CN111574630B

CN111574630B - 一种抗cd19的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌株和应用

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Publication number: CN111574630B
Application number: CN202010492730.3A
Authority: CN
Inventors: 张爱君; 徐广贤; 李光琪; 楚元奎
Original assignee: Ningxia Medical University
Current assignee: Ningxia Medical University
Priority date: 2020-06-03
Filing date: 2020-06-03
Publication date: 2021-12-14
Anticipated expiration: 2040-06-03
Also published as: CN111574630A

Abstract

本发明提供了一种抗CD19的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌株和应用，属于免疫学技术领域，本发明提供的所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；本发明所述重组纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明提供的所述抗CD19的重组纳米抗体由包括驼源的纳米抗体基因和人IgG Fc段基因融合表达，能够利用所述重组菌株进行稳定表达，并能够特异性识别CD19抗原。

Description

一种抗CD19的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌株和应用

技术领域

本发明属于免疫学技术领域，尤其涉及一种抗CD19的纳米抗体、编码基因、重组载体、重组菌株和应用。

背景技术

骆驼科动物体内存在一种天然缺失轻链的抗体，即重链抗体。该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的重链恒定区CH2和CH3区，它不像人工改造的单链抗体片段容易相互沾粘，甚至聚集成块。单独克隆并表达出的VHH(variable domain ofheavy-chainantibody,VHH)结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。其分子量只有15KD，结构直径2.5nm，长4nm，是普通IgG的十几分之一，所以称为纳米抗体(nanobody,Nb)。纳米抗体由4个保守序列和3个互补决定区组成，且有较长的CDR1和CDR3区，使其有稳定的结构。较长的CDR3区凸出的环状结构，使纳米抗体与抗原有很高的结合力。纳米抗体有高的亲水性，并且由于VHH片段与人的VH序列具有高度同源性，具有较低的免疫原性，可以对其进行人源化改造和修饰。纳米抗体可以在原核细胞和真核细胞中高效表达。纳米抗体还具有独特的理化性质，在部分高温、酸性等极端条件下依然可以维持活性，纳米抗体具有良好的组织穿透能力。基于以上优点，纳米抗体在一些疾病的诊断和治疗中具有广阔的应用前景。

人白细胞分化抗原19(CD19)分子是B淋巴细胞表面的跨膜蛋白，对 B细胞的活化、信号传导和生长调节具有重要的作用，是一种功能受体分子。 CD19在B淋巴细胞系统的恶性肿瘤中广泛表达。例如：多数急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病和B细胞淋巴瘤。在对过敏性紫癜病因的研究中发现，检测过敏性紫癜性肾炎患儿外周血淋巴细胞CD19发现，其表达率较高。同时，在肝硬化患者外周血中CD19的细胞表达水平能反应患者的肝脏损伤程度。

作用于肿瘤微环境的新型免疫治疗药物是一种具有革命性意义的癌症疗法，目前，CAR-T细胞技术被广泛运用于癌症免疫治疗的研究中。CAR-T细胞疗法具有靶向性明确、治疗效果好，目前已经有很多成功的报道。目前嵌合抗原受体T细胞在恶性肿瘤尤其是在血液恶性肿瘤治疗中取得了富有前景性的疗效，其中应用最多的是B细胞恶性肿瘤/白血病。2010年，Kochenderfer 等报道了1例应用CD19修饰的CAR-T细胞治疗难治进展期淋巴瘤患者，有效地遏制了疾病的进展(Kochenderfer James N,Wilson Wyndham H,Janik John E,Dudley Mark E,Stetler-Stevenson Maryalice,Feldman Steven A,Maric Irina,Raffeld Mark,Nathan Debbie-Ann N,Lanier Brock J,Morgan Richard A,RosenbergSteven A.Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in apatient treated with autologous T cells genetically engineered to recognizeCD19.[J].Blood,2010,116(20).)。2013年，应用二代的CD19修饰的CAR-T细胞治疗5名持续性形态学或微小残留病变阳性复发的B系急性淋巴细胞白血病(B-ALL)患者(KochenderferJames N,Rosenberg Steven A. Treating B-cell cancer with T cells expressinganti-CD19 chimeric antigen receptors.[J].Nature reviews.Clinical oncology,2013,10(5).)。CAR-T细胞输注后肿瘤细胞均被清除且显示MDR。Maude等所报道的研究表明，CTL019(抗 CD19的二代CAR-T)治疗30例复发/难治急性淋巴细胞白血病，其中90％达完全缓解。对于复发耐药的慢性淋巴细胞白血病，靶向CD19的CAR-T 能稳定持久地清除体内肿瘤，总反应率达57％(MuellerKarenThudium,Maude Shannon L,Porter David L,FreyNoelle,Wood Patricia,Han Xia,Waldron Edward,Chakraborty Abhijit,AwasthiRakesh,Levine Bruce L,Melenhorst J Joseph,Grupp Stephan A,June Carl H,LaceySimon F.Cellular kinetics of CTL019 in relapsed/refractory B-cell acutelymphoblastic leukemia and chronic lymphocytic leukemia.[J].Blood,2017,130(21).)。Garfall等报道了一例CD19 特异性CAR-T联合自体移植治愈多发性骨髓瘤的病例，显示了其在多发性骨髓瘤中的治疗潜力。CD19特异性的CAR-T细胞产品tisagenlecleucel被批准用于临床(Garfall Alfred L,Maus Marcela V,Hwang Wei-Ting,Lacey Simon F,Mahnke Yolanda D,Melenhorst J Joseph,Zheng Zhaohui,Vogl Dan T,Cohen Adam D,Weiss Brendan M,Dengel Karen,Kerr Naseem D S,Bagg Adam,Levine Bruce L,JuneCarl H,Stadtmauer Edward A.Chimeric Antigen Receptor T Cells against CD19 forMultiple Myeloma.[J].The New England journal of medicine,2015,373(11).)。但是，目前纳米抗体的筛选效果并不理想。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗CD19的纳米抗体、编码基因、重组载体、重组菌株和应用；所述抗CD19的重组纳米抗体由包括驼源的纳米抗体基因和人IgG Fc段基因融合表达，具有较强的与CD19特异性结合的能力，为CD19异常表达的疾病的诊断和治疗提供更广泛的手段。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种抗CD19的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如 SEQ IDNo.1所示。

本发明提供了一种编码所述纳米抗体的基因，所述基因的核苷酸序列如 SEQ IDNo.2所示。

本发明提供了一种抗CD19的重组纳米抗体，包括所述的抗CD19的纳米抗体和人IgG Fc段。

优选的，所述重组纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明提供了一种编码所述重组纳米抗体的基因，包括所述的纳米抗体的基因和人IgG Fc段基因；所述纳米抗体基因和人IgG Fc段基因通过连接片段连接，所述连接片段的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

优选的，所述重组纳米抗体的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

本发明提供了一种表达抗CD19的纳米抗体的重组载体，包括所述重组纳米抗体的基因和初始载体。

优选的，所述初始载体为pCZN1质粒载体。

本发明提供了一种表达抗CD19的纳米抗体的重组菌株，包括所述的重组载体和Top10克隆菌株。

本发明提供了所述的抗CD19的纳米抗体、所述编码抗CD19纳米抗体的基因、所述重组纳米抗体、编码所述重组纳米抗体的基因、所述重组载体、所述的重组菌株在制备抗肿瘤药物或肿瘤诊断试剂中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供的抗CD19的纳米抗体，针对CD19的重链，包括框架区FR和抗原决定簇互补CDR；本发明将编码所述抗CD19 的纳米抗体基因和人IgG Fc段基因融合表达的重组纳米抗体，能够特异性的识别CD19抗原，能够应用于肿瘤的分子诊断和抗肿瘤药物的制备。

附图说明

图1是第一轮巢式PCR产物的凝胶电泳图，其中1～4为第一轮巢式 PCR产物，M为DNA marker DL1000；

图2是第二轮巢式PCR产物的凝胶电泳图，其中1～4为第二轮巢式 PCR产物，M为DNA marker DL1000；

图3是菌落PCR分析验证目的片段插入率的结果；

图4是抗CD19纳米抗体筛选富集序列；

图5为IPTG诱导重组菌株表达抗CD19纳米抗体后，SDS-PAGE电泳分析结果，其中1为未诱导菌液2诱导后菌液3诱导破碎后上清液4诱导破碎后沉淀；

图6为Ni柱亲和纯化目标蛋白后SDS-PAGE电泳分析结果，其中M为蛋白质分子质量标准，1为破碎后处理样品，2为流出液，3为洗脱液；

图7为纯化的抗CD19纳米抗体的SDS-PAGE电泳染色图；

图8为纯化的抗CD19纳米抗体的WesternBlot图；

图9为抗CD19纳米抗体与抗原结合验证WesternBlot图。

具体实施方式

本发明提供了一种抗CD19的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如 SEQ IDNo.1所示；具体如下：

QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAVRRPTDSRNCMAWFRQAPGEQR EAVAGIDIYRTTGYAESVKGRFTISQDNAKNTLFLQMNSLKPEDSGTYYC AAARPCKYGSEWRRSASNFLYWGQGTQVTLSS。

在本发明中，所述抗CD19的纳米抗体包括框架区FR和抗原决定簇互补区CDR；在本发明中，所述框架区FR包括FR1、FR2、FR3和FR4；具体的氨基酸序列如下：

FR1:QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAVR(SEQ ID No.6)

FR2:RPTDSRNCMAWFRQA(SEQ ID No.7)

FR3:PGEQREAVAGIDIYRTTGYAESVKGRFTISQDNAKNTL(SEQ ID No.8)

FR4:FLQMNSLKPED(SEQ ID No.9)。

在本发明中，所述抗原决定簇互补区CDR包括CDR1、CDR2和CDR3；具体的氨基酸序列如下：

CDR1:SGTYYCAAAR(SEQ ID No.10)

CDR2:PCKYGSE(SEQ ID No.11)

CDR3:WRRSASNFLYWGQGTQVTLSS(SEQ ID No.12)。

在本发明中，所述抗CD19的纳米抗体通过以下方法筛选获得：用噬菌体表面展示技术构建天然驼源纳米抗体噬菌体展示文库，然后以生物素化的 CD19抗原为基础进行筛选，获得CD19特异性的纳米抗体基因序列。

在本发明中，所述天然驼源重链抗体噬菌体展示基因库的构建方法，优选的包括以下步骤：1)提取骆驼脾脏组织总RNA、反转录所述总RNA获得cDNA；2)以所述cDNA为模板进行巢式PCR扩增获得重链抗体的可变区片段；3)分别酶切所述重链抗体的可变区片段和pcantab5e噬菌体载体后，进行连接获得连接产物；4)将所述连接产物转入感受态细胞中获得天然驼源纳米抗体噬菌体展示文库。

在本发明中，提取骆驼脾脏组织总RNA、反转录所述总RNA获得 cDNA。本发明对所述骆驼脾脏组织总RNA的提取方法没有特殊限定，采用本领域常规的动物组织总RNA的提取方法即可。在本发明中，所述反转录优选的通过Thermo Scientific ReverAid FirstStrand cDNA Synthesis Kits试剂盒实现。

本发明在获得所述cDNA后，以所述cDNA为模板进行巢式PCR扩增获得重链抗体的可变区片段。在本发明中，所述巢式PCR优选的包括两轮 PCR；第一轮PCR用于扩增重链抗体引导肽和抗体CH2之间的片段，所述第一轮PCR的引物序列优选的如SEQ ID No.13和SEQ IDNo.14所示；第二轮PCR用于扩增重链抗体FR1区和长、短铰链区之间的片段，所述第二轮PCR的引物序列优选的如SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示。

本发明在获得所述重链抗体的可变区片段后，分别酶切所述重链抗体的可变区片段和pcantab5e噬菌体载体后，进行连接获得连接产物。在本发明中，所述酶切优选为双酶切，所述酶切优选的采用限制性内切酶SifI和Not I进行。在本发明中，所述酶切的程序优选的如下：37℃酶切1h；50℃酶切 1h。在本发明中，所述连接的温度优选为16℃，所述连接的时间优选为4h。

本发明在获得所述连接产物后，将所述连接产物转入感受态细胞中获得天然驼源纳米抗体噬菌体展示文库。在本发明中，所述感受态细胞优选为 Top10感受态细胞；所述转入的方法优选为热激转化。在本发明中，所述转化后还包括辅助噬菌体救援的过程，本发明对所述热激转化和辅助噬菌体援助的过程没有特殊限定，详细步骤参见实施例记载。

本发明对所述生物素化的CD19抗原筛选抗CD19纳米抗体的具体步骤没有特殊限定，采用本领域常规纳米抗体筛选方法即可，详细步骤参见实施例记载。

本发明还提供了一种编码所述纳米抗体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示，具体如下：

CAGGTCCAACTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTACAGGCTGG TGGATCTCTGCGTCTCTCCTGTGCAGTCCGTAGACCCACGGACAGTCG CAACTGCATGGCCTGGTTCCGCCAGGCTCCGGGGGAGCAGCGCGAGG CGGTCGCGGGAATTGATATTTACCGGACTACAGGGTACGCAGAGTCCG TGAAGGGCCGATTCACGATTTCCCAAGACAACGCCAAGAATACATTGT TTCTACAAATGAATAGCCTGAAACCGGAGGACAGTGGTACATACTACT GTGCGGCTGCCCGCCCATGTAAATATGGTTCTGAGTGGCGACGGTCGG CTTCTAATTTTCTCTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCCTCTCCTC A。

本发明提供了一种抗CD19的重组纳米抗体，包括所述的抗CD19的纳米抗体和人IgG Fc段。在本发明中，所述重组纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；具体如下：

QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAVRRPTDSRNCMAWFRQAPGEQREA VAGIDIYRTTGYAESVKGRFTISQDNAKNTLFLQMNSLKPEDSGTYYCAAAR PCKYGSEWRRSASNFLYWGQGTQVTLSSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCPAPE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPGVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGK。

本发明还提供了一种编码所述重组纳米抗体的基因，包括所述的纳米抗体的基因和人IgG Fc段基因。在本发明中，所述纳米抗体基因和人IgG Fc 段基因通过连接片段连接，所述连接片段的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体如下：GGTGGTGGTGGTAGT。

在本发明中，所述重组纳米抗体的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；其中，所述人IgG Fc段基因的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示，具体如下：

GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCA GCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAA CCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGGGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTA CGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGG AGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGC ACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAAC AAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGG GCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGA GCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTA TCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGA ACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCT TCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGG AACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA。

本发明还提供了一种表达抗CD19的纳米抗体的重组载体，包括所述重组纳米抗体的基因和初始载体。

在本发明中，所述初始载体优选为pCZN1质粒载体；所述重组纳米抗体的基因的插入位点优选的位于所述pCZN1质粒载体的NdeI和XbaI酶切位点之间。本发明对所述重组载体的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的重组载体制备方法即可。

本发明还提供了一种表达抗CD19的纳米抗体的重组菌株，包括所述的重组载体和Top10克隆菌株。在本发明中，优选的通过将所述表达抗CD19 的纳米抗体的重组载体转入所述Top10克隆菌株中获得所述重组菌株。在本发明中，所述Top10克隆菌株优选的采用市售产品。本发明对所述重组菌株的具体制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的重组菌株的制备方法即可。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

针对于天然驼源纳米抗体基因库的构建：

提取骆驼脾脏组织总RNA，具体步骤如下：

①从-80℃中取出骆驼脾脏组织，加入液氮碾碎样品标本，每100mg研碎的组织加1ml Trizol，玻璃匀浆器匀浆至肉眼看不到组织样本颗粒为止。然后移入1.5ml离心管中，室温放置15min。

②按照每1ml Trizol加入0.2ml氯仿的比例，猛烈震荡15s，室温下静置 3min。

③将样品12000rpm，4℃离心15min，把上层转移到新的Ep管中。

④加入等体积的异丙醇并在冰上混合放置20min。

⑤将溶液12000rpm，4℃离心10min，弃去上清。

⑥加入1ml DEPC水配制的75％乙醇洗涤沉淀物(每1ml Trizol至少加 1ml乙醇)。

⑦4℃下将上一步溶液10000rpm离心10min，弃去上清，再重复上一步复洗一次。

⑧10000rpm，4℃离心10min后，弃去上清，干燥10-15min。

⑨加入适量ddH₂O溶解RNA沉淀，测定RNA浓度，并保存于-80℃。

利用TIANGEN公司提供的RNA纯化试剂盒纯化，按照Thermo Scientific ReverAidFirst Strand cDNA Synthesis Kits试剂盒反转录得到 cDNA。

(2)以cDNA为模板，用巢式PCR扩增得到重链抗体的可变区片段；

第一轮PCR：

上游引物CALL001：5’-gtcctggctgctcttctacaaag-3’(SEQ ID No.13)

下游引物CALL002：5’-ggtacgtgctgttgaactgttcc-3’(SEQ ID No.14)

第一轮PCR反应体系

第一轮PCR扩增反应条件为：94℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s， 32个循环；72℃10min。

扩增重链抗体引导肽和抗体CH2之间的片段，结果显示该片段的大小约为700bp，即纳米抗体基因电泳条带约为700bp。

第二轮PCR：

以第一轮PCR产物为模板，

上游引物VHH-F：

5'-tcgcggcccagccggcccaggtccaactgcaggagtctgggg-3'(SEQ ID No.15)

下游引物VHH-R：

5'-ataagaatgcggccgctgaggagacggtgacctgggtcccc-3'(SEQ ID No.16)

第二轮PCR反应体系

第二轮PCR扩增反应条件为：95℃5min；94℃40s，64℃40s，72℃40s， 5个循环；94℃40s，68℃45s，32个循环；72℃10min。扩增重链抗体FR1 区和长、短铰链区之间的片段(长片段和短片段)结果显示该片段的大小约为400bp，即纳米抗体基因电泳条带约为400bp。

使用限制性内切酶(购自Takara公司)SifI和Not I酶切pcantab5e噬菌体载体及VHH片段，并用T4 DNA连接酶(购自Takara公司)连接两个片段。具体酶切体系及连接体系如下：

酶切体系

酶切条件：37℃酶切1h后，50℃酶切1h。

连接体系

连接条件：16℃连接4h后，4℃过夜连接。

将连接产物转化至甘油重悬法制备的TG1感受态细胞中，获得重组菌；将重组菌培养至OD600为0.5时，将所述重组菌和辅助噬菌体混合感染 1～1.5h，离心，将得到的菌体筛选培养，离心，回收噬菌体，得到VHH噬菌体展示文库；经辅助噬菌体救援后，其库容量达9.0×10¹³。其中辅助噬菌体救援步骤如下：

①取100μL的文库，接种于50ml的2×YT/Amp/Glu培养基中，37℃， 200rpm，震荡培养至对数期OD600约为0.4～0.5。

②向培养液中加入感染复数为20:1的辅助噬菌体M13KO7，混匀后37℃静置30min。

③将培养液在室温，9000rpm，离心10min，弃上清沉淀菌体，用200mL 的2×YT/Amp/Kana培养液重悬，37℃200rpm，培养过夜。

④将培养液于4℃，9000rpm，离心10min取上清，加入1/5体积的 PEG/NaCl，4℃静置6h。

⑤9000rpm离心20min弃上清，用PBS(1mL)重悬沉淀，得到重组噬菌体抗体库，分装到1.5ml Ep管中，4℃保存。

与此同时，通过菌落PCR检测文库的插入率，引物使用第二轮PCR引物，退火温度55℃，结果显示插入率达到95％以上(目的片段插入率＝含目的片段的菌落数/所有菌落数)。

针对抗CD19纳米抗体的筛选过程：

(1)在室温下，将VHH噬菌体展示文库与50μl链霉亲和素磁珠进行孵育， 1h后收集噬菌体抗体,同时使用2％PBSM封闭2ml的Ep管。

(2)在封闭完成的Ep管中加入500ul预先削减的噬菌体抗体和0.01mg/ml 的生物素化CD19抗原500μl，室温孵育1h。并单独设一阴性对照管，采用 PBS与噬菌体抗体进行孵育。

(3)加入预先封闭的50μl的链霉亲和素磁珠，室温条件下孵育1h，从磁力架收集磁珠。用PBST反复洗涤磁珠7次，再使用PBSM洗涤磁珠2次，最后使用PBS洗涤磁珠1次。加入pH为2.7的甘氨酸对结合的噬菌体进行洗脱，加入pH为9.1的1mol/LTris-HCl进行中和。将经过洗脱和中和后的噬菌体加入到预先培养的10ml处于对数生长期的TG1大肠杆菌中，离心后取上清加入PEG/NaCl沉淀噬菌体，收集得到第一轮淘筛后的噬菌体展示文库；以用于下一轮的筛选。

(4)重复步骤(3)中的淘筛过程两次，使表面表达有纳米抗体的噬菌体单克隆得到富集。

所述步骤中筛选培养用培养基为含有100μg/ml的Amp的2×YT培养基及含有100μg/ml的Amp和50μg/ml的Kana的2×YT培养基。

针对筛选获得的纳米抗体单克隆进行phage-ELISA鉴定特异性

(1)从第三轮筛选后的平板上随机挑取96个菌落，每个单菌落为一孔，接种于96孔深孔板中，2M Glu、100μg/mLAmp的2×YT培养基过夜培养。

(2)次日从过夜培养的菌液中吸取5μl接种至新的96孔深孔板，加入 500μl的2×YT培养基培养，同时加入MOI＝20:1的辅助噬菌体KM13，37℃静置30min，震荡培养30min。离心后每孔加入2×YT/Amp/Kana培养基800μl 过夜震荡培养。

(3)次日离心后取上清进行间接ELISA检测。用10μg/ml CD19抗原包被酶标板，5％PBSM过夜封闭，加入预先处理的噬菌体上清液结合，洗涤拍干后加入HRP标记的anti-M13酶标抗体，洗涤后加入TMB显色液进行显色，记录吸光度值。选取20个吸光度值较高的阳性克隆菌液保菌，并取部分菌液对其进行测序。

(4)对测序结果进行Blast分析、多序列比对、亲水性分析及3D模型构建。综合分析结果，选取上述提及核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示的纳米抗体进行表达和验证。

纳米抗体的原核表达及鉴定

(1)将纳米抗体序列连接人源性IgG Fc片段，所述人源性IgG Fc片段核苷酸序列如序列表SEQ ID No:17所示，连接接头核苷酸序列如序列表SEQ IDNo:4所示。对载体pCZN1进行NdeI和XbaI位点酶切，将构建的片段连入载体pCZN1的NdeI和XbaI位点之间；获得的重组质粒，转入Top10克隆菌株进行表达。

(2)将重组质粒1μL加入100μL感受态细菌中，置冰上20min。42℃热激90sec，迅速置冰中5min，加入600μLLB培养液。37℃，220rpm振摇1h，离心后涂布于含50μg/mLAmp的LB平板，37℃倒置培养过夜。

(3)挑取转化平板上的单克隆接种于含50μg/mLAmp的3mL LB培养液的试管中，37℃220rpm振摇过夜。次日按1:100接种于50μg/mLAmp的30mL LB培养液，37℃220rpm振摇至菌体OD600为0.6-0.8。取1mL培养物， 10000rpm室温离心2min，弃上清，用100μL 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，20℃220rpm振摇过夜，诱导融合蛋白表达。

(4)取出1mL培养物，10000rpm室温离心2min，弃上清，用100μL1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。剩余培养物4000rpm，离心10min，弃上清，用 PBS重悬菌体沉淀；重悬液进行超声波破碎后，分别取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬。进行12％SDS-PAGE检测分析，考马斯亮蓝染色显带。结果如图5所示，其中M：Protein marker 1：未诱导2：诱导后3：诱导破碎后上清4：诱导破碎后沉淀；重组质粒pCZN1-VHH-humanIgG Fc转入大肠杆菌ArcticExpress扩大培养后，挑取单克隆进行IPTG诱导表达，并进行超声破碎，对未诱导样本、诱导后样本及破碎后上清和沉淀，进行SDS-PAGE 分析，结果显示目标蛋白主要存在于沉淀中。

(5)随后进行包涵体蛋白的变复性，重溶目标蛋白并进行Ni柱亲和纯化获得目的蛋白。进行12％SDS-PAGE分析及WesternBlot验证。结果如图6 所示，其中M：蛋白质分子质量标准1：破碎后处理样品2：流出3：洗脱；对纯化后获得的目的蛋白进行Western Blot验证，结果显示目的蛋白大小约为40KD左右，与理论分子量吻合。

纳米抗体抗原结合能力检测

(1)取CD19标准抗原上样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后，取下凝胶进行转膜。将膜置于5％脱脂奶粉封闭液中封闭37℃1h。

(2)用封闭液稀释一抗：筛选获得的纳米抗体，稀释比例为1:1000，膜在一抗稀释液中4℃过夜。次日将膜取出后用PBST洗膜4次，每次5min。用含5％牛奶的封闭液以稀释二抗：抗人IgG Fc/HRP，稀释比例为1:5000，膜在二抗中37℃反应1h。

(3)反应完毕后，用PBST洗膜4次，每次5min。ECL显影，曝光。

结果如图9所示，以CD19分子为抗原进行WesternBlot验证，结果显示淘筛获得抗CD19纳米抗体可与CD19分子结合。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 宁夏医科大学

<120> 一种抗CD19的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌株和应用

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 127

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Arg Arg Pro Thr Asp Ser Arg Asn

20 25 30

Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gln Arg Glu Ala Val

35 40 45

Ala Gly Ile Asp Ile Tyr Arg Thr Thr Gly Tyr Ala Glu Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Ala Arg Pro Cys Lys Tyr Gly Ser Glu Trp Arg Arg Ser Ala Ser

100 105 110

Asn Phe Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Leu Ser Ser

115 120 125

<210> 2

<211> 381

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

caggtccaac tgcaggagtc tgggggaggc tcggtacagg ctggtggatc tctgcgtctc 60

tcctgtgcag tccgtagacc cacggacagt cgcaactgca tggcctggtt ccgccaggct 120

ccgggggagc agcgcgaggc ggtcgcggga attgatattt accggactac agggtacgca 180

gagtccgtga agggccgatt cacgatttcc caagacaacg ccaagaatac attgtttcta 240

caaatgaata gcctgaaacc ggaggacagt ggtacatact actgtgcggc tgcccgccca 300

tgtaaatatg gttctgagtg gcgacggtcg gcttctaatt ttctctactg gggccagggg 360

acccaggtca ccctctcctc a 381

<210> 3

<211> 364

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Arg Arg Pro Thr Asp Ser Arg Asn

20 25 30

Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gln Arg Glu Ala Val

35 40 45

Ala Gly Ile Asp Ile Tyr Arg Thr Thr Gly Tyr Ala Glu Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Ala Arg Pro Cys Lys Tyr Gly Ser Glu Trp Arg Arg Ser Ala Ser

100 105 110

Asn Phe Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Leu Ser Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

130 135 140

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

145 150 155 160

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Gly Val

165 170 175

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

180 185 190

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

195 200 205

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

210 215 220

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

225 230 235 240

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

245 250 255

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

260 265 270

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

275 280 285

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

290 295 300

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

305 310 315 320

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

325 330 335

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

340 345 350

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

355 360

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ggtggtggtg gtagt 15

<210> 5

<211> 1092

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

caggtccaac tgcaggagtc tgggggaggc tcggtacagg ctggtggatc tctgcgtctc 60

tcctgtgcag tccgtagacc cacggacagt cgcaactgca tggcctggtt ccgccaggct 120

ccgggggagc agcgcgaggc ggtcgcggga attgatattt accggactac agggtacgca 180

gagtccgtga agggccgatt cacgatttcc caagacaacg ccaagaatac attgtttcta 240

caaatgaata gcctgaaacc ggaggacagt ggtacatact actgtgcggc tgcccgccca 300

tgtaaatatg gttctgagtg gcgacggtcg gcttctaatt ttctctactg gggccagggg 360

acccaggtca ccctctcctc aggtggtggt ggtagtgagc ccaaatcttg tgacaaaact 420

cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc 480

cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctggggtcac atgcgtggtg 540

gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 600

gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 660

agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 720

tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 780

cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 840

agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 900

aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 960

ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1020

tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1080

tctccgggta aa 1092

<210> 6

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 6

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Arg

20 25

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 7

Arg Pro Thr Asp Ser Arg Asn Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala

1 5 10 15

<210> 8

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 8

Pro Gly Glu Gln Arg Glu Ala Val Ala Gly Ile Asp Ile Tyr Arg Thr

1 5 10 15

Thr Gly Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp

20 25 30

Asn Ala Lys Asn Thr Leu

35

<210> 9

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 9

Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

1 5 10

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 10

Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Arg

1 5 10

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 11

Pro Cys Lys Tyr Gly Ser Glu

1 5

<210> 12

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 12

Trp Arg Arg Ser Ala Ser Asn Phe Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln

1 5 10 15

Val Thr Leu Ser Ser

20

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

gtcctggctg ctcttctaca aag 23

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

tcgcggccca gccggcccag gtccaactgc aggagtctgg gg 42

<210> 16

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

ataagaatgc ggccgctgag gagacggtga cctgggtccc c 41

<210> 17

<211> 696

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60

gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120

acccctgggg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420

gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 600

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660

tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 696

Claims

1.一种抗CD19的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种编码权利要求1所述纳米抗体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种抗CD19的重组纳米抗体，其特征在于，包括权利要求1所述的抗CD19的纳米抗体和人IgG Fc段。

4.根据权利要求3所述的重组纳米抗体，其特征在于，所述重组纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

5.一种编码权利要求4所述重组纳米抗体的基因，其特征在于，包括权利要求2所述的纳米抗体的基因和人IgG Fc段基因；所述纳米抗体基因和人IgG Fc段基因通过连接片段连接，所述连接片段的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

6.根据权利要求5所述重组纳米抗体的基因，其特征在于，所述重组纳米抗体的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

7.一种表达抗CD19的纳米抗体的重组载体，其特征在于，包括权利要求5或6所述重组纳米抗体的基因和初始载体。

8.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于，所述初始载体为pCZN1质粒载体。

9.一种表达抗CD19的纳米抗体的重组菌株，其特征在于，包括权利要求7或8所述的重组载体和Top10克隆菌株。

10.权利要求1所述的抗CD19的纳米抗体、权利要求2所述的纳米抗体的基因、权利要求3或4所述的重组纳米抗体、权利要求5或6所述的重组纳米抗体基因、权利要求7或8所述重组载体、权利要求9所述的重组菌株在制备抗急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病或B细胞淋巴瘤药物或诊断急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病或B细胞淋巴瘤试剂中的应用。