CN108409861A - 一种双特异性抗体及其应用 - Google Patents

一种双特异性抗体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108409861A
CN108409861A CN201810183124.6A CN201810183124A CN108409861A CN 108409861 A CN108409861 A CN 108409861A CN 201810183124 A CN201810183124 A CN 201810183124A CN 108409861 A CN108409861 A CN 108409861A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
bispecific antibody
amino acid
acid sequence
vegfr2
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810183124.6A
Other languages
English (en)
Inventor
李陶
刘佳
吴春风
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sino US cel Biotechnology (Guangdong) Co.,Ltd.
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201810183124.6A priority Critical patent/CN108409861A/zh
Publication of CN108409861A publication Critical patent/CN108409861A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种双特异性抗体。本发明公开一种VEGFR2抗体，还提供了一种双特异性抗体，其包括VEGFR2抗体、连接肽和CD16A抗体，所述VEGFR2抗体、所述连接肽和所述CD16A抗体顺次连接。本发明公开的VEGFR2抗体和CD16A抗体连接的双特异性抗体，能特异性地与靶细胞或肿瘤细胞结合，还能激活NK细胞发生抗体依赖性细胞毒性ADCC反应，同时VEGFR2抗体还能抑制肿瘤的生长和转移。

Description

一种双特异性抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种双特异性抗体及其应用。
背景技术
CAR-T，全称是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，是目前较为有效的恶性肿瘤的治疗方式之一。嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。第一代CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。第二代是双特异性T细胞衔接器(Bispeific T cell Engager，BiTE)：又称为串联单链抗体，是由两个单链抗体通过一个灵活的连接肽(linker)如甘氨酸、丝氨酸等重复基序连接而成的串联结构，一般通过基因工程技术直接产生全人源的BiTE抗体。该双特异抗体就可在T细胞内表达分泌，一端是特异性识别肿瘤抗原的ScFv，另一端为特异性活化T细胞的ScFv，不仅可以使回输进体内的T淋巴细胞发挥特异性的抗肿瘤效应，而且还可以活化体内其他T淋巴细胞发挥抗肿瘤效应。
目前，CAR-T技术存在两个缺陷，一是CAR-T技术不能介导体内大量常驻NK细胞靶向肿瘤；二是，BiTE技术中BsAb在体内不能自我扩增、半衰期短、在体内无有效分布。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种双特异性抗体及其应用，能有效解决目前CAR-T技术不能介导体内大量常驻NK细胞靶向肿瘤以及BsAb在体内不能自我扩增、半衰期短和无有效的体内分布的技术缺陷。
本发明公开一种VEGFR2抗体，其具有重链可变区和轻链可变区：
(1)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸；或者与(1)所示的氨基酸序列至少有90％同源性的且功能相同或相似的氨基酸序列；
(2)所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸；或者与(2)所示的氨基酸序列至少有90％同源性的且功能相同或相似的氨基酸序列。
作为优选，所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个或36个。
更为优选，抗体还包括恒定区，所述的恒定区为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的任意一种。
进一步的，本发明还公开了一种VEGFR2抗体的表达载体，包括编码SEQID No.1和SEQ ID No.2的核苷酸。
进一步的，本发明还公开了一种VEGFR2抗体的宿主细胞，所述的宿主细胞经由所述的表达载体转化或转染而来，为原核细胞或真核细胞。
进一步的，本发明还公开了一种VEGFR2抗体的结合物，包含与化学标记或生物标记共价连接的所述的抗VEGFR2抗体。
进一步的，本发明还公开了一种偶联物，其由所述的抗VEGFR2抗体和/或所述的结合物与固体介质或半固体介质偶联形成。
进一步的，本发明还公开了一种药物组合物，包括所述的抗VEGFR2抗体和/或所述的结合物和/或所述的偶联物。
本发明提供了一种双特异性抗体，其包括VEGFR2抗体、连接肽和CD16A抗体；所述VEGFR2抗体、所述连接肽和所述CD16A抗体顺次连接。
作为优选，所述VEGFR2抗体，其具有重链可变区和轻链可变区：
(1)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸；或者与(1)所示的氨基酸序列至少有90％同源性的且功能相同或相似的氨基酸序列；
(2)所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸；或者与(2)所示的氨基酸序列至少有90％同源性的且功能相同或相似的氨基酸序列。
需要说明的是，VEGFR2抗体的重链可变区和轻链可变区通过抗体内短肽连接形成，抗体内短肽的氨基酸序列具体为GGGGS。
更为优选，所述CD16A抗体具有重链可变区和轻链可变区：
(3)所述CD16A抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸；或者与(3)所示的氨基酸序列至少有90％同源性的且功能相同或相似的氨基酸序列；
(4)所述CD16A抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸；或者与(4)所示的氨基酸序列至少有90％同源性的且功能相同或相似的氨基酸序列。
需要说明的是，CD16A抗体的重链可变区和轻链可变区通过抗体内短肽连接形成，抗体内短肽的氨基酸序列具体为GGGGS，该抗体内短肽的人工合成获得。
作为优选，所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个或36个。
作为优选，所述双特异性抗体还包括信号肽。
更为优选，所述信号肽的核苷酸序列如(5)所示，信号肽的核苷酸序列如SEQ IDNo.5所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸；或者与(5)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的且功能相同或相似的核苷酸序列。
需要说明的是，所述信号肽为人源IgG的前导肽。
作为优选，所述双特异性抗体还包括Fc片段。
更为优选，所述Fc片段的氨基酸序列如(6)所示，Fc片段的核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸；或者与(6)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的且功能相同或相似的核苷酸序列。
需要说明的是，本发明增加了Fc段，采用scFv-Fc的构型，Fc段有助于双特异性抗体的稳定。
更为优选，所述连接肽如SEQ ID No.7所示。
请参阅图1，Signal peptide为信号肽，信号肽的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，Anti-CD16AscFv为CD16A抗体，CD16A抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，Long linker用于连接VEGFR2抗体和CD16A抗体的连接肽，连接肽的氨基酸序列如SEQID No.7所示，VEGFR2抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，Fc片段的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
进一步的，本发明还提供一种编码双特异性抗体的核苷酸序列，包括编码所述的双特异性抗体的核苷酸序列。
进一步的，本发明还提供一种双特异性抗体的表达载体，包括编码所述的双特异性抗体的核苷酸。
进一步的，本发明还提供一种双特异性抗体的宿主细胞，所述的宿主细胞经由所述的双特异性抗体的表达载体转化或转染而来。
其中，所述的宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
需要说明的是，本发明宿主细胞能长时间将双特异性抗体的表达载体保存。
进一步的，本发明还一种双特异性抗体的药物，包括被所述的双特异性抗体修饰的NK细胞。
本发明还提供了所述的双特异性抗体和/或所述的双特异性抗体的盐药物在制备提高NK细胞的肿瘤杀伤力药物中的应用。
需要说明的是，所述双特异性抗体的VEGFR2抗体和CD16A抗体除了本申请提供的外，也可以是已知的功能相同或相似的VEGFR2抗体和已知的功能相同或相似的CD16A抗体。
本发明发现，血管内皮细胞生长因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)及其受体在肿瘤的生长和转移中起关键性作用，可以通过阻断VEGF/VEGFR信号传导通路来控制肿瘤生长，达到治疗肿瘤的目的。VEGFR2作为目前研究较为明确的VEGF受体之一，在介导内皮细胞增殖、迁移、分化、微管形成及血管通透性增加等一系列生物学活性中发挥着重要作用。但是人源化抗VEGFR2抗体药物能够阻断血管内皮生长因子配体(VEGF-A，-C，-D)的相互作用，并抑制受体激活。但是该抗体不能激活机体淋巴细胞的免疫杀伤作用，从而丧失了机体进一步对肿瘤的杀伤效果。
本发明是基于双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb)的性质，创造性的将血管内皮细胞生长因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)和CD16A的特性连接起来形成双特异性抗体，双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb)是由两种不同的抗体片段构成的一种人工蛋白质。由于包含两种不同的抗原结合域，一个双特异性抗体能够识别和结合两个不同的抗原或两个不同的抗原表位。在肿瘤免疫治疗中，双特异性抗体能够同时结合肿瘤细胞表面受体和免疫效应细胞的受体，因此它能选择性识别肿瘤细胞，还能将循环血液中的免疫效应细胞引至肿瘤组织，并诱导免疫效应细胞产生抗肿瘤活性。
本发明公开的VEGFR2抗体和CD16A抗体连接的双特异性抗体(VEGFR2×CD16A)，能导入NK细胞中表达。由于CD16A是一种分布于NK细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞表面的跨膜结构的IgG Fc受体，双特异性抗体的CD16A与NK细胞结合并激活NK细胞，激活NK细胞通过释放颗粒酶及穿孔素等将靶细胞杀死。CD16A介导NK细胞和单核巨噬细胞的ADCC作用，因此，本发明可以克服CAR-T技术不能介导体内大量常驻NK细胞靶向肿瘤的缺点，通过体内分泌双特异性抗体，不但介导修饰后的NK细胞靶向肿瘤，还可介导体内未修饰NK细胞靶向肿瘤。另一方面，它还可以克服BITE技术中双特异性抗体在体内不能自我扩增、半衰期短、无有效的体内分布等缺点，由于BITE技术只是简单的将两个抗体ScFv串联，分子量小，在体内易被清除，半衰期短。此外，BITE并未整合进细胞的基因组内，不能借助免疫细胞的趋向性实现体内的有效分布，更不能实现自我扩增。本发明的双特异性抗体在体内通过NK细胞大量分泌双特异性抗体，而不需多次回输，并且利用NK细胞本身的趋化性，实现在体内的有效分布，从而更有效的介导NK细胞靶向肿瘤，使得VEGFR2具有了激活机体淋巴细胞的免疫杀伤的作用，因此，本发明的双特异性抗体能特异性地与靶细胞(肿瘤细胞)结合，还能激活NK细胞发生抗体依赖性细胞毒性(ADCC)反应，同时VEGFR2抗体还能抑制肿瘤的生长和转移。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示双特异性抗体(VEGFR2×CD16A)基因片段的构建；
图2示琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定重组质粒(M为marker，pWXPL为pWXPL组，pWXPL-BsAb为pWXPL-VEGFR2×CD16A载体组)；
图3示流式细胞仪检测NK细胞表型；
图4示表达产物的SDS-PAGE蛋白电泳图谱(M为marker，pWXPL为pWXPL组，pWXPL-BsAb为pWXPL-VEGFR2×CD16A载体组)；
图5示双特异性抗体与NK细胞的亲和性分析(NK-BsAb为被双特异性抗体基因修饰的NK细胞)；
图6示双特异性抗体与肺癌细胞Calu-1的亲和性分析(Calu-BsAb为与双特异性抗体特异性结合的肺癌细胞Calu-1)；
图7示肺癌细胞Calu-1细胞因子分泌(NK-BsAb为肺癌细胞Calu-1与被双特异性抗体基因修饰的NK细胞组)；
图8示肺癌细胞A549细胞因子分泌(NK-BsAb为肺癌细胞A549与被双特异性抗体基因修饰的NK细胞组)；
图9示细胞水平肿瘤抑制率检测(NK+Calu-1为NK细胞与肺癌细胞Calu-1组，NK-BsAb+Calu-1为被双特异性抗体基因修饰的NK细胞组与肺癌细胞Calu-1组，NK+A549为NK细胞与肺癌细胞A549组，NK-BsAb+A549为被双特异性抗体基因修饰的NK细胞组与肺癌细胞A549组)；
图10示体内抗瘤能力检测(Control为生理盐水对照组、NK为单纯NK组、NK-BsAb为NK-VEGFR2×CD16A组)；
图11示生存率(Control为生理盐水对照组、NK为单纯NK组、NK-BsAb为NK-VEGFR2×CD16A组)。
具体实施方式
本发明提供了一种双特异性抗体及其应用，能有效解决目前CAR-T技术不能介导体内大量常驻NK细胞靶向肿瘤以及BsAb在体内不能自我扩增、半衰期短和无有效的体内分布的技术缺陷。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
其中，以下实施例的原料为市售或自制；以下实施例的序列信息来源为：收集50例健康人的外周血各10ml，混合，用淋巴细胞分离液(天津灏洋公司产品)分离单个核细胞。用Trizol试剂(Takara公司产品)从分离的人外周血单个核细胞中提取总RNA，用cDNA反转录试剂盒(Takara公司产品)反转录出cDNA，通过人的外周血cDNA获得SEQ ID No.1至SEQ IDNo.4的序列，本发明实施例的信号肽通过人类的遗传信息获得，本发明实施例的Fc片段通过人类的遗传信息获得。
实施例1
本发明实施例人工获得SEQ ID No.1至SEQ ID No.7的序列。
VEGFR2抗体的重链可变区标记为L3H5scFv VH，其碱基序列如下:GAAGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGAAACCGGGCGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCGGCGAGCGGCTTTACCTTTAGCAGCTATAGCATGAACTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGAGCAGCATTAGCAGCAGCAGCAGCTATATTTATTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGCTTTACCATTAGCCGCGATAACGCGAAAAACAGCCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCGGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGTGACCGATGCGTTTGATATTTGGGGCCAGGGCACCATGGTGACCGTGAGCAGCGCG。
VEGFR2抗体的重链可变区标记为L3H5scFv VH，其氨基酸序列如SEQ ID No.1：EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVTDAFDIWGQGTMVTVSSA。
VEGFR2的抗体轻链可变区标记为L3H5scFv VL，其碱基序列如下:
GATATTCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCGTGAGCGCGAGCATTGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCCGCGCGAGCCAGGGCATTGATAACTGGCTGGGCTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTGCTGATTTATGATGCGAGCAACCTGGATACCGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCTATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGGCGGAAGATTTTGCGGTGTATTTTTGCCAGCAGGCGAAAGCGTTTCCGCCGACCTTTGGCGGCGGCACCAAAGTG。
VEGFR2抗体的轻链可变区标记为L3H5scFv VL，其氨基酸序列如SEQ ID No.2：DIQMTQSPSSVSASIGDRVTITCRASQGIDNWLGWYQQKPGKAPKLLIYDASNLDTGVPSRFSGSGSGTYFTLTISSLQAEDFAVYFCQQAKAFPPTFGGGTKV。
实施例2
请参阅图1，本实施例为双特异性抗体(VEGFR2×CD16A)基因片段的构建，具体步骤如下：
将实施例1中所获得的抗VEGFR2抗体L3H5scFv的VL与VH序列通过GGGGS序列连接构成一个单链抗体scFv(标记为Anti-VEGFR2scFV)，抗CD16A的VL与VH序列也通过GGGGS序列连接构成第二个单链抗体scFv(标记为Anti-CD16A scFV)，CD16A抗体的VL与VH序列参考文献(Mabs,2014,6:728-739)。Anti-VEGFR2scFV与Anti-CD16A scFV通过一个连接肽(连接肽序列SEQ ID No.7：GGGGSGGGGSCPPCPGGGGS，标记为Longlinker)连接，并采用人源IgG的前导肽序列和Fc段序列分别作为双特异性抗体的信号肽和Fc段(标记为Fc)，VEGFR2×CD16A基因结构如图1所示。并在VEGFR2×CD16A的5’端加上CGCGGATCC序列，3’端加上CGACGCGTCG序列，分别作为BamHI和MluI的酶切位点。密码子优化后由南京金斯瑞公司合成双抗的cDNA序列。
实施例3
本实施例为重组慢病毒的构建和包装，具体步骤如下：
对实施例2中的双特异性抗体用BamHI/MluI(Takara公司产品)进行双酶切，同时对pWPXL质粒(购自Addgene)进行BamHI/MluI双酶切。纯化回收后用T4DNA连接酶连接双酶切后的双特异性抗体和pWPXL质粒，即把双特异性抗体整合进pWPXL质粒，成重组的pWPXL-VEGFR2×CD16A质粒。经1％琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定后，用于慢病毒的包装。如图2所示，重组的pWPXL-VEGFR2×CD16A质粒比pWPXL大约2000bp，符合预期，表明BsAb已整合进BsAb质粒中。
取对数生长期293T细胞5×106个接种于100mm细胞培养皿中，24h后待细胞融合度达80％-90％时，更换为6ml新鲜的DMEM完全培养基，4h后开始慢病毒包装，具体如下：
1)取450μl ddH2O加入1.5ml无菌EP管，分别加入目的质粒pWPXL-VEGFR2×CD16A10μg、包装质粒pMD2.G 6.5μg、包膜质粒PSPAX23.5μg，并用一个含有pWPXL质粒载体作为空白对照。
2)缓慢加入50μl CaCl2，轻轻混匀；
3)将上述含有CaCl2和质粒的混合液加入500μl 2×HBS中，轻轻混匀，室温静置15min；
4)将上述混合液加入到接种有293T细胞的DMEM完全培养基中，37℃、5％CO2培养箱中培养24h；
5)24h后更换为6ml新鲜培养基，继续培养；
6)48h后收集第一批病毒液，并加入6ml新鲜培养基继续培养；
7)72h后收集第二批病毒液；
8)将收集的病毒液置于超滤管中，5000rpm/min 4℃浓缩离心40min，收集病毒浓缩液，-80℃保存备用，并用倍数稀释法确定浓缩病毒的滴度。
实施例4
本实施例为双特异性抗体在NK细胞中表达和分泌实验，具体步骤如下：
1)采集1例健康人的外周血50ml，用淋巴细胞分离液(天津灏洋公司产品)分离单个核细胞。用人NK体外扩增试剂盒(深圳市佳科生物科技有限公司产品)体外扩增NK细胞，操作步骤参见试剂盒说明书。扩增至第14天时，流式细胞仪检测NK细胞表型，如图3所示，CD3-CD16+CD56+的比例大于80％，符合NK细胞的表型预期，可直接用于下一步实验。
2)取培养至第14天的NK细胞，分为2组，分别加入pWPXL慢病毒悬液和pWPXL-VEGFR2×CD16A慢病毒悬液(MOI＝60IU/ml)，37℃孵育。
3)感染24小时后，去除含病毒的培养液，更换为新鲜的NK培养液(深圳市佳科生物科技有限公司产品)。
4)继续培养3天后，收集培养液，得到被双特异性抗体基因修饰的NK细胞，采用蛋白A亲和层析的方法纯化表达被双特异性抗体基因修饰的NK细胞的双特异性抗体。图4为表达产物的SDS-PAGE蛋白电泳图谱，所表达的双特异性抗体分子量大约为77KD，符合预期，表明所构建的双特异性抗体基因可以在NK细胞中表达、分泌。
实施例5
本实施例为双特异性抗体亲和性分析，具体步骤如下：
1)将实施例4中制备的双特异性抗体与人肺癌细胞Calu-1(VEGFR2阳性)共孵育2h，双特异性抗体的终浓度为10nM。
2)双特异性抗体与人肺癌细胞Calu-1共孵育后的细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm，5min，弃上清液。用含1％多聚甲醛的PBS室温固定15min，PBS清洗1遍。并按相同方法固定实施例4中所扩增的被双特异性抗体基因修饰的NK细胞。
3)用生物素标记的羊抗人IgG，F(ab’)2(Jackson公司产品)片段的特异性抗体室温孵育2h，PBS清洗1遍。
4)加入PE标记的链酶亲和素200ul(Jackson公司产品)，吹打混匀，室温避光孵育1h。PBS 2ml离心洗涤2次。
5)将细胞重新悬浮于500ul PBS中，混匀，置流式管中，上机检测。
图5为被双特异性抗体基因修饰的NK细胞的流式细胞结果，图6为双特异性抗体与人肺癌细胞Calu-1细胞共孵育后的流式细胞结果。如图5、图6所示，被双特异性抗体基因修饰的NK细胞所分泌的双特异性抗体既可以和NK细胞结合，又可以和VEGFR2阳性的人肺癌细胞结合。
实施例6
本实施例为细胞因子分泌实验，具体步骤如下：
取对数生长期肺癌细胞Calu-1、A549，以105个细胞/孔铺12孔板。第二天加入正常培养的NK细胞或被双特异性抗体基因修饰的NK细胞，以效靶比10:1的浓度共同培养4小时，收集上清液，ELISA检测细胞TNF-α、GranzymeB和Perforin的分泌水平。
如图7和图8所示，对于VEGFR2高表达的肺癌细胞Calu-1，在Calu-1细胞内加入被双特异性抗体基因修饰NK细胞后，其TNF-α、Granzyme B和Perforin的分泌能力明显增强。而对于低表达VEGFR2的肺癌细胞A549，在A549细胞中加入被双特异性抗体基因修饰的NK细胞后，其TNF-α、GranzymeB和Perforin的分泌能力有所增强，但并不显著，表明被双特异性抗体基因修饰的NK细胞具有针对VEGFR2的靶向性。
实施例7
本实施例为细胞水平肿瘤抑制率检测，具体步骤如下：
1)取对数生长期Calu-1细胞、A549细胞，5000个细胞/孔铺96孔细胞培养板。
2)第二天分别加入NK细胞、被双特异性抗体基因修饰的NK细胞，以效靶比0.5:1、1:1和5:1的浓度共同培养4h，每个浓度3个平行孔。
3)加入WST1细胞计数试剂盒中应用液继续培养2小时，96孔细胞培养板放入酶联仪检测在450nm处吸光度OD值，按公式计算细胞杀伤率：
杀伤率(％)＝[1-(实验组OD值-NK对照OD值)/靶细胞对照OD值]×100％
结果如图9所示，相比于普通的NK细胞，被双特异性抗体基因修饰的NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力明显增强。且被双特异性抗体基因修饰的NK细胞对VEGFR2高表达的Calu-1肺癌细胞的杀伤，要明显高于VEGFR2低表达的A549肺癌细胞，进一步表明了被双特异性抗体基因修饰的NK细胞具有对VEGFR2高表达肿瘤细胞的靶向杀伤能力。
实施例8
本实施例为体内抗瘤能力检测，具体步骤如下：
1)取6周龄裸鼠24只，雌雄各半，每只裸鼠右腋下皮下注射1×107个人Calu-1肺癌细胞。
2)5天后肿瘤长到40mm2大小，随机分成3组：生理盐水对照组、单纯NK组、NK-VEGFR2×CD16A组(被双特异性抗体基因修饰的NK细胞)。
3)对照组尾静脉注射生理盐水200ul/次，每周3次，单纯NK组尾静脉注射NK细胞1×107个/次，每周3次；NK-VEGFR2×CD16A组尾静脉注射NK细胞1×107个/次，每周3次，连续治疗2周。游标卡尺测量瘤长度a mm，宽度为b mm，按照瘤体积计算公式计算体积：瘤体积＝0.5×a×b2，并统计各组生存率。
如图10和图11所示，相比于普通的NK细胞，被双特异性抗体基因修饰的NK细胞可以有效的缩小肿瘤体积，延长肿瘤模型鼠的生存期。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 李陶、刘佳、吴春风
<120> 一种双特异性抗体及其应用
<130> MP1729886
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 117
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Thr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala
115
<210> 2
<211> 104
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Ile Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Asn Trp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Asp Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ala Lys Ala Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
100
<210> 3
<211> 118
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Asp Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp
20 25 30
Gly His Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Ser Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu His Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 5
<211> 54
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
gactggacct ggaggttcct ctttgtggtg gcagcagcta caggtgtcca gtcc 54
<210> 6
<211> 699
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420
gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc 600
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660
tacacgcaga agagcctctc cctgtccccg ggtaaatga 699
<210> 7
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Pro Cys Pro Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20

Claims (10)

1.一种VEGFR2抗体，其具有重链可变区和轻链可变区：
(1)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸；或者与(1)所示的氨基酸序列至少有90％同源性的且功能相同或相似的氨基酸序列；
(2)所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸；或者与(2)所示的氨基酸序列至少有90％同源性的且功能相同或相似的氨基酸序列。
2.一种双特异性抗体，其包括VEGFR2抗体、连接肽和CD16A抗体；所述VEGFR2抗体、所述连接肽和所述CD16A抗体顺次连接。
3.根据权利要求2所述的双特异性抗体，其特征在于，所述VEGFR2抗体，其具有重链可变区和轻链可变区：
(1)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸；或者与(1)所示的氨基酸序列至少有90％同源性的且功能相同或相似的氨基酸序列；
(2)所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸；或者与(2)所示的氨基酸序列至少有90％同源性的且功能相同或相似的氨基酸序列。
4.根据权利要求2所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体还包括信号肽；
所述信号肽具有：(5)所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸；或者与(5)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的且功能相同或相似的核苷酸序列。
5.根据权利要求2所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体还包括Fc片段。
6.根据权利要求5所述的双特异性抗体，其特征在于，所述Fc片段具有：
(6)所述Fc片段的核苷酸序列如(6)所示，Fc片段的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸；或者与(6)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的且功能相同或相似的核苷酸序列。
7.一种编码双特异性抗体的核苷酸序列，包括编码权利要求1所述的VEGFR2抗体的核苷酸序列、编码权利要求2或3所述的双特异性抗体的核苷酸序列，以及权利要求4-6任意一项所述的双特异性抗体的核苷酸序列。
8.一种编码双特异性抗体的表达载体，包括编码权利要求1所述的VEGFR2抗体的核苷酸序列、编码权利要求2或3所述的双特异性抗体的核苷酸序列，以及权利要求4-6任意一项所述的双特异性抗体的核苷酸序列。
9.一种双特异性抗体的宿主细胞，所述的宿主细胞为经由权利要求8所述的双特异性抗体的表达载体转化或转染得到。
10.一种双特异性抗体的药物，包括被权利要求2～6任意一项所述的双特异性抗体修饰的NK细胞。
CN201810183124.6A 2018-03-06 2018-03-06 一种双特异性抗体及其应用 Pending CN108409861A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810183124.6A CN108409861A (zh) 2018-03-06 2018-03-06 一种双特异性抗体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810183124.6A CN108409861A (zh) 2018-03-06 2018-03-06 一种双特异性抗体及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108409861A true CN108409861A (zh) 2018-08-17

Family

ID=63129903

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810183124.6A Pending CN108409861A (zh) 2018-03-06 2018-03-06 一种双特异性抗体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108409861A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111826400A (zh) * 2020-07-21 2020-10-27 中科宝承生物医学科技有限公司 一种双特异性抗体nk细胞制备方法及其细胞和应用
CN114921416A (zh) * 2022-05-12 2022-08-19 广东普罗凯融生物医药科技有限公司 一种nk细胞及其制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102219856A (zh) * 2011-05-18 2011-10-19 哈尔滨医科大学 一种抗血管内皮细胞生长因子受体2/抗cd3双特异单链抗体
CN104628866A (zh) * 2015-01-21 2015-05-20 中国药科大学 一种靶向vegfr2的抗体融合蛋白的制备及其用途
CN105367660A (zh) * 2015-12-22 2016-03-02 深圳市北科生物科技有限公司 一种抗cd16a抗原和抗muc1抗原的双特异性抗体
CN106591371A (zh) * 2016-11-25 2017-04-26 哈尔滨百伊生生物科技有限公司 Cd16a/gpc3双抗慢病毒表达载体及其构建方法和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102219856A (zh) * 2011-05-18 2011-10-19 哈尔滨医科大学 一种抗血管内皮细胞生长因子受体2/抗cd3双特异单链抗体
CN104628866A (zh) * 2015-01-21 2015-05-20 中国药科大学 一种靶向vegfr2的抗体融合蛋白的制备及其用途
CN105367660A (zh) * 2015-12-22 2016-03-02 深圳市北科生物科技有限公司 一种抗cd16a抗原和抗muc1抗原的双特异性抗体
CN106591371A (zh) * 2016-11-25 2017-04-26 哈尔滨百伊生生物科技有限公司 Cd16a/gpc3双抗慢病毒表达载体及其构建方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EUKARYOTA: "Fc IgG1 heavy chain constant region, partial [Homo sapiens]", 《GENBANK》 *
MATTHEW C.: "The Structural Basis for the Function of Two Anti-VEGF Receptor 2 Antibodies", 《STRUCTURE》 *
吕一甫等: "双特性抗体技术演进与作用模式的研究进展", 《沈阳药科大学药学院》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111826400A (zh) * 2020-07-21 2020-10-27 中科宝承生物医学科技有限公司 一种双特异性抗体nk细胞制备方法及其细胞和应用
CN114921416A (zh) * 2022-05-12 2022-08-19 广东普罗凯融生物医药科技有限公司 一种nk细胞及其制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2017305366B2 (en) Anti-PD-L1 nanobody and use thereof
KR100897379B1 (ko) 혈관신생-저해 키메릭 단백질 및 그 사용
CN100447244C (zh) Baff受体(bcma),一种免疫调节剂
US20220315658A1 (en) Anti-pd-l1 single-domain antibody and derivatives and use thereof
CN107880136A (zh) 多聚体il‑15可溶性融合分子与其制造与使用方法
MXPA02001417A (es) Complejos multiples de citosina-anticuerpo.
KR20150030706A (ko) 이중 수용체 길항 항원-결합 단백질 및 그것의 사용
KR20210104060A (ko) Il-15 조성물 및 이의 사용 방법
CN113801230B (zh) 一种人抗Siglec-15抗体及其应用
CN107459579A (zh) 一种靶向egfr和cd47双特异性融合蛋白、制备方法及应用
CN109627342A (zh) 应用于nk细胞培养的蛋白质、培养基配方组合及制备方法
CN101663324A (zh) 免疫球蛋白Fc与人载脂蛋白（a）Kringle片断的融合蛋白
CN109762785A (zh) 一种高效应用于人nk细胞非滋养层体外培养的方法
CN108409861A (zh) 一种双特异性抗体及其应用
CN111320687B (zh) 抗h7n9全人源单克隆抗体4e18及其制备方法与应用
CN104592390B (zh) 一类双特异重组抗HBsAg抗体、其制备方法及用途
CN110205296B (zh) 具有Fc突变体的抗体与效应细胞的组合、用途和制法
CN108484772A (zh) 抗her2抗原的人源化抗体h5l5及其应用
CN108250290B (zh) Ccr4的n端重组蛋白及其用途
CN111320685B (zh) 抗h7n9全人源单克隆抗体3f12及其制备方法与应用
CN113683710B (zh) 一种易于定向偶联的nkg2d受体蛋白及其免疫吸附剂
CN111875704B (zh) 一种egfr抗体及其应用
CN111574630B (zh) 一种抗cd19的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌株和应用
CN111434683B (zh) 抗h7n9全人源单克隆抗体8d11及其制备方法与应用
CN115052897A (zh) PLAP-CD3ε双特异性抗体

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20210526

Address after: 523808 Room 401, building 6, 9 Xincheng Road, Songshanhu Park, Dongguan City, Guangdong Province

Applicant after: Sino US cel Biotechnology (Guangdong) Co.,Ltd.

Address before: 518057 13e, building 8, Shekou Peninsula Chengbang phase 2, Wanghai Road, Nanshan District, Shenzhen City, Guangdong Province

Applicant before: Li Tao

Applicant before: Liu Jia

Applicant before: Wu Chunfeng

TA01 Transfer of patent application right
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180817

RJ01 Rejection of invention patent application after publication