CN115052897A

CN115052897A - PLAP-CD3ε双特异性抗体

Info

Publication number: CN115052897A
Application number: CN202180010984.XA
Authority: CN
Inventors: 吴力军; 维塔·格鲁博斯卡娅
Original assignee: Primabo Biotechnology; Promab Biotechnologies Inc
Current assignee: Primabo Biotechnology; Promab Biotechnologies Inc
Priority date: 2020-01-28
Filing date: 2021-01-19
Publication date: 2022-09-13
Anticipated expiration: 2041-01-19
Also published as: EP4097139A1; EP4097139A4; US20220348688A1; CN115052897B; WO2021154534A1

Abstract

本发明涉及双特异性人源化PLAP(胎盘碱性磷酸酶)‑CD3ε链(CD3e)抗体。本发明还涉及通过向患者施用该双特异性PLAP‑CD3e抗体来杀伤PLAP‑阳性癌细胞的方法。

Description

PLAP-CD3ε双特异性抗体

序列表、表格或计算机程序的引用

序列表以ASCII格式的文本文件通过EFS-Web与说明书同时提交，文件名为Sequence Listing.txt，创建日期为2021年1月14日，大小为72.1千字节。通过EFS-Web提交的序列表是说明书的一部分，并在此通过引用全文并入本文。

技术领域

本发明涉及PLAP(胎盘碱性磷酸酶)-CD3ε链(CD3e)双特异性抗体。本发明还涉及通过向患者施用PLAP-CD3e双特异性抗体与T细胞来杀伤PLAP-阳性癌细胞的方法。

背景技术

免疫疗法正在成为一种非常有前景的癌症治疗方法。T细胞或T淋巴细胞是我们免疫系统的武装力量，不断寻找外来抗原并将异常细胞(癌症或经感染的细胞)和正常细胞区分开来。使用双特异性抗体与T细胞和肿瘤相关抗原结合，以利用细胞毒性T细胞杀伤癌细胞是设计双特异性抗体的最常见方法。双特异性抗体可以通过不同的途径输注入患者体内。与化疗或抗体相比，双特异性抗体的优势在于其特异性靶向抗原阳性癌细胞并同时激活T细胞。

通过靶向肿瘤细胞的双特异性抗体重定向T细胞的活性，而不依赖于它们的TCR特异性，是治疗癌症的有效方法。该构思基于对细胞表面肿瘤抗原的识别以及同时与T细胞上的T细胞受体(TCR)复合物中的CD3ε链(CD3e)的结合。这会触发T细胞激活，包括释放细胞毒性分子、细胞因子和趋化因子，并且诱导T细胞增殖。

PLAP

PLAP是由ALPP基因编码的胎盘碱性磷酸酶。PLAP是一种催化磷酸单酯水解的金属酶。PLAP主要在胎盘和子宫内膜组织中表达，在正常组织中不表达。

PLAP在胎盘中高表达(1)，并且在除睾丸外的大多数正常组织中不表达(2)。已发现它在恶性精原细胞瘤、畸胎瘤(2),(3)、卵巢癌和宫颈癌(3),(4),(5)和结肠腺癌(6)中过表达。在肺、胰腺、胃肿瘤中检测到PLAP(7)。在非小细胞肺癌患者的外泌体中的其它几种膜结合蛋白中也检测到了PLAP，这些蛋白有可能成为预后标志物(8)。

人PLAP是由ALPP基因编码的535个氨基酸的糖基化蛋白，其1-22为信号肽，然后是胞外结构域(23-506)，513-529为跨膜结构域(序列如下所示，跨膜结构域标有下划线)Uniprot数据库(www.uniprot.org/uniprot/P05187；NM_001632)。其序列如下所示(SEQ IDNO:1)。

存在四种不同但相关的碱性磷酸酶：包括由2号染色体上的基因编码的肠(由ALPI编码)(NM_001631)；胎盘(ALPP)；胎盘样(ALPPL2)(NM_031313)；以及由1号染色体上的基因编码的肝/骨/肾(ALPL)(组织-非特异性的)(NM_000478)。

附图说明

图1A至图1C示出了双特异性人源化PLAP和CD3抗体的结构。图1A示出了编码四种多肽的#1-4DNA构建体。图1B示出了编码二价PLAP-CD3抗体的3种多肽的#1-3DNA构建体。图1C示出了编码人源化单价PLAP-CD3抗体的3种多肽的#1-3DNA构建体。图1A和图1B的抗体具有两个PLAP结合部分和一个CD3结合部分。图1C的抗体具有一个PLAP结合部分和一个CD3结合部分。图1A和图1B的结构中示出了杵臼(knobs-in-hole)结构和沉默Fc突变P329G以及亮氨酸到丙氨酸(L234A、L235A或LA-LA)突变；对于图1C，仅示出了LA-LA。CH3中的氨基酸编号根据文献[10]从人IgG1计数。

图2示出了PLAP-h2-CD3和PLAP-h4-CD3抗体在SDS凝胶上的表达。上清液在非还原条件下(B)显示出较高的206kDa条带，而在还原条件下(C)显示出较低的分子带。A表示以kDa标志蛋白的分子量标志物(KDa)。

图3示出了PLAP-h2-CD3抗体的纯化。PLAP h2(用具有不同密码子优化的Fc核苷酸序列使用嵌合形式)-CD3抗体。A-非还原条件；B-还原条件；C-分子标志物，分子量以kDa表示。

图4通过FACS示出了PLAP-CD3抗体与CD3和PLAP抗原的结合。双特异性抗体与PLAP-阳性和PLAP-阴性细胞系一起使用。CD3-阳性T细胞用于测试结合。双特异性抗体与PLAP和Cd3抗原均呈阳性结合。如图示出了PLAP h2-CD3抗体，对于PLAP h4-CD3抗体(未示出)也观察到了相同的情况。

图5A至图5B示出了实时细胞毒性分析。PLAP h2-CD3双特异性抗体和T细胞杀伤Lovo(PLAP-阳性)细胞，但不杀伤HT29(PLAP-阴性)细胞。T细胞与靶细胞的比例为5:1(E:T)。

图6A至图6B示出了实时细胞毒性分析。PLAP h4-CD3抗体和T细胞杀伤Lovo(PLAP-阳性)细胞，但不杀伤PLAP阴性细胞。T细胞以5:1的E:T比例来使用(T细胞相对于靶细胞)。

图7示出了PLAP h2-CD3抗体加T细胞显著降低Lovo异种移植肿瘤的生长。第18天，相对于Mock T细胞，P＝0.007，学生t检验。

图8示出了二价PLAP h4-CD3 Ab PBM0015(图1B结构)在SDS凝胶上呈现为分子量为130kDa的单条带。

图9示出了二价PLAP h4-CD3(PBM0015)抗体和T细胞剂量依赖性地杀伤PLAP阳性细胞。

图10示出了二价人源化PLAPh4-CD3抗体(PBM0015)和T细胞在Lovo细胞存在的情况下分泌显著水平的IFN-γ，但在HCT116存在的情况下没有如此。Ab的浓度以ng/ml来表示。

图11A至图11D示出了单价PLAP h2-3(PBM008，图1C结构)和T细胞的特异性杀伤PLAP-阳性Lovo细胞并分泌IFN-γ。图11A至图11B：用PLAP h2-3进行RTCA并与PLAP h2和PLAP h4(图1A结构)进行比较。PLAPh2-3在Lovo细胞中具有相似的高活性，而在PLAP-阴性细胞中具有低活性。图11C至图11D：PLAP h2-3与PLAP-阳性Lovo靶细胞一起具有高IFN-γ分泌，但与PLAP-阴性HCT116细胞一起没有如此。

具体实施方式

定义

如本文所使用的，“亲和力”是单个分子与其配体结合的强度。亲和力通常由平衡解离常数(K_D或Kd)测量和报告，用于双分子相互作用的强度的评估和排位。

如本文所使用的，“双特异性抗体”是能够同时结合两种不同类型的抗原或同一抗原的不同表位的人工蛋白。

如本文所使用的，“CD3ε(CD3e)”是由位于人11号染色体上的CD3E基因编码的多肽。CD3-ε多肽与CD3-γ、-δ和-ζ以及T细胞受体α/β和γ/δ异二聚体一起形成T细胞受体-CD3复合物。该复合物在将抗原识别与多种细胞内信号转导途径耦合方面起着重要作用。CD3ε多肽在T细胞发育中起着至关重要的作用。CD3ε、CD3e和CD3在本申请中可互换使用。

如本文所使用的，“结构域”指的是多肽中的一个区域，该区域独立于其它区域折叠成特定结构。

如本文所使用的，“单链可变片段(scFv)”指的是来源于保留与抗原结合能力的抗体的单链多肽。scFv的示例包括通过重组DNA技术形成的抗体多肽，并且其中免疫球蛋白重链(H链)和轻链(L链)片段的Fv区域通过间隔序列连接。本领域技术人员所已知用于制备scFv的各种方法。

如本文所使用的，“肿瘤抗原”指的是具有抗原性的生物分子，其表达引起癌症。

发明人已发现人PLAP是一种独特的肿瘤标志物。与其它在正常组织中低水平表达的肿瘤标志物不同，人PLAP在大多数正常组织中不表达，而仅在胎盘和睾丸中表达。因此，PLAP-CD3e双特异性抗体对正常组织无反应，从而它们是安全且低毒的。

本发明涉及与人PLAP和人CD3e特异性结合的双特异性抗体。PLAP-CD3e双特异性抗体以在多种类型癌症，诸如卵巢癌、精原细胞瘤和结肠癌中高度过表达的PLAP肿瘤抗原为靶标。本发明的PLAP-CD3双特异性抗体对多种结肠癌细胞系具有高细胞毒活性。双特异性抗体激活T细胞并将T细胞重定向至PLAP-阳性癌细胞。

图1A至图1C中示出了本发明的三种双特异性抗体结构。图1A和图1B示出了异二聚体抗体，其一个臂与T细胞上表达的人CD3e链结合，两个臂与PLAP阳性癌细胞上表达的人PLAP结合。图1C示出了异二聚体抗体，其一个臂与人CD3e链结合，一个臂与人PLAP结合。

图1A的双特异性抗体结构

本发明涉及具有图1A结构的双特异性抗原结合分子。在一个方面中，PLAP抗体是人源化h2，并且双特异性抗体包含：(a)第一抗原结合部分和第二抗原结合部分，其各自是能够与人PLAP特异性结合的人源化Fab分子，并且各自包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区(PLAP VH)和具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区(PLAP VL)；(b)第三抗原结合部分，其是能够与人CD3ε特异性结合的Fab分子，第三抗原结合部分包含具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链可变区(CD3VH)和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链可变区(CD3 VL)，其中，第三抗原结合部分是其中Fab轻链和Fab重链的恒定区被交换的交叉Fab分子(crossover Fab molecule)；以及，(c)人IgG Fc结构域，其包含能够稳定缔合(association)的第一亚基和第二亚基；其中，第三抗原结合部分的Fab重链(i)在N-末端融合至第一抗原结合部分的Fab重链的C-末端(CH1)，并且(ii)在C-末端融合至Fc杵结构域的第一亚基的N-末端，并且其中，第二抗原结合部分在Fab重链的C-末端(CH1)融合至Fc臼结构域的第二亚基的N-末端。

在另一方面中，PLAP抗体是人源化h4，并且双特异性抗体包含：(a)第一抗原结合部分和第二抗原结合部分，其各自是能够与人PLAP特异性结合的人源化Fab分子，并且各自包含具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链可变区(PLAP VH)和具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链可变区(PLAP VL)；(b)第三抗原结合部分，其是能够与人CD3ε特异性结合的Fab分子，第三抗原结合部分包含具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链可变区(CD3 VH)和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链可变区(CD3VL)，其中，第三抗原结合部分是其中Fab轻链和Fab重链的恒定区被交换的交叉Fab分子；以及(c)人IgG Fc结构域，其包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基；其中，第三抗原结合部分的Fab重链(i)在N-末端融合至第一抗原结合部分的Fab重链的C-末端(CH1)，并且(ii)在C-末端融合至Fc杵结构域的第一亚基的N-末端，并且其中，第二抗原结合部分在Fab重链的C-末端(CH1)融合至Fc臼结构域的第二亚基的N-末端。

本发明的双特异性抗体采用CROSSFAB方式，其使CD3e Fab分子中的恒定域和可变域交叉，并且调换CH1结构域和CL结构域，减少了不希望的错配。

在一个实施方式中，本发明的双特异性抗体包含：(1)人源化PLAP轻链，(2)CD3e交叉FAB、CD3VL-CH1；(3)人源化PLAP VH-CH1-CD3e CROSSFAB(VH-CL)-Fc(杵)；和(4)人源化PLAP VH-CH1-Fc(臼)。(图1A)

在一个实施方式中，人源化PLAP抗体的VH具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列，VL具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

在另一个实施方式中，人源化PLAP抗体的VH具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列，VL具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列。

在一个实施方式中，Fc结构域包含促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰。

在一个实施方式中，在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，从而在第一亚基的CH3结构域内产生突起(protuberance)，该突起与第二亚基的CH3结构域内的空腔相匹配，并且在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被侧链体积较小的氨基酸残基替换，从而在第二亚基的CH3结构域内产生空腔，该空腔与第一个亚基的CH3结构域内的突起相匹配。

在一个实施方式中，与天然IgG Fc结构域相比，Fc结构域呈现出对Fc受体的降低的结合亲和力和/或降低的效应子功能。

在一个实施方式中，Fc结构域包含降低了与Fc受体的结合和/或效应子功能的一个或更多个氨基酸取代。在一个实施方式中，Fc结构域中的一个或更多个氨基酸取代选自L234、L235和P329(Kabat编号)的组。在一个实施方式中，所述氨基酸取代是L234A、L235A和P329G。

在一个实施方式中，沉默Fc突变P329G，以及L234A和L235A突变用于防止Fc依赖性免疫反应。

在一个实施方式中，仅沉默突变L234A和L235A突变来防止Fc依赖性免疫反应。

在具体的实施方式中，用被称为“杵臼(knob-into-hole)结构”的修饰来修饰Fc结构域，其包括在Fc结构域的两个亚基之一中的“杵”修饰和在Fc结构域的两个亚基中另一个中的“臼”修饰。杵臼结构技术记载于例如在美国专利No.5,731,168中。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入突起(“杵”)且在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”)，从而可以将突起定位在空腔中以促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。通过用较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替换来自第一多肽界面的较小氨基酸侧链来构建突起。通过用较小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替换较大的氨基酸侧链以在第二个多肽的界面中产生与突起相同或相似大小的补偿空腔。

在一个实施方式中，“杵”是由一个Fc上的S354C和T366W突变来构成的，相应的“臼”是由伴侣Fc上的Y349C、T366S、L368A和Y407V突变来构成的。

在一个实施方式中，双特异性抗原结合分子包含两个针对PLAP的结合部分和一个针对CD3ε的结合部分，该分子以2:1:1:1的摩尔比包含SEQ ID NO：5、8、12和14的氨基酸序列；任选地，每种氨基酸序列与上述序列相比具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，条件是序列变化在非CDR框架区中。

在一个实施方式中，双特异性抗原结合分子包含两个针对PLAP的结合部分和一个针对CD3ε的结合部分，该分子以2:1:1:1的摩尔比包含SEQ ID NO：17、8、20和22的氨基酸序列；任选地，每个氨基酸序列与上述序列相比具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，条件是序列变化在非CDR框架区中。

图1B的双特异性抗体结构

图1B示出了由3种DNA构建体组成的人源化二价双特异性PLAP-CD3e抗体的结构。该结构包含两个针对PLAP的结合部分和一个针对CD3ε的结合部分。

在一个实施方式中，该抗体以2:1:1的摩尔比包含SEQ ID NO:17、24和22的氨基酸序列；任选地，每个氨基酸序列与上述序列相比具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，条件是序列变化在非CDR框架区中。

图1C的双特异性抗体结构

图1C示出了单价人源化PLAP和单价CD3e的双特异性抗体结构；该结构由3种DNA构建体组成。该结构没有CD3 CROSS FAB，但有CD3e scFv。双特异性抗体包含一个针对PLAP的结合部分和一个针对CD3ε的结合部分。

在一个实施方式中，双特异性抗体以2:1:1的摩尔比包含SEQ ID NO:5、28和30的氨基酸序列；任选地，每个氨基酸序列与上述序列相比具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，条件是序列变化在非CDR框架区中。

在另一实施方式中，双特异性抗体以2:1:1的摩尔比包含SEQ ID NO:17、28和30的氨基酸序列；任选地，每个氨基酸序列与上述序列相比具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，条件是序列变化在非CDR框架区中。

上述图1A至图1C的结构的序列变化，即，氨基酸改变优选是较小的氨基酸改变，例如保守氨基酸取代。保守氨基酸取代是本领域技术人员所熟知的。

本发明涉及一种治疗癌症的双特异性抗体方法，包括向患有癌症的受试者施用PLAP-CD3e抗体的步骤，其中所述癌症选自由结肠癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、睾丸癌、畸胎瘤、精原细胞瘤、卵巢癌和宫颈癌组成的组，并且癌症是PLAP阳性的。

本发明还涉及包含双特异性抗原结合分子和药学上可接受的载体的药物组合物。

可以将编码本发明的双特异性抗体的核酸插入载体中，并使用无血清培养基在哺乳动物293S或CHO细胞中表达。抗体可用蛋白A或蛋白G柱来纯化并用于研究。

本申请证实了靶向在结肠癌肿瘤中过表达PLAP抗原的双特异性抗体的功效。本申请证实了PLAP-CD3e抗体结合CD3e抗原和PLAP抗原。这种抗体与T细胞一起递送可特异性降低PLAP-阳性结肠癌细胞的活力，但不会降低PLAP-阴性癌细胞的活力。PLAP-CD3e抗体与T细胞一起递送在与PLAP-阳性结肠癌细胞共孵育后引起IFN-γ显著水平的分泌，但在与PLAP-阴性癌细胞共孵育后不会如此。本申请证实了PLAP-CD3e抗体与T细胞一起施用显著降低了体内Lovo(阳性PLAP-结肠癌细胞)异种移植肿瘤的生长。

本发明人证实了PLAP-CD3抗体与T细胞显著杀伤所有的PLAP-阳性癌细胞，但不杀伤PLAP-阴性结肠癌。这意味着PLAP-CD3抗体的高特异性。

本发明人证实了图1A至图1C的双特异性抗体的三种不同设计的高功效。

以下实施例进一步说明本发明。这些实施例仅旨在说明本发明而不应解释为对本发明的限制。

实施例

实施例1.材料和方法

细胞和培养基

在加有10％FBS和1％青霉素/链霉素的杜氏改良Eagle培养基(Dulbecc’sModified Eagle's Medium，DMEM)中培养来自AlStem(Richmond，CA)的HEK293FT细胞。根据IRB批准的方案，使用Ficoll-Paque溶液(GE Healthcare)对从加利福尼亚州斯坦福的斯坦福医院血液中心(Stanford Hospital Blood Center,Stanford,CA)获得的全血分离人外周血单个核细胞(PBMC)。使用结肠癌细胞系：PLAP-阴性：HT29，以及PLAP-阳性：Lovo细胞来用于开展研究。在经加湿的5％CO₂中培养细胞(9)。

抗体

(APC)标记的抗-CD3和二抗记载于(9)中。

PLAP-CD3抗体构建体

实施例2A的四种构建体是根据(10)中记载的Cross-Fab设计的。该构建体具有P329G突变，亮氨酸324、235变为丙氨酸(称为LA-LA)，以降低Fc免疫活性。此外，如(10)中所记载，使用Fc沉默突变和杵臼突变进行工程化。我们还表达了图1B的三种构建体和图1C的三种构建体。图1A和图1B的所有构建体被克隆到pYD11载体的Nhe I和Nsi I位点。

PLAP-CD3抗体的表达

对于图1A的结构，将四种抗体构建体以2(PLAP VL-CL):1:1:1(μg/mL)的重量比与NanoFect转染剂混合并用于293S细胞转化。对于结构1B和1C，将三种抗体构建体与NanoFect转染剂以1:1:1(μg/mL)的重量比混合并用于293S细胞转化。在37℃的培养箱中，在含有8mM L-谷氨酰胺(或GlutaMAX)和0.1％Pluoronic F-68的Freestyle F17培养基中，将细胞置于瓶中在摇床上旋转一周。利用FACS和功能测定分析SDS凝胶上蛋白A柱上的上清液或经纯化的抗体。

PBMC

使PBMC以1×10⁶细胞/ml重新悬浮在含有300U/ml IL-2的10％FBS(ThermoFisher)的AIM V-AlbuMAX培养基(Thermo Fisher)中。用CD3/CD28免疫磁珠(Invitrogen)激活PBMC细胞，以用于双特异性抗体的细胞毒性分析。

荧光激活细胞分选(FACS)分析

使用FACSCalibur(BD Biosciences)将别藻蓝蛋白(APC)标记的抗CD3(eBioscience，San Diego，CA)抗体用于FACS分析。对于用结肠癌细胞系进行FACS来检测PLAP水平，使用来自Ximbio(London,UK)的双特异性PLAP-CD3或小鼠单克隆PLAP抗体(H17E2)来进行FACS分析，该分析在FACSCalibur上进行，如(9)中所记载。

实时细胞毒性测定(RTCA)

将贴壁结肠癌靶细胞(每孔10000个细胞)接种到96孔E板(Acea Biosciences，SanDiego，CA)中，并使用基于阻抗的实时细胞分析(RTCA)iCELLigence系统(AceaBiosciences)培养过夜。20小时至24小时后，培养基替换为含10％FBS的AIM V-AlbuMAX培养基，在该AIM V-AlbuMAX培养基中存在1×10⁵个效应细胞T细胞、双特异性抗体与T细胞一起，或仅抗体，一式三份。使用RTCA系统监测细胞>40小时，并绘制阻抗(与细胞指数成比例)随时间的变化。细胞毒性计算为(没有效应细胞情况下的靶细胞的阻抗-具有效应细胞情况下的靶细胞的阻抗)×100/没有效应细胞情况下的靶细胞的阻抗。

细胞因子分泌的ELISA测定

靶细胞与效应细胞或试剂一起在加有10％FBS的AIM V-AlbuMAX培养基的U型底96孔板中培养，一式三份。16小时后，去除上清液，离心以去除残留细胞。在一些实验中，使用RTCA测定后的上清液来进行ELISA细胞因子测定。将上清液转移到新的96孔板中，并根据制造商的方案使用Thermo Fisher的试剂盒通过ELISA来测定人细胞因子。

小鼠体内异种移植研究

根据机构动物护理和使用委员会(IACUC)协议饲养六周龄的雄性NSG小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)。每只小鼠皮下注射含有2×10⁶Lovo结肠癌细胞的无菌1×PBS。在不同时间点，将双特异性抗体以10μg/小鼠和1×10⁷T细胞静脉注射到小鼠。用卡尺测量肿瘤大小，每周两次，并使用公式W²L/2确定肿瘤体积(以mm³为单位)，其中W是肿瘤宽度，L是肿瘤长度。最后，收集0.1ml的血液并用于毒理学标志物的分析。

实施例2.PLAP h2-CD3e双特异性抗体(图1A)的序列

图1A示出了由4种DNA构建体组成的人源化PLAP-CD3二价抗体的结构。该结构具有CD3 CROSS-Fab。

图1A的PLAP h2-CD3e双特异性抗体包含4种构建体：

1.PLAP h2轻链(VL-CL)：PLAP VL(人源化h2 PLAP，WO2019/240934，密码子优化如下)

2.CD3 CROSSFAB，(VL-CH1)

3.PLAP h2 VH-CH1-CD3 CROSSFAB(VH-CL)–Fc(杵)P329GLA-LA

4.PLAP h2 VH-CH1-Fc(臼)P329GLA-LA

P329G突变阻止了FcγR和C1q相互作用的相互作用，从而消除了通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性吞噬作用(ADCP)或补体依赖性细胞毒性(CDC)消除靶细胞。P329G突变在递送至提供沉默Fc区的细胞时会移除FcγR介导的免疫效应功能(11)。加入将亮氨酸Leu 234和Leu 235变为丙氨酸(A)的两个其它突变LA-LA突变完全阻断了FcγR和C1q相互作用的结合，从而阻止了Fc介导的ADC、ADCC和其它免疫原性(10)。

所有序列都经过密码子优化并合成为GBlock，并插入pYD11载体的Nhe I和Nsi I位点。为了不出现轻链结构域的错配，使用CrossFAB技术，其中CD3 VH连接到CL，而CD3 VL连接到CH1。我们还使用了Crick在1952年提出的杵-臼突变来建立杵(T366W)，并使用了S354C突变；或使用臼(Y349C、T366S、L368A和Y407V)突变用于将两条Fc链保持在一起。所有序列都以信号肽(下划线)开始：METDTLLLWVLLLWVPGSTGAAS(SEQ ID NO:2)。

构建体#1.PLAP h2轻链：LC-PLAP

以下示出了人源化PLAP(PLAP h2 VL(粗体)-CL(斜体)的DNA人工序列LC(轻链)。在WO2019/240934中示出了PLAP h2 VL的核苷酸序列，该序列经密码子优化并以恒定CL区插入在Nhe I(GCTAGC位点，以斜体，加下划线示出)和Nsi I位点(pYD11载体的atgcat，以斜体，加下划线示出)。序列以信号肽开始(信号肽加下划线+(由于克隆位点后接AAS氨基酸)：

METDTLLLWVLLLWVPGSTGAAS(SEQ ID NO:2)。

两个终止密码子在人Fc开始之前添加到序列中以表达载体中不存在Fc的轻链。信号肽为粗斜体，加下划线；VL为粗体；CL为斜体。

氨基酸序列:

信号肽(加下划线)+AAS：METDTLLLWVLLLWVPGSTGAAS(SEQ ID NO:2)。

PALP h2 VL(SEQ ID NO:4)

PALP h2 VL-CL(SEQ ID NO:5)

构建体#2.CD3 CROSSFAB(VL-CH1)

CD3 VL以粗体示出，CH1以斜体示出，核苷酸序列经过密码子优化。Nhe I和NsiI位点以斜体示出。添加终止密码子TAA以终止Fc之前的序列。

核苷酸序列：信号肽为粗体、斜体、加下划线；AAS则为斜体、常规字体；VL为粗体；CH1为常规字体、斜体。

氨基酸序列(未包含信号肽)

CD3 VL(SEQ ID NO:7)

CD3 VL-CH1(SEQ ID NO:8)

构建体#3.

PLAP h2 VH CH1-CD3 CROSSFAB VH-CL–Fc(杵)P329GLA-LA

信号肽为粗体、斜体、加下划线，然后是克隆位点带来的3个氨基酸-AAS；克隆位点

和

加下划线，较大字体。

PLAP h2-VH-粗体；CH1-加下划线；2xG4S接头；CD3 VH粗斜体；CL为斜体、加下划线；带有LA-LA(L234和L235变成A)突变的IgG Fc链以以粗体、加下划线示出；以及P329G突变，P变成G以粗体、加下划线示出。

Fc结构域中的杵突变为S354C和T366W，以粗体、较大字体、斜体示出。

核苷酸序列:

氨基酸序列PLAP h2 VH，SEQ ID NO:10

CD3 VH,SEQ ID NO:11

构建体#3的氨基酸序列(未包含信号肽):

构建体#4.PLAP h2 VH-CH1-Fc(臼)P329GLA-LA

构建体#4使用与构建体#3相同的P329G和LA-LA突变，以粗体示出。臼突变为Y349C、T366S、L368A和Y407V，以粗体、较大字体、斜体示出。克隆位点

和

加下划线。

信号肽为加下划线、粗体、斜体；然后是编码3个氨基酸AAS(克隆位点)的9个核苷酸，为常规字体、斜体；PLAP-VH-粗体，CH1下划线，然后带有P329GLA-LA和臼突变的Fc。

核苷酸：

构建体#4的氨基酸(未包含信号肽)，SEQ ID NO:14

实施例3.PLAP h4-CD3抗体(图1A)的序列

PLAP h4-CD3e双特异性包含4种构建体：

1.PLAP h4轻链(VL-CL)：LC PLAP；

2.CD3 CROSSFAB，(CD3e VL-CH1)，与实施例2相同；

3.PLAP h4 VH-CH1-CD3 CROSSFAB(CD3e VH-CL)–Fc(杵)P329GLA-LA；

4.PLAP h4 VH-CH1-Fc(臼)P329G，LA-LA。

构建体#1

PLAP h4轻链：LC PLAP(人源化h4 PLAP，WO2019/240934，密码子优化如下)信号肽为粗体、斜体、加下划线，然后是9个核苷酸，克隆位点为斜体、常规字体，Nhe I和Nsi I位点加下划线。PLAP h4 VL以粗体示出，而CL为常规字体。

核苷酸序列：

PLAP h4 VL的氨基酸序列，SEQ ID NO:16

构建体#1的氨基酸序列，PLAP h4 VL-CL(没有信号肽的情况)，SEQ ID NO:17

构建体#2(CD3 CrossFAB的轻链)，与实施例2相同。

构建体#3PLAP h4 VH-CH1-CD3 CROSSFAB(VH-CL)–Fc(杵)

信号肽为斜体、加下划线、粗体，然后是9个核苷酸(克隆位点)；PLAPh4 VH为粗体，CH1加下划线；CD3 VH为粗体斜体；CL为斜体、加下划线；具有P329GLA-LA突变的Fc为粗体、加下划线；杵突变为粗体斜体、加大字体。

PLAP h4 VH的氨基酸序列，SEQ ID NO:19

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSITSYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWEDGSTNYHSALISRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARPHYGSSYVGAMEYWGAGTTVTVSS

加下划线的信号肽的氨基酸序列+AAS

METDTLLLWVLLLWVPGSTGAAS(SEQ ID NO:2)

构建体#3的氨基酸序列(无信号肽)

构建体#4，PLAP h4 VH-CH1-Fc(臼)P329GLA-LA

信号肽为斜体、粗体、加下划线+编码AAS的9个核苷酸克隆位点为斜体、常规字体；PLAP h4为粗体，CH1-加下划线，臼突变以粗体斜体、较大字体示出；329GLA-LA为粗体、加下划线。

核苷酸序列:

加下划线的信号肽的氨基酸+AAS

METDTLLLWVLLLWVPGSTGAAS(SEQ ID NO:2)

构建体#4的氨基酸(无信号肽)

实施例4.PLAP H4-CD3抗体(图1B)的序列

图1B示出了由3种DNA构建体组成的人源化二价PLAP的结构。该结构具有附接至CH3的C终末端的CD3 scFv(VH-接头-VL)。不存在CROSS-Fab CD3。

PLAP h4-CD3e二价抗体(PBM0015)包括3种构建体：

1.PLAP h4轻链，VL-CL：与实施例3相同，构建体#1。

2.PLAP h4 VH-CH1–Fc(杵)P329GLA-LA-CD3VH-接头-VL。

PLAP h4 VH-CH1的氨基酸，参见实施例3，构建体3的部分。

3.PLAP h4 VH-CH1–Fc(臼)，与实施例3中的构建体#4相同。

构建体DNA#2

构建体#2：PLAP h4 VH-CH1–Fc(杵)P329GLA-LA-G4Sx3接头-CD3VH-接头-VLDNA被克隆至pYD11载体的与实施例3相同的位点。

核苷酸序列

信号肽为斜体粗体、加下划线+编码AAS的9个核苷酸克隆位点(斜体，常规字体)；PLAPh4 VH(粗体，加下划线)；CH1为常规字体，FC具有(杵)；P329GLA-LA突变，常规字体，加下划线；G4Sx2接头，粗体，斜体；CD3scFV(VH-G4Sx3-VL)以粗体斜体、加下划线来示出。

构建体2，前面没有信号肽的氨基酸

CD3 ScFV(VH加下划线，接头斜体，VL，粗体)

实施例5.PLAP H2-CD3抗体(图1C)的序列

图1C示出了单价人源化PLAP和单价CD3的结构，其由3种DNA构建体组成。该结构没有CD3 CROSSFAB，但具有结合CD3的CD3 scFv。

PLAP h2-CD3e单价抗体包括3种构建体：

除了在端部没有AAS氨基酸之外，信号肽与SEQ ID NO 2相同；METDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ ID NO:26)。

1.PLAP h2 VL-CL，氨基酸序列与实施例2，构建体#1中的相同。核苷酸序列由于密码子优化而不同。

2.PLAP h2 VH-CH1–Fc(杵)

3.CD3scFv-Fc(臼)

构建体2的核苷酸序列

信号肽为加下划线、粗体斜体；PLAP h2 VH(粗体)-CH1-Fc(杵)；L234A、L235A突变以较大字体、加下划线、粗体示出；两个杵突变为斜体、较大字体、粗体，示出在图1C中。

构建体2的氨基酸，PLAP h2 VH-CH1-Fc(杵)(无信号肽)：_

PLAP h2 VH，加下划线的CH1；Fc为斜体，其中突变LA-LA为较大字体，敲除突变加下划线。

构建体3的核苷酸序列，CD3scFv-Fc(臼)

CD3 scFv为斜体粗体，然后是Fc(臼)，其中LA-LA突变为粗体、加下划线；臼突变为斜体、较大字体、粗体。

构建体3的氨基酸，CD3scFv-Fc(臼)，无信号肽:

CD3 scFv为粗体(CD3 VH和VL之间的接头加下划线)、斜体，FC为斜体；L234A、L235A突变为较大字体；臼突变(Y349C；T366S；L368A；Y407V)加下划线、粗体、较大字体，如图1C中所示。

实施例6.PLAP h2和PLAP h4-CD3抗体(图1A)的表达

使用在具有8mM L-谷氨酰胺(或GlutaMAX)、0.1％Pluoronic F-68的FreestyleF17表达无血清培养基中生长的293S细胞。对于转染，以3:1的比例使用NanoFect转染试剂(1微克DNA，使用3微升)。转染3至7天后收集上清液。

抗体蛋白上清液在还原和非还原条件(向裂解缓冲液中加入β-巯基乙醇)下表达并在SDS凝胶上进行电泳(图2)。凝胶显示4个条带。

还使用蛋白A或G柱来对蛋白进行纯化。使用Millipore Sigma蛋白A珠和ThermoIgG洗脱缓冲液(目录号：21004)来完成纯化。收集后，使用Thermo Fisher Slide-A-LyzerMINI透析装置对样品进行透析。图3示出了SDS凝胶上纯化的PLAP h2-CD3抗体。经纯化的PLAP h2抗体在非还原条件下显示出206kDA的上部条带(A)，在还原条件下该条带消失(B)。

实施例7.CD3和PLAP抗原通过FACS的结合

使用双特异性PLAh2和PLAP h4抗体(图1A)的FACS证明了两种抗体都与PLAP-阳性细胞中的PLAP结合，而CD3则与T细胞结合(图4)。

使用PLAP-阳性和PLAP-阴性细胞系来测试双特异性抗体。使用CD3-阳性T细胞来测试与CD3的结合。双特异性抗体与PLAP和CD3抗原均呈阳性结合。图4示出了PLAP h2-CD3抗体的结果。对PLAP h4-Cd3抗体也观察到了类似的结果(数据未示出)。

实施例8.PLAP-CD3抗体与T细胞对PLAP-阳性细胞靶系的细胞毒活性

抗体上清液与T细胞一起用于RTCA测定。添加有激活的T细胞的两种双特异性抗体均可杀伤PLAP-阳性细胞，而对于没有T细胞的情况下，则不会杀伤PLAP-阳性细胞。PLAP-h2-CD3加T细胞杀伤PLAP阳性细胞而不杀伤PLAP-阴性HT29细胞(图5A至图5B)。仅抗体不杀伤结肠癌细胞系。仅T细胞也不杀伤靶细胞。这证明了双特异性抗体在与T细胞一起使用时具有高特异性，证实了通过与T细胞中的CD3抗原和PLAP抗原结合的双特异性抗体将T细胞靶向癌细胞的机制。

PLAP h4-CD3抗体在与激活的T细胞一起使用时，杀伤PLAP-阳性细胞，而不杀伤PLAP-阴性细胞(图6A-6B)。仅PLAP h4-CD3抗体未杀伤PLAP-阳性靶细胞。此外，双特异性抗体表现出剂量依赖性活性(未示出)。

实施例9.小鼠中的体内活性

我们在Lovo异种移植小鼠模型中施用双特异性抗体PLAP h2-CD3(图1A结构)和T细胞(图7)。在第4天，第一次注射1×10^⁷T细胞，在第7天静脉注射(iv)双特异性抗体(每只小鼠10微克或0.5mg/kg)；

然后在第7、10、14和17天通过iv一起注射抗体和T细胞。双特异性PLAP h2-CD3抗体与T细胞显著降低了异种移植肿瘤的生长(图7)。

实施例10.二价人源化PLAP h4-CD3 ScFv加T细胞特异性地杀伤PLAP-阳性细胞且分泌IFN-γ

二价双特异性人源化PLAP h4与CD3 ScFv抗体(参见图1B，PBM0015)在SDS凝胶(图8)上呈现为分子量为130kDa的单条带。PBM0015抗体与Lovo细胞中的PLAP特异性结合，而不与HCT116(PLAP阴性细胞)结合；FACS检测到它也与CD3结合(未示出)。PBM0015抗体和T细胞以剂量依赖性方式特异性杀伤PLAP-阳性Lovo靶细胞(图9)，并且对PLAP-阴性HCT116细胞的杀伤极小(未示出)。PBM0015抗体与T细胞在Lovo细胞存在情况下分泌高水平的IFN-γ，但在PLAP-阴性HCT116存在的情况下不会如此(图10)。结果证明了该抗体的高特异性活性。

实施例11.单价PLAP h2-CD3 ScFv抗体与T细胞特异性杀伤PLAP-阳性细胞并分泌 IFN-γ

双特异性单价人源化PLAP h2与CD3 ScFv抗体(结构如图1C所示)(PLAPh2-3)在SDS凝胶为1个条带(MW>100kDa)(未示出)。人源化PLAP h2-CD3与PLAP-阳性Lovo、LS123细胞中的PLAP结合，而在HCT116中未发生结合，通过FACS分析，其还与CD3结合。PLAPh2-3抗体和T细胞特异性地伤死PLAP-阳性Lovo靶细胞，而不杀伤PLAP-阴性细胞(图11A至11B)。细胞毒活性与具有图1A结构的PLAPh2和PLAPh4相似或更高。PLAPh2-3 Ab与T细胞还在PLAP-阳性细胞存在的情况下分泌显著水平的IFN-γ，而在PLAP-阴性细胞中不会如此(图11C至图11D)。

参考文献

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10.M.Bacac,T.Fauti,J.Sam,S.Colombetti,T.Weinzierl,D.Ouaret,W.Bodmer,S.Lehmann,T.Hofer,R.J.Hosse,E.Moessner,O.Ast,P.Bruenker,S.Grau-Richards,T.Schaller,A.Seidl,C.Gerdes,M.Perro,V.Nicolini,N.Steinhoff,S.Dudal,S.Neumann,T.von Hirschheydt,C.Jaeger,J.Saro,V.Karanikas,C.Klein and P.Umana:A NovelCarcinoembryonic Antigen T-Cell Bispecific Antibody(CEA TCB)for the Treatmentof Solid Tumors.Clin Cancer Res,22(13),3286-97(2016)doi:10.1158/1078-0432.CCR-15-1696

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序列表

<110> 普洛迈博生物技术公司

湖南远泰生物技术有限公司

<120> PLAP-CD3ε双特异性抗体

<130> 119995-8030.WO01

<150> US 62/966,846

<151> 2020-01-28

<160> 30

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 535

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Leu Gly Pro Cys Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Arg

1 5 10 15

Leu Gln Leu Ser Leu Gly Ile Ile Pro Val Glu Glu Glu Asn Pro Asp

20 25 30

Phe Trp Asn Arg Glu Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ala Ala Lys Lys Leu

35 40 45

Gln Pro Ala Gln Thr Ala Ala Lys Asn Leu Ile Ile Phe Leu Gly Asp

50 55 60

Gly Met Gly Val Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln

65 70 75 80

Lys Lys Asp Lys Leu Gly Pro Glu Ile Pro Leu Ala Met Asp Arg Phe

85 90 95

Pro Tyr Val Ala Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Val Asp Lys His Val Pro

100 105 110

Asp Ser Gly Ala Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Gly Asn

115 120 125

Phe Gln Thr Ile Gly Leu Ser Ala Ala Ala Arg Phe Asn Gln Cys Asn

130 135 140

Thr Thr Arg Gly Asn Glu Val Ile Ser Val Met Asn Arg Ala Lys Lys

145 150 155 160

Ala Gly Lys Ser Val Gly Val Val Thr Thr Thr Arg Val Gln His Ala

165 170 175

Ser Pro Ala Gly Thr Tyr Ala His Thr Val Asn Arg Asn Trp Tyr Ser

180 185 190

Asp Ala Asp Val Pro Ala Ser Ala Arg Gln Glu Gly Cys Gln Asp Ile

195 200 205

Ala Thr Gln Leu Ile Ser Asn Met Asp Ile Asp Val Ile Leu Gly Gly

210 215 220

Gly Arg Lys Tyr Met Phe Arg Met Gly Thr Pro Asp Pro Glu Tyr Pro

225 230 235 240

Asp Asp Tyr Ser Gln Gly Gly Thr Arg Leu Asp Gly Lys Asn Leu Val

245 250 255

Gln Glu Trp Leu Ala Lys Arg Gln Gly Ala Arg Tyr Val Trp Asn Arg

260 265 270

Thr Glu Leu Met Gln Ala Ser Leu Asp Pro Ser Val Thr His Leu Met

275 280 285

Gly Leu Phe Glu Pro Gly Asp Met Lys Tyr Glu Ile His Arg Asp Ser

290 295 300

Thr Leu Asp Pro Ser Leu Met Glu Met Thr Glu Ala Ala Leu Arg Leu

305 310 315 320

Leu Ser Arg Asn Pro Arg Gly Phe Phe Leu Phe Val Glu Gly Gly Arg

325 330 335

Ile Asp His Gly His His Glu Ser Arg Ala Tyr Arg Ala Leu Thr Glu

340 345 350

Thr Ile Met Phe Asp Asp Ala Ile Glu Arg Ala Gly Gln Leu Thr Ser

355 360 365

Glu Glu Asp Thr Leu Ser Leu Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe

370 375 380

Ser Phe Gly Gly Tyr Pro Leu Arg Gly Ser Ser Ile Phe Gly Leu Ala

385 390 395 400

Pro Gly Lys Ala Arg Asp Arg Lys Ala Tyr Thr Val Leu Leu Tyr Gly

405 410 415

Asn Gly Pro Gly Tyr Val Leu Lys Asp Gly Ala Arg Pro Asp Val Thr

420 425 430

Glu Ser Glu Ser Gly Ser Pro Glu Tyr Arg Gln Gln Ser Ala Val Pro

435 440 445

Leu Asp Glu Glu Thr His Ala Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Arg

450 455 460

Gly Pro Gln Ala His Leu Val His Gly Val Gln Glu Gln Thr Phe Ile

465 470 475 480

Ala His Val Met Ala Phe Ala Ala Cys Leu Glu Pro Tyr Thr Ala Cys

485 490 495

Asp Leu Ala Pro Pro Ala Gly Thr Thr Asp Ala Ala His Pro Gly Arg

500 505 510

Ser Val Val Pro Ala Leu Leu Pro Leu Leu Ala Gly Thr Leu Leu Leu

515 520 525

Leu Glu Thr Ala Thr Ala Pro

530 535

<210> 2

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 2

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Ala Ala Ser

20

<210> 3

<211> 723

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggc 60

gccgctagcg atattcaaat gacccaatcc ccgagcagcc tgagtgccag cgtaggagat 120

cgggttacga taacgtgtcg agcatccgaa aatatctata gctatgtagc atggtaccaa 180

caaaaacctg gcaaggcacc gaaactgttg atatacaacg ccaagagtct ggcaagtggg 240

gtgccttcac gcttcagtgg aagcggaagt gggacagatt ttacacttac catttcctcc 300

cttcagcctg aagactttgc aacatattat tgtcaacatc actatgtgag tccgtggact 360

ttcgggggag gaaccaaatt ggaaataaag cgcacagtcg cagcgcccag tgtgtttata 420

ttcccccctt cagacgaaca gctcaaatcc ggcacagcat cagtggtgtg tctgttgaac 480

aatttctatc ctagagaggc aaaggttcaa tggaaagtgg acaacgcgct ccaaagcggg 540

aactcccaag agagcgtcac tgaacaagat tccaaagata gcacgtactc tctttcttca 600

acgctcacgc tcagtaaggc cgattacgag aaacataagg tatacgcttg cgaggtcacg 660

catcaagggc tgtcctcacc cgtgaccaag tctttcaacc ggggggaatg ttaataaatg 720

cat 723

<210> 4

<211> 108

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Val Ser Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 5

<211> 214

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Val Ser Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 6

<211> 720

<212> DNA

<213> 智人

<400> 6

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggc 60

gccgctagcc aggccgtagt gacacaggaa ccgtctttga cggtgtctcc gggaggtacc 120

gtcaccttga cgtgtgggtc cagcactgga gctgtaacaa cgagcaatta cgcgaattgg 180

gtgcaggaga agccaggtca ggcttttagg ggtcttatcg gagggactaa taaaagggct 240

ccaggcacgc cggcaagatt ctcagggtcc ctgctggggg ggaaagcggc actcaccctt 300

tctggtgctc agccagagga tgaggccgaa tattattgtg ccttgtggta ttctaatttg 360

tgggtctttg gaggcgggac aaaactcact gtattgtcat ctgcgtcaac gaagggacct 420

tctgtattcc ccttggcacc atccagtaaa tctaccagtg ggggtaccgc tgccctcggt 480

tgccttgtaa aagattactt tccggagccc gtcaccgtgt cctggaacag cggggcattg 540

accagtggtg tccacacttt tcccgcagta ctccaaagct ccggcctcta cagtctctct 600

tcagttgtga cggttcctag ctcttccctt ggtacgcaga cttatatctg caacgtcaac 660

cacaaacctt ccaatactaa ggtagacaaa aaggtggagc ccaaatcttg ttaaatgcat 720

<210> 7

<211> 109

<212> PRT

<213> 智人

<400> 7

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 8

<211> 214

<212> PRT

<213> 智人

<400> 8

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala

100 105 110

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser

115 120 125

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

130 135 140

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

145 150 155 160

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr

180 185 190

Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys

195 200 205

Val Glu Pro Lys Ser Cys

210

<210> 9

<211> 2214

<212> DNA

<213> 智人

<400> 9

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggc 60

gccgctagcc aggtacaatt gcaggaatca ggacccggat tggtgaagcc aagtgaaact 120

ctgagtttga cttgcacagt cagcggcttc tcactgacat cctatggggt aagttggatt 180

cggcaaccgg caggtaaggg ccttgaatgg atcggggtca tctgggaaga tgggtcaact 240

aactaccatt ctgcgctgat aagtcgcgtt accatgtcag tcgatacaag caagaatcag 300

ttctctctga aactgagcag tgtgacagcc gcagacaccg cagtgtacta ttgcgcacgc 360

cctcactacg gatcctctta tgtgggagca atggaatatt ggggagcggg aacaacagta 420

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agcacgagtg gtggaacggc cgcactcgga tgtttggtaa aagactattt cccagagccc 540

gtgactgtgt cttggaattc cggtgcactg acttctggtg tgcatacttt tccggccgtg 600

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aagggactgg agtgggtgtc ccggataaga tcaaaatata acaattacgc gacctattat 960

gcagatagtg tcaaaggaag gtttacaata tctcgcgatg attctaaaaa tacgctctat 1020

ctgcagatga atagtttgcg ggccgaagat accgcggtat attattgtgt ccgccacggg 1080

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cctgaagtta agtttaactg gtatgttgat ggggtggaag ttcacaatgc caaaaccaaa 1680

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tataagacca cgccacctgt ccttgacagt gacggaagtt ttttcctgta ttctaaattg 2040

accgtagata agtctcgatg gcagcaagga aacgtgtttt catgctctgt tatgcacgaa 2100

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<210> 10

<211> 121

<212> PRT

<213> 智人

<400> 10

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

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Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Val Ile Trp Glu Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile

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Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

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Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

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<210> 11

<211> 125

<212> PRT

<213> 智人

<400> 11

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 12

<211> 714

<212> PRT

<213> 智人

<400> 12

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Trp Glu Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile

50 55 60

Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Pro His Tyr Gly Ser Ser Tyr Val Gly Ala Met Glu Tyr Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu

225 230 235 240

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser

245 250 255

Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val

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Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser

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Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg

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Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met

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Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His

325 330 335

Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val

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Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser

370 375 380

Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln

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Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val

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Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu

420 425 430

Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu

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Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg

450 455 460

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Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

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Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

500 505 510

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

515 520 525

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

530 535 540

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

545 550 555 560

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly

565 570 575

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

580 585 590

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

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Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

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Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

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Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

645 650 655

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

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Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

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<210> 13

<211> 1479

<212> DNA

<213> 智人

<400> 13

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggc 60

gccgctagcc aggtccagct gcaagagtcc ggacctgggc tggtcaaacc cagtgagacg 120

ttgtccctta cgtgtactgt ctccggcttc agtttgacgt cttatggagt ttcttggata 180

cggcagcccg ccggtaaggg cctcgagtgg attggagtta tatgggaaga tgggtccact 240

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<212> PRT

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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

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Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Val Ile Trp Glu Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile

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Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

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Arg Pro His Tyr Gly Ser Ser Tyr Val Gly Ala Met Glu Tyr Trp Gly

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Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

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Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

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Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

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Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

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Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro

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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

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Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

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Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

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Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

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Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys

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Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr

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Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser

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Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

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Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

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Lys Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

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Leu Ser Pro Gly Lys

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<212> DNA

<213> 智人

<400> 15

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggc 60

gccgctagcg acatacagat gactcaaagc ccctcttcac tgtctgcatc agtcggggac 120

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<212> PRT

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr

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<212> PRT

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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr

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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

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gtttcttgga acagcggggc acttacgagc ggtgttcata cgttccctgc agtgttgcaa 600

tccagcggcc tttattcatt gtcttcagtt gtaacggttc cttctagtag tttggggacc 660

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agcggtacgg cgagcgttgt gtgcttgttg aacaacttct acccacgcga agccaaggtc 1260

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gaggagcagt ataattccac ttatcgcgta gtctctgtac ttacagttct tcaccaagat 1740

tggttgaacg gaaaagaata caagtgtaaa gttagcaata aggcgctcgg agctccgatc 1800

gaaaaaacaa tctccaaagc aaaagggcaa ccccgagaac cacaggtata caccctgccg 1860

ccgtgccgag acgagctgac gaaaaaccaa gtgtccctgt ggtgcttggt gaagggcttt 1920

tatccaagtg acattgcagt tgaatgggag tctaacggac agcctgaaaa taactataag 1980

accacgccac cagtccttga tagcgatgga tctttttttc tctatagcaa gttgactgta 2040

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cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctcccg ggaaatga 2148

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<211> 121

<212> PRT

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<400> 19

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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Trp Glu Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Pro His Tyr Gly Ser Ser Tyr Val Gly Ala Met Glu Tyr Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 20

<211> 692

<212> PRT

<213> 智人

<400> 20

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Trp Glu Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Pro His Tyr Gly Ser Ser Tyr Val Gly Ala Met Glu Tyr Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly

210 215 220

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser

225 230 235 240

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

245 250 255

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln

260 265 270

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr

275 280 285

Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr

290 295 300

Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser

305 310 315 320

Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn

325 330 335

Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

340 345 350

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile

355 360 365

Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val

370 375 380

Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys

385 390 395 400

Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu

405 410 415

Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu

420 425 430

Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr

435 440 445

His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu

450 455 460

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala

465 470 475 480

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

485 490 495

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

500 505 510

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

515 520 525

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

530 535 540

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

545 550 555 560

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro

565 570 575

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

580 585 590

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

595 600 605

Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

610 615 620

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

625 630 635 640

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

645 650 655

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

660 665 670

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

675 680 685

Ser Pro Gly Lys

690

<210> 21

<211> 1419

<212> DNA

<213> 智人

<400> 21

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggc 60

gccgctagcc aggttcaact tcaagaatca ggaccgggct tggttaaacc ttccgaaact 120

ctgagcctta cttgtacagt gtctggtgga tctattacga gctacggagt aagttggatc 180

cggcaaccac ccgggaaagg gctcgaatgg ataggggtga tatgggagga tggttcaacc 240

aactaccata gcgctctgat cagccgggtg accattagtg tcgacacttc caaaaaccag 300

ttttcattga agctctcaag cgtaactgcg gcggataccg ccgtatacta ttgtgcgcgg 360

ccacattacg ggtcctctta tgttggggcg atggaatatt ggggggcagg tacaacggtc 420

acggtgtctt caaccaaagg tccaagcgta tttccactcg caccgtcctc caaatcaacg 480

agtggaggta ctgcggcgtt gggatgcttg gtgaaagact atttcccaga gccggtgaca 540

gttagttgga actcaggcgc gctgactagt ggtgttcaca catttcctgc agttttgcaa 600

tcctcaggcc tctatagcct gtcaagcgtc gtgacagtac ctagcagctc acttggcacg 660

cagacatata tttgtaatgt caaccataag ccctctaaca caaaggtaga taagaaggtt 720

gaacccaagt cctgtgacaa aacgcacact tgtccaccat gtccagcgcc cgaagcagcc 780

gggggcccaa gcgtgttcct cttccctccc aagccaaaag acacccttat gatctcaagg 840

actccagaag tgacatgcgt agtcgttgac gtaagtcacg aggatccgga agtgaagttc 900

aactggtacg tggacggtgt ggaggtacat aacgcgaaga ctaagcccag agaagaacaa 960

tataactcaa cctaccgggt cgtttctgtg ctcacagtgc tccaccagga ctggcttaac 1020

ggaaaagagt ataaatgcaa agtatctaat aaagcgctcg gagcgcccat agagaaaact 1080

atttctaaag caaaaggtca accacgggag ccgcaggttt gcacacttcc accgtccagg 1140

gatgaactta ctaagaacca ggtatctctt tcttgtgccg tgaaaggttt ttatcctagt 1200

gacatcgctg tcgagtggga gagcaacggt cagccggaga ataactataa gaccacacct 1260

ccggttctgg attctgacgg ctctttcttc ctggtatcta agcttacagt cgataaaagt 1320

cgatggcaac aagggaatgt ttttagctgc tctgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380

tacacgcaga agagcctctc cctgtctccc gggaaatga 1419

<210> 22

<211> 449

<212> PRT

<213> 智人

<400> 22

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Trp Glu Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Pro His Tyr Gly Ser Ser Tyr Val Gly Ala Met Glu Tyr Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser

355 360 365

Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 23

<211> 2211

<212> DNA

<213> 智人

<400> 23

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggc 60

gccgctagcc aggttcaact tcaagaatca ggaccgggct tggttaaacc ttccgaaact 120

ctgagcctta cttgtacagt gtctggtgga tctattacga gctacggagt aagttggatc 180

cggcaaccac ccgggaaagg gctcgaatgg ataggggtga tatgggagga tggttcaacc 240

aactaccata gcgctctgat cagccgggtg accattagtg tcgacacttc caaaaaccag 300

ttttcattga agctctcaag cgtaactgcg gcggataccg ccgtatacta ttgtgcgcgg 360

ccacattacg ggtcctctta tgttggggcg atggaatatt ggggggcagg tacaacggtc 420

acggtgtctt caacaaaagg tccttccgta tttccgctcg cacccagctc taagtcaacc 480

tctggcggta ctgcagccct gggttgcctc gtaaaggact attttcctga gccagtaaca 540

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tccagcggcc tttattcatt gtcttcagtt gtaacggttc cttctagtag tttggggacc 660

cagacatata tctgcaacgt gaaccataag ccaagcaata ccaaagttga taagaaggtc 720

gaacctaagt cctgcgacaa aacacacacc tgtcccccct gtccagcccc agaggcagct 780

ggcggcccta gtgtgttctt gttcccgccc aagccaaaag atacactgat gattagccgg 840

acccctgagg taacttgtgt ggtggtggac gtgtctcatg aggacccaga ggtaaaattc 900

aactggtacg tagacggcgt cgaggtccat aatgccaaaa ccaagccacg ggaggagcag 960

tataattcca cttatcgcgt agtctctgta cttacagttc ttcaccaaga ttggttgaac 1020

ggaaaagaat acaagtgtaa agttagcaat aaggcgctcg gagctccgat cgaaaaaaca 1080

atctccaaag caaaagggca accccgagaa ccacaggtat acaccctgcc gccgtgccga 1140

gacgagctga cgaaaaacca agtgtccctg tggtgcttgg tgaagggctt ttatccaagt 1200

gacattgcag ttgaatggga gtctaacgga cagcctgaaa ataactataa gaccacgcca 1260

ccagtccttg atagcgatgg atcttttttt ctctatagca agttgactgt agataaatca 1320

cgatggcaac aaggcaatgt cttttcatgc agcgttatgc atgaggctct gcacaaccac 1380

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tattctaatt tgtgggtctt tggaggcggg acaaaactca ctgtattgta a 2211

<210> 24

<211> 713

<212> PRT

<213> 智人

<400> 24

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Trp Glu Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Pro His Tyr Gly Ser Ser Tyr Val Gly Ala Met Glu Tyr Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

450 455 460

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

465 470 475 480

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

485 490 495

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

500 505 510

Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

515 520 525

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

530 535 540

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

545 550 555 560

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

565 570 575

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

580 585 590

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val

595 600 605

Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu

610 615 620

Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn

625 630 635 640

Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly

645 650 655

Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu

660 665 670

Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp

675 680 685

Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe

690 695 700

Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

705 710

<210> 25

<211> 249

<212> PRT

<213> 智人

<400> 25

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val

130 135 140

Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu

145 150 155 160

Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn

165 170 175

Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly

180 185 190

Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu

195 200 205

Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp

210 215 220

Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe

225 230 235 240

Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

245

<210> 26

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 26

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly

20

<210> 27

<211> 1440

<212> DNA

<213> 智人

<400> 27

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg gtcgactggc 60

gaagtgcagc aggtgcagct tcaggaaagt ggaccgggcc ttgtcaaacc gtcagagacc 120

ctttcactga cttgcactgt aagtggtttc tccctgacaa gctacggagt ctcctggata 180

cgccagccag cggggaaagg gcttgagtgg atcggtgtga tctgggaaga cgggagtaca 240

aactatcact cagcactcat tagtcgagta acaatgtccg ttgacacttc caagaatcaa 300

ttcagtttga aactgtctag tgtgacggct gcggatacag cggtttatta ctgtgccagg 360

cctcattacg gaagttctta tgttggtgca atggagtatt ggggagccgg cacaactgtc 420

actgtgagct ccgtcaccgt ctcaagcgcc tccaccaagg gcccatcggt cttcccgcta 480

gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac 540

tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg ccctgaccag cggcgtccac 600

accttcccgg ctgtcctaca gtcctccgga ctctactccc tcagcagcgt agtgaccgtg 660

ccctccagca gcttgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac 720

accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg 780

tgcccagcac ctgaagccgc ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 840

gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 900

gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 960

acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 1020

ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc 1080

ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 1140

tacaccctgc ccccatgccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gtggtgcctg 1200

gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 1260

aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc 1320

aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 1380

catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 1440

<210> 28

<211> 456

<212> PRT

<213> 智人

<400> 28

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Trp Glu Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile

50 55 60

Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Pro His Tyr Gly Ser Ser Tyr Val Gly Ala Met Glu Tyr Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

115 120 125

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

130 135 140

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

145 150 155 160

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

165 170 175

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

180 185 190

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

195 200 205

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

210 215 220

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

225 230 235 240

Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

245 250 255

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

260 265 270

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

275 280 285

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

290 295 300

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

305 310 315 320

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

325 330 335

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

340 345 350

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr

355 360 365

Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

370 375 380

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

385 390 395 400

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

405 410 415

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

420 425 430

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

435 440 445

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455

<210> 29

<211> 1509

<212> DNA

<213> 智人

<400> 29

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg gtcgactggc 60

gaggtgcagc tggtcgagtc tggaggagga ttggtgcagc ctggagggtc attgaaactc 120

tcatgtgcag cctctggatt caccttcaat aagtacgcca tgaactgggt ccgccaggct 180

ccaggaaagg gtttggaatg ggttgctcgc ataagaagta aatataataa ttatgcaaca 240

tattatgccg attcagtgaa agacaggttc accatctcca gagatgattc aaaaaacact 300

gcctatctac aaatgaacaa cttgaaaact gaggacactg ccgtgtacta ctgtgtgaga 360

catgggaact tcggtaatag ctacatatcc tactgggctt actggggcca agggactctg 420

gtcaccgtct cctcaggtgg tggtggttct ggcggcggcg gctccggtgg tggtggttct 480

cagactgttg tgactcagga accttcactc accgtatcac ctggtggaac agtcacactc 540

acttgtggct cctcgactgg ggctgttaca tctggcaact atccaaactg ggtccaacaa 600

aaaccaggtc aggcaccccg tggtctaata ggtgggacta agttcctcgc ccccggtact 660

cctgccagat tctcaggctc cctgcttgga ggcaaggctg ccctcaccct ctcaggggta 720

cagccagagg atgaggcaga atattactgt gttctatggt acagcaaccg ctgggtgttc 780

ggtggaggaa ccaaactgac tgtcctaggc ggcggaggaa gtgcggccgc gactcacaca 840

tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca 900

aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 960

gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 1020

aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 1080

ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1140

aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1200

ccacaggtgt gcaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 1260

tcctgcgccg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1320

cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1380

ctcgtgagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1440

tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccc 1500

gggaaatga 1509

<210> 30

<211> 482

<212> PRT

<213> 智人

<400> 30

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val

130 135 140

Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu

145 150 155 160

Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn

165 170 175

Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly

180 185 190

Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu

195 200 205

Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp

210 215 220

Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe

225 230 235 240

Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala

245 250 255

Ala Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly

260 265 270

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

275 280 285

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

290 295 300

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

305 310 315 320

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

325 330 335

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

340 345 350

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

355 360 365

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys

370 375 380

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

385 390 395 400

Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

405 410 415

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

420 425 430

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp

435 440 445

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

450 455 460

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

465 470 475 480

Gly Lys

Claims

1.一种双特异性抗原结合分子，包含：(a)第一抗原结合部分和第二抗原结合部分，所述第一抗原结合部分和第二抗原结合部分各自是能够与人PLAP特异性结合的人源化Fab分子，并且各自包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区(PLAP VH)和具有SEQ IDNO:5的氨基酸序列的轻链可变区(PLAP VL)；(b)第三抗原结合部分，所述第三抗原结合部分是能够与人CD3ε特异性结合的Fab分子，所述第三抗原结合部分包含具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链可变区(CD3 VH)和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链可变区(CD3VL)，其中，所述第三抗原结合部分是其中Fab轻链和Fab重链的恒定区被交换的交叉Fab分子；以及(c)人IgG Fc结构域，所述人IgG Fc结构域包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基；

其中，所述第三抗原结合部分的Fab重链(i)在N-末端融合至所述第一抗原结合部分的Fab重链的C-末端(CH1)，并且(ii)在C-末端融合至Fc杵结构域的第一亚基的N-末端，并且其中，所述第二抗原结合部分在Fab重链的C-末端(CH1)融合至Fc臼结构域的第二亚基的N-末端。

2.一种双特异性抗原结合分子，包含：(a)第一抗原结合部分和第二抗原结合部分，所述第一抗原结合部分和第二抗原结合部分各自是能够与人PLAP特异性结合的人源化Fab分子，并且各自包含具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链可变区(PLAP VH)和具有SEQ IDNO:16的氨基酸序列的轻链可变区(PLAP VL)；(b)第三抗原结合部分，所述第三抗原结合部分是能够与人CD3ε特异性结合的Fab分子，所述第三抗原结合部分包含具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链可变区(CD3 VH)和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链可变区(CD3VL)，其中，所述第三抗原结合部分是其中Fab轻链和Fab重链的恒定区被交换的交叉Fab分子；以及(c)人IgG Fc结构域，所述人IgG Fc结构域包含能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基；

3.根据权利要求1或2所述的双特异性抗原结合分子，其中，所述人Fc结构域包含促进所述Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的一个或多个氨基酸取代。

4.根据权利要求1或2所述的双特异性抗原结合分子，其中，所述一个或多个氨基酸取代位于选自L234、L235和P329(EU编号)的组的一个或更多个位置处。

5.一种双特异性抗原结合分子，包含：两个针对PLAP的结合部分和一个针对CD3ε的结合部分，所述分子以2:1:1:1的摩尔比包含SEQ ID NO:5、8、12和14的氨基酸序列。

6.一种双特异性抗原结合分子，包含：两个针对PLAP的结合部分和一个针对CD3ε的结合部分，所述分子以2:1:1:1的摩尔比包含SEQ ID NO:17、8、20和22的氨基酸序列或具有至少95％的序列一致性的氨基酸序列。

7.一种双特异性抗原结合分子，包含：两个针对PLAP的结合部分和一个针对CD3ε的结合部分，所述分子以2:1:1的摩尔比包含SEQ ID NO:17、24和22的氨基酸序列或具有至少95％的序列一致性的氨基酸序列。

8.一种双特异性抗原结合分子，包含：一个针对PLAP的结合部分和一个针对CD3ε的结合部分，所述分子以2:1:1的摩尔比包含SEQ ID NO:5、28和30的氨基酸序列或具有至少95％的序列一致性的氨基酸序列。

9.一种双特异性抗原结合分子，包含：一个针对PLAP的结合部分和一个针对CD3ε的结合部分，所述分子以2:1:1的摩尔比包含SEQ ID NO:17、28和30的氨基酸序列或具有至少95％的序列一致性的氨基酸序列。