KR102657978B1 - 특이적 결합 분자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 VNAR을 포함하는 다중 도메인 특이적 결합 분자의 형성에 관한 것이다. 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)에 결합하는 특이적 결합 도메인이 또한 제공된다.

Description

특이적 결합 분자
본 발명은 VNAR을 포함하는 다중 도메인(domain) 특이적 결합 분자의 형성에 관한 것이다. 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)에 결합하는 특이적 결합 도메인이 또한 제공된다.
질병에 대항하기 위해 점점 더 효과적이고 다양화된 특이적 치료용 대항 수단에 대한 연구에는 통상적인 소분자에서 점진적으로 더 큰 생물학적 의약품, 예를 들어 단일 결합 도메인 (10 내지 15 kDa)에서 전장 IgG (약 150 kDa)에 이르기까지의 무수한 별개의 양상이 활용되어 왔다. 가능한 치료제로서 현재 연구 중인 단일 도메인은 모두 관련 장점 및 단점을 갖는 매우 다양한 단백질 스캐폴드 (scaffold)를 포함한다.
이러한 단일 도메인 스캐폴드는 별개의 종으로부터의 단백질 어레이로부터 유래될 수 있다. 신규 또는 신생 항원 수용체 (IgNAR)는 연골 어류의 혈청에서 발견되는 대략 160 kDa 동종2량체 단백질이다 (문헌[Greenberg A. S., et al., Nature, 1995. 374(6518): p. 168-173, Dooley, H., et al, Mol. Immunol, 2003. 40(1): p. 25-33; Muller, M.R., et al., mAbs, 2012. 4(6): p. 673-685)]). 각 분자는 단일 N 말단 가변 도메인 (VNAR) 및 5개의 불변 도메인 (CNAR)으로 구성된다. IgNAR 도메인은 면역글로불린-슈퍼패밀리의 구성원이다. VNAR은 면역글로불린 및 T-세포 수용체 가변 도메인 및 세포 부착 분자와 구조 및 일부 서열 유사성을 갖는 밀접하게 접힌 도메인이고, 통상적 면역글로불린 및 T 세포 수용체의 N 가변 말단 도메인과 유사하게 VNAR로 지칭된다. VNAR은 면역글로불린에 대해 제한된 서열 상동성을 공유하며, 예를 들어 VNAR과 인간 경쇄 서열 사이에는 25 내지 30%가 유사하다 (문헌[Dooley, H. and Flajnik, M. F., Eur. J. Immunol., 2005. 35(3): p. 936-945]).
문헌[Kovaleva M. et al Expert Opin. Biol. Ther. 2014. 14(10): p. 1527-1539 및 Zielonka S. et al mAbs 2015. 7(1): p. 15-25]은 최근에 VNAR의 구조적 특징 및 생성에 대한 요약을 제공하였으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로 포함된다.
VNAR은 통상적인 면역글로불린 항체 전신으로부터 발생한 것으로 보이지 않는다. VNAR의 고유한 구조적 특징은 통상적인 면역글로불린 가변 도메인에 존재하는 CDR2 루프와 동일한 서열의 절단 및 IgNAR 구조에 존재하지 않는 경쇄 도메인과의 결합을 정상적으로 가능하게 하는 소수성 VH/VL 계면 잔기의 부재 및 CDR 1 및 3에 N 말단 인접하는 프레임워크 1 및 3 영역의 시스테인 사이의 정규 면역글로불린 슈퍼패밀리 가교 이외에 추가의 이황화 가교를 형성하는 것으로 관찰되는 CDR 영역의 추가의 시스테인 잔기의 일부 VNAR 하위유형의 존재이다.
현재까지 3개의 소정의 유형의 상어 IgNAR이 I, II 및 III로 공지되어 있다 (도 1). 이들은 강한 선택 압력 하에 있으므로 거의 대체되지 않는 비정규 시스테인 잔기의 위치에 기초하여 분류되었다.
3개의 유형은 모두, 위치 36 (문헌[Kabat, E.A. et al. Sequences of proteins of immunological interest. 5th ed. 1991, Bethesda: US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH]에 따라 넘버링됨)의 비변이 트립토판과 함께 표준 면역글로불린 접힘을 안정화시키는 위치 35 및 107의 통상적인 면역글로불린 정규 시스테인을 갖는다. 이와 같은 소정의 CDR2는 존재하지 않지만, TCR HV2 및 HV4와 더 근사하게 비교되는 서열 변이 영역은 각각 프레임워크 2 및 3으로 규정되었다. 유형 I은 프레임워크 2 및 프레임워크 4의 생식계열 인코딩된 시스테인 잔기 및 CDR3 내의 짝수의 추가 시스테인을 갖는다. 라이소자임에 대해 단리되고 이와의 복합체 내의 유형 I IgNAR의 결정 구조 연구에 의해 이들 시스테인 잔기의 관여를 측정할 수 있었다. 프레임워크 2 및 4 시스테인 둘 모두, CDR3 루프가 HV2 영역 쪽으로 밀접하게 유지되는 밀집 구조를 형성하는 CDR3 내의 시스테인과 이황화 가교를 형성한다. 현재까지 유형 I IgNAR은 단지 수염상어에서만 확인되었으며 - 동일한 목의 구성원을 포함하여 다른 모든 연골어에는 유형 II 또는 이 유형의 변이체만이 존재한다.
유형 II IgNAR은 CDR1 및 CDR3 내에 시스테인 잔기를 갖는 것으로 규정되며, 이는 이들 두 영역을 근접하게 유지하는 분자 내 이황화 결합을 형성하여, 결합 주머니 또는 홈에 관여하는 돌출 CDR3 (도 2)을 생성한다. 유형 I 서열은 통상적으로 유형 II보다 더 긴 CDR3을 가지며 각각 평균 21 및 15개의 잔기를 갖는다. 이는 1형 CDR3 내의 2개 이상의 시스테인 잔기가 그의 프레임워크 2 및 4 대응 잔기와 결합하는 강한 선택적 압력 때문인 것으로 여겨진다. 체세포 돌연변이의 축적에 대한 연구는 유형 I보다 유형 II의 CDR1에 더 많은 수의 돌연변이가 존재하며, 유형 I의 HV2 영역은 유형 II보다 더 큰 서열 변이를 나타냄을 보여준다. 이러한 증거는 항원 결합 부위 내에서 이들 영역의 소정의 위치와 적절하게 관련된다.
유형 III으로 공지된 제3 IgNAR 유형은 신생아에서 확인되었다. IgNAR 패밀리의 이 구성원은 V-유전자와 D1 및 D2 영역 (CDR3을 형성함)의 생식계열 융합으로 인해 CDR3 내에 다양성이 부족하다. 공지된 거의 모든 클론은 서열 다양성이 거의 없거나, 전혀 없는 15개의 잔기 길이의 CDR3을 갖는다.
유형 (IIIb 또는 IV)으로 지칭되는 또 다른 구조적 유형의 VNAR은 단지 2개의 정규 시스테인 잔기를 갖는다. 지금까지 이 유형은 곱상어에서 최초로 발견되었으며 (문헌[Liu, J.L., et al. Mol. Immunol. 2007. 44(7): p. 1775-1783; Kovalenko O.V., et al. J Biol Chem. 2013. 288(24): p. 17408-19]), 또한 수염상어로부터 유래된 반합성 V-NAR 라이브러리로부터 단리되었다 (문헌[Streltsov, V.A. et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (34): p. 12444-12449]).
그러나 VNAR 서열로부터 형성된 합성 라이브러리로부터 단리된 특이적 VNAR은 다른 단백질에 대해 높은 친화도로 결합할 수 있으며 (문헌[Shao C.Y. et al. Mol Immunol. 2007. 44(4): p. 656-65; WO2014/173959]), 연골 어류가 항원에 결합하는 것으로 획득된 반응성 IgNAR 및 항원으로 면역화될 수 있으므로, IgNAR은 적응 면역계의 일부인 것으로 나타났다 (문헌[Dooley, H., et al, Mol. Immunol, 2003. 40(1): p. 25-33; WO2003/014161]). IgNAR은 면역글로불린 및 T 세포 수용체와 유사한 D 및 J 서열과 V 유사 서열의 조합 연결 메커니즘을 갖는 것으로 나타났다 (문헌[Zielonka S. et al mAbs 2015. 7(1): p. 15-25]에 의해 요약됨).
VNAR 결합 표면은 다른 천연 면역글로불린의 가변 도메인과 달리 CDR1, HV2, HV4 및 CDR3의 4개의 다양성 영역으로부터 유래하며 (또한 문헌[Stanfield, R. L, et al, Science, 2004. 305(5691): p. 1770-1773; Streltsov, V.A., et al, Protein Sci., 2005. 14(11): p. 2901-2909; Stanfield, R. L, et al., J Mol. Biol., 2007. 367(2): p. 358-372] 참조), 이는 FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4의 순서로 개재 프레임워크 서열에 의해 연결된다. 천연 경쇄 대상의 부재 및 CDR2의 부재의 조합에 의해 VNAR은 척추동물계에서 가장 작은 천연 발생 결합 도메인이다.
IgNAR은 낙타과에서 발견되는 중쇄 전용 면역글로불린 (HCAb)과 일부 부수적인 특징을 공유한다 (낙타, 단봉 낙타 및 라마, 문헌[Hamers-Casterman, C. et al. Nature, 1993. 363, 446-448; Wesolowski, J., et al., Med Microbiol Immunol, 2009. 198(3): p. 157-74]). IgNAR과 달리, HCAb는 면역글로불린 패밀리로부터 명확하게 유래되며, 표준 면역글로블린과 유의한 서열 상동성을 공유한다. 중요하게는 VNAR의 주요 특징 중 하나는 분자가 임의의 진화 시점에서 통상적인 면역글로불린 또는 HCAb와는 달리 대상 경쇄가 존재하지 않았다는 점이다. 문헌[Flajnik M.F. et al PLoS Biol 2011. 9(8): e1001120 및 Zielonka S. et al mAbs 2015. 7(1): p. 15-25]은 낙타과로부터의 VNAR 및 면역글로불린-유래 VHH 단일 결합 도메인의 유사성 및 차이점, 및 상이한 진화 기원에 대해 언급하였다.
통상적인 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄 (각각 VL 및 VH)로부터 유래된 결합 도메인은, 면역글로불린 VL 및 VH 도메인이 짧은 펩타이드 링커에 의해 연결되는(문헌[Traunecker et al. (Traunecker A, et al. EMBO J.1991. 10, p. 3655-36, Traunecker A, et al. Int J Cancer Suppl.7, 51-52; Neri D. J Mol Biol. 1995. 246(3): p. 367-73]) scFv 형식으로(문헌[Bird et al., 1988; Huston et al., 1988]) 또는 디아바디로서(문헌[Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993. 90, 6444-6448; Holliger P. et al. Nat. Biotechnol. 15, 632-636].다른 초기 예를 위해 문헌[Mack M, et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995. 92, p. 7021-7025, Jost CR, et al Mol. Immunol. 1996. 33, p. 211-219] 참조) 2가 또는 다가 및 이중 특이적 결합 물질을 형성하기 위해 서로 연결될 수 있는 것으로 나타났다. Tandab는 단일 폴리펩타이드 사슬에 연결된 2쌍의 VL 및 VH 도메인을 포함하여 (문헌[Kipriyanov S.M. et al., J. Mol. Biol. 293, 41-56]), 분자에 대해 이중 특이성 및 2가 형태를 형성한다.
또한, VHHS는 서로 연결되어 2가 또는 다가 및 이중 특이적 결합 물질을 형성할 수 있는 것으로 나타났다 (문헌[Els Conrath et al. J Biol Chem. 2001. 276(10) p.7346-7350]). 유사하게, T 세포 수용체로부터의 가변 도메인은 면역글로불린 scFv에 연결되어 이중 특이적 형식을 형성할 수 있다 (문헌[McCormack E. et al. Cancer Immunol Immunother. 2013. 62(4): p. 773-85]). 통상적인 면역글로불린으로부터의 단일 항체 가변 도메인 (dAB: 문헌[Ward E.S. et al. Nature 1989, 341, p. 544-546])이 또한 2량체화될 수 있다. 이중 특이적 결합 분자의 전반적인 개념 및 이들의 생성에서의 현재 진행 상황은 최근에 예를 들어 문헌[Kontermann R. mAbs 2012. 4(2): 185-197; Jost C. and Pluckthun A. Curr Opin Struct Biol. 2014. 27: p. 102-112; Spiess C. et al. Mol Immunol 2015. 67(2): 95-106]에 의해 검토되었다.
개별 분자 상의 에피토프(epitope)를 인식하는 이중 특이적 분자 이외에, 동일한 단백질 상의 인접한 에피토프를 인식하는 2개의 항체 결합 도메인을 연결하는 개념 (이중 파라토프)은 오랜 역사를 가지고 있다 (문헌[Neri D. J Mol Biol. 1995. 246(3): p. 367-73] 참조). 이중 파라토프 VHH 분자가 개시되어 있다 (예를 들어, 문헌[Jahnichen S. et al Proc Natl Acad Sci U S A. 2010. 107(47): p. 20565-70; Roovers R.C. et al Int J Cancer. 2011129(8): p. 2013-24]).
그러나, VHHS와 달리, VNAR은 2량체 융합 분자를 효율적으로 형성하지 못할 수 있다고 제시되었다 (문헌[Simmons D.P. et al. Immunol Methods. 2006 315(1-2): p. 171-84]). (또한 문헌[Bispecific Antibodies Konterman R.E. Springer Publishing 2011; 6.6]의 견해 참조; 또한 문헌[Strohl W.R. and Strohl L.M., Therapeutic Antibody Engineering, Woodhead Publishing 2012]의 p322/323의 견해 참조).
본 발명은 2개 이상의 VNAR 도메인을 포함하는 다중 도메인 특이적 결합 분자의 제공에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 2가 및 다가 VNAR의 제공에 관한 것이다. 본 발명자들은 최근 당 업계의 일반적인 이해와 달리, 실제로 VNAR의 2량체, 3량체 및 이중 특이적 융합이 형성될 수 있음을 제시하였다.
최근에 문헌[Muller M.R. et al mAbs 2012. 4(6): p. 673-685; WO2013/167883]은 하나의 도메인이 인간 혈청 알부민 (HSA)에 대한 특이성을 갖는 VNAR을 포함하는 이중 특이적 VNAR을 개시하였으며, 이는 2가 구조가 혈청 중 HSA에 결합하여, 대상 도메인의 생물학적 반감기가 연장될 수 있도록 한다. HSA-결합 VNAR의 N 및 C 말단 둘 모두에서 VNAR의 융합은 HSA 결합 도메인의 기능을 유지시키는 것으로 나타났다. 더욱 최근에, WO/2014/173975는 B 세포, 활성화된 단핵구 및 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포 (APC) 상에 항시적으로 발현되는 세포 표면 항원인 ICOSL (CD275) 및 B7 패밀리 구성원의 리간드 ICOS (CD278)에 결합할 수 있는 VNAR을 개시하고, 있다 (문헌[Yoshinaga.S., K., et al., Int. Immunol., 2000. 12(10): p. 1439-1447]). 이러한 ICOSL VNAR 중 특정의 것은 HSA 결합 VNAR에 연결될 수 있으며, 두 도메인 모두 기능을 유지하는 것으로 나타났다. 상이한 항원 (hICOSL, mICOSL 및 HSA)을 인식하는 각각의 3량체 형태를 제조할 수 있고, 각각의 도메인은 기능을 유지하는 것으로 나타났다.
그러나, 동일한 항원상의 동일하거나 상이한 에피토프를 인식하는 이중 또는 다중 특이적 VNAR이 형성될 수 있음은 종래에 밝혀지지 않았다. 또한, 예기치 않게, 이 형태의 이중 특이적 분자는 구성 단량체로부터 형성된 2가 분자, 또는 단량체 형태 자체 또는 HSA를 인식하는 VNAR에 연결된 단량체보다 향상된 특성을 나타낸다.
본 발명은 다가 또는 다중 특이적 물질로 조합될 수 있고, 다중 도메인 물질 내에서 각 도메인이 결합 기능을 유지하는 능력을 갖는 특이적 VNAR 도메인 서열에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 제1 양상에서, 하나 이상의 특이적 항원의 동일하거나 상이한 에피토프에 결합하는 2개 이상의 VNAR 도메인을 포함하는 다중 도메인 특이적 결합 분자가 제공된다.
바람직한 특정 실시형태에서, 본 발명의 제1 양상의 다중 도메인 특이적 결합 분자 내의 VNAR은 특이적 항원 상의 동일한 항원에 결합한다.
추가의 바람직한 실시형태에서, 다중 도메인 특이적 결합 분자의 VNAR은 특이적 항원 상의 상이한 에피토프에 결합한다. 이들 실시형태에 따른 다중 도메인 특이적 결합 분자는 본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이 이중-파라토프 분자로 지칭될 수 있다.
일 실시형태에서, 특이적 VNAR 결합 도메인 서열은 다가 또는 다중 특이적 물질로 조합되고, 다중 도메인 물질 내에서 각각의 도메인은 결합 기능을 유지하며, 결합 도메인은 단일 항원 상의 별개의 에피토프를 인식한다.
본 발명의 바람직한 실시형태는 2개 (또는 그 이상)의 상이한 VNAR 도메인을 포함하는 이중 또는 다중 특이적 결합 분자이고, 결합 특이성은 단일 특이적 항원 상의 별개의 에피토프에 대한 것이며, 생성된 물질은 개별 VNAR 결합 도메인과 비교하여 향상된 특성을 나타낸다. 향상된 특성의 예는 단량체 VNAR과 비교하여 증가된 작용제 또는 길항제 효과를 포함한다.
바람직하게는 본 발명의 다중 도메인 특이적 결합 분자의 VNAR 도메인은 스페이서 서열(spacer sequence)에 의해 분리된다. 더욱 바람직하게는, 스페이서 서열은 결합 분자에 나타나는 독립적인 기능성을 갖는다. 일 실시형태에서, 스페이서 서열은 VNAR 도메인 또는 그의 기능성 단편이다. 특정 예에서, 스페이서는 인간 혈청 알부민 또는 ICOSL을 포함하여 혈청 알부민에 결합하는 VNAR 또는 그의 기능성 단편일 수 있다. 특정 실시형태에서 스페이서 서열은 서열번호 67, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 또는 88 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 그에 대해 적어도 60% 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 기능성 단편을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 스페이서 서열은 인간 면역글로불린 Fc 영역을 포함하지만 이에 제한되지 않는 면역글로불린의 Fc 부분일 수 있다. 향상된 특성은 예를 들어 스페이서 중 VNAR 도메인의 수동적 공간적 분리, 생성된 물질에 대해 생체내 반감기의 연장을 야기할 수 있는 혈청 알부민 결합과 같은 스페이서의 고유 특성 또는 ICOSL과 같은 제2 치료 자가면역 표적의 인식 또는 면역글로불린 Fc 영역의 경우 면역계 또는 보체의 세포와의 결합 능력의 도입에 의해 스페이서의 특성으로부터 부분적으로 또는 전체적으로 유래할 수 있다.
스페이서 서열에 의해 분리된 둘 이상의 VNAR 도메인을 포함하는 본 발명의 다중 도메인 특이적 결합 분자의 실시형태는 본 명세서에서 Quad-X 형식으로 지칭될 수 있다.
다른 바람직한 실시형태에서, 다중 도메인 특이적 결합 분자는 하나 이상의 비-VNAR 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 하나 이상의 비-VNAR 도메인은 VNAR 도메인에 대해 임의의 위치에 위치할 수 있다. 통상적으로, 및 바람직한 실시형태에서, 비-VNAR 도메인은 VNAR 도메인에 대해 C 말단 또는 N 말단일 것이다.
2개 이상의 VNAR 도메인 및 VNAR 도메인에 대해 C 말단 또는 N 말단인 비-VNAR 도메인을 포함하는 본 발명의 다중 도메인 특이적 결합 분자의 실시형태는 본 명세서에서 Quad-Y 형식으로 지칭될 수 있다.
예시적 비-VNAR 도메인은, 다음에 제한되는 것은 아니나, TNF R1 및 면역글로불린 Fc를 포함한다.
특이적 항원은 사이토카인, 성장 인자, 효소, 세포 표면 결합 분자, 세포 표면 막 성분, 세포내 분자, 세포외 기질 성분, 간질 항원, 혈청 단백질, 골격 항원, 미생물 항원 또는 정상적 면역-부여 위치(normally immune-privileged location)로부터의 항원을 포함하는 군으로부터의 것일 수 있다.
본 발명의 추가의 양상은 사이토카인을 인식하는 VNAR 결합 도메인의 특이적 조합이다.
본 발명은 또한 인간 TNF를 인식하고, 현재 질병을 치료하는데 사용되는 잘 특성화된 다른 모든 항-TNF 항체 및 VHH 결합인자와 상이한 에피토프에 결합하는 특이적 도메인을 제공한다.
따라서, 제2 양상에서, 본 발명은 하기 CDR 및 초가변 영역 (HV)을 포함하는 TNF-알파 특이적 VNAR 결합 도메인 또는 적어도 60%의 서열 동일성을 갖는 그의 기능성 변이체를 제공한다:
CDR1: HCATSS (서열번호 68) 또는 NCGLSS (서열번호 69) 또는 NCALSS (서열번호 70)
HV2: TNEESISKG (서열번호 71)
HV4: SGSKS (서열번호 72) 또는 EGSKS (서열번호 73)
CDR3: ECQYGLAEYDV (서열번호 1) 또는 SWWTQNWRCSNSDV (서열번호 6) 또는 YIPCIDELVYMISGGTSGPIHDV (서열번호 11).
특히 바람직한 실시형태에서, TNF-알파 특이적 VNAR 결합 도메인은 서열번호 2, 7 또는 12의 아미노산 서열, 또는 적어도 60%의 서열 동일성을 갖는 그의 기능성 변이체를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 TNF-알파 특이적 VNAR 도메인은 특이적 항원 상의 특이적 에피토프에 대해 기능성 결합 활성을 유지하면서, 예를 들어 인간화, 탈면역화 또는 유사한 기술에 의해 생체내 면역원성 가능성을 감소시키기 위해 하나 이상의 아미노산 서열 위치에서 변형된다.
본 발명의 일 실시형태는 TNFα를 인식하고, 본 발명에 요약된 형태로, 개별 결합 도메인에 비해 향상된 기능성 특성을 제공하는 생성된 다중 도메인 결합 분자로의 VNAR 결합 도메인의 특이적 조합이다. TNFα를 인식하는 것으로 주장되는 VNAR이 증가할 수 있는 것으로 공지되어 있다 (문헌[Camacho-Villegas T, et al MAbs. 2013. 5(1): P. 80-85; Bojalil R, et al BMC Immunol. 2013. 14: 17; WO2011/056056; US20110129473; US20140044716]). 그러나 이들 VNAR은 연결되어, 2량체 또는 이중 특이적 형태를 형성하지 않았다. 또한, 단량체 형식의 이들 도메인은 본 명세서에 기재된 단량체 항-TNF VNAR 도메인보다 70 내지 200배 덜 강하다.
따라서, 본 발명의 제2 양상의 TNF-알파 특이적 VNAR 결합 도메인은 제1 양상의 다중 도메인 특이적 결합 분자에서 하나 또는 둘 모두의 VNAR 도메인으로서 사용될 수 있다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, 하나 이상의 VNAR 도메인이 서열번호 2, 7 또는 12, 또는 적어도 60%의 서열 동일성을 갖는 그의 기능성 변이체를 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 제1 양상의 다중 도메인 특이적 결합 분자가 제공된다. 다른 바람직한 실시형태에서, 2개 이상의 VNAR 도메인이 서열번호 2, 7 또는 12, 또는 적어도 60%의 서열 동일성을 갖는 그의 기능성 변이체를 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 제1 양상의 다중 도메인 특이적 결합 분자가 제공된다.
본 발명의 제1 양상의 다른 바람직한 실시형태는 서열번호 65 또는 66을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 적어도 60%의 서열 동일성을 갖는 그의 기능성 변이체를 갖는 하나 이상의 VNAR 도메인을 포함하는 제1 양상의 다중 도메인 특이적 결합 분자를 포함한다. 제1 양상의 또 다른 실시형태는 서열번호 65 또는 66을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 적어도 60%의 서열 동일성을 갖는 그의 기능성 변이체를 갖는 2개 이상의 VNAR 도메인을 포함하는 제1 양상의 다중 도메인 특이적 결합 분자를 포함한다.
본 발명의 제1 양상에 사용된 VNAR 도메인 또는 도메인들은 특이적 항원 상의 특이적 에피토프에 대해 기능성 결합 활성을 유지하면서, 예를 들어 인간화, 탈면역화 또는 유사한 기술에 의해 생체내 면역원성 가능성을 감소시키기 위해 하나 이상의 아미노산 서열 위치에서 변형될 수 있다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 임의의 양상 또는 실시형태에 따른 결합 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.
또한, 본 발명에 따른 결합 분자의 제조 방법으로서, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포를, 상기 숙주 세포가 결합 분자를 생성하는 조건 하에서 배양하거나, 유지시키는 단계를 포함하고, 선택적으로 결합 분자를 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
본 발명의 추가 양상에 따르면, 본 발명의 이전 양상의 특이적 항원 결합 분자 및/또는 다중 도메인 특이적 결합 분자의 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 임의의 적합한 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 애주번트 또는 완충 용액을 포함할 수 있다. 본 조성물은 추가의 약제학적 활성제를 포함할 수 있다. 이러한 담체는 다음에 제한되는 것은 아니나, 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 리포좀, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
이러한 조성물은 지시된 바와 같이 추가의 약제학적 활성제를 포함할 수 있다. 추가 제제는 치료 화합물, 예를 들어 항염증제, 세포독성제, 세포정지제 또는 항생제일 수 있다. 이러한 추가 제제는 이를 필요로 하는 환자에 투여하기에 적합한 형태로 존재할 수 있으며, 이러한 투여는 동시, 개별 또는 순차적으로 이루어질 수 있다. 상기 성분은 적절하게 설명서를 포함할 수 있는 키트 형태로 제조될 수 있다.
약제학적 조성물은, 예를 들어, 특히 경구, 국소, 정맥내, 근육내, 비강내 또는 피내 경로에 의한 투여를 포함하여 환자의 질병을 치료하는데 효과적인 임의의 효과적이고 편리한 방식으로 투여될 수 있다. 요법에서 또는 예방제로서, 활성제는 주사용 조성물, 예를 들어 멸균 수성 분산액, 바람직하게는 등장성으로서 개체에 투여될 수 있다.
포유류, 특히 인간에 투여하기 위해, 활성제의 1일 투여량은 0.01 mg/kg 체중 내지 통상적으로 대략 1 mg/kg, 2 mg/kg, 10 mg/kg 또는 최대 100 mg/kg일 것으로 예상된다. 일부 경우에도 의사는 개체의 연령, 체중, 성별 및 반응을 포함한 인자에 따라 개체에 가장 적합한 실제 투여량을 결정할 것이다. 상기 투여량은 평균 경우의 예시이다. 물론, 더 높거나, 더 낮은 투여량이 유리한 경우가 있을 수 있으며, 이는 본 발명의 범위 내에 있다. 본 발명은 또한 사용 설명서와 함께 본 명세서에 규정된 바와 같은 약제학적 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 추가 양상에 따르면, 약제에 사용하기 위한 이전 양상의 약제학적 조성물이 제공된다. 이러한 용도는 상기 규정된 바와 같은 본 발명의 약제학적 조성물이를 필요로 하는 환 유효량의 투여를 통한 본 발명의 결합 도메인의 표적 항원과 그의 리간드 대상(들) 간의 상호작용과 관련된 질병을 치료하는 방법을 포함한다. 본 조성물은 본 발명의 적어도 하나의 특이적 항원 결합 분자 (VNAR 도메인) 또는 다중 도메인 특이적 결합 분자, 또는 이러한 분자 및/또는 이들의 인간화 변이체의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 이러한 양상에 따르면, 본 발명의 결합 도메인의 표적 항원과 그의 리간드 대상(들) 간의 상호작용과 관련된 질병의 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 조성물이 제공된다.
이러한 조성물은 제시된 바와 같이 추가의 약제학적 활성제를 포함할 수 있다. 추가 제제는 치료 화합물, 예를 들어 항염증제, 세포독성제, 세포정지제 또는 항생제일 수 있다. 이러한 추가 제제는 이를 필요로 하는 환자에 투여하기에 적합한 형태로 존재할 수 있으며, 이러한 투여는 동시, 개별 또는 순차적으로 이루어질 수 있다. 상기 성분은 적절하게 설명서를 포함할 수 있는 키트 형태로 제조될 수 있다.
본 발명에 따르면, 약제에 사용하기 위한 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자 또는 다중 도메인 특이적 결합 분자가 제공된다. 따라서 본 발명의 이러한 양상은 이를 필요로 하는 환자에서 질병 치료용 약제의 제조에서의 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자 또는 다중 도메인 결합 분자의 용도로 확장된다. 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자는 또한 본 발명의 약제학적 조성물과 관련하여 상기 규정된 바와 같은 특이적 결합 분자 또는 다중 도메인 결합 분자를 포함하는 융합 단백질을 제조하는데 사용될 수 있다. 이러한 용도는 또한 치료가 이를 필요로 하는 환자에서 질병을 치료하는 방법으로서, 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자 또는 다중 도메인 결합 분자를 포함하는 본 명세서에 규정된 바와 같은 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "치료"는 인간 또는 비인간 동물에 유리할 수 있는 임의의 요법을 포함한다. 수의학에서 "비인간 동물"의 치료는 말 및 반려 동물 (예를 들어, 고양이 및 개)을 포함한 가축, 양, 염소, 돼지, 소 및 말과 포함한 농장/농업 동물의 치료까지 확장된다. 치료는 임의의 기존 병태(condition) 또는 장애와 관련하여 치료학적 치료일 수 있거나, 예방학적 (예방 치료)인 것일 수 있다. 치료는 선천성 또는 후천성 질병의 치료일 수 있다. 치료는 급성 또는 만성 병태의 치료일 수 있다. 치료는 염증 및/또는 암과 관련된 병태/장애의 치료일 수 있다. 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자 또는 다중 도메인 특이적 결합 분자는 다음에 제한되는 것은 아니나, 골관절염, 경피증, 신장 질병, 류머티스 관절염, 염증성 장 질병, 다발성 경화증, 죽상동맥경화증 또는 임의의 염증성 질병을 포함하는 장애의 치료에 사용될 수 있다.
추가의 양상에서, 본 발명은 TNFα에 의해 매개되는 병태를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 TNFα에 특이적으로 결합하는 본 발명의 조성물의 치료 유효량의 투여를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 ICOSL에 의해 매개되는 적어도 하나의 병태를 치료하는 방법으로서, ICOSL에 특이적으로 결합하는 본 발명의 조성물의 유효량의 투여를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 양상은 세포-표면 분자를 인식하는 VNAR 결합 도메인의 특이적 조합이다. 특정 실시형태에서, 다중 도메인 결합 분자의 VNAR은 상이한 종류의 리간드 또는 표적에 결합한다. 본 명세서에서 고려되는 하나의 비 제한적인 예는 적어도 하나의 VNAR 도메인이 자가면역 질병과 관련된 표적에 결합하고, 적어도 하나의 VNAR 도메인이 염증 반응에 관련된 표적에 결합하는 본 발명의 제1 양상의 다중 도메인 특이적 결합 분자이다.
본 발명의 특히 바람직한 다중 도메인 특이적 항원 결합 분자는 TNF-특이적 VNAR 및 ICOSL 특이적 VNAR을 포함한다. 바람직하게는, TNF-특이적 VNAR은 본 발명의 제2 양상의 VNAR이다.
본 발명의 일 실시형태는 ICOSL을 인식하고, 본 발명에 요약된 형태로 개별 결합 도메인에 비해 향상된 기능성 특성을 제공하는 생성된 다중 도메인 결합 분자로의 VNAR 결합 도메인의 특이적 조합이다.
본 출원에서, 다음의 다수의 도면이 참조된다:
도 1 항-수염상어 IgNAR 하이브리도마 항체를 이용한 면역화된 수염상어 혈장의 항-hTNF-알파 IgNAR 적정
면역화된 동물, 사전 면역화 및 채혈 5 후 혈청의 ELISA 적정
면역화된 수염상어에서의 항-rhTNF-α IgNAR 역가의 결합 ELISA 측정. GA8 단일클론 항-수염상어 IgNAR 항체에 의해 검출을 수행하고, 항-마우스 IgG-HRP 접합 항체를 이차 항체로 사용하였다.
도 2 L929 세포에서 hTNF-알파 유도 세포독성의 중화
이 분석에서, 세포 바이오-분석에서 hTNF-α의 활성을 중화시키는 항-TNF 도메인 (D1 및 C4) 및 대조군 항-인간 혈청 알부민 도메인 (BA11)의 능력을 결정하였다. D1 및 C4 도메인 둘 모두 유사한 농도 의존적 중화 수준을 나타내었다 (계산된 값에 대해서는 표 2 참조). BA11 대조군은 hTNF를 인식하지 못하므로, 최고 농도에서도 중화가 관찰되지 않았다. hTNF-α + 액티노마이신-D (Actinomycin-D)는 중화 도메인의 부재 하에 통상적인 세포독성을 나타내는 대조군으로서 작용하였다.
도 3 L929 섬유육종 세포주에서의 시험관내 rhTNFα 중화 분석.
A. 1x LD80 [0.3 ng/ml rhTNFα]의 중화, n=3, 실험당 2회 반복 실험,±SEM;
B. 10x LD80 [3 ng/ml rhTNFα]의 중화, n=2, 실험당 2회 반복 실험,±SD.
TNF30-Fc는 IgG Fc에 융합된 면역화된 낙타에서 단리된 항-rhTNFα VHH 나노바디의 융합체이다 (문헌[Coppieters et al., Arthritis and Rheumatism, 2006, 54 (6): 1856-1866; Riechmann et al., J. Immunol. Methods, 1999. 231: 25-38]).
Alb8-Fc는 IgG Fc에 융합된 HSA를 인식하는 VHH 도메인이다.
2V는 공지된 표적을 인식하지 못하는 음성 대조군 VNAR이다. 2V-Fc는 2V와 IgG Fc의 융합체이다.
hTNF에 특이적인 결합인자 (D1, C4 및 TNF-30)만이 농도 의존적 방식으로 유리 hTNF의 활성을 중화시키는 것으로 입증될 수 있었다. 단량체로부터 2가 Fc 형식으로의 전환에 의해 중화 효능이 향상되었다. D1-Fc 및 C4-Fc의 조합은 함께 중화 효능을 제공하였으며, 이는 D1-Fc 단독 또는 C4-Fc 단독의 경우보다 우수하였다 (모든 계산된 중화 값에 대해서는 표 2 참조). Alb-8 및 2V 대조군은 둘 모두 이러한 2가 Fc 형식에서도 중화시킬 수 없었다.
도 4 2가 및 이중 특이적 작제물의 형식의 도표
도 5는 TNF-30 VHH 대조군과 함께 2량체 VNAR (TNF30-TNF30)의 ELISA 결합이다.
시험된 모든 VNAR 도메인 D1, C4, B4는 그 자체로 쌍을 형성하거나 (예를 들어, D1-D1, C4-C4 등), 가능한 두 방향으로 (예를 들어, C4-D1, B4-D1) 서로 쌍을 형성하였다 (예를 들어, D1-C4, D1-B4). ELISA 순위에 의하면, 이 ELSA 형식에서 D1-D1 2량체 쌍은 최고 (포화 신호에 도달하는데 필요한 VNAR의 최저 농도)로, B4-C4 및 B4-B4는 최저 수행성으로 책정되었다. 다수의 VNAR 쌍은 VHH 2량체 대조군보다 우수하였다.
도 6 VNAR 2량체 쌍에 의해 TNF 중화를 측정하기 위한 L929 분석
항-TNFα VNAR 2량체 쌍 D1-D1, D1-C4, D1-B4 및 양성 대조군 항-TNF VHH 2량체 (TNF30-TNF30)의 중화 능력을 적절한 생체 분석을 사용하여 평가하였다. 이 분석 형식에서 가장 강력한 중화 활성을 나타내는 도메인 쌍은 VNAR 쌍 D1-C4였다 (계산된 중화 값에 대해서는 표 2 참조). 임의의 중화 도메인의 부재 하의 hTNFα + 액티노마이신-D 처리된 세포는 적절한 통상적 비억제 세포독성 제어를 제공하였다.
도 7 3량체 항-hTNF-α VNAR을 사용한 L929 세포에서의 hTNFα 유도 세포독성의 중화
선행 항-hTNFα VNAR 2량체 (D1-D1 및 D1-C4)를 두 2량체 작제물의 중간에 항-HSA 인간화 VNAR (soloMER™ BA11)을 혼입함으로써, 이를 다가 3량체 작제물로 개조하여, 각각 D1-BA11-D1 및 D1-BA11-C4를 획득하였다. hTNFα를 중화시키는 이들 다가 3량체 작제물 및 humira (아달리무맙 (Adalimumab)) 및 TNF30-BA11-TNF30의 능력을 통상적인 L929 분석에서 평가하였다. D1-BA11-C4 작제물은 아달리무맙과 유사한 중화 효능을 나타내었고, VHH 3량체 작제물 및 또한 항-hTNFα 2량체 (D1-C4 및 D1-D1) VNAR보다 유의하게 향상된 효능을 나타내었다 (계산된 ND50 값에 대해서는 표 2 참조).
도 8 극성 Caco2 세포에서 Caco2 상피 투과성
Caco-2 세포를 처리하고, 10 ng/mL TNFα, LPS 및 IFNγ +/- 항-TNFα 단백질과 함께 18시간 동안 인큐베이션하였다. 5 μl의 10 mg/ml FITC-덱스트란 [3000-5000 kDa]을 최상부 챔버에 첨가하고, 막을 통과한 기저측 챔버로의 수송을 24시간 후에 측정하였다.
VNAR/VHH 단량체 및 VNAR 대조군 단백질로의 처리는 50 nM 농도에서 이루어졌으며, VNAR 2량체 (2C 및 2D) 및 아달리무맙으로의 처리는 25 nM에서 이루어졌다.
BA11 및 2V는 비-TNFα 결합 VNAR 대조군이며, B4는 비-중화 TNF-결합 VNAR이다.
항-hTNFα VNAR 작제물 (단량체 D1, C4, B4; 2량체 D1-D1, D1-C4; 3량체, D1-BA11-D1, D1-BA11-C4), VHH 작제물 TNF30, TNF30-TNF30, TNF30-BA11-TNF30, 및 아달리무맙이 사이토카인 처리된 Caco-2 세포에서 장 장벽 기능이상을 예방하는 능력을 이러한 통상적인 분석을 사용하여 평가하였다. VNAR 도메인 D1-C4 및 D1-BA11-C4는 아달리무맙에 유사한 효능을 나타내었다. 음성 대조군 BA11 및 2V는 장 장벽 기능이상을 예방할 수 없었다.
도 9 극성 Caco-2 세포에서의 상피 저항
분화된 Caco-2 세포를 처리하고, 10 ng/mL TNFα 및 IFNγ +/-항-TNFα와 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 상피 통과 저항에 대한 사이토카인 처리의 효과를 볼트-옴 미터 (volt-ohm meter)를 사용하여 측정하였다. 처리 하 표면적에 대해 저항을 정규화하였다 (옴. cm2).
VNAR/VHH 단량체 및 VNAR 대조군 단백질로의 처리는 50 nM 농도에서 이루어졌으며, VNAR 2량체 (2C 및 2D) 및 아달리무맙으로의 처리는 25 nM에서 이루어졌다.
BA11 및 2V는 비-TNFα 결합 VNAR 대조군이고, B4는 비-중화 TNF-결합 VNAR이다.
[n=1±SD, 처리당 8회 이상의 반복 실험, 일원 ANOVA 및 GraphPad Prism 5를 사용한 Dunnett의 사후 검정)
사이토카인 처리된 Caco-2 세포에서 상피 저항을 복구시키는 항-hTNFα VNAR 도메인의 효능을 VHH TNF30 및 임상적으로 이용 가능한 아달리무맙의 효능과 등몰 투여량 범위에서 비교 조사하였다. 항-hTNFα 2량체 및 3량체 VNAR 도메인은 아달리무맙에 의해 관찰된 효과에 유사한 방식으로 상피 저항을 복구시키는데 유의한 능력을 나타내었다. 음성 대조군 BA11 및 2V는 상피 저항을 복구시키지 않았다.
도 10 ICOSL VNAR-Fc 융합의 형식
도 11 ICOSL ELISA 결합 데이터
인간 및 마우스 ICOS 리간드 둘 모두에 대한 상이한 항-ICOSL Quad-X™ 작제물의 결합 ELISA
도 12 TNF R1 도메인, ICOSL VNAR 및 인간 IgG Fc를 혼입시키는 본 발명의 다가 및 다중 특이적 VNAR에 대한 형식
도 13 TNF R1 도메인, ICOSL을 혼입시키는 다가 및 다중 특이적 VNAR에 대한 효능 데이터. 추가적인 향상된 기능성 특성을 제공하는 VNAR 및 인간 IgG Fc.
VNAR-TNFR1 Fc 이중 기능성 작제물은 세포 기반 중화 분석에서 특이적이고 강력한 효능을 나타낸다.
형식 1: 항-TNFα scFv
형식 2: 항-mlCOSL VNAR (CC3)
형식 3: 항-hlCOSL scFv
형식 4: 항-hlCOSL VNAR (2D4)
도 14 VNAR T43 뿔상어 클론과 VNAR 수염상어 D1 및 C4 사이의 hTNF-알파 결합 프로파일.
1 μg/ml hTNFα 코팅된 웰에 대한 뿔상어로부터의 VNAR T43 및 VNAR D1 및 C4의 결합 ELISA. T43 클론의 결합 프로파일은 사용된 실험 농도에서 측정할 수 없었다.
도 15 VNAR T43 뿔상어 클론 및 VNAR 수염상어 D1 및 C4의 L929 세포에서 hTNF-알파 중화 효능
등몰 투여량 범위의 뿔상어 T43 VNAR과 비교한 항-hTNFα VNAR 단량체 D1 및 C4의 중화 효능의 비교. T43 도메인은 투여량 의존적 중화 효과를 나타내지 않았으며, hTNFα 및 액티노마이신-D로 처리된 비보호 세포와 유사한 프로파일을 나타낸다 (표 2 참조).
도 16 성공적으로 인간화된 항-hTNF-알파 D1 (또한 D1 soloMER™으로 공지됨)의 결합 프로파일
다수의 점진적으로 향상된 프레임워크 인간화 버전의 VNAR D1 도메인의 결합 프로파일. D1-v1, D1-v2, D1-v3 및 D1-v4는 다양한 인간화 정도를 나타내며, VNAR D1 (wt)는 모체 VNAR D1 도메인이다. 수염상어 프레임워크 아미노산 잔기를 DPK-9의 잔기로 치환하는 경우, 인간 생식계열 카파는 hTNFα를 인식하는 인간화된 D1 버전의 능력을 방해하지 않았다.
도 17 D1 soloMER™의 L929 세포에서의 중화 효능
L929 세포에서 hTNFα 매개 세포독성을 중화시키는 능력을 인간화된 VNAR D1 변이체에서 평가하였다. soloMER D1-v2는 hTNFα 유도된 세포독성에 대한 중화 효능을 유지하였다.
도 18 인간 IgG Fc를 혼입시키는 본 발명의 다가 및 다중 특이적 VNAR에 대한 형식
도 19 이중 파라토프/이중 특이적 D1-Fc-C4 (Quad-X™) 대 이중 파라토프 VNAR Fc 작제물 D1-Fc 및 C4-Fc의 결합 프로파일을 나타내는 다가/다중 특이적 VNAR-Fc 작제물의 hTNF-알파 결합 프로파일. 항-hTNF-α VNAR Quad-X™ D1-Fc-C4는 D1-Fc 및 C4-Fc에 근사하고, 약간 향상된 결합 프로파일로 hTNFα에 대한 결합을 유지하였다.
도 20 L929에서 다가/다중 특이적 VNAR-Fc 작제물의 hTNF-알파 중화 활성 평가
hTNFα 매개 세포독성의 L929 세포 기반 분석에서 VNAR Quad-X™ D1-Fc-C4 대 Humira (아달리무맙)의 중화 효능 평가. VNAR Quad-X™ D1-Fc-C4는 중화 능력을 유지하였고, Humira와 비교하여 우수한 중화 활성을 나타내었다 (ND50 값에 대해서 표 2 참조).
도 21 항-마우스 TNF-알파 VNAR; 및 항-HSA soloMER™ BA11 또는 ICOSL VNAR 도메인, A5 또는 마우스 IgG2a Fc를 혼입시키는 본 발명의 다가 이중 파라토프 VNAR에 대한 형식
도 22a 이중 파라토프 항-마우스 TNF-알파 VNAR 작제물의 마우스 TNF-알파 결합 프로파일.
항-ICOS 리간드 VNAR A5 또는 항-HSA 인간화 VNAR, soloMER™ BA11을 혼입시키는 다가/다중 특이적 3량체로서 VNAR 항-마우스 TNFα S17 도메인의 개조. 두 작제물 모두 마우스 TNF-알파에 대한 인식을 유지하였다.
도 22b 이중 파라토프 항-마우스TNF-알파 VNAR 작제물의 HSA 결합 프로파일. 항-ICOS 리간드 VNAR A5 또는 항-HSA 인간화 VNAR, soloMER™ BA11을 혼입시키는 다가/다중 특이적 3량체로서 VNAR 항-마우스 TNFα S17 도메인의 개조. S17-BA11-S17은 HSA에 대한 결합을 유지하였으며, S17-A5-S17은 HSA를 인식하지 못하였다.
도 22c 이중 파라토프 2량체/3량체 항-ICOSL VNAR 작제물의 마우스 ICOS 리간드 결합 프로파일.
마우스 ICOS 리간드에 대한 개조된 S17-A5-S17 및 A5-A5 동종2량체의 결합 프로파일에 의하면, S17-A5-S17과 같이 중간에 항-마우스 ICOS 리간드 VNAR A5를 혼입시키는 개조된 3량체 작제물이 마우스 ICOS 리간드에 대한 결합을 유지한 것으로 나타났다.
도 23a 및 도 23b 각각 이중 파라토프 및 IgG2a Fc 융합 항-마우스 TNF-알파 VNAR S17 작제물의 L929 프로파일에서의 마우스 TNF-알파 중화.
항-마우스 TNFα 작제물 (S17-A5-S17, S17-BA11 -S17, S17-Fc)의 중화 효능을 마우스 TNFα 매개 세포독성 L929 분석에서 평가하였다. 3량체 S17 및 이중 파라토프 S17-Fc 작제물 둘 모두는 L929 세포에서 마우스 TNFα 매개 세포독성에 대한 중화 활성을 나타내었다. S17-A5-S17은 3개의 작제물 중에서 가장 높은 효능을 나타내었다. BA11은 분석에서 음성 대조군이었으며, 또한 hTNFα + 액티노마이신 D는 항-마우스 TNFα 억제제/중화제의 부재 하에 관찰된 통상적인 세포독성 효과를 나타내었다. 세포 단독의 경우에는 처리되지 않은 건강한 세포를 나타낸다.
도 24 CHO-기반 hulCOS/재조합 마우스 ICOS 리간드-Fc (ICOSL-Fc) 중화 (블로킹 (blocking)) 분석-ELISA 기반.
이 블로킹 분석에서, 다가 VNAR 작제물은 마우스 ICOSL-Fc가 CHO 세포 상의 그의 동족 결합 대상인 ICOS와 상호작용하는 것을 블로킹하는 유의한 능력을 나타내었다. 이는 세포 기반 ELISA 형식에서 항-인간 Fc-HRP 항체를 사용하여 마우스 ICOSL-Fc의 Fc 부분의 감소/손상된 검출로 이어진다. A5-A5 2량체가 가장 강력한 블로킹제이고, 이어서 S17-A5-S17이며, S17 단량체는 이 분석에서 음성 대조군이다.
도 25 항-hTNF-알파 VNAR 대 VHH TNF30 및 Humira® 사이의 결합 교차 반응성 차이.
이 도면은 VHH TNF30 및 Humira와 비교하여 VNAR D1-C4의 결합 교차 반응성 프로파일을 도시한다. VNAR D1-C4는 인간, 개 및 사이노몰거스 (cynomolgus) TNFα에만 결합하고; 인간, 개 및 사이노몰거스 TNFα에 대한 결합을 포함하는 VHH TNF30은 돼지 TNFα 및 또한 인간 ΤNFβ에 약하게 결합한다. Humira는 인간, 개, 사이노몰거스 및 마우스 TNFα에 결합한다. 이들 항-TNFα 도메인의 결합 및 중화 프로파일의 상세사항에 대해서는 표 3a 및 표 3b를 또한 참조한다.
도 26 항-hTNF-알파 VNAR 이종2량체 대 VHH TNF30 2량체의 BIAcore™ T200 에피토프 구간 분할 분석.
이 에피토프 구간 분할 데이터는 VNAR D1-C4가 VHH TNF30 도메인에 의해 인식되는 에피토프와 별개의 hTNFα 분자 상의 에피토프를 인식하고, 상호작용한다는 것을 나타낸다. 이 분석은 제1 결합 도메인 (이 경우, KD 값의 100배로 측정된 포화 농도를 사용한 VNAR D1-C4) 후 제2 결합 도메인 (TNF30)에 의해 이용 가능한 에피토프 포화의 도달을 포함한다.
도 27 ELISA 형식의 Quad-X™ 및 Quad-Y™ 작제물에 의한 hTNF-알파에 대한 기능성 결합.
도 28 L929에서 다가/다중 특이적 VNAR-Fc 작제물의 hTNF-알파 중화 활성 평가
hTNFα 매개 세포독성의 L929 세포 기반 분석에서 VNAR Quad-X™ D1-Fc-C4, Quad-Y™ D1-C4-Fc 및 C4-D1-Fc 대 Humira (아달리무맙)의 중화 효능 평가. VNAR Quad-Y™ 작제물은 0.3 ng/ml 또는 3 ng/ml hTNF-알파의 존재 하에 Quad-X™와 유사한 중화 활성을 나타내는 D1-C4-Fc 작제물에 의한 중화 능력을 유지하였다 (ND50 값에 대해서 표 2 참조).
도 29 실험 Tg197 마우스의 체중 증가에 대한 D1-Fc-C4 (Quad-X™) 및 Humira®의 효과. 연구 종료 (10주령)시, 3주째부터 주 2회 처리된 모든 그룹의 평균 체중은 다음과 같았다: G1-비히클=19.3+1.4 g, G4-Humira® 10 mg/kg=24.4±1.5 g, G2-D1-Fc-C4 3 mg/kg=24.1±1.5 g, G5-D1-Fc-C4 10 mg/kg=24.1±1.7 g 및 G3-D1-Fc-D4 30 mg/kg=23.4±1.4 g. 3주째 대조군 마우스는 9.8±0.2 g의 평균 체중을 나타내었다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 30 실험 Tg197 마우스의 생체내 관절염 점수에 대한 D1-Fc-C4 (Quad-X™) 및 Humira®의 효과. 연구 종료 (10주령)시, 3주째에 주 2회 처리된 모든 그룹의 평균 생체내 질병 중증도 점수는 다음과 같았다: G1-비히클=1.36±0.07, G4-Humira® 10 mg/kg=0.25±0.05, G2-D1-Fc-C4 3 mg/kg=0.17±0.04, G5-D1-Fc-C4 10 mg/kg=0.17±0.04 및 G3-D1-Fc-D4 30 mg/kg=0.17±0.04. 3주째에 대조군 마우스는 생체내 관절염 점수=0.13±0.05를 나타내었다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 31 실험 Tg197 마우스의 관절염 조직병리 점수에 대한 D1-Fc-C4 (Quad-X™) 및 Humira®의 효과. 연구 종료 (10주령)시, 3주째에 주 2회 처리된 모든 그룹의 평균 관절염 조직병리 점수는 다음과 같았다: G1-비히클=2.94±0.12, G4-Humira® 10 mg/kg=0.42±0.07, G2-D1-Fc-C4 3 mg/kg=0.41±0.03, G5-D1-Fc-C4 10 mg/kg=0.50±0.05 및 G3-D1-Fc-D4 30 mg/kg=0.42±0.07. 3주째에 대조군 마우스는 조직병리 점수=1.22±0.10을 나타내었다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 32 실험 Tg197 마우스의 생체내 관절염 점수 대 발목 조직병리 점수에 대한 D1-Fc-C4 (Quad-X™) 및 Humira®의 효과의 비교. 연구 종료 (10주령)시, 3주째부터 주 2회 처리된 모든 그룹의 평균 질병 중증도 점수는 다음과 같았다: G1-비히클=2.94±0.12 (HS) 및 1.36±0.07 (AS), G4-Humira® 10 mg/kg=0.42±0.07 (HS) 및 0.25±0.05 (AS), G2-D1-Fc-C4 3 mg/kg=0.41±0.03 (HS) 및 0.17±0.04 (AS), G5-D1-Fc-C4 10 mg/kg=0.50±0.05 (HS) 및 0.17±0.04 (AS) 및 G3-D1-Fc-D4 30 mg/kg=0.42±0.07 (HS) 및 0.17±0.04 (AS). 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 33 관절염의 Tg197 모델에서 관절염 병리 향상에서의 0.5, 1 및 3 mg/kg의 D1-Fc-C4 (Quad-X™) 및 30 mg/kg의 D1-BA11-C4 대 1 mg/kg 및 3 mg/kg의 Humira®의 효능 평가.
도 34 관절염의 Tg197 모델의 평균 그룹 중량에 대한 0.5, 1 및 3 mg/kg의 D1-Fc-C4 (Quad-X™) 및 30 mg/kg의 D1-BA11-C4 대 1 mg/kg 및 3 mg/kg의 Humira®의 효과.
도 35 생체내 관절염 및 조직학 점수에 대한 상이한 Humira® 투여 요법의 효과. 이는 별도의 실험으로 수행되었지만, 도 29 내지 도 32에 대해 기재된 것과 동일한 방법을 사용하였다.
도 36 12마리의 랫트를 광수용체간 망막 결합 단백질 (Interphotoreceptor Retinal Binding Protein) (IRBP)로 면역화하여 실험적 자가 면역 포도막염 (EAU)을 유도하였다. 4마리의 동물을 각각 8일, 10일 및 12일째에 20 mg/kg의 (설치류 단백질 특이적) 항 TNFα VNAR-Fc의 복강내 주사를 통해 처리하였고; 4마리의 동물을 같은 날에 덱사메타손을 복강내 처리하고, 4마리의 동물을 동일하게 비히클로 처리하였다. 랫트 안구의 전부 및 후부 절편 둘 모두의 광간섭단층촬영 (OCT)을 0, 7, 10, 12, 13 및 14일째에 수행하였다. 결과의 임의의 과학적 편중을 최소화하기 위해, 검증된 점수 책정 시스템을 사용하여 총 염증에 대해 "실험적으로 블라인드 처리된 관찰자"에 의해 OCT 이미지의 점수를 책정하였다. 실험은 또한 비히클 대조군 및 표준 투여량의 덱사메타존 스테로이드를 사용한 양성 대조군을 포함하였다.
도 37a 및 도 37b L929 세포에서 soloMER VNAR 2량체 작제물의 hTNF-알파 중화 활성을 평가
도 38 L929 세포에서 S17-Fc 대 S17-Fc-S17 (Quad-X™) 작제물의 hTNF-알파 중화 활성 평가. S17 작제물에 사용된 Fc는 마우스 IgG2a로부터 유래한 것이다.
도 39a, 도 39b 및 도 39c: 인간 및 마우스 TNF-알파에 대한 S17-Quad-X™ 및 D1-C4 Quad-X™의 교차-반응성 결합 프로파일
다양한 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열이 본 명세서에 다음과 같이 제공된다:
서열번호 1
TNF VNAR D1 CDR3 아미노산 서열

서열번호 2
TNF VNAR D1 아미노산 서열 (CDR1 및 CDR3 1줄 밑줄 부분임)

서열번호 3
HIS 및 MYC 태그를 갖는 TNF VNAR D1 아미노산 서열 (2줄 밑줄 부분임) (CDR1 및 CDR3 1줄 밑줄 부분임)

서열번호 4
TNF VNAR D1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열

서열번호 5
HIS 및 MYC 태그를 갖는 TNF VNAR D1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열

서열번호 6
TNF VNAR C4 CDR3 아미노산 서열

서열번호 7
TNF VNAR C4 아미노산 서열 (CDR1 및 CDR3 밑줄 부분임)

서열번호 8
HIS 및 MYC 태그를 갖는 TNF VNAR C4 아미노산 서열 (2줄 밑줄 부분임) (CDR1 및 CDR3 1줄 밑줄 부분임)

서열번호 9
TNF VNAR C4를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열

서열번호 10
HIS 및 MYC 태그를 갖는 TNF VNAR D1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열

서열번호 11
TNF VNAR B4 CDR3 아미노산 서열

서열번호 12
TNF VNAR B4 아미노산 서열 (CDR1 및 CDR3 1줄 밑줄 부분임)

서열번호 13
HIS 및 MYC 태그를 갖는 TNF VNAR B4 아미노산 서열 (2줄 밑줄 부분임) (CDR1 및 CDR3 1줄 밑줄 부분임)

서열번호 14
TNF VNAR B4를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열

서열번호 15

서열번호 16

서열번호 17

서열번호 18

서열번호 19

서열번호 20
HIS 및 MYC 태그를 갖는 TNF VNAR B4를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열

서열번호 21
HIS 및 MYC 태그를 갖는 TNF VNAR 2량체 D1-D1 아미노산 서열 (2줄 밑줄 부분임) (CDR1 및 CDR3 1줄 밑줄 부분, 링커는 이텔릭체 표기됨)

서열번호 22
HIS 및 MYC 태그를 갖는 TNF VNAR 2량체 D1-D1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열

서열번호 23
HIS 및 MYC 태그를 갖는 TNF VNAR 2량체 C4-C4 아미노산 서열 (2줄 밑줄 부분임) (CDR1 및 CDR3 1줄 밑줄 부분, 링커는 이텔릭체 표기됨)

서열번호 24
HIS 및 MYC 태그를 갖는 TNF VNAR 2량체 C4-C4를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열

서열번호 25
HIS 및 MYC 태그를 갖는 TNF VNAR 2량체 B4-B4 아미노산 서열 (2줄 밑줄 부분임) (CDR1 및 CDR3 1줄 밑줄 부분, 링커는 이텔릭체 표기됨)

서열번호 26
HIS 및 MYC 태그를 갖는 TNF VNAR 2량체 B4-B4를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열

서열번호 27
HIS 및 MYC 태그를 갖는 TNF VNAR 2량체 D1-C4 아미노산 서열 (2줄 밑줄 부분임) (CDR1 및 CDR3 1줄 밑줄 부분, 링커는 이텔릭체 표기됨)

서열번호 28
HIS 및 MYC 태그를 갖는 TNF VNAR 2량체 D1-C4를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열

서열번호 29
HIS 및 MYC 태그를 갖는 TNF VNAR 2량체 D1-B4 아미노산 서열 (2줄 밑줄 부분임) (CDR1 및 CDR3 1줄 밑줄 부분, 링커는 이텔릭체 표기됨)

서열번호 30
TNF VNAR 2량체 D1-B4 뉴클레오타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열
HIS 및 MYC 태그를 갖는 서열

서열번호 31
TNF VNAR 2량체 B4-D1 아미노산 서열 (His 및 Myc 태그 - 2줄 밑줄 부분, CDR1 및 CDR3 1줄 밑줄 부분, 링커는 이텔릭체 표기됨)

서열번호 32
TNF VNAR 2량체 B4-D1 뉴클레오타이드 서열

서열번호 33
TNF VNAR 2량체 C4-B4 아미노산 서열 (His 및 Myc 태그 - 2줄 밑줄 부분, CDR1 및 CDR3 1줄 밑줄 부분, 링커는 이텔릭체 표기됨)

서열번호 34
TNF VNAR 2량체 C4-B4 뉴클레오타이드 서열

서열번호 35
TNF VNAR 2량체 B4-C4 아미노산 서열 (His 및 Myc 태그 - 2줄 밑줄 부분, CDR1 및 CDR3 1줄 밑줄 부분, 링커는 이텔릭체 표기됨)

서열번호 36
TNF VNAR 2량체 B4-C4 뉴클레오타이드 서열

서열번호 37
HIS 및 MYC 태그를 갖는 TNF VNAR D1-BA11-C4 아미노산 서열 (His 및 Myc 태그 -2줄 밑줄 부분, CDR1 및 CDR3 1줄 밑줄 부분, 링커는 이텔릭체 표기됨)

서열번호 38
HIS 및 MYC 태그를 갖는 TNF VNAR D1-BA11-C4를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열

서열번호 39
HIS 및 MYC 태그를 갖는 TNF VNAR D1-BA11-D1 아미노산 서열 (His 및 Myc 태그 -2줄 밑줄 부분, CDR1 및 CDR3 1줄 밑줄 부분, 링커는 이텔릭체 표기됨)

서열번호 40
HIS 및 MYC 태그를 갖는 TNF VNAR D1-BA11-D1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열

서열번호 41
HIS 및 MYC 태그를 갖는 TNF VNAR D1-BA11-B4 아미노산 서열 (His 및 Myc 태그 -2줄 밑줄 부분, CDR1 및 CDR3 1줄 밑줄 부분, 링커는 이텔릭체 표기됨)

서열번호 42
HIS 및 MYC 태그를 갖는 TNF VNAR D1-BA11-B4를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열

서열번호 43
ICOS VNAR 2D4-Fc-2D4 아미노산 서열 (링커는 이텔릭체 표기되고, Fc 부분은 밑줄 부분임)

서열번호 44
ICOS VNAR 2D4-FC-2D4 뉴클레오타이드 서열

서열번호 45
ICOS VNAR 2D4-Fc-CC3 아미노산 서열 (링커는 이텔릭체 표기되고, Fc 부분은 밑줄 부분임)

서열번호 46
ICOS VNAR 2D4-FC-CC3 뉴클레오타이드 서열

서열번호 47
ICOS VNAR CC3-Fc-2D4 아미노산 서열 (링커는 이텔릭체 표기되고, Fc 부분은 밑줄 부분임)

서열번호 48
ICOS VNAR CC3-FC-2D4 뉴클레오타이드 서열

서열번호 49
ICOS VNAR CC3-Fc-CC3 아미노산 서열 (링커는 이텔릭체 표기되고, Fc 부분은 밑줄 부분임)

서열번호 50
ICOS VNAR CC3-FC-CC3 뉴클레오타이드 서열

서열번호 51
HIS 태그를 갖는 SoloMER™ VNAR D1-v1 아미노산 서열

서열번호 52
HIS 태그를 갖는 SoloMER™ VNAR D1-v1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열

서열번호 53
HIS 태그를 갖는 SoloMER™ VNAR D1-v2 아미노산 서열

서열번호 54
HIS 태그를 갖는 SoloMER™ VNAR D1-v2를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열

서열번호 55
HIS 태그를 갖는 SoloMER™ VNAR D1-v3 아미노산 서열

서열번호 56
HIS 태그를 갖는 SoloMER™ VNAR D1-v3을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열

서열번호 57
HIS 태그를 갖는 SoloMER™ VNAR D1-v4 아미노산 서열

서열번호 58
HIS 태그를 갖는 SoloMER™ VNAR D1-v4를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열

서열번호 59
Quad-X™ D1-Fc-C4 아미노산 서열 (Fc 부분은 밑줄 부분임)

서열번호 60
Quad-X™ D1-Fc-C4를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열

서열번호 61
Quad-Y-D1 C4™ D1-C4-Fc 아미노산 서열 (Fc 부분은 밑줄 부분임)

서열번호 62
Quad-Y-D1 C4™ 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열

서열번호 63
Quad-Y-C4D1™ C4-D1-Fc 아미노산 서열 (Fc 부분은 밑줄 부분임)

서열번호 64
Quad-Y-C4D1™ 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열

서열번호 65 - 2D4

서열번호 66 - CC3

서열번호 67 - BA11

서열번호 68 - CDR1

서열번호 69 - CDR1

서열번호 70 - CDR1

서열번호 71 - HV2

서열번호 72 - HV4

서열번호 73 - HV4

서열번호 74 - NARF4For1

서열번호 75 - NARF4For2

서열번호 76 - NARFI Rev

서열번호 77 - E06

서열번호 78 - hE06v1.10

서열번호 79 - AC9

서열번호 80 - AD4

서열번호 81 - AG11

서열번호 82 - AH7

서열번호 83 - BB10

서열번호 84 - BB11

서열번호 85 - BC3

서열번호 86 - BD12

서열번호 87 - BE4

서열번호 88 - BH4

서열번호 89 - HIS 태그를 갖는 (Gly 4 Ser) 3 아미노산 서열을 갖는 TNF VNAR 2량체 D1-C4 (링커는 이텔릭체 표기되고, 태그는 2줄 밑줄 부분임)

서열번호 90 - HIS 태그를 갖는 (Gly 4 Ser) 3 뉴클레오타이드 서열을 갖는 TNF VNAR 2량체 D1-C4

서열번호 91 - HIS 태그를 갖는 (Gly 4 Ser) 3 아미노산 서열을 갖는 TNF soloMER™ 2량체 D1 v2-C4v1 (링커는 이텔릭체 표기되고, 태그는 2줄 밑줄 부분임)

서열번호 92 - HIS 태그를 갖는 (Gly 4 Ser) 3 뉴클레오타이드 서열을 갖는 TNF soloMER™ 2량체 D1 v2-C4v1

서열번호 93 - HIS 태그를 갖는 (Gly 4 Ser) 5 아미노산 서열을 갖는 TNF soloMER™ 2량체 D1 v2-C4v1 (링커는 이텔릭체 표기되고, 태그는 2줄 밑줄 부분임)

서열번호 94 - HIS 태그를 갖는 (Gly 4 Ser) 5 뉴클레오타이드 서열을 갖는 TNF soloMER™ 2량체 D1 v2-C4v1

서열번호 95 - (Gly 4 Ser) 5 아미노산 서열을 갖는 TNF S17-Quad-X™ (Fc 부분은 밑줄 부분임)

서열번호 96 - (Gly 4 Ser) 5 뉴클레오타이드 서열을 갖는 TNF S17-Quad-X™
정의
아미노산은 본 명세서에서 단일 문자 코드 또는 3문자 코드 또는 둘 모두로서 표시된다.
용어 "친화도 정제"는 조합 또는 복합체를 형성하기 위한 화학적 또는 결합 대상에 대한 분자의 특이적 유도 또는 결합을 기반으로 한 분자의 정제를 의미하며, 이에 의해, 대상 모이어티에 결합되거나, 유도된 상태에서, 불순물로부터 분자를 분리시킬 수 있다.
용어 "상보성 결정 영역" 또는 CDR (즉, CDR1 및 CDR3)은 그 존재가 항원 결합에 필요한 VNAR 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각각의 VNAR은 통상적으로 CDR1 및 CDR3으로 확인되는 CDR 영역을 갖는다. 각각의 상보성 결정 영역은 "상보성 결정 영역"으로부터의 아미노산 잔기 및/또는 "초가변 루프" (HV)로부터의 잔기를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상보성 결정 영역은 CDR 영역 및 초가변 루프 둘 모두로부터의 아미노산을 포함할 수 있다. VNAR 분자에 대해 일반적으로 인정되는 명명법에 따르면, CDR2 영역은 존재하지 않는다.
"프레임워크 영역" (FW)은 CDR 잔기 이외의 VNAR 잔기이다. 각 VNAR에는 일반적으로 FW1, FW2, FW3a, FW3b 및 FW4로 확인되는 5개의 프레임워크 영역이 있다. 따라서 VNAR 도메인은 통상적으로 N 말단으로부터 C 말단 방향으로 구조 FW1-CDR1-FW2-HV2-FW3a-HV4-FW3b-CDR3-FW4를 갖는다.
"세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 (문맥상 달리 나타내지 않는 한) 상호 혼용되며, 이러한 명칭은 세포 또는 세포주의 모든 자손을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"와 같은 용어는 1차 대상 세포 및 계대 수에 관계없이 이로부터 유래된 배양물을 포함한다. 의도되었거나, 의도되지 않은 돌연변이로 인해 모든 자손의 DNA 함량이 정확하게 동일하지 않을 수도 있다는 것이 또한 이해된다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 포함된다.
발현과 관련하여, "제어 서열"은 특정 숙주 유기체에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 의미한다. 원핵생물에 적합한 제어 서열은 예를 들어 프로모터, 선택적으로 오퍼레이터 서열, 리보솜 결합 부위 등을 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서와 같은 제어 서열을 사용한다.
용어 "외피 단백질"은 적어도 일부가 바이러스 입자의 표면에 존재하는 단백질을 의미한다. 기능성 관점에서, 외피 단백질은 숙주 세포에서 바이러스 조립 과정 동안 바이러스 입자와 결합하고, 다른 숙주 세포를 감염시킬 때까지 조립된 바이러스와 연관된 상태로 유지되는 임의의 단백질이다.
특정 분석에서 화학 물질에 대한 "검출 한계"는 해당 분석에 대한 배경 수준 이상으로 검출될 수 있는 해당 물질의 최소 농도이다. 예를 들어, 파지 ELISA에서, 특정 항원 결합 단편을 디스플레이하는 특정 파지에 대한 "검출 한계"는 특정 파지가 항원 결합 단편을 디스플레이지 않는 대조군 파지에 의해 생성된 것보다 높은 ELISA 신호를 생성하는 파지 농도이다.
"융합 단백질" 및 "융합 폴리펩타이드"는 서로 공유결합에 의해 연결된 2개의 부분이 존재하고, 각각의 부분이 상이한 특성을 갖는 폴리펩타이드인 폴리펩타이드를 지칭한다. 이 특성은 시험관내 또는 생체내 활성과 같은 생물학적 특성일 수 있다. 이 특성은 또한 표적 항원에의 결합, 반응의 촉매 작용 등과 같은 단순한 화학적 또는 물리적 특성일 수 있다. 두 부분은 단일 펩타이드 결합에 의해 직접 또는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드 링커를 통해 연결될 수 있다. 일반적으로, 두 부분 및 링커는 서로 판독 프레임 내에 존재할 것이다. 바람직하게는, 폴리펩타이드의 두 부분은 이종 또는 상이한 폴리펩타이드로부터 획득된다.
본 명세서에서 용어 "융합 단백질"은 일반적인 용어로 수소 결합 또는 염 가교를 포함하는 화학적 수단 또는 단백질 합성 또는 둘 모두를 통한 펩타이드 결합에 의해 함께 연결된 하나 이상의 단백질을 의미한다.
"이종 DNA"는 숙주 세포로 도입되는 임의의 DNA이다. DNA는 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 및 이들의 융합 또는 조합을 포함하는 다양한 공급원으로부터 유래될 수 있다. DNA는 숙주 또는 수용체 세포와 동일한 세포 또는 세포 유형으로부터의 DNA 또는 상이한 세포 유형, 예를 들어 동종이계 또는 이종 공급원으로부터의 DNA를 포함할 수 있다. DNA는 선택적으로 마커 또는 선택 유전자, 예를 들어 항생제 내성 유전자, 내열성 유전자 등을 포함할 수 있다.
"고도의 다양성 위치"는 공지되고/거나, 천연 발생 항체 또는 항원 결합 단편의 아미노산 서열을 비교할 때, 그 위치에 다수의 상이한 아미노산이 배치된 경쇄 및 중쇄의 가변 영역에 위치한 아미노산의 위치를 지칭한다. 고도의 다양성 위치는 일반적으로 CDR 영역 내에 존재한다.
"동일성"은 서열을 비교함으로써 결정된 바와 같이 2개 이상의 폴리펩타이드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 사이의 관계를 기재한다. 동일성은 또한 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 사이의 서열 관련성 (상동성)의 정도를 의미하며, 경우에 따라 이러한 서열의 가닥 사이의 매칭에 의해 결정되는 바와 같을 수 있다. 2개의 폴리펩타이드 또는 2개의 폴리뉴클레오타이드 서열 사이의 동일성을 측정하기 위한 다수의 방법이 존재하지만, 동일성을 결정하기 위해 일반적으로 사용되는 방법은 컴퓨터 프로그램에서 코드화된다. 두 서열 사이의 동일성을 결정하기 위한 적절한 컴퓨터 프로그램은 다음에 제한되는 것은 아니나, GCG 프로그램 패키지 (문헌[Devereux, et al., Nucleic Acids Res, 1984, 12, 387]) BLASTP, BLASTN 및 FASTA (문헌[Atschul et al., J. Molec. Biol. (1990) 215, 403])를 포함한다.
바람직하게는, 단백질의 아미노산 서열은 아미노산 수준에서 본 명세서에 개시된 아미노산 서열에 대해, HGMP (Human Genome Mapping Project)에 의해 제공되는 BLAST 컴퓨터 프로그램 (문헌[Atschul et al., J. Mol. Biol. 1990 215, 403-410])의 디폴트 파라미터 (default parameter)를 사용하여 적어도 60% 동일성을 갖는다.
더욱 바람직하게는, 단백질 서열은 핵산 또는 아미노산 수준에서 본 명세서에 제시된 바와 같은 아미노산 서열에 대해 적어도 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 및 훨씬 더욱 바람직하게는 95% (훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일성을 가질 수 있다.
단백질은 또한 HGMP에 의해 제공되는 BLAST 컴퓨터 프로그램의 디폴트 파라미터를 사용하여, 본 명세서에 개시된 서열과 적어도 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
"라이브러리"는 복수의 VNAR 또는 VNAR 단편 서열 또는 이들 서열을 인코딩하는 핵산을 지칭한다. 라이브러리의 유래는 특성상 다양성이 천연 또는 천연 프레임워크의 조합으로 조작된 비 천연 공급원으로부터의 것이거나, 합성된 것일 수 있거나, 면역화된 동물로부터 추출된 RNA로부터 단리된 VNAR 도메인으로부터 예시된 바와 같은 천연 공급원으로부터의 것일 수 있다.
"결찰"은 2개의 핵산 단편 사이에 포스포디에스테르 결합을 형성하는 과정이다. 두 단편의 결찰을 위해서는 단편의 말단이 서로 적용 가능해야 한다. 일부 경우에는, 엔도뉴클레아제 분해 후 말단이 직접적으로 적용 가능해질 수 있다. 그러나, 우선, 엔도뉴클레아제 분해 후 일반적으로 생성되는 엇물림 말단을 평활 말단으로 전환시켜, 이를 결찰에 적용 가능하게 하는 것이 필요할 수 있다. 평활 말단이 되도록 하기 위해, DNA를 4개의 데옥시리보뉴클레오타이드 트리포스페이트의 존재 하에 DNA 중합효소 I 또는 T4 DNA 중합효소의 Klenow 단편의 약 10 단위에 의해 15℃에서 적어도 15분 동안 적합한 완충액에서 처리한다. 이어서 DNA를 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전 또는 실리카 정제에 의해 정제한다. 함께 결찰될 DNA 단편은 약 등 몰량으로 용액 중에 존재한다. 용액은 또한 ATP, 리가제 완충액, 및 리가제, 예컨대 T4 DNA 리가제를 0.5 ＼ig의 DNA당 약 10 단위로 포함할 것이다. DNA가 벡터에 결찰되는 경우, 벡터를 먼저 적절한 제한 엔도뉴클레아제(들)로 분해하여 선형화시킨다. 이어서 선형화된 단편을 박테리아 알칼리성 포스파타제 또는 송아지 장 포스파타제로 처리하여, 결찰 단계 동안 자가 결찰을 방지한다.
"돌연변이"는 야생형 서열과 같은 기준 뉴클레오타이드 서열과 비교하여 뉴클레오타이드(들)의 결실, 삽입 또는 치환이 존재한다.
"천연" 또는 "천연 발생" VNAR은 비 합성 공급원, 예를 들어 생체 외에서 획득된 조직 공급원 또는 판새아강의 동물의 혈청으로부터 확인된 VNAR을 지칭한다. 이들 VNAR은 천연 또는 다른 방식으로 유도된 임의의 유형의 면역 반응에서 생성된 VNAR을 포함할 수 있다. 천연 VNAR은 아미노산 서열, 및 이들 항체를 구성하거나, 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 천연 VNAR은 "합성 VNAR"과 상이하며, 합성 VNAR은 예를 들어, 상이한 아미노산이 공급원 항체 서열과 상이한 항체 서열을 제공하는 상이한 아미노산을 갖는 특정 위치에서 하나의 아미노산 또는 하나 초과의 아미노산의 대체, 결실, 또는 첨가에 의해 공급원 또는 주형 서열로부터 변화된 VNAR 서열을 지칭한다.
용어 "핵산 작제물"은 일반적으로 클로닝에 의해 획득되거나, 화학적 합성에 의해 생성된 DNA, cDNA 또는 RNA 예컨대 mRNA일 수 있는 임의의 길이의 핵산을 지칭한다. DNA는 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 단일 가닥 DNA는 코딩 센스 가닥일 수 있거나, 비 코딩 또는 안티센스 가닥일 수 있다. 치료적 사용을 위해, 핵산 작제물은 바람직하게는 치료될 대상체에서 발현될 수 있는 형태이다.
핵산을 지칭할 때 "작동 가능하게 연결된"은 핵산이 다른 핵산 서열과 기능적으로 관련되도록 배치된 것을 의미한다. 예를 들어, 전서열 또는 분비 선행서열의 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 관여하는 전단백질로서 발현되는 경우, 폴리펩타이드의 DNA에 작동 가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우, 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되거나; 리보솜 결합 부위는 번역을 용이하게 하는 위치인 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되어 있다. 일반적으로, "작동 가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 인접하고, 분비 선행서열의 경우 불확정적이며, 판독 프레임 내에 존재함을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접해야 하는 것은 아니다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 결찰에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상적인 실시 방법에 따라 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 사용한다.
"파지 디스플레이"는 변이 폴리펩타이드가 파지, 예를 들어 사상 파지 입자의 표면상의 외피 단백질의 적어도 일부에 대한 융합 단백질로서 디스플레이되는 기술이다. 파지 디스플레이 기술은 높은 친화도로 표적 항원에 결합하는 서열에 대해 신속하고, 효율적으로 분류될 수 있는 무작위 단백질 변이체의 대형 라이브러리의 제조를 가능하게 한다. 파지 상의 펩타이드 및 단백질 라이브러리의 디스플레이는 수백만 개의 폴리펩타이드를 특이적 결합 특성을 갖는 것에 대해 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 다가 파지 디스플레이 방법은 사상 파지의 외피 단백질 pill, pV III, pVI, pVII 또는 pIX를 인코딩하는 유전자에의 융합을 통해 소형 무작위 펩타이드 및 소형 단백질을 디스플레이하기 위해 사용되어 왔다.
"파지미드"는 박테리아 복제 기점, 예를 들어 ColEI 및 박테리오파지의 유전자 간 영역의 카피를 갖는 플라스미드 벡터이다. 파지미드는 사상 박테리오파지 및 람도이드 박테리오파지 (lambdoid bacteriophage)를 포함하는 임의의 공지된 박테리오파지에 사용될 수 있다. 플라스미드는 또한 일반적으로 항생제 내성에 대한 선택 가능한 마커를 포함할 것이다. 이들 벡터에 클로닝된 DNA의 절편은 플라스미드로서 증식될 수 있다. 이들 벡터를 유지하는 세포에 파지 입자의 생성에 필요한 모든 유전자가 제공될 때, 플라스미드의 복제 방식은 회전환 복제 (rolling circle replication)로 변화되어, 플라스미드 DNA의 하나의 가닥 및 패키지 파지 입자의 카피를 생성한다. 파지미드는 감염성 또는 비 감염성 파지 입자를 형성할 수 있다. 이 용어는 이종성 폴리펩타이드가 파지 입자의 표면 상에 디스플레이되도록 유전자 융합으로서 이종성 폴리펩타이드 유전자에 연결된 파지 외피 단백질 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 파지미드를 포함한다. 파지미드 디스플레이 벡터의 예는 pWRIL-1이다.
용어 "파지 벡터"는 이종성 유전자를 포함하고, 복제가 가능한 박테리오파지의 이중 가닥 복제 형태를 의미한다. 파지 벡터는 파지 복제 및 파지 입자 형성을 가능하게 하는 파지 복제 기점을 갖는다. 파지는 바람직하게는 사상 박테리오파지, 예컨대 M13, fl, fd, Pf3 파지 또는 이들의 유도체, 또는 람다 파지, 예컨대 람다, 21, phi80, phi81 또는 이들의 유도체이다.
용어 "단백질"은 일반적인 용어로 펩타이드 결합에 의해 함께 연결된 복수의 아미노산 잔기를 의미한다. 이는 상호 혼용되며, 펩타이드, 올리고펩타이드, 올리고머 또는 폴리펩타이드와 동일함을 의미하며, 당단백질 및 그의 유도체를 포함한다. 용어 "단백질"은 또한 단백질의 단편, 유사체, 변이체 및 유도체를 포함하는 것으로 의도되며, 상기 단편, 유사체, 변이체 또는 유도체는 기준 단백질과 필수적으로 동일한 생물학적 활성 또는 기능을 유지한다. 단백질 유사체 및 유도체의 예는 펩타이드 핵산 및 DARPin (Designed Ankyrin Repeat Protein)를 포함한다. "본 발명의 폴리펩타이드"는 본 명세서에 규정된 바와 같은 TNFα 특이적 항원 결합 분자이다.
단백질의 단편, 유사체, 변이체 또는 유도체는 이들이 유래된 원래의 단백질 서열의 길이에 따라 적어도 25 바람직하게는 30 또는 40, 또는 최대 50 또는 100, 또는 60 내지 120개의 아미노산 길이일 수 있다. 일부 경우에는 90 내지 120, 100 내지 110개의 아미노산 길이가 간편할 수 있다.
단백질의 단편, 유도체, 변이체 또는 유사체는 (i) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존 또는 비 보존 아미노산 잔기 (바람직하게는, 보존 아미노산 잔기)로 치환되고, 이러한 치환된 아미노산 잔기가 유전자 코드에 의해 코딩된 것이거나, 아닐 수 있는 것, 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환기를 포함하는 것, 또는 (iii) 추가 아미노산이 폴리펩타이드의 정제에 사용되는 선행서열 또는 보조 서열과 같은 성숙한 폴리펩타이드에 융합된 것일 수 있다. 이러한 단편, 유도체, 변이체 및 유사체는 본 명세서의 교시로부터 당업자의 범위 내에 있는 것으로 고려된다.
"올리고뉴클레오타이드"는 공지된 방법 (예를 들어, 고체상 기술을 사용한 포스포트리에스테르, 포스파이트 또는 포스포르아미다이트 화학)에 의해 화학적으로 합성되는 짧은 길이의 단일 또는 이중 가닥 폴리데옥시뉴클레오타이드이다. 추가 방법은 유전자의 전체 핵산 서열이 제시된 경우 또는 코딩 가닥에 상보적인 핵산의 서열이 이용 가능한 경우에 사용되는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 포함한다. 대안적으로, 표적 아미노산 서열이 제시된 경우, 각각의 아미노산 잔기의 제시된 적절한 코딩 잔기를 사용하여 가능한 핵산 서열을 유추할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 폴리아크릴아미드 겔 또는 분자 사이징 컬럼 (molecular sizing column) 상에서 또는 침전에 의해 정제될 수 있다. DNA가 비 핵산 불순물 (극성, 비극성, 이온 등일 수 있음)로부터 분리되었을 때, DNA는 "정제된" 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "공급원" 또는 "주형" VNAR"은 항원 결합 서열이 본 명세서에 기재된 기준에 따른 다량화가 수행되는 주형 서열로서 작용하는 VNAR 또는 VNAR 항원 결합 단편을 지칭한다. 항원 결합 서열은 일반적으로 VNAR 내에 바람직하게는 프레임워크 영역을 포함하는 하나 이상의 CDR을 포함한다.
"전사 조절 요소"는 다음 성분 중 하나 이상을 포함할 것이다: 인핸서 요소, 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리프레서 유전자 및 전사 종결 서열.
"형질전환"은 세포가 DNA를 흡수하여 "형질전환체"가 되는 과정을 의미한다. DNA 흡수는 영구적이거나, 일시적일 수 있다. "형질전환체"는 DNA와 관련된 표현형 (예를 들어, DNA에 의해 인코딩된 단백질에 의해 부여된 항생제 내성)의 발현에 의해 나타나는 바와 같이 DNA를 흡수하여 유지시킨 세포이다.
융합 단백질 (폴리펩타이드) 또는 이종성 폴리펩타이드 (파지에 대해 이종성)와 같은 출발 또는 기준 폴리펩타이드 (예를 들어, 공급원 VNAR 또는 그의 CDR)의 "변이체" 또는 "돌연변이체"는 (1) 출발 또는 기준 폴리펩타이드와 상이한 아미노산 서열을 가지며, (2) 천연 또는 인위적 돌연변이 유발을 통해 출발 또는 기준 폴리펩타이드로부터 유래된 폴리펩타이드이다. 이러한 변이체는 예를 들어 대상 폴리펩타이드의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 예를 들어, (공급원 VNAR 또는 항원 결합 단편에서 해당 위치에 존재하는 아미노산에 대해) 변이체 아미노산을 갖는 서열을 인코딩하는 비 무작위 코돈 세트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 생성된 본 발명의 융합 폴리펩타이드는 공급원 VNAR 또는 항원 결합 단편에 대해 변이 폴리펩타이드일 것이다. 따라서, 변이체 CDR은 출발 또는 기준 폴리펩타이드 서열 (예를 들어, 공급원 VNAR 또는 항원 결합 단편의 서열)에 대해 변이체 서열을 포함하는 CDR을 지칭한다. 이와 관련하여, 변이체 아미노산은 출발 또는 기준 폴리펩타이드 서열 (예를 들어, 공급원 VNAR 또는 항원 결합 단편의 서열)의 해당 위치의 아미노산과 상이한 아미노산을 지칭한다. 최종 작제물이 적절한 기능성 특성을 갖는 경우, 최종 변이체 또는 돌연변이체 작제물에 도달하도록 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있다. 아미노산 변화는 또한 글리코실화 부위의 수 또는 위치의 변화와 같이 폴리펩타이드의 번역 후 과정을 변이시킬 수 있다.
"야생형" 또는 "기준" 서열 또는 "야생형" 또는 "기준" 단백질/폴리펩타이드, 예를 들어 외피 단백질, 또는 공급원 VNAR의 CDR의 서열이 돌연변이의 도입을 통해 변이 폴리펩타이드가 유래되는 기준 서열일 수 있다. 일반적으로, 소정의 단백질에 대한 "야생형" 서열은 특성상 가장 일반적인 서열이다.
유사하게, "야생형" 유전자 서열은 자연에 가장 흔히 존재하는 유전자에 대한 서열이다. 돌연변이는 자연적 과정 또는 인간 유도 수단을 통해 "야생형" 유전자 (및 따라서 이를 인코딩하는 단백질)에 도입될 수 있다. 이러한 과정의 산물은 원래의 "야생형" 단백질 또는 유전자의 "변이체" 또는 "돌연변이체" 형태이다.
DNA 조작, 형질감염 방법 및 배양 방법에 대한 일반적인 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이와 관련하여 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition) Cold Spring Harbor Publishing]을 참조한다.
VNAR의 단리
VNAR 도메인은 표적 면역화된 상어로부터의 조직을 사용하여 작제된 파지 디스플레이 라이브러리로부터 획득될 수 있으며, 참조로 포함되는 문헌[Dooley, H., et al. Mol Immunol, 2003. 40(1): p. 25-33; Nuttall, S.D., et al, Proteins, 2004. 55(1): p. 187-97; 및 Dooley, H., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2006. 103(6): p. 1846-51], WO2003/014161은 상어를 면역화하고, 결합 도메인을 획득하기에 유용한 방법을 기재하고, 있다.
VNAR 결합 도메인은 또한 VNAR 서열을 포함하는 합성 라이브러리로부터 획득될 수 있다. 참조로 포함되는 WO2014/173959는 VNAR 라이브러리를 생성하고, 결합 도메인을 획득하기에 유용한 방법을 기재하고 있다.
또한 CDR3을 표적화하는 합성 다양성을 갖는 라이브러리가 VNAR 구조를 기반으로 한 결합 도메인을 획득하는데 사용될 수 있음이 밝혀졌다 (문헌[Nuttall, S.D., et al. Mol Immunol, 2001. 38(4): p. 313-26; Nuttall, S.D., et al. Eur J Biochem, 2003. 270(17): p. 3543-54; Shao, C.Y., et al. Mol Immunol, 2007. 44(4): p. 656-65 및 Liu, J.L., et al. BMC Biotechnol, 2007. 7: p. 78]; WO2005/118629).
본 발명의 VNAR는 인간에 투여될 때 잠재적 면역원성을 감소시키도록 추가로 조정될 수 있다 (인간화).
항체 가변 도메인의 인간화는 인간 이외의 종에서, 치료적으로 유용한 표적에 대해 발생된 항체를 변형시켜, 인간화 형태가 인간 대상체에 투여되는 경우, 부적절한 면역 반응을 방지하기 위해, 당 업계에 널리 공지된 기술이다. 인간화와 관련된 방법은 문헌[Almagro J.C and William Strohl W. Antibody Engineering: Humanization, Affinity Maturation, and Selection Techniques in Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic. Edited by An J. 2009 John Wiley & Sons, Inc and in Strohl W.R. and Strohl L.M., Therapeutic Antibody Engineering, Woodhead Publishing 2012]에 요약되어 있다.
IgNAR이 면역글로불린과 비교하여 별개의 기원을 갖고, 면역글로불린 가변 도메인과 비교하여 서열 상동성이 매우 적지만, 면역글로불린과 IgNAR 가변 도메인 사이에 일부 구조적 유사성이 존재하여, 유사한 과정이 VNAR 도메인에 적용될 수 있다. 예를 들어, 참조로 포함된 WO2013/167883은 VNAR의 인간화에 대한 설명을 제공하며, 또한 문헌[Kovalenko O.V., et al. J Biol Chem. 2013. 288(24): p. 17408-19]을 참조한다.
단백질 발현
본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자 또는 다중 도메인 특이적 결합 분자를 인코딩하는 핵산 서열은 핵산 작제물에 존재할 수 있다. 이러한 핵산 작제물은 벡터, 예를 들어 발현 벡터의 형태일 수 있고, 특히 염색체, 에피솜 (episome) 및 바이러스-유래 벡터, 예를 들어 박테리아 플라스미드, 박테리오파지, 트랜스포손 (transposon), 효모 에피솜, 삽입 요소, 효모 염색체 요소, 바이러스, 예컨대 바큘로 바이러스 (baculo-virus), 파포바 바이러스 (papova-virus), 예컨대 SV40, 백시니아 바이러스 (vaccinia virus), 아데노바이러스 (adenovirus), 가두 바이러스(fowl pox viruse), 슈도라비 바이러스 (pseudorabies virus) 및 레트로바이러스 (retrovirus)로부터 유래된 벡터 및 이들의 조합으로부터 유래된 벡터, 예를 들어, 플라스미드 및 박테리오파지 유전자 요소, 예를 들어 코스미드 (cosmid) 및 파지미드 (phagemid)로부터 유래된 것들을 포함할 수 있다. 일반적으로, 숙주에서 폴리펩타이드를 발현시키기 위해 핵산을 유지, 증식 또는 발현시키기에 적합한 임의의 벡터가 이와 관련하여 발현에 사용될 수 있다.
핵산 작제물은 핵산의 발현을 제어하는 프로모터 또는 다른 조절 서열을 적절하게 포함할 수 있다. 핵산의 발현을 제어하는 프로모터 및 다른 조절 서열이 확인되었으며, 당 업계에 공지되어 있다. 당업자는 전체 프로모터 또는 다른 조절 서열을 사용할 필요가 없을 수 있음을 이해할 것이다. 단지 최소 필수 조절 요소만이 필요할 수 있으며, 실제로 이러한 요소는 키메라 서열 또는 다른 프로모터를 작제하는데 사용될 수 있다. 물론 필수 요건은 조직 및/또는 시간적 특이성을 유지하는 것이다. 프로모터는 임의의 적합한 공지 프로모터, 예를 들어, 인간 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus) (CMV) 프로모터, CMV 즉시 초기 프로모터, HSV 티미딘 키나제, 초기 및 후기 SV40 프로모터 또는 레트로바이러스 LTR의 프로모터, 예컨대 라우스 육종 바이러스 (Rous Sarcoma virus) (RSV)의 프로모터 및 마우스 메탈로티오닌-1 프로모터와 같은 메탈로티오닌 프로모터일 수 있다. 프로모터는 프로모터 활성을 위해 포함된 최소의 것 (예를 들어, 선택적으로 인핸서 요소의 부재 하의 TATA 요소), 예를 들어 CMV 프로모터의 최소 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 프로모터는 핵산 서열에 인접한다.
본 명세서에 언급된 바와 같이, 핵산 작제물은 벡터 형태일 수 있다. 벡터는 종종 그에 의해 형질감염 (또는 형질전환)된 세포의 선택을 가능하게 하고, 바람직하게는 이종 DNA를 혼입시키는 벡터를 포함하는 세포의 선택을 가능하게 하는 하나 이상의 발현 마커를 포함한다. 적절한 개시 및 정지 신호가 일반적으로 존재할 것이다.
벡터는 pET와 같은 임의의 적합한 발현 벡터일 수 있다. 벡터는 개시 및 종결 서열을 포함하여, 적절한 추가적인 제어 서열, 예를 들어 선택 가능한 마커 (예를 들어, 항생제 내성, 형광 등), 전사 제어 서열 및 프로모터를 포함할 수 있다.
프로모터는 본 발명의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 단백질의 발현을 유발하기 위한 임의의 적합한 프로모터, 예를 들어 CMV 프로모터, 인간 포스포글리세레이트 키나제 (hPGK) 프로모터일 수 있다.
이러한 벡터는 숙주 세포에 존재할 수 있다. 본 발명의 핵산 작제물의 발현에 적합한 숙주 세포의 대표적인 예는 바이러스 벡터로의 핵산의 포획화를 가능하게 하는 바이러스 패키징 세포; 박테리아 세포, 예컨대 스트렙토코시 (Streptococci), 스타필로코시 (Staphylococci), E. 콜라이 (E. coli), 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 및 바실루스 섭틸리스 (Bacillus subtilis); 단일 세포, 예컨대 효모 세포, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비시아에 (Saccharomyces cerevisiae), 및 아스퍼길루스 (Aspergillus) 세포; 곤충 세포 예컨대 드로소필라 (Drosophila) S2 및 스포돕테라 (Spodoptera) Sf9 세포, 동물 세포 예컨대 CHO, COS, C127, 3T3, PHK.293, 및 보웨스 멜라노마 (Bowes Melanoma) 세포 및 다른 적합한 인간 세포; 및 식물 세포, 예를 들어 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)를 포함한다. 적합하게는, 숙주 세포는 진핵 세포, 예컨대 CHO 세포 또는 HEK293 세포이다.
숙주 세포 내로의 발현 벡터의 도입은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형 형질감염, 미세주입, 양이온-지질 매개 형질감염, 전기천공, 형질도입, 스크랩 로딩 (scrape loading), 탄도성 도입 (ballistic introduction), 감염 또는 다른 방법에 의해 달성될 수 있다. 이러한 방법은 문헌[Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]와 같은 많은 표준 실험실 매뉴얼에 기재되어 있다.
성숙한 단백질은 적절한 프로모터의 제어 하에 포유류 세포, 예컨대 CHO 세포, 효모, 박테리아 또는 다른 세포를 포함하는 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 무 세포 번역 시스템은 본 발명의 제3 양상의 핵산 작제물로부터 유래된 RNA를 사용하여 이러한 단백질을 생성하는데 사용될 수 있다. 원핵생물 및 진핵생물 숙주와 함께 사용하기에 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 문헌[Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]에 의해 기재되었다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 본 발명의 임의의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자 또는 다중 도메인 특이적 결합 분자의 생성 방법으로서, 본 명세서에 규정된 바와 같은 적합한 숙주 세포에서 상기 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 발현시키는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
단백질은 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 렉틴 및/또는 헤파린 크로마토그래피를 포함하는 표준 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 치료를 위해, 예를 들어 재조합 벡터의 형태의 핵산 작제물은 예컨대, 문헌[Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]에 기재된 바와 같은 컬럼 크로마토그래피에 의해 당 업계에 공지된 기술에 의해 정제될 수 있다.
따라서, 본 발명의 이러한 양상은 숙주 세포에서의 발현에 의한 재조합적 융합 단백질의 생성, 펩타이드 결합 연결, 수소 또는 염 결합 또는 화학적 교차 연결에 의한 발현 융합 단백질의 정제를 포함하는 본 발명의 융합 단백질의 제조 과정으로 확장된다. 본 발명의 이러한 양상의 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 펩타이드가 가능한 수소 또는 염 결합 또는 다량체화, 예를 들어 2량체화 또는 3량체화를 사용하여 제조될 수 있다.
항원 특이적 항원 결합 분자 또는 다중 도메인 특이적 결합 분자는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 분자의 생성 과정 동안 정제 및/또는 단리를 보조할 수 있는 것으로, 사용 전에 절단된 추가의 N 말단 또는 C 말단 서열, 예를 들어, 분자의 C 말단의 (Ala)3(His)6을 포함할 수 있다.
본 발명에는 또한, 수 개, 예를 들어 5 내지 10, 또는 1 내지 5, 또는 1 내지 3, 2, 1 또는 0개의 아미노산 잔기가 임의의 조합으로 치환되거나, 결실되거나, 첨가된 단백질의 아미노산 서열을 갖는 변이체, 유사체, 유도체 및 단편이 포함된다. 이들 중 본 발명의 단백질의 특성 및 활성을 변이시키지 않는 침묵화 치환, 첨가 및 결실이 특히 바람직하다. 이와 관련하여 본 발명의 단백질의 특성이 원래 형태와 비교하여 변이체로 보존되는 보존적 치환이 특히 바람직하다. 변이체는 또한 본 발명에 따른 항원 특이적 항원 결합 분자를 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 변이체의 예는 하나 이상의 아미노산이 하나 이상의 다른 아미노산으로 치환된 단백질을 포함한다. 당업자는 다양한 아미노산이 유사한 특성을 갖는다는 것을 이해한다. 물질의 하나 이상의 이러한 아미노산은 종종 물질의 적절한 활성을 방해하거나, 제거하지 않으면서, 하나 이상의 다른 이러한 아미노산으로 치환될 수 있다. 이러한 치환은 "비 보존적" 아미노산 치환으로 지칭될 수 있다.
따라서, 아미노산 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신은 종종 서로 치환될 수 있다 (지방족 측쇄를 갖는 아미노산). 이들 가능한 치환 중에서, 글리신 및 알라닌이 서로간의 치환에 사용되며 (상대적으로 짧은 측쇄를 갖기 때문임), 발린, 류신 및 이소류신이 서로간의 치환에 사용되는 것 (이들은 소수성인 더 큰 지방족 측쇄를 가지기 때문임)이 바람직하다. 종종 서로 치환될 수 있는 다른 아미노산은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판 (방향족 측쇄를 갖는 아미노산); 리신, 아르기닌 및 히스티딘 (염기성 측쇄를 갖는 아미노산); 아스파테이트 및 글루타메이트 (산성 측쇄를 갖는 아미노산); 아스파라긴 및 글루타민 (아미드 측쇄를 갖는 아미노산); 및 시스테인 및 메티오닌 (황 포함 측쇄를 갖는 아미노산)을 포함한다. 이러한 성질의 치환은 종종 "보존적" 또는 "반-보존적" 아미노산 치환으로 지칭된다.
아미노산 결실 또는 삽입은 또한 상기 지칭된 융합 단백질에 대한 아미노산 서열과 관련하여 이루어질 수 있다. 따라서, 예를 들어, 폴리펩타이드의 활성에 실질적인 영향을 미치지 않거나, 적어도 이러한 활성을 제거하지 않는 아미노산이 결실될 수 있다. 이러한 결실은 여전히 활성을 유지하면서, 폴리펩타이드의 전체 길이 및 분자량이 감소할 수 있기 때문에 유리할 수 있다. 이에 의해 특정 목적에 필요한 폴리펩타이드의 양이 감소될 수 있으며 - 예를 들어, 투여량 수준이 감소될 수 있다.
상기 융합 단백질의 서열에 대한 아미노산 삽입이 또한 이루어질 수 있다. 이는 본 발명의 물질의 특성을 변이시키기 위해 (예를 들어, 융합 단백질과 관련하여 상기 설명된 바와 같이 확인, 정제 또는 발현을 보조하기 위해) 수행될 수 있다.
본 발명의 융합 단백질의 서열에 대한 아미노산 변화는 임의의 적합한 기술을 사용하여, 예를 들어, 부위 지정 돌연변이 유발을 사용하여 이루어질 수 있다.
본 발명의 범위 내에서 아미노산 치환 또는 삽입은 천연 발생 또는 비 천연 발생 아미노산을 사용하여 이루어질 수 있음을 이해해야 한다. 천연 또는 합성 아미노산의 사용 여부에 관계없이, 단지 L-아미노산만이 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 단백질은 추가의 N 말단 및/또는 C 말단 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이러한 서열은 다양한 이유, 예를 들어 글리코실화를 위해 제공될 수 있다.
융합 단백질은 융합 단백질에 구조적 요소를 제공하는 단백질 서열 또는 이종 펩타이드에 융합된 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 융합 단백질은 생물학적 활성을 갖는 분자와 융합된 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자를 포함할 수 있다. 분자는 펩타이드 또는 단백질 서열, 또는 다른 생물학적 활성 분자일 수 있다.
예를 들어, 항원 특이적 항원 결합 분자는 폴리 아미노산 서열, 예를 들어 복수의 히스티딘 잔기 또는 복수의 리신 잔기 (적합하게 2, 3, 4, 5 또는 6개의 잔기), 또는 면역글로불린 도메인 (예를 들어, Fc 도메인)일 수 있는 이종 펩타이드 서열에 융합될 수 있다.
이종 펩타이드 서열에 대한 언급은 쥣과동물 및 인간과 같은 다른 포유류 종으로부터의 서열 및 다른 VNAR 도메인으로부터 유래된 임의의 이종 펩타이드 서열을 포함한다.
융합 단백질이 생물학적 활성을 갖는 분자와 융합된 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자를 포함하는 경우, 생물학적 활성 모이어티는 효소, 면역글로불린, 사이토카인 또는 이들의 단편과 같은 생물학적 활성을 갖는 펩타이드 또는 단백질일 수 있다. 대안적으로, 생물학적 활성 분자는 항생제, 항암제, NSAID, 스테로이드, 진통제, 독소 또는 다른 약제학적 활성제일 수 있다. 항암제는 세포독성 또는 세포정지 약물을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 융합 단백질은 다른 면역글로불린 가변 또는 불변 영역 또는 본 발명의 다른 항원 특이적 항원 결합 분자에 융합된 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자, 즉, 가변 길이, 예를 들어 2량체, 3량체, 4량체 또는 그 이상의 다량체 (즉, 5량체, 6량체, 7량체, 8량체, 9량체 또는 10량체 이상)의 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자의 융합을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이는 단량체 VNAR 하위단위의 다량체로서 나타낼 수 있다.
본 발명의 융합 단백질에서, 항원 특이적 항원 결합 분자는 융합 단백질의 다른 요소에 직접 융합되거나, 링커 모이어티를 통해 연결될 수 있다. 링커는 펩타이드, 펩타이드 핵산 또는 폴리아미드 연결일 수 있다. 적합한 펩타이드 링커는 복수의 아미노산 잔기, 예를 들어 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 25개의 아미노산, 예컨대 (Gly)4, (Gly)5, (Gly)4Ser, (Gly)4(Ser)(Gly)4 또는 이들의 조합 또는 이들의 다량체 (예를 들어, 2량체, 3량체 또는 4량체 이상)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 적합한 링커는 (GGGGS)3일 수 있다. 대안적인 링커는 (Ala)3(His)6 또는 그의 다량체를 포함한다. 또한 HGMP에 의해 제공된 BLAST 컴퓨터 프로그램의 디폴트 파라미터를 사용하여 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열이 포함된다.
본 발명에 따라 기재된 바와 같이 작제된 벡터는 증폭 및/또는 발현을 위해 숙주 세포에 도입된다. 전기천공, 인산칼슘 침전 등을 포함하는 표준 형질전환 방법을 사용하여 벡터를 숙주 세포에 도입시킬 수 있다. 벡터가 바이러스와 같은 감염성 입자인 경우, 벡터 자체가 숙주 세포로의 유입을 제공한다. 표준 절차에 따라 파지 입자의 유전자 융합 및 생성을 인코딩하는 복제 가능한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포의 형질감염은 파지 입자의 표면에 융합 단백질이 디스플레이되는 파지 입자를 제공한다.
복제 가능한 발현 벡터는 다양한 방법을 사용하여 숙주 세포 내로 도입된다. 일 실시형태에서, 벡터는 다음을 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다: 세포를 표준 배양 배지에서, 선택적으로 약 37℃에서 약 6 내지 48시간 동안 (또는 OD600=0.6 내지 0.8) 배양한 후, 배지를 원심분리하고, 상청액을 제거한다 (예를 들어, 따라냄). 초기 정제는 바람직하게는 세포 펠렛을 완충 용액 (예를 들어, 1.0 mM HEPES pH 7.4)에 재현탁시킨 후, 재원심분리하고, 상청액을 제거함으로써 이루어진다. 생성된 세포 펠렛을 희석된 글리세롤 (예를 들어, 5 내지 20% v/v)에 재현탁시키고, 다시 재원심분리하여, 세포 펠렛을 형성시키고, 상청액을 제거한다. 세포 펠렛을 물 또는 희석된 글리세롤 중에 적절한 농도로 재현탁시킴으로써 최종 세포 농도를 획득한다.
전기천공 동안 더 높은 DNA 농도 (약 10x)를 사용하면, 형질전환 효율이 증가하고, 숙주 세포로 형질전환된 DNA의 양이 증가한다. 높은 세포 농도를 사용하면, 또한 효율이 증가한다 (약 10x). 전달 DNA의 양이 더 클수록, 다양성이 더 크고, 더 많은 수의 조합 라이브러리의 고유한 구성원을 나타내는 더 대형의 라이브러리가 생성된다. 일반적으로 항생제 포함 배지에서의 성장에 의해 형질전환된 세포를 선택한다.
약제학적 조성물 및 용도
본 발명에 따르면, 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자 또는 다중 도메인 특이적 결합 분자의 약제학적 조성물이 제공된다. 이러한 조성물은 상기 항원 특이적 항원 결합 분자를 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
약제학적 조성물은 또한 치료 단백질 또는 그의 단편에 융합된 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자를 포함할 수 있다. 치료 단백질은 호르몬, 성장 인자 (예를 들어, TGFβ, 표피 성장 인자 (EGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 신경 성장 인자 (NGF), 콜로니 자극 인자 (CSF), 간세포 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자, 태반 성장 인자); 분화 인자; 혈액 응고 인자 (예를 들어, 인자 VIIa, 인자 VIII, 인자 IX, VonWillebrand 인자 또는 단백질 C) 또는 혈액 응고 전달계로부터의 다른 단백질 (예를 들어, 안티트롬빈); 사이토카인, 예를 들어 인터루킨 (예를 들어, IL1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32 또는 IL-33 또는 인터페론 (예를 들어, IFN-α, IFN-β 및 IFN-γ), 종양 괴사 인자 (TNF), IFN-γ 유도 인자 (IGIF), 골 형태형성 단백질 (BMP, 예를 들어, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP10, BMP-11, BMP-12, BMP-13); 인터루킨 수용체 길항제 (예를 들어, IL-1ra, IL-1RII); 케모카인 (예를 들어, MIP (마크로파지 염증 단백질), 예를 들어 MIP1α 및 MIP1β; MCP (단핵구 화학주성 단백질), 예를 들어 MCP1, 2 또는 3; RANTES (활성화시 정상적인 T-세포 발현 및 분비되도록 조절됨); 영양 인자; 사이토카인 억제제; 사이토카인 수용체; 효소, 예를 들어 유리 라디칼 소거 효소, 예를 들어 수퍼옥사이드 디스뮤타제 또는 카탈라제 또는 전구약물 전환 효소 (예를 들어, 안지오텐신 전환 효소), 데아미나제, 탈수소효소, 환원효소, 키나제 및 포스파타제); 펩타이드 모방체; 프로테아제 억제제; 금속 단백 분해 효소 (TIMP, 예를 들어 TIMP1, TIMP2, TIMP3 또는 TIMP4)의 조직 억제제 또는 세르핀 (세린 프로테아제 억제제)일 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 융합 단백질의 치료 단백질은 Fab, Fc, F(ab')2 (화학적으로 연결된 F(ab')2 사슬 포함), Fab', scFv (이의 다량체 형태, 즉 디-scFv 또는 트리-scFv 포함), sdAb 또는 BiTE (이중 특이적 T-세포 결합인자)를 포함하는 항체 또는 그의 조작된 단편일 수 있다. 항체 단편은 또한 가변 도메인 및 그의 단편뿐만 아니라, 다른 VNAR 유형 단편 (IgNAR 분자)을 포함한다.
약제학적 조성물은 치료 단백질에 융합된 본 발명의 다수의 항원 특이적 항원 결합 분자, 예를 들어 2량체, 3량체 또는 고차 다량체, 즉 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8머로 구성될 수 있다.
치료 단백질에 대한 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자의 융합은 단백질의 임의의 편리한 위치에서 이루어질 수 있으며, N, C 및/또는 N/C 말단 융합(들)일 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자의 융합은 치료 단백질의 N 및 C 말단 둘 모두에 이루어진다.
본 발명의 약제학적 조성물은 임의의 적합한 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 애주번트 또는 완충 용액을 포함할 수 있다. 조성물은 추가의 약제학적 활성제를 포함할 수 있다. 이러한 담체는 다음에 제한되는 것은 아니나, 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 리포좀, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
이러한 조성물은 지시된 바와 같이 추가의 약제학적 활성제를 포함할 수 있다. 추가 제제는 치료 화합물, 예를 들어 항염증제, 세포독성제, 세포정지제 또는 항생제일 수 있다. 이러한 추가 제제는 이를 필요로 하는 환자에 투여하기에 적합한 형태로 존재할 수 있으며, 이러한 투여는 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 이루어질 수 있다. 성분은 적절하게 설명서를 포함할 수 있는 키트 형태로 제조될 수 있다.
약제학적 조성물은, 예를 들어, 특히 경구, 국소, 정맥내, 근육내, 비강내 또는 피내 경로에 의한 투여를 포함하여 환자의 질병을 치료하는데 효과적인 임의의 효과적이고 편리한 방식으로 투여될 수 있다. 치료 또는 예방으로서, 활성제는 바람직하게는 등장성인 주사용 조성물, 예를 들어 멸균 수성 분산액으로서 개체에 투여될 수 있다.
포유류, 특히 인간에 투여하기 위해, 활성제의 1일 투여량은 0.01 mg/kg 체중 내지 통상적으로 대략 1 mg/kg, 2 mg/kg 또는 최대 4 mg/kg일 것으로 예상된다. 일부 경우에 의사는 개체의 연령, 중량, 성별 및 반응을 포함한 인자에 따라 개체에 가장 적합한 실 투여량을 결정할 것이다. 상기 투여량은 평균 경우의 예시이다. 물론, 더 높거나, 더 낮은 투여량이 유리한 경우가 있을 수 있으며, 이는 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명에 따르면, 약제에 사용하기 위한 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자 또는 다중 도메인 특이적 결합 분자가 제공된다. 따라서, 본 발명의 이러한 양상은 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자 또는 다중 도메인 특이적 결합 분자를 이를 필요로 하는 환자에서 질병 치료용 약제의 제조에 사용하는 것으로 확장된다. 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자는 또한 본 발명의 약제학적 조성물과 관련하여 상기 규정된 바와 같은 특이적 결합 분자를 포함하는 융합 단백질을 제조하는데 사용될 수 있다.
이러한 용도는 또한 치료가 필요한 환자에서 질병을 치료하는 방법으로서, 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자 또는 다중 도메인 특이적 결합 분자를 포함하는 본 명세서에 규정된 바와 같은 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "치료"는 인간 또는 비인간 동물에 이로울 수 있는 임의의 요법을 포함한다. 수의학에서 "비인간 동물"의 치료는 말 및 반려 동물 (예를 들어, 고양이 및 개), 양, 염소, 돼지, 소 및 말과를 포함한 농장/농업 동물을 포함한 가축의 치료까지 확장된다. 치료는 임의의 기존 병태 또는 장애와 관련하여 치료학적 치료일 수 있거나, 예방학적일 수 있다 (예방 치료). 치료는 선천성 또는 후천성 질병을 위한 것일 수 있다. 치료는 급성 또는 만성 병태를 위한 것일 수 있다. 치료는 염증 및/또는 암과 관련된 병태/장애를 위한 것일 수 있다. 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자 또는 다중 도메인 특이적 결합 분자는 다음에 제한되는 것은 아니나, 골관절염, 경피증, 신장 질병, 류머티스 관절염, 염증성 장 질병, 다발성 경화증, 죽상동맥경화증, 또는 임의의 염증성 질병을 포함하는 장애의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자 또는 다중 도메인 특이적 결합 분자는 또한 환자에서 질병 병태의 성질을 조사하기 위해 사용될 수 있다. 항원 특이적 항원 결합 분자 또는 다중 도메인 특이적 결합 분자는 X-선, 감마선 또는 PET 스캐닝과 같은 영상화 기법 또는 유사한 방식을 사용하여 대상체의 신체의 질병 부위의 이미지를 생성하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 대상체에서 질병 부위를 영상화하는 방법으로서, 적절하게 검출 가능하게 표지된 항원 특이적 항원 결합 분자 또는 다중 도메인 특이적 결합 분자를 대상체에 투여한 후, 대상체의 신체를 스캐닝하는 단계를 포함하는 방법으로 확장될 수 있다. 대안적으로, 대상체에 상기 분자를 투여하고, 분자의 투여 후 대상체로부터의 샘플을 분석함으로써 시험 결과를 제공할 수 있다. 이러한 실시형태는 대상체에서 질병 또는 의학적 병태의 진단 방법으로서, 본 발명의 항원 특이적 항원 결합 분자 또는 다중 도메인 특이적 결합 분자의 투여를 포함하는 방법을 포함할 수 있다. 본 발명의 다중 도메인 특이적 결합 분자는 특히 동일한 항원 상의 상이한 에피토프를 표적화하는 다수의 VNAR이 사용되는 경우, 진단 감도와 관련하여 특히 유용할 수 있다.
결합 측정
VNAR과 표적의 결합의 검출 및 측정은 ELISA 및 표면 플라즈몬 공명을 포함하여 당 업계에 널리 공지된 다수의 방식으로 측정될 수 있다.
기능성 활성
본 발명의 VNAR은 사이토카인과 같은 분자의 생물학적 효과에의 결합 및 그의 중화, 리간드 결합을 방지하거나, 또는 결합 후 생물학적 효과를 유발하는 수용체에의 결합을 포함하여 다수의 방식으로 기능할 수 있다.
결합 도메인의 기능성 활성을 측정하는 방법은 당 업계에 공지되어 있다.
본 발명은 다음의 비 제한적 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명된다.
실시예 1: 특이적 항원 결합 VNAR의 단리
A. TNF 결합 VNAR
면역화 및 선택
수염상어 [Ginglymostoma cirratum]를 0.1% (w/v) 트리카인 메탄술포네이트 [MS-222]를 포함하는 인공 해수를 포함한 용기에 배치하였다. 적절한 수준의 마취를 달성한 후, 면역화 또는 채혈을 위해 이를 운반하였다. 완전한 Freund 애주번트 [CFA]에 유화된 hTNFα [250 μg]를 20 게이지 바늘을 사용하여 상어의 측면 지느러미에 주사하였다. 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 가용성 항원 [샘플 0.45 μM 멸균 여과]으로서 꼬리 정맥에 4주 간격으로 부스팅 (boosting)을 제공하였다. 꼬리 정맥으로부터 200 μl 돼지 헤파린 [PBS 중 1000 U/ml]을 포함하는 30 ml 주사기로 혈액 샘플을 수집하였다. 혈장으로부터 혈액 세포를 분리하기 위해 혈액 샘플을 2000 rpm에서 10분 동안 회전시켰다. 혈장 상청액 분획을 RNA 안정화 완충액을 사용하여 멸균 튜브 내로 조심스럽게 운반하여, -80℃에 저장하였다.
상어 혈청에서의 hTNFα 특이적 IgNAR의 검출
ELISA 플레이트를 1 μg/ml rhTNFα로 코팅하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 37℃에서 1시간 동안 4% (w/v) MPBS에서 블로킹 (blocking)하였다. 상어 혈청 [사전 채혈, 채혈 4 및 5]을 1:2 연속 희석의 지정 웰에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS 중 1:200의 희석으로 100 μl/웰의 정제된 항-수염상어 IgNAR 단일클론 항체 [GA8]와 함께 인큐베이션하였다. 0.1% (v/v) Tween-20 PBS (PBST) 중 1:2000의 희석에서 항-마우스 IgG-HRP를 첨가하여 결합 신호를 생성하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 모든 단계 후에 플레이트를 PBST로 3회 세척하고, 항-마우스 IgG-양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) 접합 항체 [Sigma]와 함께 인큐베이션한 후에 추가로 PBS로 3회 세척하였다. 플레이트에 SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate [Thermo Scientific]를 첨가하고, 1M H2SO4로 반응을 중지시키고, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
각 면역 부스팅 후의 rhTNFα 특이적 IgNAR 반응을 각 부스팅 후에 획득된 혈청을 사용하여 결합 ELISA에 의해 측정하였다. PBS 중에 하이브리도마 조직 배양 상청액으로 희석된 마우스 단일클론 항-수염상어 IgNAR 항체인 GA8을 검출 항체로 사용하였다 (문헌[Haines et al., 2005; Muller, et al. 2012]). 결과는 채혈 4 및 5에 제시된 바와 같이 면역화 후 시간에 따른 IgNAR 증가의 뚜렷한 경향을 보여주었으며, 또한 사전 채혈 샘플에서 나타나는 배경 반응은 면역화 전에 유의한 rhTNFα-특이적 IgNAR 반응이 없음을 시사한다 [도 1].
PBL로부터의 전체 RNA 단리 및 PCR 증폭
말초 혈액 림프구 [PBL]를 최대 IgNAR 반응이 나타난 채혈 [채혈 5]의 혈장으로부터 수집하고, 총 RNA를 제조하였다. 수집된 PBL로부터의 총 RNA를 Superscript III First 가닥 합성 슈퍼믹스 [Invitrogen]를 사용한 cDNA 합성의 주형으로서 대략 2 μg/μl에서 사용하였다. 프레임워크 특이적 프라이머 NARF4For1 [5'-ATA ATC AAG CTT GCG GCC GCA TTC ACA GTC ACG ACA GTG CCA CCT C-3'] (서열번호 74) 및 NARF4For2 [5'-ATA ATC AAG CTT GCG GCC GCA TTC ACA GTC ACG GCA GTG CCA TCT C-3'] (서열번호 75)에 의해 cDNA를 생성하였다 (문헌[Dooley, H., et al, Mol. Immunol, 2003. 40(1): p. 25-33] 참조). cDNA 합성 후, 공통 프레임워크의 하나의 특정 프라이머 NARF1 Rev [5'-ATA ATA AGG AAT TCC ATG GCT CGA GTG GAC CAA ACA CCG-3'] (서열번호 76)를 도입하고, 3 단계 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭 프로토콜을 사용하여, IgNAR V 영역 DNA를 증폭시켰다. 약 400개의 염기쌍의 생성된 PCR 산물을 1.5% 아가로스 겔에서 구동시키고, NAR V 영역을 잘라내어, 정제하였다 [QIAquick 정제 키트, QIAGEN]. 정제된 DNA를 제한효소 Ncol 및 Notl [New England Biolabs]로 프라이머-인코딩된 제한 부위 [밑줄 부분]에서 분해시키고, 다시 정제하였다.
라이브러리 작제
파지미드 벡터 pHEN2를 제한효소 Ncol 및 Notl로 분해하고, PCR 정제 [QIAquick PCR 정제]하고, 유사하게 제조된 PCR 산물에 결찰시켰다. 결찰된 물질을 전기천공-가능 E. 콜라이 TG1 세포 [Lucigen]로 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 2% 글루코스 [w/v], 100 μg/ml 암피실린을 포함하는 TYE 한천 플레이트 상에 플레이팅하고, 37℃에서 밤새 성장시켰다. 라이브러리 크기를 계산하고, 플레이트로부터 콜로니를 스크랩하고, 라이브러리 스톡의 분취량을 -80℃에 저장하였다.
파지 디스플레이 선택
2% 글루코스 [w/v], 100 μg/ml 암피실린을 포함하는 2 x TY 성장 배지에 0.1의 OD600에 상응하는 라이브러리 스톡의 단일 분취량을 첨가하고, 37℃에서 중간 로그 상 (mid-log phase)으로 성장시킨 후 [0.4 내지 0.6의 OD600], M13K07 헬퍼 파지 [New England Biolabs]로 감염시켰다. 라이브러리 발현을 30℃에서 2 x TY 배지, 0.2% 글루코스, 100 μg/ml 암피실린 및 50 μg/ml 카나마이신 중에서 밤새 수행하였다. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)로 배양 상청액으로부터 파지를 침전시키고, 바이오 패닝 (bio-panning)에 사용하였다. 라이브러리를 Dynabeads® M-280 스트렙타비딘 비드 [Dynabeads, Invitrogen]에서 포획된 비오틴화된 rhTNFα에 대해 패닝하였다. 라이브러리 파지 및 Dynabeads® M-280 스트렙타비딘을 실온에서 교반하면서 블로킹 용액 [PBS 중 3% (w/v) 우유, 1% (w/v) BSA]으로 1시간 동안 별도로 사전-블로킹하였다. 비오티닐화된 rhTNFα [400 nM]를 블로킹된 비드에 첨가하고, 실온에서 교반하면서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 다른 튜브에, 라이브러리 파지를 사전에 블로킹된 스트렙타비딘 비드와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 비결합 파지를 Dynabeads 마그네틱 랙 (magnetic rack)을 사용하여 회수하였으며, 이 단계에서 회수된 파지를 선택 해제된 파지로 지칭한다. 실온에서 1시간 교반하면서, 블로킹된 비드와 인큐베이션함으로써 파지를 선택 해제시켰다. 비오틴-rhTNFα 부속 비드를 실온에서 교반하면서 1시간 동안 선택 해제된 파지와 함께 인큐베이션하였다. 비드를 PBST로 5회 및 PBS로 5회 세척한 후, 400 μl의 100 mM 트리에틸아민 (TEA)으로 엄격한 조건 하에 8분 동안 용리시키고, 200 μl의 1 M Tris-HCI pH 7.5를 첨가하여 중화시켰다. 중간 로그 상 E. 콜라이 TG1 세포 [10 ml]를 37℃에서 30분 동안 400 μl 용리 파지로 감염시켰다. 이어서, 2% 글루코스 (w/v), 100 μg/ml 암피실린을 포함하는 TYE 한천 플레이트 상에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 3회의 추가 선택 라운드를 수행하고, 비오틴-rhTNFα의 농도를 200 nM로 감소시킴으로써 라운드 3 및 4에서 엄격성을 증가시켰다.
클론의 스크리닝 및 선택
1 μg/ml rhTNFα로 코팅하고, 4% [w/v] 우유-PBS로 블로킹시킨 ELISA 플레이트를 사용하여 항원 결합 단일클론 파지의 다량화를 평가하였다. 항-M13-HRP 접합 단일클론 항체 [GE Healthcare]로 결합을 검출하였다. 또한 단일클론 파지를 스트렙타비딘 및 HSA 코팅된 ELISA 플레이트에 대한 선택성 및 특이성에 대해 각각 분석하였다.
라이브러리를 rhTNFα에 대한 4회 반복 라운드 패닝에 적용하였다. 바이오패닝 항원 농도는 라운드 1 및 2에서 일정하게 유지되었지만, 고친화도 결합인자에 유리한 경우, 후속 라운드의 패닝에서 절반으로 감소하였다. ELISA에 의한 rhTNFα 결합에 대한 각 라운드의 바이오패닝 종료시 양성 단일클론 파지 결합인자의 다량화를 평가하였다. 라운드 2를 통해 사전 선택된 클론으로부터 항원 결합의 꾸준한 증가가 관찰되었고, 라운드 3 및 4 후에 단일클론 파지 결합인자의 수가 감소하였다. rhTNFα 단일클론 결합인자는 라운드 0 [사전 선택 라이브러리]의 약 6% [11/184]로부터 라운드 2 후에 99.46% [183/184]로 증가하였다.
라이브러리 패닝으로부터 다수의 고유한 서열이 확인되었다. 여기에는 D1, C4 및 B4로 명명되는 VNAR이 포함된다.
CDR1 및 CDR3의 시스테인 (C) 잔기 (2줄의 밑줄 부분)는 통상적인 유형 II VNAR이며, FW1 및 FW3b의 시스테인 (1줄의 밑줄 부분) 사이의 정규 면역글로불린 수퍼패밀리 가교 이외에 제2의 이황화 가교를 형성하는 것으로 관찰된다.
TNFα에 결합하는 VNAR의 발현
SHuffle 세포의 세포질에서 가용성 VNAR 단백질의 제조
단일클론 파지 스크리닝으로부터 확인된 대상 IgNAR V 영역 삽입물을 Xbal 및 EcoR1 제한효소 부위를 통해 발현 벡터 pET28b (+) (Novagen)에 클로닝하였다. VNAR DNA를 E. 콜라이 TG1 배양으로부터 제조하고 (QIAprep 미니프렙 키트, QIAGEN 사용), 자체 설계된 프라이머 쌍 Xbal_NARFW1_#127 (서열번호 26) 및 EcoR1_stop_myc_#129 (서열번호 29)를 사용하여 PCR 증폭시켰고, 이는 각각 클로닝 부위 Xbal 및 EcoR1를 도입시키고, 프라이머 서열번호 29는 c-myc, 6x 히스티딘 태그 및 정지 코돈을 VNAR 유전자 서열에 혼입시켰다. 정제된 VNAR DNA PCR 산물 및 pET28b (+) 플라스미드 DNA를 37℃에서 2시간 동안 50 U Xbal 및 10 U EcoR1-HF로 분해시켰다. 분해된 샘플을 정제하고, 결찰시키고, 전기천공 가능 E. 콜라이 SHuffle® T7 Express 세포 [New England Biolabs]로 형질전환시키고, 50 μg/ml 카나마이신을 포함하는 TYE 한천 플레이트에서 선택하였다. VNAR 항-hTNFα -D1, C4 및 B4 융합 단백질을 30℃에서 IPTG로 유도하여 SHuffle® 세포의 세포질에서 발현시켰다. 세포를 원심분리에 의해 수집하고, 세포 펠렛을 Bugbuster™ 단백질 추출 시약 [Novagen]으로 처리하여 세포를 용해시키고, 가용성 단백질을 방출시켰다. VNAR 가용성 단백질을 헥사 히스티딘 꼬리를 통해 고정화된 금속 친화도 크로마토그래피 [IMAC]에 의해 정제하고, pH 8의 500 mM의 이미다졸로 IMAC 수지로부터 용리시켰다. 단백질 샘플을 사용 전에 pH 7.4의 PBS에 대해 투석하였다. 단백질 농도를 Ultraspec 6300 pro UV/Visible 분광분석계 [Amersham, Biosciences]를 사용하여 측정하였다. 정제된 총 단백질을 쿠마시 블루 (Coomassie blue) 염색된 SDS-PAGE에서 시각화하였다. 정제된 VNAR 단량체 단백질은 대략 14 kDa의 단일 밴드로 이동하였으며 [헥사 히스티딘 및 c-myc 태그 포함], 단백질 응집은 나타나지 않았다. 순도는 SDS-PAGE 겔을 기반으로 하여 약 90%인 것으로 추정되었다
단백질 완전성 및 순도의 결정
변성 소듐 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 [SDS-PAGE]를 사용하여 정제된 단백질 순도 및 크기를 평가하였다. 단백질 샘플을 5% β-머캅토에탄올을 포함하는 NuPAGE® LDS 샘플 완충액 [Life Technologies] 중 제조하고, 5분 동안 95℃로 가열하였다. 변성 단백질 샘플을 MES SDS 구동 완충액에 침지시킨 NuPAGE® 4 내지 12% 비스-트리스 겔 [Life Technologies]에 로딩하고, 전기영동을 160 볼트에서 55분 동안 수행하였다. Full Range 재조합 단백질 분자량 마커 [GE Healthcare]를 분자량 래더 표준 (molecular weight ladder standard)으로서 사용하였다. 겔을 증류수로 세척하고, 쿠마시 블루로 1시간 동안 염색한 후, 증류수에서 밤새 탈염색 과정을 수행하였다.
선택성 및 특이성의 결정
1 μg/ml 비오틴-TNF 및 rhTNFα, 또는 10 μg/ml HSA, BSA, 스트렙타비딘, 단일 가닥 DNA, 티로글로불린 또는 리소자임으로 코팅된 ELISA 플레이트에서 결합의 특이성 및 선택성을 결정하였다. ELISA 플레이트를 4% [w/v] 우유-PBS에서 적절하게 블로킹하고, 단백질 샘플을 최고 농도 1 μg/ml로 로딩하고, 연속 희석을 수행하였다. 항-c-myc-HRP 접합 단일클론 항체 [Roche]로 결합을 검출하였다.
더욱 정확한 결합 데이터를 획득하기 위해, 또한, BIACore T200 또는 Octet RED96 기기에 의해 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 특정 분자를 측정하였다.
BIACore™ T200 (GE Healthcare)
아민 커플링은 리간드를 칩 표면에 고정시키기 위한 매우 일반적인 접근법이다. 칩 표면은 카복실기로 유도체화된 덱스트란 기질을 가지고, 이는 N-하이드록시숙신이미드 (NHS) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 (EDC)에 의한 활성화 후 반응성 숙신이미드 에스테르를 형성하며, 이는 리간드 상의 임의의 이용 가능한 1차 아민기 (예를 들어, 리신)를 통한 리간드의 공유결합 포획을 가능하게 한다.
TNFα를 pH 5.5의 10 mM 아세트산나트륨 완충액에 1/10로 희석하고, 활성화된 칩에 주입하였다. 고정된 TNFα의 200 RU를 목표 값 설정하기 위해, "목표 값 설정 (aim for)" 소프트웨어 고정 마법사 또는 특정 기간을 사용할 수 있다. 또한, 표면활성제가 리간드 활성에 영향을 미칠 수 있는 것으로 고려되므로, 구동 완충액을 0.05% Tween 20의 부재 하의 PBS로 변경하였다. 202 RU의 최종 리간드 고정 수준을 획득하였다.
개시 사이클은 30 μl/분의 유속으로 60초 완충액 주입 후 30초의 해리 기간으로 구성되었다. 항-TNFα 샘플 사이클은 30 μl/분에서 120초 샘플 주입 후 30 μl/분에서 60초 10 mM 글리신 pH2 주입의 재생 단계를 포함하였다. 마지막으로, 다음 사이클의 개시 전에 기준선 평형을 가능하게 하기 위해 각 사이클의 종료시 120초 안정화 기간을 포함시켰다.
스크리닝된 일련의 농도 및 해리 기간은 가변적이며, 다음과 같았다: 해리 시간이 600초였던 모든 단량체 도메인 D1, C4, B4, TNF43 및 TNF30을 제외하고, 모든 샘플을 100 nM의 최고 개시 농도 및 1200초의 해리 시간에서 분석하였다. B4 및 TNF43 VNAR을 각각 500 nM 및 5μM의 최고 개시 농도에서 분석하였다. 이중 참조 데이터 세트를 생성하기 위해 5개의 블랭크 샘플 사이클을 포함시켰다.
도메인에 대한 결합 반응을 BIACore™ T200 평가 소프트웨어를 사용하여 분석하고, 이중 참조 데이터를 1:1 Langmuir 모델에 적용하여, 동역학 및 친화도 특성을 획득하였다.
OCTET® RED96 [ForteBio™]
생물층 간섭계 (BLI)를 사용하여 평형 해리 상수 (KD)를 측정하였다. 침지 및 판독 스트렙타비딘 바이오센서를 pH 7.4의 PBS 중에서 적어도 30분 동안 재수화시켰다. 센서에 20 μg/ml 비오티닐화 hTNF-α를 로딩하고, 항-TNF-α VNAR 단백질을 100 nM의 최고 농도로 연속 희석하고, TNF43 및 VNAR 음성 대조군을 최고 농도 1 μM에서 분석하였다. 결합 연결을 10분 동안 모니터링한 후 5분의 해리 시간을 적용하였다. 모든 항-TNF-α VNAR 측정의 경우, 곡선 적용 데이터가 복합 다상 곡선을 나타내었으므로, 2-부위 모델을 사용하여 동역학 데이터 세트를 적용하였지만, 대조군 항-TNF-α 나노바디, TNF30의 경우, 대량 운송 모델의 1:1 Langmuir 결합을 사용하였다.
획득된 데이터는 표 1에 제시되어 있다. 표 1은 시험된 단량체 VNAR이 TNF 43 VNAR과 비교하여 TNFα에 대해 적어도 500배 더 낮은 결합 친화도를 가짐을 보여준다.
시험관내 중화 분석
VNAR 도메인에 대한 중화 용량 및 ND50을 측정하기 위해, 마우스 섬유육종 세포주 L929 [ATCC, CCL-1]를 10% 열 불활성화된 소 태아 혈청 [GIBCO] 및 1 μg/ml 액티노마이신 D [R & D systems]이 보충된 둘베코 변형 이글 배지 [GIBCO]에서 성장시켰다. 각각의 VNAR 클론에 대해 웰당 5,000개의 세포를 5% CO2 및 습도에서 37℃에서 24시간 동안 96웰 플레이트에서 2회 반복 실험으로 인큐베이션하였다. 연속 희석된 VNAR 단백질 또는 세포 단독을 포함하는 웰에 LD50 [1x, 0.25 ng/ml] 및 10x LD50 [2.5 ng/ml]의 rhTNFα를 첨가하였다. 이어서 플레이트를 5% CO2 및 습도로 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 세포독성 또는 세포 생존율을 50 μl의 1:20 희석 WST-1 세포 증식 시약 [Roche]을 첨가하여 측정하고, 5% CO2 및 습도로 37℃에서 4 내지 8시간 동안 인큐베이션하였다. 450 내지 560 nm에서 흡광도를 판독하였다.
1 μg/ml 액티노마이신 D의 존재하에 TNFα는 L929 섬유육종 세포에서 세포독성을 유발하고, LD50은 0.25 내지 0.3 ng/ml이었다. 본 발명자들은 나노몰 농도에서 본 발명자들의 VNAR 단백질 도메인이 rhTNFα의 LD50의 최대 10배까지 중화할 수 있음을 입증하였다 [도 3]. 이 실험에서, 대조군 항-TNFα 항체 MAB210과 비교하기 위해, 2가 분자를 형성하기 위해 VNAR을 펩타이드 링커에 의해 그의 C 말단에서 IgG Fc 도메인에 결합시켰다.
중화 분석에서 단일 도메인으로서 측정하는 경우, D1 및 C4 VNAR은 TNF30 VHH 나노바디만큼 효과적인 것으로 나타나지 않았다 (도 2). 이는 단일 부위 결합 친화도와 관련이 있는 것으로 보인다. 그러나 혼합물 (도 3) 또는 2가 또는 이중 특이적 형식 (도 xxxx)으로 조합시, 이는 2량체 TNF30 VHH 나노바디에 비해 예상치 못하게 향상된 특성을 나타내었다.
세포간 유출 분석
인간 상피 결장직장 선암 세포 (Caco-2)를 10 (% v/v) 열 불활성화 FBS 및 1% (v/v) 페니실린-스트렙토마이신 (각각 10,000 단위/ml 및 10,000 μg/ml)이 보충된 DMEM에서 배양하였다. T75 플라스크에서 세포를 90% 컨플루언스 (confluence)로 성장시킨 후, 24웰, 0.4 μm 반투과성 조직 배양 트랜스웰 삽입물 (Corning Inc.)에 시딩하였다. 90 μl의 0.4% 트리판 블루 배제 염료 (Beckman Coulter)에 10 μl 세포 현탁액을 현탁시키고, 커버 슬립이 부착된 상태에서 혼합물을 혈구계로 조심스럽게 운반하여, 생존 세포 수를 측정하였다.
생존 세포 수 측정 후, 1 x 105개의 세포를 트랜스웰 삽입물당 100 μl의 최종 DMEM 부피로 시딩하고, 세포 부재 하의 600 μl DMEM을 외부 수용 웰로 운반하였다. 트랜스웰 플레이트를 5% (v/v) CO2로 37℃에서 인큐베이션하고, 48시간마다 소모된 DMEM + 10% (v/v) FBS를 교체하였다. 일반적으로 시딩 후 5 내지 7일 사이에 세포가 100% 컨플루언스에 도달할 때까지 위상차 현미경 (40x 대물렌즈 배율) 하에서 세포 증식을 모니터링하였다. 추가의 21일 동안 Caco-2 세포를 성장시켜, 분화되도록 하고, 분화시까지 소모된 배지를 48시간마다 교체하였다.
10% (v/v) HI-FBS가 포함된 100 μl DMEM에 극성 세포 (최상부)를 포함하는 지정 삽입 웰을 항-TNFα VNAR 단백질의 존재 또는 부재 하에 10 ng/ml hTNFα, IFNγ, LPS로 처리하였다. 처리된 세포를 5% (v/v) CO2로 37℃에서 18시간 동안 인큐베이션하였다. 사이토카인±항-TNFα VNAR과 함께 18시간 동안 인큐베이션한 후, 처리된 세포의 위상차 이미지를 캡처한 다음, 5 μl의 10 mg/ml 플루오레세인 이소티오시아네이트-표지 덱스트란, 분자량 (3 내지 5 kDa)을 Caco-2 단층의 최상부 (삽입 웰)에 첨가하였다. 트랜스웰 챔버의 기저측부로부터 배지를 FITC-덱스트란의 첨가 24시간 후에 수집하였다.
형광 강도를 485 nm 여기 및 520 nm 방출 파장에서 Synergy HT (BioTek®) 마이크로플레이트 리더를 사용하여 측정하였다.
상피 저항 기능이상 분석
인간 상피 결장직장 선암 세포 (Caco-2)를 10 (% v/v) 열 불활성화 FBS 및 1% (v/v) 페니실린-스트렙토마이신 (각각 10,000 유닛/ml 및 10,000 μg/ml)이 보충된 DMEM에서 배양하였다. T75 플라스크에서 세포를 90% 컨플루언스로 성장시킨 후, 12 또는 24웰, 0.4 μm 반투과성 조직 배양 트랜스웰 삽입물 (Corning Inc.)에 시딩하였다. 세포가 완전한 분화에 도달할 때까지 전술한 프로토콜을 따랐다.
10% (v/v) HI-FBS가 포함된 200 μl DMEM에 극성 세포 (최상부)를 포함하는 지정 삽입 웰을 항-TNFα VNAR 단백질의 존재 또는 부재 하에 10 ng/ml hTNFα 및 IFNγ로 처리하였다. 처리된 세포를 5% (v/v) CO2 및 습도로 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 사이토카인±항-TNFα VNAR와 함께 24시간 동안 인큐베이션한 후, Millicell® ERS-2 상피 (볼트/옴) 미터 및 MERSSTX01 프로브 (Merck Millipore)를 사용하여 최상부 챔버에서 경상피 전기 저항 (TEER)을 측정하였다. 측정된 저항 값을 처리 하 표면적에 대해 정규화하였다.
12개의 웰 조직 배양 트랜스웰 삽입물에 500 μl의 DMEM을 포함하는 5 x 106개의 세포/웰로 시딩하였으며, 외부 웰 (기저측부)은 1.5 ml의 DMEM을 포함하였다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 또한 TEER 측정 동안, 삽입 및 외부 웰의 DMEM 부피를 각각 500 μl 및 1.5 ml로 증가시켜, 볼트-옴 미터 전극을 웰 바닥과 접촉되지 않도록 하여, 배지 내에 완전히 침지시켰다.
B. ICOSL 결합 VNAR
ICOSL 결합 VNAR 2D4 및 CC3의 단리 및 특성화는 WO2014/173975 및 WO2014/ 173959에 개시되어 있다.
2. 다가 및 다중 특이적 VNAR의 형성.
TNF 결합 도메인
도 3은 D1-Fc 및 C4-Fc 분자의 조합이 2가 형태에서 증가된 중화 능력을 보여줌을 도시한다. 따라서, 융합으로서 함께 조합되는 경우, 중화 용량에서 동일한 향상이 나타남을 입증하기 위해, VNAR D1 및 C4 및 다른 조합을 2가 또는 이중 특이적 융합으로서 제조하였다.
2량체 및 3량체의 작제
도 4는 2가 및 이중 특이적 작제물의 형식의 도표를 제공한다
하기 열거된 올리고뉴클레오타이드 조합을 사용하여 N 말단, 중간 말단 [3량체의 경우] 및 C 말단 VNAR 도메인을 증폭시키기 위해 2개 또는 3개의 개별 PCR 반응을 설정하였으며, 각각의 올리고뉴클레오타이드는 각각 정제 및 검출이 용이한 특정/고유한 클로닝 부위 및/또는 6x his-태그 및 c-myc 태그를 보유하였다.
2량체 작제물 PCR 올리고:
N-말단 단편 올리고뉴클레오타이드 쌍:
3량체 작제 PCR 올리고뉴클레오타이드: 본 발명자들은 각각 N 및 C 말단에 Xba1/BamH1 및 APA1/EcoR1 클로닝 부위에 측접된 중간 단편으로서 BA11 유전자를 보유하는 자체 설계 DNA 카세트를 이용하였다. N 말단 정방향 올리고뉴클레오타이드 내에 Xba1 및 BssH11 부위둘 모두를 보유하는 올리고뉴클레오타이드뿐만 아니라, 상기 열거된 올리고뉴클레오타이드 쌍을 PCR 증폭 단계에서 이용함으로써, 3량체 유전자를 자체적인 진핵생물 발현 벡터 pEEE2A로 서브클로닝할 수 있다. 그외에는 모든 클로닝을 pET28b (+) 발현 벡터에서 수행한다.
2 μl VNAR DNA (50 내지 100 ng), 2 μl 정방향 및 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머 (최종 농도 1 μM), 5 μl의 10X Taq 중합효소 완충액, 0.25 μl의 Taq 중합효소 (최종 농도 25 U/ml), 0.5 μl dNTP (최종 농도 0.1 mM), 및 38.25 μl H2O의 PCR 반응으로서, 최종 반응 부피는 50 μl이다. 98℃에서 5분 동안 PCR 프로그램을 개시하였다. 이어서 30초 동안 94℃, 30초 동안 56℃ 및 1분 동안 72℃의 30 사이클을 수행하였다. 72℃에서 5분 동안의 최종 연장. 앰플리콘 (Amplicon)을 아가로스 겔 전기영동으로 확인하고, QIAquick PCR 정제 키트를 사용하여 정제하였다. 용리된 DNA를 적절한 제한 엔도뉴클레아제로 분해시켰다.
E. 콜라이 SHuffle® T7 발현 세포에서의 2량체 및 3량체의 발현
Xbal 및 EcoR1 제한효소 부위를 통해 발현 벡터 pET28b (+)로 클로닝된 VNAR 영역 및 VNAR 유전자를 포함하는 생성된 정제 플라스미드를 전기천공 가능 E. 콜라이 SHuffle® T7 발현 세포 [NEB]로 형질전환시키고, 카나마이신 50 μg/ml를 포함하는 TYE 한천 플레이트에서 선택하였다. 항-hTNFα VNAR -D1, C4 및 B4 융합 단백질은 30℃에서 IPTG로 유도시 SHuffle 세포의 세포질에서 발현되었다.
일반적으로 37℃, 250 rpm에서 4 내지 6시간 인큐베이션하여 OD600 0.4 내지 0.6이 달성될 때까지, 형질전환된 E. 콜라이 SHuffle ® T7 발현 세포의 단일 콜로니를 5 ml 2x TY-카나마이신 배지에서 성장시켰다. 이 로그 상 배양을 사용하여 카나마이신 및 PO4 염을 포함하는 50 ml TB 배지에 접종하고, 이들이 OD600 6.0 내지 10.0에 도달할 때까지 30℃, 250 rpm에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 4000 rpm, 30℃에서 15분 동안 원심분리한 후, 새로운 TB-카나마이신-PCU 염 배지에 재현탁시키고, 30℃, 250 rpm에서 1 내지 2시간 동안 회복시켰다. 세포질 단백질 발현을 1 mM의 최종 IPTG 농도를 사용하여 유도하고, 유도 후 12 내지 16시간 동안 30℃, 200 rpm에서 세포를 인큐베이션하였다. 6000 rpm, 25℃에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수집하고, 세포 펠렛 습식 중량을 측정하였다. 세포 펠렛을 5ml/그램의 습식 세포 페이스트 BugBuster™ 단백질 추출 시약 + Benzonase® (Novagen, UK)에 재현탁시키고, 세포 현탁액을 10 내지 15 rpm, 실온에서 20분 동안 진탕 플랫폼에 배치하였다. 세포 현탁액을 6000 rpm, 4℃에서 20분 동안 원심분리하고, 고정 금속 친화도 크로마토그래피 (IMAC) 수지 (니켈-니트릴로트리아세트산, Ni-NTA 또는 Ni-Sepharose)를 사용하여 폴리히스티딘 태그를 통한 친화도 정제를 위해 상청액에서 수집된 가용성 단백질을 준비하였다. VNAR 융합 단백질을 pH 8.0의 300 내지 500 mM 이미다졸로 용리시키고, 용리액을 pH 7.4의 PBS (1 L PBS/1 ml 용리 단백질)로 밤새 투석한 다음, 추가로 3 내지 4 시간의 투석을 위해 PBS를 교체하였다. 단백질 특질을 SDS-PAGE를 통해 평가하고, Ultraspec 6300 pro uv/가시광선 분광광도계 (Amersham Biosciences, GE Healthcare)를 사용하여 정량화하였다.
진핵 세포 발현을 위해, BA11 3량체 카세트에 클로닝된 도메인을 BssHII 및 EcoR 효소를 사용하여 분해하고, CMV 프로모터를 사용하여 pEEE2A 진핵 발현 벡터에 서브클로닝하고, 플라스미드 증식을 위해 E. 콜라이 균주 내에 형질전환시켰다. VNAR 3량체 유전자를 포함하는 단리 및 정제된 플라스미드 벡터를 선형 폴리에틸렌이민 [PEI]과 20분 동안 실온에서 공동 인큐베이션하였다. 플라스미드 DNA: PEI의 혼합물을 HEK293 세포를 포함하는 세포 배양 플라스크로 옮겨, 세포 성잘 밀도가 90% 컨플루언스에 도달하도록 하였다. 형질감염된 HEK293 세포를 37℃, 5% v/v CO2에서 5 내지 7일 동안 인큐베이션하였다. 세포 배양 상청액을 수집하고, IMAC 수지를 사용하여 발현 단백질을 정제하고, PBS에 대해 투석하였다.
결합 및 TNF 중화 데이터
도 5는 TNFα에 대한 2량체 및 이중 특이적 작제물의 ELISA 결합을 도시한다.
초기 ELISA 데이터는 이중 특이적 D1-C4 작제물이 TNF30 나노바디 2량체 작제물과 비교하여 증가된 결합력 (조합 결합 친화도)을 가짐을 나타내었다.
그 후, 이들 중 다수의 것을 표면 플라즈몬 공명에서 고정 TNF에 대한 결합에 대해 측정하였다.
표 1은 측정된 2량체 분자 중, D1-C4 이중 특이적 분자가 TNF30 2가 나노바디 작제물과 비교하여 우수한 결합 친화도 (결합력)를 나타냄을 보여준다.
도 6은 2가 TNF 나노바디와 비교하여 다수의 2가 또는 이중 특이적 VNAR 융합에 대한 TNF 중화 데이터를 도시한다. 결합 분자를 L929 분석에서 TNF 중화에 대해 시험하는 경우, D1-C4 2량체는 TNF30 나노바디 2량체 작제물과 동일하거나, 그보다 우수하였다. 이 실험에서 D1-D1 2량체는 D1-B4 2량체보다 열등하였다.
표 1은 시험된 3량체 작제물에 대한 SPR 결합 데이터를 보여준다. 이는 TNFα 결합 도메인 사이의 스페이서로서 작용하는 추가 도메인의 도입이 TNFα에 대한 분자의 친화도 (결합력)를 유의하게 향상시키는 것으로 나타남을 시사한다.
TNFα 중화 분석에서 측정하는 경우, D1-BA11-C4 3량체 작제물은 아달리무맙과 동일하고, TNF30 나노바디 작제물보다 우수하였다. 이 분석에서, D1 도메인을 포함하는 2가 분자는 TNF30 나노바디 작제물과 효능이 동일하였다.
도 7은 TNFα 기능을 중화시키기 위한 다양한 VNAR 형식의 능력을 측정하기 위한 실험 결과를 도시한다.
표 2는 중화 데이터를 요약한 것이다. 스페이서 도메인이 포함되는 경우, D1-BA11-D1 및 D1-BA11-C4 둘 모두는 중화 능력에서 10배 이상의 향상을 나타내며, D1-BA11-C4는 아달리무맙 및 MAB210과 거의 동일한 효능을 나타낸다. TNF30-BA11-TNF30은 또한 TNF30-TNF30 2량체 형태에 비해 향상된 것으로 나타나지만 현저한 것은 아니다. D1-C4 작제물 (서열번호 27 및 28)의 GlySer 링커 길이는 (Gly4Ser)2로부터 (Gly4Ser)3까지 연장되며, 결과적으로 hTNF-알파 중화 효능이 향상된다.
이들 실험으로부터의 데이터는 표 2에 제시되어 있다. 추가 비교 데이터는 표 3에 제시되어 있다.
A. 본 발명자들에 의해 획득된 결합 (B) 및 중화 (N) 데이터
B. 문헌에 보고된 바와 같이 임상적으로 이용 가능한 항-hTNF-알파 생물학의 교차 반응성 데이터
기능성 활성
배경기술
인간 상피 결장직장 선암 세포 (Caco-2)는 적합한 플랫폼 (예를 들어, 플라스틱 접시, 니트로셀룰로스 필터)에서 성장할 때 정상 장세포의 형태학적 특성을 발달시킨다. 다수의 경우 콜라겐 코팅된 폴리카보네이트 또는 폴리에스테르 막은 장 상피 수송 모델 시스템으로서 Caco-2 단층에 적합한 것으로 나타났다 (문헌[Wang, F., et al. Am. J. Path. 166.2 (2005): 409-419.; Hidalgo, I.J., et al Gastroenterology 1989. 96: 736-49]).
상피 막의 주요 기능은 이눌린 및 덱스트란과 같은 친수성 용질에 대한 장벽의 유지이다. 다음에 제한되는 것은 아니나, 감염성, 면역 매개성 및 특발성 질병을 포함하여, 장 상피와 관련된 특정 질병에서 이 장벽이 손상된다 (문헌[Clayburgh, D.R., et al Lab Invest. 2004. 84(3): 282-291; Wang, F., et al. Am. J. Path. 2005. 166(2): 409-419]). 세포간 투과성의 증가 및 장 상피 저항의 감소로 측정되는 바와 같은 장 장벽 기능이상은 크론병과 같은 염증성 장 질병 (IBD)과 밀접한 관련이 있다 (문헌[Irvine E.J. 및 Marshall J.K., Gastroenterology 2000. 119.6: 1740-1744.; Wyatt et al., The Lancet 1993. 341 (8858): 1437-1439]). 또한 IBD에서 상피 밀접 접합 단백질이 감소된 결과 누출 설사를 야기하는 용질의 손실에 기여한다는 것을 뒷받침하는 증거가 존재한다 (문헌[Schulzke J.D. et al., Ann N YAcad Sci. 2009 1165:294-300; Schmitz H. et al., J. Cell Sci 1999. 112(1): 137-146]). 마지막으로 인터페론-γ (IFN-γ), TNFα 및 지질다당류 (LPS)는 인간 상피 세포주에서 장 상피 장벽 기능이상을 상승작용적으로 유도하는 것으로 나타났다 (문헌[Wang et al., J. Cell Science 1999. 112(1): 137-146; Schuerer-Maly C.C et al., Immunology 1994. 81 (1): 85]).
항-TNFα 처리는 크론병에서 장 장벽 기능이상을 회복시키는 것으로 나타났으며 (문헌[Suenaert P. et al., Am J Gastroenterol 2002. 97(8): 2000-2004]), 따라서 본 발명자들은 본 발명자들의 항-TNF VNAR 도메인이 시험관내에서 유도된 이러한 기능이상을 회복시킬 수 있는지를 입증하기 위해 이를 조사하였다. 본 발명자들은 이중 특이 적/다가 VNAR 도메인이 VNAR 단량체와 비교할 때 이러한 기능이상의 예방에 더 효과적일 것이라고 가정했다.
극성 Caco-2 세포 단층에 걸친 FITC-덱스트란 세포간 유출
인간 상피 결장직장 선암 세포 (Caco-2)를 10 (% v/v) 열 불활성화 FBS 및 1% (v/v) 페니실린-스트렙토마이신 (각각 10,000 유닛/ml 및 10,000 μg/ml)이 보충된 DMEM에서 배양하였다. T75 플라스크에서 세포를 90% 컨플루언스까지 성장시킨 후, 24 웰, 0.4 μm 반투과성 조직 배양 트랜스웰 삽입물 (Corning Inc.)에 시딩하였다. 90 μl의 0.4% 트리판 블루 배제 염료 (Beckman Coulter) 중 10 μl 세포 현탁액을 현탁시키고, 커버 슬립이 부착된 상태에서 혼합물을 혈구계로 조심스럽게 운반함으로써, 생존 세포 수를 측정하였다.
생존 세포 수 측정 후, 1 x 105개의 세포를 100 μl의 최종 DMEM 부피로 트랜스웰 삽입물 마다 시딩하고, 세포 부재 하의 600 μl DMEM을 외부 수용 웰로 옮겼다. 트랜스웰 플레이트를 5% (v/v) CO2 및 습도에서 37℃에서 인큐베이션하고, 소모된 DMEM + 10% (v/v) FBS를 48시간마다 교체하였다. 일반적으로 시딩 후 5 내지 7일 사이에 세포가 100% 컨플루언스에 도달할 때까지 위상차 현미경 (40x 대물렌즈 배율) 하에서 세포 증식을 모니터링하였다. 추가의 21일 동안 Caco-2 세포를 성장시켜, 분화되도록 하고, 분화시까지 소모된 배지를 48시간마다 교체하였다.
10% (v/v) HI-FBS가 포함된 100 μl DMEM에 극성 세포 (최상부)를 포함하는 지정 삽입 웰을 항-TNFα VNAR 단백질의 존재 또는 부재 하에 10 ng/ml hTNFα, IFNγ, LPS로 처리하였다. 처리된 세포를 5% (v/v) CO2 및 습도로 37℃에서 18시간 동안 인큐베이션하였다. 사이토카인±항-TNFα VNAR과 함께 18시간 동안 인큐베이션한 후, 처리된 세포의 위상차 이미지를 캡처한 다음, 5 μl의 10 mg/ml 플루오레세인 이소티오시아네이트-표지 덱스트란, 분자량 (3 내지 5 kDa)을 Caco-2 단층의 최상부 (삽입 웰)에 첨가하였다. 트랜스웰 챔버의 기저측부로부터 배지를 FITC-덱스트란의 첨가 24시간 후에 수집하였다.
형광 강도를 485 nm 여기 및 520 nm 방출 파장에서 Synergy HT (BioTek®) 마이크로플레이트 리더를 사용하여 측정하였다.
도 8은 수 개의 TNF VNAR 다중 도메인 결합 분자를 비교하여, 극성 Caco-2 세포 단층에 걸쳐 세포간 유출을 측정하는 실험으로부터의 투과성 데이터를 도시한다. 이 실험은 더 낮은 농도의 2량체 또는 3량체가 유발 세포의 증가된 수준의 보호를 전달함에 따라, 다양한 2가 및 이중 특이적 형태가 단량체 형태에 비해 향상된 기능을 나타냄을 보여준다.
극성 Caco-2 세포 단층에서의 상피 저항 기능이상 분석
인간 상피 결장직장 선암 세포 (Caco-2)를 10 (% v/v) 열 불활성화 FBS 및 1% (v/v) 페니실린-스트렙토마이신 (각각 10,000 유닛/ml 및 10,000 μg/ml)이 보충된 DMEM에서 배양하였다. T75 플라스크에서 세포를 90% 컨플루언스까지 성장시킨 후, 12 또는 24 웰, 0.4 μm 반투과성 조직 배양 트랜스웰 삽입물 (Corning Inc.)에 시딩하였다. 세포가 완전한 분화를 달성할 때까지 섹션 0에서 전술한 프로토콜을 따랐다.
10% (v/v) HI-FBS가 포함된 200 μl DMEM에 극성 세포 (최상부)를 포함하는 지정 삽입 웰을 항-TNFα VNAR 단백질의 존재 또는 부재 하에 10 ng/ml hTNFα, 및 IFNγ로 처리하였다. 처리된 세포를 5% (v/v) CO2 및 습도로 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 사이토카인±항-TNFα VNAR과 함께 24시간 동안 인큐베이션한 후, Millicell® ERS-2 상피 (볼트/옴) 미터 및 MERSSTX01 프로브 (Merck Millipore)를 사용하여 최상부 챔버에서 경상피 전기 저항 (TEER)을 측정하였다. 측정된 저항 값을 처리 하 표면적에 대해 정규화하였다.
12개의 웰 조직 배양 트랜스웰 삽입물에 500 μl의 DMEM을 포함하는 5 x 106개의 세포/웰로 시딩하였으며, 외부 웰 (기저측부)은 1.5 ml의 DMEM을 포함하였다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 또한 TEER 측정 동안, 삽입 및 외부 웰의 DMEM 부피를 각각 500 μl 및 1.5 ml로 증가시켜, 볼트-옴 미터 전극을 웰 바닥과 접촉되지 않도록 하여, 배지 내에 완전히 침지시켰다.
도 9는 극성 Caco-2 세포에서 상피 저항을 측정하는 분석을 도시한다. 이 실험은 다양한 2가 및 이중 특이적 형태가 단량체 형태에 비해 향상된 기능을 나타냄을 보여준다.
B ICOSL 결합 도메인
다가 형태의 작제 및 향상된 효능 데이터.
2D4 및 CC3 Fc 융합
도 10은 추가의 향상된 기능성 특성을 제공하는 ICOSL VNAR (및 인간 IgG Fc)을 혼입시키는 본 발명의 다가 및 다중 특이적 VNAR에 대한 형식을 도시한다.
방법
선택된 VNAR 단량체 도메인을 PCR 증폭시키고, 진핵생물 발현 벡터로 서브클로닝하였다. 이 클로닝은 인간 IgG1 Fc 인코딩 DNA 단편의 5' 말단에서 이루어졌다 (이러한 인간 IgG1 Fc 단편은 또한 일반적으로, 세린이 돌연변이된 경쇄에 이황화 가교에 의해 연결된 가장 중요한 5개의 Cys 잔기를 갖는 전장 인간 IgG1 힌지 서열을 인코딩함).
PCR 증폭에 적용하면서, 올리고뉴클레오타이드를 사용하여, 포유류 벡터 발현 시스템에 적합한 제한 엔도뉴클레아제 부위뿐만 아니라, VNAR 도메인의 카복실 말단과 인간 IgG1 힌지 영역의 N 말단 잔기 사이에 링커 서열을 삽입하는 아미노산 잔기를 도입하였다. 이 과정에 의해 도입된 링커 서열은 밑줄친 RT 아미노산 잔기를 인코딩하는 핵산 서열이 BsiW1 제한 엔도뉴클레아제 부위를 도입시키는 GGGGSGGGGRT이거나, 밑줄친 GADQ 아미노산 잔기의 코돈 사용이 Bcl1 부위를 도입시키는 GGGGSGGGADQ였다. 이들 부위 둘 모두는 상이한 버전의 Fc 진핵생물 발현 벡터에서의 클로닝 부위에 적합하다. 모든 앰플리콘의 5' 말단에는 진핵생물 벡터 작제에 적합한 고유한 BssHII 부위를 도입시킨다.
Fc의 카복실 말단에 링커 VNAR 도메인 융합을 도입하기 위한 DNA 서열을 설계하고, 이러한 중간 단편의 합성을 GeneArt (Invitrogen)에 의해 수행하였다. 이 단편의 N 말단에는 인간 IgG1 유래 CH3 영역 내의 천연 발생 BsrGI 부위 및 벡터 내의 EcoR1 부위를 이용하였다. 이 작제물은 Fc 도메인의 카복실 말단과 VNAR 도메인의 아미노 말단 사이에 아미노산 서열 TAAAATAAAATAAAATAAAA를 갖는 링커를 도입시켰다. 링커의 밑줄친 삼중 알라닌 영역의 코돈 사용은 추가적인 이중 특이적 VNAR 작제물을 조립하기 위해 후속 클로닝 작업에 사용될 수 있는 NotI 제한 부위의 도입을 가능하게 한다.
무혈청 배지를 사용하여 현탁액 HEK 293 세포에서 PEI-매개 형질감염 및 일시적 발현 후, NAR Fc 융합 단백질의 발현 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. 세포 파편을 제거하기 위해, 처음에 0.2 μm 여과 정화 단계 후에 VNAR Fc 단백질을 정제하기 위해 단백질 친화도 크로마토그래피를 수행하였다. 단계 사이에 적절한 경우, 완충액 교체와 함께 이온 교환 또는 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 친화도 정제된 단백질을 조정하기 위한 제2 크로마토그래피 단계를 수행하였다. 단백질을 Amicon 초 여과 장치를 사용하여 농축하고, 최종 단백질 농도를 UV 분광법으로 측정하였다. 분석 SEC 및 SDS PAGE를 사용하여 최종 정제 단백질의 완전성을 측정하였다.
ICOSL 중화 분석
리간드-수용체 중화 분석을 다음과 같이 수행하였다: 인간 ICOS 수용체를 발현하는 CHO 세포를 96웰 세포 배양 플레이트 (Greiner, Bio-One)에서 DMEM/F12 + 5% FBS 배지에서 컨플루언스에 도달하도록 성장시켰다. 1μg/ml의 rmB7-H2/Fc (158-B7, R&D Systems) 총 20 μl를 DMEM/F12 + 2% FBS에서 연속 희석된 항-ICOSL-VNAR-Fc 40 μl와 함께 1시간 동안 사전 인큐베이션한 다음, 세포에 첨가하였다. 16℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 DMEM/F12 + 2% FBS로 3회 주의하여 세척하고, 동일한 배지에서 1:10,000으로 희석된 염소 항-인간 Fc-HRP (SIGMA)와 함께 16℃에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, TMB 기질로 전개시켰다.
도 11은 ICOSL VNAR이 이 형식의 동족 항원에 결합하는 것을 보여주는 ELISA 결합 데이터를 도시한다.
도 12는 추가로 향상된 기능성 특성을 제공하는 것으로, TNF R1 도메인, ICOSL VNAR 및 인간 IgG Fc를 혼입시키는 본 발명의 다가 및 다중 특이적 VNAR의 형식을 도시한다.
도 13은 추가로 향상된 기능성 특성을 제공하는 것으로, TNF R1 도메인, ICOSL VNAR 및 인간 IgG Fc를 혼입시키는 본 발명의 다가 및 다중 특이적 VNAR의 효능 데이터를 도시한다.
이 데이터는 융합체가 TNFR1을 통해 TNF에 결합하고, VNAR 도메인을 통해 mICOSL 및 hICOSL에 결합할 수 있음을 보여준다. 이 작제물은 그들의 동족 CHO-발현 수용체에 대한 m 또는 hICOSL의 결합을 억제할 수 있다
이 데이터는 다가 형식으로 조합된 VNAR이 그의 표적에 결합할 수 있고, 이 분자가 단량체 VNAR에 비해 향상된 특성을 나타낼 수 있음을 보여준다.
생체내 전임상 연구
연구의 배경기술
류머티스 관절염의 Tg197 쥣과동물 모델은 야생형 및 3'-변형된 인간 종양 괴사 인자 (hTNF-α) 전이유전자를 운반 및 발현하는 트랜스제닉 마우스 (transgenic miouse) 계통이다. 이러한 트랜스제닉 마우스는 생체활성 인간 TNF-α의 과발현에 따라 4 내지 7주령에서 100% 발생률로 만성 다발성 관절염을 발생시킨다 (문헌[Keffer et al. 1991, EMBO J., Vol. 10, pp. 4025-4031]). Tg197 마우스 모델을 사용하여, 제1 항-TNF-α 치료 항체, Remicade® 및 기타 항-TNF-알파 생물학의 치료 효능의 예시를 확립하였다 (문헌[Shealy et al., 2002, Arthritis Research & Therapy, 4(5), p.R7; Shealy et al., 2010, MAbs (Vol. 2, No. 4, pp. 428-439). Taylor & Francis]).
본 연구의 목적은 관절염의 Tg197 트랜스제닉 마우스 모델에서 관절염 증상의 예방에서 Humira®와 비교하여 항-TNF-α D1-Fc-C4 (Quad-X™)의 치료 효능을 평가하는 것이었다.
방법
총 40마리의 마우스를 5개의 시험 그룹 G1 내지 G5 각각에 배정하였다 (표 4). 이 연구의 목적을 위해, 트랜스제닉 마우스를 8마리의 마우스로 이루어진 그룹에 배정하고, 각각 시험 화합물 또는 비히클 완충액 (인산염 완충 식염수, PBS, pH 7.4)를 관절염 확립 전에 3주령에 개시하여 1주에 2회 피하 제공하고, 10주령까지 7주 동안 이를 지속하였다. 트랜스제닉 마우스 (수컷 2마리 및 암컷 2마리) 비처리 동물의 하나의 추가 그룹을 조직병리적 상태에 대해 3주령 대조군 마우스로서 사용하였고, 제1 투여량 투여 전에 희생시켰다.
제1 관절염 점수화를 수행하기 전에 마우스를 그룹에 배정하였다. 주령 및 암수 균형 연구는 이유시 동시 교배의 상이한 새끼로부터 풀링된 그룹 G1 내지 G5 마우스에 대해 8 (4마리의 수컷 및 4마리의 암컷) 이형접합 Tg197로 구성되었다. 상이한 실험 그룹에의 마우스의 배정은 연구 개시시 상이한 그룹 사이에 동일한 체중 분포를 보장하는 방식으로 수행되었다. 생체내 관절염 점수를 표 5에 기재된 바와 같이 평가하였다.
10주령에, 모든 동물을 희생시키고, 각 동물의 혈액 (혈청을 단리하고, -80℃에서 저장함) 및 2개의 발목 관절을 수집하였다. 모든 실험 동물의 발목 관절을 절개하고, 석회화하고, 추가로 처리하여, 관절염의 조직병리 평가를 수행하였다. 발목 조직병리을 표 6에 기재된 조직병리 점수화 시스템에 따라 현미경 검사에 의해 평가하고, 대표 이미지만을 결과 섹션에 포함시켰다.
그룹 평균 점수와 생체내 관절염 점수가 결과 섹션에 그래프로 도시되어 있다.
그룹 평균 점수와 조직병리 점수가 결과 섹션 및 별첨 표에 막대 그래프로 도시되어 있다. 25배 배율의 예시적 조직병리적 이미지가 또한 별첨에 제시되어 있다.
결과
Tg197 관절염 모델에 대한 항-hTNF-α D1-Fc-C4 (Quad-X™) 및 Humira®의 효능의 평가를 예방적 투여 계획에 따라 수행하였으며, 즉, 생체내 관절염 병리 및 초기 조직병리적 병변의 경미한 징후가 나타나는 3주령의 마우스에서 처리를 개시하였다. 10주령에, 비히클 처리 대조군 그룹 G1의 생체내 관절염 점수는 3주령의 비처리 동물과 비교하여 급격히 증가하였으며, 동일한 주령에 G1의 동물에서 관찰된 조직병리적 병변은 3주의 대조군 마우스 그룹에서 관찰된 것보다 통계적으로 더 중증이었다.
시험 항목 D1-Fc-C4 항-hTNFα의 생체내 및 조직병리적 및 체중 관절염 증상에서의 치료 효과의 효능 평가
ㆍ D1-Fc-C4 시험 항목의 3, 10 및 30 mg/kg 투여량 요법은 G1의 비히클 처리 마우스와 비교하여 생체내 및 조직병리적 관절염 병리에서 Tg197의 통계적으로 유의하고 강력한 억제를 제공하였다. 더욱 구체적으로, 7주의 기간 동안 주 2회로 14회 투여량을 투여한 후, 투여량 요법은 다음을 야기하였다:
G2에서 동물의 3 mg/kg D1-Fc-D4 시험 항목 처리 후 약 88%의 생체내 억제 및 약 86%의 관절염 조직병리 점수의 억제
G5의 동물의 10 mg/kg D1-Fc-C4 시험 항목 처리 후 약 88%의 유의한 생체내 억제 및 약 83%의 관절염 조직병리 점수의 억제
G3의 동물의 30 mg/kg D1-Fc-C4 시험 항목 처리 후 약 88%의 유의한 생체내 억제 및 약 86%의 관절염 조직병리 점수의 억제
ㆍ 단지 3 mg/kg 및 10 mg/kg 투여량 요법에서만 통계 유의도가 달성되었지만, G1의 비히클 처리 마우스와 비교하여 모든 투여량 수준에서 더 많은 체중을 획득한 것으로 나타난 D1-Fc-C4 시험 항목 처리 마우스의 평균 체중 곡선에서 유사한 결과가 관찰되었다.
D1-Fc-C4 시험 항목 투여량 반응 효능 평가
ㆍ 3, 10 및 30mg/Kg 투여량의 D1-Fc-D4 시험 항목으로의 처리는 생체내 관절염 평가 및 체중 점수뿐만 아니라, 조직병리 평가에 의해 제시된 바와 같이 투여량-의존적 반응 효과를 나타내지 않았고, 모든 투여량이 유사하게 작용하였으며, 그 치료 효과가 통계적으로 차별화되지 않았다.
생체내 및 조직병리적 및 체중 관절염 증상에서 Humira®의 치료 효과의 효능 평가
ㆍHumira®의 10 mg/kg 투여량 요법은 G1의 비히클 처리 마우스와 비교하여 생체내 및 조직학적 관절염 병리에서 Tg197의 강력한 통계적으로 유의한 억제를 제공하였다. 더욱 구체적으로, 7주 동안 주 2회로의 14회 투여량을 투여한 후, 본 발명자들은 다음을 관찰하였다:
G4에서 동물의 10 mg/kg Humira® 처리 후 약 82%의 생체내 억제 및 약 86%의 관절염 조직병리 점수의 억제
ㆍG1의 비히클 처리 마우스와 비교하여, 더 많은 체중을 획득한 것으로 나타난 Humira® 처리 마우스의 평균 체중 곡선에서 유사한 결과가 관찰되었다.
D1-Fc-C4 시험 항목과 Humira® 사이의 투여량 반응 비교
10 mg/kg 투여량에 걸친 D1-Fc-C4 시험 항목과 Humira® 사이의 억제 효과의 비교 시험에 의해, 이는 체중, 생체내 관절염 점수 및 조직병리 평가를 포함하여 평가된 모든 파라미터에서 통계적으로 차별화되지 않는 것으로 나타났다.
3주령 대조군 동물에 대한 D1-Fc-C4 시험 항목 및 Humira®의 효과의 조직병리적 비교
3, 10 및 30 mg/Kg의 D1-Fc-C4 시험 항목뿐만 아니라, 10 mg/Kg Humira®의 억제 효과는 10주째에 더 적은 조직병리 병변을 유발하였으며, 3주령 대조군 비처리 동물로부터 통계적으로 차별화되었다.
또한, 마우스 TNF-알파를 표적화하는 VNAR S17 Quad-X™ 작제물을 사용한 시험관내 효능 향상의 제2 예시를 수행하였다.
VNAR S17은 인간 TNF-알파에 대한 결합 또는 중화 활성이 없는 특이적 항-마우스 TNF-알파이다. VNAR S17-Fc는 대략 8 nM의 시험관내 효능 (ND50)을 갖는 마우스 TNF-알파의 강력한 중화제이다. Quad-X™ 작제물 (S17-Fc-S17)로 설계하는 경우, 시험관 내 중화 효능은 0.2 nM로 약 40배 향상되었다 (도 30).
또한, S17 Quad-X™ 및 D1-C4 Quad-X™ 작제물은 별개의 종의 TNF-알파를 인식하는 것으로 나타났다 (도 31).
논의 및 결론
이 연구의 결과는 기준 Humira® 및 D1-Fc-C4 (Quad-X™) 및 D1-BA11-C4 항-hTNF-α 항목이 Tg197 동물에서 관찰된 관절염 표현형을 억제하여, 비히클 처리 동물과 비교하여 체중 증가를 야기하고, 생체내 및 조직병리적 관절염 병리을 감소시킨 것으로 나타났다.
기준 Humira®의 치료 효과를 10 mg/kg 투여량으로 평가하였고 (도 29 내지 도 32), 이는 비히클 처리 마우스와 비교하여, 생체내 관절염 및 발목 조직병리 평가의 통계적으로 유의한 억제를 야기하였다. 도 33에서 1 mg/kg Humira®는 8주째에 질병에 대한 유의한 진전를 나타낸다. 1 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg 및 30 mg/kg Humira®의 투여 요법을 사용한 이전의 Tg197 마우스 모델 연구에서, 1 mg/kg (도 33) 또는 3 mg/kg Humira® (도 35) 처리된 마우스 그룹에서 질병에 대한 유의한 진전이 있는 것으로 나타났다. 이들 마우스 그룹은 비처리 그룹과 유사한 시간 의존적 질병 진행을 나타내었으며, 생체내 관절염 (AS) 및 조직병리 점수 (HS)는 10 mg/kg 또는 30 mg/kg Humira®로 처리된 그룹보다 유의하게 더 높았다 (도 33).
D1-Fc-C4 (Quad-X™) 시험 항목은 평가된 모든 투여량, 즉 0.5, 1, 3 mg/kg, 10 mg/kg 및 30 mg/kg에서 질병이 완전히 제어되어, 유사하고, 통계적으로 차별화되지 않는 치료 효과를 나타냈으므로, 투여량-의존적 반응을 나타내지 않았다. 또한, 생체내 관절염 및 조직병리 평가에 의하면, 3 mg/kg 투여량의 D1-Fc-C4 시험 항목의 치료 효과가 10 mg/kg Humira®의 치료 효과와 통계적으로 유사한 것으로 나타났다. 본 발명자들은 또한 10주령의 3 mg/kg D1-Fc-C4 처리 마우스에서 질병에 대한 진전의 임의의 징후를 관찰하지 못했으며, 본 발명자들은 8주령의 0.5 및 1 mg/kg D1-Fc-C4에서도 관찰하지 못했다.
따라서, 본 발명자들은 D1-Fc-C4 항-hTNF-α 도메인이 시험관내 (L929 및 Caco2 데이터― 도 2, 도 3, 도 6 내지 도 8, 도 20, 도 23 및 도 28) 및 생체내 (도 29 내지 도 35)에서 TNF-알파 효과의 중화에서 표준 요법인 Humira®보다 더 강력함을 추가로 예시하였다. 본 발명자들은 또한 비-Fc 기반 탠덤 다가 VNAR, D1-BA11-C4의 생체내 효능을 입증하였다 (도 33 및 도 34).
마지막으로, 본 발명자들은 항-TNF VNAR (D1-Fc)가 또한 Fc 단독 형식에서 전신 투여된 경우, 염증성 안구 질병의 랫트 모델에서 포도막염을 제어하고, 치료할 수 있음 (덱사메타손과 유사한 효능을 가짐)을 제시할 수 있었다 (도 36).
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 355 360 365 Gly Gly Gly Ser Gly Ala His Ser Ala Ser Val Asn Gln Thr Pro Arg 370 375 380 Thr Ala Thr Lys Glu Thr Gly Glu Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu 385 390 395 400 Thr Asp Thr His Ala Lys Val Phe Thr Thr Ser Trp Phe Arg Lys Asn 405 410 415 Pro Gly Thr Thr Asp Trp Glu Arg Met Ser Ile Gly Gly Arg Tyr Val 420 425 430 Glu Ser Val Asn Lys Gly Ala Lys Ser Phe Ser Leu Arg Ile Lys Asp 435 440 445 Leu Thr Val Ala Asp Ser Ala Thr Tyr Ile Cys Arg Ala Gly Gly Tyr 450 455 460 Leu Ser Gln Pro Arg Val Tyr Trp Asp Val Tyr Gly Ala Gly Thr Val 465 470 475 480 Leu Thr Val Asn <210> 96 <211> 1452 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 96 gcaagcgtta atcagacacc gcgtaccgca accaaagaaa ccggtgaaag cctgaccatt 60 aattgtgttc tgaccgatac ccatgctaaa gttttcacta ccagctggtt tcgtaaaaat 120 ccgggtacaa ccgattggga acgtatgagc attggtggtc gttatgttga aagcgtgaat 180 aaaggtgcca aaagctttag cctgcgcatt aaagatctga ccgttgcaga tagcgcaacc 240 tatatctgtc gtgccggtgg ttacctgtct cagccgcgtg tttactggga tgtttatggt 300 gcaggcaccg ttctgaccgt taatggcggt ggtggttctg gtggtggtgg tcgtacggag 360 cctcgaggcc ccacaatcaa gccctgtcct ccatgcaaat gcccagcacc taacctcttg 420 ggtggaccat ccgtcttcat cttccctcca aagatcaagg atgtactcat gatctccctg 480 agccccatag tcacatgtgt ggtggtggat gtgagcgagg atgacccaga tgtccagatc 540 agctggtttg tgaacaacgt ggaagtacac acagctcaga cacaaaccca tagagaggat 600 tacaacagta ctctccgggt ggtcagtgcc ctccccatcc agcaccagga ctggatgagt 660 ggcaaggagt tcaaatgcaa ggtcaacaac aaagacctcc cagcgcccat cgagagaacc 720 atctcaaaac ccaaagggtc agtaagagct ccacaggtat atgtcttgcc tccaccagaa 780 gaagagatga ctaagaaaca ggtcactctg acctgcatgg tcacagactt catgcctgaa 840 gacatttacg tggagtggac caacaacggg aaaacagagc taaactacaa gaacactgaa 900 ccagtcctgg actctgatgg ttcttacttc atgtacagca agctgagagt ggaaaagaag 960 aactgggtgg aaagaaatag ctactcctgt tcagtggtcc acgagggtct gcacaatcac 1020 cacacgacta agagcttctc ccggactccg ggtaaaggag gtggcggttc cggaggtggc 1080 ggtagcggag gtggcggtag cggaggtggc ggtagcgggg cccattctgc aagcgttaat 1140 cagacaccgc gtaccgcaac caaagaaacc ggtgaaagcc tgaccattaa ttgtgttctg 1200 accgataccc atgctaaagt tttcactacc agctggtttc gtaaaaatcc gggtacaacc 1260 gattgggaac gtatgagcat tggtggtcgt tatgttgaaa gcgtgaataa aggtgccaaa 1320 agctttagcc tgcgcattaa agatctgacc gttgcagata gcgcaaccta tatctgtcgt 1380 gccggtggtt acctgtctca gccgcgtgtt tactgggatg tttatggtgc aggcaccgtt 1440 ctgaccgtta at 1452

Claims (34)

  1. 다음 CDR 및 초가변 영역 (HV)을 포함하는, TNF-알파 특이적 VNAR 결합 도메인(domain):
    a) CDR1: HCATSS (서열번호 68) 또는 NCGLSS (서열번호 69) 또는 NCALSS (SEQ ID NO: 70);
    b) HV2: TNEESISKG (서열번호 71);
    c) HV4: SGSKS (서열번호 72) 또는 EGSKS (서열번호 73); 및
    d) CDR3: ECQYGLAEYDV (서열번호 1) 또는 SWWTQNWRCSNSDV (서열번호 6) 또는 YIPCIDELVYMISGGTSGPIHDV (서열번호 11).
  2. 제1항에 있어서, VNAR 결합 도메인은 다음으로부터 선택되는 CDR 및 초가변 영역 (HV)의 조합을 포함하는, TNF-알파 특이적 VNAR 결합 도메인:
    a) HCATSS의 CDR1 (서열번호 68), TNEESISKG의 HV2 (서열번호 71), SGSKS의 HV4 (서열번호 72), 및 ECQYGLAEYDV의 CDR3 (서열번호 1);
    b) NCGLSS의 CDR1 (서열번호 69), TNEESISKG의 HV2 (서열번호 71), EGSKS의 HV4 (서열번호 73), 및 SWWTQNWRCSNSDV의 CDR3 (서열번호 6); 또는
    c) NCALSS의 CDR1 (서열번호 70), TNEESISKG의 HV2 (서열번호 71), SGSKS의 HV4 (서열번호 72), 및 YIPCIDELVYMISGGTSGPIHDV의 CDR3 (서열번호 11).
  3. 제1항에 있어서, VNAR 결합 도메인은 서열번호 2, 7 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는, TNF-알파 특이적 VNAR 결합 도메인.
  4. 제1항에 있어서, VNAR 도메인은 인간화되거나 탈면역화된 것이고, 선택적으로 VNAR 결합 도메인은 다음의 아미노산 서열을 포함하는, TNF-알파 특이적 VNAR 결합 도메인:
    a) 서열번호 51의 1 내지 106번째 아미노산
    (ARVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLRDSHCATSSTYWYRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRINDLTVEDSGTYRCASECQYGLAEYDVYGGGTKVEIK);
    b) 서열번호 53의 1 내지 106번째 아미노산
    (ARVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLRDSHCATSSTYWYRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFTLTISSLQPEDFATYYCASECQYGLAEYDVYGGGTKVEIK);
    c) 서열번호 55의 1 내지 106번째 아미노산
    (ARVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLRDSHCATSSTYWYQQKPGKTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFTLTISSLQPEDFATYYCASECQYGLAEYDVYGGGTKVEIK); 또는
    d) 서열번호 57의 1 내지 106번째 아미노산
    (ARVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLRDSHCATSSTYWYRKKPGSTNEESISKGGRFSGSGSSGSKSFTLTISSLQPEDFATYYCASECQYGLAEYDVFGQGTKVEIK).
  5. 하나 이상의 특이적 항원의 동일하거나 상이한 에피토프(epitope)에 결합하는 2개 이상의 VNAR 도메인을 포함하는 다중-도메인 특이적 결합 분자로서, 상기 VNAR 도메인 사이에 스페이서 서열(spacer sequence)을 추가로 포함하고, 스페이서 서열이 면역글로불린 Fc 영역으로부터 유래하고, 적어도 하나의 VNAR 도메인은 하기 CDR 및 초가변 영역 (HV)을 포함하는 TNF-알파 특이적 VNAR 결합 도메인인, 다중-도메인 특이적 결합 분자:
    a) CDR1: HCATSS (서열번호 68) 또는 NCGLSS (서열번호 69) 또는 NCALSS (서열번호 70);
    b) HV2: TNEESISKG (서열번호 71);
    c) HV4: SGSKS (서열번호 72) 또는 EGSKS (서열번호 73); 및
    d) CDR3: ECQYGLAEYDV (서열번호 1) 또는 SWWTQNWRCSNSDV (서열번호 6) 또는 YIPCIDELVYMISGGTSGPIHDV (서열번호 11).
  6. 제5항에 있어서, 적어도 하나 또는 2개 이상의 VNAR 도메인은 인간화되거나 탈면역화된 것이고, 선택적으로 적어도 하나의 VNAR 결합 도메인은 다음의 아미노산 서열을 포함하는, 다중-도메인 특이적 결합 분자:
    a) 서열번호 51의 1 내지 106번째 아미노산
    (ARVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLRDSHCATSSTYWYRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRINDLTVEDSGTYRCASECQYGLAEYDVYGGGTKVEIK);
    b) 서열번호 53의 1 내지 106번째 아미노산
    (ARVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLRDSHCATSSTYWYRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFTLTISSLQPEDFATYYCASECQYGLAEYDVYGGGTKVEIK);
    c) 서열번호 55의 1 내지 106번째 아미노산
    (ARVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLRDSHCATSSTYWYQQKPGKTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFTLTISSLQPEDFATYYCASECQYGLAEYDVYGGGTKVEIK); 또는
    d) 서열번호 57의 1 내지 106번째 아미노산
    (ARVDQSPSSLSASVGDRVTITCVLRDSHCATSSTYWYRKKPGSTNEESISKGGRFSGSGSSGSKSFTLTISSLQPEDFATYYCASECQYGLAEYDVFGQGTKVEIK).
  7. 제5항에 있어서, 다중-도메인 특이적 결합 분자 내의 하나 이상의 VNAR 도메인이 단량체 VNAR과 비교하여, 그의 표적에 대해 더 높은 결합 친화도를 나타내는, 다중-도메인 특이적 결합 분자.
  8. 제5항에 있어서, 2개 이상의 VNAR 도메인이 하나의 특이적 항원의 동일하거나 상이한 에피토프에 결합하는, 다중-도메인 특이적 결합 분자.
  9. 제5항에 있어서, 2개 이상의 VNAR 도메인이 하나의 특이적 항원의 상이한 에피토프에 결합하는, 다중-도메인 특이적 결합 분자.
  10. 제5항에 있어서, 2개 이상의 VNAR 도메인이 각각 상이한 특이적 항원에 결합하는, 다중-도메인 특이적 결합 분자.
  11. 제5항에 있어서, 스페이서 서열이 인간 면역글로불린 Fc 영역으로부터 유래하는, 다중-도메인 특이적 결합 분자.
  12. 제5항에 있어서, 2개 이상의 VNAR 도메인은 서열번호 2, 7 또는 12, 또는 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 그의 기능성 변이체를 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는, 다중-도메인 특이적 결합 분자.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 단일 도메인 특이적 결합 분자 또는 제5항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 다중-도메인 특이적 결합 분자를 인코딩(encoding)하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  14. 결합 분자를 제조하는 방법으로서, 제13항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포를, 상기 숙주 세포가 결합 분자를 생성하는 조건 하에서 배양하거나 유지시키는 단계를 포함하고, 선택적으로 결합 분자를 단리하는 단계를 추가로 포함하는, 결합 분자를 제조하는 방법.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 단일 도메인 특이적 결합 분자 또는 제5항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 다중-도메인 특이적 결합 분자 및 선택적으로 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 염증 또는 암의 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  16. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 사용하기 위한, 단일 도메인 특이적 결합 분자.
  17. 제4항에 있어서, 요법에 사용하기 위한, 단일 도메인 특이적 결합 분자.
  18. 제5항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 사용하기 위한, 다중-도메인 특이적 결합 분자.
  19. 제6항에 있어서, 요법에 사용하기 위한, 다중-도메인 특이적 결합 분자.
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