CN114437222B

CN114437222B - 一种抗her-2的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌株和应用

Info

Publication number: CN114437222B
Application number: CN202210077082.4A
Authority: CN
Inventors: 徐广贤; 王丽燕; 蒋丹; 张爱君; 李艳宁; 李光琪
Original assignee: Ningxia Medical University; Guangdong Medical University
Current assignee: Ningxia Medical University; Guangdong Medical University
Priority date: 2022-01-24
Filing date: 2022-01-24
Publication date: 2023-04-28
Anticipated expiration: 2042-01-24
Also published as: CN114437222A

Abstract

本发明提供了一种抗HER‑2的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌株和应用，涉及生物医药技术领域。本发明提供了抗HER‑2的纳米抗体，针对HER‑2的重链，包括框架区FR和抗原决定簇互补CDR；同时将编码所述抗HER‑2的纳米抗体基因和人IgG Fc段基因融合表达的重组纳米抗体。在本发明实施例中，所述重组纳米抗体能够特异性的识别并结合HER‑2抗原，亲和力为9.34μM；同时重组纳米抗体对SKBR‑3细胞具有毒性作用，且毒性作用与重组纳米抗体的作用时间以及作用浓度有关，能够应用于肿瘤的分子诊断和抗肿瘤药物的制备。

Description

一种抗HER-2的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌株和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗HER-2的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌株和应用。

背景技术

人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)属于表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)家族。HER-2基因是一种原癌基因，编码HER2受体。其蛋白产物是一种膜结合酪氨酸激酶受体，激活后可促进细胞增殖和肿瘤发展。大约20％～30％的原发性浸润性乳腺癌患者过度表达HER-2，HER-2过表达已被证明在某些侵袭性类型的乳腺癌的发生和发展中起重要作用，与疾病复发率增加和预后不良密切相关。随着许多类型肿瘤基因组图谱的增加，发现HER-2过表达不仅限于乳腺癌，也出现在其他类型肿瘤中，如胃癌、结肠癌、膀胱癌和子宫浆液性癌等。

自从1998年第一个抗HER-2药物曲妥珠单抗(trastuzumab)被美国食品和药品监督管理局(FDA)批准进入临床以来，如今已有多种靶向HER-2的抗体被用来治疗癌症。但是随着研究的发现，单克隆抗体虽然具有一定的疗效，也会使患者引发心脏毒性，并且对一些患者容易产生耐药性。因此，寻求更为有效的抗体用于HER-2过表达癌症的治疗显得尤为迫切。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗HER-2的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌株和应用，所述纳米抗体和重组纳米抗体能够特异性识别并结合HER-2抗原，并对肿瘤细胞表现出时间和剂量依赖效应。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种抗HER-2的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明还提供了一种编码上述抗HER-2的纳米抗体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种抗HER-2的重组纳米抗体，所述重组纳米抗体包括权利要求1所述抗HER-2的纳米抗体和来源于人的IgG Fc段。

优选的，所述重组纳米抗体由N端至C端，依次包括抗HER-2的纳米抗体、连接肽和来源于人的IgG Fc段。

优选的，所述连接肽的编码基因序列如SEQ ID NO.5所示。

优选的，所述重组纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明提供了一种包含上述重组纳米抗体的编码基因的重组表达载体，所述重组表达载体以原核表达载体为基础载体。

本发明还提供了一种表达上述重组纳米抗体的重组菌株，所述重组菌株的基因组中包含上述重组纳米抗体的编码基因或上述重组表达载体。

本发明还提供了上述抗HER-2的纳米抗体、上述的重组纳米抗体或利用上述的重组菌株制备得到的重组纳米抗体在制备抗肿瘤药物或肿瘤诊断试剂中的应用。

本发明还提供了一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物的有效成分包括：上述抗HER-2的纳米抗体、上述的重组纳米抗体或利用上述的重组菌株制备得到的重组纳米抗体。

有益效果：本发明提供了抗HER-2的纳米抗体，针对HER-2的重链，包括框架区FR和抗原决定簇互补CDR；同时将编码所述抗HER-2的纳米抗体基因和人IgG Fc段基因融合表达的重组纳米抗体。在本发明实施例中，所述重组纳米抗体能够特异性的识别并结合HER-2抗原，亲和力为9.34μM；同时重组纳米抗体对SKBR-3细胞具有毒性作用，且毒性作用与重组纳米抗体的作用时间以及作用浓度有关，能够应用于肿瘤的分子诊断和抗肿瘤药物的制备。

附图说明

图1为纳米抗体的第一轮DNA电泳图，各泳道分别表示：第六道为1000bp的Marker(条带大小依次为：1000、700、500、400、300、200、100bp)，第一、二、三及五道为PCR产物，条带约为700bp，第四道为空；

图2为纳米抗体的第二轮DNA电泳图，从左到右泳道分别表示：第一道为1000bp的Marker(条带大小同上)，第二、四及六道为PCR产物，条带约为400bp，第三及五道为空；

图3为用噬菌体的酶联免疫方法(phage-ELISA)筛选特异性单个阳性克隆的模式图：其中1是将HER-2抗原包被在酶标板上，2是噬菌体上清，3是鼠抗km13107抗体，4是山羊抗鼠IgG(AP)的抗体，5是TMB显色液；

图4为纯化的重组纳米抗体，其中，左图为破碎后处理样品、流出样品和洗脱样品的SDS-PAGE电泳染色图；右图为纯化后的重组纳米抗体的SDS-PAGE电泳染色图；

图5为HER-2抗原的westernblot图；

图6为重组纳米抗体与HER-2抗原亲和力检测图；

图7为重组纳米抗体与SKBR-3细胞免疫荧光图；

图8为重组纳米抗体对SKBR-3细胞增殖-毒性检测图，图中每组数据从左到右依次表示control、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL和100μg/mL，且图中HER-2Nb表示重组纳米抗体。

具体实施方式

本发明提供了一种抗HER-2的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示：QVQLQESGGGSVGLGGSLRLTCTISAVIDDYCMGWYRQAPGKWREGVADIAESGTPGYIDSVRGRFIISRDNDKNILYLQMNSLKPEDTAMYYCAARLRGSCSTDPHNFGYWGQGTQVTVSS。

本发明所述抗HER-2的纳米抗体优选包括框架区FR和抗原决定簇互补区CDR，更优选的所述框架区FR包括FR1、FR2、FR3和FR4。

本发明所述框架区FR的氨基酸序列及对应的核苷酸序列优选如下：

FR1:QVQLQESGGGSVGLGGSLRLTCTIS(SEQ ID NO.6)；

FR2:MGWYRQAPGKWREGVAD(SEQ ID NO.7)；

FR3:GYIDSVRGRFIISRDNDKNILYLQMNSLKPEDTAMYYC(SEQ ID NO.8)；

FR4:WGQGTQVTVSS(SEQ ID NO.9)；

对应的核苷酸序列如下：

FR1:CAGGTCCAACTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGGGGCTTGGAGGGTCTCTGAGACTCACCTGCACAATCTCC(SEQ ID NO.10)；

FR2:ATGGGTTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAATGGCGCGAGGGGGTCGCAGAC(SEQ IDNO.11)；

FR3:GGCTACATAGACTCCGTGAGGGGCCGATTCATCATCTCCCGGGACAACGACAAGAACATTCTGTATCTCCAAATGAACAGCCTAAAACCTGAGGACACCGCCATGTACTACTGT(SEQ ID NO.12)；

FR4:TGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO.13)。

本发明所述抗原决定簇互补区CDR优选包括CDR1、CDR2和CDR3，氨基酸序列及对应的核苷酸序列优选如下：

CDR1:AVIDDYC(SEQ ID NO.14)；

CDR2:IAESGTP(SEQ ID NO.15)；

CDR3:AARLRGSCSTDPHNFGY(SEQ ID NO.16)；

对应的核苷酸序列具体如下：

CDR1:GCCGTAATCGACGACTACTGT(SEQ ID NO.17)；

CDR2:ATTGCCGAATCTGGCACCCCA SEQ ID NO.18)；

CDR3:GCGGCTAGATTACGTGGCTCGTGTAGCACGGACCCCCACAACTTTGGTTAC(SEQ IDNO.19)。

本发明所述抗HER-2的纳米抗体优选驼源，且对所述抗HER-2的纳米抗体的筛选方法并没有特殊限定，优选用噬菌体表面展示技术构建天然驼源纳米抗体噬菌体展示文库，然后以生物素化的HER-2抗原为基础进行筛选，获得HER-2特异性的纳米抗体基因序列。

本发明所述天然驼源纳米抗体噬菌体展示文库的构建方法，优选包括：1)提取骆驼脾脏组织总RNA、反转录所述总RNA获得cDNA；2)以所述cDNA为模板进行巢式PCR扩增获得重链抗体的可变区片段；3)分别酶切所述重链抗体的可变区片段和pcantab5e噬菌体载体后，进行连接获得连接产物；4)将所述连接产物转入感受态细胞中获得天然驼源纳米抗体噬菌体展示文库。

本发明对所述生物素化的HER-2抗原筛选抗HER-2纳米抗体的具体步骤没有特殊限定，采用本领域常规纳米抗体筛选方法即可。

本发明还提供了一种编码上述抗HER-2的纳米抗体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：CAGGTCCAACTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGGGGCTTGGAGGGTCTCTGAGACTCACCTGCACAATCTCCGCCGTAATCGACGACTACTGTATGGGTTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAATGGCGCGAGGGGGTCGCAGACATTGCCGAATCTGGCACCCCAGGCTACATAGACTCCGTGAGGGGCCGATTCATCATCTCCCGGGACAACGACAAGAACATTCTGTATCTCCAAATGAACAGCCTAAAACCTGAGGACACCGCCATGTACTACTGTGCGGCTAGATTACGTGGCTCGTGTAGCACGGACCCCCACAACTTTGGTTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA。

本发明对所述基因的获得方法并没有特殊限定，优选与上述相同，在此不再赘述。

本发明所述重组纳米抗体由N端至C端，优选依次包括抗HER-2的纳米抗体、连接肽和来源于人的IgG Fc段，且所述连接肽的编码基因序列优选如SEQ ID NO.5所示：GGTGGTGGTGGTAGT；并且编码所述IgG Fc段的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.24所示：GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGGGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA。

本发明所述重组纳米抗体的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.4所示：QVQLQESGGGSVGLGGSLRLTCTISAVIDDYCMGWYRQAPGKWREGVADIAESGTPGYIDSVRGRFIISRDNDKNILYLQMNSLKPEDTAMYYCAARLRGSCSTDPHNFGYWGQGTQVTVSSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；所述重组纳米抗体的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.3所示：CAGGTCCAACTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGGGGCTTGGAGGGTCTCTGAGACTCACCTGCACAATCTCCGCCGTAATCGACGACTACTGTATGGGTTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAATGGCGCGAGGGGGTCGCAGACATTGCCGAATCTGGCACCCCAGGCTACATAGACTCCGTGAGGGGCCGATTCATCATCTCCCGGGACAACGACAAGAACATTCTGTATCTCCAAATGAACAGCCTAAAACCTGAGGACACCGCCATGTACTACTGTGCGGCTAGATTACGTGGCTCGTGTAGCACGGACCCCCACAACTTTGGTTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTGGTGGTAGTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAA。

本发明所述原核表达载体优选包括pET-30a，在本发明实施例中，优选将SEQ IDNO.5所示的序列插入所述pET-30a的NdeI-XhoI位点之间，从而得到所述重组表达载体。本发明对所述重组表达载体的制备方法并没有特殊限定，优选利用本领域的常规重组载体制备方法即可。

本发明所述重组菌株优选以大肠杆菌为基础菌，实施例中选择大肠杆菌ArcticExpress作为基础菌。本发明优选将上述重组载体转入所述大肠杆菌Arctic Express中获得所述重组菌株。本发明对所述重组菌株的具体制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的重组菌株的制备方法即可。

本发明所述抗HER-2的纳米抗体或重组纳米抗体均能够特异识别并结合特异性抗原HER-2，并对肿瘤细胞具有毒害作用。本发明实施例中优选以人乳腺癌细胞SKBR-3为例进行说明，所述重组纳米抗体对SKBR-3细胞具有毒性作用，且毒性作用与重组纳米抗体的作用时间以及作用浓度有关。

本发明对所述重组菌株制备重组纳米抗体的方法并没有特殊限定，优选利用IPTG诱导。

本发明所述抗肿瘤药物中优选还包括药学上可接受的辅料，且对所述剂型的种类并没有特殊限定，根据剂型选择对应的辅料即可。

下面结合实施例对本发明提供的一种抗HER-2的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌株和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

针对于天然驼源纳米抗体基因库的构建

(1)Trizol法提取骆驼脾脏组织总RNA，利用TIANGEN公司提供的RNA纯化试剂盒纯化，按照Thermo Scientific ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kits试剂盒反转录得到cDNA。

(2)以cDNA为模板，用巢式PCR扩增得到重链抗体的可变区片段；

第一轮PCR：

上游引物：5’-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAAG-3’(SEQ ID NO.20)；

下游引物：5’-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3’(SEQ ID NO.21)；

第一轮PCR反应体系(20μL)：cDNA 2μL、Mix 10μL、上游引物1μL、下游引物1μL和ddH₂O余量；

第一轮PCR扩增反应条件为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃45s，32个循环；72℃10min。

扩增重链抗体引导肽和抗体CH2之间的片段，结果如图1所示，显示该片段的大小约为700bp，即纳米抗体基因电泳条带约为700bp。

第二轮PCR：

以第一轮PCR产物为模板，配制第二轮PCR的反应体系(50μL)：第一轮PCR产物2μL、Mix25μL、上游引物1μL、下游引物1μL和ddH₂O余量。

上游引物：

5'-TCGCGGCCCAGCCGGCCCAGGTCCAACTGCAGGAGTCTGGGG-3'(SEQ ID NO.22)；

下游引物：

5'-ATAAGAATGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGTCCCC-3'(SEQ ID NO.23)。

第二轮PCR扩增反应条件为：94℃5min；94℃40s，55℃40s，72℃40s，25个循环；72℃10min。扩增重链抗体FR1区和长、短铰链区之间的片段(长片段和短片段)如图2所示，该片段的大小约为400bp，即纳米抗体基因电泳条带约为400bp。

使用限制性内切酶(购自Takara公司)SifI和Not I酶切pcantab5e噬菌体载体及VHH片段(即本发明所述的抗HER-2的纳米抗体)，并用T4 DNA连接酶(购自Takara公司)连接两个片段。

将连接产物电转化至电转感受态细胞TG1中，构建天然驼源纳米抗体噬菌体展示文库，经辅助噬菌体救援后，其库容量达9.0×10¹³。

其中辅助噬菌体救援步骤如下：

①取100μL的文库，接种于50mL的2×YT/Amp/Glu培养基中，37℃，200rpm，震荡培养至对数期OD₆₀₀约为0.4～0.5。

②向培养液中加入感染复数为20:1的辅助噬菌体M13KO7，混匀后37℃静置30min。

③将培养液在室温，9000rpm，离心10min，弃上清沉淀菌体，用200mL的2×YT/Amp/Kana培养液重悬，37℃200rpm，培养过夜。

④将培养液于4℃，9000rpm，离心10min取上清，加入1/5体积的PEG/NaCl，4℃静置6h。

⑤9000rpm离心20min弃上清，用PBS(1mL)重悬沉淀，得到重组噬菌体抗体库，分装到1.5mL Ep管中，4℃保存。

与此同时，通过菌落PCR检测文库的插入率，引物使用第二轮PCR引物，退火温度55℃，结果显示插入率达到95％以上(目的片段插入率＝含目的片段的菌落数/所有菌落数)。

针对抗HER-2纳米抗体的筛选过程：

将噬菌体文库(1×10¹²个噬菌体)与50μL链霉亲和素磁珠在转动台上室温孵育1h后，收集噬菌体抗体；在2个已用2％PBSM封闭过的1mL离心管中，分别加入500μL预先削减的噬菌体抗体，再向一个离心管中加入500μL用PBS稀释的5μg生物素化的HER-2抗原，另一个离心管中加入500μL的PBS缓冲液作为阴性对照，在转动台上室温孵育1h，后加入预先封闭的50μL的链霉亲和素磁珠，在转动台上室温孵育30min，收集磁珠。用PBST洗涤磁珠7次，PBSM洗涤2次，PBS洗涤1次。加入pH2.7的Glycine进行洗脱，pH9.1的1mol/L Tris-HCl进行中和。将上述中和液加入到5mL处于对数生长期的TG1(OD₆₀₀为0.5)中，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选，经过3轮筛选，阳性克隆将不断得到富集，从而达到了利用噬菌体展示技术筛选抗体库中HER-2特异性抗体的目的。

噬菌体的酶联免疫方法(phage-ELISA)筛选特异性单个阳性克隆：

筛选原理模式图如图3所示，具体方法如下：

首先制备VHH噬菌体单克隆上清：从3轮筛选后的固体平板上，随机挑取90个单菌落并接种于含有100μg/mL的氨苄青霉素及2％的葡萄糖的2×YT培养基中，220rpm 37℃培养过夜，次日取50μL菌液至新的96深孔板中，每孔加入800μL含有100μg/mL的氨苄青霉素及2％的葡萄糖的2×YT培养基，生长至对数期后，加入感染复数为20:1的辅助噬菌体M13K07，37℃侵染30min，10000rpm离心5min，弃上清，用800μL含有100ug/mL的氨苄青霉素及50ug/mL的卡那青霉素的新鲜2×YT培养基重悬菌体，37℃，220rpm培养12h，次日，将菌液10000rpm，离心5min，其上清即为VHH噬菌体单克隆上清。

用包被液将HER-2抗原稀释至10μg/mL，每孔加入100μL，4℃包被过夜，并设立阴性和阳性对照。次日，用PBST洗涤三次，用2％PBSM于37℃封闭2h，用PBST洗涤三次，加入200μL预处理的VHH噬菌体单克隆上清，37℃孵育1h。加入1:5000的用0.1％的PBST稀释的鼠源性抗M13KO7/HRP的二抗，37℃孵育1h，洗去未结合的抗体，加入TMB显色液，于酶标仪上在450nm波长处读取吸光度值。当样品孔OD值大于对照孔OD两倍以上时判定为阳性对照孔，取阳性菌液进行基因测序。

使用DNAMAN软件进行序列分析及blast比对，把CDR1、CDR2、CDR3序列相同的菌株视为同一克隆株。最终采用氨基酸序列SEQ ID NO.1所示的纳米抗体序列做后续实验。

实施例2

重组纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中的表达及纯化

(1)将测序分析所获得的的纳米抗体序列(SEQ ID NO.1)连接人源性IgGFc段并亚克隆pET-30a质粒载体中，并转化至大肠杆菌Arctic Express，挑取转化平板上的单克隆接种于含50μg/mL Kan的3mL LB培养液的试管中，37℃220rpm振摇过夜；(2)次日按1:100接种于50μg/mL Kan的30mL LB培养液中，37℃220rpm振摇至菌体OD₆₀₀为0.6～0.8，加入IPTG至终浓度为0.5mM，20℃220rpm振摇过夜，诱导融合蛋白表达；(3)收集菌体并进行超声破碎，得到包涵体蛋白粗体液，后经Ni柱亲和纯化得到融合蛋白。图4是纯化的重组纳米抗体，其中左图为重组纳米抗体纯化过程的SDS-PAGE电泳染色图：其中泳道M为蛋白分子标准，泳道1-3分别是破碎后处理样品、流出样品和洗脱样品；右图为纯化后的重组纳米抗体的SDS-PAGE电泳染色图，其中泳道M为蛋白分子标准，泳道1是0.5mg/mL的BSA作为浓度衡量标准，泳道2是纯化的重组纳米抗体。

实施例3

重组纳米抗体的特异性验证

用HER-2抗原做western blot(其中一抗用实施例2纯化的重组纳米抗体，二抗为抗人IgG Fc/HRP)，图5为HER-2抗原的western blot图：其中泳道M是蛋白分子标准，泳道1是HER-2抗原。由此说明，本发明提供的重组纳米抗体可与HER-2抗原特异性结合。

实施例4

重组纳米抗体与HER-2抗原亲和力检测

采用表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)技术检测本发明实施例2重组纳米抗体与HER-2抗原的亲和力。将重组纳米抗体从浓度1000nM起始2倍倍比稀释至62.5nM。将稀释后的重组纳米抗体以30μL/min的流速注入到实验通道与参比通道，结合时间为60s，解离时间为90s。结合解离步骤均在运行试剂中进行。每一个浓度分析后，芯片需要用3M氯化镁以20μL/min的流速冲洗30s。使用Biacore 8K分析软件Biacore InsightEvaluation Software计算抗体的KD值。检测结果如图6所示，重组纳米抗体与HER-2抗原的亲和力为9.34μM。

实施例5

重组纳米抗体对SKBR-3细胞增殖-毒性检测

用重组纳米抗体与SKBR-3细胞做免疫荧光，其中一抗用实施例2纯化的重组纳米抗体，二抗为抗人IgG Fc/FITC，图7为细胞免疫荧光结果图。由此说明，本发明提供的重组纳米抗体可以与SKBR-3细胞上表达的HER-2分子结合。

采用CCK-8试验检测实施例2重组纳米抗体对SKBR-3细胞的毒性作用。用SKBR-3细胞铺96孔板，每孔1×10⁴个细胞，设置对照孔和空白孔，实验孔加入不同浓度的重组纳米抗体，孵育培养至设置的不同时间点。在到达设置时间点前2h，每孔加入10μL CCK-8试剂继续培养，然后于酶标仪上检测A₄₅₀，细胞存活率计算公式：[(A实验孔-A空白孔)/(A对照孔-A空白孔)]。结果如图8，细胞存活率随重组纳米抗体作用时间的延长以及作用浓度的增高而下降，具有剂量依赖性。高浓度重组纳米抗体(50μg/mL、100μg/mL)对SKBR-3细胞的毒性作用明显强于低浓度(P<0.05)。综上，本发明提供的重组纳米抗体对SKBR-3细胞具有毒性作用，且毒性作用与重组纳米抗体的作用时间以及作用浓度有关。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 广东医科大学

宁夏医科大学

<120> 一种抗HER-2的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌株和应用

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gly Leu Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Thr Cys Thr Ile Ser Ala Val Ile Asp Asp Tyr Cys

20 25 30

Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Trp Arg Glu Gly Val Ala

35 40 45

Asp Ile Ala Glu Ser Gly Thr Pro Gly Tyr Ile Asp Ser Val Arg Gly

50 55 60

Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Gln

65 70 75 80

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala

85 90 95

Arg Leu Arg Gly Ser Cys Ser Thr Asp Pro His Asn Phe Gly Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 365

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caggtccaac tgcaggagtc tgggggaggc tcggtggggc ttggagggtc tctgagactc 60

acctgcacaa tctccgccgt aatcgacgac tactgtatgg gttggtaccg ccaggctcca 120

gggaaatggc gcgagggggt cgcagacatt gccgaatctg gcaccccagg ctacatagac 180

tccgtgaggg gccgattcat catctcccgg gacaacgaca agaacattct gtatctccaa 240

atgaacagcc taaaacctga ggacaccgcc atgtactact gtgcggctag attacgtggc 300

tcgtgtagca cggaccccca caactttggt tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 360

tcctc 365

<210> 3

<211> 1077

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caggtccaac tgcaggagtc tgggggaggc tcggtggggc ttggagggtc tctgagactc 60

acctgcacaa tctccgccgt aatcgacgac tactgtatgg gttggtaccg ccaggctcca 120

gggaaatggc gcgagggggt cgcagacatt gccgaatctg gcaccccagg ctacatagac 180

tccgtgaggg gccgattcat catctcccgg gacaacgaca agaacattct gtatctccaa 240

atgaacagcc taaaacctga ggacaccgcc atgtactact gtgcggctag attacgtggc 300

tcgtgtagca cggaccccca caactttggt tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 360

tcctcaggtg gtggtggtag tgagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg 420

tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 480

gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 540

gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 600

acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 660

ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc 720

ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 780

tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 840

gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 900

aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctatagc 960

aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 1020

catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtcccc gggtaaa 1077

<210> 4

<211> 359

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gly Leu Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Thr Cys Thr Ile Ser Ala Val Ile Asp Asp Tyr Cys

20 25 30

Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Trp Arg Glu Gly Val Ala

35 40 45

Asp Ile Ala Glu Ser Gly Thr Pro Gly Tyr Ile Asp Ser Val Arg Gly

50 55 60

Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Gln

65 70 75 80

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala

85 90 95

Arg Leu Arg Gly Ser Cys Ser Thr Asp Pro His Asn Phe Gly Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

115 120 125

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

130 135 140

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

145 150 155 160

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

165 170 175

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

180 185 190

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

195 200 205

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

210 215 220

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

225 230 235 240

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

245 250 255

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys

260 265 270

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

275 280 285

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

290 295 300

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

305 310 315 320

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

325 330 335

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

340 345 350

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

355

<210> 5

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtggtggtg gtagt 15

<210> 6

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gly Leu Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Thr Cys Thr Ile Ser

20 25

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Trp Arg Glu Gly Val Ala

1 5 10 15

Asp

<210> 8

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gly Tyr Ile Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Asp Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

35

<210> 9

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 10

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

caggtccaac tgcaggagtc tgggggaggc tcggtggggc ttggagggtc tctgagactc 60

acctgcacaa tctcc 75

<210> 11

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgggttggt accgccaggc tccagggaaa tggcgcgagg gggtcgcaga c 51

<210> 12

<211> 114

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggctacatag actccgtgag gggccgattc atcatctccc gggacaacga caagaacatt 60

ctgtatctcc aaatgaacag cctaaaacct gaggacaccg ccatgtacta ctgt 114

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc tca 33

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Ala Val Ile Asp Asp Tyr Cys

1 5

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Ile Ala Glu Ser Gly Thr Pro

1 5

<210> 16

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Ala Ala Arg Leu Arg Gly Ser Cys Ser Thr Asp Pro His Asn Phe Gly

1 5 10 15

Tyr

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gccgtaatcg acgactactg t 21

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

attgccgaat ctggcacccc a 21

<210> 19

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gcggctagat tacgtggctc gtgtagcacg gacccccaca actttggtta c 51

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gtcctggctg ctcttctaca aag 23

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23

<210> 22

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tcgcggccca gccggcccag gtccaactgc aggagtctgg gg 42

<210> 23

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ataagaatgc ggccgctgag gagacggtga cctgggtccc c 41

<210> 24

<211> 696

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60

gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120

acccctgggg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420

gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 600

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660

tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 696

Claims

1.一种抗HER-2的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码权利要求1所述抗HER-2的纳米抗体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种抗HER-2的重组纳米抗体，其特征在于，所述重组纳米抗体包括权利要求1所述抗HER-2的纳米抗体和来源于人的IgGFc段。

4.根据权利要求3所述重组纳米抗体，其特征在于，所述重组纳米抗体由N端至C端，依次包括抗HER-2的纳米抗体、连接肽和来源于人的IgGFc段。

5.根据权利要求4所述重组纳米抗体，其特征在于，所述连接肽的编码基因序列如SEQID NO.5所示。

6.根据权利要求3或4所述重组纳米抗体，其特征在于，所述重组纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

7.一种包含权利要求3～6任一项所述重组纳米抗体的编码基因的重组表达载体，所述重组表达载体以原核表达载体为基础载体。

8.一种表达权利要求3～6任一项所述重组纳米抗体的重组菌株，所述重组菌株的基因组中包含权利要求3～6任一项所述重组纳米抗体的编码基因或权利要求7所述重组表达载体。

9.权利要求1所述抗HER-2的纳米抗体、权利要求3～6任一项所述的重组纳米抗体或利用权利要求8所述的重组菌株制备得到的重组纳米抗体在制备抗肿瘤药物或肿瘤诊断试剂中的应用。

10.一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物的有效成分包括：权利要求1所述抗HER-2的纳米抗体、权利要求3～6任一项所述的重组纳米抗体或利用权利要求8所述的重组菌株制备得到的重组纳米抗体。