄가 임의적으로 펩티드 연결자를 통해 서로 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 제2 항원 결합 모이어티가 Fab 경쇄의 C-말단에서 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄의 N-말단에 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  8. 제1항 내지 제3항, 제5항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 제2 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 서브유닛 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 서브유닛 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    제1 항원 결합 모이어티 및 제2 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 각각 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자인 제3 항원 결합 모이어티를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  12. 제11항에 있어서,
    제3 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 서브유닛 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    제2 항원 결합 모이어티 및 제3 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 각각 융합되어 있고, 제1 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C-말단에서 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  14. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    제1 항원 결합 모이어티 및 제3 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 각각 융합되어 있고, 제2 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되어 있는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    IgG4 Fc 도메인이 인간 IgG4 Fc 도메인인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    IgG4 Fc 도메인이 위치 S228(카바트 넘버링)에서 아미노산 치환을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 아미노산 치환이 S228P인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인이 Fc 도메인의 1 서브유닛 및 제2 서브유닛의 결합을 촉진하는 변경을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  19. 제18항에 있어서,
    Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기를 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환함으로써, 돌출부를 제2 서브유닛의 CH3 도메인 내의 캐비티에 위치할 수 있는 제1 서브유닛의 CH3 도메인 내에서 발생시키고, Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기를 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환함으로써, 캐비티를 제1 서브유닛의 CH3 도메인 내의 돌출부가 위치할 수 있는 제2 서브유닛의 CH3 도메인 내에서 발생시키는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인이 천연 IgG4 Fc 도메인에 비해 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타내는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인이 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 하나 이상의 아미노산 치환이 L235 및 P329(카바트 넘버링)의 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 존재하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  23. 제22항에 있어서,
    위치 L235에서의 상기 아미노산 치환이 L235E이고, 위치 P329에서의 상기 아미노산 치환이 P329G인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    IgG4 Fc 도메인의 각각의 서브유닛이 아미노산 치환 L235E 및 S228P를 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    IgG4 Fc 도메인의 각각의 서브유닛이 아미노산 치환 L235E, S228P 및 P329G를 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  26. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 수용체가 Fcγ 수용체인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  27. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    효과기 기능이 항체 의존적 세포-매개된 세포독성(ADCC)인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    활성화 T 세포 항원이 CD3인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  29. 제28항에 있어서,
    제1 항원 결합 모이어티가 서열번호 270의 중쇄 CDR1, 서열번호 271의 중쇄 CDR2, 서열번호 272의 중쇄 CDR3, 서열번호 274의 경쇄 CDR1, 서열번호 275의 경쇄 CDR2 및 서열번호 276의 경쇄 CDR3을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서,
    제1 항원 결합 모이어티가 서열번호 269와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 273과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 세포 항원이 흑색종 관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP), 표피 성장인자 수용체(EGFR), CD19, CD20, CD33, 암배아 항원(CEA) 및 섬유모세포 활성화 단백질(FAP)로 이루어진 군으로부터 선택되는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 세포 항원이 암배아 항원(CEA)인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  33. 제32항에 있어서,
    제2 항원 결합 모이어티가 서열번호 290의 중쇄 CDR1, 서열번호 291의 중쇄 CDR2, 서열번호 292의 중쇄 CDR3, 서열번호 294의 경쇄 CDR1, 서열번호 295의 경쇄 CDR2 및 서열번호 296의 경쇄 CDR3을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서,
    제2 항원 결합 모이어티가 서열번호 289의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 293의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  35. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 세포 항원이 흑색종 관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP)인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  36. 제35항에 있어서,
    제2 항원 결합 모이어티가 서열번호 280의 중쇄 CDR1, 서열번호 281의 중쇄 CDR2, 서열번호 282의 중쇄 CDR3, 서열번호 284의 경쇄 CDR1, 서열번호 285의 경쇄 CDR2 및 서열번호 286의 경쇄 CDR3을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서,
    제2 항원 결합 모이어티가 서열번호 279의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 283의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  38. CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 항원 결합 모이어티, MCSP에 결합할 수 있는 제2 항원 결합 모이어티, 및 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자로서, 상기 항원 결합 분자가 서열번호 278, 319, 369 및 370의 아미노산 서열을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  39. CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 항원 결합 모이어티, MCSP에 결합할 수 있는 제2 항원 결합 모이어티, 및 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자로서, 상기 항원 결합 분자가 서열번호 278, 319, 371 및 372의 아미노산 서열을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  41. 제40항에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드.
  42. 제40항에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 특히 발현 벡터.
  43. 제40항에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 제42항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  44. a) T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건하에 제43항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계, 및
    b) 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 회수하는 단계
    를 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 제조 방법.
  45. 제44항에 따른 방법에 의해 제조된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  46. 제1항 내지 제39항 및 제45항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  47. 제1항 내지 제39항, 제45항 및 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    약제로서 사용하기 위한 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 약학 조성물.
  48. 제1항 내지 제39항, 제45항 및 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    질환의 치료가 필요한 개체의 질환을 치료하기 위한 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 약학 조성물.
  49. 제48항에 있어서,
    질환이 암인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 약학 조성물.
  50. 질환이 치료가 필요한 개체의 질환을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 제1항 내지 제39항 및 제45항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 용도.
  51. 제1항 내지 제39항 및 제45항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 약학적으로 허용되는 형태로 포함하는 치료 유효량의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 질환을 치료하는 방법.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서,
    상기 질환이 암인, 용도 또는 방법.
  53. T 세포의 존재하에 제1항 내지 제39항 및 제45항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 표적 세포의 용해를 유도하는 방법.
  54. 본원에 기재된 바와 같은 발명.
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